Научно обоснованные пути скрининга новорожденных для выявления мышечной дистрофии Дюшенна
advertisement
Научно обоснованные пути скрининга новорожденных для выявления мышечной дистрофии Дюшенна erry R. Mendell MD1,*, Chris Shilling MS1, Nancy D. Leslie MD2, Kevin M. Flanigan MD1, Roula al-Dahhak MD1, Julie Gastier-Foster PhD1,3, Kelley Kneile BS3, Diane M. Dunn BS4, Brett Duval BS4, Alexander Aoyagi BS4, Cindy Hamil AS4, Maha Mahmoud BS4, Kandice Roush RN1, Lauren Bird RN1, Chelsea Rankin BS1, Heather Lilly BS5, Natalie Street MS, CGC6, Ram Chandrasekar PhD5, Robert B. Weiss PhD4,* Материалы и методы Изучаемая популяция. Это исследование включало 4 фазы. Фаза 1 : усилия были направлены на создание групп населения на основе диапазона КК в качестве критерия, установления порога, при котором необходимо проводить анализ мутаций гена дистрофина. Эти исследования были проведены в Департаменте здравоохранения Огайо (ODH) с помощью анонимного анализа сухой капли крови у новорожденных мальчиков и девочек. В фазе 2 данного исследования, родители новорожденных мальчиков были приглашены для участия в пилотном исследовании проводимом в 4 крупных больницах в Колумбусе и Цинциннати, штат Огайо, с марта 2007 по сентябрь 2008 года. Новорожденные мальчики, кто родился в любой из участвующих больниц имеют право на исследование. В фазе 3, программа была расширена за счет включения в общей сложности 43 больниц в штате Огайо, начиная с октября 2008 года и вплоть до сентября 2010 года. В фазе 4, заключительный этап исследования, пятна крови у новорожденных, мужчины и женщины снова прошли анонимное обследование ODH (июнь 2010-январь 2011). Цель на заключительном этапе увеличение числа образцов мужчин и включение женщин. Мы включили оба пола не с расчетом на выявление носителей Х-сцепленных заболеваний таких, как МДД, но с конкретной целью укрепления наших возможностей выявления мутаций гена при проверке на 2ом уровне скрининга (КК из сухого пятна крови затем анализ ДНК) для решения вопроса о повышенном уровне КФК у субъектов, у которых не обнаружены мутации гена МДД. Учитывая то, что ложно-положительных повышение КК является потенциальной проблемой, мы хотели постараться определить мутации характерные для других форм мышечной дистрофии. Дизайн исследования Обследование населения на уровень КК методом сухой капли крови В фазе 1 исследования диапазон КК населения был построен по данным тестирования 30 547 последовательных анонимных образцов сухой капли крови (табл. 1, рис 1). Поставлен вопрос о изменчивости, связанной с полом, весом и возрастом новорожденных на момент взятия пробы. Данное исследование имеет важное значение в создании будущих руководящих принципов для определения уровня КК, потому что мы не обнаружили существенных различий в средних значениях между мужчинами (251,52 ± 113.85U / л) и женщинами (246,39 ± 113.86U / л), с минимальным эффектом, связанным с весом при рождении. Другой интересный момент, что, хотя наша целевая группа фокусируется на исследовании сухой капли крови, собранной в течение первых 48 часов, результаты данного исследования были увеличены, потому что деятельность КК уменьшается с течением времени. Собранная нами информация показала, что КК не проявляют большого эффекта до 5 дней (> 120 часов). С этой базой данных мы смогли разработать наш протокол для 2-х уровневого плана испытаний. Первоначально, мы решили начать анализ ДНК гена МДД на уровне КФК в ≥ 600U / л- 3 стандартных отклонения от среднего значения (0,75% экранированных населения, см. таблицу 1, рис.1 Реализация тестирования КК у новорожденных 2 и 3 фазы являются добровольными и требуют письменного согласия одного из родителей или опекуна на основе утвержденных протоколов Экспертного совета (IRB) каждой участвующей больнице. В течение 48 часов после рождения, обученные сотрудники подходили к родителям новорожденных мальчиков и рассказывали об участии в исследовании. Была представлена брошюра с описанием преимуществ и рисков. Карты с каплями крови поставляются в ODH и включают в себя демографические данные, дату и время сбора, а также пять 100 мкл образцов крови, полученных из пятки в отдельных кругах на листе фильтровальной