Бреховских Александр Андреевич Защитные механизмы
advertisement
На правах рукописи Бреховских Александр Андреевич Защитные механизмы автотрофной цианобактерии Nostoc muscorum от токсического воздействия ионов кадмия 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 2 Работа выполнена в лаборатории фотобиохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН Научный руководитель: кандидат биологических наук О.Д. Бекасова Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.В. Карапетян доктор биологических наук Л.М. Герасименко Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В Ломоносова, биологический факультет Защита диссертации состоится « 21 » марта 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2. С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1. Автореферат разослан « 10 » февраля 2006 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 3 Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Кадмий относится к группе самых опасных элементов, так как способен нарушать многие физиологические и метаболические процессы путем прямого ингибирования или активации, а также непрямым воздействием на регуляторные механизмы, образуя прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими НS- и RS-группы, заменяя металлы в металлсодержащих ферментах. Цианобактерии могут аккумулировать кадмий наряду с другими тяжелыми металлами быстро и в больших количествах. Генетическая модификация цианобактерий усиливает их устойчивость к токсичным элементам и способность аккумулировать тяжелые металлы (Shi et al., 1998). Изучение конкретных видов, характеризующихся устойчивостью к высоким концентрациям Cd2+, представляется актуальным как в практическом, так и теоретическом аспектах. Практический интерес обусловлен использованием цианобактерий, при разработке технологий осаждения и удаления тяжелых металлов из промышленных стоков биоаккумуляцией - более эффективным и дешевым способом удаления токсичных металлов из окружающей среды по сравнению с физико-химическими методами. Теоретический интерес обусловлен обнаружением способности у некоторых микроорганизмов, в том числе и N. muscorum, к биосинтезу наночастиц CdS в процессе детоксикации ионов Cd2+. CdS – неорганический полупроводник, обладает фотосенсибилизировать фотохимической биохимические активностью и способен окислительно-восстановительные реакции (Красновский и др., 1979). К настоящему времени осуществлен ряд ферментативных реакций, фотосенсибилизированных неорганическими полупроводниками, включая сульфид кадмия (Никандров и др. 1994). С перспективой технического использования созданы системы на основе гидрогеназы, сопряженной с CdS в качестве фотосенсибилизатора, способные к выделению молекулярного водорода (Недолужко, 1998). Наночастицы со свойствами полупроводников находят широкое применение в фотокатализе и других областях науки и техники благодаря уникальным фотофизическим и химическим свойствам, которые зависят от размеров частиц (Бучаченко, 2003). С целью получения наночастиц определенного размера и свойств развиваются методы их синтеза и биосинтеза. Привлекательность фикобилиновых пигментов для стабилизации наночастиц заключается в идентичности туннельных полостей в центре пигментных молекул, что существенно для синтеза одноразмерных частиц, когда требуются очень 4 малые реакционные объемы. Возможность стабилизации наночастиц сульфида кадмия фикобилипротеинами ранее не исследовалась. Цели и задачи исследования. Целью нашей работы было изучение защитных механизмов цианобактерии Nostoc muscorum штамм ВКМ-16 от воздействия ионов кадмия. Поставленная цель определила задачи диссертационной работы: 1. Изучить влияние ионов кадмия в широком диапазоне концентраций (10-6 – 10-2 М) на жизнеспособность N. muscorum и микроорганизмы, обитающие в его слизистой оболочке. 2. Выявить возможные способы детоксикации ионов Cd2+ N. muscorum, включая участие экзополисахаридов и фикобилиновых пигментов в связывании ионов Cd2+. 3. Синтезировать наночастицы сульфида кадмия in vitro, используя фикоэритрин в качестве белковой матрицы; выяснить влияние условий синтеза на размер наночастиц СdS; исследовать их спектральные и фотохимические свойства. 4. Получить бактериологически чистую культуру N. muscorum и выяснить ее устойчивость к ионам Cd2+. 5. Выделить из альгологически чистой культуры N. muscorum бактерии-спутники, устойчивые к токсическому действию кадмия, охарактеризовать их и исследовать способность к связыванию ионов Cd2+. Научная новизна. Показано противоположное действие низких и высоких концентраций кадмия на биомассу, морфологию, фотосинтетический аппарат и выделение экзополисахаридов N. muscorum. Обнаружено активное и избирательное выделение полисахаридов N. muscorum во внешнюю среду в условиях кадмиевого стресса. Впервые установлено, что кадмий индуцирует усиление экскреции полисахаридов, состав которых отличается от такового в отсутствие кадмия: доминирующим моносахаридом становится глюкозамин, который легко присоединяет ионы Cd2+. Обнаружено, что при концентрации кадмия ≤10-4М, не влияющей на скорость роста и морфологию цианобактерии, перенос энергии от ФС2 к ФС1 усиливается одновременно с активацией защитных механизмов от кадмия, тогда как при концентрации Cd2+ 10-3 М, инициирующей отмирание клеток, перенос энергии между фотосистемами сильно уменьшается. 