исследование роли карнозина в обучении крыс и регуляции

На правах рукописи
Бережной Даниил Сергеевич
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ КАРНОЗИНА В ОБУЧЕНИИ
КРЫС И РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО
ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В МОЗГЕ
специальность 03.03.01 – «физиология»
специальность 03.01.04 – «биохимия»
Автореферат диссертации
на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва – 2014
Работа выполнена на кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Московский государственный университет имени
М.В.Ломоносова» и в лаборатории нейрохимии Федерального государственного бюджетного
учреждения науки «Научный центр неврологии» РАМН.
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:
Доктор биологических наук
Иноземцев Анатолий Николаевич
Доктор биологических наук
Фёдорова Татьяна Николаевна
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Гарибова Таисия Леоновна
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории психофармакологии
Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научно-исследовательский
институт фармакологии имени В.В.Закусова» Российской академии медицинских наук.
Онуфриев Михаил Валерьевич
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории функциональной
биохимии нервной системы Федерального государственного бюджетного учреждения науки
«Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии» Российской академии наук.
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биофизики клетки»
Российской академии наук.
Защита состоится 15 декабря 2014 года в 15:30 на заседании диссертационного совета
Д 501.001.93 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по
адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1 стр.12, биологический факультет Московского
государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного
университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан «14» ноября 2014 года.
Учёный секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук
Умарова Белла Анверовна
1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Изучение процессов высшей нервной деятельности,
обеспечивающих поведение человека
проблемой
современной
и животных, остаётся значимой
нейробиологии.
Эффективной
методологией
подобного изучения является использование фармакологических веществ
различных классов для влияния на поведение (Ашмарин, 1975; Вальдман, 1979;
Семёнова, 1992). Успешно в этом плане используются препараты ноотропного
и анксиолитического ряда. Препараты этих классов ускоряют формирование
инструментальных условных реакций и противодействуют их функциональным
нарушениям (Иноземцев и др., 1996; Тушмалова и др., 2001), обладают
антиамнестическим эффектом (Гарибова и др., 2005; Яснецов, Крылова, 2013).
Определение механизма влияния ноотропов затрудняется тем, что в этот класс
попадают вещества самого разнообразного строения и спектра действия
(Воронина, Середенин, 1998). Значительное внимание в последнее время
привлекают вещества с антиоксидантным действием, так как, с одной стороны,
для них показаны ноотропные эффекты (Cantuti-Castelvetri et al., 2000;
Соловьёв, Яснецов, 2006; Tagliari et al., 2011; Воронина, 2012), а с другой, у
эталонного ноотропа пирацетама отмечается антиоксидантный компонент
(Фёдорова и др. 2007; Абдулина, 2010).
Широкие возможности для применения антиоксидантов связаны с тем,
что активация свободнорадикальных процессов перекисного окисления
липидов в мозге сопровождает многие стрессовые воздействия на организм:
электроболевое раздражение, иммобилизацию, индуцированные судороги,
депривацию сна, гипоксию, ишемию, холодовой стресс (Меерсон, Пшённикова,
1988; Гуляева и др., 1989; Барабой и др., 1992; Stvolinskii et al., 2000; Болдырев,
2012).
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: ПУР – пищедобывательный условный рефлекс; УРАИ –
условный рефлекс активного избегания; УРПИ – условный рефлекс пассивного избегания;
ФН – функциональные нарушения; ХЛ – хемилюминесценция; Asp - аспартат; Glu глутамат; Gly - глицин; GABA – гамма-аминомасляная кислота; DA – дофамин; NA норадреналин; 5-HT – серотонин.
2
Однако
если
роль
перекисного
окисления
липидов
в
развитии
физиологического стресса является общепризнанной, то лишь в отдельных
исследованиях отмечается его роль при психоэмоциональном стрессе,
например в конфликтной ситуации (Дюмаев и др., 1995) и при функциональном
нарушении реакции избегания (Иноземцев и др., 2004), что обуславливает
возможность использования антиоксидантов в этих условиях. Появляются
также работы, подчёркивающие значение антиоксидантной системы при
функционировании нервной ткани в норме (Rebec et al., 2005; Cortright, Rebec,
2006; Suer et al., 2009).
Таким
образом,
представляется
перспективным
изучение
антиоксидантной системы мозга, важную роль в поддержании которой играет
природный дипептид карнозин (β-аланил-L-гистидин), содержащийся в
значительных количествах в нервной ткани (Flancbaum et al., 1990). Карнозин
рассматривают как модулятор активности эндогенной антиоксидантной
системы,
имеющий
исключительную
важность
для
функционирования
головного мозга (Boldyrev et al., 1997, 2013). Показано, что антиоксидантная и
мембранопротекторная активность карнозина имеет существенное значение для
обучения и памяти в стрессовых условиях, таких как острая гипобарическая
гипоксия (Stvolinsky et al., 2012), ишемия головного мозга (Gallant et al., 2000),
паркинсонизм (Фёдорова и др., 2009). Это открывает новый этап в
исследовании фармакологической активности дипептида, связанный с его
возможным влиянием на мнестические и гностические функции.