бумаги, прикрепленном к верхней части коллекции карт. Два круга используются для тестов входящих в обязательный скрининг новорожденных, а 2 из 3 оставшихся кругов были использованы в рамках настоящего исследования. Все результаты отправлены по почте лечащему врачу или непосредственно в семью, если так просили родители во время оформления согласия. В случае положительного результата и выявления МДД мутации, семье сообщалось по телефону, и назначалась консультация с лечащим врачом и специалистом по нервно-мышечным заболеваниям из нашей команды. Для результатов КK из сухой капли крови выше порогового значения при отрицательном тестировании ДНК на мутациями гена дистрофина, лечащий врач был уведомлен по телефону, и предлагалось повторить тестирование венозной крови на КК. В случаях, когда снова определялся высокий КК при повторном тестировании, наши сотрудники предлагали записаться на прием в ближайшую клинику Ассоциации Мышечной дистрофии для дальнейшего обследования. Материалы. Тест на КК КK тестирование проводилось на сухой капли крови, полученные для всех 4 фаз, выполнялось в лаборатории ODH с использованием ранее опубликованных методов. Сухие пятна крови с помощью Wallac DBS (Perkin Elmer, Бостон, MA) помещают в лунки пластины с добавлением диаденозина пентафосфата (USB Corporation, Кливленд, Огайо). После инкубации при комнатной температуре для подавления активности фермента красных кровяных клеток, супернатант удаляли с помощью N-ацетил-L-цистеин для возобновления деятельности КK (Набор реагентов; Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). КK ферментативная активность катализировалась трансфосфорилированием аденозин дифосфата (АДФ) и аденозинтрифосфата (АТФ).Ряд связанных реакций восстановленной формы никотинамид аденин динуклеотида (НАД) со скоростью, прямо пропорциональной деятельности КК, измеренной при длине волны 355 нм и длине волны излучения 460nm по флуорометр (Виктор 2D с Stacker, Perkin Elmer) . Для каждого образца, 5 измерений были проведены в течение 5 секунд (кинетический метод), а разница между первым и последним чтением каждого образца была использована для нормализации различий. КФК (в единицах на литр) была рассчитана для каждого образца по формуле независимо для каждой пластины с использованием внутреннего контроля, с заданными концентрациями КK , который загружался на каждую пластину. Тестирование ДНК Извлечение ДНК и Амплификация полного генома ДНК тестирование сухих пятен крови проводился на образцах с повышенным КK. Высушенные пятна крови были направлены в клиническую лаборатории секвенирования ДНК в университете штата Юта. Геномная ДНК очищена с помощью MasterPure (Мэдисон, Висконсин, каталог номер MC89010).Часть (2mm2) каждой карты пятен крови была погружена в 300 мкл раствора для клеточного лизиса, содержащего 50 мкг протеиназы К, и инкубирована при 50 ° С в течение 16 часов; 160мкл MasterPure ™ реагента осаждения белков было добавлено к образцам, и затем их поместили на лед на 30 минут. Лишние вещества удалены центрифугированием в течение 10 минут при 10000 в микроцентрифуге .Супернатант был перелит в новую пробирку, содержащую 600μl изопропанола, и оставлен при температуре -20 ° С в течение 30 минут. ДНК осаждали центрифугированием при 4 ° С в течение 10 минут при 10000 , промыванием в 70% ледяном этиловом спирте, высушиванием на воздухе и ресуспендировали в 20 мкл ТЕ буфера, рН 7,6. Амплификация полного генома (WGA) этой очищенной ДНК из каждой капли крови проводилось с Repli-г комплектом (Qiagen, Валенсия, штат Калифорния, каталог номер 150045). Пять мкл геномной ДНК денатурировали в течение 3 минут при комнатной температуре и нейтрализуют в соответствии инструкцией завода-изготовителя, 50 мкл окончательной смеси, содержащей Repli-г ДНК-полимеразу инкубировали при 30 ° C в течение 16 часов с последующим нагреванием при 65 ° C в течение 3 минут для инактивации фермента. Анализ мутаций Удаление и анализ последовательности гена дистрофина были выполнены на матрице ДНК WGA с использованием 2-х ступенчатого SCAIP метода, как это описано прежде. Этот метод использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и флуоресцентное секвенирования ДНК для выявления