Е Кс п Е ри м Е н та л... хараКтЕристиКа тиаминтрифосфатазы плазматичЕсКой мЕмбраны нЕрвных КлЕтоК

Е Кс п е р и м е н т а л ь н і р о б о т и
УДК 577.152.3:577.164.11
характеристика тиаминтрифосфатазы
плазматической мембраны нервных клеток
А. А. Сидорова, С. П. Степаненко, Ю. М. Пархоменко
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев;
e-mail: sidorovanastya@mail.ru
Исследованы кинетические параметры реакции гидролиза тиаминтрифосфата (ThTP) препаратами плазматических мембран синаптосом, изолированных из головного мозга крыс. Показано, что
оптимум рН тиаминтрифосфатазной (ThTP-азной) реакции лежит в зоне 7,4, кажущаяся K m составляет 52 мкМ, кажущаяся константа сродства по Мg2+ составляет 1,9 мМ.
Проведен сравнительный анализ указанных параметров для ThTP-азной активности мембранносвязанных (результаты данного исследования и описанные в литературе) и цитозольного (данные
литературы) протеинов, который позволяет сделать предположение о том, что описанный ранее
тиаминсвязывающий протеин является единственным носителем ThTP-азной активности в плазматических мембранах нервных клеток.
Показано, что активный центр энзима, катализирующего реакцию гидролиза ThTP в плазматических мембранах нервных клеток, ассоциирован с цитоплазматической поверхностью мембраны.
К л ю ч е в ы е с л о в а: тиамин, тиаминтрифосфат, тиаминтрифосфатаза, плазматические
мембраны синаптосом, тиаминсвязывающий протеин.
Н
акопленные на сегодня сведения от­
носительно особенностей обмена тиа­
мина и его участия в клеточном мета­
болизме, к сожалению, не способны прояснить
вопрос, почему дефицит тиамина, независимо
от его происхождения, вызывает дегенератив­
ные изменения, прежде всего в нервных клет­
ках. Между тем выяснение этого вопроса чрез­
вычайно актуально, поскольку развитие ряда
нейродегенеративных заболеваний связывают
с нарушением обмена тиамина [1–4]. Весо­
мым доказательством особой роли макроэр­
гического фосфорилированного производного
витамина В1 – тиаминтрифосфата (ThTP) в
функционировании нервных клеток явилось
установление того факта, что развитие леталь­
ного генетического заболевания – сверхнекро­
тизирующая энцефаломиелопатия (болезнь
Лея) – обусловлено нарушением синтеза этого
соединения в нервных клетках при отсутствии
явных изменений в активности тиаминдифос­
фатзависимых энзимов [1]. Это наблюдение
инициировало формирование представлений
о наличии в нервных клетках процессов, су­
щественных для их функционирования, в ко­
торых принимают участие производные ти­
амина, в частности ThTP, по некоэнзимным
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
механизмам [2]. Действительно, было пока­
зано, что ThTP, так же как и тиаминдифос­
фат (ThDP) – независимо от его коэнзимной
функции – могут принимать непосредствен­
ное участие в регуляции активности пиру­
ватдегидрогеназного комплекса по механизму
фосфорилирования–дефосфорилирования [5]
и, таким образом, принимать участие в регу­
ляции синтеза ацетилхолина [6]. Было также
показано, что ThTP является специфическим
донором фосфата в фосфорилировании одного
из белков ацетилхолинового рецептора – рап­
сина [7]. Эти отрывочные наблюдения не дают
полного представления о биологической роли
ThTP в нервных клетках. Однако анализ сово­
купности данных относительно обмена тиами­
на и его биологически активных производных
в нервных клетках привел к формированию
представления о наличии в них подвижного
пула тиамина и его фосфатов, циркуляция
которого между внутриклеточным пространст­
вом и пресинаптической щелью обеспечивает
сопряжение обмена тиамина с функцией нерв­
ных клеток [1, 8]. Предположительно, ThTP
является важным компонентом этого пула
производных тиамина. Мы также предполага­
ем, что изолированный ранее из ткани мозга
57
експериментальні роботи
тиаминсвязывающий протеин (ТСП) [9–11]
опосредует перенос тиамина через плазмати­
ческую мембрану как при его захвате клет­
ками, так и при высвобождении. Сведения о
мембранной локализации ТСП [10] и выяв­
ленная способность его избирательно гидро­
лизовать фосфорные эфиры тиамина [11] со­
ответствуют ранним наблюдениям, сделанным
в опытах с нервно-мышечными препаратами,
которые свидетельствуют о том, что из этих
препаратов при возбуждении высвобождается
в среду свободный тиамин, а не его фосфор­
ные эфиры, которые превалируют в общем
внутриклеточном пуле производных тиамина
[12]. Последнее наводит на мысль о том, что в
возбудимой мембране с цитозольной стороны
должен присутствовать протеин (или протеи­
ны), осуществляющий при определенных ус­
ловиях избирательный гидролиз тиаминфос­
фатов, в частности ThTP, поскольку доказано,
что ThDP и ThTP не могут проникать через
плазматическую мембрану [13]. Таким протеи­
ном, возможно, и является ТСП.