5 Обнаружена высокая Cd-связывающая способность R-фикоэритрина. Впервые для стабилизации наночастиц CdS использован фикоэритрин. Выяснено влияние условий синтеза на размер и свойства наночастиц. Из слизистой оболочки N. muscorum выделены бактерии устойчивые к токсическому воздействию кадмия. Они способны выделять сероводород и связывать кадмий. На основании сравнительного филогенетического анализа с использованием последовательностей генов 16S рРНК, установлено, что выделенный штамм относится к виду Stenotrophomonas maltophilia. Практическая значимость. Полученные результаты значительно расширяют современные представления о защитных механизмах N. muscorum от высоко токсичных ионов Cd2+ и могут быть полезны при разработке биотехнологических методов очистки промышленных сточных вод и городских водоемов от тяжелых металлов. Обнаруженное свойство R-фикоэритрина быстро и в больших количествах связывать ионы Cd2+ может быть использовано в терапии острых и хронических отравлений кадмием. Предложен новый способ стабилизации наночастиц CdS при помощи Rфикоэритрина. Полученные результаты могут быть использованы в разработке лекарственных препаратов и открывают новые возможности для Cd-нейтронозахватной терапии. Способность S. maltophilia образовывать сульфид и связывать ионы кадмия представляет интерес в связи выяснением механизмов биосинтеза наночастиц со свойствами неорганических флуоресцентных меток в полупроводников; биологических использования системах; важна их для в оценки качестве вклада микроорганизмов в трансформацию соединений тяжёлых металлов и детоксикацию окружающей среды. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 191 страницах машинописного текста, включает 72 рисунка и 10 таблиц. Список литературы включает 303 наименований, в том числе 235 зарубежных изданий. Апробация конференциях: работы. Материалы диссертации представлены на научных 6 • Автотрофные микроорганизмы. К 75-летию со дня рождения академика Елены Николаевны Кондратьевой. Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет. 2000. • International conference 'Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem II' and traditional XVII th' Pushcheno Readings in Phosynthesis'. 2002. • International Symposium Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants With Technogenic Enviromental Pollutants. Saratov. 2003. • Динамика и структура в химии и биологии. Всероссийская Школа-Симпозиум. Институт химической-физики им. Н.Н. Семенова РАН. 2004. • XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2005), Черноголовка, 2005. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (5 статей и 5 тезисов докладов). Материалы и методы исследования Объекты исследования: Штамм ВКМ-16 N. muscorum, полученный из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, культивировали на минеральной среде Кратца-Майерса (КМ) (Kratz, Myers, 1955) при 28 °С, непрерывном поступлении воздуха, обогащенного СО2, освещённости 6000 люкс, pH 7.5. Начальный объём среды с концентрацией N. muscorum 2 ± 0.2 мг сухой биомассы/ мл составлял ~ 100 мл. От случайных бактериальных загрязнений культура была предварительно очищена фильтрованием через мембранный фильтр "Synpor" (диаметр пор 1,5 мкм) в сочетании с промыванием стерильной средой и воздействием ультразвуком в течение 15 секунд с последующей фильтрацией и пересевом на 1,4% агаризованную среду КМ. Бактерии-спутники выращивали на среде с добавлением глюкозы и пептона по 1 г/л (КМсп), для выращивания микроорганизмов на твердой среде вносили агар – 14 г/л. Бактериальные загрязнения N. muscorum определяли по окрашиванию ДНК флуоресцентным красителем DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole) (Whittaker et al., 1991). Препараты просматривали под эпифлуоресцентным микроскопом. Бактерии-спутники N. muscorum выделяли из слизистой оболочки: а) накопительной неочищенной культуры; б) культуры после освобождения её от случайных бактериальных 7 загрязнений; в) культуры N. muscorum инкубированной с 10-2 М, 10-3 М и 10-4 М Cd(NO3)2 в течение 2 месяцев. Для посева на чашки Петри отбирали по 0.5 мл соответствующей культуры, растирая шпателем, и этим же шпателем делали посев на вторую чашку Петри. Отбирали колонии бактерий, рост которых по штриху был визуально однороден. Морфологическую однородность выделенных культур контролировали микроскопированием. Из пробирок со скошенным агаром штаммы пересевали в жидкую среду, отмечали характер роста и делали посев на чашки Петри. Чистоту выделенных культур контролировали по однородности выросших колоний. Видовую принадлежность выделенных штаммов бактерий-спутников определяли по филогенетическому положению микроорганизмов на основании секвенирования гена 16S рРНК в Центре «Биоинженерия» РАН. ДНК выделяли из бактерий согласно методу (Булыгина и др., 2002). Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК пользовались универсальной праймерной системой (Edwards et al, 1989). Выделение экзополисахаридов из культуральной среды. Отбирали пробу, добавляли 96%-ный этанол в отношении 1:1 для осаждения полисахарида. Через 1 сутки пробы центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 мин. Осадок трижды промывали этанолом при центрифугировании (10 мин, 15000 об/мин) и растворяли в дистиллированной воде. Концентрацию экзополисахаридов определяли методом Дюбуа, основанным на появлении желто-оранжевого окрашивания при добавлении фенола и серной кислоты к моно-, олиго- или полисахаридам (Dubois et al., 1956). Состав экзополисахаридов определяли по спектрам поглощения гидролизованного полисахарида (Ikawa, Niemann, 1949). Разложение на компоненты спектров поглощения гидролизованных экзометаболитов осуществляли, как описано в работе (Литвин, Гуляев, 1969). Выделение сероводорода определяли на жидкой среде по потемнению индикаторной бумаги с ацетатом свинца (Егоров, 1995) и по потемнению среды Kliger агар (Kligler, 1918). Гистохимическое определение ионов кадмия выполняли по реакции с дитизоном (Серёгин, Иванов, 1997). 8 Концентрацию ионов кадмия в среде определяли двумя методами. 