делеций и точечных мутаций в 79 экзонах и около 50 последовательностях интронов из основных изоформ транскрипта мРНК плюс 5 'нетранслируемой области (УТР), 3' УТР и 6 альтернативных промоутеров. ПЦР проводили в 10 мкл с использованием платиновой Taq ДНКполимеразы (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Ферментативную очистку проводили ExoSAP-IT реагентом (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния), а также рассматривали образцы секвенирования с использованием ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) BigDye Terminator v.3.1. Образцы проанализированы с использованием программного обеспечения, описанного ранее.32 нуклеотидные позиции были определены в соответствии с эталоном последовательности, который используется для анализа мутаций (инвентарный номер GenBank NM_004006.2). Все образцы были проанализированы на делеции / дупликации одного или множественных экзонов в гене дистрофина с использованием усиленного зонда (Salsa [ММПУ] Комплекта P034/P035 DMD / Becker ММПУ; MRC-Голландия, Амстердам, Нидерланды). Один микролитр WGA шаблона в 5 мкл ТЕ буфера был нагрет при 98 ° C в течение 5 минут, и охлажден и разделены в 2 отдельные пробирки; 1.5мкл Salsa P034 и P035 праймеров добавляли в пробирки, соответственно, и инкубировали при 95 ° С в течение 1 минуты с последующим отжигом при температуре 60 ° С в течение 20 часов. ДНК-лигазы добавляли к каждой реакции в общем объеме 20 мкл и инкубировали при 54 ° C в течение 15 минут, после 5-минутной инкубации при 98 ° C. Пять мкл впоследствии было использовано в ПЦР, которая состояла из 35 циклов: 95 ° C в течение 30 минут, 60 ° С в течение 30 минут и 72 ° С в течение 1 минуты, после чего проведена окончательная инкубации при 72 ° С в течение 20 минут ; 1.5мкл образца помещены в ABI 3730xl и проанализированы размеры фрагмента с помощью GeneMapper программного обеспечения (Applied Biosystems). Диагностическая точность анализа сухой капли крови по шаблону WGA подтверждена анализом пятен крови, пациентов с МДД и родителей с известными мутациями, в том числе делецией 7 экзона и дупликацией 6 экзона. Анализ показал 100% точность на этих образцах. Анализ мутаций был проведен у 9 анонимных образцов от 2 женщин и 7 мужчин, которые имели уровень КФК> 2000 и не имели мутаций, выявленных в гене МДД. 7 самых общих генов, которые вызывают конечностнопоясную мышечную дистрофию (КПМД) были отобраны, как приоритетные для анализа (DYSF, CAPN3, SGCA, SGCB, SGCG, SGCD и FKRP). DYSF и CAPN3 секвенировали с 15мкл шаблонов с помощью WGA SCAIP метода. Эти тесты для точечных мутаций в гене DYSF (ссылка мРНК, Национальный центр биотехнологической информации [NCBI] NM_003494.3, 55 экзонов кодирования 237kDa белка дисферлина) и в CAPN3 гене ( мРНК, NCBI NM_000070.2 24 экзонов кодирования кальпаина-3 изоформы белка 94kDa). В образцах, где не обнаружено DYSF или CAPN3 мутаций, проводился анализ следующих генов: SGCA (NM_000023.2), SGCB (NM_000232.4), SGCD (NM_000337.5), SGCG (NM_000231.2) и FKRP (NM_024301.4). Результаты Скрининг новорожденных на уровень КK : Фаза 2 и Фаза 3 Фазы 2 пилотного исследования скрининга 6928новорожденных была проведена в крупных больницах в Колумбусе и Цинциннати, штат Огайо. На этом этапе исследования, мы отслеживали количество тех, кто отказался согласия и нашли , что 6,0% (п = 478) лиц дали одобрение. Мы обнаружили, что у 110 человек КK ≥ 600U / л и превысила порог, требующий анализа ДНК. Только у 2 больных КК ≥ 2000 Ед / л (2461 и 2675) было установлено наличие мутаций в гене дистрофина. .Ложно-положительные результаты на этом этапе составили 1,6% (108 из 6926). Пилотное исследование дало толчок для изменения порога КK для штата, 3 фазы программы ≥ 750U / л. Данные, полученные от обследования дополнительных 10 937 новорожденных мальчиков привели к выявлению 58 человек с повышенным уровнем КФК. У одного новорожденного была найдена мутация в гене дистрофина, и его КK> 2000 Ед / л (2003 ед / л).