По своим функциональным свойствам
ТСП можно отнести к транспортерам тиамина
(ТТ), наличие которых в тканях человека было
выявлено при расшифровке этиологии болез­
ни «тиаминзависимая мегалобластическая
анемия» [14]. При этой болезни у людей был
выявлен генетический дефект, следствием ко­
торого стало нарушение транспорта тиамина в
клетки. В итоге ученые идентифицировали ген
ТТ [15], а далее был экспрессирован и исследо­
ван сам протеин [16]. Никаких упоминаний о
наличии у ТТ способности гидролизовать фос­
форные эфиры тиамина нет, хотя некоторые
бактериальные транспортеры тиамина относят
к семейству транспортных АТР-аз [17]. Не­
смотря на то, что вышеуказанные протеины,
а именно изолированный нами и описанный
в литературе ТТ, отличаются по описанным
свойствам, мы допускаем, что одна из двух
субъединиц ТСП [11] может соответствовать
описанному ТТ или быть ему гомологичной,
а другая – проявлять тиаминфосфатгидро­
лазную, в частности тиаминтрифосфатазную
(ThTP-азную) активность.
Кроме этого протеина в литературе описа­
но два различных энзима с ThTP-азной актив­
ностью. Один из них локализован в цитозоле
(растворимая ThTP-аза), другой – в мембран­
ных структурах клеток (мембранносвязанная
ThTP-аза). Растворимая ThTP-аза (КФ 3.6.1.28)
в настоящее время изучена достаточно хорошо,
идентифицирован ген, кодирующий этот про­
теин [18, 19]. Что же касается мембранносвя­
58
занной ThTP-азы, описанной в литературе, то
информация об этом протеине весьма ограни­
чена [20, 21]. Впервые описанный в 1972 году
как «мембранно-ассоциированная» ThTP-аза
[20], он до сих пор не был изолирован и иден­
тифицирован. Установление мембранной ло­
кализации изолированного нами ранее ТСП,
проявляющего тиаминфосфатгидролазную ак­
тивность, в том числе ThTP-азную активность
[10], дает основания задуматься о том, не иден­
тичен ли этот протеин (возможно одна из двух
его субъединиц [17]) протеину, описанному
Barchi et al. [20, 21].
В связи с вышесказанным, целью настоя­
щей работы является исследование свойств
тиаминтрифосфатазной активности, ассоции­
рованной с плазматическими мембранами си­
наптосом, сравнительный анализ полученных
данных со свойствами описанных в литературе
ThTP-аз и изолированного ТСП, а также изу­
чение внутримембранной локализации актив­
ного центра, отвечающего за гидролиз ThTP.
Материалы и методы
В работе использовали АТР, уабаин, ал­
когольдегидрогеназу, сахарозу, пируват (Sigma,
США), трисгидроксиметиламинометан, диги­
тонин (Merck, Германия), тиаминдифосфат,
NАDН (Fluka, Швейцария). Тиаминтрифос­
фат гидрохлорид был синтезирован и любезно
предоставлен нам проф. В. Н. Сильниковым
(Институт химической биологии и фундамен­
тальной медицины РАН, Новосибирск), за что
мы выражаем ему глубокую благодарность.
Остальные реактивы были отечественного
производства квалификации чда и хч.
В экспериментах использованы крысы
самцы с массой тела 180–200 г.
Плазматические мембраны синаптосом
(ПМС) получали из мозга крыс методом диф­
ференциального центрифугирования в градиен­
те плотности сахарозы как описано ранее [10].
Содержание протеина в мембранном препара­
те определяли по методу Лоури.
ThTP-азную активность ПМС определяли
по накоплению ThDP, который образовался в
результате реакции гидролиза ThTP. Энзима­
тическое определение ThDP основывается на
рекомбинации его как коэнзима с апопиру­
ватдекарбоксилазой (апоПДК) и проведении
реакции с избытком пирувата в присутствии
алкогольдегидрогеназы (АДГ) [22]. Реакция
учитывалась по окислению NADH. АпоПДК
для определения ThDP получали из пивных
дрожжей (Saccharomyces carlsbergensis) в виде
сульфатной пасты, которую хранили при
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
А. А. Сидорова, С. П. Степаненко, Ю. М. Пархоменко
‑20 °С. Непосредственно перед работой из пас­
ты получали апоэнзим [22].
ThTP-азную активность определяли при
37 °С в стандартной среде инкубации (объ­
ем 0,25 мл), которая содержала: 50 мМ трисHCl-буфер, pН 7,4; 5 мМ МgCl2, 80 мкМ ThTP.
Время инкубации – 20 мин. При определении
внутримембранной локализации активного
центра энзима использовали среду инкубации,
содержащую вместо 50 мМ трис-HCl-буфера
(pН 7,4) 0,1 М К-фосфатный буфер, pН 7,4.
