РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМЕНИ Н.Н. БЛОХИНА РАМН
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМЕНИ Н.Н. БЛОХИНА РАМН на правах рукописи ЗАМКОВА МАРИЯ АНАТОЛЬЕВНА ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА HSF1 ПРИ ЭКСПРЕССИИ ОНКОГЕНОВ RAS: МЕХАНИЗМЫ И РОЛЬ В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ Специальность 14.01.12 - Онкология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор Б. П. Копнин МОСКВА 2013 Оглавление Список сокращений 3 Введение 6 Глава 1. Обзор литературы 9 Белки семейства Ras: структурная организация и биологические функции 9 Строение и внутриклеточная локализация белков Ras 9 Регуляция активности белков Ras 10 Эффекторы белков Ras 14 Биологические последствия конститутивной активации белков Ras 17 Влияние на пролиферацию клеток 17 Подавление апоптоза 18 Модификация микроокружения 19 Воздействие на подвижность клеток; связь с инвазией и метастазированием 20 Влияние на метаболизм 22 Транскрипционный фактор HSF1 Строение и активация HSF1 23 24 Строение HSF1 24 Активация HSF1 25 Позитивные и негативные регуляторы HSF1 31 Позитивные регуляторы активности HSF1 33 Негативные регуляторы активности HSF1 37 Биологические функции HSF1 и его роль в процессах канцерогенеза 41 Глава 2. Материалы и методы 51 Глава 3. Результаты исследования 60 Влияние активных форм белка Ras на уровень АФК и экспрессию генов сестринов 60 Влияние экспрессии Ras на активность транскрипционного фактора HSF1 63 Влияние модификаций активности HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов 66 Влияние изменений активности HSF1 на размножение клеток in vitro 72 Влияние изменений активности HSF1 на рост клеток in vivo 75 Глава 4. Обсуждение полученных результатов 78 Глава 5. Выводы 84 Список литературы 85 2 Список сокращений Abi1 - Abelson interactor 1 AF-6 - ALL1-fused gene from chromosome 6 protein AIP1 - ASK-interacting protein 1 AP-1 - The activator protein 1 APC - The anaphase promoting complex AREG - Amphiregulin ASK - Apoptosis signal-regulating kinase ATF2 - Activating transcription factor 2 BAD - The Bcl-2-associated death promoter BAG3 - Bcl-2 associated athanogene 3 BAK1 - BCL2-antagonist/killer 1 Bcl-2 - B-cell lymphoma 2 Bcl-XL - B-cell lymphoma-extra large bFGF - Basic fibroblast growth factor CaMKII - Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II CAPRI - Ca(2+)-promoted Ras inactivator Cdc20 - Cell division cycle 20 homolog Cdk - Cyclin-dependent kinase ChIP-seq - Chromatin Immunoprecipitation sequencing CK2 - Casein kinase 2 CKI - Cyclin-dependent kinase inhibitor CNK - Connector enhancer of KSR COX-2 - Cyclooxygenase-2 CRM1 - Chromosome region maintenance 1 protein CRYAB - Crystallin, alpha-B cryaf - Crystallin, alpha-F DAF - Abnormal dauer formation protein DTT - 1,4-Dithiothreitol eEF1A - Eukaryotic translation elongation factor 1A EGF 1 - Epidermal growth factor 1 Eps8 - Epidermal growth factor receptor pathway substrate 8 ErbB - Erythroblastic leukemia viral oncogene homolog ERK1 - Extracellular signal-regulated kinase 1 FADD - Fas-associated death domain Fgf7 - Fibroblast growth factor 7 Fkbp52 - FK506 (tacrolimus) binding protein 52 FLIP - FADD-like interleukin 1-converting enzyme-inhibitory protein FOXO - Forkhead box protein O GAP - GTPase-activating protein GDS - Guanine nucleotide dissociation stimulator GEF - Guanine nucleotide exchange factor GLUT1 - Glucose transporter 1 Grb2 - Growth factor receptor-bound protein 2 GRF - Guanine nucleotide-releasing factor GRO1 - The chemokine growth-regulated oncogene 1 GRP - Guanyl-releasing protein GSK-3 - Glycogen synthase kinase 3 HBEGF - Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor HDAC6 - Histone deacetylase 6 HIF - Hypoxia-inducible factor 3 Hop - Homeodomain only protein HSBP1 - Heat shock factor binding protein 1 HSE - Heat shock elements HSF - Heat shock transcription factor HSP – Heat shock protein HSR1 - The heat shock RNA-1 IAPs - The inhibitors of apoptosis Icmt1 - Isoprenylcysteine carboxymethyl transferase 1 IGF1R - Insulin-like growth factor 1 receptor JNK - c-Jun N-terminal kinase KSR - Kinase suppressor of Ras lif - Leukemia inhibitory factor MAD2 - Mitotic arrest deficient 2 MAPK - Mitogen-activated protein kinase MAPKAP - Mitogen-activated protein kinase-activated protein Mcl-1 - Myeloid cell leukemia sequence 1 Mek - Mitogen-activated protein kinase kinase MEKK1 - Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1 mTOR - Mammalian target of rapamycin MYC - V-Myc myelocytomatosis viral oncogene homolog NF1- Neurofibromatosis type 1 NF-kB - Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells p97/VCP - The 97-kDa valosin-containing protein PAR4 - Prostate apoptosis response 4 PDGF - Platelet-derived growth factor PDSM - Phosphorylation-dependent sumoylation motif PI3K - Phosphoinositide-3 kinase PIP2 - Phosphatidylinositol (4,5) biphosphate PIP3 - Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate PKA - Protein kinase A PKC - Protein kinase С PKC-B - Protein kinase C beta type PLK1 - Polo-like kinase 1 P-TEFb - Positive transcription elongation factor b PН - Pleckstrin homology PР - Protein phosphatase RalBP1 - Ral-binding protein 1 RASAL - RasGAP-activating-like protein 1 RASSF5 - Ras association domain-containing family protein 5 RBD - Ras-binding domain Rce1 - Ras converting enzyme 1 REM - Ras-exchange motif RGL – RalGDS like RSK2 - Ribosomal protein S6 kinase 2 SAM68 - Src-associated in mitosis 68 SCF - Skp1 (S-phase kinase-associated protein 1)/cullin/F-box SH - Src homology SIRT1 - Silent information regulator 2 Sos - Son of sevenless homolog SRF - Serum response factor TGF - Transforming growth factor Tiam1 - T-cell lymphoma invasion and metastasis 1 4 TNF - Tumor necrosis factor TRAP80 - Thyroid receptor-associated protein-80 uPA - Urokinase-type plasminogen activator VEGF - Vascular endothelial growth factor β-TrCP - β-Transducin repeat-containing protein АТФ – Аденозинтрифосфат АФК – Активные формы кислорода ГДФ – Гуанозиндифосфат ГТФ – Гуанозинтрифосфат 5 Введение Актуальность проблемы Злокачественные новообразования возникают в результате накопления в какойлибо из клеток организма мутаций в генах, продукты которых контролируют важнейшие аспекты ее жизнедеятельности – размножение, дифференцировку, метаболизм и др. В настоящее время известны сотни генов, так или иначе принимающих участие в процессах канцерогенеза. Однако многие детали молекулярных событий, ответственных за неопластическую трансформацию клеток при тех или иных первичных нарушениях генома и закономерности дальнейшей опухолевой прогрессии мутантных клонов с различным генетическим ландшафтом изучены недостаточно. Между тем их выяснение должно привести к более глубокому пониманию молекулярных механизмов канцерогенеза, идентификации новых перспективных мишеней для таргетной терапии новообразований, разработки новых способов ингибирования опухолевой прогрессии и, как результат, улучшению результатов лечения онкологических заболеваний. Онкогены семейства RAS (H-RAS, K-RAS, N-RAS) являются генами, мутации в которых наиболее часто встречаются в различных новообразованиях человека. Кодируемые этими генами белки Ras регулируют размножение, миграцию, жизнеспособность, метаболизм и дифференцировку клеток. При этом в зависимости от клеточного контекста, условий микроокружения и внутриклеточного уровня белков Ras, их влияние на судьбу клетки может сильно варьировать, и, в частности, либо способствовать неопластической трансформации, либо вызывать необратимую остановку клеточного цикла, старение и смерть клеток. В настоящее время, несмотря на многочисленные попытки, эффективных методов ингибирования действия онкогенного Ras в клинической практике не существует. Поэтому пополнение фундаментальных знаний о регуляции и функционировании онкобелков Ras имеет большое значение для поиска эффективных путей подавления вызываемой ими опухолевой прогрессии. Ранее в лаборатории цитогенетики НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН было обнаружено, что экспрессия мутантных онкобелков Ras приводит к уменьшению экспрессии генов сестринов, контролирующих антиоксидантную активность пероксиредоксинов, и, как следствие, к увеличению внутриклеточного содержания активных форм кислорода (АФК), воздействующих на многие аспекты жизнедеятельности клеток. Кроме того, с помощью биоинформатического анализа, было установлено, что промоторы генов сестринов содержат потенциальные HSF1- респонсивные элементы. HSF1 – транскрипционный фактор, регулирующий синтез белков теплового шока, – в настоящее время рассматривается некоторыми исследователями в 6 качестве новой перспективной мишени противоопухолевой таргетной терапии. Однако имеющиеся в литературе данные о роли HSF1 в процессах канцерогенеза весьма противоречивы. Выяснение закономерностей функционирования HSF1 в клетках, трансформированных онкобелками Ras, и изучение влияния на опухолевый рост различных модификаций функции HSF1, может внести существенный вклад в поиск новых эффективных способов ингибирования опухолевой прогрессии. Цели и задачи исследования Целью настоящей работы являлось изучение влияния экспрессии онкогенов RAS на активность транскрипционного фактора HSF1 и оценка биологических последствий различных изменений активности HSF1 в нормальных, иммортализованных и опухолевых клетках человека. Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи: 1. Изучить влияние экспрессии мутантных форм онкобелка Ras на активность транскрипционного фактора HSF1 в нормальных фибробластах (ФЧ) и иммортализованных кератиноцитах (HaCaT). 2. Исследовать влияние экспрессии мутантных форм онкобелка Ras на внутриклеточное содержание активных форм кислорода (АФК) и экспрессию генов сестринов в ФЧ и HaCaT; изучить связь изменений уровня АФК и экспрессии генов сестринов с изменениями транскрипционной функции HSF1. 3. Создать лентивирусные векторы, экспрессирующие различные мутантные формы HSF1 (конститутивно-активную, доминантно-негативную); с помощью трансдукции созданных векторов изучить влияние разных модификаций функции HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в различных типах клеток (ФЧ, HaCaT, рак ободочной кишки HCT116, фибросаркома HT1080). 4. Изучить влияние различных модификаций функции HSF1 на скорость роста клеток разных типов в культурах in vitro. 5. Изучить влияние различных модификаций функции HSF1 на кинетику роста и васкуляризацию ксенографтов опухолевых клеток человека в бестимусных мышах. Научная новизна и практическая значимость исследования Выполненные исследования позволили получить ряд приоритетных результатов. Впервые установлено, что экспрессия активных форм онкобелка Ras повышает внутриклеточное содержание АФК, репрессируя ген SESN3 счет изменения активности регулирующего его транскрипционного фактора HSF1. Выявлено противоположное 7 действие онкобелка Ras на транскрипционную активность HSF1 в различных клеточных контекстах, в частности в нормальных фибробластах и иммортализованных кератиноцитах человека. Обнаружено, что противоположные изменения активности HSF1 - увеличение активности в кератиноцитах и понижение активности в фибробластах - ведут в данных клеточных контекстах к сходным последствиям: репрессии гена SESN3, повышению внутриклеточного уровня АФК, активации ингибитора циклинзависимых киназ p21Cip1/Waf1 и замедлению скорости роста клеток in vitro. Продемонстрировано ингибирующее влияние избирательного подавления экспрессии гена SESN3 на скорость роста культивируемых клеток. При изучении влияния различных модификаций функции HSF1 на кинетику роста ксенографтов рака ободочной кишки человека HCT116 в бестимусных мышах показано, что ингибирование транскрипционной активности HSF1 увеличивает скорость опухолевого роста, а активация функции HSF1 приводит к противоположному эффекту. Эти эффекты, по крайней мере, частично, связаны с изменениями активности ключевых регуляторов клеточного цикла и ангиогенеза – белков Erk1/2 и HIF-1α. Таким образом, предлагаемое в качестве нового терапевтического подхода ингибирование функции HSF1 приводит в исследованной модели не к замедлению, а к ускорению опухолевого роста, тогда как активация функции HSF1, наоборот, замедляет опухолевую прогрессию. Противоположные эффекты ингибирования активности HSF1 на скорость роста опухолевых клеток, полученные на разных моделях/клеточных линиях в условиях in vitro и in vivo, указывают на необходимость проведения более углубленных исследований для оценки возможности и путей использования транскрипционного фактора HSF1 в качестве терапевтической мишени. 8 Глава 1. Обзор литературы Белки семейства Ras: структурная организация и биологические функции Строение и внутриклеточная локализация белков Ras У млекопитающих Ras суперсемейство малых ГТФазных белков содержит около 150 белков. В зависимости от строения и функций оно делится на 6 семейств: Ras, Rho, Rab, Ran, Rad и Arf. Семейство белков Ras, в свою очередь, делится на следующие подсемейства: Rap, R-Ras, Ral и Ras [55]. У млекопитающих найдено три гена подсемейства Ras (H-Ras, K-Ras, N-Ras), которые располагаются на разных хромосомах. Эти гены кодирует четыре схожих по структуре белка: H-Ras, N-Ras, K-Ras4A (189 аминокислот) и K-Ras4B (188 аминокислот). A и B изоформы белка K-Ras образуются за счет альтернативного сплайсинга четвертого экзона гена K-Ras. Гены H-Ras и K-Ras являются клеточными аналогами генов вирусов саркомы Харвея и Кирстена, соответственно; N-RAS экспрессируется в тканях нейробластомы человека [14]. Подсемейство Ras считается наиболее часто мутируемым классом онкогенов в опухолях человека. Мутации (12, 13, 61 аминокислотные остатки), приводящие к активации белков Ras, обнаруживаются в 33% всех опухолей человека. Мутации в гене KRAS ассоциированы с 21,6% всех типов рака человека, в гене N-Ras – с 8%, а в гене H-Ras – с 3,3% [12]. Основываясь на сравнении первичных последовательностей этих белков, в них можно выделить три протяженных участка. Первый, одинаковый у всех белков Ras, находится на N-конце и состоит из 86 аминокислотных остатков. Внутри него находится основной эффекторный домен (аминокислоты с 32 по 40), с помощью которого Ras взаимодействует со всеми своими эффекторами. Второй участок, состоящий из 80 аминокислотных остатков, несколько различается у разных белков Ras (85% гомологии между двумя любыми белками Ras). Эти два участка содержат консенсусные последовательности, участвующие в связывании фосфата/Mg2+ или ГДФ/ГТФ [200, 226]. Последний С-концевой участок (со 165 аминокислоты) является гипервариабельным. В нем не обнаружено гомологии в последовательности между различными вариантами белков Ras, за исключением только одного консервативного мотива СААХ (С – цистеин, А – алифатическая аминокислота, Х – любая аминокислота) на самом С-конце белков, который присутствует у всех членов подсемейства Ras и участвует в посттрансляционном процессинге [14, 108]. 9 Белки Ras локализованы на внутренней стороне плазматической мембраны, где они могут эффективно взаимодействовать как со своими активаторами, так и с эффекторами. Для ассоциации белков Ras с мембраной необходима посттрансляционная модификация их С-конца. В этом процессе критическую роль играет мотив СААХ. На первом этапе с помощью фермента фарнезилтрансферазы происходит образование ковалентной связи между изопреноидом фарнезилом (С15) и цистеиновым остатком в мотиве СААХ. Пренилирование цистеина является сигналом для локализации белка на цитозольной стороне эндоплазматического ретикулума и двух последующих модификаций: (1) эндопротеолитического удаления последовательности ААХ, катализируемого Rasконвертирующим ферментом-1 (Rce1) и (2) карбоксиметилирования теперь ставшего терминальным изопренилированного цистеинового остатка с помощью фермента изопренилцистеин карбоксиметилтрансферазы-1 (Icmt1) [12]. Модификации мотива СААХ являются необходимым, но недостаточным условием для связывания белков Ras с внутренней стороной плазматической мембраны. Для функционирования белков Ras и их стабильного взаимодействия с мембраной также необходимы сигналы, поступающие из гипервариабельного района, расположенного перед мотивом СААХ. Для белков H-Ras, NRas и K-Ras4A этими вторичным сигналом служит образование дополнительной ковалентной связи между пальмитиновой жирной кислотой и остатком цистеина в мотиве СААХ. K-Ras4В содержит домен, состоящий из многоосновных аминокислот, в основном это остатки лизина, который и является вторичным сигналом для его связывания с мембраной [12, 14]. Различные формы белков Ras взаимодействуют с разными участками плазматической мембраны, что обуславливается не только наличием у них уникального «якорного» мотива, но и различием в механизмах доставки белков к мембране. Например, белок H-Ras взаимодействует преимущественно с холестерол-богатыми микродоменами плазматической мембраны. Белки H-Ras и N-Ras транспортируются к мембране через аппарат Гольджи, где они подвергаются пальмитилированию, тогда как K-RasВ, вследствие наличия у него участка, состоящего из многоосновных аминокислот, из эндоплазматического ретикулума напрямую направляется к мембране, минуя аппарат Гольджи [14]. Регуляция активности белков Ras Как было отмечено выше, суперсемейство Ras представляет собой малые ГТФазные белки, которые активны в ГТФ-связанном и неактивны в ГДФ-связанном состоянии. Активное/неактивное состояние регулируется двумя типами регуляторных 10 белков: GEF, обменивающих ГДФ на ГТФ, и GAP, осуществляющих гидролиз ГТФ до ГДФ. Таким образом, белки GEF являются положительными регуляторами активности белков Ras, а белки GAP, соответственно, отрицательными. При этом для каждого члена суперсемейства Ras существует свой набор