1) Потенциометрически в присутствии 0,1 М NaNO3 с помощью рН/мВ-метра ("Эксперт001", Россия), в котором измерительным электродом был ион-селективный электрод для кадмия "Эком-Cd". Диапазон линейности электродной функции Cd-селективного электрода 10-7 М – 10-2 М Cd2+ при рН 6,0. Крутизна электродной функции 26,5 мВ при 20 °С. 2) На атомно-эмиссионном спектрофотометре с индуктивно-связанной плазмой “IRIS Advantage” фирмы “Thermo Jarrel Ash” (США). Длина волны измерения 228,802 нм. Скорость подачи раствора 1,85 мл/мин. Мощность плазмы 1150 Вт. Синтез наночастиц CdS на R-фикоэритрине включал: связывание ионов кадмия фикоэритрином, синтез сульфида кадмия и фракционирование частиц. Кадмийфикоэритриновый комплекс получали при добавлении Сd(NO3)2 в концентрации от 10-5 М до 10-2 М к 1,8·10-6 М раствору R-фикоэритрина. Образование комплекса Cd2+ c Rфикоэритрином обнаруживали по тушению флуоресценции R-фикоэритрина и по снижению концентрации свободных ионов Cd2+ в среде. Синтез CdS инициировали добавлением 0,3 М Na2S к Cd2+-фикоэритриновому комплексу. Количество сульфида варьировали от 3,0 до 60 мМ. Через 30 мин инкубирования при комнатной температуре препарат центрифугировали в течение 10 мин при 8 °С и 3000 g. Размер наночастиц CdS определяли по спектрам поглощения и по электронным микрофотографиям. Электронно-микроскопические исследования проводили совместно с д.г-м.н. В.Т. Дубинчуком в просвечивающем электронном микроскопе BS-540 (Чехия) с приставкой РЭМ-201 для микрозондового анализа. При этом использовали германий-литиевый детектор при напряжении 25 кВ. Счет в зоне возбуждения 1000 имп/мин, площадь зоны возбуждения варьировали в пределах 2-10 мкм2. Препараты для просвечивающей электронной микроскопии, микрорентгеноспектрального и микродифракционного анализа готовили испарением небольшой капли образца на поддерживающей медной сетке. Капиллярный электрофорез выполняли на приборе «Капель 103Р» (Россия) в 0,1 мМ трис-буфере с добавлением 0,3 % полидиаллилдиметиламмоний хлорида, рН 8,2. Внутренний диаметр капилляра 75 мкм, эффективная длина 50 см, общая длина 60 см. 9 Пробы вводили 5 секунд при избыточном давлении 50 мбар. Рабочее напряжение 15 кВ, детектирование при 254 нм. Спектральные измерения выполнены при помощи следующих спектрофотометров: СФ-18, Hitachi-557, Beckman coulter DU 650, Specord UV-VIS “Carl Zeiss” и флуориметров: MPF-4, “Hitachi”, RF-5301 PC “Shimadzu”. Результаты и их обсуждение Влияние ионов кадмия на биомассу и морфологию N. muscorum в зависимости от концентрации и длительности воздействия. Исследование воздействия кадмия в различных концентрациях на N. muscorum показало, что в присутствии 10-4 М Cd(NO3)2 цианобактерия оставалась жизнеспособной в течение нескольких месяцев наблюдений, при этом морфология клеток, прирост биомассы, скорость выделения кислорода и интенсивность дыхания были такими же, как в культуре без кадмия (рис. 1 а, б; табл. 1). Таблица 1. Изменения биомассы N. muscorum (мг·сух. биомассы / мл) при инкубировании с Cd2+ Концентрация Cd(NO3)2 , М Продолжительность экспозиции, сутки 0 3 9 Изменение биомассы за 9 суток 0 10-4 5·10-4 10-3 1,72±0,06 1,75±0,15 1,96±0,18 1,74±0,01 2,02±0,12 2,14±0,13 2,24±0,04 1,76±0,03 1,55±0,09 1,24±0,05 + 0,24 + 0,28 + 0,10 - 0,52 Рост цианобактерии замедлялся и размер клеток уменьшался, если в культуральную среду вносили 5·10-4 М Cd(NO3)2 (рис. 1 в). Ионы Cd2+ в концентрации 10-3 М вызывали снижение биомассы на 30 % за 9 суток, распад нитей на фрагменты и отдельные клетки, удерживаемые общей слизью (рис. 1 г). Через три-четыре недели инкубирования с 10-3 М Cd(NO3)2 слизистые оболочки отделялись от трихомов, формировались скопления колониальной слизи, содержащие сгустки частиц, имевших вид кристаллитов, зёрен и более массивных образований в виде друз. Слизистая оболочка трихомов, а также сгустки слизи, отделившиеся от нитей колоний, образовывали комплекс с дитизоном жёлтооранжевого цвета. Интенсивность цвета и площадь окрашенных участков увеличивалась с 10 возрастанием концентрации кадмия и длительности экспозиции (в пределах 1 часа). Часть бактерий-спутников также приобретали оранжевую окраску в присутствии дитизона. В отсутствие Cd2+ окрашивание исходной культуры дитизоном не происходило. Рис. 1. Цианобактерия N. muscorum, выращенная на среде без кадмия (а), в присутствии Cd2+: 10-4 М (б), 5·10-4 М (в), 10-3 М (г). (а), (б) – контрастированы тушью, (г) – фазовый контаст. Длительность инкубирования 7 суток. При инкубировании N. muscorum с ионами Cd2+ поглощение культуральной среды в УФ- и видимой области при длинах волн короче 600 нм монотонно увеличивалось (рис. 2, кривые 2, 3). Именно такое поглощение при длинах волн короче 400 нм без четко выраженных максимумов характерно для CdS. Максимум флуоресценции смещался от 440 нм в длинноволновую область, при этом вид спектра и интенсивность излучения зависели от концентрации кадмия в среде (рис. 2, кривые 4-6). Эти изменения в спектрах поглощения и флуоресценции культуральной среды после инкубации цианобактерии с кадмием позволяют предположить, что связанный кадмий хотя бы частично накапливается экзометаболитами в виде сульфида кадмия. Рис. 2. Спектры поглощения (1-3) и флуоресценции (4-6) культуральной среды после инкубирования в ней N. muscorum без кадмия (1, 4) и в присутствии 10-4 М (2, 5) и 10-3 М Cd(NO3)2 (3, 6); дифференциальный спектр поглощения культуральной среды после инкубирования в ней N. muscorum («с 10-4 М Cd(NO3)2» минус «без кадмия») (7, 8). Длительность инкубирования 7 суток (кривые 1-7) и 35 суток (кривая 8). 