Проф. Л.П.Сычева, НИИ экологии человека и гигиены

Цитогенетический мониторинг
в экологической эпидемиологии
Сычева Людмила Петровна, д.б.н., профессор,
зав.лабораторией генетического мониторинга
INTERNATIONAL SCIENTIFIC WORKSHOP
YOUNG SCIENTISTS SCHOOL
ENVIRONMENTAL EPIDEMIOLOGY AND TOXICOLOGY:
FOCUS ON EPIGENETICS
December, 07, 2015
НИИ экологии человека и гигиены
окружающей среды им. А.Н. Сысина
Минздрава России, г. Москва
1
Определение
Мониторинг (monitoring) – слежение, контроль
Цели генетического мониторинга:
• Слежение за появлением и накоплением в
окружающей среде генотоксичных и мутагенных
соединений
• Контроль мутационного груза в популяциях
человека
2
Генетический мониторинг
Отдельных
факторов
окружающей
среды
Физических
Объектов
окружающей
среды
Атмосферного
воздуха
Воды
Химических
Почвы
Биологических
Продуктов
питания
Биологических
объектов:
популяций
человека
Генетических
повреждений
клеток
Последствий
генетических
повреждений
3
Основные подходы к проведению
генетического мониторинга
 Анализ суммарной мутагенной активности объектов
окружающей среды (воздуха, воды, почвы, отходов)
 Натурные исследования на растительных и животных
объектах в условиях производства и в экологически
опасных регионах
 Генетический мониторинг населения, проживающего в
условиях загрязнения окружающей среды
Генетический мониторинг популяций человека
Актуальность
(обоснование необходимости развития работ по генетическому
мониторингу)
• 10% вновь вводимых в среду веществ
характеризуются мутагенным действием
•  60-90% веществ не нормировано, и у еще большего
количества веществ не изучена мутагенная активность
или изучена в тестах на микробах (тесте Эймса)
• Воздействие факторов на организм – комплексное, что
не позволяет корректно оценить реальную нагрузку и
прогнозировать развитие патологии по содержанию
отдельных факторов ли групп факторов в среде
обитания.
5
Актуальность
• Все больше фактов о ведущей роли генома в развитии и
функционировании отдельных клеток, тканей, органов и
систем органов, а также организма в целом.
• Новые данные об этиологической роли нарушений в
строении генома и экспрессии генов при развитии и
течении онкологических и других заболеваний.
• Данные международных обследований в Европе (Hagmar et
al., 1998, Bonassi et al., 2005) о повышенных уровнях
онкопатологии через 20 лет у лиц с высоким уровнем
цитогенетических нарушений (хромосомных аберраций и
микроядер)
6
Методы генетического мониторинга
Биохимический мониторинг
(изучение полиморфизма белков крови человека)
 Цитогенетический мониторинг
Учет спонтанных абортов, врожденных пороков развития (ВПР),
врожденных морфогенетических вариантов (ВМГВ)
Учет «специфических фенотипов»
Поликистоз почек
1:400-1000
Нейрофиброматоз
1:2500-3000
Несовершенный
остеогенез
1:12000-15000
7
Ахондроплазия
1:15000-40000
Частоты наследственной патологии
в популяциях человека
(Н.П.Бочков,2001; В.И.Шевченко и соавт., 2003)
• Генные болезни – 1%
• Хромосомные болезни – 0,5%
• Врожденные пороки развития – 2% (по последним данным 3-5%)
• Болезни с наследственной предрасположенностью у детей – 1%
• Болезни с наследственной предрасположенностью, выявляемые
до 50 лет– 15%
• Болезни с наследственной предрасположенностью, выявляемые
до 70 лет – 60%
Генотоксичность- свойство химических
соединений взаимодействовать с ДНК,
изменяя ее структуру
Цитогенетическая активностьспособность фактора вызывать хромосомные
аберрации в митозе или микроядра
в интерфазе, определяемые под микроскопом
Мутагенная активность – способность
фактора вызывать генные, хромосомные
или геномные мутации
Кольман, Рем,
2000
Special issue of “Mutagenesis” 2011 V26,N1:
Micronuclei. Recent advances in there measurement
in understanding of molecular mechanisms and there
association with environment, genetics and disease.