Энзиматическую реакцию инициировали вве­
дением в среду инкубации 50 мкл суспензии
ПМС (50 мкг протеина) и останавливали до­
бавлением 1 мл 0,05 М Na-фосфатного буфера,
рН 6,8. Для количественного определения об­
разовавшегося ThDP 0,1 мл аликвоты инкуби­
ровали в течение 30 мин при 25 °С с апоПДК
[22]. Активность определяли в сопряженной
с АДГ реакции по снижению поглощения
NADH при 340 нм. Количество образовавше­
гося ThDP рассчитывали по калибровочной
кривой, которую строили, используя опре­
деленные концентрации хроматографически
чистого ThDP.
Исследование свойств мембранносвязан­
ной ThTP-азы во фракции ПМС проводили в
стандартной среде инкубации, изменяя соот­
ветствующие параметры и компоненты:
- влияние рН изучали в интервале кон­
центрации ионов водорода – 5,0–9,0, исполь­
зуя трис-НСl и трис-малеат-NaOH-буфер;
- влияние ThTP исследовали, изменяя его
концентрацию в пределах 20–100 мкМ;
- влияние ионов Mg2+ изучали, изменяя диа­
пазон концентраций MgCl2 в пределах 0,5–10 мМ.
Na+,K+-АТР-азную активность измеряли
по накоплению продукта реакции Рі методом
Rathbun & Betlach [23] при 37 °С в среде инку­
бации, содержащей 20 мМ HEPES-трис-буфер
(рН 7,4), 3 мМ MgCl2, 130 мМ NaCl, 20 мМ
KCl, 1 мМ ATP, 0,2 мМ ЕДТА, 1,25 мМ ди­
тиотрейтол, 50 мкг протеина фракции ПМС.
Время инкубации – 4 мин.
Активность ацетилхолинэстеразы опреде­
ляли по методу Ellman et al. [24] при 37 °С
в среде инкубации следующего состава: 0,1 М
К-фосфатный буфер рН 8,0, 0,33 мМ 5,5-ди­
тио-бис-2-нитробензойная кислота, 0,5 мМ
ацетилтиохолиниодид, 50 мкг протеина. Вре­
мя инкубации – 10 мин.
В экспериментах по изучению влияния
перфоратора плазматической мембраны диги­
тонина на энзиматическую активность Na+,K+АТР-азы, ацетилхолинэстеразы и ThTP-азы в
стандартную среду инкубации вносили алик­
воту водного раствора дигитонина до получе­
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
ния конечной концентрации в пределах 0,005–
0,2%.
Определение внутримембранной локализации активного центра протеина, отвечающего
за гидролиз ThTP в ПМС. Был применен ме­
тод, описанный ранее [25], который основан
на определении активности энзимов в ПМС до
и после обработки фракции детергентом диги­
тонином (0,005–0,2%). Для сравнения с ThTPазной активностью нами были использованы
активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) – эн­
зима, активный центр которого находится на
внешней поверхности мембраны, и активность
Na+,K+-АТР-азы, имеющей локализацию ак­
тивного центра с внутренней поверхности
мембраны.
Ход рассуждений авторов заключается в
следующем [25].
При условии гетерогенности фракции
ПМС суммарное количество везикул по про­
теину n 0 составляет:
n+ + n– + n = n 0 (1),
где n+ – количество правильно ориентирован­
ных везикул, n– – количество неправильно
ориентированных везикул, n – количество ра­
зорванных фрагментов.
Из уравнения 1 имеем:
n n n
n0 n0 n0
1
(2)
или
θ+ + θ– + θ = 1,
(3)
+
где θ – относительное количество правильно
ориентированных везикул, θ– – относительное
количество неправильно ориентированных
везикул, θ – относительное количество разор­
ванных фрагментов.
Далее в расчете использовали активность
маркерных энзимов.
Поскольку активный центр АХЭ находит­
ся на внешней стороне мембраны, то ее актив­
ность (А) тестируется только в случае правиль­
но ориентированных и разорванных везикул:
А = k (θ+ + θ)
При разрушении везикул под действием
детергента активность АХЭ будет максималь­
ной (А max = k).
В связи с тем, что активный центр Na+,K+АТР-азы находится с цитоплазматической сто­
роны мембраны, а рецептор к оуабаину – с
внешней, активность оуабаинчувствительной
Na+,K+-АТР-азы (N ) тестируется только в слу­
чае разорванных фрагментов:
N = k′ θ.
59
експериментальні роботи
Из параметров, которые характеризуют
индивидуальные особенности энзиматической
активности двух и более протеинов с одина­
ковой биохимической активностью, для про­
теинов с ThTP-азной активностью, описанных
в литературе, упоминаются следующие: усло­
вия, при которых проявляется максимальная
активность (прежде всего рН-оптимум), ки­
нетические параметры реакции, зависимость
реакции от наличия в среде ионов металлов, в
основном Mg2+. Все эти параметры мы иссле­
довали для реакции гидролиза ThTP плазма­
тическими мембранами синаптосом.