11 Роль внеклеточных полисахаридов N. muscorum в детоксикации ионов кадмия. Удельное содержание полисахаридов, экскретируемых цианобактерией N. muscorum при плотности культуры 2 г/л сухой биомассы, было равно 0,7 ± 0,01 г глюкозных единиц в расчете на 1 г сухой биомассы. После экспозиции N. muscorum с Cd2+ содержание экзополисахаридов в культуральной среде возрастало. Динамика концентрации экзополисахаридов в культуральной среде зависела от количества вносимого кадмия и продолжительности инкубирования с ним N. muscorum (рис. 3). Рис. 3. Изменение содержания экзополисахаридов в культуральной среде в зависимости от концентрации Сd2+ в среде и длительности инкубирования N. muscorum. Цифры у кривых: 1 – 0 М, 2 – 10-4 М, 3 5·10-4 М, 4 – 10-3 М Cd(NO3)2. Одновременно с изменением концентрации экзополисахаридов изменялась их первичная структура, о чём свидетельствуют различия в спектрах поглощения гидролизованных экзополисахаридов (рис. 4). После инкубирования N. muscorum с 10-3 М Cd(NO3)2 основной максимум в спектре поглощения смещался к 325 нм и обнаруживался дополнительный при 272 нм (рис. 4 б; кривая 1). 2 а 0,6 0,8 б 1 1 2 0,6 0,4 3 0,3 8 6 4 0,2 0,1 0,0 поглощение поглощение 0,5 9 7 220 240 260 10 5 280 300 3 0,4 0,2 11 320 длина волны, нм 4 7 6 340 360 0,0 220 5 240 260 280 300 320 340 360 длина волны, нм Рис. 4. Спектры поглощения гидролизованных экзометаболитов, выделяемых N. muscorum в культуральную среду, а – в отсутствие кадмия, б – в присутствии 10-3 М Cd(NO3)2. Длительность инкубирования 9 суток. Цифры у кривых: 1 – экспериментальная кривая , 2 – сумма компонентов разложения, 3 – глюкозамин, 4 – глюкуроновая кислота, 5 – арабиноза, 6, 7, 8 – неидентифицированные компоненты, 9 – галактоза, 10 – глюкоза, 11 – рамноза. 12 Разложение спектра поглощения гидролизованного полисахарида на спектры индивидуальных моносахаридов позволило конкретизировать изменения, происходящие в первичной структуре полисахарида при инкубировании N. muscorum с кадмием (рис. 4). Спектр поглощения гидролизованного полисахарида из контрольного опыта без кадмия (рис. 4 а), раскладывается на спектры следующих моносахаридов: глюкозамин, глюкуроновая кислота, галактоза, глюкоза, арабиноза, рамноза (перечислены в порядке уменьшения их вклада в основную полосу поглощения) и 3-х неидентифицированных компонентов, поглощение которых описывается гауссовыми кривыми с максимумами при 215 нм, 227 нм и 263 нм. Возможно, последние обусловлены поглощением неуглеводных компонентов экзометаболитов (см. рис. 2, кривая 8). Спектр поглощения полисахарида, присутствующего в культуральной среде после инкубирования N. muscorum с Cd, раскладывается на меньшее количество компонентов, при этом явно доминирует поглощение глюкозамина (рис. 4 б). Таким образом, комплексные определения концентрации экзополисахаридов в культуральной среде, коррелирующие с толщиной слизистой оболочки, изменения первичной структуры экзополисахаридов и биомассы цианобактерии, а также связывания ионов кадмия (по реакции с дитизоном) после инкубирования с ионами кадмия в различных концентрациях позволяют заключить, что N. muscorum способен к активному и избирательному выделению ионов кадмия во внешнюю среду для дистанционной детоксикации. Способ защиты обеспечивается, по-видимому, активацией синтеза полисахарида изменённой первичной структуры. Изменчивость фотосинтетического аппарата N. muscorum при воздействии ионов кадмия. Основными компонентами в пигментной системе N. muscorum штамм ВКМ-16 являются хлорофилл, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин и каротиноиды. В качестве минорного компонента содержится фикоэритроцианин. Каждый из основных пигментов представлен двумя и более спектральными формами (табл. 2). Кадмий при всех исследованных концентрациях вызывал изменения в фотосинтетическом аппарате. Однако, если при концентрации ≤10-4 М Cd2+ их удавалось регистрировать только при 77 К, то при 5·10-4 М Cd2+ после 9 суток инкубации 13 изменения обнаруживались спектральными методами при комнатной температуре, а при 10-3 М Cd2+ изменения наблюдались даже визуально по обесцвечиванию культуры. Из данных, суммированных в табл. 2, следует, что отличия в спектрах поглощения N. muscorum до и после инкубирования с 10-4 М Cd2+ заключались в смещении максимумов поглощения на 1-4 нм и возникновении новых полос при длинах волн < 410 нм (обусловленных, по-видимому, фикобилипротеиновый поглощением комплекс) и > 730 нм наночастиц CdS), 586 (хлорофилл-белковые нм (Cd- комплексы, модифицированные кадмием). После инкубирования с 10-3 М Cd2+ поглощение в красной области сильно снижалось, по сравнению с контролем в результате обесцвечивания хлорофилла и основной максимум смещался от 678 к 666 нм; полосы поглощения в области 470-540 нм отсутствовали, что указывает на деструкцию каротиноидов; полос в области < 410 нм становилось больше, что, возможно, отражает возрастающее разнообразие частиц CdS по размерам и носителям (табл. 2). Предположение подтверждается появлением новых полос излучения в низкотемпературном спектре флуоресценции N. muscorum после инкубирования с 10-4 М Cd2+ и 10-3 М Cd2+, измеренных при селективном возбуждении светом, поглощаемым преимущественно хлорофиллом (430 нм) или фикобилипротеинами (530 нм) (табл. 2, последний столбец). Возгорание длинноволновой флуоресценции хлорофилла (≥ 700 нм) после инкубирования N. muscorum с 10-4 М Cd2+, измеренных при селективном возбуждении светом поглощаемым преимущественно хлорофиллом (430 нм) или фикобилипротеинами (530 нм) указывает на усиление переноса возбуждения в ФС1 (рис. 5 кривые 1,2). Вывод подтверждается тем, что в спектре возбуждения флуоресценции при 770 нм доминируют полосы, соответствующие максимумам поглощения фикобилипротеинов. Сопоставление спектров флуоресценции N. muscorum до и после инкубирования с 10-3 М Cd2+ позволяет заключить, что перенос энергии возбуждения от фикобилипротеинов на хлорофилл практически не происходит, собственная флуоресценция хлорофилла снижается почти на два порядка (рис. 5 кривые 1,3). 