Основные цитогенетические биомаркеры
в опытах на млекопитающих
ДНКповреждения
(тест ДНККомет)
Хромосомные
аберрации
Микроядро в
клетке
10
Сестринский хроматидный обмен (СХО) —
обмен участками между сестринскими хроматидами одной
хромосомы. Процесс обмена происходит во время репликации ДНК путём
гомологичной рекомбинации между сестринскими хроматидами
11
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals,
Section 4: Health Effects (400-488)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Test No. 451: Carcinogenicity Studies
Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test
Test No. 473: In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test
Test No. 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test
Test No. 475: Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test
Test No. 476: In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test
Test No. 477: Genetic Toxicology: Sex-Linked Recessive Lethal Test in
Drosophila melanogaster
Test No. 478: Genetic Toxicology: Rodent Dominant Lethal Test
Test No. 479: Genetic Toxicology: In vitro Sister Chromatid Exchange Assay in
Mammalian Cells
Test No. 480: Genetic Toxicology: Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation
Assay
Test No. 481: Genetic Toxicology: Saacharomyces cerevisiae, Miotic
Recombination Assay
Test No. 482: Genetic Toxicology: DNA Damage and Repair, Unscheduled DNA
Synthesis in Mammalian Cells in vitro
Test No. 483: Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test
Test No. 484: Genetic Toxicology: Mouse Spot Test
Test No. 485: Genetic toxicology, Mouse Heritable Translocation Assay
Test No. 486: Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver
Cells in vivo
12
Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test
Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays
(В.Г.Дружинин, 2003)
Результаты
картографирования
цитогенетических
эффектов
(средняя частота
аберрантных метафаз
в %)
у населения Кемеровской
области
Цитогенетические показатели
у жителей промышленных городов России
Город
Спонтанный уровень
Кемерово
Новокузнецк
Уфа
Чапаевск
Ярославль
Курск
Частота лимфоцитов с
хромосомными
аберрациями в %
Литература
1,5-2,5
3,3
3,3
2,6-3,3
4,9
3,2-6,4
1,6
Бочков Н.П., 1994, 1999
Дружинин В.Г., 2003
Дружинин В.Г., 2003
Викторова Т.В., 1993
Журков и соавт, 2001
Цуцман Т.Е.,
Крассов С.В.,
The International Human Micronucleus (HUMN)
Project, основан в 1997 г. www.humn.org
•
Обследовано 6718 чел из 10 стран при участии 20 лабораторий
между 1980 и 2002 г.
•
Значимое повышение частоты всех типов рака (особенно
урогенитального и желудочно-кишечного) отмечено в группах
со средней и высокой частотой
лимфоцитов с хромосомн. аберрациями или с
микроядрами
Получены доказательства, что повышенная частота лимфоцитов с
микроядрами является предиктивным биомаркером риска развития
рака в популяции здоровых людей (M.Fenech et al. 2014)
15
The Human Micronucleus Assay in exfoliated
cells (HUMNxl) Project,
основан в 2007 г. www.humn.org
• Обследовано более 15000 чел.
• Средняя частота клеток с микроядрами - 1,1 на
1000
• Коэффициент корреляции частоты буккальных
эпителиоцитов и лимфоцитов с микроядрами
R=0,74
•
Fenech M., Holland N., Zeiger E. et al., 2011
16
Преимущество эксфолиативных буккальных
клеток
Кожа – «зеркало» организма,
слизистая оболочка щеки –составная часть кожи
Более 90% злокачественных новообразований имеет
эпителиальное происхождение
Воздействие на слизистую оболочку рта:
●Пероральное (начало метаболизма),
● ингаляционное, ● через кровообращение
Простой способ получения препаратов: неинвазивно
(эксфолиативные клетки); не нужно культивировать
Большой объем цитоплазмы позволяет корректно
определять экстрануклеарные структуры
17
Полиорганный кариологический тест
Объекты исследования:
• Индивидуальная оценка
цитогенетического статуса человека
• Групповая оценка цитогенетического
статуса
Показатели
пролиферации
Микроядро
?
