ИМПОРТ РНК В МИТОХОНДРИИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В
advertisement
32 ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2015. ¹ 3 ÓÄÊ 577.29 ÈÌÏÎÐÒ ÐÍÊ Â ÌÈÒÎÕÎÍÄÐÈÈ È ÅÃÎ ÏÐÈÌÅÍÅÍÈÅ Â ÃÅÍÍÎÉ ÒÅÐÀÏÈÈ Â.À. Ëàêóíèíà, Ì.Â. Áàëåâà, Ñ.À. Ëåâèöêèé, È.Â. ×è÷åðèí, È.À. Êðàøåíèííèêîâ, Å.Î. Ñàìîéëîâà, Ï.À. Êàìåíñêèé (êàôåäðà ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè; e-mail: peter@protein.bio.msu.ru) Ê áèîëîãè÷åñêèì ìàêðîìîëåêóëàì, èìïîðòèðóþùèìñÿ â ìèòîõîíäðèè ýóêàðèîòè÷åñêèõ êëåòîê èç öèòîçîëÿ, îòíîñÿòñÿ áåëêè è ðèáîíóêëåèíîâûå êèñëîòû. Èìïîðò áåëêîâ â ìèòîõîíäðèè — óíèâåðñàëüíûé ïðîöåññ, è åãî ìåõàíèçìû îïèñàíû â äîñòàòî÷íîé ñòåïåíè ïîäðîáíî. Èìïîðò ÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè, íàïðîòèâ, ïîêàçàí òîëüêî äëÿ íåêîòîðûõ ãðóïï îðãàíèçìîâ, è â êàæäîì ñëó÷àå ìåõàíèçìû äàííîãî ïðîöåññà îáëàäàþò áîëüøèì êîëè÷åñòâîì èíäèâèäóàëüíûõ îñîáåííîñòåé.  äàííîì îáçîðå ðàññìàòðèâàþòñÿ ñîâðåìåííûå äàííûå î ïðîöåññå èìïîðòà ÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè êëåòîê ÷åëîâåêà, è îáñóæäàåòñÿ âîçìîæíîñòü èñïîëüçîâàíèÿ äàííîãî ïðîöåññà â ãåííîé òåðàïèè ìèòîõîíäðèàëüíûõ áîëåçíåé. Êëþ÷åâûå ñëîâà: ìèòîõîíäðèè, ÐÍÊ, èìïîðò ÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè, ãåííàÿ òåðàïèÿ, îáçîð. Ìèòîõîíäðèè — óíèâåðñàëüíûå îðãàíåëëû ýóêàðèîòè÷åñêîé êëåòêè, îáåñïå÷èâàþùèå åå ýíåðãèåé è âûïîëíÿþùèå ìíîæåñòâî äðóãèõ âàæíåéøèõ ôóíêöèé.  ñîîòâåòñòâèè ñ ãîñïîäñòâóþùåé â íàñòîÿùåå âðåìÿ ýíäîñèìáèîòè÷åñêîé ãèïîòåçîé ìèòîõîíäðèè ñôîðìèðîâàëèñü èç ñâîáîäíîæèâóùèõ áàêòåðèé, â ñâîå âðåìÿ çàõâà÷åííûõ êëåòêîéõîçÿèíîì.  ïðîöåññå ýâîëþöèè ãåíîì îðãàíåëë çíà÷èòåëüíî ðåäóöèðîâàëñÿ — áîëüøîå êîëè÷åñòâî ìèòîõîíäðèàëüíûõ ãåíîâ êàêèì-òî îáðàçîì ïåðåíåñëèñü â ÿäðî. Òåì íå ìåíåå â ìèòîõîíäðèÿõ èìåþò ìåñòî âñå îñíîâíûå ìîëåêóëÿðíî-áèîëîãè÷åñêèå ïðîöåññû. Òå ìàêðîìîëåêóëû, êîòîðûå íåîáõîäèìû äëÿ íîðìàëüíîãî ïðîòåêàíèÿ äàííûõ ïðîöåññîâ, íî íå çàêîäèðîâàíû â ãåíîìå îðãàíåëë, èìïîðòèðóþòñÿ â ìèòîõîíäðèè èç öèòîçîëÿ. Ê ÷èñëó òàêèõ ìàêðîìîëåêóë îòíîñÿòñÿ áåëêè è ÐÍÊ.  íàñòîÿùåé ðàáîòå ìû ñôîêóñèðóåìñÿ íà ïðîöåññàõ èìïîðòà ÐÍÊ èç öèòîçîëÿ.  îòëè÷èå îò èìïîðòà áåëêîâ, êîòîðûé èìååò ìåñòî ó âñåõ ýóêàðèîòè÷åñêèõ îðãàíèçìîâ, èìïîðò ÐÍÊ ýêñïåðèìåíòàëüíî ïîêàçàí òîëüêî äëÿ íåñêîëüêèõ ãðóïï ýóêàðèîò. Ïî÷òè âñå èìïîðòèðóåìûå ÐÍÊ — ýòî òÐÍÊ, íåîáõîäèìûå äëÿ ìèòîõîíäðèàëüíîé òðàíñëÿöèè â ñâÿçè ñ îòñóòñòâèåì èõ ãåíîâ â ìèòîõîíäðèàëüíîì ãåíîìå. Òîëüêî äëÿ ìëåêîïèòàþùèõ áûë ïîêàçàí èìïîðò íåêîòîðûõ äðóãèõ ìàëûõ ÐÍÊ. Ïðè ýòîì ó ðàçíûõ îðãàíèçìîâ â ìèòîõîíäðèè èìïîðòèðóåòñÿ ðàçíûé íàáîð ÐÍÊ, ïðè÷åì ïî ðàçíûì ìåõàíèçìàì [1]. ×åëîâåê (êàê è äðóãèå ìëåêîïèòàþùèå) ñòîèò îñîáíÿêîì â ðÿäó îðãàíèçìîâ, äëÿ êîòîðûõ ïîêàçàí èìïîðò ÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè. Äåëî â òîì, ÷òî âî âñåõ îñòàëüíûõ ñëó÷àÿõ â ìèòîõîíäðèè èìïîðòèðóþòñÿ òÐÍÊ, íåîáõîäèìûå äëÿ ïðîöåññîâ ìèòîõîíäðèàëüíîé òðàíñëÿöèè, îáû÷íî ýòî ñâÿçàíî ñ íàëè÷èåì íåïîëíîãî íàáîðà ãåíîâ òÐÍÊ â ìèòî- õîíäðèàëüíîì ãåíîìå.  