Биологические основы и возможности выявления

XXXII Научно-практический семинар ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ СЕГОДНЯ:
НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
Москва, 9 декабря 2015 года
Биологические основы и возможности
выявления устойчивости вируса гепатита С
к прямым противовирусным препаратам.
Булатова К.В.
ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора
Референс-центр по мониторингу за вирусными гепатитами
Hepatitis C virus (HCV)
• Сферическая частица диаметром около 50 нм, покрыта
липидной оболочкой + димеры E1-E2
• Геном: оцРНК положительной полярности, 9600 нт, 1 ORF =
10 вирусных белков
• 7 известных генотипов и несколько десятков субтипов. В РФ
преобладают 1b, 3a, 2.
Жизненный цикл HCV
1. Взаимодействие с рецептором
8. Экзоцитоз
2. Экзоцитоз
5. Разрезание полипротеина
7. Сборка
4. Трансляция
3. Высвобождение РНК
6. Репликация
NB! В ЖЦ нет ДНК-формы
Feeney ER, Chung RT, Antiviral treatment of hepatitis C, BMJ. 2014 Jul 7;348:g3308. doi: 10.1136/bmj.g3308. Review.
Процессинг полипротеинового
предшественника
Feeney ER, Chung RT, Antiviral treatment of hepatitis C, BMJ. 2014 Jul 7;348:g3308. doi: 10.1136/bmj.g3308. Review.
Возникновение нуклеотидных замен связано с
нормальной работой РНК-полимеразы
• Низкая точность и отсутствие редактирующей способности
• Два обязательных раунда репликации (+ РНК →-РНК,
-РНК→+РНК) для одного генома
• 1012 новых вирионов HCV ежедневно продуцируются в
гепатоцитах лиц, не получающих лечение
• Частота ошибок µ= 10−4 на 1 нт или 1 ошибка на геном
• Согласно математическому распределению для РНК вирусов:
Вероятность
возникновения
в ходе цикла
репликации
WT
1 замена
2 замены
3 замены
91%
8,7%
0,42%
0,013%
Число
потенциальных
мутантов
Rong L et al., Rapid emergence of protease inhibitor resistance in hepatitis C virus. Sci Transl Med. 2010 May 5;2(30):30ra32. doi:
10.1126/scitranslmed.3000544.
Концепция квазивида применима к HCV
• Анализ кДНК-клонов единичного изолята HCV
продемонстрировал неоднородность вирусной популяции
(до 10% различий).
• 25-30% различий в пределах субтипа, 30-35% внутри
генотипа
• Манфред Эйген описал концепцию квазивида в 1971г.
• «Квазивид – группа реплицирующихся с низкой точностью
РНК-молекул, различающихся по последовательности, но в
то же время сильно схожих».
Концепция квазивида применима к HCV
Репликация вирусной РНК
Мутантный спектр
Репликация вирусной РНК
Репликация вирусной РНК
Концепция квазивида применима к HCV
• В ходе репликации вирусного генома появляются измененные
варианты вируса
• Популяция состоит из исходного вируса и окружающего его
«облака» измененных вариантов
• Разные по значимости мутации
• Возможность быстро приспособиться к изменившимся условиям
Элиминация ранее
преобладавшего вируса
Чувствительный
Устойчивый
Антивирусная
терапия
Размножение устойчивого
вируса
Чего ожидать от квазивида ?
• Возникновение мутаций, приводящих к ускользанию
вируса от иммунного ответа
• Смена клеточного тропизма
• Появление вариантов, устойчивых к существующим
вакцинам
• Появление устойчивости к противовирусным препаратам
DAAs - Direct-acting antiviralsПрепараты прямого противовирусного
действия
• ПППД - высоко эффективные средства лечения
• Ингибируют функциональную активность неструктурных
белков NS3, NS5A, NS5B HCV
• Сокращение курса лечения до 24-12недель
• Связаны с развитием устойчивости
DAAs - Direct-acting antiviralsПрепараты прямого противовирусного
действия
Класс препарата
Мишень
Чувствите
льные
генотипы
Барьер
устойчивости
Название
Симепревир (2013)
Паритапревир (2014)
Телапревир, Боцепревир
(2011)
NS3 ингибиторы
NS3
1 (и 4)
Ближе к
среднему
Нуклеотидные
NS5B ингибиторы
NS5B
1-6
Очень высокий
Софосбувир (2013)
Ненуклеотидные
NS5B ингибиторы
NS5B
1
Низкий
Дасабувир(2014)
Очень низкий
Ледипасвир, Омбитасвир
(2014)
Даклатасвир (2015)
NS5А ингибиторы
NS5A
1, 4-6
Белок NS3 и его ингибиторы
Боцепревир
Телапревир
• NS3 – сериновая протеаза, разрезает
полипротеин на белки NS4A, NS4B, NS5A,
NS5B.