Ложноположительных результатов на этапе 3 было 0,52% (57 из 10 936). Увеличение порога КK с 600U / л до 750U / л сократило число новорожденных, которым требуется анализ ДНК на 68%. Дополнительных интерес представляет КK тестирования в период новорожденности, так как считается , что уровень этого фермента повышен от травмы при прохождении новорожденного через родовые пути. Мы изучили это, проверяя КФК в последующих образцах венозной крови, полученных у лечащего врача для участников на этапе 2 и 3 фазы исследования. Нам удалось получить образцы только 43 из 165 пациентов, которые были отрицательны на наличие мутаций гена МДД и у которых КК был определен на сухой капле крови (распределились следующим образом: 35 между 600 и 999U / л, 6 от 1000 до 1499 МЕ / л и 2 от 1500 до 1999 МЕ / л). В большинстве случаев последующей анализ уровня КК в венозной крови был ниже по сравнению с сухой каплей крови (рис. 2). Особо следует отметить, самая высокая группа 1700 Ед / л при повторе показала уровни КФК в 46U / л. Только в 2 случаях, КK остается умеренно высокой> 500U / л (888 уменьшение до 672, 809 уменьшение до 656). Это подтверждает, что высота КK в сухой капле крови может быть связана с травмой при рождении и составляют большинство значений выше нормы, результаты которых похожи на предыдущий доклад. Примечательно то, что у 1 младенца с документально подтвержденной мутацией гена дистрофина, у которого определялась КК в сухой капле крови, КK была 2462 ед / л, и при повторных анализах венозной крови в течение 6 недель обнаруживалось резкое повышение до 8888 Ед / л. Этап 4 Скрининг новорожденных, исследование КК. В четвертой и заключительной фазе этого исследования, чтобы увеличить размер выборки для дальнейшей проверки 2-х уровневнего подхода к идентификации МДД в период новорожденности, мы взяли образцы у большой когорты новорожденных анонимно. Это увеличило наши выборки на 19 884 новорожденных мальчиков (общее число 37 649). На основании результатов фазы 2 и фазы 3 исследования, мы ограничили скрининг ДНК на сухой капле крови, чтобы мальчики с КК ≥ 750U / л. Существовали 308 уровней КФК оказались > 750U / л, и десять > 2000 Ед / л. В этом заключительном этапе исследования мы также включили анализ КК сухих пятен крови новорожденных девочек 18 763. Для женщин, КK был ≥ 750U / л в 242, и КK ≥ 2000 2 анонимных сухих пятен крови. Анализ ДНК сухой капли крови Среди 37 649 новорожденных обследованых на МДД (2 фаза, 3, 4), у 6 мальчиков были обнаружены мутации в гене дистрофина. Все они были делециями одного или нескольких экзонов, 5 с нарушением рамки считывания и 1 без нарушения рамки считывания (табл. 2), ни точечные мутаций или дупликаций обнаружено не было. Эти мутации следуют типичному распределению наблюдаемому в большой когорте, хотя о делеции с сохранением рамки считывания экзонов 5-41 сообщалось прежде только один раз (http://www.leiden.nl), и было связано с МДД, вероятно, в связи с делецией, которая охватывает критическую актин-связывающую область. Дискуссия. КK тестирование сухой капли крови для выявления случаев МДД в период новорожденности было утверждено в 1979 году и рассчитано на активность фермента катализировать трансфосфорилирование АДФ в ATФ. Как первоначально введено, на основе анализа биолюминесценции установлена интенсивность активности фермента; последующие изменения использованного НАД Н на основе флуорометрического считывания как меры активности КK. Таблица 3 отслеживает последовательные истории NBS для выявления МДД я в Новой-Зеландии 1 через программы в Эдинбурге, 2 Германии, 3 Канаде, 4 Франции, 5 США (западная Пенсильвания), 6 Уэльсе, Кипре 7, 8. Антверпен является единственной программой, которая поддерживает NBS для МДД и по сей день. В рамках этой программы, образцы с повышенным КK, повторно исследованы в венозной крови, взятой примерно в 6 недель после родов. С самого начала наши цели включали создание программы NBS, которая будет соответствовать практике акушерства в США, где мать и ребенок выписывается в течение 24 -48 часов после неосложненных родов, и разработка метода должна включать возможность легко отличать ложные и истинные результаты. Выполнение этой задачи требует 2-х уровневой системы анализа: тестирования КK, за которым следуют анализ ДНК тех же сухих пятен крови. Система имеет сходство с программой NBS для муковисцидоза на основе 2-х уровневого молекулярного генетического тестирования, которая была