ìèòîõîíäðèè æå ìëåêîïèòàþùèõ â åñòåñòâåííûõ óñëîâèÿõ òÐÍÊ íå èìïîðòèðóþòñÿ; âìåñòî íèõ â îðãàíåëëû ìîãóò ïðîíèêàòü òðè äðóãèõ âèäà ÐÍÊ. Ïåðâûå äâà âèäà ÐÍÊ — ýòî ÐÍÊ-êîìïîíåíò ÐÍÊàçû MRP, ðàñùåïëÿþùåé ÐÍÊ-çàòðàâêè ïðè ðåïëèêàöèè ìèòîõîíäðèàëüíîé ÄÍÊ [2, 3], à òàêæå ÐÍÊ-êîìïîíåíò ÐÍÊàçû Ð, ó÷àñòâóþùåé â 5¢-êîíöåâîì ïðîöåññèíãå ïðåäøåñòâåííèêîâ ìèòîõîíäðèàëüíûõ òÐÍÊ [4]. Äîëãîå âðåìÿ ìåõàíèçì èìïîðòà äàííûõ ÐÍÊ îñòàâàëñÿ íåèçó÷åííûì, ïîêà â 2010 ã. íå áûëà îïóáëèêîâàíà ðàáîòà, â êîòîðîé â êà÷åñòâå îñíîâíîãî ó÷àñòíèêà äàííîãî ïðîöåññà íå áûëà èäåíòèôèöèðîâàíà ìèòîõîíäðèàëüíàÿ ïîëèíóêëåîòèäôîñôîðèëàçà (ÏÍÔàçà) [5]. Ýòà 3¢—5¢-ýêçîðèáîíóêëåàçà îñóùåñòâëÿåò ïðîöåññèíã ìèòîõîíäðèàëüíûõ òðàíñêðèïòîâ [6]. Îíà ëîêàëèçîâàíà â ìåæìåìáðàííîì ïðîñòðàíñòâå [5], ÷òî ñàìî ïî ñåáå ÿâëÿåòñÿ ñòðàííûì, ïîñêîëüêó ñóáñòðàòû åå ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè ðàñïîëàãàþòñÿ â ìàòðèêñå ìèòîõîíäðèé. Ïðîöåññ èìïîðòà ÏÍÔàçû â ìèòîõîíäðèè ïðîòåêàåò ïî íåñêîëüêî íåñòàíäàðòíîìó ïóòè: ïîñëå ïåðåñå÷åíèÿ âíåøíåé ìåìáðàíû (ïîñðåäñòâîì ÒÎÌ-êîìïëåêñà) è ñâÿçûâàíèÿ ñ êîìïîíåíòàìè TIM23-êîìïëåêñà ïðîèñõîäèò ýêñïîíèðîâàíèå åå MTS â ìàòðèêñ, ãäå òà îòðåçàåòñÿ êàíîíè÷åñêîé ïðîòåàçîé MPP, à çàòåì â äåëî âñòóïàåò ïðîòåàçà âíóòðåííåé ìåìáðàíû Yme1, êîòîðàÿ êàêèì-òî îáðàçîì îïîñðåäóåò âûñâîáîæäåíèå çðåëîé ÷àñòè ÏÍÔàçû èç êîìïëåêñà ñ TIM23-áåëêàìè è åå âûõîä â ìåæìåìáðàííîå ïðîñòðàíñòâî [7]. Áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ÏÍÔàçà ÿâëÿåòñÿ êðèòè÷åñêè âàæíûì ó÷àñòíèêîì ïðîöåññà èìïîðòà ÐÍÊ-êîìïîíåíòîâ ÐÍÊàç Ð è MRP, à òàêæå 5S ðÐÍÊ (ñì. íèæå) [5]. Ëþáîïûòíî, ÷òî ïðè ýêñïðåññèè ãåíà ÏÍÔàçû â êëåòêàõ äðîææåé (êîòîðûå â íîðìå òàêîãî ôåðìåíòà íå ñîäåðæàò) âñå âûøåïåðå÷èñ- ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2015. ¹ 3 ëåííûå ÐÍÊ, êîòîðûå â íîðìå îïÿòü æå íå èìïîðòèðóþòñÿ â äðîææåâûå ìèòîõîíäðèè, íà÷èíàëè ïîäâåðãàòüñÿ èìïîðòó [5].  ýòèõ ÐÍÊ áûëà èäåíòèôèöèðîâàíà ñòðóêòóðà òèïà “ñòåáåëü—ïåòëÿ”, êîòîðàÿ, ïî âñåé âèäèìîñòè, îïðåäåëÿåò âîçìîæíîñòü èõ ñâÿçûâàíèÿ ñ ÏÍÔàçîé è èìïîðòà â ìèòîõîíäðèè. Ïðè äîáàâëåíèè íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ôîðìèðóþùåé äàííóþ ñòðóêòóðó, ê ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿì ðàçëè÷íûõ íåèìïîðòèðóåìûõ òÐÍÊ è ìÐÍÊ ïîëó÷àåìûå ãèáðèäíûå ìîëåêóëû ÐÍÊ íà÷èíàëè èìïîðòèðîâàòüñÿ â ìèòîõîíäðèè êëåòîê ÷åëîâåêà [8]. Òðåòèé òèï ÐÍÊ, èìïîðòèðóþùåéñÿ â ìèòîõîíäðèè ìëåêîïèòàþùèõ, — ýòî 5S ðÐÍÊ [9, 10]. Ýòà ÐÍÊ îáû÷íî ÿâëÿåòñÿ ñòðóêòóðíîé ñîñòàâëÿþùåé áîëüøîé ðèáîñîìíîé ñóáúåäèíèöû. Îíà ñîñòîèò èç òðåõ ÷åòêî âûäåëåííûõ äîìåíîâ; îáùàÿ äëèíà ìîëåêóëû ñîñòàâëÿåò îêîëî 120 íóêëåîòèäîâ [11]. Áûëî ïîêàçàíî, ÷òî ýëåìåíòû, âàæíûå äëÿ èìïîðòà â ìèòîõîíäðèè, ðàñïîëàãàþòñÿ ëèøü â äâóõ èç ýòèõ äîìåíîâ; ïðè ýòîì ëþáûå ìóòàöèè (è äàæå áîëüøèå âñòàâêè) â òðåòüåì äîìåíå íèêàê íå âëèÿëè íà ýôôåêòèâíîñòü èìïîðòà [12].  