регуляторных белков, которые могут связываться с ним с разной степенью аффинности. GAPs и GEFs являются многодоменными белками. Многие из этих доменов представляют собой участки для связывания белков или липидов, что указывает на то, что они служат в качестве сигналов локализации и/или предоставляют «площадку» для формирования белковых комплексов [22]. Для эффективного гидролиза ГТФ, осуществляемого белками GAP, критическое значение имеют следующие моменты: правильная ориентация атакующей молекулы воды и ее поляризация; «захват» этой молекулы из активного сайта, а также стабилизация переходного состояния. Так, например, результатом мутации глутамина-61 в белке Ras, участвующего в координации молекулы воды, является невозможность осуществления GAP-индуцируемого гидролиза [22]. В семейство белков RasGAP, являющихся негативными регуляторами активности Ras, входят следующие белки: р120, NF1, RASAL, CAPRI, а также AIP1. р120 является наиболее изученным представителем RasGAP. Он имеет комплексную модулярную структуру и состоит из С-концевого каталитического GAP домена, участвующего во взаимодействии с ГТФазами; двух аминоконцевых SH2 доменов, фланкирующих SH3 домен, а также РН домена и кальций-зависимого фосфолипид связывающего домена, необходимого для связывания с внутренней стороной плазматической мембраны. На N-конце он также содержит последовательность, богатую пролином и участвующую во взаимодействии с представителями семейства Src киназ [72]. Наличие домена GAP необходимо и достаточно для гидролиза RasГТФ. Однако для приобретения полной каталитической активности и эффективной стимуляции гидролиза на внутренней стороне плазматической мембраны важно взаимодействие р120GAP с другими факторами. Например, одним из таких факторов является PDGF. Он связывается со своим рецептором, что приводит к аутофосфорилированию его (рецептора) цитоплазматического домена и взаимодействию со вторым доменом SH2 белка р120GAP. Подобным образом р120GAP может связываться и с активированным рецептором эпидермального фактора роста (EGF). Взаимодействие р120GAP с рецепторами является общим механизмом, стимулирующим последующий гидролиз ГТФ, осуществляемый GAP доменом [72]. Нейрофибромин (NF1) является продуктом гена опухолевого супрессора NF1. Инактивация NF1 приводит к гиперактивности белков Ras в опухолевых клетках. В 11 клетках нейрофибросаркомы, а также клетках, полученных от больных лейкемией, наблюдается снижение GAP активности белка NF1 и повышение уровня RasГТФ. что приводит к последующей активации его эффекторов. GAP домен нейрофибромина гомологичен таковому у белка р120GAP, однако их совместная экспрессия во многих типах тканей говорит об их функциональных различиях. Так, нейрофибромин имеет более низкие Км и Ккат для связывания RasГТФ и для гидролиза ГТФ, соответственно, что указывает на его высокую эффективность при низких концентрациях RasГТФ, тогда как р120GAP функционирует при более высоком содержании RasГТФ, а также активируется в ответ на сигналы, поступающие от факторов роста [72]. GAP белки RASAL и CAPRI являются Са2+-зависимыми; их транслокация на плазматическую мембрану индуцируется повышением содержания Са2+. Однако механизмы ответа несколько различаются: RASAL, следуя колебаниям в уровне кальция, постоянно перемещается между мембраной и цитозолем, тогда как CAPRI остается связанным с мембраной после кальций-зависимой стимуляции [22]. AIP1, недавно открытый член семейства RasGAP, участвует в TNF-индуцируемой активации ASK1, являющегося активатором JNK- и р38 МАРК-сигнальных каскадов, способствуя диссоциации комплекса ASK1 с его ингибитором 14-3-3 [98, 239]. Белки GEFs катализируют диссоциацию ГДФ от G-белков путем модификации нуклеотид-связывающего сайта, что приводит к ослаблению связи между ними, высвобождению ГДФ и последующей замене его на ГТФ. Сродство G-белков к ГДФ и ГТФ одинаково, поэтому результатом увеличения содержания ГТФ-связанной формы является в 10 раз по сравнению с ГДФ повышенная концентрация ГТФ в клетке [22]. RasGEFs представляют собой достаточно многочисленную группу белков, которая включает в себя белки Sos1 и 2, GRF1 и 2, Ost, GRP и др. [172]. Белок Sos1, а также родственный ему белок Sos2, состоят из N-концевого гистон-связывающего домена, RacGEF каталитического домена, соединенного с доменом РН, домена REM, RasGEF каталитического домена и С-концевого участка, богатого пролином. Факторы роста вызывают активацию белков Sos и их перемещение к плазматической мембране, где располагаются их мишени – ГТФазы. В этой транслокации участвует адапторный белок Grb2, который взаимодействует, с одной стороны, своим SH2 доменом с фосфорилированным по тирозину рецептором, а с другой, SH3 домен Grb2 образует связь с богатой пролином С-концевой областью белков Sos. Перемещение Sos к мембране негативно контролируется киназой Erk (по принципу обратной связи), которая, фосфорилируя Sos по аминокислотным остаткам в С-концевом участке, разрушает белковый комплекс Grb2-Sos [16, 222]. Удаление N- и/или С-концевого участка белков Sos 12 приводит к его активации, что указывает на то, что в отсутствие стимуляции Sos, как и многие другие белки GEF, находится в аутоингибированной конформации. Взаимодействие адапторного белка Grb2 с С-концевой областью способствует изменению этой конформации и активации Sos. В аутоингибировании N-конца белков Sos участвует RacGEF каталитический домен. Активация белков Sos может также осуществляться за счет аллостерических взаимодействий, в частности, RasГТФ может напрямую связываться с доменом REM, тем самым изменяя конформацию белка и разрушая взаимодействие между RacGEF каталитическим доменом и доменом REM [198]. Выбор между RacGEF и RasGEF активностями Sos может частично осуществляться за счет взаимодействия с различными адапторными белками. Так, например, в активации RasGEF участвует белок Grb2, тогда как для приобретения RacGEF активности необходим комплекс белков, содержащий адапторы Abi1 и Eps8 [189]. Таким образом, белки Sos являются связующим звеном, через которое осуществляется координация активации белков Ras и Rac в ответ на сигналы, поступающие от факторов роста. Недавно был предложен еще один механизм регуляции активности белков Sos [241]. В ответ на активацию эпидермального фактора роста происходит присоединения фосфатидной кислоты, образованной активированной фосфолипазой D2, к РН домену белка Sos, последующее перемещение Sos к плазматической мембране и активация белков Ras. Мутации в белках GEF и GAP ассоциированы со многими болезнями, включая онкологические [16]. Так, например, мутации в гене NF1 приводят к развитию нейрофиброматоза первого типа, распространенного заболевания, характеризующегося повышением риска образования злокачественных опухолей нервных тканей [15]. Нарушение функционирования белков Sos вызывает развитие наследственного фиброматоза десен [100]. Мутации в генах некоторых RhoGEF белков приводят к развитию Х-сцепленной умственной отсталости [144], а нарушения функций белков Dock (GEF белки) – к развитию рака [203]. Активированный Ras далее взаимодействует со своими белками-мишенями, иначе называемыми эффекторами (рис. 1). 13 Рисунок 1. Процесс активации белка Ras на плазматической мембране и его эффекторы. Эффекторы белков Ras Активированный Ras, взаимодействуя с белками-мишенями, индуцирует активацию множества сигнальных путей. Эффекторами RasГТФ является большая группа белков, многие из которых были обнаружены недавно, включающая белки RAF, PI3K, семейство RalGDS, Tiam1, p120GAP, NF1, MEKK1, Rin1, AF-6, PKC-B, Nore1 (RASSF5), Canoe и др. [34]. Разные белки Ras могут регулировать различные члены одно и того же семейства эффекторных белков. Разные изоформы Ras имеют количественные и качественные отличия в своей способности взаимодействовать с определенным эффектором; эффекторы, в свою очередь, могут являться мишенями для одних белков семейства Ras и не взаимодействовать с другими членами этого семейства. Такое селективное взаимодействие имеет очень важные биологические последствия [180]. Все эффекторы белков Ras содержат Ras-связывающий домен (RBD). Исходя из последовательности аминокислот (примерно 100 аминокислотных остатков), составляющей этот домен, RBDs были разделены на три класса: (1) домен, содержащийся в белках Raf или Tiam1, (2) PI3K-RBD и (3) Ras-ассоциированный домен, обнаруженный в большинстве других эффекторов [176]. Несмотря на то, что все три класса доменов практически не имеют гомологии в первичной последовательности, все они обладают топологией, схожей с укладкой убиквитина, которая характеризуется βαβαβ четвертичной 14 структурой. Такая общая для разных эффекторов топология Ras-связывающего домена объясняет одинаковый механизм взаимодействия белков Ras со своими мишенями [103]. Первым из идентифицированных Ras-зависимых сигнальных путей является RafMek-Erk путь. Семейство белков Raf, состоящее из A-Raf, B-Raf и Raf-1 (также известен под названиями C-Raf или C-Raf-1), представляет собой серин/треониновые киназы, которые связываются с эффекторным участком RasГТФ, что индуцирует их транслокацию к плазматической мембране. Дальнейшая активация белков Raf связана, в первую очередь, с фосфорилированием определенных аминокислотных остатков протеинкиназами, в частности протеинкиназой С (РКС). Активный Raf фосфорилирует киназы Mek1 и Mek2, которые, в свою очередь, фосфорилируют и активируют регуляторные киназы Erk1/2 [56]. Процесс фосфорилирования белков ERK1/2 способствует их гомодимеризации и транслокации в ядро, где они путем фосфорилирования индуцируют активацию ряда транскрипционных факторов, включая p62/Elk-1, Ets-2 и Jun [34, 124]. Киназы ERK1/2 влияют на многие клеточные процессы; в число их мишеней, помимо транскрипционных факторов, также входят рибосомальные белки, различные ферменты, белки цитоскелета и т.д. [167]. Белки семейства Raf отличаются по своей способности к активации Mek-ERK сигнального пути. Так, B-Raf обладает наиболее высокой базальной киназной активностью, а также легче всего вступает во взаимодействия с белками Ras и активируется в ответ на внеклеточные стимулы. Активация белков A-Raf и Raf-1 схожа между собой, тогда как активация B-Raf несколько отличается. Дело в том, что белок BRaf имеет конститутивно фосфорилированные аминокислотные остатки на N-конце (серин и аспартат), поэтому ему не требуется дополнительного фосфорилирования Nконцевого участка для полной активации в отличие от A-Raf и Raf-1 [43, 89]. Считается, что B-Raf обладает наибольшим онкогенным потенциалом среди всех членов семейства Raf. Мутации в гене B-Raf обнаружены примерно в 70% всех злокачественных меланом человека, а также в 15% колоректальных опухолей [61, 151]. Киназа PI3K является вторым по степени изученности эффектором белков Ras и играет важную роль в Ras-опосредованных сигнальных путях, ответственных за выживание и пролиферацию клеток [211]. Ras непосредственно взаимодействует с каталитической субъединицей PI3K, что приводит к активации липидной киназы в результате ее транслокации на мембрану и последующих конформационных изменений. Активная PI3K фосфорилирует фосфотидилинозитол-4,5-дифосфат (PIP2) до фосфотидилинозитол-3,4,5-трифосфата (PIP3). PIP3 является вторичным мессенджером, который связывается с большим количеством белков через РН домен. В частности, он фосфорилирует Akt/PKB, индуцируя каталитическую активность киназы Akt, что 15 приводит к фосфорилированию и активации ряда белков-мишеней (например, GSK3β и mTOR), участвующих в процессах клеточного роста и выживания, клеточном цикле. Кроме того, активация PI3K ведет к функциональной активации белков Rac, членов семейства малых Rho ГТФ-аз, осуществляющих регуляцию организации актинового цитоскелета [33, 34]. В общем, PI3K, положительно влияя на рост клеток и отрицательно на их апоптотическую активность, способствует поддержанию процессов канцерогенеза. Мутации, затрагивающие каталитическую субъединицу PI3K, приводят к активации PI3Kопосредованного сигнального пути и обнаруживаются в 15-20% всех колоректальных раков [210, 223]. Еще в одном хорошо изученном Ras-регулируемом сигнальном пути принимают участие белки RalGDS (RalGEFs). Взаимодействуя с активированным Ras, RalGDS индуцируют активацию белков RalA и RalB, являющихся малыми ГТФазами [57]. Идентифицировано шесть белков-эффекторов Ras, принадлежащих к семейству RalGDS: RalGDS, RGL, RGL2 (также известен как Rlf), RalGPS1 и 2 и RGL3. RalGDS-Ral сигнальный путь регулирует активность различных транскрипционных факторов, а также процессы эндо/экзоцитоза, организацию актинового цитоскелета, апоптоз и везикулярный транспорт. Кроме того, RalGDSs играют существенную роль в Ras-опосредованных процессах трансформации и онкогенеза [78, 94]. Отметим, что хроническая активация белков RalA и RalB обнаружена во многих опухолевых клетках и тканях. Ингибирование функции RalA приводит к снижению скорости роста опухолевых клеток независимо от субстрата, а RalВ способствует выживанию различных опухолевых клеточных линий. Считается, что совместное функционирование RalA и RalВ снижает чувствительность опухолевых клеток к сигналам, ограничивающим избыточную пролиферацию и выживаемость, характерным для нормальных клеток [21, 133]. Нарушения в функционировании Ras-зависимых сигнальных путей могут также приводить к аномальной активации белков семейства Rho ГТФаз, которые, в свою очередь, способствуют таким процессам, как опухолевая инвазия и метастазирование [184]. Поэтому эффекторы белков Ras, участвующие в активации белков Rho, играют важную роль в Ras-опосредованной опухолевой прогрессии. Одним из таких эффекторов является белок Tiam1, специфическая Rac ГТФаза, обладающая схожим с белками Raf Ras-связывающим доменом. Инактивация Tiam1 у мышей приводит к их устойчивости к H-Ras-индуцируемому процессу канцерогенеза в коже [34, 143]. Отметим также существование некоторого числа белков (KSR, 14-3-3, CNK), которые, взаимодействуя с Ras, способствуют активации его эффекторов [30, 182, 207]. 16 Биологические последствия конститутивной активации белков Ras В норме Ras регулирует многие клеточные процессы, в первую очередь деление и миграцию клеток. Образование функционально активных форм белка Ras происходит в строго определенных для нормальной работы клетки количествах. Активирующие мутации в белке Ras приводят к постоянной экспрессии активных форм этого белка. Следствием этого является нарушение нормальной работы клеточного цикла, что в конечном итоге приводит к избыточной клеточной пролиферации; ингибированию апоптоза; нарушению морфогенетических реакций клетки (изменения цитоскелета, адгезионных взаимодействий клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом), приводящих к изменению морфологии и подвижности клеток; модификации микроокружения клетки (деградация внеклеточного матрикса, образование новых кровеносных сосудов) [1]. Таким образом, конститутивная активация Ras-регулируемых сигнальных путей вызывает целый ряд изменений, способствующих неопластической трансформации клетки и образованию из нее злокачественной опухоли. Влияние на пролиферацию клеток В основе избыточной пролиферации, характерной для опухолевых клеток, лежат нарушения механизмов, которые в норме способствуют формированию адекватного ответа клеток на митогенные и анти-митогенные сигналы, поступающие из внеклеточного окружения. Вследствие того, что белки Ras являются первичными посредниками в проведении таких сигналов в клетке, неудивительно, что их конститутивная активация может привести к избыточной клеточной пролиферации. Так, гиперэкспрессии онкогенного H-Ras достаточно для того, чтобы клетки, находящиеся в стадии G0, вступили в клеточный цикл даже в отсутствие сигналов от факторов роста [76]. Активные белки Ras могут способствовать клеточной пролиферации за счет увеличения транскрипционной активности факторов роста, таких как, гепарин-связывающего EGFподобного фактора роста (HBEGF), трансформирующего фактора роста α (TGFα), амфирегулина (AREG) [188], а также за счет модуляции экспрессии рецепторов факторов роста [90]. Онкогенный H-Ras увеличивает активность интегринов, что также способствует пролиферации клеток [232]. С другой стороны, активный Ras может помешать поступлению анти-пролиферативных сигналов, в частности, за счет ингибирования TGFβ-сигнального пути [81]. Результатом пролиферативных сигналов, поступающих от онкогенных форм Ras, является повышение экспрессии транскрипционных факторов, необходимых для клеточной пролиферации, включая FOS, SRF (фактор ответа сыворотки), JUN, Elk1, активирующий транскрипционный фактор 2 17 (ATF2) и ядерный фактор-кВ (NF-kB) [82, 230]. Эти факторы, в свою очередь, регулируют экспрессию циклинов G1 и D1, играющих критическую роль в прогрессии клеточного цикла. Ранее было показано, что ключевую роль в увеличении экспрессии циклина D1 играет Raf-MAPK сигнальный путь, однако на настоящий момент доказано, что в этой регуляции также принимают участие PI3K-, Rac1- и RalGDS-сигнальные пути [80, 93]. Помимо стимуляции экспрессии циклина D1, онкогенный Ras также влияет на стабильность данного белка путем PI3K-зависимого ингибирования активности GSK3β, киназы, участвующей в фосфорилировании, последующем убиквитинилировании и протеасомной деградации циклина D1 [69]. Уровень циклина D1 является маркером Rasиндуцированной трансформации. Так, мыши, дефицитные по этому гену, проявляют устойчивость к развитию опухолей молочных желез и плоскоклеточного рака, индуцированных онкогенным H-Ras [179]. Помимо влияния на активность циклина D1 онкогенный Ras может способствовать прогрессии клеточного цикла за счет нарушения регуляции анти-пролиферативных путей, в частности, путем подавления активности ингибиторов циклин-зависимых киназ (CKIs), таких как, р27 и р21 [171, 