14 Таблица 2. Положение отрицательных пиков (нм) во второй производной низкотемпературного спектра поглощения N. muscorum в зависимости от концентрации ионов кадмия в среде, длительность инкубации 7 суток Компонент CdS Хлорофилл Каротиноиды Фикоэритрин Комплекс Cd-фикобилипротеин Фикоэритроцианин Концентрация Cd2+ в среде, М 0 10-4 10-3 – 391 F450*) F470 – 393 – F485 398 Fп500 406 415 415 416 419 418 427 – – 433 443 445 448 472 471 – п 477 477 – – 500 – п 507 507 – 509 – – 514 514 – – 532 – 544 540 – 549 558 559 554 F560 571 569 573 F585 576 – 586 586 F594 596 – – 621 631 658 674 686 714 599 598 – 607 Фикоцианин – 618 622 627 633 637 Аллофикоцианин 659 659 Форма 673 672 хлорофилла 686 683 714 – – Cd-хлорофилл 733 белковые комплексы 751 767 786 ) * Цифры в сочетании с буквой F указывают положение максимумов флуоресценции (нм), возникающих в присутствии кадмия F622 F760 15 Рис. 5. Спектры флуоресценции N. muscorum при 295 К в зависимости от концентрации ионов кадмия в культуральной среде, (а) λвозб =430 нм, (б) λвозб =530 нм. Цифры у кривых: 1 - контроль без кадмия, 2 - 10-4 М Cd2+, 3 - 10-3 М Cd2+. Связывание ионов кадмия R-фикоэритрином Поскольку мы обнаружили, что фикобилиновые пигменты связывают ионы кадмия в N. muscorum, представляло интерес исследовать синтез CdS при участии фикобилиновых пигментов в модельных системах. Для решения этой задачи был выбран R-фикоэритрин (пигмент красной водоросли), как наиболее стабильный из всех фикобилиновых пигментов. При добавлении к раствору R-фикоэритрина ионов кадмия в концентрации от 7·10-5 до 3,5·10-2 М потенциал кадмиевого электрода увеличивался, что свидетельствует об уменьшении концентрации свободных ионов Cd2+ в среде. Измерения ЕCd показали, что при варьировании концентрации Cd2+ в указанных пределах 1,8 мкМ фикоэритрин за короткое время связывал от 20 до 70 % Cd2+. В результате образовывался Cd2+фикоэритриновый комплекс. При связывании ионов кадмия R-фикоэритрин оставался хорошо растворимым в воде, но поглощение и интенсивность флуоресценции R-фикоэритрина снижались в той или иной степени в зависимости от количества связанного им кадмия и рН среды. Зависимость размера частиц CdS от условий синтеза. При добавлении сульфида натрия к Cd-фикоэритриновому комплексу синтезировались частицы CdS и обесцвечивался R-фикоэритрин. Частицы были устойчивы и не выпадали в осадок. Исследование зависимости размера частиц CdS от соотношения концентраций S2- : Cd2+ : R-фикоэритрин и рН среды показало, что он зависит главным образом от соотношения концентраций ионов S2- и Cd2+ (рис. 6); зависимость от рН среды незначительна (рис. 7), а концентрация пигмента вовсе не влияла на размер синтезируемых частиц CdS (рис. 8). 16 Размер наночастиц колебался от 2 до 5.6 нм в зависимости от условий синтеза, указанных в подписях к рисункам 6-8. Рис. 6. Зависимость оптических свойств CdS от соотношения концентраций ионов сульфида и кадмия во время синтеза (реакционная смесь содержала 8 мМ Сd2+, 2 мкМ R-фикоэритрин и [S2-] в мМ, указаны у кривых): а – спектры поглощения частиц CdS, стабилизированных Rфикоэритрином, б – поглощение при 350 нм (А350) и интенсивность флуоресценции при 500 нм (F500), λвозб 400 нм частиц CdS в 0,01 М трис-буфере, рН 7,5. Рис. 7. Спектры поглощения при различных рН (цифры у кривых) (а) и зависимость интенсивности флуоресценции при 500 нм (λвозб = 400 нм) от рН (б) для наночастиц CdS (образец – 1.0 мкМ R-фикоэритрин, 10 мМ Сd2+, 48 мМ S2-). Рис. 8. Спектры поглощения при различных концентрациях R-фикоэритрина (цифры у кривых, в мкМ) (а) и зависимость интенсивности флуоресценции наночастиц CdS при 500 нм (λвозб = 400 нм) от концентрации Rфикоэритрина (б); условия синтеза: 12 мМ· Сd2+, 14 мМ· S2-, рН 8.7. 17 Размер и фазовое состояние наночастиц CdS. Определения размеров частиц по микрофотографиям показали, что присутствовали частицы размером от 2 нм до 1,1 мкм. Доминировали частицы 6,05 нм. Среднеквадратичное отклонение составляло 1,82 нм (рис. 9). Рис. 9. Распределение по размерам частиц CdS, стабилизированных Rфикоэритрином. Среднеквадратичное отклонение 1,82. На вставке – электронная микрофотография доминирующих частиц и микродифракционная картина характерная для них. Условия синтеза: 0,5 М Cd2+, 1,8 мкМ R-фикоэритрина, в пропорции 0,3 М Na2S 22+ [S ]/[Cd ]=1,2. На вставке рис. 9 представлена электронная микрофотография наиболее мелких частиц. Они из-за небольшого количества вещества, давали слабую микродифракционную картину, на которой присутствовал 1-2 максимума (рис. 9). Поэтому достоверно определить фазовое состояние наночастиц размером ≤ 6 нм не удалось. Среди крупных частиц имелись кристаллические, аморфные и двухфазные аморфно-кристаллической структуры. Энергодисперсионный спектр рентгеновского характеристического излучения одной из частиц представлен на рис. 10. Крупных частиц было очень мало. Рис. 10. Энергодисперсионный спектр рентгеновского характеристического излучения частицы CdS, синтезированной на R-фикоэритрине. На вставке – электронная микрофотография, на которой стрелками отмечены кристаллическая (1) и аморфная (2) частицы CdS, и соответствующие им микродифракционные картины. Спектры поглощения и флуоресценции наночастиц сульфида кадмия, изображенных на микрофотографиях, представлены на рис. 11. 