впервые представлена в рамках пилотной программы Wisconsin. Утвержденный метод был необходим для извлечения геномной ДНК из небольшого сухого пятна крови, после чего весь геном исследуется на наличие делеци / дупликаций в гене дистрофина с использованием SCAIP в сочетании с MLPA. Подготовительные исследования при условии уверенности в методологии, основанной на 100% точности в выявлении делеций 7 экзона и дупликацию 6 экзона взятых у пациентов с МДД с известными мутациями, размещенные на карты обследования новорожденных в больнице и отправлен в клиническую ДНК лабораторию в Университете штата Юта. Кроме того, необходимо создать уровни диапазона КК для анонимных сухие пятна крови. Это важное мероприятие стало возможным благодаря всестороннему сотрудничеству лаборатории ODH. По анонимным анализам КК > 30 000 новорожденных (см. рис 1), мы установили, отправную точку для анализа ДНК по уровню КK на 3 стандартных отклонения выше среднего. Добавление КK тестирования к набору тестов сухой капли крови ODH было не слишком обременительной, а стоимость добавления этого 1 анализа (до 35 других) была минимальной (около $ 1,00 ). Для превышающих порог КK требуется анализ ДНК, стоимость в лаборатории Университета штата Юта дополнительно $ 150.00 . Результаты нашего исследования подтверждают, что 2-х уровневая система анализа для скрининга новорожденных на МДД, возможно, принесет еще большее удовлетворение, чем ожидалось. В ходе этой программы, мы обследование 37 649 мальчиков и обнаружили 6 с мутациями гена дистрофина, частота 1 к 6291. Сравнительная заболеваемость новорожденных мальчиков МДД документально ниже, чем в других исследованиях по всему миру, которые варьировались от 1 к 3802 до 1 к 6002 (с учетом всех программ вместе, 1 к 4087, см. таблицу 3), и должны рассматриваться с осторожностью в зависимости от размера выборки и места в государстве в США. Что особенно заметно по нашему исследованию, что все наши пациенты с МДД (или дистрофинопатией) имели КФК при рождении ≥ 2000 Ед / л. Это разница между документально подтвержденными случаями МДД и с повышенными КK, у которых не обнаружены мутации, обеспечивает достаточную уверенность для ложных результатов, что позволяет нам повысить порог для анализа ДНК в фазе 3 исследование КК ≥ 750U / л. Это привело к снижению числа новорожденных, которым необходимо тестирование на мутации, примерно 68%, что представляет собой значительную экономию средств по данной программе . С дополнительным подтверждением наших выводов, эти первоначальные исследования показывают, что порог для анализа ДНК может быть поднят еще выше (например, КK ≥ 1000 Ед / л), повышение потенциального соотношения затрат и выгоды. По мере того как развивается наша программа, у нас было больше уверенности в идентификации большего количества мутаций МДД, но мы знали об ограничениях. Дополнительный тест должен будет подтвердить, что точечные мутации, присутствующие примерно у четверти пациентов с МДД, не обнаруженые в этом исследовании, обнаружены с использованием проверки ДНК, выделенной из сухих пятен крови. Тем не менее, мы уверены, что соответствующая методология была применена в данном исследовании, на основе наших предыдущих работ демонстрирующих обнаружение 506 точечных мутаций (294 нонсенс мутаций) при анализе 1111 дистрофинопатий представляющих 46% пациентов (более широко представлены в этой группе населения из-за дизайна исследования). Кроме того, группа дистрофинопатий проявляется преимущественно как кардиомиопатия, щадящая скелетные мышцы (например, Х-сцепленных кардиомиопатия) часто не входит в протокол NBS. Хорошо известно, что многие пациенты в этой группе имели уменьшение КФК в венозной крови, а некоторые даже нормальный или почти нормальный уровень, мы также выявили новорожденных на другом конце спектра с повышенным КK и но не имевших МДД. По этой причине, мы расширили исследование для решения этой задачи. На заключительном этапе этого исследования, мы сделали анализ ДНК для наиболее распространенных генов конечностных миодистрофий, если КK был ≥ 2000 Ед / л при отсутствии определеных мутаций гена дистрофина. В этом небольшом примере мы обнаружили, 1 человека с известной однонуклеотидной