183]. Так, снижение активности р27 связано с активацией Ras-Raf и Ras-PI3K сигнальных путей, а также с подавлением транскрипционной активности факторов семейства FORKHEAD, за счет фосфорилирования их определенных аминокислотных остатков, которое индуцируется активацией сигнальных путей, контролируемых PI3К и Ral [148]. Суммарным результатом негативной регуляции р27Kip1 является повышение активности циклинзависимой киназы Cdk2, ответственной за переход из G1 в S-фазу клеточного цикла [51]. Подавление апоптоза Апоптоз считается злокачественности; одним ингибирование из главных этого механизмов процесса является защиты клетки характерной от чертой опухолевых клеток. Апоптотическая клеточная смерть может быть инициирована как внешними сигналами (нехватка факторов роста, потеря контактов с межклеточным матриксом), активирующими рецепторы смерти, так и внутренними (повреждение ДНК, нехватка питательных веществ). Несмотря на то, что результатом функционирования сигнальных путей, запускаемых как внешними, так и внутренними стимулами, является активация каспазы-3, в регуляцию этих путей вовлечены различные механизмы: про- и анти-апоптотические белки семейства Bcl-2 участвуют в регуляции митохондрионопосредованных путей (внутренние сигналы); анти-апоптотические FADD-подобные белки FLIP регулируют апоптоз, инициированный внешними стимулами; ингибиторы 18 апоптоза (IAPs) вовлечены в регуляцию обоих путей [54]. Активированные онкогенные белки Ras вызывают нарушения в нормальной регуляции апоптоза. Результатом элиминации индуцированной экспрессии онкогенного H-Ras является регрессия меланом, сопровождаемая массовой гибелью опухолевых клеток [41]. PI3K и Raf-зависимые сигнальные пути снижают активность про-апоптотических белков и увеличивают антиапоптотических. Так, результатом активации PI3K является ингибирование функции белка BAK1 (Bcl-2 гомологичный антагонист/киллер-1), а также увеличения уровня IAPs за счет активации NF-kB [147]. Активация Raf пути приводит к снижению активности проапоптотического белка PAR4, репрессора транскрипции, участвующего в апоптозе клеток простаты [159], а также к повышению активности анти-апоптотических белков семейства Bcl-2 и белка-репрессора апоптоза ARC [233]. Как Ras-Raf, так и Ras-PI3K сигнальные пути участвуют в фосфорилировании про-апоптотического белка, члена семейства Bcl-2, BAD по серинам 136 и 122, в результате чего происходит формирование неактивного комплекса с белками 14-3-3, что предотвращает гетеродимеризацию и последующую инактивацию белков BCL-2 и BCL-XL [60]. В недавних работах было также продемонстрировано Ras-индуцируемая эпигенетическая инактивация экспрессии проапоптотического гена CD95 [91]. Однако активированный Ras может также способствовать запуску про- апоптотических программ [10]. Так, H-Ras зависимая активация киназы JNK связана с инициацией процесса апоптоза [122], а фосфорилирование K-Ras протеинкиназой С способствует его транслокации к митохондриям и BCL-XL-зависимой индукции апоптоза [20]. Таким образом, в Ras-трансформированных клетках существует некоторый баланс между про- и анти-апоптотическими программами, который в конечном итоге определит, будет ли клетка жить или нет. Однако, как показывают данные, в большинстве раковых клеток, экспрессирующих онкогенный Ras, все-таки преобладают анти-апоптотические сигналы [171]. Модификация микроокружения После достижения опухолью определенного размера (3-5 мм в диаметре), ее дальнейший рост возможен лишь в случае образования в ней кровеносных сосудов (процесс ангиогенеза), которые позволят опухолевым клеткам получать достаточное количество кислорода и питательных веществ [84]. Регуляция активированным Ras проангиогенных процессов является комплексной и включает модуляцию активности эндотелиальных факторов роста, а также усиление процессов местного воспаления и модификацию структуры стромы [129]. Фактор роста сосудистого эндотелия А (VEGF-A), 19 играющий ключевую роль в стимуляции пролиферации эндотелиальных клеток и прорастании новых кровеносных сосудов, является мишенью для онкобелков Ras. Результатом подавления экспрессии онкогенных белков K-Ras является снижение уровня VEGF-A, что приводит к уменьшению роста опухоли [208]. В регуляции онкобелками Ras фактора VEGF-A участвует множество сигнальных путей, активация которых в конечном итоге приводит к стабилизации про-ангиогенного транскрипционного фактора HIF1α, являющегося активатором транскрипции гена VEGF-A [177]. Существует еще один путь, по которому онкогенный Ras регулирует VEGF-A: через про-ангиогенный фермент циклооксигеназу-2 (COX-2), который посредством увеличения продукции простагландинов повышает цАМФ-зависимую транскрипцию VEGF-A [129]. COX-2 также стимулирует активность ряда других факторов, таких как bFGF и PDGF, необходимых для интегрин-опосредованного разрастания и миграции клеток эндотелия [187]. Онкобелки Ras стимулируют синтез провоспалительных цитокинов, что также влияет на процесс ангиогенеза. Ras-зависимая регуляция экспрессии цитокинов, включая интерлейкин 8, 6 и GRO1, осуществляется путем активации сигнальных путей, которые активируют определенные транскрипционные факторы (например, AP-1 и NFкB), непосредственно контролирующие экспрессию цитокинов. Цитокины привлекают клетки иммунной системы, нейтрофилов и макрофагов, которые продуцируют ангиогенные факторы роста [9, 171, 199]. Для того, чтобы факторы роста могли достичь эндотелиальные клетки-мишени, а также для миграции новых клеток эндотелия требуется модификация внеклеточного матрикса (ВКМ). Онкобелки Ras увеличивают экспрессию матриксных металлопротеиназ (ММП) 2 и 9, а также uPA, играющих важную роль в расщеплении компонентов ВКМ. Онкогенный Ras через определенные сигнальные пути активирует транскрипционные факторы AP-1 и Ets1, которые индуцируют экспрессию ММП [229], а также фактор NFкB, который увеличивает экспрессию ММП-9 и уменьшает экспрессию ингибитора матриксных металлопротеаз [32]. Активированный Ras также способствует ангиогенезу путем уменьшения экспрессии негативных регуляторов этого процесса, таких как, тромбоспондины 1 и 2. Так, через PI3K-сигнальный путь происходит фосфорилирование белка MYC, который репрессирует экспрессию тромбоспондина-1 [214]. Воздействие на подвижность клеток; связь с инвазией и метастазированием Одним из самых угрожающих аспектов развития опухолей является приобретение раковыми клетками метастатических свойств, то есть способности распространяться в окружающие и отдаленные ткани и органы, образовывая там вторичные очаги 20 опухолевого роста. Во многих метастатических опухолях (таких как, рак легкого, поджелудочной железы и толстой кишки) обнаружены мутации в генах Ras. Первый этап метастатического процесса заключается в приобретении клетками инвазивных свойств, то есть способности проникать в окружающие нормальные ткани. Результатом функционирования онкобелков Ras является увеличение миграционной способности раковых клеток, связанной с возникновением нарушений, выраженных в реорганизации системы актиновых микрофиламентов и изменении формирования фокальных и межклеточных контактов [1]. Мишенями онкогенного Ras являются молекулы, отвечающие за поддержание межклеточный адгезионных контактов, такие как, кальцийзависимый рецептор Е-кадгерина и ассоциированный с ним цитоплазматический белок βкатенин [96]. Так, экспрессия онкобелков Ras приводит к уменьшению уровня Екадгерина за счет увеличения активности его транскрипционных репрессоров (таких как, SNAIL и SLUG), стимуляции протеолитической деградации Е-кадгерина, а также метилирования его промотора. Более того, активированный Ras негативно влияет на стабильность комплекса Е-кадгерин/β-катенин и индуцирует релокализацию β-катенина [92, 96]. Помимо влияния на межклеточные контакты экспрессия онкогенного Ras также вызывает нарушения в формировании фокальных контактов за счет снижения экспрессии субъединиц интегринов (например, α5β1-субъединиц), которые в норме отвечают за поддержание стабильных адгезионных комплексов [99]. И, наконец, онкобелки Ras повышают двигательную активность неопластических клеток за счет непосредственного влияния на полимеризацию и организацию актина; полимеризацию и/или стабильность микротрубочек; а также транскрипцию генов, продукты которых обладают митогенными свойствами. Все эти изменения приводят к тому, что клетка теряет полярность и приобретает фибробластоподобный фенотип, необходимый для ее последующей миграции [32]. Для образования метастаз необходимо, чтобы раковая клетка покинула первичную опухоль и проникла в кровеносную и лимфатическую системы. Критическим на этом этапе является способность опухолевой клетки к преодолению физического барьера, созданного базальной мембраной. Экспрессия онкобелков Ras влияет на деградацию ВКМ за счет увеличения экспрессии/активности различных протеаз и, параллельно, снижения экспрессии ингибиторов протеаз, а также за счет защиты клеток от аноикиса (форма апоптоза, обусловленная отрывом клетки от клеток-соседей) [86, 195]. Ras-зависимые сигнальные пути, через которые осуществляется влияние активированного Ras на приобретение опухолевой клеткой инвазивных и метастатических свойств, включают Ras–MAPK, Ras–PI3K, Ras–Ral ГТФазный и Ras–Rho ГТФазный пути 21 [92]. Так, например, активация Ras–Rho ГТФазного пути приводит к изменениям в клеточной адгезии и подвижности [184], а результатом активации Raf-Erk и RalA сигнальных каскадов является индукция экспрессии uPA, участвующего в процессе разрушения базальной мембраны. Кроме того, активированный Ras, увеличивая активность транскрипционного фактора Ets-1, повышает уровень протоонкогена Met, являющегося рецепторной тирозинкиназой, который, в свою очередь, также может влиять на экспрессию uPA [32]. В некоторых случаях индукция метастазирования является результатом совместного действия онкогенного Ras и других путей, которые могут способствовать этому процессу, в частности, TGFβ-сигнального пути [111, 171]. Влияние на метаболизм Вследствие высокой скорости пролиферации раковых клеток выживаемость опухолей зависит от метаболических путей, играющих критическую роль в снабжении их веществами, необходимыми для образования новых клеток. Было показано, что типичным для опухолевых клеток является увеличение поглощения глюкозы и сдвиг метаболизма с окислительного фосфорилирования на аэробный гликолиз [119]. Онкогенный Ras участвует в перепрограммировании метаболических путей путем увеличения экспрессии HIF1α, который, связываясь с HIF1β, формирует транскрипционный фактор HIF, являющийся известным индуктором сдвига метаболизма в сторону гликолиза. Влияние Ras на активность HIF1α осуществляется за счет активации MAPK и PI3K-сигнальных путей, которые стимулируют активацию mTOR и mTOR-опосредованную трансляцию HIF1α, что приводит к повышению транспорта глюкозы и ее поглощения в цикле гликолиза [85, 114]. Кроме того, онкобелки Ras увеличивают транскрипцию гена транспортера глюкозы – GLUT1, что коррелирует с повышением способности клеток к поглощению глюкозы [37]. Активированный Ras также стимулирует образование промежуточных продуктов за счет увеличения уровня ключевых ферментов гликолиза: гексокиназы, фосфофруктокиназы и лактатдегидрогеназы [40]. Другим путем, по которому онкогенный Ras может координировать клеточный метаболизм, является его влияние на процесс аутофагии (процесс самопоглощения, при котором вырабатывается энергия, а также строительный материал, необходимый для выживания клеток). Аутофагия может, как способствовать, так и ингибировать процессы канцерогенеза. Однако недавние работы показали, что результатом Ras-опосредованной индукции аутофагии является сдвиг метаболизма в сторону гликолиза, увеличение выживаемости клеток и, как следствие, поддержание роста опухолей in vivo [139, 171]. 22 Хочется отметить, что влияние активного белка Ras на многие клеточные процессы осуществляется за счет изменения концентрации внутриклеточных активных форм кислорода (АФК), являющихся известными вторичными мессенджерами, участвующими в регуляции различных клеточных путей. Так, повышенный уровень АФК может влиять на клеточную пролиферацию и дифференциацию, апоптоз, повреждение ДНК, миграцию [77], причем эффекты модуляции содержания АФК на клеточные процессы сильно зависят от степени изменения их концентрации в клетке, а также клеточного контекста (например, активности антиоксидантных программ). На настоящий момент известно, что гиперэкспрессия белков Ras приводит к увеличению уровня АФК в различных типах клеток [77], однако, следует отметить, что эффект может быть двухфазным, когда за первичным повышением содержания АФК следует его снижение за счет активации антиоксидантных программ, индуцированных активацией белков р53 [127], Nrf2 [67]. Механизмы регуляции уровня АФК активными формами Ras до конца не ясны. Одним из них является активация PI3K/Rac и Raf/Mek/Erk путей, приводящая к активации NADPHоксидазы [2, 11], действие другого механизма осуществляется за счет регуляции NOXоксидазы [42]. Результатом Ras-индуцированной активации Raf/Mek/Erk1 пути является репрессия экспрессии генов сестринов, контролирующих активность пероксиредоксинов, что приводит к подавлению антиоксидантных программ [127]. На настоящий момент известны многие биологические последствия аберрантной экспрессии белков Ras, однако наши знания о механизмах действия белков Ras оставляют широкое поле для исследований. Транскрипционный фактор HSF1 Транскрипционный фактор HSF1 принадлежит к семейству транскрипционных факторов теплового шока (HSFs), которое помимо HSF1 включает в себя еще три фактора (у позвоночных и растений): HSF2, HSF3 и HSF4. Их основная функция заключается в регуляции высококонсервативного среди эукариот механизма ответа на тепловой шок, который может быть индуцирован различными протеотоксическими стрессами, включающими как стрессы, поступающие из окружающей среды, так и физиологические стимулы [156]. HSFs связываются со специфичной последовательностью в промоторах генов белков теплового шока (HSP) и индуцируют их экспрессию. Все члены семейства имеют как уникальные, так и перекрывающиеся функции, а также тканеспецифичный паттерн экспрессии. У позвоночных HSF1 является главным регулятором активности HSP; он экспрессируется в большинстве тканей и типах клеток. Однако функционирование HSF1 не ограничивается только регуляцией экспрессии HSP, о чем мы расскажем ниже. 23 HSF2 играет важную роль в процессах развития организма. Он также может участвовать в модуляции ответа на тепловой шок посредством формирования гетеротримеров с HSF1 [185]. До недавнего времени считалось, что HSF3 является уникальным фактором, экспрессирующимся только у птиц. Однако недавно он был обнаружен также и у мышей [88]. Для птичьего HSF3 характерна активация в ответ на тепловой шок, но с отличной от HSF1 кинетикой. Считается, что при очень сильных стрессах он «помогает» HSF1 с защитой организма. Для мышиного HSF3 показана его транслокация в ядро, индуцируемая тепловым шоком, и активация генов, отличных от генов HSP. HSF4 за счет альтернативного сплайсинга образует 2 изоформы белка: HSF4a и HSF4b. Хотя эти изоформы имеют небольшие различия в последовательности аминокислот, они сильно отличаются по функциональным свойствам. HSF4a является ингибитором экспрессии HSP, тогда как HSF4b – это транскрипционный активатор. Важно отметить, что формирование гомо- и гетеротримеров между различными членами этого семейства является обычным событием в HSF-опосредованной транскрипционной регуляции [5, 156, 170, 212]. Ниже рассмотрим строение, активацию, регуляцию и функции транскрипционного фактора HSF1. Строение и активация HSF1 Строение HSF1 Белки HSF1 состоят из функциональных модулей. На N-конце находится ДНКсвязывающий домен (ДСД), являющийся наиболее консервативным участком белков HSF. ДСД ответственен за связывание HSF1 с определенной последовательностью ДНК и состоит из трех α-спиралей и четырех β-цепей. HSF1 принадлежит к классу факторов транскрипции, имеющих ДНК-связывающий мотив типа спираль-поворот-спираль. Характерной особенностью этого класса является наличие центрального фолда, состоящего из α-спиралей 2 и 3, где α-спираль 3 узнает молекулу ДНК и взаимодействует с ее большим желобком. Четыре β-цепи образуют один антипараллельный β-лист, в центре которого находится Рис. 2. Расположение петли в ДНКсвязывающем домене фактора HSF1. [3], с модификациями). гидрофобное ядро, образованное тяжами [141]. Петля, расположенная между 3 и 4 β-цепями, участвует в белокбелковых взаимодействиях между субъединицами внутри тримера HSF1 или между соседними ДНК-связывающимися тримерами и, таким образом, 24 она может увеличивать сродство HSF1 к ДНК, не соприкасаясь при этом с ней. Кроме того, эта петля у HSF1 может регулировать олигомеризацию в ответ на тепловой шок. Дело в том, что она претерпевает конформационные изменения, которые способствуют высвобождению тримеризационного домена (рис.2) [3]. ДСД узнает последовательность 5’-nGAAn-3’. Сравнение последовательностей всех типов HSFs выявило наличие участка, содержащего один или несколько гидрофобных гептадных повторов (ГП-A/B), расположенных рядом с ДНК-связывающим доменом. Для олигомеризации HSF1 требуется хотя бы один такой повтор. Большинство HSFs содержат дополнительный гидрофобный повтор (ГП-C), расположенный в первой трети С-конца. Он консервативен среди HSFs позвоночных и может подавлять процесс тримеризации. На С-конце находится трансактивационный домен (ТД), состоящий (у HSF1) из двух модулей, ТД1 и ТД2, богатых гидрофобными и кислыми аминокислотными остатками [95]. Между ГПA/B и ГП-C располагается регуляторный домен (РД), аминокислотные остатки которого участвуют в пост-трансляционных модификациях (рис.3). Между 297 и 304 аминокислотными остатками в регуляторном домене находится мотив сумоилирования, зависимый от фосфорилирования (PDSM), I/L/V-K-X-E-X-X-S-P, который участвует в репрессии трансактивационной активности HSF1. У S.cerevisiae также найден трансактивационный домен на N-конце [212]. Рис. 3. Структура HSF1. Вверху/внизу отмечены аминокислотные остатки, на которые действуют позитивные/негативные регуляторы активности HSF1 (приведены в скобках). ДСД – ДНК-связывающий домен; ГП – гидрофобные повторы (лейциновая молния); РД – регуляторный домен; ТД – трансактивационный домен; СЯЛ – сигнал ядерной локализации; PDSM - phosphorylation-dependent sumoylation motif (мотив сумоилирования, зависимый от фосфорилирования) Активация HSF1 В отсутствие стресса HSF1 находится в неактивном состоянии в комплексе с различными белками. Под действием стресса происходит активация HSF1, включающая 25 несколько этапов: высвобождение HSF1 из гетерокомплекса с шаперонами и кошаперонами, накопление в ядре, тримеризацию, приобретение ДНК-связывающей активности, гиперфосфорилирование HSF1 и его трансактивацию (рис. 4) [170]. Рисунок 4. Схема активации транскрипционного фактора HSF1. Можно сказать с уверенностью, что HSF1, находясь в активной форме, имеет ядерную локализацию. Однако по поводу локализации неактивного HSF1 (в отсутствие какого-либо стресса) до недавнего времени имелись противоречивые данные. Одни указывали на его цитоплазматическую локализацию [13], другие утверждали, что HSF1 является ядерным белком [152]. Споры разрешились в 2005 г., когда вышла работа, в которой говорится, что HSF1 в репрессированном состоянии (в виде мономера в комплексе с белками) циркулирует между ядром и цитоплазмой, причем полный цикл занимает в среднем 2-4 часа [215]. При цитоплазматическом стрессе, вызываемом при физиологической температуре такими агентами как ингибиторы протеасом, аналоги аминокислот, простагландин А1, вещества, вызывающие окислительное повреждение белков, - происходит дестабилизация репрессированного состояния HSF1 и его переход в дерепрессированную форму (мономер, но без белкового комплекса). В таком состоянии HSF1, попав в ядро, теряет способность к рециркуляции в цитоплазму. При цитоплазматическом стрессе наблюдается медленная активация HSF1, которая может занимать несколько часов (2-6), в отличие от теплового шока, при котором происходит быстрая активация и накопление HSF1 в ядре [215]. 