В связи с вышеизложенным, представляется важным анализ роли
природного антиоксиданта карнозина при обучении крыс в условиях,
связанных с разным уровнем стрессорного воздействия.
Цель данной работы заключалась в изучении роли карнозина в регуляции
процессов перекисного окисления липидов, активности антиоксидантной
системы
и
содержания
нейромедиаторов
в
мозге
при
выработке
оборонительного и пищедобывательного условных рефлексов у крыс. В
соответствие с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
3
1. Охарактеризовать состояние процессов перекисного окисления липидов,
активность антиоксидантной системы в ткани мозга крыс и оценить
эффективность карнозина в условиях выработки оборонительных (УРПИ,
УРАИ) и пищедобывательного рефлексов, а также в условиях стресса на
фоне функциональных нарушений реакции избегания («сбой» и
«пространственная переделка»).
2. В
условиях
выработки
УРАИ
и
пищедобывательного
рефлекса
охарактеризовать содержание нейромедиаторов в гипоталамусе крыс и
выявить влияние на него карнозина.
3. Описать влияние карнозина на поведение крыс в стандартных тестах,
используемых для изучения активности фармакологических веществ:
открытом поле, тёмно-светлой камере, приподнятом крестообразном
лабиринте и УРПИ.
4. Оценить эффект карнозина на выработку пищедобывательного и
оборонительного
(УРАИ)
рефлексов
у
крыс
и
устойчивость
к
функциональным нарушениям реакции избегания.
Научная новизна и практическая значимость. В работе впервые
показано снижение активности эндогенной антиоксидантной системы и
активация
процессов
перекисного
окисления
липидов
при
выработке
оборонительных (УРАИ, УРПИ) и пищедобывательного условных рефлексов у
крыс. Это позволяет расширить представления об участии процессов
перекисного окисления липидов в модуляции работы головного мозга.
Установлено, что дипептид карнозин (β-аланил-L-гистидин) оказывает
положительное влияние на обучение, память и эмоциональное напряжение
животных в стрессогенных условиях (при выработке и функциональных
нарушениях реакции избегания). Показана связь положительных эффектов
карнозина с его прямым антиоксидантным действием, обеспечивающим
нормализацию процессов перекисного окисления липидов в ткани мозга.
4
Впервые установлено, что карнозин в процессе обучения вызывает
повышение активности антиоксидантной системы мозга и увеличение
содержания норадреналина, дофамина, серотонина и глутамата в гипоталамусе.
Эти данные позволяют подойти к изучению новых механизмов действия
карнозина в центральной нервной системе. Полученные в работе результаты
открывают перспективу использования карнозина в терапии стрессовых
состояний.
В ходе методической подготовки работы получен патент на полезную
модель автоматизированной камеры для выработки пищевых условных
рефлексов у лабораторных животных. Использованная методика позволила
выявить дополнительные особенности влияния карнозина на поведение
животных.
Основные положения, выносимые на защиту
1. При выработке пищедобывательного и оборонительных условных
рефлексов отмечаются проявления окислительного стресса в мозге
экспериментальных
животных:
снижение
активности
эндогенной
антиоксидантной системы и усиление перекисного окисления липидов.
2. Введение дипептида карнозина животным в условиях обучения приводит
к активации эндогенной антиоксидантной системы, нормализации
процессов перекисного окисления липидов в мозге и изменению
содержания нейромедиаторов в гипоталамусе.
3. Карнозин положительно влияет на поведение животных в приподнятом
крестообразном лабиринте, тёмно-светлой камере, на выработку и
устойчивость к функциональным нарушениям реакции избегания.
Наблюдаемый
эффект
позволяет
говорить
о
стресс-протекторной
активности карнозина в моделях in vivo.
4. Положительное влияние карнозина на обучение, память и эмоциональное
напряжение животных в стрессогенных условиях связано с его прямым
антиоксидантным действием, обеспечивающим нормализацию процессов
перекисного окисления в ткани мозга.
5
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на
заседании кафедры высшей нервной деятельности Биологического факультета
МГУ 19.06.2014; на IX Международном конгрессе «Нейронаука для медицины
и психологии» в 2013 г. (Украина, Судак); на Международном симпозиуме
«Stress and behavior 2013» в 2013 г. (Армения, Ереван); на VI Международной
конференции по когнитивной науке в 2014 г. (Россия, Калиниград); на IX
Международном форуме по нейронауке «FENS 2014» в 2014 г. (Италия,
Милан); на IV съезде физиологов СНГ в 2014 г. (Россия, Сочи).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы
в изданиях, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ,
получен 1 патент на полезную модель.
Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных
результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной
литературы. Работа изложена на 150 страницах, иллюстрирована 33 рисунками
и 3 таблицами. Список литературы включает 229 источников, из них 149
опубликованы в зарубежных изданиях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа проведена на 156 крысах самцах Wistar (280-300 г масса тела,
возраст - 2,5 мес.). Животные содержались в контролируемых условиях вивария
при 12 ч световом цикле. Все эксперименты проводились в соответствии с
международными правилами по работе с лабораторными животными (URL:
http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=12910).