Оптимальное значение концентрации
водородных ионов для протекания катализи­
руемой реакции является характерной осо­
бенностью конкретных энзимных протеинов.
Именно различное значение оптимума рН для
активности двух исследованных ThTP-аз (мем­
бранносвязанной и цитозольной) стало осно­
ванием в самом начале исследования этой ак­
тивности для предположения о существовании
в нервных клетках двух различных протеинов,
осуществляющих гидролиз ThTP [20]. Соот­
ветственно было установлено, что рН оптимум
для гидролиза ThTP цитозольным энзимом
приближается к 8,9–9,5 [27], а мембранносвя­
занным – 6,5 [20].
0.16
0,16
0.14
0,14
ɧɦɨɥɶ ThDP/ɦɢɧ•ɦɝ ɛɟɥɤɚ
Результаты и обсуждение
Следует отметить, что при определении
рН-оптимума последнего энзима авторы по­
лучили довольно пологий пик и, комментируя
эти результаты, они считают, что оптимальное
значение рН для мембранносвязанной ThTPазы находится в диапазоне рН от 6,5 до 7,2.
Для изолированного нами ранее ТСП рН-оп­
тимум был найден равным 7,4 [11].
Принимая во внимание вышеприведен­
ные данные, скорость реакции гидролиза
ThTP препаратами плазматических мембран
мы измеряли при варьировании рН в диапа­
зоне 5,0–9,0, а именно брали следующие фик­
сированные значения рН: 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,4;
8,0; 9,0. Приведенные на рис. 1 данные свиде­
тельствуют о наличии на графике одного чет­
кого пика в точке, соответствующей значению
рН 7,4.
Изучение реакции гидролиза ThTP, прове­
денное ранее [20], свидетельствует о необходи­
мости присутствия ионов металлов для ее про­
текания, наиболее активным оказался Мg2+.
Было показано, что поскольку ThTP обладает
высокой хелатирующей способностью, он об­
разует устойчивый комплекс с двухвалентны­
ми ионами, в частности с Мg2+ (Kd 6,5⋅10-5 М)
[21]. Предполагается, что не свободный ThTP,
а его комплекс с металлом является истин­
ным субстратом как для мембранносвязанной
ThTP-азы [21], так и для цитозольного энзи­
ма [27]. Также предполагается, что Мg2+ при­
нимает участие в акте катализа не только как
компонент металлосубстратного комплекса, но
и как активатор энзима, поскольку последний
проявляет каталитическую активность только
в случае, если рассчитанная исходная кон­
нмоль ThDP/мин на 1 мг протеина
После обработки детергентом активность
оуабаинчувствительной Na+,K+-АТР-азы ста­
новится максимальной (Nmax = k′), где k, k′ –
коэффициенты пропорциональности.
Кинетический анализ экспериментальных
данных. Кажущиеся кинетические параметры,
которые характеризуют реакцию гидролиза
ThTP: значение константы активации иона­
ми Mg (K Mg), величина константы Михаэлиса
(K m) и начальная максимальная скорость реак­
ции гидролиза ThTP по Mg2+ (VMg) и по ThTP
(Vmax) – определяли методом Лайнуивера-Бер­
ка [26]. Полученные концентрационные зави­
симости скорости энзиматической реакции от
количества исследуемых субстратов в реакции
гидролиза (ThTP и Mg2+) строили в координа­
тах: 1/V от 1/S, где S – заданная концентрация
реагентов ThTP или Mg2+, а V – скорость эн­
зиматического гидролиза ThTP при заданной
концентрации ThTP или Mg2+ соответственно.
Статистический анализ экспериментальных данных. Полученные результаты обрабаты­
вали статистически с использованием t‑кри­
терия Стьюдента. Кинетический анализ и
статистическую обработку данных проводили
с помощью программы Excel.
0.12
0,12
0,10
0.1
0.08
0,08
0.06
0,06
0.04
0,04
0.02
0,02
0
4
55
66
pH
77
8
9
9
pH
Ɋɢɫ.
1. 1. Зависимость тиаминтрифосфатазной
Рис.
активности плазматической мембраны синаптосом от рН среды (M ± m, n = 6)
0,4
ISSN 0201
0,35 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
/ɦɢɧ•ɦɝ ɛɟɥɤɚ
60
0,3
0,25
0,2
10
0
4
5
6
7
8
9
10
pH
А. А. Сидорова, С. П. Степаненко, Ю. М. Пархоменко
0,40
0,4
0,4
0,40
нмольɧɦɨɥɶ
ThDP/мин
на 1 мг протеина
ThDP/ɦɢɧ·ɦɝ
ɛɟɥɤɚ
нмольɧɦɨɥɶ
ThDP/мин
на 1 мгɛɟɥɤɚ
протеина
ThDP/ɦɢɧ•ɦɝ
Ɋɢɫ. 1.