26 Итак, в неактивном состоянии HSF1 циркулирует между ядром и цитоплазмой в виде мономера в комплексе с белками HSP90, p23 и иммунофилином Fkbp52, который связан с α-тубулином, являющимся компонентом цитоскелета. На начальных этапах формирования этого комплекса HSF1 связывается с белками HSP70 и HSP40. Затем, с помощью белка Нор, взаимодействующего как с HSP70, так и с HSP90, происходит замена HSP70 на HSP90. HSP40 уходит, а к комплексу добавляются белки р23 и Fkbp52. Все эти три белка (HSP90, p23, Fkbp52) также могут связываться и с тримерной формой HSF1, с которой также могут взаимодействовать и HSP70, и HSBP1, связывающийся как с HSP70, так и с HSF1. Таким образом, они участвуют еще и в диссоциации тримеров. В стрессовых условиях происходит накопление денатурированных полипептидов, с которыми связывается шапероны, вследствие чего гетерокомплекс денатурирует и HSF1 переходит в дерепрессированное состояние [17, 170, 212]. В процессе тримеризации HSF1 под действием теплового шока играют роль три области, содержащие мотив лейциновой молнии и расположенные сразу за ДНКсвязывающим доменом на N-конце молекулы. Только белки HSF1 человека и дрозофилы содержат еще один гидрофобный гептадный повтор на С-конце молекулы (четвертая «лейциновая молния» - ГП-C), который подавляет тримеризацию HSF1. Результатом удаления данной области HSF1 у человека является постоянная ДНК-связывающая активность фактора даже в отсутствии стресса. Таким образом, ГП-C стабилизирует мономерное состояние HSF1 за счет внутримолекулярных взаимодействий с аминоконцевыми «лейциновыми молниями», маскируя их и, тем самым, подавляя процесс образования тримеров. Тепловой шок разрушает это взаимодействие и HSF1 тримеризуется [170, 173]. В регулировании процесса олигомеризации HSF1 важную роль играет линкерный участок, расположенный между концом β-цепи 4 ДНК-связывающего мотива и первым олигомеризационным мотивом (остатки 102-136 для HSF1 человека). Аминоконцевая часть линкерной области (аминокислотные остатки лейцин-112 и изолейцин-115 у HSF1 человека) участвует в стабилизации мономерного состояния за счет внутримолекулярных взаимодействий с ДНК-связывающим доменом [138]. Важную роль в процессах тримеризации HSF1 и его последующего связывания с ДНК играют аминокислотные остатки цистеина (Ц). У человеческого и мышиного HSF1 имеется пять таких остатков: Ц36, Ц103, Ц153, Ц373, Ц378, или Ц1-Ц5, соответственно, у человека. Два типа S-S связей регулируют процессы тримеризации и связывания с ДНК: SS1 и SS2. Для формирования тримера человеческого HSF1 необходимо образование ковалентной связи между Ц1 остатком одной цепи и Ц2 остатком другой (SS1 связь). 27 Таким образом, три SS1 связи формируются в тримере HSF1, что увеличивает его стабильность под воздействием различных стрессов [140]. Подобные результаты были получены также на мышах [4], у которых в образовании дисульфидной связи участвовали остатки Ц35 и Ц105. Вторая дисульфидная связь (SS2) формируется между остатками Ц3 и Ц4/Ц5 и играет противоположную роль в активации HSF1. Восстановление этой связи с помощью DTT способствует тримеризации и связыванию HSF1 с ДНК, или, другими словами, SS2 ингибирует стресс-индуцируемую активацию HSF1. В нейтральных условиях некоторое количество мономеров HSF1 человека могут содержать связь SS2, регуляция формирования/разрушения которой может осуществляться за счет небольших изменений в окислительно-восстановительном балансе. Предполагается, что, с одной стороны, некоторые регуляторы активации HSF1, взаимодействуя с ним, могут репрессировать его активацию за счет стимулирования образования SS2 связи, тогда как стресс, разрушая белковые взаимодействия между регуляторами HSF1 и HSF1, приводит к разрыву SS2 связи. С другой стороны, внеклеточный стресс может вызывать изменения в окислительно-восстановительном балансе клетки, что также может привести к разрушению SS2 связи [140]. Помимо цистеиновых остатков важную роль в процессе тримеризации HSF1 играет олигомеризационный домен. Образование олигомеров HSF1, связанных нековалентными внутримолекулярными молния») взаимодействиями, является гидрофобными необходимым условием, («лейциновая предваряющим образование SS1 ковалентной связи [140]. Позднее были определены два ароматических аминокислотных остатка, участвующих в формировании этих гидрофобных взаимодействий [141]. Ими оказались триптофан37 (Трп37) и фенилаланин104 (Фен104). На расстоянии менее 7Ǻ происходит взаимодействие между ними [29], которое способствует формированию S-S связи. В то же время межмолекулярные взаимодействия между α-спиралью 1 и тирозином60 (Тир60), стабилизируя структуру HSF1, способствуют взаимодействию этих ароматических аминокислот (Трп37 и Фен104). α-Спираль 1 является консервативным участком в ДНК-связывающем домене и содержит два гидрофобных (Лей19 и Лей22) и два ароматических (Трп23 и Фен18) аминокислотных остатка [141]. Лей19 и Лей22 взаимодействуют с гидрофобным ядром ДСД HSF1. Тир60 взаимодействует с четырьмя аминокислотными остатками (Ала17, Фен18, Лиз21 и Лей25) в α-спирали 1. Мутационная инактивация Фен18 на 50% снижает активность HSF1 по сравнению с диким типом, тогда как, мутанты по всем четырем остаткам (Ала17, Фен18, Лиз21 и Лей25) полностью теряют активность [140, 141]. Кроме того, Трп23 находится в пространстве вблизи остатка Фен104, что предполагает наличие взаимодействия между 28 ними. Таким образом, получается, что Фен104 располагается в центре двух взаимодействий: с одной стороны с Трп23, с другой с Трп37 [141]. Ранее выдвигалось предположение [4], что процесс олигомеризации предшествует накоплению HSF1 в ядре, так как сигнал ядерной локализации (СЯЛ) становится доступным только после формирования тримеров. Однако результаты недавней работы опровергли это предположение [215]. Авторы показали ядерную локализацию белка HSF1 с делецией аминокислотных остатков со 160 по 172, вследствие которой блокируется процесс тримеризации. Также с помощью мутационного анализа они обнаружили, что СЯЛ состоит из двух модулей, разделенных 15 аминокислотными остатками: более короткого C-концевого модуля (был идентифицирован только лизин224) и N-концевого модуля - аминокислотные остатки с 206 по 208 (лизин-аргинин-лизин). Остатки 206-208 играют доминантную роль, так как при мутационной инактивации остатка 224 процесс импорта HSF1 в ядро сохраняется. Важным также является тот факт, что СЯЛ HSF1 всегда «открыт» (а не замаскирован, как соответствующий СЯЛ у HSF2), поэтому он функционально активен как для мономеров, так и для олигомеров. Кроме того, при мутационной замене остатков 206-208 на аланины HSF1 сохраняет способность к олигомеризации при тепловом шоке, в отличие от HSF3, которому для формирования тримеров in vivo требуется функциональный СЯЛ. СЯЛ белка HSF1 узнается гетеродимером импортинов-α/β in vitro [215]. Далее тример HSF1 приобретает ДНК-связывающую активность. ДСД HSF1 узнает специфичную нуклеотидную последовательность, расположенную в промоторе активируемых HSF1 генов – HSE (Heat Shock Elements). HSE бывают нескольких типов: непрерывный тип состоит как минимум из трех прилегающих друг к другу инвертированных повторов последовательности nGAAn («совершенный» тип, nTTCnnGAAnnTTCn); дискретный тип, когда третий повтор отделен от предыдущих двух пятью нуклеотидами («разорванный» тип, nTTCnnGAAn(5bp)nGAA) или, когда все три повтора nTTCn разделены пятью нуклеотидами («шаговый» тип, nTTCn(5bp)nTTCn(5bp)nTTCn) [238]. Как у дрожжей, так и у млекопитающих, выявлены гены, регулируемые HSF1, но не имеющие ни одного из вышеперечисленных типов HSE [209]. Предполагается, что линкерный участок молекулы HSF1 позволяет ей узнавать подругому ориентированные повторы последовательности nGAAn с разной длиной промежутков между ними [209, 238]. Показано, что различные транскрипционные факторы HSF человека могут связываться с разными типами HSE [238]. Три HSF человека – HSF1, HSF2 и HSF4 – узнают «совершенный» тип HSE. Кроме того, HSF4 имеет также 29 высокое сродство к дискретному типу HSE, однако для этого обязателен процесс его тримеризации, который не столь важен для связывания с непрерывным типом. После первого этапа активации, когда HSF1 сформировал тримеры, транслоцировался в ядро и приобрел способность связываться с HSE, он должен стать транскрипционно активным. HSF1 на С-конце содержит 2 активационных домена – АД1, АД2, которые находятся под контролем центрально расположенного регуляторного домена – РД. Важную роль в этом процессе играет гиперфосфорилирование HSF1. В клетках, подверженных только тепловому шоку, обнаружено 12 сериновых остатков, по которым происходит фосфорилирование: Сер121, Сер292, Сер314, Сер319, Сер326, Сер344, Сер419, Сер444, Сер230, Сер303, Сер307 и Сер363 (PMID: 15760475). Сер303 и Сер307 участвуют в процессе восстановления после теплового шока. В неактивном состоянии HSF1 фосфорилирован по сериновым остаткам 303, 307 и 363. Главной мишенью для фосфорилирования HSF1 при его активации тепловым шоком является Сер326. Замена этого остатка уменьшает синтез HSP90 в несколько раз. Фосфорилирование Сер326 существенно увеличивает транскрипционную, а не ДНКсвязывающую активность HSF1, возможно, за счет индуцирования некоторых локальных конформационных изменений, вследствие которых происходит связывание неким регуляторным белком регуляторного домена, участвующего в репрессии транскрипционной активности HSF1. Для фосфорилирования других сериновых остатков при активации HSF1 требуется предварительное фосфорилирование Сер326. Некоторые сериновые остатки фосфорилируются под действием теплового шока, но их влияние на активность HSF1 не обнаружено. Это может объясняться тем, что эффект фосфорилирования этих остатков проявляется под действием каких-либо других условий, не созданных в эксперименте; либо дело в том, что их фосфорилирование влияет на активность HSF1, не связанную с транскрипцией генов HSP [97]. Под действием теплового шока HSF1 может образовывать дискретные ядерные структуры, известные как ядерные стрессовые тела. Помимо теплового шока действие других стресс-индуцирующих агентов, таких как, тяжелые металлы, аналоги аминокислот, ингибиторы протеасом, также приводит к формированию HSF1-содержащих ядерных структур. Формирование стрессовых тел на данный момент обнаружили только у человека и обезьян [116]. Размер HSF1 стрессовых тел варьирует от 0,3 до 3 мкм; они могут выглядеть либо в виде одиночной глобулярной структуры, либо образовывать кластер глобулярных гранул [118]. Стрессовые тела можно обнаружить в течение 30 сек после теплового шока, и они постепенно исчезают по мере восстановления после него [53, 118]. Интересен тот факт, что локализация стрессовых тел не совпадает с 30 транскрипционными сайтами генов HSP [117]. В 2002 году показали, что стрессовые тела формируются на гетерохроматиновом участке 9 хромосомы (локус q11-q12), причем HSF1 непосредственно связывается с ДНК повторами третьего сателлита [115]. В то же время в другой работе обнаружили скопление HSF1-содержащих тел на центромерных участках 12 и 15 хромосом [65]. Помимо HSF1 в стрессовых телах был также обнаружен и другой транскрипционный фактор из семейства HSFs – HSF2 (PMID: 12865437). Кроме того, под действием теплового шока в стрессовые тела транслоцируется гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин (гяРНП) А1-ассоциированный белок (ГАБ) [224], который представляет собой многофункциональный белок, участвующий в метаболизме РНК и транскрипции [64]. В стрессовых телах обнаружены также и другие факторы, участвующие в процессинге РНК: гяРНП М, SAM68 (митоз-специфический субстрат, активируемый Src-киназой), факторы сплайсинга серин-аргининового семейства белков (СА) [64, 118]. Интерес к работе Jolly и его коллег обусловлен тем, что они показали наличие транскрипционной активности в гетерохроматиновом участке хромосомы. Стресс-индуцируемая транскрипция повторов третьего сателлита в пределах локуса 9q11q12 является HSF1-зависимой. Кроме того, HSF1 способствует ацетилированию гистонов (Н2А, Н2В, Н3 и Н4) и накоплению РНК-полимеразы II в стрессовых телах. Функции транскриптов, ассоциированных с ядерными телами, пока точно неизвестны, однако, применение ингибиторов РНК-полимеразы II и РНКазы А препятствует накоплению ГАБ в стрессовых гранулах [224], что может указывать на возможную роль транскриптов в транслокации ГАБ, и, возможно, других факторов, участвующих в процессинге РНК, в стрессовые тела. Более того, транскрипты третьего сателлита могут влиять на активность других генов, ассоциированных с той же хромосомой [18]. На данный момент пока неизвестно, как активированный HSF1 распределен между сайтами транскрипции генов HSP и ядерными стрессовыми телами. При восстановлении после теплового шока HSF1 становится транскрипционно неактивным, происходит диссоциация тримеров и связывание HSF1 с шаперонами и кошаперонами. Позитивные и негативные регуляторы HSF1 В регуляции процесса активации HSF1, и соответственно экспрессии контролируемых им генов, принимают участие различные типы пост-трансляционных модификаций (ПТМ) фактора. Сайты для ПТМ расположены между 1 и 444 аминокислотными ацетилирование, остатками. может HSF1 фосфорилирование по подвергаться множеству следующим сериновых и ПТМ: треониновых 31 аминокислотным остаткам, а также сумоилирование. За последнее время открыто большое количество сайтов ПТМ, однако, функции многих их них, а также белки, участвующие в осуществлении ПТМ HSF1, остаются неизвестными [237]. Ниже рассмотрены регуляторы активности HSF1, известные на настоящий момент (табл. 1). Таблица 1. Название белка Мишень Позитивные регуляторы RalBP1 PKA PLK1 Ser320 Ser419 Ser216 CK2 САМКII JNK2 Thr142 Ser230 eEF1A + HSR1 SIRT1 Lys80 HDAC6 + p97/VCP Негативные регуляторы МК2 Ser121 ERK1 Ser307 GSK3 Ser303 14-3-3 Ubc9 Lys298 HSP27 JNK1 Ser363 Эффект Ссылки Высвобождения HSF1 из комплекса с шаперонами Транслокация в ядро Транслокация в ядро Связывание HSF1 с полюсами веретена деления Трансактивация Трансактивация Предположительно: увеличение транскрипционной активности Предположительно: стабилизация тримеров Продление времени связывания HSF1 с промотором Высвобождения HSF1 из комплекса с шаперонами (в условиях ингибирования функции протеасом и накоплении убиквитиновых белков) [110, 228] Усиливает взаимодействие между HSF1 и HSP90 (в отсутствие теплового шока) Снижение транскрипционной активности Снижение транскрипционной активности Ядерный экспорт Снижение транскрипционной активности Способствует сумоилированию HSF1 по Lys298; снижение транскрипционной активности Ядерный экспорт [219] [58, 158, 206] [126] [130] [197] [106] [165] [192] [227] [23] [217] [217] [217, 218] [104, 155] [26] [59] 32 HSP70 Ингибирование ДНКсвязывающей активности Ингибирование транслокации нефосфорилированной формы HSF1 в ядро, фосфорилирование HSF1 в ядре [71] [70] Позитивные регуляторы активности HSF1 Один из путей, ведущий к активации HSF1, связан с активацией сигнального пути, регулируемого RalГТФ. Дело в том, что было обнаружено взаимодействие между HSF1 и эффектором белка Ral – RalBP1 как in vitro, так и in vivo. Под действием теплового шока происходит переход неактивной формы RalГДФ в активную форму RalГТФ. Вследствие того, что RalГТФ имеет высокое сродство к RalBP1, происходит диссоциация комплекса RalBP1-HSF1-HSP90-α-тубулин и высвобождение