18 ∆2D/∆λ2 D a 2,5 0,01 возб. F -0,01 2 2,0 0 0,01 -0,02 1 1 150 40 -0,01 0,5 200 50 1,5 1,0 5 60 0,00 F, отн. ед. б 70 0,02 30 2 20 3 100 50 10 0,0 -0,03 300 400 500 600 0 250 300 0,03 нм 4 350 400 450 500 550 600 0 650 700 нм Рис. 11. Спектральные характеристики наночастиц CdS, синтезированных на Rфикоэритрине. а – спектр поглощения (1) и его вторая производная (2). б – спектр флуоресценции при λвозб 400 (1), 360 (2), 340 нм (3), 320 нм (4) и спектр возбуждения флуоресценции, λрег 500 нм (5). Переходы при 406 и 395 нм, определенные по второй производной спектра поглощения (рис. 11 а, кривая 2), соответствуют размеру частиц CdS 3,2±0,2 нм. Именно такого размера частицы проявляются по второй производной спектра поглощения цианобактерии N. muscorum инкубированный с кадмием. Размер наночастиц CdS, стабилизированных R-фикоэритрином, определяемый по спектру поглощения, согласуется с данными литературы (табл. 3). В таблице 3 приведены лишь несколько работ из большого числа публикаций, в которых указываются размеры наночастиц CdS. Анализ данных литературы показал, что разброс в положении перехода из основного состояния в возбуждённое для частиц одного и того же размера колеблется от 1 до 8 нм по выборкам из 3-5 работ и в значительной мере определяется структурой наночастиц, методом определения их размеров, а также гомогенностью используемых матриц. Таблица 3. Зависимость положения перехода из основного состояния в возбужденное частиц CdS от их размера Размер частиц, нм 2,5±0,5 2,8 2,8 3,2 ±0,2 4,0 5,6 Положение пика перехода, нм Ссылка 330 350 365 396-406 455 462 Lingdong Sun et al., 2000 Wang, Herron, 1987 Dameron, Winge, 1990 Собств. данные Wossmeyer et al., 1994 Wossmeyer et al., 1994 19 Размер частиц CdS, определяемый по спектрам поглощения, совпадает с диаметром туннельного пространства в центре гексамера, тогда как размер доминирующих частиц, определяемый по микрофотографиям, совпадает с длиной туннеля. Расхождение в определении размеров наночастиц по микрофотографиям и спектрам поглощения, повидимому, связано с гипохромным эффектом и обратной зависимостью интенсивности поглощения от размера частиц (чем больше размер, тем меньше коэффициент экстинкции) (Trindade et al., 2001). По этим причинам переход при 480 нм, соответствующий размеру частиц 6 нм, проявляется cлабо и только по второй производной спектра поглощения. Флуоресцентные свойства наночастиц CdS. Спектр флуоресценции наночастиц сульфида кадмия размером от 3,2 до 5,6 нм в водном растворе R-фикоэритрина характеризуется максимумами излучения при 470 нм и 520 нм (CdS) и 575 нм (R-фикоэритрин) (рис. 11). Соотношение полос в спектре флуоресценции не зависело от длины волны возбуждающего света и не изменялось при разбавлении даже в 70 раз. Вместе с тем в спектре возбуждения флуоресценции проявлялись несколько излучающих центров: при 280-290, 360, 395 и 440 нм (рис. 11 б, кривая 5). Последний был четко выражен при λрег 500 нм. Излучающие центры электрофореза и не удалось разделить методами капиллярного фракционирования этанолом. На электрофореграмме CdS, стабилизированных R-фикоэритрином, имелся только 1 пик, а спектры поглощения супернатанта и суспендированного осадка, полученных при фракционировании наночастиц этанолом, совпадали. Совокупность этих данных свидетельствует, что наночастицы состоят из кластеров разных размеров, связанных молекулой Rфикоэритрина в гетероагрегат (рис.12). На модели наночастица CdS диаметром 3.2 нм, синтезируемая в полости R-фикоэритрина, представлена как совокупность кластеров разных размеров, между которыми происходит миграция энергии возбуждения. Кластеры плотно упакованы в единый гетероагрегат, который тесно связан с хромофорными группами R-фикоэритрина. На разный размер кластеров указывает сложная форма спектра излучения флуоресценции и зависимость положения максимума в спектре возбуждения флуоресценции от длины волны регистрации. О плотной упаковке кластеров в гетероагрегате свидетельствует миграция энергии возбуждения между кластерами. Постоянное соотношение между полосами излучения кластеров CdS и R-фикоэритрином, которое не зависит от λвозб, свидетельствует о возможной ассоциации наночастицы CdS с 20 хромофорными группами R-фикоэритрина. Образованию гетероагрегата, по-видимому, благоприятствует неоднородность полости фикоэритрина: наличие гидрофильных и гидрофобных зон, а также различных функциональных групп (–SH, –NH, –COOH), связывающих Cd2+. Рис. 12. Схематические модели Rфикоэритрина с наночастицей CdS в центральной полости (а) и наночастицы CdS как гетероагрегата (б). а – Rфикоэритрин в форме гексамера (αβ)6γ изображен в виде двух параллельно расположенных дисков – тримеров в центральной полости (αβ)3, локализована наночастица CdS; б – стрелки указывают перенос энергии возбуждения между кластерами (1) разных размеров и на хромофорные группы (2) R-фикоэритрина, как конечные акцепторы. Фотохимические свойства наночастиц CdS. Освещение УФ-светом CdS, стабилизированного R-фикоэритрином, в анаэробных условиях в присутствии 7,8 мМ метилвиологена сопровождалось восстановлением последнего. Концентрация восстановленного метилвиологена не превышала 64 нМ после 40 мин освещения. Фотовосстановление метилвиологена сопровождается вторичным синтезом CdS. Бактерии-спутники и их роль в детоксикации ионов кадмия С целью выяснения возможной роли бактерий-спутников в образовании кристаллитов сульфида кадмия культурой цианобактерии эти микроорганизмы были выделены из исходного N. muscorum, а также из культур, инкубированных в течение 2-х месяцев с 10-3 М и 10-4 М Cd(NO3)2. В ходе исследования выделено 29 штаммов. Для штаммов, выделенных из предварительно очищенной культуры, все многообразие сводится к основным 3 типам: короткие подвижные палочки (длина 1-2 мкм), длинные подвижные палочки (длина более 2 мкм) и мелкие кокки. В ходе работы были отобраны чистые 14 штаммов гетеротрофных бактерий и проверена их способность к образованию H2S на жидкой среде КМсп с добавлением по 0.02% цистина и цистеина. 