• Необходим кофактор NS4A
(прикрепление к мембане, повышение
стабильности и каталитической
активности)
• Ингибиторы, блокирующие ССЦ :
-Линейные пептидомиметики, ков.св.
(Телапревир, Боцепревир)
-Линейные пептидомиметики, неков.св.
(Асунапревир, Фалдапревир)
-Макролитические пептидомиметики, неков.св.
(Симепревир, Ванипревир)
Welsch C et al., Peptidomimetic escape mechanisms arise via genetic diversity in the ligand-binding site of
the hepatitis C virusNS3/4A serine protease. Gastroenterology. 2012 Mar;142(3):654-63. doi: 10.1053/j.gastro.2011.11.035.
Аминокислотные замены, связанные с
устойчивостью к ингибиторам NS3(1)
NS3 протеаза (180 aa)
Боцепревир
Телапревир
Симепревир
Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый.
Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/
Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30.
Аминокислотные замены, связанные с
устойчивостью к ингибиторам NS3(2)
NS3 протеаза (180 aa)
Асунапревир
Паритапревир
Ванипревир
Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый.
Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/
Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30.
Аминокислотные замены, связанные с
устойчивостью к ингибиторам NS3
Телапревир, 1а
Телапревир, 1b
K
Боцепревир, 1а
Боцепревир, 1b
Фалдапревир
Данопревир
Ванипревир
Симепревир
Асунапревир
R155K: частота развития резистентности к ингибиторам протеазы
зависит от субтипа HCV (1a или 1b)
AGG→AAG
CGG→CAG→AAG
1a
1b
Vermehren, Sarrazin, Best Practice & Research Clin Gast 26 (2012) 487-503
Белок NS5A и его ингибиторы
• Низкая консервативность (вариабельней только E2)
• NS5A 2 формы: р56 (отвечает за репликацию) и р58
(переключение с репликации на сборку вирусных частиц)
• Взаимодействует с клеточными белками: ApoE
(липопротеин), Annexin (мембранный сортинг), липидкиназа, PI4KIIIα
• 3 домена
Ингибиторы:
Механизм действия
ингибиторов не совсем
ясен (РНК-св.? Димеры?)
• Несимметричные (BSM-824, IRBM-521)
• Палиндромные (Даклатасвир,
Ледипасвир, Омбитасвир)
Аминокислотные замены, связанные с
устойчивостью к ингибиторам NS5А
NS5A 1ый домен (213 aa)
Даклатасвир
Ледипасвир
Омбитасвир
Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый.
Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/
Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30.
Белок NS5B и его ингибиторы
• Классическая структура «правой руки»
• Консервативный активный центр в
«ладони», подпись GDD (правильная
ориентация 2 Mg++)
• Синтез + и – РНК цепей, низкая
точность, нет редактирующей
способности
2 класса ингибиторов
• Нуклеотидные
(Софосбувир) «Ошибочный
субстрат»-блок АЦ и обрыв
цепи, очень высокий барьер
и широкий спектр действия.
• Ненуклеотидные
(Дасабувир) связывают один
из менее консервативных
регионов и препятствуют
конформационным
изменениям фермента в
ходе каталитического акта.
Pingzu Jiao,a Weiwei Xue,b Yulin Shen,c Nengzhi Jinc and Huanxiang Liu*ad
Show Affiliations Understanding the drug resistance mechanism of hepatitis C virus NS5B to PF-00868554 due to mutations
of the 423 site: a computational study Mol. BioSyst., 2014,10, 767-777
Аминокислотные замены, связанные с
устойчивостью к ингибиторам NS5В
• S282T найдена у пациента с HCV 2g., у которого наблюдался вирусологический
прорыв через 4 недели после окончания курса лечения софосбувиром
• Несколько пациентов с HCV 3g в. течение клин.испытаний софосбувира L159F,
V321A
NS5B Полимераза (591 a.о.) – Нуклеотидные ингибиторы
Софосбувир
591 ак
NS5B Полимераза (591 a.о.) – Ненуклеотидные ингибиторы
Дасабувир
591 ак
Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый.
Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/
Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30.
Некоторые аминокислотные замены – естественные
полиморфизмы, встречающиеся в вирусной
популяции
• Жизнеспособность мутантных форм сравнима с WT
• Мутантный вирус способен запустить инфекционный процесс в новом организме
• Замены присутствуют в белках-мишенях ПППД: NS3, NS5A, NS5B
• Выявляются у пациентов с ХГС, ранее не
получавших ПППД.