ðàçðàáîòàííîé äëÿ èçó÷åíèÿ ìåõàíèçìîâ èìïîðòà 5S ðÐÍÊ ñèñòåìå in vitro áûëî ïîêàçàíî, ÷òî äàííûé ïðîöåññ çàâèñèò îò ÀÒÔ è ìåìáðàííîãî ïîòåíöèàëà ìèòîõîíäðèé, à òàêæå òðåáóåò ïðèñóòñòâèÿ ðàñòâîðèìûõ öèòîçîëüíûõ áåëêîâ [13]. Âïîñëåäñòâèè áûëà ðåêîíñòðóèðîâàíà ìèíèìàëüíàÿ ñèñòåìà èìïîðòà 5S ðÐÍÊ â èçîëèðîâàííûå ìèòîõîíäðèè êëåòîê ÷åëîâåêà, ñîñòîÿùàÿ èç äâóõ òàêèõ áåëêîâ — ìèòîõîíäðèàëüíîé òèîñóëüôàòñóëüôîòðàíñôåðàçû, èëè ðîäàíåçû [14], è ïðåäøåñòâåííèêà ìèòîõîíäðèàëüíîãî ðèáîñîìíîãî áåëêà L18 [15]. Ôóíêöèîíàëüíûå ýêñïåðèìåíòû ïîçâîëèëè óñòàíîâèòü öåïî÷êó ñîáûòèé, ïðîèñõîäÿùèõ ñ 5S ðÐÍÊ äî åå ïðîíèêíîâåíèÿ ÷åðåç ìèòîõîíäðèàëüíûå ìåìáðàíû. Òðàíñïîðòèðóÿñü èç ÿäðà â öèòîçîëü ïîñëå òðàíñêðèïöèè, 5S ðÐÍÊ ïî÷òè ñðàçó æå ñâÿçûâàåòñÿ ñ ðèáîñîìíûì áåëêîì L5 è âñòðàèâàåòñÿ â ñîñòàâ âíîâü ñîáèðàåìûõ öèòîçîëüíûõ ðèáîñîì [11]. Îäíàêî íåáîëüøàÿ ÷àñòü ìîëåêóë 5S ðÐÍÊ âìåñòî ýòîãî ìîæåò ñâÿçûâàòüñÿ ñ ïðåäøåñòâåííèêîì ìèòîõîíäðèàëüíîãî ðèáîñîìíîãî áåëêà L18. Äàëåå òàêàÿ 5S ðÐÍÊ ïåðåäàåòñÿ íà ðîäàíåçó, ïðè÷åì ôîðìèðîâàíèå äàííîãî êîìïëåêñà ïðîèñõîäèò êîòðàíñëÿöèîííî (ò.å. êîìïëåêñ ñ ðîäàíåçîé îáðàçóåòñÿ íåïîñðåäñòâåííî â ïðîöåññå ðèáîñîìíîãî ñèíòåçà ïîñëåäíåé). Ðîäàíåçà â äàííîì êîìïëåêñå ôåðìåíòàòèâíî íåàêòèâíà; ñòðóêòóðà 5S ðÐÍÊ â ýòîì êîìïëåêñå òàêæå îòëè÷àåòñÿ îò êàíîíè÷åñêîé [14, 15]. Ïîñëå ýòîãî 5S ðÐÍÊ èìïîðòèðóåòñÿ â ìèòîõîíäðèè; äàííûé ïðîöåññ, êàê óæå óïîìèíàëîñü âûøå, çàâèñèò îò ôåðìåíòà ìåæìåìáðàííîãî ïðîñòðàíñòâà ÏÍÏàçû [5]. Òàêèì îáðàçîì, èìïîðò 5S ðÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè êëåòîê ÷åëîâåêà â ÷àñòè ñîáûòèé, ïðîèñõîäÿùèõ ñ ÐÍÊ â öèòîçîëå, íàïîìèíàåò àíàëîãè÷íûå ïðîöåññû â õîäå èìïîðòà òÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè äðîææåé Saccharomy- 33 ces cerevisiae: â äàííîì ñëó÷àå òàêæå èìååò ìåñòî ïîñëåäîâàòåëüíîå ñâÿçûâàíèå ÐÍÊ ñ äâóìÿ öèòîçîëüíûìè áåëêîâûìè ôàêòîðàìè, íåïîñðåäñòâåííî ïðåäøåñòâóþùåå èìïîðòó [16, 17]. Àáñîëþòíî íåÿñíûì îñòàåòñÿ âîïðîñ î ôóíêöèè 5S ðÐÍÊ â ìàòðèêñå ìèòîõîíäðèé. Êàê òîëüêî ñòàëî ÿñíî, ÷òî äàííàÿ ìîëåêóëà ïðèñóòñòâóåò â ìèòîõîíäðèÿõ, áûëî âûñêàçàíî ïðåäïîëîæåíèå î òîì, ÷òî îíà âõîäèò â ñîñòàâ ìèòîõîíäðèàëüíûõ ðèáîñîì è ïðèíèìàåò, òàêèì îáðàçîì, ó÷àñòèå â áèîñèíòåçå áåëêà â îðãàíåëëàõ. Òîìó áûëè ïîëó÷åíû êîñâåííûå ïîäòâåðæäåíèÿ. Âî-ïåðâûõ, êîëè÷åñòâî ìîëåêóë 5S ðÐÍÊ â ìèòîõîíäðèÿõ ÷ðåçâû÷àéíî áëèçêî ê êîëè÷åñòâó ìèòîõîíäðèàëüíûõ ðèáîñîì [13]. Âî-âòîðûõ, ïîäàâëåíèå ýêñïðåññèè ãåíà ðîäàíåçû ìåòîäîì ÐÍÊ-èíòåðôåðåíöèè ïðèâîäèëî ê çíà÷èòåëüíîìó óìåíüøåíèþ êîëè÷åñòâà 5S ðÐÍÊ â ìèòîõîíäðèÿõ è îäíîâðåìåííî ê ïðîïîðöèîíàëüíîìó îñëàáëåíèþ ìèòîõîíäðèàëüíîé òðàíñëÿöèè [14]. Â-òðåòüèõ, ìåòîäîì êîèììóíîïðåöèïèòàöèè áûëî ïîêàçàíî, ÷òî 5S ðÐÍÊ àññîöèèðîâàíà ñ ìèòîõîíäðèàëüíûìè ðèáîñîìàìè [15]. Îäíàêî ñòðóêòóðíûå èññëåäîâàíèÿ, ïðîâåäåííûå ìåòîäàìè ðåíòãåíî-ñòðóêòóðíîãî àíàëèçà [18] è êðèîýëåêòðîííîé ìèêðîñêîïèè [19], ïîêàçàëè, ÷òî â òîì ó÷àñòêå, ãäå äîëæíà ïðèñóòñòâîâàòü 5S ðÐÍÊ, â ìèòîõîíäðèàëüíûõ ðèáîñîìàõ ìëåêîïèòàþùèõ íàõîäèòñÿ òà èëè èíàÿ ìèòîõîíäðèàëüíàÿ òÐÍÊ. Òåì íå ìåíåå ýòî íå ÿâëÿåòñÿ îêîí÷àòåëüíûì îòâåòîì íà âîïðîñ î ïðèñóòñòâèè 5S ðÐÍÊ â ñîñòàâå ìèòîõîíäðèàëüíûõ ðèáîñîì. Âîçìîæíà ñèòóàöèÿ, êîãäà òÐÍÊ ñâÿçûâàåòñÿ ñ íèìè äëÿ ïðåäîòâðàùåíèÿ àññîöèàöèè ñóáúåäèíèö â öåëóþ ðèáîñîìó, à â ñîñòàâå ïîëíîðàçìåðíûõ ôóíêöèîíàëüíûõ ðèáîñîì ïðèñóòñòâóåò èìåííî 5S ðÐÍÊ. Ê ñîæàëåíèþ, â íàñòîÿùåå âðåìÿ ïðîâåðèòü ýòó