8 штаммов выделяли H2S с разной интенсивностью. Для дальнейшей работы отобраны штаммы 1А и 2А, выделенные из исходной культуры N. muscorum, и штаммы 1В и 2В, выделенные из 21 культуры цианобактерии, инкубированной с 10-3М Cd(NO3)2 в течение двух месяцев, которые наиболее интенсивно выделяли H2S и хорошо росли. Влияние кадмия на интенсивность роста сопутствующих микроорганизмов изучено на жидкой и агаризованной среде. Динамика роста исследованных штаммов в отсутствие и в присутствии 10-3М Cd(NO3)2, типична для периодических культур (рис. 13). В присутствии Cd2+ рост 1В, 1А и 2А штаммов начинался с некоторой задержкой и менее интенсивен по сравнению с контролем. Скорость роста штамма 2А на среде с Cd2+ резко увеличивалась после 10-дневного периода адаптации и к концу периода наблюдения плотность культуры в два раза превышала таковую в контроле. Рис. 13. Влияние кадмия на рост гетеротрофных бактерий, выделенных из культуры N. muscorum. Бактерии (штаммы 1А, 2А, 1В, 2В) выращены в отсутствие кадмия (кривые 1А, 2А, 1В, 2В) и в присутствии 103 М Cd(NO3)2 (кривые 1А+Cd, 2А+Cd, 1В+Cd, 2В+Cd) на жидкой среде КМсп. Оптическая плотность измерена на СФ-18 при 600 нм. Ошибка измерений 0,05 D. При использовании агаризованной среды с 10-4М Cd(NO3)2 и в контроле без кадмия, посев проводили из суточных культур с одинаковой плотностью в разведениях 10-3 и 10-4. В контроле для всех культур рост обнаруживался через 1 сутки и в обоих разведениях на 3 сутки был сплошной рост. На средах с добавлением Cd2+ культуры 1В и 2В образовывали газон на 3 сутки в 10-3 разведении, а в 10-4 выросло от 12 до 90 точечных колоний. Следует отметить, что при концентрации 10-3М Cd(NO3)2 на агаризованной среде бактерии не растут. Связывание ионов кадмия сопутствующими микроорганизмами Исследование связывания кадмия с использованием дитизона культурами, выросшими на агаризованной среде, содержащей 10-4 М Cd2+, показало, что только культура 2В связывает Cd в этих условиях. Таким образом, среди гетеротрофных бактерий, обитающих в слизистой оболочке N. muscorum, имеются устойчивые к кадмию бактерии, которые способны выделять сероводород и связывать ионы кадмия. Установлено, что штамм 2В относится к кластеру видов рода Stenotrophomonas внутри подразделения 22 гамма-протеобактерий. Согласно анализу последовательностей генов 16S рРНК изучаемый штамм относится к гетерогенному виду S. maltophilia. Влияние кадмия на рост S. maltophilia на жидкой среде показано на (рис. 14). оптическая плотность 0,45 0,40 1 0,35 2 3 0,30 Рис. 14. Кривые роста S. maltophilia на среде КМсп: 1 - без кадмия, 2 – с 10-4М Cd(NO3)2, 3 – 2.5·10-4М Cd(NO3)2, 4 – 5·10-4М Cd(NO3)2, 5 – 7.5·10-4М Cd(NO3)2, 6 – 10-3М Cd(NO3)2. Оптическая плотность, измерена на СФ-18 при 600 нм. Ошибка измерений 0,03 D. 0,25 4 0,20 0,15 5 0,10 6 0,05 0,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 сутки При концентрации ≥ 2.5·10-4М Cd(NO3)2 в среде в первые сутки биомасса культуры увеличивалась медленнее, чем в контроле, так как происходила адаптация клеток к кадмию. После 1-2 суток культура интенсивно начинала расти с общим повышением плотности суспензии и накоплением в среде продуктов метаболизма, способных связывать кадмий. В итоге снижалось количество свободных ионов Cd2+, приходящихся на клетку. Связывание ионов кадмия S. maltophilia При внесении ионов Cd2+ 10-3 М в суспензию клеток, отмытых от среды в воде, и перемешивании в течение 5 минут, концентрация свободных ионов кадмия не менялась. Это указывает на то, что сами клетки не способны связывать ионы кадмия в больших количествах. Связывание ионов кадмия отмечалось в процессе роста клеток. При внесении 5·10-4 М Cd(NO3)2 в среду с цистеином концентрация кадмия снижалась до 9·10-5 М, а в среде без цистеина – до 3·10-4 М, вследствие связывания Cd2+ компонентами среды. После начала роста клеток при оптической плотности суспензии клеток 0,03 концентрация кадмия оставалась прежней. Однако, как только биомасса клеток увеличивалась до 0,2 D, концентрация кадмия в среде резко понижалась до 10-6 –10-7 М. Снижение концентрации ионов Cd2+ связано с образованием CdS. Образование наночастиц CdS в культуре S. maltophilia видно по разнице спектров поглощения культуральной среды после осаждения клеток S. maltophilia центрифугированием (рис. 15). На кривой 2 рис. 15 явно выражено плечо в области 350 нм, характерное для 23 наночастиц CdS размером 2,8 нм, тогда как в спектрах поглощения клеток S. maltophilia отмытых от среды наблюдалось монотоноое увеличение поглощения в УФ- и синей областях спектра. Источником S2- был сероводород, образующийся в среде в процессе роста S. maltophilia. Рис. 15. Спектры поглощения среды КМсп поглощение 1,0 с 0.02% цистеином после осаждения S. maltophilia, инкубированной без кадмия (1) 0,5 и с 5·10-4 М Cd(NO3)2 (2). 2 1 0,0 300 320 340 360 380 400 длина волны, нм Таким образом, присутствие гетеротрофных бактерий-спутников способных выделять сероводород повышает устойчивость N. muscorum к кадмию. В целом отношения N. muscorum со спутниками, устойчивыми к кадмию и способными продуцировать сульфид симбиотические. Это подтверждается тем, что выделенные клоны аксеничной культуры N. muscorum утрачивали способность роста и погибали через 1-3 месяца. Отсюда следует, что создание искусственной ассоциации цианобактерии с гетеротрофными бактериями, устойчивыми к Cd2+ может обеспечить связывание ионов Cd2+ и повысить устойчивость цианобактерии к токсическому действию этого тяжелого металла. Заключение Совокупность собственных и литературных данных позволяет заключить, что присутствие солей кадмия в среде стимулирует в цианобактериях активацию системы защиты от Cd2+, которая направлена на снижение концентрации свободных ионов