мутацией в DYSF, 1 - с известной миссенс мутацией в FKRP, и еще с дупликацией SGCB неизвестной патогенности, которые были зарегистрированы у 5 пациентов (Лейден, см. таблицу 2). Эти данные показывают доказательство принципа, что генные мутации КПМД могут быть определены как часть процесса отбора. Только 1 патогенный аллель был обнаружен в каждом конкретном случае, что не редкость для этих генов. Дальнейшая характеристика этих образцов должна будет оценить число изменений, указывающих на вторую, незамеченную большую делецию или дупликацию. Наше завершенное исследование не было предназначено для решения вопроса о том должны ли быть введены эти тесты, чтобы обеспечить путь для реализации терапевтической пользы для МДД. Фаза 2 программы изучила этические вопросы, связанные с путем оценки родителей через анкеты, однако, эта тема была зарезервирована для будущей статьи. Программа, которую мы ввели отличается от прошлых программ и нынешний подход для МДД требует 3 этапа: (1) КK тестирование сухой капли крови, а затем (2) подтверждение повышенного уровня КФК при анализе венозной крови, полученной на 4 - 6 недели, (3) последний шаг, который требует дополнительного анализа кровь для анализа ДНК. Подход, который мы разработали в 2 этапа, со всеми испытаниями, проведенными с использованием крови, полученной из пятки в течение первых 24 - 48 часов. Все тестирование проводилось из того же сухого пятна крови. Пороговый уровень КК определяет, будет ли проведено ДНК тестирование без дополнительного анализа крови, полученной от новорожденных. ДНК тест использует самые современные технологии available40. Лечение развивается настолько далеко, что оправдан скрининг для новорожденных на МДД требует оценки государственных и федеральных агентств с соответствующей юрисдикцией. Если будет разработана ранняя терапия, что повысит уровень здоровья для людей с МДД, наше исследование служит в качестве модели для осуществления скрининга новорожденных на МДД. Если разработка перспективной терапии МДД продолжит идти нынешними темпами, скрининг новорожденных может быть на страже этой болезни, не только в США, но и в других странах. В случае успеха терапии дистрофинопатий доступной для новорожденных, принципы исследования должны быть установлены. Ссылки 1 Drummond LM. Creatine phosphokinase levels in the newborn and their use in screening for Duchenne muscular dystrophy. Arch Dis Child 1979; 54: 362–366. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 15 2 Skinner R, Emery AEH, Scheuerbrandt G, Syme J. Feasibility of neonatal screening for Duchenne muscular dystrophy. J Med Genet 1982; 19: 1–3. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 12 3 Scheuerbrandt G, Lövgren T, Mortier W. Screening for Duchenne muscular dystrophy: an improved screening test for creatine kinase and its application in an infant screening program. Muscle Nerve 1986; 9: 11–23. Direct Link: AbstractPDF(1108K)References 4 Greenberg CR, Jacobs HK, Nylen E, et al. Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening. Lancet 1988; 2: 425–427. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 14 5 Plauchu H, Dorche C, Cordier MP, et al. Duchenne muscular dystrophy: neonatal screening and prenatal diagnosis. Lancet 1989; 1: 669. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 4 6 Naylor EW. New technologies in newborn screening. Yale J Biol Med 1991; 64: 21–24. PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 3 7 Bradley DM, Parsons EP, Clarke AJ. Experience with screening newborns for Duchenne muscular dystrophy in Wales. BMJ 1993; 306: 357–360. CrossRef,PubMed,CAS 8 Drousiotou A, Ioannou P, Georgiou T, et al. Neonatal screening for Duchenne muscular dystrophy: a novel semiquantitative application of bioluminescence test for creatine kinase in a pilot national program in Cyprus. Genet Test 1998; 2: 55–60. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 17 9 Eyskens F, Philips E. Newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. The experience in the province of Antwerp. Neuromuscul Disord 2006; 16: 721. CrossRef,Web of Science® 10 Pearce JM, Pennington RJ, Walton JN. Serum enzyme studies in muscle disease. III. Serum creatine kinase activity in relatives of patients with Duchenne type muscular dystrophy. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1964; 27: 181–185. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 95 11 Heyck H, Laudahn G, Carsten P. Enzyme activity determination in progressive muscular dystrophy. IV. Serum enzymatic kinetics in the preclinical stage of the Duchenne type during the 1st 2 years of life [in German]. Klin Wochenschr 1966; 44: 695–700. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 26 12 Zellweger H, Antonik A. Newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Pediatrics 1975; 55: 30–34. PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 83 13 Wilson JMG, Jungner G. Principles and practice of screening for disease. Public Health Paper No. 34. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 1968. 14 Ross LF. Screening for conditions that do not meet the Wilson and Jungner criteria: the case of Duchenne muscular dystrophy. Am J Med Genet A 2006; 140: 914–922. PubMed 15 Goemans NM, Tulinius M, van den Akker JT, et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med 2011; 364: 1513–1522. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 26 16 Kinali M, Arechavala-Gomeza V, Feng L, et al. Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo controlled, dose-escalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol 2009; 8: 918–928. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 128 17 Cirak S, Arechavala-Gomeza V, Guglieri M, et al. Exon skipping and dystrophin restoration in Duchenne muscular dystrophy patients after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, doseescalation study. Lancet 2011; 378: 595–605. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 11 18 Malik V, Rodino-Klapac LR, Viollet L, et al. Gentamicin-induced readthrough of stop codons in Duchenne muscular dystrophy. Ann Neurol 2010; 67: 771–780. PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 26 19 Finkel R. Read-through strategies for suppression of nonsense mutations in Duchenne/Becker muscular dystrophy: aminoglycosides and Ataluren (PTC124). J Child Neurol 2010; 25: 1158–1164. CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 11 20 Moxley RT III, Pandya S. Weekend high-dose prednisone: a new option for treatment of Duchenne muscular dystrophy. Neurology 2011; 77: 416–417. CrossRef,PubMed,Web of Science® 21 Balaban B, Matthews DJ, Clayton GH, Carry T. Corticosteroid treatment and functional improvement in Duchenne muscular dystrophy: long-term effect. Am J Phys Med Rehabil 2005; 84: 843–850. CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 38 22 Biggar WD, Harris VA, Eliasoph L, Alman B. Long-term benefits of deflazacort treatment for boys with Duchenne muscular dystrophy in their second decade. Neuromuscul Disord 2006; 16: 249–255. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 55 23 King WM, Ruttencutter R, Nagaraja HN, et al. Orthopedic outcomes of long-term daily corticosteroid treatment in Duchenne muscular dystrophy. Neurology 2007; 68: 1607–1613. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 31 24 Houde S, Filiatrault M, Fournier A, et al. Deflazacort use in Duchenne muscular dystrophy: an 8-year follow-up. Pediatr Neurol 2008; 38: 200–206. CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 19 25 Moxley RT III, Pandya S, Ciafaloni E, et al. Change in natural history of Duchenne muscular dystrophy with long-term corticosteroid treatment: implications for management. J Child Neurol 2010; 25: 1116–1129. CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 4 26 Moxley RT III, Ashwal S, Pandya S, et al. Practice parameter: corticosteroid treatment of Duchenne dystrophy: report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and the Practice Committee of the Child Neurology Society. Neurology 2005; 64: 13–20. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 74 27 Manzur AY, Kuntzer T, Pike M, Swan A. Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy. Cochrane Database Syst Rev 2008;( 1): CD003725. PubMed,CAS 28 Bushby K, Finkel R, Birnkrant DJ, et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol 2010; 9: 77–93. CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 68 29 Ciafaloni E, Fox DJ, Pandya S, et al. Delayed diagnosis in Duchenne muscular dystrophy: data from the Muscular Dystrophy Surveillance, Tracking, and Research network (MD STARnet). J Pediatr 2009; 155: 380–385. CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 13 30 Rosalki SB. An improved procedure for serum creatine phosphokinase determination. J Lab Clin Med 1967; 69: 696–705. PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 1661 31 Orfanos AP, Naylor EW. A rapid screening test for Duchenne muscular dystrophy using dried blood spot specimens. Clin Chim Acta 1984; 138: 267–274. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 11 32 Flanigan KM, von Niederhausern A, Dunn DM, et al. Rapid direct sequence analysis of the dystrophin gene. Am J Hum Genet 2003; 72: 931–939. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 77 33 Lalic T, Vossen RH, Coffa J, et al. Deletion and duplication screening in the DMD gene using MLPA. Eur J Hum Genet 2005; 13: 1231–1234. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 45 34сAhn JW, Ogilvie CM, Welch A, et al. Detection of subtelomere imbalance using MLPA: validation, development of an analysis protocol, and application in a diagnostic centre. BMC Med Genet 2007; 8: 9. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 12 35 Rudolph N, Gross RT. Creatine kinase activity in serum of newborn infants as indicator of fetal trauma during birth. Pediatrics 1966; 38: 1039–1046. PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 36 36 Bodensteiner JB, Zellweger H. Creatine phosphokinase in normal neonates and young infants. J Lab Clin Med 1971; 77: 853–858. PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 40 37 Gilboa N, Swanson JR. Serum creatine phosphokinase in normal newborns. Arch Dis Child 1976; 51: 283–285. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 32 38 Gregg, RG, Simantel A, Farrell PM, et al. Newborn screening for cystic fibrosis in Wisconsin: comparison of biochemical and molecular methods. Pedatrics 1997; 99: 819–824. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 75 39 van Ommen GJB, Scheuerbrandt G. Neonatal screening for muscular dystrophy. Consensus recommendation of the 14th workshop sponsored by the European Neuromuscular Center (ENMC). Neuromuscul Disord 1993; 3: 231–239. CrossRef,PubMed,CAS 40 Flanigan KM, Dunn DM, von Niederhausern A, et al. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Hum Mutat 2009; 30: 1657–1666. Direct Link: AbstractPDF(316K)References 41 Arbustini E, Diegoli M, Morbini P, et al. Prevalence and characteristics of dystrophin defects in adult male patients with dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2000; 35: 1760–1768. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 31 42 Kimura S, Ikezawa M, Ozasa S, et al. Novel mutation in splicing donor of dystrophin gene first exon in a patient with dilated cardiomyopathy but no clinical signs of skeletal myopathy. J Child Neurol 2007; 22: 901–906. CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 4 43 Feng J, Yan J, Buzin CH, et al. Mutations in the dystrophin gene are associated with sporadic dilated cardiomyopathy. Mol Genet Metab 2002; 77: 119–126. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 32 44 Nguyen K, Bassez G, Krahn M, et al. Phenotypic study in 40 patients with dysferlin gene mutations: high frequency of atypical phenotypes. Arch Neurol 2007; 64: 1176–1182. CrossRef,PubMed,Web of Science® Times Cited: 50 45 Trabelsi M, Kavian N, Daoud F, et al. Revised spectrum of mutations in sarcoglycanopathies. Eur J Hum Genet 2008; 16: 793–803. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 9 46 Brockington M, Yuva Y, Prandi P, et al. Mutations in the fukutin-related protein gene (FKRP) identify limb girdle muscular dystrophy 2I as a milder allelic variant of congenital muscular dystrophy MDC1C. Hum Mol Genet 2001; 10: 2851–2859. CrossRef,PubMed,CAS,Web of Science® Times Cited: 215 Оригинальна статья : http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ana.23528/full Переведено проектом МОЙМИО: http://www.mymio.org/