ãèïîòåçó ïðåäñòàâëÿåòñÿ çàòðóäíèòåëüíûì, ïîñêîëüêó äëÿ ýòîãî òðåáóåòñÿ ñèñòåìà ìèòîõîíäðèàëüíîé òðàíñëÿöèè in vitro, êîòîðàÿ, íåñìîòðÿ íà âñå óñèëèÿ èññëåäîâàòåëåé, òàê è íå áûëà ðàçðàáîòàíà — íèêàêèìè ìåòîäàìè íå óäàâàëîñü âûäåëèòü èç ìèòîõîíäðèé ðèáîñîìû, êîòîðûå áûëè áû àêòèâíû â îòíîøåíèè ïðèðîäíûõ ìèòîõîíäðèàëüíûõ ìÐÍÊ. Íåñìîòðÿ íà òî ÷òî in vivo òÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè ìëåêîïèòàþùèõ íå ïðîíèêàþò, áûëî ïîêàçàíî, ÷òî èìïîðòèðóåìàÿ äðîææåâàÿ òÐÍÊ ïðîíèêàåò â èçîëèðîâàííûå ìèòîõîíäðèè êëåòîê ÷åëîâåêà, ïðè÷åì ýòîò ïðîöåññ ìîæåò îáåñïå÷èâàòüñÿ êàê äðîææåâûì, òàê è ÷åëîâå÷åñêèì êëåòî÷íûì áåëêîâûì ýêñòðàêòîì [13]. Òàêèì îáðàçîì, â êëåòêàõ ÷åëîâåêà ñîäåðæàòñÿ âñå íåîáõîäèìûå äëÿ èìïîðòà òÐÍÊ ôàêòîðû, à òîò ôàêò, ÷òî ÷åëîâå÷åñêèå òÐÍÊ íå èìïîðòèðóþòñÿ â ìèòîõîíäðèè, îáúÿñíÿåòñÿ çíà÷èòåëüíûì îòëè÷èåì èõ ñòðóêòóð îò ñòðóêòóðû èìïîðòèðóåìîé äðîææåâîé òÐÍÊ. Ýòî ïîäòâåðæäàåòñÿ òåì, ÷òî ÷åëîâå÷åñêèå áåëêè — îðòîëîãè äðîææåâûõ ôàêòîðîâ èìïîðòà òÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè — ó÷àñòâóþò â íàïðàâëåíèè äðîææåâîé òÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè êëåòîê ÷åëîâåêà [20]. 34 Èíòåðåñíî, ÷òî ïîìèìî èìïîðòèðóåìîé äðîææåâîé òÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè ÷åëîâåêà èìïîðòèðóþòñÿ òàêæå åå ìóòàíòíûå âåðñèè è íåêîòîðûå äðóãèå äðîææåâûå òÐÍÊ [13]. Ýêñïðåññèðóÿñü â êëåòêàõ ÷åëîâåêà, ýòè òÐÍÊ ýôôåêòèâíî àìèíîàöèëèðóþòñÿ ëèçèíîì è ïðîíèêàþò â ìèòîõîíäðèè [21]. Áîëåå òîãî, ïðè ïîìîùè òàêîãî “èñêóññòâåííîãî” èìïîðòà óäàëîñü äîñòèãíóòü ñóùåñòâåííîãî ïðîãðåññà â ðàçðàáîòêå ãåííî-òåðàïåâòè÷åñêèõ ïîäõîäîâ ê ëå÷åíèþ òàê íàçûâàåìûõ ìèòîõîíäðèàëüíûõ áîëåçíåé. Ìóòàöèè â ìèòîõîíäðèàëüíîì ãåíîìå ÷åëîâåêà âñòðå÷àþòñÿ ñ äîñòàòî÷íî âûñîêîé ÷àñòîòîé (îêîëî 1:250 â îáùå÷åëîâå÷åñêîé ïîïóëÿöèè) è ÷àñòî ïðèâîäÿò ê ðàçâèòèþ òÿæåëûõ íàñëåäñòâåííûõ çàáîëåâàíèé (îáû÷íî — ðàçëè÷íûõ òèïîâ íåéðîìûøå÷íûõ äèñòðîôèé) [22]. Áîëüøå ïîëîâèíû îïèñàííûõ íà ñåãîäíÿøíèé äåíü ïàòîãåííûõ ìèòîõîíäðèàëüíûõ ìóòàöèé — ýòî òî÷å÷íûå ìóòàöèè â ãåíàõ ìèòîõîíäðèàëüíûõ òÐÍÊ. Èñïîëüçóÿ èìïîðò ïðîèçâîäíûõ äðîææåâûõ òÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè ìóòàíòíûõ êëåòîê ÷åëîâåêà â êóëüòóðå, óäàëîñü äîñòè÷ü ñóïðåññèè ìóòàöèé â ãåíàõ ëèçèíîâîé [21, 23] è ëåéöèíîâîé [24] òÐÍÊ (äâóõ ñàìûõ ðàñïðîñòðàíåííûõ ìóòàöèé â ìèòîõîíäðèàëüíîì ãåíîìå). Èìïîðòèðóåìûå òÐÍÊ âêëþ÷àëèñü â ìèòîõîíäðèàëüíóþ òðàíñëÿöèþ âìåñòî ìóòàíòíûõ ìîëåêóë, ÷òî ïðèâîäèëî ê íîðìàëèçàöèè äàííîãî ïðîöåññà è êàê ñëåäñòâèå — ê îáùåìó âîññòàíîâëåíèþ ìèòîõîíäðèàëüíîé ôóíêöèè ìóòàíòíûõ êëåòîê è ê èñ÷åçíîâåíèþ ìóòàíòíîãî ôåíîòèïà. Äàëåêî íå âñå ìóòàöèè â ìèòîõîíäðèàëüíîì ãåíîìå ïàòîãåííû. Äåëî â òîì, ÷òî ôàêò ôåíîòèïè÷åñêîãî ïðîÿâëåíèÿ òàêèõ ìóòàöèé çàâèñèò îò êîëè÷åñòâåííîãî ñîîòíîøåíèÿ íîðìàëüíûõ è ìóòàíòíûõ êîïèé ìèòîõîíäðèàëüíîé ÄÍÊ â êëåòêå. Ïðè ýòîì â áîëüøèíñòâå ñëó÷àåâ äîëÿ ìóòàíòíûõ ìîëåêóë (íàçûâàåìàÿ òàêæå ãåòåðîïëàçìèåé) íå ïðåâûøàåò íåñêîëüêèõ ïðîöåíòîâ, à ñîîòâåòñòâóþùèå ñèìïòîìû ïðîÿâëÿþòñÿ ó ïàöèåíòîâ íà÷èíàÿ ñ óðîâíÿ ãåòåðîïëàçìèè 65—70%. Òàêèì îáðàçîì, íàïðàâëåííûé