• Буккальный
эпителий
• Назальный
эпителий
Протрузия
Цитогенетические
показатели
Вакуолизация
Двуядерная клетка
Показатели деструкции
ядра (апоптоза)
Кариопикноз
Кариолизис
Клетки
человека
Кариорексис
• Уротелиальный
эпителий
• Бронхиальный
• Лимфоциты
Индекс накопления
цитогенетических повреждений
(Сычева , 2012 «Гигиена и
санитария», №6):
Iac= (Ic х Ip / Iapop) х 100
Три группы риска:
низкий (Iac 2)
умеренный (2<Iac <4)
высокий (Iac4)
18
Кариологические показатели
Классификация и диагностические признаки (Сычева Л.П., Мед. генетика №11, 2007)
Норма
Двуядерная
клетка
Перинуклеарная
вакуоль
Микроядро
Протрузия
Сдвоенные
ядра
Повреждение
ядерн. мембраны
Конденсация
хроматина
Начало
кариолизиса
19
Кариорексис
Пикноз
Кариолизис
20
Критерии оценки
цитогенетического статуса человека
(Сычева Л.П., Гигиена и санитария , 2012, №6)
1. Уровень цитогенетического стресса:
?
Три группы риска:
• Низкий – отсутствие превышения ориентировочных нормативных уровней
исследованных показателей
• Допустимый – превышение по показателям деструкции ядра и/или
пролиферации
• Высокий (группа риска) – превышение ориентировочного нормативного
уровня по цитогенетическим и другим показателям
2. Индекс накопления цитогенетических повреждений (Iac= (Ic х Ip / Iapop) х 100)
Три группы риска:
• Низкий (Индекс 2)
• Умеренный (2<Индекс <4)
• Высокий (Индекс 4)
21
22
23
Норма по индексу
24
Медицина 4П
Оценка
цитогенетического статуса
Прогностическая
Персонализированная
Норма, не стоит
беспокоится
Допустимый риск, через 2-3
месяца доп. анализ
Профилактическая
Партнерская
Высокий риск, выяснение
причин, доп.
обследование,
устранение причин,
коррекция
25
Выявление действующего фактора при обследовании людей
Доля людей в % с превышением Х±3
Доля (%) служащих офиса в помещениях с уровнем кариологических показателей,
превышающих х±3
(совместно с Ю.Д.Губернским, Н.В.Калининой)
90
80
70
60
Щека
Нос
Оба органа
50
40
30
20
10
0
26
Бактерии: кариологические показатели у служащих офиса в
зависимости от кондиционирования воздуха
Доля клеток в промилле
(совместно с Ю.Д.Губернским, Н.В.Калининой и др.)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1 кондиционер (170 КОЕ/м3)
3 кондиционер (30 КОЕ/м3)
В воздухе, поступающего в
помещения с конди-ционера 1
(т.е. на 24 и 25 этажи корпуса
А) выделен гемолитический
стафилококк. Воздух,
поступающий из
кондиционера 2 в помещения офиса, также был
дополнительно
контаминирован
стафилококками, из которых
50% составляли
гемолитические.
2 кондиционер (70 КОЕ/м3)
Наиболее высокие
уровни
цитогенетических
нарушений и апоптоза
отмечены в группе
детей с БА,
проживающих в
загрязненном районе.
R=1,97
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
*
*
14
*
12
Доля клеток в промилле
Доля клеток в промилле
Кариологические показатели
у детей г.Тулы в районах с разным уровнем загрязнения
атмосферного воздуха (М.М.Бяхова, 2008)
*
10
8
*
6
4
2
0
Привокзальный район ("чистый")
Пролетарский район ("грязный")
Сумма клеток с
двумя и более
ядрами
28
Апоптический
индекс
г.Тула, уровень цитогенетических
нарушений буккального эпителия
(диссертационное исследование М.М.