В работе выполнено 4 серии экспериментов (Табл. 1). В каждой серии
животных разделяли на 2 группы. Животным опытной группы вводили
внутрибрюшинно раствор карнозина (100 мг/мл) в дозе 100 мг/кг массы тела за
1 ч до опыта, животные контрольной группы в то же время получали
эквивалентный объем физиологического раствора (далее – физ.раствор).
Таблица 1. Схема проведения экспериментов (по сериям).
Серии
I серия
(Интактные
животные)
Группы и
количество
животных
Виварный контроль
(n=20)
Порядок
поведенческих
тестов
Биохимические
анализы
II серия
(Оборонительный
рефлекс 1)
III серия
(Оборонительный рефлекс 2)
IV серия
(Пищедобывательный рефлекс)
Контроль (n=23)
Контроль (n=28)
Контроль (n=17)
Карнозин (n=22)
Карнозин (n=30)
Карнозин (n=16)
Открытое поле (1ый день)
Приподнятый крестообразный
Открытое поле
лабиринт (2ой день)
Тёмно-светлая камера (3ий день)
Выработка
Выработка условного рефлекса
условного рефлекса
активного избегания (8 дней)
Выработка пищедобывательного
пассивного
условного рефлекса (14 дней)
Функциональные нарушения
избегания (3 дня)
реакции избегания
Оценка процесса перекисного окисления липидов в ткани мозга методом железоиндуцированной хемилюминесценции
Определение
содержания
Определение содержания
Определение содержания моноаминов
моноаминов и
моноаминов и аминокислот в
в гипоталамусе
аминокислот в
гипоталамусе
гипоталамусе
-
-
-
7
Тестирование поведения животных. Перед выработкой условного
рефлекса активного избегания и пищедобывательного рефлекса у животных
оценивали поведение с помощью стандартных тестов: «открытое поле»,
«приподнятый крестообразный лабиринт» и «тёмно-светлая камера». В каждом
из приведённых тестов регистрировали поведение животного в течение 5
минут. В тёмно-светлой камере регистрировали латентный период захода в
тёмный отсек. Во всех тестах регистрировали общее количество пересечённых
квадратов: в открытом поле – отдельно центральных, медиальных и
периферических зон, в приподнятом крестообразном лабиринте – отдельно зон
открытых и закрытых рукавов, в тёмно-светлой камере – отдельно зон тёмных и
светлых отсеков. Кроме того, регистрировали поведенческие реакции:
остановки, стойки, замирание, груминг и дефекации.
Выработку модифицированного УРПИ (Иноземцев и др., 2007)
проводили
в
камере
(90х30х30см),
состоящей
из
трёх
отсеков
с
электрифицированным полом: освещённого центрального и двух затемнённых
боковых. Отсеки были разделены перегородками с проходами. Крысу
помещали в освещённый отсек и регистрировали выбор одного из тёмных
отсеков, латентный период захода. При выработке рефлекса животное при
заходе в любой тёмный отсек получало в нём 10-секундное электроболевое
раздражение через решетчатый пол, после чего опыт заканчивался. Отсек, в
котором
животное получило
ток, обозначался
далее
как
«опасный».
Противоположный отсек, соответственно, как «безопасный». Эксперимент
состоял из трёх сессий: 1ый день – выработка УРПИ, 2ой день - тестирование
№1, 3ий день - тестирования № 2. В тесте №1 оценивается поведение в течение
5 минут. В этом тесте животное также получает 10-секундное электроболевое
раздражение в «опасном» отсеке, за счет чего происходит дополнительное
обучение. В тесте №2 оценивается поведение животного в течение 10 минут. В
данном эксперименте карнозин вводили животным в 1ый день за 1 час до
выработки УРПИ и во 2ой день сразу после тестирования.
8
Выработку УРАИ проводили у крыс в челночной камере, состоящей из
двух одинаковых отсеков (25х25х30см), с контактным решетчатым полом,
светодиодными панелями для подачи стимулов, и разделённых перегородкой.
Перегородка, разделяющая отсеки, имела проходы у передней стенки камеры и
у дальней стенки. В данном эксперименте использовался только дальний
проход, а ближний был всегда закрыт. В каждой пробе к условному световому
стимулу (20 сек) через 10 сек изолированного действия присоединялся
безусловный стимул – электроболевое раздражение (10 сек). Переход
животного в другую половину камеры во время действия света (реакция
избегания) или тока (реакция избавления) прекращал действие стимулов, и
начинался межсигнальный интервал (30 сек). Опыты проводили в течение 8
дней, каждый опыт состоял из 20 проб. Фиксировали количество реакций
избегания, избавления, и межсигнальных реакций в процентах от числа проб в
опыте.
В работе также использовали приём сочетанных функциональных
нарушений (ФН) УРАИ (Иноземцев, Прагина, 1992). Данный эксперимент
проводился после выработки реакции активного избегания. После 8 опытов в
методику УРАИ вносили следующие изменения. В 9ом опыте после 20 проб
изменяется схема эксперимента: переход животного на условный или
безусловный стимул не прекращает действие тока, после 5 переходов между
отсеками действие тока прекращается немедленно, а звука – через 2 сек. После
этого дальний проход между отсеками, который использовали животные в ходе
обучения, закрывали, а вместо него открывался проход у передней стенки
камеры. Затем воспроизведение УРАИ тестировали у животных ещё в течение
20 проб в условиях пространственных изменений среды.