ñäâèã óðîâíÿ ãåòåðîïëàçìèè â ñòîðîíó óìåíüøåíèÿ äîëè ìóòàíòíûõ ìîëåêóë ìîã áû ïðèâåñòè ê èñ÷åçíîâåíèþ ñèìïòîìîâ çàáîëåâàíèé. Ìîäóëÿöèÿ óðîâíÿ ãåòåðîïëàçìèè â ìóòàíòíûõ êëåòêàõ ÷åëîâåêà òàêæå âîçìîæíà ïðè ïîìîùè ïðîöåññîâ èìïîðòà ÐÍÊ â ìèòîõîíäðèè. Ôóíäàìåíòàëüíûå îñíîâû ýòîãî ïîäõîäà áûëè çàëîæåíû â 2010 ã., êîãäà ïðè ïîìîùè ìåòîäà in vitro ñåëåêöèè íà îñíîâå äðîææåâîé èìïîðòèðóåìîé òÐÍÊ áûëè ñîçäàíû ìîëåêóëû ÐÍÊ, îáëàäàþùèå ÷ðåçâû÷àéíî âûñîêîé ýôôåêòèâíîñòüþ èìïîðòà â ìèòîõîíäðèè (â ñîòíè ðàç âûøå, ÷åì èìïîðòèðóåìàÿ äðîææåâàÿ òÐÍÊ) [25]. Çàòåì áûëî ïîêàçàíî, ÷òî òàêèå ÐÍÊ èìïîðòèðóþòñÿ è â ìèòîõîíäðèè êëåòîê ÷åëîâåêà, ïðè÷åì òàêæå ñ î÷åíü âûñîêîé ýôôåêòèâíîñòüþ. Áûë èäåíòèôèöèðîâàí ñòðóêòóðíûé ýëåìåíò òàêèõ ìîëåêóë (îñîáàÿ øïèëüêà), êîòîðûé îïðåäåëÿåò âûñîêóþ ýôôåêòèâíîñòü èìïîðòà ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2015. ¹ 3 â ìèòîõîíäðèè. Íàêîíåö, óäàëîñü ïîêàçàòü, ÷òî äðóãèå ÷àñòè ìîëåêóë ÐÍÊ, ïîìèìî ýòîé øïèëüêè, íå îêàçûâàþò ñóùåñòâåííîãî âëèÿíèÿ íà ýôôåêòèâíîñòü ïðîöåññà òðàíñïîðòà â ìèòîõîíäðèè [25]. Òàêèì îáðàçîì, ïîäîáíûå ìîëåêóëû ÐÍÊ ìîæíî èñïîëüçîâàòü â êà÷åñòâå “âåêòîðîâ” äëÿ íàïðàâëåííîé äîñòàâêè íóêëåèíîâûõ êèñëîò â ìèòîõîíäðèè. Äàííûé ïîäõîä áûë âïåðâûå àïðîáèðîâàí íà êëåòêàõ ÷åëîâåêà, ÷åé ìèòîõîíäðèàëüíûé ãåíîì ñîäåðæèò ïðîòÿæåííóþ äåëåöèþ (îêîëî òðåòè âñåãî ãåíîìà ìèòîõîíäðèé).  ðåçóëüòàòå äàííîé äåëåöèè â ìîëåêóëàõ ìèòîõîíäðèàëüíîé ÄÍÊ ïîÿâëÿåòñÿ óíèêàëüíûé ó÷àñòîê, êîòîðîãî íåò â íåìóòàíòíûõ ìîëåêóëàõ. Áûëà ñêîíñòðóèðîâàíà õèìåðíàÿ ÐÍÊ, ñîäåðæàùàÿ âûøåîïèñàííûé ñèãíàë âûñîêîýôôåêòèâíîãî èìïîðòà â ìèòîõîíäðèè è ñëèòóþ ñ íåé ïîñëåäîâàòåëüíîñòü íóêëåîòèäîâ, êîìïëåìåíòàðíóþ óíèêàëüíîìó ó÷àñòêó ìóòàíòíîé ìèòîõîíäðèàëüíîé ÄÍÊ. Äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ ïîêàçàëè, ÷òî òàêàÿ ÐÍÊ ïîñëå òðàíñôåêöèè ýôôåêòèâíî èìïîðòèðóåòñÿ â ìèòîõîíäðèè è èçáèðàòåëüíî ñâÿçûâàåòñÿ èìåííî ñ ìóòàíòíûìè ìîëåêóëàìè ìèòîõîíäðèàëüíîãî ãåíîìà. Ýòî ïðèâîäèò ê èíãèáèðîâàíèþ èõ ðåïëèêàöèè è óìåíüøåíèþ óðîâíÿ ãåòåðîïëàçìèè [26]. Êàê ñëåäñòâèå — âîññòàíàâëèâàåòñÿ íîðìàëüíûé ôåíîòèï. Êàê ýòî íè óäèâèòåëüíî, ïîäîáíûé “àíòèãåíîìíûé” ïîäõîä ê ñóïðåññèè ìóòàöèé â ìèòîõîíäðèàëüíîì ãåíîìå ïðèìåíèì íå òîëüêî äëÿ ïðîòÿæåííûõ äåëåöèé, íî è äëÿ òî÷å÷íûõ ìóòàöèé. Áûëî ñî âñåé îïðåäåëåííîñòüþ ïîêàçàíî, ÷òî ïðè ïðàâèëüíî ïîäîáðàííîé ñòðóêòóðå “òåðàïåâòè÷åñêîãî” ó÷àñòêà èìïîðòèðóåìîé ÐÍÊ ïîñëå åå èìïîðòà â ìèòîõîíäðèè ïðîèñõîäèò ñåëåêòèâíîå ñâÿçûâàíèå èìåííî ñ ìóòàíòíûìè ìîëåêóëàìè ÄÍÊ îðãàíåëë (õîòÿ â äàííîì ñëó÷àå ýòè ìîëåêóëû îòëè÷àëèñü îò íåìóòàíòíûõ âñåãî îäíèì íóêëåîòèäîì). Òàêîå ñâÿçûâàíèå òàêæå ïðèâîäèò ê èíãèáèðîâàíèþ ðåïëèêàöèè ìóòàíòíûõ ÄÍÊ è ê óìåíüøåíèþ èõ äîëè îòíîñèòåëüíî îáùåãî êîëè÷åñòâà ìîëåêóë ìèòîõîíäðèàëüíîãî ãåíîìà [27]. Òàêèì îáðàçîì, çà ïîñëåäíèå ãîäû èññëåäîâàòåëÿìè äîñòèãíóò çíà÷èòåëüíûé ïðîãðåññ â ðàçðàáîòêå ìåòîäîâ ëå÷åíèÿ íàñëåäñòâåííûõ áîëåçíåé ÷åëîâåêà, ñâÿçàííûõ ñ ìóòàöèÿìè â ìèòîõîíäðèàëüíîì ãåíîìå. Òåì íå ìåíåå äàëüíåéøèå ðàáîòû â ýòîì íàïðàâëåíèè íåîáõîäèìû, òàê êàê ñóùåñòâóþùèå ñïîñîáû õàðàêòåðèçóþòñÿ ðÿäîì ñóùåñòâåííûõ íåäîñòàòêîâ, ïðåæäå âñåãî îòñóòñòâèåì óíèâåðñàëüíîñòè. *** Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ïîääåðæêå Ìèíèñòåðñòâà îáðàçîâàíèÿ è íàóêè ÐÔ (Ôåäåðàëüíàÿ öåëåâàÿ ïðîãðàììà “Èññëåäîâàíèÿ è ðàçðàáîòêè ïî ïðèîðèòåòíûì íàïðàâëåíèÿì ðàçâèòèÿ íàó÷íî-òåõíîëîãè÷åñêîãî êîìïëåêñà Ðîññèè íà 2014—2020 ãîäû”, ñîãëàøåíèå ¹ 14.604.21.0113, èäåíòèôèêàòîð RFMEFI60414X0008). ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2015. ¹ 3 35 ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ 1. Schneider A. Mitochondrial tRNA import and its consequences for mitochondrial translation // Annu. Rev. Biochem. 2011. Vol. 80. P. 1033—1053. 2. Chang D.D., Clayton D.A. A mammalian mitochondrial RNA processing activity contains nucleus-encoded RNA // Science. 1987. Vol. 235. N 4793. P. 1178—1184. 3. Li K., Smagula C.S., Parsons W.J., Richardson J.A., Gonzalez M., Hagler H.K., Williams R.S. Subcellular partitioning of MRP RNA assessed by ultrastructural and biochemical analysis // J. Cell Biol. 1994. Vol. 124. N 6. P. 871—882. 4. Doersen C.J., Guerrier-Takada C., Altman S., Attardi G. Characterization of an RNase P activity from HeLa cell mitochondria. Comparison with the cytosol RNase P activity // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. N 10. P. 5942—5949. 5. Wang G., Chen H.W., Oktay Y., Zhang J., Allen E.L., Smith G.M., Fan K.C., Hong J.S., French S.W., McCaffery J.M., Lightowlers R.N., Morse H.C. III, Koehler C.M., Teitell M.A. PNPASE regulates RNA import into mitochondria // Cell. 2010. Vol. 142. N 3. P. 456—467. 6. Wang G., Shimada E., Koehler C.M., Teitell M.A. PNPASE and RNA trafficking into mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 2012. Vol. 1819. N 9—10. P. 998—1007. 7. Rainey R.N., Glavin J.D., Chen H.W., French S.W., Teitell M.A., Koehler C.M. A new function in translocation for the mitochondrial i-AAA protease Yme1: import of polynucleotide phosphorylase into the intermembrane space // Mol. Cell Biol. 2006. Vol. 26. N 22. P. 8488—8497. 8. Wang G., Shimada E., Zhang J., Hong J.S., Smith G.M., Teitell M.A., Koehler C.M. Correcting human mitochondrial mutations with targeted RNA import // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109. N 13. P. 4840—4845. 9. Yoshionari S., Koike T., Yokogawa T., Nishikawa K., Ueda T., Miura K., Watanabe K. Existence of nuclearencoded 5S-rRNA in bovine mitochondria // FEBS Lett. 1994. Vol. 338. N 2. P. 137—142. 10. Magalhaes P.J., Andreu A.L., Schon E.A. Evidence for the presence of 5S rRNA in mammalian mitochondria // Mol. Biol. Cell. 1998. Vol. 9. N 9. P. 2375—2382. 11. Smirnov A.V., Entelis N.S., Krasheninnikov I.A., Martin R., Tarassov I.A. Specific features of 5S rRNA structure — its interactions with macromolecules and possible functions // Biochemistry (Mosc.). 2008. Vol. 73. N 13. P. 1418—1437. 12. Smirnov A., Tarassov I., Mager-Heckel A.M., Letzelter M., Martin R.P., Krasheninnikov I.A., Entelis N. Two distinct structural elements of 5S rRNA are needed for its import into human mitochondria // RNA. 2008. Vol. 14. N 4. P. 749—759. 