Бяховой, 2008)
• Привокзальный район - 0,08 ‰
• Центральный район – 0,33 ‰
• Советский район – 0,7 ‰
• Зареченский район - 0,81‰
• Пролетарский район – 0,89 ‰
29
Брюховецкая
Тимашевск
Доля клеток в промилле
Цитогенетические показатели и показатели
пролиферации назального эпителия детей,
проживающих в ст.Брюховецкая и в г.Тимашевске
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Слизистая оболочка щеки
Доля клеток в промилле
6
5
4
3
2
1
0
30
3
Контроль
Воздействие
2,5
2
1,5
1
Сумма 2Яд
Сдвоенные
ядра
Двуядерные
Атипичные
ядра
Сумма МЯ и
ПР
0
Протрузии
0,5
Микроядра
Доля клеток в промилле
Цитогенетические показатели и показатели пролиферации
клеток слизистой оболочки щеки у детей
4
г.Великий Новгород
3,5
31
Джамбетова П.М. и соавт.,
г. Грозный,
Чеченский государственный
университет
Долинск
Гойты
Мескер-Юрт
Эколого-географическое
положение изучаемых
населенных пунктов:
с.Гойты
с.Долинск
с.Мескер-Юрт
Физическая карта Чечено-Ингушской республики
Содержание нефтепродуктов и бенз(а)пирена
в почвах изучаемых населенных пунктов
Объект
исследования
Содержание
нефтепродуктов в
почве, мг/кг
2002 г.
2007 г.
Гойты
200
Долинск
15600
ПДК
нефтепро
дуктов
в почвах,
мкг/кг
Концентрация
бенз(а)пирена,
мг/кг
2002 г.
2007 г.
100
0,03
< 0,001
10200
0,15
0,066
>1000
Мескер-Юрт
11000
8100
ПДК
бенз(а)
пирена
в почвах,
мг/кг
0,02
1,83
0,548
*
*
*
*
* *
*
*
*
Доля детей в каждой из трех групп
цитогенетического стресса
Распределение детей на загрязненной территории
(с. Мескер-Юрт) и в контроле (с. Гойты)
по уровню цитогенетического стресса
(индексу накопления цитогенетических
повреждений)
100%
80%
60%
Гойты
40%
Долинск
Мескерт-Юрт
20%
0%
1
Iac= (Ic х Ip / Iapop) х 100
2
Группа цитогенетического стресса, расчет Iac
:низкий(Iac ≤ 2), умеренный (2 < Iac < 4) высокий
(Iac 4) Сычева, Гигиена и санитария, №6, 2012
3
Врожденные морфогенетические варианты
№
1
2
3
4
5
6
7
8
Название ВМГВ
Выступающий лоб
Выступающий затылок
Плоский затылок
Брахицефалия
Долихоцефалия
Мыс «вдовы»
Низкий рост волос на лбу
Гипертрихоз
№
30
31
32
33
34
35
36
37
Название ВМГВ
Гипертелоризм глаз
Гипотелоризм глаз
Телекант
Страбизм
Птоз
Экзофтальм
Гетерохромия радужки
Синофриз
59
60
61
62
63
64
65
66
Название ВМГВ
Витилиго
Лентиго
Невус (родинка)
Гемангиома
Гипертелоризм сосков
Дополнительные соски
Сакральная ямка
Широкое пупочное кольцо
9
Гипотрихоз
38
Голубые склеры
67
Расхождение прямых мышц живота
10
Алопеция
39
Плоское и широкое переносье
68
Шалевидная мошонка
11
Две макушки
40
Искривление носовой перегородки
69
Паховая грыжа
12
13
14
15
16
Низкий рост волос на шее
Короткая шея
Асимметрия ушей
Макротия
Микротия
41
42
43
44
45
Открытые вверх ноздри
Гиперплазия верхней челюсти
Гипоплазия верхней челюсти
Гиперплазия нижней челюсти
Гипоплазия нижней челюсти
70
71
72
73
74
Брахидактилия
Арахнодактилия
Клинодактилия
Камптодактилия
Широкие первые пальцы на кистях
17
Низкорасположенные и
46
Макростомия
75
Кожная синдактилия пальцев кисти
18
19
20
Ротированные назад уши
Упрощенная форма ушей