0,35
0,35
0,30
0,3
0,25
0,25
0,20
0,2
0,15
0,15
0,10
0,1
0,05
0,05
00
0
2
4
6
MgCl22, мМ
mM
MgCl
8
10
10
0,35
0,35
0,3
0,30
0,25
0,25
0,2
0,20
0,15
0,10
0,1
0,05
0,05
0
12
12
0
0,02
0,02
0,04
0,04
0,06
0,06
0,08
0,10
0,08
0,1
мМ
0,12
0,12
ThTP,
ThTP, ɦM
Ɋɢɫ.
2. 2. Зависимость тиаминтрифосфатазной
Рис.
Ɋɢɫ.
3. 3. Зависимость тиаминтрифосфатазной
Рис.
активности плазматической мембраны синапто­
сом от концентрации ионов Mg2+ при постоянной
концентрации ТhТР 80 мкМ (M ± m, n = 7)
активности плазматической мембраны синаптосом от концентрации ТhТР при постоянной
концентрации Mg2+ 5 мМ (M ± m, n = 7)
центрация свободного Мg2+ в пробе не ниже
0,1 мМ. Этот эффект Мg2+ можно объяснить,
рассматривая его как субстрат, не подвергаю­
щийся превращению, а реакцию в целом – как
двухсубстратную.
Учитывая вышесказанное, нами были
проведены исследования зависимости ThTPазной активности ПМС от концентрации в
среде ионов Mg2+ в диапазоне 0,5–10 мМ при
постоянной концентрации ThTP (80 мкМ).
Согласно полученным данным, для ThTPазы ПМС наблюдается зависимость энзима­
тической реакции от ионов Мg2+ (рис. 2), по­
добная описанной для мембранносвязанной
ThTP-азы [21]. Повышение концентрации Мg2+
в среде от 0,5 до 5 мМ приводит к плавному
возрастанию ThTP-азной активности. Макси­
мальная активация ионами Мg2+ наблюдается
при их концентрации около 5 мМ. Значение
константы активации ионами Mg (K Mg) равно
1,9 мМ, а максимальная скорость реакции гид­
ролиза ThTP по Mg (VMg) – 0,50 ± 0,02 нмоль
ThDP/мин на 1 мг протеина.
Аналогичным образом исследовали за­
висимость скорости реакции гидролиза ThTP
препаратами ПМС от концентрации основно­
го субстрата (ThTP) в диапазоне 20–100 мкМ
при концентрации в среде Mg2+ 5 мМ (рис. 3).
Величина кажущейся K m определена равной
52 мкМ, Vmax – 0,51 ± 0,02 нмоль ThDP/мин на
1 мг протеина.
Для проведения сравнительного анализа
имеющихся сведений о ThTP-азной активнос­
ти, выявленной в нервных клетках, мы объеди­
нили в табл. 1 данные по некоторым харак­
терным параметрам энзиматических реакций
гидролиза
ThTP, описанные в литературе и
100
полученные в настоящем исследовании. В таб­
лице
80 приведены данные о значении рН-опти­
1
мума реакций и кажущихся констант сродства
2+
к Мg
и ThTP. Следует отметить, что из двух
2
60
возможных методов определения активности
3
ThTP-азы
– по образованию Pi (мало специ­
40
фичному) или ThDP (высокоспецифичному),
последний
метод использован при изучении
20
активности растворимой ThTP-азы, ТСП, а
также
в данном исследовании. В ранних ра­
0
ботах 0 Barchi 0.05
et al. [20,0.1 21] активность
мем­
0.15
0.2
бранносвязанной ThTP-азы
оценивалась
по
ɞɢɝɢɬɨɧɢɧ
%
образованию Pi. В этом случае при работе с
мембранными
препаратами возможно включе­
Ɋɢɫ.
4.
ние в реакцию неспецифических фосфатаз и
полученные результаты едва ли можно считать
корректными.