В ходе данного теста регистрировались те же параметры поведения, что и при
обучении УРАИ, но в качестве единицы анализа использовали не целый опыт, а
серии из 10 проб. Дополнительно регистрировали количество подходов к
закрытому дальнему проходу.
9
Выработка пищедобывательного условного рефлекса (ПУР). В опытах
использовали
оригинальную
методику
выработки
пищедобывательного
рефлекса, разработанную в лаборатории «Эволюции механизмов памяти»
кафедры высшей нервной деятельности МГУ им. М.В. Ломоносова (Патент №
143683 от 08.11.2013). Выработку рефлекса проводили в модифицированной
челночной камере, состоящей из двух одинаковых отсеков (25х25х30см),
оснащённых
кормушками
для
подачи
отдельных
порций
корма
и
светодиодными панелями для подачи стимулов. В каждой пробе в отсеке, в
котором находится животное, включается световой стимул (на 20 сек); после 10
сек его изолированного действия к нему присоединяется второй стимул –
шорох у кормушки (на 10 сек) в противоположном отсеке. При подходе
животного к кормушке в противоположном отсеке во время действия любого из
этих стимулов оно получает одну порцию пищевого подкрепления. После
окончания действия стимулов следует 30 сек межсигнальный интервал. Опыты
проводили в течение 14 дней, опыт всегда состоял из 20 сочетаний стимулов проб. В поведении животных выделяли подходы к кормушкам на условные
стимулы (отдельно на свет, отдельно на шорох) и межсигнальные реакции. Все
реакции представляли в процентах от числа проб в опыте.
Через 1 час после соответствующего экспериментального воздействия
животных декапитировали, структуры мозга (кора, ствол, гипоталамус)
извлекали на льду и замораживали в жидком азоте для проведения
биохимических анализов. Пробы брали в 8-м (воспроизведение) и в 9-м (ФН)
опытах у животных, вырабатывавших УРАИ, и в 4-м (обучение) и 14-м
(воспроизведение) опытах у животных, вырабатывавших ПУР.
Оценка состояния процессов перекисного окисления липидов в ткани
мозга. Ткань головного мозга (корковые структуры и ствол - продолговатый и
средний мозг) экспериментальных животных размельчали в гомогенизаторе
тефлон-стекло с добавлением охлаждённого фосфатного буфера (60 мМ
КН2РО4, содержащего 105 мМ КСl, рН=7,45). Полученный 10% гомогенат
мозга использовали для проведения исследования хемилюминесценции (ХЛ).
10
Характеристику
перекисного
окисления
липидов
и
активность
антиоксидантной системы в ткани мозга исследовали с помощью метода Fe2+индуцированной
хемилюминесценции
(Vladimirov,
1996),
который
был
адаптирован в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии НЦ
Неврологии РАМН применительно к прибору «Люминометр-1251, LKB,
Швеция». (Фёдорова, 2004). В измерительную кювету вносили 100 мкл 10%
гомогената и добавляли 800 мкл фосфатного буфера, после чего пробы
инкубировали в течение 5 мин при температуре 37оС до помещения в
измерительную камеру люминометра. Для инициирования ХЛ реакции к
образцу добавляли 100 мкл раствора двухвалентного железа (FeSO4• 7H2O) в
конечной концентрации 2,5мМ. Измерение по каждой структуре у каждого
животного проводили в 2-3 параллельных пробах.
Анализировали следующие кинетические параметры хемилюминесценции:
величину начального всплеска хемилюминесценции, отражающего уровень
предобразованнх липидных гидроперекисей (h, mB), способность ткани к
окислению по максимальному уровню люминесценции (H, mB) и активность
антиоксидантной системы по латентному периоду, предшествующему началу
окислительных процессов в образце (τ, с).
Определение содержания аминокислот и нейромедиаторов в ткани
мозга. Содержание аминокислот и моноаминов определяли в гомогенате мозга
(гипоталамус)
экспериментальных
высокоэффективной
жидкостной
животных
хроматографии
с
помощью
с
метода
электрохимической
детекцией на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, USA) с
аналитической колонкой Phenomemex (C18, 4x150mm,4 mcM) (Мирошниченко
и др., 1988). Перед экспериментом пробы размельчали в гомогенизаторе
(тефлон-стекло) в 20 объемах 0,1 н HClO4 с добавлением диоксибензиламина
(0,5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта для определения моноаминов.
Пробы центрифугировали при 10000g в течение 10 минут, и использовали
надосадочную жидкость для определения содержания основных медиаторных
аминокислот: глутамата (Glu), аспартата (Asp), глицина (Gly) и гамма-
11
аминомасляной
кислоты
(GABA);
а
также
содержания
медиаторных
моноаминов: серотонина (5-HT), норадреналина (NA) и дофамина (DA).
Автор благодарен к.б.н. Кудрину В.С. за помощь в проведении
исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Статистическая обработка данных производилась с помощью
программ Microsoft Excel 2003 и MATLAB R2010a. Все значения в работе
приведены в форме средней ± ошибки среднего. Использовался ранговый тест
Манна-Уитни,
коэффициент
корреляции
Спирмена.