HSF1. Кроме того, в данный гетерокомплекс могут входить некоторые протеинкиназы, которые также могут активироваться в ответ на активацию Ral. Они, в свою очередь, могут фосфорилировать и активировать HSF1. Так как активация Ral может быть кальций-зависимой, то на роль данных протеинкиназ претендуют кальций-зависимые протеинкиназы, такие как протеинкиназа С, протеинкиназа G, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа [110, 228]. Одними из регуляторов активности HSF1 являются киназы, осуществляющие фосфорилирование фактора по различным аминокислотным остаткам, что приводит либо к активации HSF1, либо к его дезактивации в зависимости от фосфорилируемого остатка. Одной из таких киназ является 3’-5’-циклический аденозинмонофосфат зависимая протеинкиназа А (PKA), которая связывается с транскрипционным фактором HSF1 in vivo и in vitro и фосфорилирует его по серину-320, что способствует накоплению HSF1 в ядре [158]. PKA, участвующая в регуляции клеточного метаболизма и транскрипции генов, состоит из двух субъединиц: регуляторной (PKAr) и каталитической (PKAc). HSF1 связывается с PKAcα (α форма), но не с регуляторным доменом. При этом происходит фосфорилирование фактора киназой по Сер-320, который находится в центре регуляторного домена HSF1, что приводит к накоплению фактора в ядре и в ядерных стрессовых телах, его связывание с промотором гена HSP70.1 и последующей активации транскрипции. Результатом снижения уровня PKAcα является транслокация HSF1 из ядра и уменьшение уровня транскрипции HSP70.1. Предполагается, что протеинкиназа А, фосфорилируя HSF1 по Сер-320, меняет направление ядерного экспорта [158], однако точных данных пока нет. Необходимо отметить, что в отсутствие стресса в некоторых 33 клетках (HeLa, MCF-7) небольшое количество HSF1 связано с PKAcα и фосфорилировано по Сер-320, что согласуется с тем фактом, что HSF1 во многих злокачественных клетках человека обладает базовой транскрипционной активностью, необходимой для выживания этих клеток [58, 206]. Еще одной киназой, регулирующей активацию HSF1, является PLK1, которая фосфорилирует HSF1 по серину-419, что также способствует его накоплению в ядре [126]. PLK1 является важным регулятором прогрессии клеточного цикла. Кроме того, PLK1, наряду с другим членом семейства, PLK3 способствуют развитию и прогрессии многих типов опухолей [194, 204]. Подобно PKAcα PLK1 слабо взаимодействует с HSF1 при нормальных условиях, однако действие теплового шока в значительной степени усиливает это взаимодействие. Кроме того, в комплексе PLK1-HSF1 был также идентифицирован еще один известный партнер HSF1 – HSP90 [126]. Как сказано выше, под действием теплового шока PLK1 фосфорилирует HSF1 по Сер-419, однако совершенно другая ситуация наблюдается в процессе митоза [130]. PLK1, являющаяся одной из основных киназ, регулирующих процесс митоза, может временно связываться с различными митотическими структурами: полюсами веретена деления, кинетохорами, центральным веретеном. В прометафазе PLK1 напрямую фосфорилирует HSF1 по серину-216, что приводит к ассоциации фосфо-HSF1 с полюсами веретена деления, что необходимо для правильного расположения хромосом в метафазе. Для выхода клетки из митоза требуется разрушение фосфо-HSF1. Ингибирование процесса деструкции фосфо-HSF1 приводит к продлению стадии митоза. Разрушение фосфо-HSF1 происходит за счет его связывания с убиквитинлигазой SCFβ-TrCP (β-TrCP). В результате нокдауна β-TrCP или трансфекции β-TrCP, не обладающей функцией убиквитинирования, происходит ингибирование деградации фосфо-HSF1, стабилизация циклина В1 и продление митоза. Сразу после фосфорилирования HSF1 по Сер-216 PLK1 происходит связывание фосфо-HSF1 с Cdc20, и это взаимодействие приводит к ингибированию активности АРС [130]. Гиперэкспрессия Cdc20 ингибирует β-TrCP-зависимую деградацию фосфо-HSF1. После разрушения фосфо-HSF1 происходит взаимодействие Cdc20 с АРС и переход клетки из метафазы в анафазу. Кроме того, HSF1 способствует связыванию Cdc20 с Mad2, что необходимо для прохождения чекпоинта [130]. Протеинкиназа CK2 регулятором активности (казеин киназа 2) также является положительным HSF1. Под действием теплового шока CK2 может активироваться и транслоцироваться в ядро. Ее активность возрастает в несколько раз, одновременно усиливается транскрипция генов теплового шока. При совместной инкубации CK2 и HSF1 уровень фосфорилирования последнего увеличивается. CK2 34 фосфорилирует HSF1 по треонину-142, расположенному в первом мотиве «лейциновая молния», который участвует в процессах тримеризации и связывания HSF1 с HSE. Фосфорилирование киназой CK2 HSF1 по Тре-142 играет важную роль в трансактивации последнего. Считается, что фосфорилирование Тре-142 является необходимым, но недостаточным условием для полной трансактивации промотора HSP70В [197]. САМКII (кальций/кальмодулин зависимая киназа II) также участвует положительной регуляции трансактивации HSF1. Результатом активации в CAMKII является фосфорилирование определенных белков, участвующих во многих важнейших физиологических и патологических процессах, таких как, захват Ca2+, сокращение мускулатуры [106, 168]. CAMKII фосфорилирует HSF1 по серину-230, который находится в консенсусной последовательности, узнаваемой данной протеинкиназой. Сер-230 расположен в регуляторной области транскрипционного фактора HSF1. Фосфорилирование Сер-230 необходимо для транскрипционной активации HSF1 и не влияет на его связывание с ДНК. Наличие фосфосерина-230 обнаружено в комплексе HSF1 с ДНК, а также в ядерных стрессовых телах. Сер-230 фосфорилируется и в нормальных условиях, но количество фосфосерина существенно увеличивается под действием теплового шока. Результатом гиперэкспрессии активной формы САМКII является увеличение уровня эндогенного фосфосерина-230 и трансактивация HSF1. Ингибирование САМКII приводит к снижению транскрипционной активности HSF1 [106]. В работе, проведенной на кардиомиоцитах крысы, показали, что δВ изоформа САМКII локализуется в ядре, и именно она осуществляет индуцированное стрессом фосфорилирование HSF1 по Сер-230, увеличение его транскрипционной активности и повышение уровня экспрессии iHSP70 (также известен, как HSP72) [168]. Недавно было обнаружено, что убиквитарный высококонсервативный белок eEF1A (фактор элонгации трансляции) является ко-активатором транскрипционного фактора HSF1 [192]. Небольшое количество комплекса HSF1-eEF1A присутствует в клетках в нормальных условиях. Действие теплового шока приводит к значительному увеличению количества этого комплекса с достижением максимума на 30 минуте воздействия и возвращением к исходному уровню через час после его снятия. Однако действие одного фактора eEF1A не приводит к активации HSF1. Третьим компонентом комплекса HSF1-eEF1A, необходимым для активации HSF1, является не кодирующая РНК – HSR1 (РНК-1 теплового шока). С помощью антисмысловых ДНК олигонуклеотидов было идентифицировано 2 домена в HSR1, участвующих в активации HSF1: 84 нуклеотида на 5’-конце и нуклеотиды со 157 по 240. Предполагается, что комплекс eEF1A-HSR1 связывается с высвободившимся из комплекса с шаперонами HSF1, что 35 способствует тримеризации и/или стабилизирует тримеры. Образование комплекса eEF1A-HSR1-HSF1 предполагает наличие свободного фактора eEF1A, что сопровождается подавлением трансляции [164] и разрушением цитоскелета [225]. Активация HSF1 с помощью eEF1A и HSR1 наблюдается как in vitro, так и in vivo [192]. Еще одним регулятором активности HSF1 является деацетилаза SIRT1, которая деацетилируя HSF1 по лизиновому аминокислотному остатку, продлевает время связывания HSF1 с промоторами генов теплового шока [227]. SIRT1 относится к третьему семейству гистоновых деацетилаз и является никотинамидадениндинуклеотид (NAD+) зависимой. Активность SIRT1 можно ингибировать с помощью никотинамида. Результатом действия никотинамида является уменьшение количества мРНК основных генов теплового шока (HSP70, HSP90, HSP40 и HSP27). Эксперименты, проводимые с использованием siРНК к SIRT1, показали, что количество HSF1, связанного с промотором гена HSP70, уменьшалось в 4 раза по сравнению с контролем. Кроме того, SIRT1 также связывается с промотором гена HSP70 как в нормальных условиях, так и при стрессе. Все это говорит о том, что SIRT1 играет важную роль в процессе активации HSF1 путем регулирования его взаимодействия с ДНК. В клетках с гиперэкспрессией SIRT1 усиливается взаимодействие между HSF1 и ДНК и ингибируется стадия ослабления этого взаимодействия, что приводит к увеличению времени связывания HSF1 с ДНК. Также был идентифицирован аминокислотный остаток, по которому происходит ацетилирование/деацетилирование HSF1, играющий ключевую роль в связывании HSF1 с ДНК - лизин-80, расположенный в ДНК-связывающем домене. Мутации по этому остатку приводят к неспособности HSF1 связаться с ДНК, а также образовывать стрессовые тела, однако они не влияют на формирование тримеров и способность HSF1 накапливаться в ядре. Таким образом, предполагается, что ацетилирование HSF1 по Лиз-80 регулирует процесс высвобождения тримеров HSF1 из комплекса с ДНК. Кроме того, было показано, что смертность клеток, подверженных тепловому шоку (45оС), с гиперэкспрессией SIRT1 в три раза меньше, чем в контроле. Также необходимо отметить, что возрастное снижение ДНК-связывающей активности HSF1 (поздние пассажи фибробластов) коррелирует с уменьшением количества деацетилазы SIRT1 [227]. Еще одной деацетилазой, принадлежащей ко второму классу гистоновых деацетилаз, участвующей в активации HSF1, является HDAC6. Однако, в отличие от SIRT1, деацетилазная каталитическая активность HDAC6 не участвует в активации HSF1. В данном случае критическую роль играет ее убиквитин-связывающая активность. HDAC6-опосредованная активация HSF1 имеет место в случае ингибирования функции протеасом и, как следствие, накоплении нефункциональных дефектных белков, формирующих цитотоксичные агрегаты. Как было 36 отмечено выше, в нестрессовых условиях HSF1 находится в комплексе с шапероном HSP90. Недавно в этом комплексе также детектировали присутствие белка p97/VCP (шаперон-подобная ААА АТФаза), который взаимодействует с HSP90 [23]. Эта связь формируется за счет активности HDAC6, так как в ее отсутствии образование комплекса HSP90-p97/VCP не обнаруживается. HDAC6, в свою очередь, взаимодействует с p97/VCP. В результате ингибирования функции протеасом HDAC6 связывается с убиквитиновыми белками, что приводит к диссоциации комплекса HDAC6-p97/VCP [190]. Далее, p97/VCP, используя свою АТФазную активность, вызывает диссоциацию комплекса HSP90-HSF1 и, таким образом, высвобождает HSF1, который затем проходит остальные ступени активации. p97/VCP также необходима для «рециркуляции» HDAC6 – она высвобождает HDAC6 из ее взаимодействий с другими клеточными компонентами, образует с ней комплекс, который далее взаимодействует с HSP90 (в комплексе с HSF1), формируя, так называемый, «базисный комплекс» в нестрессовых клетках. Важно отметить, что четкой роли HDAC6 в активации HSF1 в ответ на тепловой шок не обнаружено. Подчеркнем, HDAC6 (и p97/VCP) участвуют в активации HSF1 при ингибировании функции протеасом и накоплении убиквитиновых белков [6, 23]. Негативные регуляторы активности HSF1 Одним из негативных регуляторов активности HSF1 является провоспалительная протеинкиназа MAPKAP киназа 2, или МК2 (митоген-активированная протеинкиназа активированной протеинкиназы 2). МК2 играет важную физиологическую роль при ответе на воспалительный процесс посредством повышения экспрессии провоспалительных цитокинов [128, 161]. МК2 является одним из потенциальных ингибиторов активности HSF1, так как ее активация приводит к подавлению связывания HSF1 с HSE и трансактивации промоторов генов HSP [219]. Активированная МК2 связывается непосредственно с HSF1 и фосфорилирует его по серину-121, высококонсервативному аминокислотному остатку, расположенному в линкерной области HSF1 между ДНКсвязывающим и первым олигомеризационным доменами. Замена серина-121 на аланин приводит к усилению трансактивации HSF1. Однако результатом замены серина на аспартат является образование молекулы HSF1 с пониженной способностью к активации, что говорит о том, что главную роль в ингибировании активности HSF1 играет отрицательный заряд Сер121. Активация МК2 и, как следствие, образование фосфосерина в молекуле HSF1, приводят к связыванию HSF1 с HSP90 (еще одним известным ингибитором активности HSF1). Замена серина на аланин препятствует МК2 опосредованному взаимодействию между HSF1 и HSP90 и, как следствие, увеличивает 37 связывание фактора с HSE. Однако действие теплового шока приводит к быстрой диссоциации комплекса HSF1-HSP90, даже при гиперэкспрессии МК2. Кроме того, тепловой шок уменьшает степень связывания киназы с HSF1, в результате чего происходит частичное дефосфорилирование Сер121. Однако какую роль играет фосфоСер121 в процессе активации HSF1 при стрессе точно неизвестно [219]. Важную роль в негативной регуляции активности HSF1 играют киназы ERK1 и GSK3 (α и β), являющиеся участниками МАРК-сигнальных путей, а также белок 14-3-3 (ε и ζ). Активированные ERK1 и GSK3 связываются с HSF1 и фосфорилируют его по сериновым остаткам 307 и 303, соответственно, что приводит к снижению транскрипционной активности HSF1 in vitro и in vivo. Эти два сериновых остатка находятся в пролин-богатой области регуляторного домена, являющегося регулятором трансактивационного домена. Причем процессы связывания и фосфорилирования подчиняются некоторой иерархии – первично происходит образование фосфоСер307, что способствует связыванию GSK3 с HSF1 и фосфорилированию Сер303. Мутации по Сер303, Сер307, либо обоим остаткам приводят к формированию молекулы HSF1, обладающей более высокой транскрипционной активностью по сравнению с диким типом. Кроме того, гиперэкспрессия GSK3 может напрямую ингибировать HSF1, что говорит о наличии некоторого количества конститутивно-фосфорилированного по Сер307 HSF1 [45, 46]. Наличие фосфосеринов 303 и 307 играет ключевую роль в связывании HSF1 с еще одним репрессором его транскрипционной активности – 14-3-3 (преимущественно с изоформами ε и ζ). Взаимодействие между HSF1 и 14-3-3 осуществляется только при наличии либо обоих фосфосеринов, либо одного из них, причем степень связывания возрастает в ряду: фосфоСер303 – фосфоСер307 – фосфоСер303/307. Подавление транскрипционной активности HSF1 осуществляется за счет его 14-3-3-опосредованного ядерного экспорта и накопления преимущественно в цитоплазме, а также снижения его ДНК-связывающей активности. Так как при нормальных условиях HSF1, как в цитоплазме, так и в ядре находится преимущественно в мономерной форме, и лишь небольшое его количество обладает ДНК-связывающей и транскрипционной активностями, то считается, что экспорт именно этой активной формы HSF1 и осуществляется за счет взаимодействия с 14-3-3. Кроме того, ядерный экспорт HSF1 является CRM1-зависимым (рецептор ядерного экспорта), так как ингибирование CRM1 приводит к тому, что комплекс 14-3-3-HSF1 перестает экспортироваться в цитоплазму и накапливается в ядре. Вследствие того, что белки семейства 14-3-3 являются димерами и могут взаимодействовать либо со многими сайтами внутри одного белка (например, cRaf1), либо связываться с двумя различными белками, считается, что именно вторым 38 образом 14-3-3 влияет на взаимодействие HSF1 с рецептором и его экспорт в цитоплазму [217]. Тепловой шок активирует ERK1 (увеличивается количество фосфоERK1), результатом чего является гиперфосфорилирование HSF1 (как и при гиперэкспрессии ERK1 в нестрессовых условиях) и взаимодействие между HSF1 и ERK1. Однако в отличие от нестрессовых условий, при которых формирование комплекса HSF1-14-3-3 в отсутствие активированной ERK1 не наблюдалось, тепловой шок приводит к образованию небольшого количества комплекса HSF1-14-3-3 даже в отсутствие фосфосеринов 303/307. Наличие фосфосеринов сильно увеличивает взаимодействие между HSF1 и 14-3-3, что указывает на их важную роль в формировании данного комплекса. В отличие от нормальных условий связывание 14-3-3 с HSF1 в результате теплового шока не приводит ни к подавлению транскрипционной активности HSF1, ни к его накоплению в цитоплазме. Эффект взаимодействия 14-3-3 с HSF1 начинает проявляться только на стадии восстановления после теплового шока. Так через 4 часа после теплового шока в клетках, гиперэкспрессирующих 14-3-3, более 80% HSF1 локализуется в цитоплазме, тогда как в контрольных клетках HSF1 только начинает экспортироваться из ядра (˂ 20%) [218]. Стресс-индуцируемое фосфорилирование HSF1 по Сер303 также является сигналом для сумоилирования фактора по лизиновому аминокислотному остатку 298, расположенному в так называемом зависимом от фосфорилирования мотиве сумоилирования (PDSM), который находится в регуляторном домене HSF1 [104]. Этот мотив был впервые открыт у HSF1, а позднее обнаружен у многих других белков (HSF4, MEF2A, SP3) [105, 178, 186]. Фосфорилированный по Сер303 HSF1 ко-локализован в ядре с небольшими убиквитин-родственными белками – SUMO [26, 104]. Ubc9 (конъюгирующий фермент Е2), взаимодействуя с фосфо-HSF1 способствует его конъюгации с белками SUMO, в результате чего происходит ингибирование транскрипционной активности HSF1 [104, 155]. Однако молекулярные механизмы репрессии трансактивационной способности HSF1 за счет сумоилирования не ясны. Также было обнаружено, что шаперон HSP27, накапливаясь в ядре в виде больших олигомеров, может способствовать сумоилированию HSF1. Предполагается, что HSP27 может выступать в роли фактора E3 (увеличивает эффективность сумоилирования определенного субстрата), вследствие того, что он проявляет некоторую специфичность к HSF1 (например, он не влияет на сумоилирование такого белка, как c-Fos) [26]. Еще одними киназами, участвующими