13. Entelis N.S., Kolesnikova O.A., Dogan S., Martin R.P., Tarassov I.A. 5S rRNA and tRNA import into human mitochondria. Comparison of in vitro requirements // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. N 49. P. 45642—45653. 14. Smirnov A., Comte C., Mager-Heckel A.M., Addis V., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Entelis N., Tarassov I. Mitochondrial enzyme rhodanese is essential for 5S ribosomal RNA import into human mitochondria // J. Biol. Chem. 2010. Vol. 285. N 40. P. 30792—30803. 15. Smirnov A., Entelis N., Martin R.P., Tarassov I. Biological significance of 5S rRNA import into human mi- tochondria: role of ribosomal protein MRP-L18 // Genes Dev. 2011. Vol. 25. N 12. P. 1289—1305. 16. Entelis N., Brandina I., Kamenski P., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Tarassov I. A glycolytic enzyme, enolase, is recruited as a cofactor of tRNA targeting toward mitochondria in Saccharomyces cerevisiae // Genes Dev. 2006. Vol. 20. N 12. P. 1609—1620. 17. Kamenski P., Smirnova E., Kolesnikova O., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Entelis N., Tarassov I. tRNA mitochondrial import in yeast: Mapping of the import determinants in the carrier protein, the precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase // Mitochondrion. 2010. Vol. 10. N 3. P. 284—293. 18. Brown A., Amunts A., Bai X. C., Sugimoto Y., Edwards P.C., Murshudov G., Scheres S.H., Ramakrishnan V. Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria // Science. 2014. Vol. 346. N 6210. P. 718—722. 19. Greber B.J., Boehringer D., Leibundgut M., Bieri P., Leitner A., Schmitz N., Aebersold R., Ban N. The complete structure of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome // Nature. 2014. Vol. 515. N 7526. P. 283—286. 20. Gowher A., Smirnov A., Tarassov I., Entelis N. Induced tRNA import into human mitochondria: implication of a host aminoacyl-tRNA-synthetase // PLoS One. 2013. Vol. 8. N 6. P. e66228. 21. Kolesnikova O.A., Entelis N.S., Jacquin-Becker C., Goltzene F., Chrzanowska-Lightowlers Z.M., Lightowlers R.N., Martin R.P., Tarassov I. Nuclear DNA-encoded tRNAs targeted into mitochondria can rescue a mitochondrial DNA mutation associated with the MERRF syndrome in cultured human cells // Hum. Mol. Genet. 2004. Vol. 13. N 20. P. 2519—2534. 22. Patrushev M.V., Kamenski P.A., Mazunin I.O. Mutations in mitochondrial DNA and approaches for their correction // Biochemistry (Mosk.). 2014. Vol. 79. N 11. P. 1151—1160. 23. Kolesnikova O.A., Entelis N.S., Mireau H., Fox T.D., Martin R.P., Tarassov I.A. Suppression of mutations in mitochondrial DNA by tRNAs imported from the cytoplasm // Science. 2000. Vol. 289. N 5486. P. 1931—1933. 24. Karicheva O.Z., Kolesnikova O.A., Schirtz T., Vysokikh M.Y., Mager-Heckel A.M., Lombes A., Boucheham A., Krasheninnikov I.A., Martin R.P., Entelis N., Tarassov I. Correction of the consequences of mitochondrial 3243A>G mutation in the MT-TL1 gene causing the MELAS syndrome by tRNA import into mitochondria // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39. N 18. P. 8173—8186. 