Кроме
того,
при
статистическом анализе использовался тест Фишера для дисперсий и критерий
согласия частот Пирсона для сопоставления распределений по группам
животных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Тестирование поведения животных. Тесты «открытое поле», «тёмносветлая
камера»
и
«приподнятый
крестообразный
лабиринт»
широко
используются в психофармакологии для изучения влияния препаратов на
двигательную активность, ориентировочно-исследовательское поведение и
тревожность экспериментальных животных (Воронина, Островская, 2005). В
нашем исследовании данные тесты использовались перед обучением для
первичной оценки влияния карнозина на поведение животных.
В тесте «открытое поле» введение карнозина не изменяло ни общую
двигательную активность, ни её распределение между центральным и
периферическими отсеками (95±7% от общего количества пересечённых
отсеков – на периферии), ни количество поведенческих реакций (норки, стойки,
замирания, груминг.
В
тесте
«тёмно-светлая
камера»
под
действием
карнозина
наблюдалось достоверное увеличение латентного периода первого захода
животных в тёмный отсек. Время захода у животных, получавших карнозин,
увеличилось практически вдвое и составило в среднем 23±4 сек против 12±1
12
сек в контроле (р=0,03). Анализ поведенческих реакций выявил, что количество
замираний, которые рассматривают как проявление реакции страха, у опытных
животных достоверно уменьшалось и составляло 2,5±0,5 против 4,2±0,5 в
контроле (р=0,04). Полученные данные позволяют предположить снижение
уровня страха под действием карнозина.
В пользу высказанного предположения говорят результаты, полученные в
тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». У животных, получавших
карнозин, была достоверно повышена общая двигательная активность (64,8±4,2
пересечённых квадратов против 43,8±3,2 в контроле, р=0,001), количество
пересечений центрального отсека (15,9±1,1 против 10,2±0,8 у контрольной
группы, р=0,001) и время, проведённое в открытых рукавах (121±8 сек против
83±8 сек в контроле, р=0,02). Анализ поведенческих реакций показал
увеличение количества свешиваний в открытых рукавах (11,8±1,2 против
6,4±0,9 в контроле, р=0,005) и уменьшение количества замираний в закрытых
рукавах (0,6±0,2 против 2,9±0,5 в контроле, р=0,005). Указанные изменения в
поведении животных под действием карнозина можно охарактеризовать как
усиление ориентировочно-исследовательской активности. В приподнятом
крестообразном лабиринте, основанном, как и тест «тёмно-светлая камера», на
естественном стремлении грызунов избегать ярко освещённых мест, подобный
эффект
может
являться
следствием снижения
страха
и
тревожности
экспериментальных животных (Wall, Messier, 2001).
Влияние
карнозина
на
выработку
модифицированного
УРПИ.
Использование двух последовательных тестирований УРПИ показало, что у
всех животных, как контрольной, так и опытной групп, латентный период
прогрессивно возрастал как в первом, так и во втором тесте. Однако анализ
латентных периодов захода не выявил изменений на фоне исследуемого
вещества ни в одном из тестов. Часто для решения подобной проблемы в
экспериментальных исследованиях прибегают к дополнительным стрессовым
воздействиям, вызывающим амнезию реакции избегания, на фоне которой мог
бы проявиться эффект препарата (Яснецов, Крылова, 2013). Использование в
13
нашем эксперименте модифицированного варианта методики УРПИ позволило
обойтись без дополнительных воздействий, поскольку выработка УРПИ в
трёхкамерной установке даёт возможность разделить неспецифическую
пассивно-оборонительную
реакцию,
которая
отражается
в
увеличении
латентного периода и снижении двигательной активности, и пространственный
компонент памяти, выражающийся в предпочтении «безопасного» тёмного
отсека (Иноземцев, 2013). Анализ полученных данных показал, что под
воздействием карнозина было усилено воспроизведение пространственного
компонента памяти. Если среди контрольных животных предпочтения какоголибо из отсеков не наблюдалось, то опытные животные выбирали безопасный
отсек в 2,2 раза чаще, чем опасный, уже в Тесте №1 (Табл. 2). В тесте №2 ни
одно из опытных животных не заходило в опасный отсек. В то же время, у
контрольных
животных
даже
после
дополнительного
электроболевого
раздражения в Тесте №1, не наблюдалось предпочтения какого-либо отсека в
Тесте №2.
Таблица 2 - Распределение животных по предпочтению одного из отсеков установки
при тестировании УРПИ.
Тест
№1
Вещество
Опасный
Отсек
7
Центральный
отсек
7
Физ.раствор
(n=23)
Карнозин
5
(n=22)
№2
Физ.раствор
4
(n=10)
Карнозин
0
(n=8)
Значения отображают количество животных, *- p<0,05
отсека.