Как можно видеть из данных, приведен­
ных в табл. 1, величина оптимума рН для
ThTP-азной активности, ассоциированной с
препаратами ПМС, совпадает с таковой, опре­
деленной ранее для изолированного ТСП (7,4)
[11] и ближе по значению к величине рН-оп­
тимума, определенного Barchi et al. для мемб­
ранносвязанного энзима (6,5–7,2) [20, 21], чем
для водорастворимого (8,9–9,5). Отсутствие
четко выраженного пика при определении
рН-оптимума для мембранносвязанной ThTPазы в работах Barchi et al., о чем упоминалось
выше, может свидетельствовать о вмешатель­
стве в реакцию гидролиза ThTP неспецифи­
ческих кислых фосфатаз, что фиксируется при
определении активности по образованию Pi.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
ɮɟɪɦɟɧɬɚɬɢɜɧɚɹ ɚɤɬɢɜɧɨɫɬɶ, %
120
61
0.25
експериментальні роботи
Т а б л и ц а 1. Параметры энзимов, катализирующих гидролиз ThTP, M ± m, n = 5–7
pH
оптимум
K Mg, мМ
K m,
мкМ
Растворимая ThTP-аза
8,7–9,5
1,3
Мембранносвязанная
ThTP-аза
6,5–7,2
ThTP-аза, ассоциированная
с ТСП
ThTP-аза, ассоциированная
с препаратами ПМС
Энзимы
Специфичность к
тиаминфосфатам
Ссылка
ThTP
ThDP
ThMP
43
+
–
–
1,5
1500
+
7,4
2,0 ± 0,3
50
+
+
+
[11]
7,4
1,9 ± 0,4
52 ± 7
+
+
+
данное
исследование
не показано
[27]
[20, 21]
Условные обозначения: ТСП – тиаминсвязывающий протеин, ПМС – плазматическая мембрана синапто­
сом
Следует также учитывать, что этот параметр,
определенный разными исследователями в
различных условиях может не совпадать даже
для одного и того же протеина. С учетом ска­
занного выше относительно метода определе­
ния ThTP-азной активности в работах Barchi et
al. [20, 21], можно согласиться, что эта разни­
ца в значениях рН-оптимума не является ре­
шающей. Сродство к иону Mg анализируемых
энзимов, которое характеризуется показателем
K Mg, существенно не отличается. Для раство­
римой ThTP-азы величина K Mg определена
равной 1,3 мМ [27], для мембранносвязанно­
го энзима – 1,5 мМ [21], для изучаемой нами
ThTP-азы – 1,9 мМ.
Не наблюдается существенных различий
в величинах кажущихся K m для ThTP-азной
активности изолированного ТСП, препаратов
ПМС и цитозольного энзима. Данные по этому
параметру для мембранносвязанной ThTP-азы,
описанной Barchi et al. [20, 21], скорее всего,
не являются корректными, как уже говорилось
выше.
В данный сравнительный анализ мы
включили также сродство ThTP-аз к дру­
гим фосфорным эфирам тиамина. Имеются
сведения о том, что описываемая нами мем­
бранносвязанная ThTP-аза, так же как и ТСП,
проявляет избирательную активность по от­
ношению ко всем тиаминфосфатам, включая
ThDP и ThMP, но не гидролизует ни один из
известных нуклеотидтрифосфатов [11]. Цито­
зольный энзим является строго специфичным
только к ThTP. Что же касается мембранносвя­
занной ThTP-азы, описанной Barchi et al., то
строгая специфичность только к ThTP не была
показана, поэтому нельзя исключить возмож­
62
ность, что этот протеин также способен гидро­
лизовать ThDP и ThMP.
Как можно заключить из вышеприве­
денных данных, определенные нами харак­
теристики энзима в составе плазматических
мембран синаптосом, который катализирует
ThTP-азную активность, совпадают с такими
же параметрами для изолированного ранее из
ПМС тиаминсвязывающего протеина.
Контроль полученной нами фракции
ПМС, с которой ассоциирована изучаемая
нами ThTP-азная активность, с помощью
электронной микроскопии показал, что по
своей топологии она является гетерогенной –
содержит замкнутые везикулы и разорванные
фрагменты. При этом замкнутые везикулы мо­
гут быть ориентированы цитоплазматической
поверхностью внутрь и/или наружу. В связи
с этим, исходя из активности АХЭ и Na+,K+АТР-азы до и после обработки фракции ПМС
детергентом, мы количественно (по содержа­
нию протеина) охарактеризовали топологию
мембранных фрагментов (см. материалы и ме­
тоды).
Согласно полученным данным (табл. 2,
контроль), фракция ПМС на 59 ± 5% пред­
ставлена правильно ориентированными вези­
кулами, на 9 ± 3% – везикулами, ориентиро­
ванными цитоплазматической поверхностью
наружу, и на 32 ± 5% – невезикулированными
фрагментами плазматической мембраны.
Для определения локализации активного
центра, с которым взаимодействует ThTP как
субстрат, мы провели количественный анализ
топологии мембранного препарата по опреде­
ляемой активности АХЭ, оуабаинчувствитель­
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
ThTP, ɦM
Ɋɢɫ. 3.
120
120
100
100
ɮɟɪɦɟɧɬɚɬɢɜɧɚɹ ɚɤɬɢɜɧɨɫɬɶ, %
Энзиматическая активность, %
А. А. Сидорова, С. П. Степаненко, Ю. М. Пархоменко
80
80
1
60
60
2
2
3
40
40
20
20
00
00
0.05
0,05
0.1
0.15
0,10
0,15
ɞɢɝɢɬɨɧɢɧ
Дигитонин,
%%
0.2
0,20
Рис.4. 4. Влияние дигитонина на активность энɊɢɫ.