в регуляции активности HSF1, являются 2 изоформы белка JNK – JNK1 и JNK2. Однако действие этих изоформ является противоположным. JNK1 (как и ERK) связывается in vitro с HSF1 в области, называемой D 39 доменом, и расположенной между 203 и 226 аминокислотным остатком. В результате этого взаимодействия происходит фосфорилирование HSF1 по Сер363. В клетках, гиперэкспрессирующих JNK1, наблюдается быстрое исчезновение ядерных стрессовых тел (80% за 4 часа; в контрольных клетках – за 10-12 часов), а также быстрая потеря фактором ДНК-связывающей активности и продукции белка HSP70. Мутации по Сер363 приводят к тому, что даже после 4 часов восстановления после теплового шока, более 90% стрессовых тел обнаруживаются в ядре [59]. В случае с JNK2 также показано ее связывание с HSF1 и последующее фосфорилирование фактора in vivo, однако эффект этого взаимодействия, как говорилось выше, является противоположным. Ингибирование функции JNK2 и последующий сильный стресс (45ºС) приводят к уменьшению количества гиперфосфорилированной формы HSF1 и снижению его транскрипционной активности [165]. Кроме того, в клетках, подверженных действию канцерогена арсенита, репрессия функции JNK2 также приводит к снижению гиперфосфорилированной формы HSF1 [137]. Как известно JNK могут участвовать как в про-апоптотическом, так и в антиапоптотическом сигнальных путях в зависимости от изоформы белка, типа клеток и т. п. [62]. Таким образом, разница в эффектах JNK1 и JNK2 на активность HSF1 может объясняться тем, что, возможно, изоформа JNK1 играет важную роль в осуществлении про-апоптотического сигнала и, таким образом, ингибирует активность HSF1, тогда как JNK2 участвует в анти-апоптотическом пути и увеличивает стабильность фактора [137]. Помимо киназ регулятором активности HSF1 является продукт его активации – белок HSP70. Его повышенная экспрессия ингибирует связывание HSF1 с HSE (PMID: 9059991 [71], транслокацию нефосфорилированной формы HSF1 в ядро и само фосфорилирование HSF1 в ядре [70]. Здесь имеет место отрицательная обратная связь, предотвращающая гиперпродукцию HSP70. HSP70 уменьшает количество фосфорилированного HSF1 за счет изменения баланса между активностями протеинкиназ и протеинфосфатаз. Результатом гиперэкспрессии HSP70 является активации протеинфосфатаз (РР1 и РР2А) и ингибирование активности протеинкиназы С (РКС), что и приводит к снижению фосфорилирования и/или дефосфорилированию HSF1 по остаткам серина и репрессии его активности [70]. Также хотелось бы отметить киназу RSK2 (участница МАРК-сигнального пути) и протеинфосфатазу РР5 (58кДа белок, принадлежащий к РРР семейству сериновых/треониновых протеинфосфатаз). RSK2 претендует на роль негативного регулятора активности HSF1, так как показано, что при 37ºС in vivo она слегка ингибирует активность HSF1; in vitro фосфорилирует HSF1; в условиях теплового шока репрессирует 40 образование комплекса HSF1-HSE. Однако требуются дальнейшие исследования для выяснения роли RSK2 в регуляции активности HSF1 [201, 216]. Исследования, направленные на выявления роли РР5 в регуляции активности HSF1, были проведены на ооцитах Xenopus [52]. В результате обнаружили, что РР5 может взаимодействовать как с неактивной (мономер), так и с активной (тример) формами HSF1; ускорять процесс деактивации тримеров (формирование мономеров) за счет своей фосфатазной активности, вследствие чего происходит снижение индуцируемой тепловым шоком ДНК-связывающей и трансактивационной активностей HSF1. Данные пока не получили подтверждения у человека и/или млекопитающих. Биологические функции HSF1 и его роль в процессах канцерогенеза Как было отмечено выше, основные функции транскрипционного фактора HSF1 сводятся к защите организма от воздействия на него неблагоприятных факторов среды. Он играет первичную роль в так называемом ответе на тепловой шок (ОТШ). ОТШ, имеющий высококонсервативный механизм действия среди всех организмов, начиная с дрожжей и заканчивая человеком, может быть индуцирован сильными протеотоксическими агентами, такими как температура, окислительный стресс, тяжелые металлы, токсины и бактериальные инфекции. Консервативность данного ответа среди эукариот позволяет предположить, что он необходим организмам для выживания в стрессовых условиях [5]. Главной задачей ОТШ является борьба с протеотоксическими стрессами и поддержание белкового гомеостаза, поврежденных белков. что достигается Важнейшей путем обнаружения особенностью стрессовых и нейтрализации клеток является повышенный уровень синтеза в них HSP, представляющих собой молекулярные шапероны, которые осуществляют рефолдинг неправильно свернутых пептидов и подавляют формирование белковых агрегатов. Синтез HSP осуществляется за счет стрессиндуцированной активации и быстрого перемещения HSF1 на промоторы генов HSP, содержащих HSF1-респонсивные элементы (HSE), и последующей индукции их экспрессии. Рассмотрим подробнее, как это происходит на примере гена HSP70 [8]. Быстрая индукция синтеза HSP70 осуществляется за счет освобождения от нуклеосом промотора гена HSP70 и РНК-полимеразы 2 (РНКП2), которая связана с неиндуцированным промотором и находится в состоянии задержки транскрипции [135]. Нуклеосомы являются неким барьером для перехода РНКП2 в стадию элонгации. In vitro на гене HSP70 человека показали, что наличие нуклеосом на промоторе этого гена способствует нахождению РНКП2 в состоянии задержки транскрипции, что указывает на 41 критическую роль процесса ремоделирования структуры хроматина в этом районе в высвобождении РНКП2 из состояния задержки транскрипции [24]. Под действием стресса способствует HSF1 высвобождению РНКП2 за счет прямого взаимодействия фенилаланиновых аминокислотных остатков, расположенных в трансактивационном домене, с белком BRG1, представляющим собой АТФазную субъединицу SWI/SNF хроматин-ремодулирующего комплекса. Таким образом происходит высвобождение РНКП2 и последующий синтез полноразмерных транскриптов [202]. Разрушение нуклеосом вокруг всего гена HSP70 происходит очень быстро, в течение 5 сек после стресса, и коррелирует с накоплением HSF1 на промоторе гена (показано на D. melanogaster) [169]. Подавление активации HSF1 приводит к сохранению наличия нуклеосом на протяжении всего гена HSP70, что указывает на то, что активный HSF1 подает сигнал для ремоделирования хроматина и, как следствие, освобождение гена от нуклеосом [5, 8]. Для формирования полноценного активного транскрипционного комплекса необходимо сайт-специфическое гиперфосфорилирование С-концевого домена РНКП2. У D. melanogaster тепловой шок приводит к накоплению киназы P-TEFb, ответственной за фосфорилирование РНКП2, на промоторе гена HSP70. В отсутствии HSF1 транслокации P-TEFb на промотор не происходит, однако прямого взаимодействия между этими белками не обнаружено. Стоит отметить, что ингибирование активности киназы приводит не только к снижению синтеза HSP, но и к неправильному 3’процессингу транскриптов [136]. К тому же у млекопитающих HSF1 взаимодействует с симплекином – белком, необходимым для взаимодействия факторов полиаденилирования, - что необходимо для эффективного полиаденилирования транскриптов гена HSP70 [236]. Таким образом, HSF1 не только активирует транскрипцию генов HSP, но и участвует в процессинге мРНК. Более того, трансактивационный домен HSF1 может связываться с белком TRAP80, являющимся субъединицей медиаторного комплекса, который необходим для осуществления функциональной связи между РНКП2 и белкамиактиваторами транскрипции, и привлекать его, таким образом, к местам транскрипции генов HSP [166]. HSF1 остается стабильно связан с ДНК на протяжении всего раунда транскрипции [7, 8]. Помимо установленной роли HSF1 в защите организма от воздействия стрессиндуцирующих агентов, в последнее время накапливается все больше данных о его участии во многих физиологических процессах, в частности в процессе развития организма. Эксперименты, проведенные на D. melanogaster, выявили, что делеция гена hsf1 приводит к нарушениям в процессах оогенеза и развития личинки [113]. Причем эти эффекты не связаны с изменением уровня экспрессии генов HSP, на что указывает еще 42 одна работа, в которой обнаружили, что отсутствие фактора HSF1 не влияет на базовый уровень экспрессии генов HSP на стадии эмбриогенеза у мышей [235]. С помощью проведенного на геномном уровне анализа экспрессии генов также обнаружили некоторое количество генов, не классифицируемых как гены HSP или других молекулярных шаперонов, и находящихся под контролем HSF1 [209]. Мыши, у которых отсутствует ген hsf1, способны, тем не менее, дожить до взрослого возраста, однако, у них проявляются дефекты в развитии, включая увеличение числа внутриутробных летальных исходов, бесплодие у самок, нарушения в синтезе цитокинов и задержку роста. При скрещивании hsf1-дефицитных самок с самцами дикого типа оплодотворенные ооциты не развиваются дальше стадии зиготы, что указывает на критическую роль HSF1 на ранних стадиях развития [44]. Недавно в созревающих ооцитах обнаружили обильную экспрессию фактора HSF1, специфично регулирующего транскрипцию гена HSP90α. В ооцитах, лишенных HSF1 и, как следствие, экспрессии HSP90α, происходит остановка в мейотическом созревании, включая задержку в переходе из стадии G2 в М, а также нарушения в асимметричном дисфункциональные делении. митохондрии и Более того, чувствительны к такие ооциты окислительному содержат стрессу, результатом чего является снижение выживаемости [153]. Также необходимо отметить, что в целом фенотип hsf1-дефицитных мышей свидетельствует об участии HSF1 в таких процессах, как формирование плаценты, развитии плакоды и иммунной системы. Все эти данные указывают на участие защитной функции HSF1 в процессах развития и выживания [5, 8]. Транскрипционный фактор HSF1, наряду с HSF2, также является ключевым регулятором процесса развития мозга и поддержания протеостаза в центральной нервной системе (ЦНС). Результатом делеции гена hsf1 является образование больших полостей, что приводит к развитию астроглиоза, нейродегенерации, потери миелина и накоплению убиквитиновых белков в определенных областях постнатального мозга в нестрессовых условиях [107]. Кроме того, в мозге, дефицитном по гену hsf1, наблюдается значительное снижение экспрессии HSP25 (также известен под названием HSBP1) и α-В-кристаллина (CRYAB), протеинов, необходимых для защиты клеток от стресс-индуцируемого разрушения белков и от клеточной смерти [5]. Функционирование HSF1 вместе с другим членом этого семейства, HSF4, необходимо для нормальной работы органов чувств, особенно при действии на них первых стимулов из окружающей среды, то есть сразу после рождения. Мыши, у которых отсутствует hsf1, страдают серьезной атрофией обонятельного эпителия, повышенным содержанием слизи, а также смертью обонятельных чувствительных нейронов в раннем 43 постнатальном периоде [205]. Недавно обнаруженными новыми мишенями для HSF1 и HSF4, играющими критическую роль в функционировании органов чувств, помимо ранее известных HSP25, HSP70, HSP90, являются γ-F-кристаллин (crygf), фактор роста фибробластов 7 (fgf7), фактор ингибирования лейкемии (lif) [5, 205]. Вместе с транскрипционным фактором HSF2, HSF1 также участвует в регуляции процесса сперматогенеза (у мышей). Совместная регуляция осуществляется предположительно за счет формирования гетеротримеров между HSF1 и HSF2 [5]. Центральная роль HSF1 в регуляции экспрессии генов HSP и поддержания белкового гомеостаза на протяжении всей жизни организма также предполагает его участие в «определении» срока жизни. Действительно, на протяжении всего периода существования организм постоянно подвергается действию различных стрессов из окружающей среды и/или физиологического характера, поэтому необходим эффективный контроль над качеством синтезируемых белков для предотвращения накопления поврежденных белков и нарушения протеостаза клетки. Протеотоксические стрессы, связанные с ослаблением качества контроля над белковым гомеостазом, развивающимся с возрастом, приводят постепенно к клеточному старению. Результатом ингибирования функций HSF1 у C. elegans является снижение продолжительности жизни на 30-40%, а также увеличение количества белковых агрегатов. экспрессирующие дополнительные копии гена Более того, hsf1, проявляют нематоды, устойчивость к гипертермии и окислительному стрессу, а срок их жизни увеличивается на 40% по сравнению с их сородичами с диким фенотипом [109]. В работах, посвященных определению молекулярных основ механизма старения, был предложен сигнальный путь (ИП, инсулин/инсулиноподобный) с участием инсулина, рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), а также фосфоинозитид 3-киназы (PI3K), киназы АКТ и транскрипционных факторов из семейства FOXO, в качестве ключевого процесса, влияющего на процесс старения [157]. DAF-2 (рецептор, воспринимающий инсулин и инсулиноподобный белок) взаимодействует с PI3K, что приводит к активации членов семейства АКТ, которые, в свою очередь, фосфорилируя DAF-16 (у C. elegans фактор транскрипции из семейства FOXO), способствуют его накоплению в цитоплазме, тем самым предотвращая активацию экспрессии его генов-мишеней [48]. Результатом нарушения функционирования компонентов данного сигнального пути является значительное снижение продолжительности жизни. Например, у мышей, гетерозиготных по igf1r, на 30% увеличивается срок жизни, а также они становятся более устойчивыми к таким процессам, как потеря нейронов и ослабление памяти, вызываемых экспрессией Аβ пептида, связанного с развитием болезни Альцгеймера [50]. Активность HSF1, 44 ассоциированная с продолжительностью жизни, также находится под контролем ИП сигнального пути. Так, у C. elegans, имеющей мутации в различных компонентах ИПопосредованного сигнального пути, происходит снижение активности HSF1 и, как следствие, накопление белковых агрегатов и уменьшение длительности жизни. Наоборот, результатом подавления ИП сигнального пути является более высокая активность HSF1, способствующая продлению срока жизни за счет эффективного поддерживания протеостаза [157]. Активность HSF1 тесно связана с функционированием фактора DAF16. В отсутствии DAF-16 у C. elegans не наблюдается эффекта продления жизни при гиперэкспрессии HSF1. Изучение профиля экспрессии генов, регулируемых HSF1 и DAF16, выявило, что некоторое количество генов являются мишенями обоих транскрипционных факторов, например, HSP-12 и HSP-16, кодирующих небольшие HSP. Так как экспрессия белков, кодируемых HSP-12 и HSP-16, повышается при снижении активности DAF-2, а генетический нокдаун этих генов приводит к снижению продолжительности жизни, то это дает нам основания предположить, что HSP-12 и HSP16 принимают непосредственное участие в регуляции длительности жизни факторами HSF1 и DAF-16 [109]. Эксперименты, проведенные на нематодах, экспрессирующих Аβ пептид, показали, что действия этих двух факторов (HSF1 и DAF-16), направленное на борьбу с протеотоксическим стрессом, разделены по времени: HSF1 играет доминантную роль при развитии и в раннем возрасте, тогда как DAF-16 ингибирует развитие паралича в более позднем периоде. Кроме того, механизмы действия этих факторов также различны: HSF1 ответственен за разрушение Аβ агрегатов, а функционирование DAF-16 направлено на формирование менее токсичных высокомолекулярных агрегатов. Таким образом, несмотря на очевидное участие обоих факторов в снижении ИП-регулируемой протеотоксичности, механизмы их действия, направленные на поддержания протеостаза, различны. Хочется отметить, что снижение активности HSF1 сильнее сокращает срок жизни, нежели ингибирование отдельных генов-мишеней HSF1, что указывает на комплексное участие фактора в контроле продолжительности жизни [47, 49]. ИП-зависимый сигнальный путь является не единственным путем, способствующим продлению жизни. Продолжительность жизни многих организмов, включая дрожжей, мух и кроликов, увеличивается при ограничении их в потреблении пищи или в калориях. Кроме того, уменьшение калорий способствует замедлению развития возрастных заболеваний, таких как, рак, сердечнососудистые болезни и болезни, связанные с нарушением обмена веществ, а также стимулирует метаболизм и двигательную активность и повышает устойчивость к стрессам [19]. Центральную роль в процессах, опосредованных ограничением в калориях, играют гистоновые деацетилазы – 45 сиртуины. Наиболее известной является SIRT1 (sir2 у дрожжей). Мишенями этого белка являются такие транскрипционные факторы, как HSF1 (как было отмечено выше), р53 и FOXO. SIRT1 считается главным кандидатом на позицию связующего звена между метаболизмом и транскрипционным ответом на изменения в нем. С возрастом ДНКсвязывающая активность HSF1 и количество SIRT1 снижаются. Однако в стареющих клетках, ограниченных в калориях, происходит восстановление активности HSF1. Результаты указывают на совместную роль HSF1 и SIRT1 в защите клеток от стрессов и, тем самым, в обеспечении их выживания и продления срока жизни [5, 8, 25]. Как было отмечено выше, активность HSF1 и, следовательно, ОТШ ослабляется с возрастом, в результате чего происходит накопление неправильно упакованных и/или поврежденных белков, что приводит к риску развитию нейродегенеративных заболеваний, таких как, болезни Хантингтона, Кеннеди, Паркинсона и Альцгеймера, амиотрофический латеральный склероз, спинально-церебеллярная атаксия (СЦА) [228]. Например, вероятность развития болезней Паркинсона и Альцгеймера значительно увеличивается после 70 лет [146]. Болезнь Хантингтона и СЦА относятся к наследственным полиглутаминовым заболеваниям. Их развитие связано с образованием ненормального количества полиглутаминовых повторов в белках, ассоциированных с данными болезнями (белок хантингтин в случае болезни Хантингтона), что приводит к их неправильной упаковке