Безопасный
отсек
9
6
11*
3
3
4
4*
относительно выбора опасного
Влияние карнозина на выработку УРАИ. Полученные в эксперименте данные
свидетельствуют о том, что под воздействием карнозина быстрее происходит
выработка условного рефлекса активного избегания (Рис.1). Различия между
группами наблюдались уже в 1ом опыте - у 94% животных, получавших
14
карнозин, проявилась первая реакция избегания, в отличие от контроля, где
число таких животных было меньше 65% (p=0,008). К 8му опыту 65% опытных
животных достигли 75%-критерия устойчивого воспроизведения навыка, в то
время как в контрольной группе - только 33% животных (р=0,02). По
результатам данного эксперимента можно заключить, что положительные
эффекты карнозина связаны как с начальным этапом обучения, так и с этапом
воспроизведения навыка.
100
Рис. 1 Динамика выработки реакции
активного избегания у экспериментальных
животных.
На графике представлены средние
значения с ошибкой среднего. По оси
абсцисс – дни опытов, по оси ординат –
количество реакций избегания в % от числа
проб в опыте. Сплошная линия –
контрольная группа, пунктирная линия –
опытная.
Звёздочками
отмечена
достоверность отличий от контроля по
критерию Манна-Уитни с p<0,05.
*
80
Реакции избегания, %
*
60
40
20
0
Реакции избегания (%)
1
2
3
4
5
Опыты
6
7
8
#
100
*
80
60
40
20
0
1-10
11-20
21-30
31-40
Пробы
Рис.2 Динамика воспроизведения
реакции избегания при функциональных
нарушениях.
По оси абсцисс – блоки по 10 проб, по оси
ординат – количество реакций избегания (в
% от числа проб). Область с точками –
контрольная
группа,
заштрихованная
область – опытная. Стрелкой отмечен
момент функционального нарушения. * достоверность отличий от контроля по
критерию Манна-Уитни с p<0,05, # достоверность отличий по критерию
Вилкоксона с p<0,05
Влияние карнозина на функциональное нарушение реакции избегания. Для
дополнительной
характеристики
действия
карнозина
в
условиях
психоэмоционального стресса анализировали сохранность выработанного
навыка УРАИ после сочетанных функциональных нарушений (Рис. 2).
15
У животных контрольной группы наблюдалось достоверное снижение уровня
реакции избегания до 47,8±7,8% (p=0,01) в первом блоке из 10 проб. Под
действием карнозина это функциональное нарушение было менее выражено,
что позволяет говорить о стресс-протекторной активности карнозина в
условиях психоэмоционального стресса.
Влияние карнозина на выработку пищедобывательного условного
рефлекса.
А
Б
100
80
80
60
60
*
40
40
*
20
УР на звук, %
УР на свет, %
100
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7 8 9
Опыты
10 11 12 13 14
1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 13 14
Опыты
Рис.3 Динамика выработки пищедобывательных реакций у экспериментальных
животных (А – условная реакция на световой раздражитель, Б – условная реакция на
шорох)
По оси абсцисс – последовательные дни опытов, по оси ординат – количество
условных реакций (в % от числа проб в опыте). Чёрная сплошная линия – контрольная
группа, пунктирная линия – опытная. * - достоверность отличий от контроля по
критерию Манна-Уитни с p<0,05.
Результаты
выработки
у
животных
под
воздействием
карнозина
пищедобывательного условного рефлекса использовали для сравнения с
оборонительными рефлексами (УРАИ, УРПИ). Поскольку при выработке
пищедобывательного условного рефлекса роль играла как реакция на звук
(шорох), так и на свет, анализировали оба вида реакций у животных (Рис. 3).
Карнозин оказывал потенцирующее влияние только на выработку реакции на
звук (на начальном этапе обучения), но не оказывал влияния в дальнейшем,
16
когда большую роль играла реакция на свет. Соответственно, к концу обучения
отличий животных, получавших карнозин, от контрольной группы не
наблюдалось.
Положительное
действие
карнозина
при
выработке
пищедобывательного рефлекса, в отличие от оборонительных рефлексов,
ограничивалось начальным этапом обучения.
Влияние карнозина на содержание нейромедиаторов и медиаторных
аминокислот в гипоталамусе животных при обучении.
Таблица 3 – Содержание нейромедиаторов и медиаторных аминокислот в гипоталамусе
крыс после различных воздействий.