зимов в плазматической мембране синаптосом:
1 – ацетилхолинэстеразная активность, 2 –
Na+,K+-АТР-азная активность, 3 – ThTP-азная
активность. За 100% принят уровень максимальной активации энзима (M ± m, n = 6)
ной Na+,K+-АТР-азы и ThTP-азы до и после
обработки ПМС детергентом (рис. 4) для двух
возможных вариантов (табл. 2).
1) Активный центр ThTP-азы находится
с цитоплазматической стороны. В этом слу­
чае количественное соотношение везикули­
рованных фрагментов мембранного препарата
практически совпадает с таковым в контроле в
случае использования АХЭ и оуабаинчувстви­
тельной Na+,K+-АТР-азы.
2) Активный центр ThTP-азы находится с
внешней стороны (подобно ацетилхолинэсте­
разе). В этом случае количественное соотно­
шение
везикул отличается от контрольного.
0.25
Результаты проведенного нами анализа
свидетельствуют, что активный центр энзи­
ма, проявляющего ThTP-азную активность в
плазматических мембранах синаптосом, имеет
цитоплазматическую ориентацию.
В целом результаты, полученные в данном
исследовании, дают основание предполагать,
что наиболее вероятным носителем тиамин­
Т а б л и ц а 2. Топология препаратов плазматической мембраны синаптосом (ПМС), с которыми проводились исследования
Количественное соотношение
мембранного препарата
Энзимные системы
Контроль
АХЭ и оуабаинчувствительная Na+,K+-АТР-аза
θ+ = 59 ± 5%
θ– = 9 ± 3%
θ = 32 ± 5%
Вариант 1. Активный центр ThTP-азы с внешней стороны ПМС
АХЭ и ThTP-аза
(θ+ + θ) = 90 ± 3% (по АХЭ)
(θ+ + θ) = 42 ± 5% (по ThTP-азе)
ThTP-аза и оуабаинчувствительная Na+,K+-АТР-аза
θ+ = 10 ± 3%
θ– = 58 ± 6%
θ = 32 ± 4%
Вариант 2. Активный центр ThTP-азы с цитоплазматической стороны ПМС
АХЭ и ThTP-аза
θ+ = 60 ± 5%
θ– = 11 ± 3%
θ = 29 ± 6%
ThTP-аза и оуабаинчувствительная Na+,K+-АТР-аза
θ+ = 58 ± 6%
θ– = 10 ± 2%
θ = 32 ± 4%
Условные обозначения: θ+ – относительное количество правильно ориентированных молекул, θ– – непра­
вильно ориентированных молекул, θ – количество разорванных фрагментов, АХЭ – ацетилхолинэстераза.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
63
експериментальні роботи
трифосфатазной активности в плазматических
мембранах нервных клеток является ТСП, а
также свидетельствуют о том, что активный
центр ТСП, отвечающий за ThTP-азную ак­
тивность, локализован на внутренней поверх­
ности плазматических мембран нервных клеток.
Исследования выполнены при поддержке
Украинского государственного фонда фунда­
ментальных исследований, проект Ф28.4/057.
характеристика
тіамінтрифосфатази,
асоційованої
з плазматичними мембранами
нервових клітин
А. О. Сидорова, С. П. Степаненко,
Ю. М. Пархоменко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна
НАН України, Київ;
e-mail: sidorovanastya@mail.ru
Досліджено кінетичні параметри реакції
гідролізу ThTP препаратами плазматичних
мембран синаптосом, ізольованих із голов­ного
мозку щурів. Показано, що оптимум рН ThTPазної реакції дорівнює 7,4, уявна K m становить
52 мкМ, уявна константа спорідненості за Мg2+
складає 1,9 мМ.
Проведено порівняльний дослід указа­
них параметрів для ThTP-азної активності
мембранозв’язаних (результати цього дослі­
дження та літературні дані) та цитозольно­
го (дані літератури) протеїнів, який дозволяє
зробити припущення, що раніше описаний
тіамінзв’язуючий протеїн є єдиним носієм
ThTP-азної активності у плазматичних мем­
бранах нервових клітин.
Показано, що активний центр ензиму,
який каталізує реакцію гідролізу ThTP у плаз­
матичних мембранах нервових клітин, асоційо­
ваний з цитоплазматичною поверхнею мем­
брани.
К л ю ч о в і с л о в а: тіамін, тіамінтрифос­
фат, тіамінтрифосфатаза, плазматичні мембра­
ни синаптосом, тіамінзв’язуючий протеїн.
64
characterization of thiamine
triphosphatase associated
with neural cells plasma
membranes
A. Sydorova, S. Stepanenko,
Iu. M. Parkhomenko
Palladin Institute of Biochemistry, National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: sidorovanastya@mail.ru
Summary
The kinetic parameters of the ThTP hydroly­
sis by synaptic plasma membranes isolated from
rat brain were investigated. It was shown that the
ThTPase­ reaction pH optimum was 7.4, the ap­
parent К m was 52 µM and the apparent affinity
constant for Мg2+ was 1.9 mM.