и накоплению в соответствующих нейронах [87]. Возраст, в котором, например, болезнь Хантингтона начинает проявляться зависит от числа этих повторов: в среднем это после 40 лет, однако, если количество повторов слишком большое, то она может проявиться и до 20 лет. Результаты многих работ указывают на то, что повышенная экспрессия HSP, таких как, HSP70, HSP40 и HSP27, подавляют развитие нейродегенеративных заболеваний, в том числе и полиглутаминовых [36, 88, 101, 160]. А так как экспрессия HSP находится под контролем HSF1, то он представляет собой хорошую мишень для терапии данных болезней [160]. Перечисленные выше результаты деятельности транскрипционного фактора HSF1 имеют положительное значение для выживания организма и его борьбы с различными стрессами. Однако несколько другая (негативная) картина наблюдается в случае возникновения раковых заболеваний. К сожалению, эффекты функционирования HSF1 могут распространяться также и на неопластические клетки, способствуя их выживанию. Изучение роли транскрипционного фактора HSF1 в процессе канцерогенеза началось сравнительно недавно. Большинство ученых сходятся на том, что HSF1, не являясь ни классическим онкогеном, ни опухолевым супрессором, в общем и целом способствует 46 поддержанию и развитию опухолей. Однако данные о влиянии HSF1 на развитие опухолей неоднозначны. С одной стороны, во многих типах опухолей наблюдается повышенное содержание HSP (HSP27, HSP70, HSP60, HSP40 и HSP90), что коррелирует с конститутивной активностью HSF1 в неопластических клетках. Однако механизмы активации HSF1 и HSP в опухолевых клетках на настоящий момент недостаточно изучены. Одним из возможных механизмов может являться то, что большое количество мутантных онкобелков, гиперэкспрессирующихся в раковых клетках, активируют ОТШ [120]. Другим механизмом, более специфичным, чем перегрузка клетки мутантными белками, является возможная активация промоторов основных HSP онкобелком MYC, а активация HSF1 может осуществляться посредством сигнального пути с участием киназ семейства erbB [123]. Более того, в норме, как известно, экспрессия HSP подавляется функционированием белков р53 и р63 и может активироваться при нарушении функций этих белков, что характерно для многих типов опухолей [31]. Анеуплоидия, событие, часто встречаемое во многих раковых клетках, может приводить к активации HSF1, однако механизмы на данный момент неизвестны. Интересным является тот факт, что микроокружение опухолей играет незначительную роль в процессе активации HSF1. Оно скорей участвует в активации ответа на наличие неправильно упакованных белков за счет функционирования резидентных шаперонов эндоплазматического ретикулума (ЭР). В пользу того, что клеточные факторы в большей степени ответственны за активацию HSF1, чем микроокружение опухоли, также говорит и тот факт, что клетки карциномы простаты, растущие in vivo, имеют более низкий уровень HSP, чем те же клетки, растущие в культуре. Необходимо отметить, что каким бы способом не осуществлялась активация HSF1, она не может полностью объяснить гиперэкспрессию HSP в опухолевых клетках. Даже при генетическом нокдауне HSF1 количество HSP во многих раковых клетках не уменьшается до исходного уровня, характерного для нормальных клеток [220, 231]. На настоящий момент считается, что наличие конститутивно-активного HSF1, а также высокого уровня HSP в раковых клетках, способствует развитию опухолей путем ингибирования процесса программируемой клеточной смерти вследствие предотвращения образования неправильно упакованных белков, а также специфичной положительной регуляции экспрессии и функционирования некоторого числа антиапоптотических белков, таких как, Bag3, Bcl-XL, Mcl-1, и Bcl-2 [112]. Кроме того, некоторые данные указывают, что увеличение активности HSF1 может стимулировать онкогенез и через HSPнезависимые механизмы, включая нарушения в регуляции митоза и нестабильность 47 генома [125, 220], изменения регуляции клеточной пролиферации, метаболизма глюкозы и выживаемости [58, 196]. Активный HSF1 приводит к развитию анеуплоидии в некоторых опухолевых клеточных линиях (карцинома простаты, остеосаркома, немелкоклеточный рак легкого), дефицитных по гену р53. Как было отмечено выше, для правильного прохождения митоза большое значение имеют степень связывания HSF1 с Cdc20, опосредованная фосфорилированием HSF1 киназой PLK1, а также разрушение фосфо-HSF1 белком βTrCP [131]. При наличии стабильного фосфо-HSF1 удлиняется время связывания HSF1 с Cdc20, что, в свою очередь, приводит к ингибированию взаимодействия Cdc20 с АРС, необходимого для нормального прохождения клетки из стадии метафазы в стадию анафазы, и развитию анеуплоидии. Более того, взаимодействие HSF1 с Cdc20 ингибирует формирование связи между Cdc20 и Mad2, что приводит к нарушениям в прохождении чекпоинтов, митотическому аресту и анеуплоидии в р53-дефицитных клетках. Однако в присутствии нормального р53, PLK1 «предпочитает» фосфорилировать его, нежели HSF1, результатом чего является более прочное связывание Cdc20 с Mad2 и, как следствие, надлежащая регуляция митоза, в том числе прохождение чекпоинтов [125, 221]. Поддержанию трансформированного фенотипа клеток способствует ингибирование процесса апоптоза и, как следствие, пролиферация неопластических клеток. Как было отмечено выше, HSF1 может осуществлять регуляцию активности некоторых антиапоптотических белков. Так, например, активный HSF1 связывается с промотором гена bag3, увеличивая его транскрипционную активность, тогда как результатом нокдауна hsf1 является подавление активности bag3, индуцируемой ингибитором протеасом MG132 [73]. BAG3 защищает клетку от апоптоза за счет стабилизации антиапоптотических белков, таких как, Bcl-XL, Mcl-1 и Bcl-2 [112]. Секретируемый белок херегулин β1, обладающий высоким онкогенным потенциалом, связывается с рецепторами c-erbB на поверхности клетки, тем самым ингибируя активность GSK3, что приводит к активации HSF1 и, как следствие, повышенной экспрессии HSP. Активируемый таким образом HSF1 играет ключевую роль в защите клеток от апоптоза, а также индукции их роста независимо от субстрата [123]. Не последнюю роль в прогрессии опухолей играет клеточная миграция, способствующая процессам инвазии и метастазированию. Результатом делеции гена hsf1 в иммортализованных мышиных фибробластах является снижение подвижности клеток и их миграции в рану в культуре [163]. Влияние HSF1 на эти процессы осуществляется за счет модуляций активности МАРК-сигнальных путей, которые, как известно, участвуют в 48 регуляции клеточной подвижности. Отсутствие экспрессии гена hsf1 приводит как минимум к двум функциональным нарушениям в МАРК путях: снижение экспрессии рецептора EGF 1 (рецептор эпидермального фактора роста 1) и/или подавлении активности онкобелка Ras. Результатом обоих этих нарушений является ослабление процессов активации ERK и JNK, что и приводит к снижению клеточной подвижности. Таким образом, вследствие того, что HSF1 может способствовать росту клеток независимо от субстрата, а также увеличению их подвижности, считается, что он может играть положительную роль в инвазии и метастазировании, процессах, сопутствующих прогрессии опухолей [123, 163]. Как было сказано выше, HSF1 сам по себе не является ни онкогеном, ни супрессором. Ни гиперэкспрессия этого фактора, ни его нокаут не приводят к развитию опухолей. Однако, считается, что функционирование HSF1 в трансформированных клетках способствует поддержанию злокачественного фенотипа за счет участия этого фактора во многих ключевых клеточных процессах, включая пролиферацию, выживаемость, синтез белков и метаболизм глюкозы. Клетки, не экспрессирующие HSF1, проявляют большую устойчивость к Ras- и PDGF-индуцируемой трансформации по сравнению с диким типом in vitro и in vivo. Мыши, несущие мутацию в «горячей точке» в гене р53, живут дольше при отсутствии экспрессии hsf1. Мутация в гене р53 приводит к развитию большого числа спонтанных опухолей, включая саркомы, лимфомы и карциномы. Интересно, что в результате снижения (не подавления) экспрессии hsf1 изменяется спектр образуемых опухолей у мышей, дефицитных по гену р53: возрастает частота появления карцином и снижается сарком [58, 154]. В случае полного подавления экспрессии hsf1 изменения в спектре опухолей определить сложно, вследствие недостаточного их количества [58]. Кроме того, HSF1 способствует эффективной трансляции белков даже в условиях пониженной активности ростовых факторов, что характерно для трансформированного фенотипа. Считается, что влияние HSF1 на синтез белка включает в себя участие mTOR сигнального пути. Последние данные указывают, что злокачественные клетки «предпочитают» использовать гликолиз для катаболизма глюкозы, что является преимуществом для роста опухолей и их выживания [75]. HSF1 положительно влияет на этот ключевой для прогрессии опухолей процесс [58, 231]. Влияние HSF1 на какую-либо одну клеточную функцию имеет небольшое значение для процесса трансформации, однако, сумма таких эффектов дает большой вклад в адаптацию организма к злокачественности и поддержанию развития опухолей [231]. С другой стороны, ряд данных указывает на негативное влияние гиперактивности HSF1 на пролиферацию и/или выживаемость неопластических клеток. Так, например, 49 экспрессия конститутивно-активной формы HSF1 индуцирует Fas-опосредованный апоптоз [234], а также снижает онкогенное влияние активированного белка Ras за счет ингибирования экспрессии гена c-fos (участвует в регуляции клеточной пролиферации и дифференциации) и гена uPA (играет важную роль в опухолевой инвазии и метастазировании) [38]. Кроме того, в качестве ко-репрессора в подавлении Rasиндуцированной экспрессии c-fos вместе с HSF1 участвует HSP70 [102]. Интересными также представляются данные, обнаруженные недавно с помощью ChIP-Seq анализа [150], что 60% генов, с которыми связывается HSF1 в опухолевых клетках, не регулируются этим фактором в нетрансформированных клетках; остальные 40% регулируются как в неопластических, так и в нормальных клетках в условиях теплового шока. Гены, на экспрессию которых влияет HSF1 преимущественно в раковых клетках, регулируют такие процессы, как: энергетический метаболизм, клеточный цикл, репарация ДНК, апоптоз, клеточную адгезию, формирование внеклеточного матрикса и трансляцию [150]. То есть транскрипционные программы, осуществляемые HSF1, в значительной мере варьируют в зависимости от типа клеток. 50 Глава 2. Материалы и методы Бактериальные штаммы и плазмиды В работе использовали штамм E. coli XL-10 Gold (Stratagene). Бактерии культивировали в жидкой среде LB (1% NaCl, 1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевого экстракта) и на чашках Петри с LB-агаром (LB, с добавлением 1% агара) в присутствии селективного антибиотика - ампициллина (50мкг/мл). Для создания генно-инженерных конструкций использовали следующие вектора: лентивирусный вектор pLenti6-mod1, представляющий собой модифицированный вектор pLenti6; лентивирусный вектор pLSL-puro, содержащий внутри области U3 правого LTR кассету для экспрессии siРНК, состоящую из промотора H1 для РНК-полимеразы III, который контролирует экспрессию транскрипта, образующего шпильку (shРНК); ретровирусный вектор pLXSN-neo; лентивирусный репортерный вектор pLentiA-mCMV-Luc-puro. Методы молекулярного клонирования Выделение плазмидной ДНК Плазмидную ДНК из E. coli выделяли стандартным методом щелочного лизиса. Бактерии собирали центрифугированием (15 мин. при 2500g, 4°С), ресуспендировали в растворе №1 (50мМ глюкоза, 25мМ Tris-HCl pH 8,0, 10мМ EDTA рН 8,0) и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Далее добавляли два объема раствора №2 (0,2н NaOH, 1% SDS), встряхивали несколько раз и инкубировали 5 мин при 0°С. Затем добавляли полтора объема раствора №3 (3М ацетат калия, 11% ледяной уксусной кислоты, рН 4-5), встряхивали и снова инкубировали 5 мин при 0°С. Центрифугированием (15 мин при 2500g, 4°С) удаляли геномную ДНК и связанные с ней компоненты клеточной стенки. Плазмидную ДНК преципитировали в 0,6 объема изопропилового спирта. Полученный центрифугированием осадок ДНК промывали 70% спиртом и растворяли в деионизованной воде. Раствор плазмидной ДНК обрабатывали рибонуклеазой-А (10мкг/мл, 30 мин) и далее проводили стандартную процедуру фенол-хлороформной очистки. Концентрацию плазмидной ДНК, преципитированной 96% этанолом с добавлением ацетата натрия, собранной центрифугированием и растворенной в деионизованной воде, определяли при помощи спектрофотометра из расчета 1OD260 = 50 мкг ДНК. 51 Электрофорез ДНК в агарозном геле Электрофорез ДНК проводили в горизонтальном 1% - 2% агарозном геле (процентное содержание агарозы в геле определялось длиной анализируемой ДНК). Гель содержал 0,5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве электрофорезного буфера использовали 1х трис-ацетатный (ТАЕ) буфер (0,04М трис-ацетат, 0,001М ЭДТА, ледяная уксусная кислота рН 8.0). К образцу ДНК перед нанесением на гель добавляли 6х буфер для нанесения (0,5% SDS, 0,1М ЭДТА, 50% глицерин, бромфеноловый синий и ксиленцианол рН 8,0). Степень электрофоретического разделения ДНК контролировали по пробегу красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. Наличие ДНК в геле определяли по флюоресценции в проходящем УФ свете с длиной волны от 240 до 360 нм при помощи гель-документирующей системы CHEMY-CAPT 3000 (Vilber-Lourmat). Гели после препаративного электрофореза просматривали на источнике дальнего УФ при длине волны 366 нм. Для анализа размера ДНК использовали ДНК маркер GeneRuler (Fermentas). Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей Для элюции ДНК из агарозных гелей использовали 1% легкоплавкую агарозу. Область геля, содержащую нужный фрагмент ДНК, вырезали с помощью скальпеля и плавили в течение 3-5 мин при 70°С до полного расплавления агарозы. ДНК выделяли стандартным способом фенол-хлороформной экстракции с последующей преципитацией ДНК 96% этанолом. Собранную центрифугированием ДНК растворяли в деионизованной воде. Количество ДНК определяли визуально с помощью гель-электрофореза с известным количеством ДНК сходного размера в качестве маркера. Рестрикция фрагментов ДНК Гидролиз ДНК рестрицирующими эндонуклеазами проводили при 37°С в течение 1 часа. Реакционная смесь содержала рестрикционный буфер (1х), необходимое количество ДНК, фермента (10 ед.) и деионизированной воды. Реакцию инактивировали дефосфорилированием с использованием щелочной фосфатазы SAP (Fermentas) при 37°С в течение 45 минут. Продукты реакции анализировали в агарозном геле. Лигирование фрагментов ДНК Лигирование «липких» концов ДНК проводили с использованием T4-ДНК-лигазы в условиях, рекомендуемых производителем (Fermentas). Векторную ДНК и клонируемый фрагмент лигировали в молярном соотношении 1:1-1:2. Реакции проводили при 16°С в 52 течение ночи, фермент инактивировали инкубацией при 65°С в течение 10 мин. Полученную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E. coli. Получение компетентных клеток E. coli Штамм бактерий E. coli XL10-Gold (Stratagene) рассевали штрихом на чашки Петри с LB-агаром без ампициллина в асептических условиях. Инкубацию проводили в течение ночи при 37°С до появления отдельных колоний. Несколько клонов переносили в 50 мл среды SOB (2% бакто-триптона, 1,1% бакто-дрожжевого экстракта, 0,2% NaCl, 1% KCl), содержащей 10мМ MgSO4, культивировали при 20°С на шейкере и интенсивной аэрации до оптической плотности OD600=0,3-0,4, после чего суспензию клеток немедленно помещали в лед на 10 мин. Бактерии осаждали центрифугированием (4000g, 10 мин, 4°С). Образовавшийся осадок ресуспендировали в 50 мл раствора TB (0°С) (10мМ PIPES, 55мМ MnCl2, 250мМ KCl pH 6,7). Далее полученный после центрифугирования осадок ресуспендировали в 5 мл раствора TB (0°С), содержащего 7% DMSO. Суспензию клеток разливали по 50 мкл в охлажденные, стерильные пробирки и замораживали в жидком азоте. Компетентность полученных клеток проверяли контрольной трансформацией. Трансформация компетентных клеток E. coli К 50 мкл компетентных клеток добавляли не более 5 мкл раствора ДНК на льду. Смесь инкубировали в течение 30 мин на льду, затем подвергали “тепловому шоку” (1мин при 42°С) и вновь охлаждали до 0°С. Клетки высевали на чашки Петри с LB-агаром в присутствии селективного антибиотика (ампициллин - 50 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 37°С. Создание конструкций В работе использовали созданные ранее и любезно предоставленные нам J. Downward (Cancer Research UK) следующие конструкции: ретровирусные конструкции на основе вектора pLXSN-neo, содержащие активные мутантные формы гена H-Ras человека с заменами аминокислот в позициях 12 (H-RasV12), 12 и 40 (H-RasV12C40), 12 и 37 (HRasV12G37) и 12 и 35 (H-RasV12S35). Олигонуклеотид длиной 60 п. о., образующий шпильку и содержащий участок в 19 п. о., соответствующий определенной области мРНК гена SESN3 человека (5’GACGAGGAGAAGAGCATTT-3’ и 5’-CCAGAGAGAGATCCAGAAA-3’), подобранный с помощью алгоритма siRNA-scale (doi: 10.1093/nar/gkm088), был заклонирован в вектор pLSL-puro. Вектор pLSL-puro также использовали для клонирования шпилечной 53 структуры, содержащей последовательность в 21 п.