Тест
УРАИ (воспроизведение)
В-во
Ф-р
Карнозин
УРАИ (ФН)
Ф-р
Карнозин
ПУР (обучение)
Ф-р
Карнозин
111.3±8.8
NA
DA
109.6±5.6
85.2±12.8
129.7±6.3 *
90.8±8.0
116.8±5.4
85.8±7.2
v
93.8±8.9
83.9±6.8
71.6±5.3
94.6±2.7
88.6±7.3
107.4±4.9
5-HT
84.0±8.9
107.3±5.8 *
^
ПУР (воспроизведение)
Ф-р
Карнозин
116.6±6.5
133.8±9.5
^
^
121.4±14.0
133.9±8.9
^
^
159.2±15.1
168.5±13.2
107.9±4.7
108.9±6.4
97.2±5.1
v
v
120.3±7.2
Asp
94.1±9.3
106.3±5.1
^
116.1±6.5
-
-
-
-
Glu
98.8±9.9
119.1±6.0
120.7±5.9
114.9±6.5
-
-
-
-
100.6±7.8
111.5±5.4
112.8±9.0
100.6±6.3
-
-
-
-
109.7±11.2
109.7±4.2
109.5±5.9
107.9±6.6
-
-
-
-
GABA
Gly
Все значения представлены в процентах относительно интактной группы, серым цветом
отмечены достоверные отличия от интактной группы, *- p<0,05 относительно контроля; ^ и v
- достоверное увеличение и снижение по сравнению с обучением (для ПУР), с
воспроизведением до ФН (для УРАИ), ф-р – животные, получавшие физ.раствор
Основным эффектом введения карнозина при выработке как УРАИ, так и ПУР,
на медиаторный обмен в гипоталамусе было достоверное увеличение
содержания NA в гипоталамусе относительно интактной группы при
воспроизведении навыка (Табл. 3). При выработке ПУР наблюдались
однонаправленные изменения содержания нейромедиаторов у животных,
получавших физ.раствор и карнозин, от 4го опыта к 14му. Однако, только на
фоне введения карнозина содержание нейромедиаторов при воспроизведении
17
достоверно отличалось от интактных значений. При выработке УРАИ карнозин
изменял
содержание
нейромедиаторов
в
гипоталамусе
только
при
воспроизведении навыка, но при функциональных нарушениях их содержание
не отличалось от контрольной и интактной групп.
Анализ содержания медиаторных аминокислот показал, что карнозин при
воспроизведении УРАИ также увеличивал содержание в гипоталамусе
возбуждающей аминокислоты Glu. В то же время, при функциональных
нарушениях навыка этого эффекта не наблюдалось. У животных, получавших
физ.раствор, наоборот, содержание Asp и Glu не отличалось от нормальных
значений
при
воспроизведении
навыка,
но
увеличивалось
после
функциональных нарушений. Впервые полученные под влиянием карнозина
изменения уровня NA и Glu в гипоталамусе позволяют предположить новый
механизм его действия и объяснить его влияние на выработку УРАИ.
Влияние
карнозина
на
параметры
железоиндуцированной
хемилюминесценции в гомогенатах мозга животных при обучении. Анализ
содержания липоперекисей, отражающих активность перекисного окисления
липидов, в гомогенатах мозга животных, получавших физ.раствор, показал, что
обучение
во
всех
исследованных
моделях
(УРАИ,
УРПИ,
ПУР)
сопровождалось активацией окислительных процессов с увеличением уровня
липоперекисей (Табл. 4). Более выраженные отличия от интактной группы
обнаружены в гомогенатах корковых структур. В то же время, активность
антиоксидантной системы в гомогенатах мозга контрольных животных была
достоверно снижена и в коре, и в стволе мозга. Подобные сопряжённые
биохимические изменения у контрольных животных позволяют говорить о
развитии окислительного стресса в ткани мозга при обучении (Sies, 1997).
Интересно, что такие же изменения наблюдаются и на начальном этапе в
модели пищедобывательного рефлекса (при обучении), не сопряжённого с
воздействием электроболевого стресса. К 14му опыту в модели ПУР процессы
перекисного окисления липидов возвращаются к норме.
18
Таблица
4
Основные
информативные
параметры
железоиндуцивованной
хемилюминесценции, измеренные в гомогенатах мозга экспериментальных животных после
различных воздействий. Все обозначения как в таблице 3.
Вещество
Карнозин
Структура мозга
Кора
Физ.раствор
Ствол
Кора
Ствол
Уровень липоперекисей (h)
УРАИ (воспроизведение)
110.9±2.6
109.5±4.3
123.8±7.0
110.4±3.6
УРАИ (ФН)
108.0±3.5
101.7±2.9
114.2±6.1
106.4±3.4
ПУР (обучение)
125.4±5.8
99.9±4.1
123.5±4.7
100.2±2.6
ПУР (воспроизведение)
105.6±6.9 v
101.0±9.8
96.0±2.5 v
96.8±4.2
УРПИ
105.8±9.3 *
-
139.3±6.4
-
Активность антиоксидантной системы (τ, тау)
УРАИ (воспроизведение)
110.7±2.2 *
133.6±5.5
*
68.2±4.9
68.2±5.0
УРАИ (ФН)
104.3±2.6 *
139.5±6.4 *
71.5±5.4
72.0±2.7
ПУР (обучение)
96.1±5.7 *
81.4±5.5 *
45.2±3.2
47.4±4.5
ПУР (воспроизведение)
93.2±6.3 *
103.8±8.1 ^
76.4±5.9 ^
108.8±12.4 ^
УРПИ
111.3±22.8 *
-
32.0±2.8
-
Общая способность к окислению (Н)
УРАИ (воспроизведение)
103.7±2.5
97.9±3.1
101.5±4.3
101.6±5.8
УРАИ (ФН)
103.9±2.5
95.7±3.5 *
101.4±2.9
109.3±2.3
ПУР (обучение)
-
-
-
-
ПУР (воспроизведение)
-
-
-
-
УРПИ
79.3±4.8 *
-
99.0±2.1
-
Анализ
общей
незначительные
предположить,
способности
изменения
что
образцов
при
мозга
обучении
окислительный
стресс
к
окислению
животных,
в
что
исследованных
показал
позволяет
моделях
проявляется не так значительно, как при патологических состояниях мозга.