Чашеобразные ушные раковины
47
48
49
Микростомия
Короткий фильтр
Длинный фильтр
76
77
78
Короткий пятый палец
Утолщение ногтевых фаланг
Ломкие ногти
21
Пре- и аурикулярные выросты
50
Ямки на нижней губе
79
Поперечная ладонная складка
22
23
24
25
26
Бороздки на ушной раковине
Оттопыренные уши
Преаурикулярные фистулы
Асимметрия глаз
Блефарофимоз
51
52
53
54
55
Макроглоссия
Складчатый язык
Высокое небо
Раздвоение язычка
Аномальная форма зубов
80
81
82
83
84
Сиднеевская складка
Одна складка на мизинце
Широкие первые пальцы на стопах
Гипоплазия 1 пальца стопы
Гипоплазия 5 пальца стопы
27
Монголоидный разрез
56
Аномальный рост зубов
85
Кожная синдактилия пальцев стопы
28
29
Антимонголоидный разрез
Эпикант
57
58
Центральная диастема
Пятна «кофе с молоком»
86
87
Пяточная стопа
Сандалевидная щель
Подход к оценке влияния факторов окружающей среды
на генетическое здоровье детей
с использованием неинвазивных методов исследования
Качественный и количественный анализ факторов окружающей среды
Выбор групп воздействия и контроля среди организованного детского населения 5-8
лет
Анкетирование обследуемых
Оценка цитогенетического статуса детей в
Анализ врожденных морфогруппах воздействия и контроля с
генетических вариантов детей в
использованием кариологического
группах воздействия и контроля
анализа клеток буккального эпителия
Определение
биомаркеров
чувствительности
Формирование баз данных. Статистический анализ результатов. Сравнение
результатов в группах контроля и воздействия
Заключение о влиянии исследуемого фактора на цитогенетический статус и уровень
ВМГВ обследуемого населения
Частота клеток с цитогенетическими нарушениями (микроядрами)
в промилле у детей в городах России
(обведены синим – данные литературы)
0,2; 1,2
0,38; 0,66
0,38
0,19-0,42
0,66
1,3
1,17; 1,67
0,18; 0,35
0,5; 2,5
*
*
Совместные с РоссийскоВьетнамским центром
исследования:
«Оранжевый агент» смесь 2,4-Д и 2,4,5-Т,
содержал 30 мг/кг и более
2,3,7,8-ТХДД.
В почве 15-20 нг/кг (ОБУВ
– 9нг/кг)
В крови - 2,7 нг/л
Сычева и соавт., 2006
Определение
мутагенного
действия факторов
при обследовании
населения,
проживающего на
загрязненных
территориях
*
*
41
Этапы генетического мониторинга
• Картирование количественного содержания
мутагенов/канцерогенов для млекопитающих и
человека в регионе
• Выделение промышленных и сельскохозяйственных
объектов, представляющих наибольшую угрозу
генетическому здоровью населения
• Оценка суммарной мутагенной активности проб
атмосферного воздуха, воды, почвы для
подтверждения прогнозируемого генотоксического
действия выявленных факторов
Этапы генетического мониторинга
• Проведение популяционных генетических
исследований населения региона с учетом района
проживания и пр.
• Создание карт, характеризующих уровни
генотоксических эффектов у населения в разных
районах региона
• Создание компьютерных баз данных, включающих
региональные уровни показателей генетического
здоровья населения
и показатели загрязнения объектов окружающей
среды мутагенами/канцерогенами
lpsycheva@mail.ru
44