токсичного металла и включает следующие механизмы: ускоренный синтез и выделение во внешнюю среду полисахаридов измененной первичной структуры для дистанционной детоксикации ионов кадмия; трансформирование Cd2+ в менее токсичные частицы и кристаллиты CdS и Cd0 на слизистой оболочке при участии бактерий-спутников, а также 24 в клетках при помощи фикобилиновых пигментов и специфического металлсвязывающего белка, типа металлотионеина, синтез которого индуцируют ионы кадмия. Cd2+ Увеличение скорости синтеза полисахаридов изменённой первичной структуры Ускоренное обновление слизистой оболочки Изменения в фотосинтетическом аппарате при воздействии Cd2+: образование Cd-пигментных комплексов и активация ФС1 Индукция синтеза белков, связывающих Cd2+ (Cobbett, 2000) Дистанционная детоксикация R–N=Cd; R–P=Cd; R–CO–Cd–OC–R CdS Бактерии-спутники Рис. 16. Гипотетическая схема системы защиты цианобактерии N. muscorum от ионов Cd2+. Схематическое изображенеие системы защитных механизмов от ионов кадмия представлены на рис. 16. Перечисленные механизмы дополняют друг друга и действуют одновременно. Энергетические затраты, связанные с преодолением Cd-стресса, могут компенсироваться в результате активации ФС 1. Выводы 1. Полисахариды, выделяемые N. muscorum в культуральную среду, способны связывать ионы кадмия, предохраняя тем самым клетки от токсического воздействия Cd2+. Впервые показано, что в присутствии ионов кадмия выделение полисахаридов усиливается и происходит изменение в их составе: доминирующим моносахаридом становится глюкозамин. 2. Обнаружено, что в культуре N. muscorum инкубированной с кадмием в концентрации (≤10-4М), не влияющей на скорость роста и морфологию, наблюдается усиление переноса энергии от ФС2 к ФС1, тогда как при концентрации Cd2+ 10-3 М, 25 инициирующей отмирание клеток, перенос энергии между фотосистемами сильно уменьшается. 3. Фикобилиновые пигменты способны связывать ионы кадмия in vivo и в водных растворах. Показано, что в спектрах поглощения и флуоресценции N. muscorum инкубированной с ионами кадмия образуются новые полосы, которые могут быть отнесены к CdS и Cd-белковым комплексам. 4. Синтезированы наночастицы сульфида кадмия с использованием R-фикоэритрина в качестве стабилизатора. Размер частиц, связанных с R-фикоэритрином, зависит главным образом от соотношения концентраций ионов S2- и Cd2+, концентрация R-фикоэритрина не влияет на размер синтезируемых частиц CdS. Совокупность данных спектрального анализа, электронной микроскопии и капиллярного электрофореза свидетельствуют, что частицы CdS диаметром ≥3.2 нм представляют собой гетероагрегаты. 5. Высокая стабильность частиц CdS, совпадение их размеров с размерами (3.5 × 6 нм) полости в центре гексамера R-фикоэритрина, а также сходство электрофореграмм свободного R-фикоэритрина и в комплексе с CdS указывают, что наиболее вероятным местом синтеза наночастиц являются туннельные полости пигмента. 6. Из альгологически чистой культуры N. muscorum выделены бактерии-спутники, устойчивые к токсическому действию кадмия (в концентрации до 1 мМ) и способные выделять сероводород. Установлена принадлежность одного из кадмий-устойчивых штаммов к виду S. maltophilia, предположительно участвующего в синтезе наночастиц CdS. Симбиотические взаимоотношения N. muscorum со спутниками, устойчивыми к кадмию и способными продуцировать сульфид, повышают устойчивость цианобактерии к действию тяжелых металлов. Список работ, опубликованных по материалам диссертации 1. Москвина М.И., Бреховских А.А., Бекасова О.Д., Никандров В.В. Роль слизистой оболочки цианобактерии Nostoc muscorum в связывании и детоксикации ионов кадмия // В сб. Автотрофные микроорганизмы, 2000, Москва, С. 124-125. 2. Бекасова О.Д., Бреховских А.А., Москвина М.И. О механизме детоксикации ионов кадмия цианобактерией Nostoc muscorum при участии ее внеклеточных полисахаридов // Биофизика, 2002, Т. 47, № 3, С. 515-523. 26 3. Bekasova O.D., Brekhovskikh A.A., Nikandrov V.V. Double-side action of cadmium ions on energy excitation transfer in cyanobacterium Nostoc muscorum // XVII Pushchino Readings in Photosynthesis and International Conference Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem II, 2002, Pushchino, Russia, P.7-8. 4. Москвина М.И., Бреховских А.А., Никандров В.В. Роль гетеротрофных спутников цианобактерии Nostoc muscorum в синтезе сульфида кадмия // Микробиология, 2003, Т. 72, № 2, С. 284-285. 5. Бекасова О.Д., Бреховских А.А. Влияние кадмия на поглощение и перенос энергии возбуждения в цианобактерии Nostoc muscorum // Биофизика, 2004, Т. 49, № 4, С. 692-714. 6. Brekhovskikh A.A., Moskvina M.I., Nikandrov V.V. The role of the heterotrophic bacteria associated to cyanobacterium Nostoc muscorum in detoxification of Cd and formation of СdS // Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants, 2003, Saratov, Russia, P. 9-10. 7. Bekasova O.D., Brekhovskikh A.A. Molecular mechanisms of cyanobacterial protection against cadmium ions // Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants, 2003, Saratov, Russia, P. 7-8. 8. Бреховских А.А., Бекасова О.Д. Наночастицы CdS в белковой матрице – Rфикоэритрине // Неорганические материалы, 2005, Т. 41, № 4, С. 400-406. 9. Бекасова О.Д., Бреховских А.А., Брыкина Г. Д., Дубинчук В.Т., Мочалова В.С., Котельников А.С. R-фикоэритрин как природный лиганд для детоксикации ионов кадмия и туннельная матрица для синтеза наночастиц сульфида кадмия // Прикладная биохимия и микробиология, 2005, Т. 41, № 3, С. 308-314. 10. Бекасова О.Д., Бреховских А.А. R-фикоэритин, как молекулярная матрица для синтеза наночастиц сульфида кадмия // XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2005), 2005, Черноголовка, Россия, С. 239-240.
