Document 2341834

понятными. В связи с этим важнейшей и актуальной задачей данной работы были
разработка методов кристаллизации мутантов обелина в двух конформационных
состояниях – в комплексе с активированным субстратом и в комплексе с продуктом
реакции. Получение и сравнение пространственных структур четырех комплексов
позволило выявить ключевую роль молекул воды и системы водородных связей в
функционировании
данных
фотопротеинов.
Цели,
поставленные
в
данной
диссертации, позволили получить новые данные о роли ряда аминокислотных
остатков активного центра в механизме биолюминесценции.
Литературный обзор изложен на 33 страницах, содержит 15 рисунков. Обзор
написан профессионально, четко и ясно, дает полное представление о современном
уровне знаний в данной области. Можно сделать лишь некоторые замечания. Так на
рис. 1.2 нумерация аминокислотных остатков не совпадает с нумерацией этих
остатков в тексте. Некоторые рисунки, по-видимому, взяты из литературы, но не
везде в подписях к рисункам даны ссылки на цитируемые работы. В качестве вывода
из анализа литературных данных в конце обзора было бы желательно определить те
ключевые моменты, которые представляют особый интерес для автора, и
обосновать выбор именно тех мутантов, которые являются предметом данного
исследования.
Глава «Материалы и методы» занимает всего 7 страниц, написана слишком
кратко. Например, на стр. 50 нет детального описания, как характеризовали
относительную
биолюминесцентную
активность
–
по
максимуму
биолюминесценции или по интегральной интенсивности. Не описаны условия
измерения спектров биолюминесценции – длительность регистрации спектров
биолюминесценции, длины волн возбуждения при регистрации флуоресценции и т.д.
Встречаются неудачные выражения вроде «спад биолюминесцентных реакций», а
нужно писать: «спад интенсивности биолюминесценции». Встречаются отдельные
опечатки: на стр. 46 вместо «250 мкг/мл» написано «250 мг/мл».
В главах 3 и 4 автор излагает результаты, полученные по пространственной
структуре двух мутантов обелина в двух состояниях: связанных с исходным
субстратом, 2-гидропероксицелентаразином, и с продуктом биолюминесцентной
реакции – целентерамидом и ионами кальция. Эта часть диссертации производит
очень хорошее впечатление прежде всего благодаря высокому экпериментальному
уровню проведенной работы. Впервые получены кристаллы для четырех белков,
установлены
их
пространственные
структуры
с
высоким
разрешением,
2
представлены прекрасные двухмерные изображения структур активного центра двух
конформационных состояний мутантов обелина – до и после реакции. Проведен
тщательный анализ полученных данных, сравнение их с результатами более ранних
работ. Показано, что хотя мутации и не меняют общие структуры фотопротеинов и
положение основных аминокислотных остатков активного центра, однако вносят
некоторые минорные изменения в системы водородных связей и, прежде всего,
влияют на функционирование молекулы воды в активном центре. Так в мутанте
Тyr138Phe, связанном с субстратом, в отличие от обелина дикого типа, одна
молекула воды отсутствует в активном центре, поскольку введенный вместо
тирозина остаток фенилаланина не способен образовать водородную связь с
субстратом. Однако в комплексе Тyr138Phe с продуктом реакции молекула воды
вновь появляется во
внутренней полости активного
центра в результате
конформационных изменений системы, инициированных связыванием белка с
ионами кальция. Некоторые вопросы возникают при рассмотрении рисунков.
Например, на рис. 3.8 не ясно, чем отличаются левые и правые изображения. Почему
структура комплекса мутанта с продуктом представлена на рис. 4.2Б в виде двух
почти разделенных доменов? Не ясно, приводимые на рисунках 4.4, 4.5, 4.7
двумерные рисунки сети водородных связей для дикого обелина и акворина
построены ли автором диссертации или цитируются по литератуным данным. Это
следовало бы указать.
В главе 5 автор получил уникальные результаты при исследовании
взаимодействия апо-обелина с целентеразином в анаэробных условиях. Показано
быстрое образование прочного комплекса между белком и субстратом, изучена
кинетика его превращения
в активный фотопротеин при взаимодействии с
кислородом воздуха, сделан вывод о том, что процесс образования активного
фотопротеина, комплекса обелина с 2-гидроксиценлентеразином, протекает в
несколько стадий.
Диссертация
Наташина
П.В.
является
законченным
исследованием,
выполненным на высоком экспериментальном и теоретическом уровне, результаты
которого вносят новый ценный вклад в понимание механизма функционирования
биолюминесцентной системы кальций-регулируемых фотопротеинов и несомненно
будут использованы при создании новых биоаналитических систем. Результаты и
выводы работы Наташина П.В. не вызывают сомнения в их достоверности и
надежности. Материал диссертации изложен последовательно, результаты каждого
3