25. Kolesnikova O., Kazakova H., Comte C., Steinberg S., Kamenski P., Martin R.P., Tarassov I., Entelis N. Selection of RNA aptamers imported into yeast and human mitochondria // RNA. 2010. Vol. 16. N 5. P. 926—941. 26. Comte C., Tonin Y., Heckel-Mager A.M., Boucheham A., Smirnov A., Aure K., Lombes A., Martin R.P., Entelis N., Tarassov I. Mitochondrial targeting of recombinant RNAs modulates the level of a heteroplasmic mutation in human mitochondrial DNA associated with Kearns Sayre Syndrome // Nucleic Acids Res. 2013. Vol. 41. N 1. P. 418—433. 27. Tonin Y., Heckel A.M., Vysokikh M., Dovydenko I., Meschaninova M., Rotig A., Munnich A., Venyaminova A., Tarassov I., Entelis N. Modeling of antigenomic 36 ÂÅÑÒÍ. ÌÎÑÊ. ÓÍ-ÒÀ. ÑÅÐ. 16. ÁÈÎËÎÃÈß. 2015. ¹ 3 therapy of mitochondrial diseases by mitochondrially addressed RNA targeting a pathogenic point mutation in mi- tochondrial DNA // J. Biol. Chem. 2014. Vol. 289. N 19. P. 13323—13334. Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 01.12.2014 RNA IMPORT INTO MITOCHONDRIA AND ITS USE IN THE GENE THERAPY V.A. Lakunina, M.V. Baleva, S.A. Levitskii, I.V. Chicherin, I.A. Krasheninnikov, E.O. Samoylova, P.A. Kamenski Among biological macromolecules imported into the eukaryotic cells mitochondria, there are proteins and ribonucleic acids. Protein import into mitochondria is a universal process, and its mechanisms are currently well described. RNA import into mitochondria, on the contrary, is known only for several eukaryotic species, and the mechanisms of this process are largely species-specific. In this review, we summarize existing data about RNA import into mitochondria of human cells and discuss the possibilities of its implication for the gene therapy of mitochondrial diseases. Key words: mitochondria, RNA, RNA import into mitochondria, gene therapy, review. Ñâåäåíèÿ îá àâòîðàõ Ëàêóíèíà Âàëåíòèíà Àëåêñàíäðîâíà — àñïèðàíò êàôåäðû ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939-54-85; e-mail: carrie8@yandex.ru Áàëåâà Ìàðèÿ Âÿ÷åñëàâîâíà — àñïèðàíò êàôåäðû ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939-54-85; e-mail: mary-bw@mail.ru Ëåâèöêèé Ñåðãåé Àëåêñååâè÷ — êàíä. áèîë. íàóê, ñò. íàó÷. ñîòð. êàôåäðû ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939-54-85; e-mail: krolick@yandex.ru ×è÷åðèí Èâàí Âëàäèìèðîâè÷ — àñïèðàíò êàôåäðû ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939-54-85; e-mail: i.v.chicherin@gmail.com Êðàøåíèííèêîâ Èãîðü Àëåêñàíäðîâè÷ — êàíä áèîë. íàóê, ïðîô. êàôåäðû ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939-54-85; e-mail: igor@protrin.bio.msu.ru Ñàìîéëîâà Åëåíà Îëåãîâíà — ìë. íàó÷. ñîòð. êàôåäðû ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939-54-85; e-mail: elen.samoylova@yandex.ru Êàìåíñêèé ϸòð Àíäðååâè÷ — êàíä. áèîë. íàóê, âåä. íàó÷. ñîòð. êàôåäðû ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ. Òåë.: 8-495-939-54-85; e-mail: peter@protein.bio.msu.ru