Введение карнозина экспериментальным животным во всех моделях обучения
приводит к значительной активации эндогенной антиоксидантной защиты, что
особенно выражено в стволовых структурах мозга при выработке УРАИ, где
значения τ (тау) у животных, получавших карнозин, значительно превышают
показатели интактных животных (Табл. 4). На фоне повышенной активности
19
антиоксидантной системы под действием карнозина уровень липоперекисей в
гомогенатах мозга при обучении во всех моделях поддерживается в пределах
нормы.
Полученные
данные
показывают,
что
положительный
эффект
карнозина на обучение животных связан с его способностью предотвращать
развитие окислительного стресса, снижающего функциональные возможности
нервной ткани.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Можно заключить, что в данном исследовании выявлена значимая роль
антиоксидантной системы в обеспечении процесса обучения животных и
нейромедиаторного обмена в гипоталамусе. При функциональных нагрузках,
таких как выработка пищедобывательного и оборонительных условных
рефлексов (УРАИ, УРПИ), наблюдалось снижение активности эндогенной
антиоксидантной защиты нервной ткани. Карнозин обеспечивал адекватную
поддержку антиоксидантной системы во всех исследованных ситуациях, что
отразилось не только на снижении уровня липидных гидроперекисей в ткани
мозга, но и на содержании нейромедиаторов в гипоталамусе, и эффективности
обучения животных. Это расширяет представления о физиологической роли,
возможных механизмах и терапевтическом потенциале применения карнозина
и делает перспективным дальнейшее изучение действия этого соединения на
центральную нервную систему.
20
ВЫВОДЫ
1. Выработка пищедобывательного и оборонительных условных рефлексов
приводила к снижению активности эндогенной антиоксидантной системы
и усилению процессов перекисного окисления липидов в мозге
животных, что свидетельствует о вовлечённости окислительного стресса
в процессы обучения.
2. Карнозин увеличивал активность эндогенной антиоксидантной системы,
препятствовал активации перекисного окисления липидов в мозге и
способствовал обучению животных, что указывает на сопряжённость
изучаемых процессов.
3. Введение
карнозина
исследовательской
приводило
активности
к
увеличению
на
фоне
ориентировочно-
снижения
пассивно-
оборонительного поведения в приподнятом крестообразном лабиринте и
тёмно-светлой камере, что согласуется с его положительным влиянием на
формирование оборонительных реакций.
4. Карнозин
оказал
положительное
влияние
на
пространственный
компонент памяти в условиях выработки условного рефлекса пассивного
избегания
в
модифицированной
трёхкамерной
установке
и
при
пространственной переделке навыка активного избегания.
5. Спектр нейрохимических эффектов, развивающихся в процессе обучения
в условиях применения карнозина, включает как повышение активности
антиоксидантной системы мозга, так и увеличение концентрации
норадреналина, дофамина и серотонина в гипоталамусе.
6. Совокупность полученных в работе результатов позволяет объяснить
положительное влияние карнозина на поведение животных его прямым
антиоксидантным действием, обеспечивающим нормализацию процессов
перекисного окисления липидов в ткани мозга.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ
1. Иноземцев А.Н., Бережной Д.С., Фёдорова Т.Н., Стволинский С.Л.
Влияние природного дипептида карнозина на обучение крыс в условиях
отрицательного подкрепления./ Доклады Академии наук, 2014. 454(5): с.
606-608.
2. Стволинский С.Л., Фёдорова Т.Н., Бережной Д.С., Логвиненко А.А.,
Музычук
О.А.,
Иноземцев
А.Н.
Карнозин
(β-аланил-L-гистидин)
повышает эффективность обучения в условиях окислительного стресса,
связанного
с
выработкой
условного
рефлекса
с
отрицательным
подкреплением./ Нейрохимия, 2014. 31(4): с. 328-334.
3. Бережной Д.С., Киселёв А.В., Новоселецкая А.В., Киселёва Н.М.,
Иноземцев
А.Н.
Влияние
акустических
воздействий
высокой
интенсивности на поведение крыс./ Вестник Московского Университета.
Серия 16. Биология (в печати), 2015. 2: с. 3-8.
Другие издания
1. Бережной Д.С., Овчинникова Т.С., Иноземцев А.Н. Особенности
межсигнальных реакций в оборонительном и пищедобывательном
рефлексах. 150 лет «Рефлексам головного мозга». Сборник научных
трудов, посвященных изданию статьи И.М. Сеченова (23 ноября 1863г.)./
Отв. ред. А.Ю. Алексеев, Ю.Ю. Петрунин, А.В. Савельев и Е.А.
Янковская, М. ИИнтелл. 2014: с. 317-328.
Патенты
1. Патент
на
полезную
Автоматизированная
модель
камера
№
для
143683
РФ,
выработки
МПК
А61В5/16.
пищевых
условных
рефлексов у лабораторных животных./ Бережной Д.С., Иноземцев А.Н.;
заявитель
и
государственный
патентообладатель
университет
ФГБОУ
имени
М.В.
ВПО
"Московский
Ломоносова"
2013149920/14, заявлено 08.11.13. опубл. 27.07.2014, Бюл.21. – 1 с.
№