• Их определение крайне важно для начала
терапии ПППД.
Естественные полиморфизмы,
встречающиеся в NS3 HCV 1a sub.
Welsch C1, Zeuzem S. Clinical relevance of HCV antiviral drug resistance. Curr Opin Virol. 2012 Oct;2(5):651-5. doi:
10.1016/j.coviro.2012.08.008. Epub 2012 Sep 21.
• Устойчивость к симепревиру в NS3 Q80K среди пациентов с
HCV 1a в 18.5% случаев + 11% дополнительные замены
V36L и V55A (Beloukas A. et al., Clinical Microbiology and Infection, 11.2015)
• Устойчивость к ингибиторам NS3. HCV 1a = 0.7% V36M, 0.7%
V36L, 6.85% T54S, 3.42% V55A, 13.7% Q80K (Samantha J. Shepherd et
al., Journal of Clinical Virology, 02.2015)
• Устойчивость к ингибиторам в NS5A Q30H, Y93N среди
пациентов с HCV 1a в 5.4% случаев + Y93N в 2.8% случаев с
HCV 3a (Lindström I. et al., Infectious Diseases, 08.2015)
• Устойчивость к ингибиторам в NS5A. HCV 1a = M28T, Y93H
13.5%. HCV 1b = Y93H 3.7% (Peres-da-Silva A. et al., Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 03.2015)
Мутации устойчивости к препаратам ППД в NS3, NS5Aрегионах HCV у наивных пациентов в Москве
A156S
4%
R30Q
L28T 7%
4%
wt
96%
NS3
N=27, 1b HCV
Y93H
7%
wt
82%
NS5A
Методы обнаружения устойчивости
• Генотипирование: обнаружение мутации устойчивости
в геноме вируса при помощи секвенирования
• Фенотипирование: определение in vitro подавляющей
концентрации (IC) противовирусного препарата и
влияния на это определенных мутаций (по сравнению
с IC50 WT)
• Виртуальное фенотипирование: моделирование
фенотипа исследуемого штамма на основании анализа
генотипа при сравнении со штаммами со сходным
профилем мутаций и известным фенотипом
Способы выявления генотипической резистентности
Метод
Чувствительность
(минимальная доля
мутантной популяции,
которая может быть
обнаружена)
Особенности
Прямое секвенирование
20%
Выявляет как известные,
так и новые мутации
≥ 10%
Выявляет как известные,
так и новые мутации;
трудоемкий
<1%
Выявляет как известные,
так и новые мутации;
высокая стоимость
Клонированиесеквенирование
NGS
«АмплиСенс HCV-Resist-seq»
1
• ПЦР-амплификация кДНК NS3, NS5A и NS5B
регионов генома HCV
• Прямое секвенирование продукта амплификации
2
3
• Анализ электрофореграммы при помощи
программного обеспечения «ДЕОНА»
• Интерпретация результатов
4
Заключение
• РНК-зависимая-РНК полимераза вируса гепатита С (белок NS5B) обладает
низкой точностью и не имеет редактирующей способности
• Вирус существует в организме в виде гетерогенной популяции – квазивида
• Среди различных вариантов вируса присутствуют устойчивые к действию
лекарственных препаратов
• ПППД – высоко эффективные средства лечения, однако в ряде случаев
вирусы могут быть устойчивы к их действию
• Получены подробные карты аминокислотных замен в NS белках,
связанных с развитием устойчивости к ПППД
• Замены, приводящие к резистентности, могут присутствовать в геноме
исходного варианта вируса до начала терапии
• Своевременное выявление мутаций и полиморфизмов крайне важно для
выбора стратегии или корректировки терапии с использованием ПППД
• Прямое секвенирование – доступный и эффективный метод выявления
замен, приводящих к лекарственной устойчивости
Благодарю за внимание
Дополнительный слайд
Дополнительный слайд
Номер позиции
и аминокислота
«дикого» типа
< 10%
пациентов
не достигших
УВО
≥ 10%
пациентов
не достигших
УВО
Генотип/субтип HCV: 1a – красный, 1b – синий, 2 – коричневый, 3a – зеленый, 4 – оранжевый.
Lontok E. et al. Hepatology. 2015, Jun 10
Аминокислотные замены, связанные с
устойчивостью к ингибиторам NS3
NS3 протеаза (180 aa)
Боцепревир
Телапревир
Симепревир
Асунапревир
Паритапревир
Lontok E et al., Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: State of the art summary/
Hepatology. 2015 Nov;62(5):1623-32. doi: 10.1002/hep.27934. Epub 2015 Jul 30.