The comparative analysis of the indicated
parameters was done for the ThTPase activity of
membrane bound (the data of present work and
literature data) and cytosolic (literature data) pro­
teins. The analysis allows us to suppose that thia­
mine-binding protein described earlier is the sing­
le ThTPase activity carrier in neural cells plasma
membranes.
It was shown that the active site of the en­
zyme that catalyzes the ThTP hydrolysis in neural
cells plasma membranes is associated with the in­
side membrane surface.
K e y w o r d s: thiamine, thiamine triphos­
phate, thiamine triphosphatase, synaptic plasma
membranes, thiamine-binding protein.
1. Пархоменко Ю. М., Протасова З. С., Дончен­
ко Г. В. // Укр. биохим. журн. – 1996. – 68,
№ 2. – С. 3–15.
2. Haas R. H. //Ann. Rev. Nutr. – 1988. – 8. –
P. 483–515.
3. Bâ A. // Cell. Mol. Neurobiol. – 2008. – 28. –
P. 923–931.
4. Gibson G. E., Blass J. P. // Antioxid. Redox
Signal. – 2007. – 9, N 10. – P. 1605–1620.
5. Пархоменко Ю. М., Черныш И. Ю., Чурило­
ва Т. Я., Халмурадов А. Г. // Укр. биохим.
журн. – 1987. – 59, № 5. – С. 49–54.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
А. А. Сидорова, С. П. Степаненко, Ю. М. Пархоменко
6. Пархоменко Ю. М., Пилипчук С. Ю.,
Янчий О. Р. и др. // Тезисы докл. Межд.
конф. “Рецепция и внутриклеточная сигна­
лизация”. – Пущино. – 2005, С. 150–153.
7. Nghiem H.O., Bettendorff L., Changeux J. P. //
The FASEB J. – 2000. – 14, N 3. – P. 543–
554.
8. Bettendorff L. // Neurochem. Int. – 1995. –
26, N 3. – P. 295–302
9. Постоенко В. А., Пархоменко Ю. М., Дончен­
ко Г. В. // Укр. биохим. журн. – 1987. – 59,
№ 6. – С. 9–14.
10. Пархоменко Ю. М., Протасова З. С., Янчий О. Р.
и др. // Нейрофизиология. – 2001. – 33,
№ 5. – С. 161–165.
11. Янчий О. Р., Пархоменко Ю. М., Донченко Г. В.
//Укр. біохім. журн. – 2001. – 73, № 3. –
С. 107–111.
12. Протасова З. С., Пархоменко Ю. М., Дончен­
ко Г. В., Чурилова Т. Я. // Там само. – 1999. –
71, № 4. – С. 50–57.
13. Kozik A. Thiamine-protein interaction. –
Krakow, 1996, – 133 p.
14. Fleming J. C., Tartaglini E., Steinkamp M. P. et
al. //Nat. Genet. – 1999. – 22, N 3 – P. 305–
308.
15. Subramanian V. S., Marchant J. S., Parker I.,
Said H. M. // J. Biol. Chem. – 2003. – 278,
N 6 – P. 3976–3984.
16. Subramanian V. S., Marchant J. S., Said H. M.
// Clin. Sci. – 2007. – 113, N 2. – P. 93–102.
17. Soriano E. V., Rajashankar K. R., Hanes J. W.
// Biochemistry. – 2008. – 47, N 5. – P. 1346–
1357.
18. Lakaye B., Verlaet M., Dubail J. et al. // Int.
J. Biochem. Cell Biol. – 2004. – 36, N 10. –
P. 2032–2041.
19. Szyniarowski P., Lakaye B., Czerniecki J. et al.
// Biochim. Biophys. Acta. – 2005. – 1725,
N 1. – P. 93–102.
20. Barchi R. L., Braun P. E. // J. Biol. Chem. –
1972. – 247, N 23. – P. 7668–7673.
21. Barchi R. L., Viale R. O. // Ibid. – 1976. – 251,
N 1. – P. 193–197.
22. Экспериментальная витаминология / под
ред. Ю. М. Островского. – Минск: Наука и
техника, – 1979. – 552 с.
23. Rathbun W., Betlach V. // Anal. Biochem. –
1969. – 28, N 1–3. – P. 436–445.
24. Ellman G. L., Courtney K. D., Valentino A.,
Featherstone V. R. M. // Biochem. Pharma­
cology. – 1961. – 7, N 2 – P. 88–95.
25. Данилович Г. В. Кінетичні властивості Mg2+залежної АТРази плазматичної мембрани
гладеньком’язових клітин. Автореф. дис. ...
канд. біол. наук. – К. 2005. – 20 с.
26. Келети
Т.
Основы
ферментативной
кинетики. – М: Мир, – 1990. – 350 с.
27. Черникевич И. П., Макарчиков А. Ф. // Укр.
биохим. журн. – 1997. – 69, № 5–6. –
C. 41–50.
Получено 04.02.2009
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
65