о., соответствующую нуклеотидам с 353 по 373 мРНК HSF1 человека (5’-AAGTACTTCAAGCACAACAAC-3’). Конститутивно-активная (делеция аминокислот с 203 по 315) и доминантнонегативная (делеция аминокислот с 455 по 523) формы HSF1 человека, клонированные в плазмиду pcDNA 3.1(+) (Invitrogen), были любезно предоставлены Dr. Richard Voellmy (Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Miami, Miller School of Medicine). Было создано два вектора, содержащих предоставленные последовательности HSF1, путем их клонирования в лентивирусный вектор pLenti6-mod1 по сайтам рестрикции NheI/EcoRI. Для создания вектора, содержащего HSF1-респонсивные элементы (HSE), были синтезированы следующие олигонуклеотиды (Evrogen): смысловая последовательность: 5’- CTAGCAGACCCGAAACTGCTGGAAGATTCCCGAAACTTCTGGT-3’ антисмысловая последовательность: 5’- CTAGACCAGAAGTTTAGGGAATCTTCCAGCAGTTTCGGGTCTG-3’ Образованный в результате отжига и лигирования указанных олигонуклеотидов фрагмент двуцепочечной ДНК, в состав которого была включена четырежды повторяющаяся последовательность HSE, был клонирован в вектор pLentiA-mCMV-Lucpuro по сайту рестрикции эндонуклеазы XbaI. Данный вектор был любезно предоставлен д.б.н. П. Чумаковым (Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта, Москва). Правильная ориентация клонированных фрагментов была подтверждена с помощью рестрикционного анализа и секвенирования ДНК (Evrogen). Эукариотические клеточные линии В работе использовали следующие клеточные линии: иммортализованные кератиноциты человека (HaCaT), клетки рака ободочной кишки человека НСТ116 (p53+/+, ATCС #CCL-247), фибросаркому HT1080 (ATCC #CCL-121), а также нормальные фибробласты человека (ФЧ), полученные из десны. В качестве упаковочных линий использовали эпителиальные клетки 293Т (получены из American Type Tissue Collection, CRL-11268™) и Phoenix™ Ampho. Клетки культивировались в среде DMEM (HyClone) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone) и содержащей 0,1 мг/мл пенициллина и стрептомицина при 37°С и 5% содержанием СО2. 54 Получение клеточных сублиний, стабильно экспрессирующих созданные конструкции. Для получения клеточных культур, стабильно экспрессирующих различные мутантные формы белка H-Ras, использовали упаковочную линию Phoenix™ Ampho. Трансфекцию ретровирусных конструкций в клетки проводили с использованием реагента Lipofectamine (Invitrogen). Последующее заражение реципиентных клеток рекомбинантными вирионами, полученными через 24 - 72 часа после трансфекции, проводили, используя супернатант культур пакующих клеток, в присутствии полибрена (8мкг/мл). Последующую селекцию инфицированных клеточных культур проводили в течение 6-7 дней в среде, содержащей 0,6 мг/мл антибиотика G-418 (Invitrogen). Для получения клеточных культур, стабильно экспрессирующих различные лентивирусные конструкции, использовали упаковочную линию 293Т и хэлперные плазмиды dR 8,2 и pVSV-G. Эквимолярные количества плазмидной ДНК и хэлперных плазмид были трансдуцированы в клетки HEK293T как было описано выше. Селекцию клеточных культур, инфицированных конструкциями на основе векторов pLSL-puro и pLentiA-mCMV-Luc-puro, проводили в среде, содержащей антибиотик пуромицин (1 мкг/мл; P8833, Sigma) в течение 4-5 дней. Селекцию клеток, содержащих конструкции на основе вектора pLenti6-mod1, осуществляли с помощью бластицидина (5 мкг/мл; R210-01, Invitrogen; 4-5 дней). Выделение РНК из эукариотических клеток Тотальную мРНК выделяли с помощью TRI Reagent (T9424, Sigma). Клетки выращивали до состояния субконфлюентного монослоя, затем лизировали реагентом Trizol из расчета 1 мл на 1-1.5 х106 клеток. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, тщательно перемешивали и центрифугировали (15 мин при 12000g, 4°С). В чистые 1,5 мл пробирки переносили прозрачную водную фазу, к которой добавляли 500 мкл изопропанола. Пробирки несколько раз аккуратно переворачивали, оставляли при комнатной температуре на 15 минут, после этого центрифугировали (10 мин при 12000g, 4°С). Осадок промывали 75% этанолом, растворяли в свободной от РНКаз воде. Концентрацию РНК определяли при помощи спектрофотометра из расчета 1OD260 = 40 мкг РНК. Образцы РНК хранили при -70°С. 55 Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) Обратная транскрипция Для проведения реакции обратной транскрипции использовали фермент M-MLV обратную транскриптазу (USB). Реакцию проводили в два этапа: 1. вносили в чистую от РНКаз пробирку 2 мкг РНК и смесь гексамеров (0,1 А260 единиц); грели в водяной бане на 70°С 5 минут, затем помешали на лед на 5 минут. 2. затем вносили следующие компоненты: реакционный буфер (50мМ трисHCl, 50мМ KCl, 4мМ MgCl2, 10мМ DTT pH 8,3), смесь нуклеотидов (10мМ каждый), ингибитор рибонуклеазы (25 ед/мкл), фермент (200 ед/мкл) и воду, не содержащую нуклеаз, инкубировали при 40°С в течение одного часа. Реакцию останавливали нагреванием реакционной смеси (70°С, 10 мин). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) В качестве матрицы для полимеразной цепной реакции использовали плазмидную ДНК или кДНК, полученную в ходе реакции обратной транскрипции. Реакционная смесь включала: 1х амплификационный буфер (10мМ трис-HCl, 50мМ KCl, 0,08% NP40, 1,5мМ MgCl2 pH 8,8), прямой и обратный праймеры (0,1мкМ каждого), смесь нуклеотидов (0,25мМ каждого), 1 единицу Taq-ДНК полимеразы (Fermentas), амплифицируемую ДНК и деионизованную воду. Последовательности праймеров, использованных для проведения ПЦР, приведены в табл.2. Количество циклов, при котором происходила амплификация каждого из фрагментов, различалось в зависимости от клеточной линии и было подобрано экспериментально. Таблица 2. Последовательности праймеров Название гена α-тубулин SESN1 SESN2 SESN3 Последовательность (5’→ 3’) F - GTTGGTCTGGAATTCTGTCAG R - AAGAAGTCCAAGCTGGAGTTC F - TGCATGTTCCAACATTTCGT R - CTGGGGCTTAGTACCTTCCC F - CCCTAGTGAACAGAGCAGC R - GTCTTCCACAAAGCACAGCA F - GTTCACTGTATGTTTGGAATCAGG R - GGGTGATACTTCAGGTCAAATG 56 HSF1-Act, HSF1 HSF1-dN, HSF1 F - TGACGGACGTGCAGCTGATG R - CAGGCTACGCTGAGGCACTT F - GACAAGAATGAGCTCAGTGAC R - AACAACCTGCAGGGTCAGTC Полуколичественная оценка ПЦР была проведена с использованием Chemi-Smart 3000 Imaging System (Vilber Lourmat) и программного обеспечения TotalLab v.2.01. Вестерн-блот анализ. Экстракты клеток лизировали в охлажденном буфере RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate Na, 1% NP-40, 0.1% SDS, 100 mM PMSF, 1 mM pepstatin A и 1 mM E64). Для выделения ядерной и цитоплазматической фракции клетки лизировали в охлажденном гипотоническом буфере (10mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 DTT, 0.05% NP40, 100 mM PMSF, 1 mM pepstatin A и 1 mM E64, pH 7.9). После 15 мин инкубации во льду клетки центрифугировали при 3000 rpm в течение 10 мин для получения супернатанта (цитоплазматическая фракция) и осадка (ядерная фракция). Осадок затем ресуспендировали в охлажденном буфере RIPA. После 30 мин инкубации во льду образцы центрифугировали при 13000 rpm в течение 20 мин. Супернатант использовали в качестве ядерной фракции. Концентрацию белков определяли с помощью protein assay system (BioRad). Брали по 20 мкг белков. Электрофорез проводили в 12% SDS полиакриламидном геле; белки переносили на мембрану PVDF (RPN303F, Amersham GE Healthcare). Использовали антитела, специфичные к гистону H3 (#9715, Cell Signaling), HSF1 (#2923, Abcam), Ras (#OP40, Calbiochem), p53 (DO-1, Santa Cruz), p21Cip1/WAF1 (M7202, DAKO), Erk (#9102, Cell Signaling), фосфо- Erk (#9106, Cell Signaling) (данные антитела были любезно предоставлены к.б.н. М. Макаровой (Институт Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва)), HIF-1 (610959, BD Transduction Laboratories), актину (#4968, Cell Signaling) и β-тубулину (556321, BD PharMingen). После инкубации с первичными антителами мембрану обрабатывали вторичными антителами: антимышиные/кроличьи- HPR (NA931V, Amersham GE Healthcare). Для проявки использовали хемолюминисцентный реагент ECL Plus (RPN2132, Amersham GE Healthcare) согласно протоколу производителя. 57 Анализ люциферазной активности Проводили, используя Steady-Glo Luciferase Assay System (E2510, Promega), согласно протоколу производителя; полученные значения нормализовали по концентрации белка. Определение скорости роста клеточных культур. Клетки рассевали в 6-луночные плашки по 20 тысяч. Каждые два дня клетки трипсинизировали и считали, используя гемацитометр. Эксперимент повторяли три раза. Измерение уровня активных форм кислорода Для измерения уровня АФК в клетках использовали способность к флюоресценции 2’-7’ дихлородигидрофлуоресцин диацетата (DCF-DA) при его окислении. Клетки инкубировали в среде DMEM в присутствии 5мкМ DCF-DA (Sigma) в течение 30 мин, промывали холодным раствором PBS, обрабатывали 0,25% раствором трипсина и переносили в полипропиленовые пробирки. Анализ флюоресценции DCF проводили при помощи проточного цитофлюориметра фирмы Becton Dickinson и программного обеспечения Cell Quest 3.2. Иммунофлуоресцентная микроскопия Клетки рассеивали на стекла (SlideFlask, NUNCLON); на 10-12 день после введения RasV12 проводили фиксацию с помощью метанола/формальдегида, отмывали несколько раз в растворе PBS, инкубировали с первичными антителами к HSF1 (#2923, abcam) в течение 1 часа при комнатной температуре. Детекцию проводили с использованием Alexa488-конъюгированных вторичных антител (Invitrogen) в течение 30 мин при комнатной температуре. Визуализацию проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 и программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Goettingen, Germany). Анализ роста опухолевых ксенографтов. В работе использовались самки бестимусных мышей линии D2×J в возрасте 6-8 недель. Каждому животному подкожно прививалось по 2 опухоли (106 клеток, суспендированных в 100 мкл физиологического раствора). Размер опухолей измерялся каждые 3 дня, их объем высчитывался по формуле: (ширина)²×(длина)×0.5. Продолжительность эксперимента составляла 3 недели для роста ксенографтов НСТ116. Образовавшиеся опухоли эксплантировали и проводили иммуногистохимический анализ. 58 Эксперименты повторяли как минимум 2 раза. Протокол работы с животными был утвержден Комитетом Этики по Экспериментам над Животными; эксперименты проводили в соответствие с правилами проведения экспериментов над животными, принятыми в Институте Канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина. Иммуногистохимический анализ. Ткани опухолей фиксировались в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов и заключались в парафин. Срезы толщиной 5мкм окрашивались моноклональными антителами к CD34 (553731, BD Biosciences Pharmingen) и HIF-1α (Ab8366, Abcam). Связывание первичных антител детектировалось с помощью меченных биотином антикрысиных вторичных антител (559286, BD Biosciences Pharmingen) с последующей обработкой препарата стрептавидином-HRP (K0690, Dako). Связывание первичных антител к HIF-1α детектировали с помощью анти-мышиной Labelled Polymer-HPR (K4006; Dako). Активность пероксидазы выявляли с помощью 3’,3’-диаминобензидина (DAB; K3468, Dako) согласно протоколу производителя. После этого препараты окрашивали гематоксилином. Подсчет количества сосудов в опухоли. Подсчет CD34-позитивных кровеносных сосудов и капилляров проводился под микроскопом при увеличении ×10. Ангиогенез в опухолях оценивался по среднему суммарному количеству сосудов с просветами, относительно крупных (≥100 мкм) сосудов, и недоразвитых сосудов. Статистический анализ. Все данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Для определения статистической значимости различий использовался тест Манна-Уитни. 59 Глава 3. Результаты исследования Влияние активных форм белка Ras на уровень АФК и экспрессию генов сестринов Задачи диссертационной работы включали: а) изучение влияния экспрессии активных белков Ras на содержание АФК и уровень мРНК генов сестринов; б) выяснение вопроса являются ли эти эффекты HSF1-зависимыми; и, в) оценку биологических последствий данных эффектов. Для решения поставленных задач был создан набор сублиний HaCaT и культур ФЧ, экспрессирующих экзогенные активные мутантные белки H-Ras, с заменами аминокислот в кодонах: 12 (RasV12), 12 и 40 (RasV12C40), 12 и 37 (RasV12G37) и 12 и 35 (RasV12S35). Данные мутанты являются доминантно-активными формами белка Ras; двойные мутанты способны активировать лишь определенный сигнальный путь (Табл. 3). Таблица 3. Сублинии HaCaT и ФЧ, экспрессирующие различные мутантные варианты белка Ras. Мутантные формы Ras Культуры клеток HaCaT и ФЧ «Пустой» вектор pLXSN (контроль - К) экспрессия эндогенного белка H-Ras Мутант RasV12 (V12) одновременная экспрессия эндогенного белка и конститутивно-активного белка HRas Двойной мутант RasV12C40 (C40) одновременная экспрессия эндогенного белка и белка H-Ras, активирующего PI3Kсигнальный путь Двойной мутант RasV12G37 (G37) одновременная белка и белка экспрессия H-Ras, эндогенного активирующего RalGDS-сигнальный путь Двойной мутант RasV12S35 (S35) одновременная экспрессия эндогенного белка и белка H-Ras, активирующего Rafсигнальный путь Для создания конструкций использовали ретровирусный вектор pLXSN. Их трансдукция в клеточные линии приводила к экспрессии мутантных вариантов белка Ras (Рис. 5). 60 Рис. 5. Вестерн-блот анализ экспрессии мутантных вариантов белка Ras. Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок -актин использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов. Используя полученные культуры клеток, был проведен анализ влияния экспрессии активного белка Ras на уровень внутриклеточных АФК. Измерения проводили на 11-15 день после инфекции. Было показано, что трансдукция Ras приводит к 1,5-кратному увеличению содержания АФК в HaCaT и к 1,4-1,8-кратному повышению уровня АФК в фибробластах человека. При этом вклад двойных мутантов, то есть разных Rasактивируемых сигнальных путей, был примерно равным (рис. 6А, Б, вверху). Вследствие того, что повышение уровня АФК может быть связано с Ras-регулируемой экспрессией генов сестринов, как ранее было показано на некоторых клеточных линиях [127], мы решили оценить уровень мРНК сестринов в наших клеточных сублиниях. Как видно из рисунка 6А (внизу), экспрессия RasV12 в HaCaT приводит к значительному снижению экспрессии SESN3 на 11-15 день после инфекции, и к небольшому уменьшению уровня мРНК SESN1 на 11 день после инфекции. Наши эксперименты показали, что подавление экспрессии SESN3 и SESN1 в большей степени связано с активацией Ras-Raf сигнального пути (RasV12S35) (рис. 6А, внизу). В случае с ФЧ также было показано Ras-индуцируемое снижение экспрессии SESN3 на 11-15 день после инфекции. Так же, как и в HaCaT, наибольший вклад вносит Ras-Raf сигнальный путь (рис. 6Б, внизу). Однако в фибробластах не было обнаружено влияния экспрессии активного Ras на уровень мРНК SESN1 на момент наших измерений. 61 Рис. 6. Влияние экспрессии активных мутантов белка Ras на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в HaCaT (A) и фибробластах человека (Б).А), Б) Вверху, средние значения суммарной флюоресценции DCF в 5 х 104 клеток в трех экспериментах. Среднее значение ± стандартное отклонение, p < 0.05. Внизу, результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК αтубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. Как было показано ранее на некоторых клеточных линиях [127], Ras-индуцируемое повышение содержания АФК и снижение экспрессии генов сестринов носит временный характер и с некоторого момента возвращается к контрольному уровню. Поэтому мы продолжали проводить измерения изменений уровня АФК и экспрессии генов сестринов в клетках, экспрессирующих активные мутантные варианты Ras, до 24 дня после инфекции. Мы обнаружили, что в случае HaCaT содержание АФК в клетках, экспрессирующих активный Ras, возвращалось к базовому контрольному уровню после 18 дня после инфекции. При этом уровень экспрессии SESN1 оказывался на уровне контроля после 12 дня; а SESN3 - после 16 дня после инфекции (рис. 7А). В случае ФЧ наблюдалась сходная картина (рис. 7Б). На рисунке 3 представлены результаты влияния трансдукции RasV12 и RasV12S35 на уровень АФК и экспрессию гена SESN3, так как, исходя из данных предыдущего эксперимента (рис. 6), их эффект является наиболее значимым. Необходимо 62 отметить, что вплоть до 24 дня после введения активных мутантов белка Ras, их экспрессия сохранялась. Рис. 7. Влияние экспрессии активных мутантов белка Ras (RasV12 и RasV12S35) на уровень АФК и экспрессию гена SESN3 в HaCaT и ФЧ с 11 по 24 дни после инфекции. А) графики средних значений суммарной флюоресценции DCF в 5 х 104 клеток в трех экспериментах в различные дни после инфекции. Б) относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESN1 и SESN2 к интенсивности полос α-тубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.05. Влияние экспрессии Ras на активность транскрипционного фактора HSF1 Мы продемонстрировали эффект гиперэкспрессии онкогенного белка Ras на экспрессию генов сестринов, однако механизмы влияния оставались неизвестны. Используя базу данных TRANSFAC, содержащую информацию о сайтах связывания эукариотических факторов транскрипции в геномах, мы обнаружили, что в промоторах генов сестринов есть HSF1-респонсивные элементы. Исходя из этих данных, мы решили проанализировать, не является ли Ras-индуцируемое снижение экспрессии генов 63 сестринов HSF1-зависимым. Для этого сначала было проведено исследование влияния экспрессии мутантов белка Ras на транскрипционную активность фактора HSF1. Для решения данной задачи была создана репортерная конструкция pLentiA-mCMV-HSE-Lucpuro, содержащая HSF1-респонсивные элементы, активация которых приводит к экспрессии люциферазы. Эта конструкция, а также все мутантные варианты белка Ras и «пустой» вектор (в качестве контроля), были трансдуцированы в культуры клеток HaCaT и ФЧ. Анализ люциферазной активности, проводимый с 11 по 24 дни после инфекции белков Ras, показал, что экспрессия активного Ras приводит к 1,5-2-кратному увеличению транскрипционной активности HSF1 в HaCaT и к 1,5-2,5-кратному снижению активности HSF1 в фибробластах. При этом вклад двойных мутантов Ras, активирующих лишь отдельные эффекторы Ras (Raf или PI3K или RalGDS) оказался примерно одинаковым (рис. 8). Рис. 8. Влияние экспрессии активных мутантов белка Ras на активность люциферазного репортера, содержащего HSF1-респонсивные элементы, в HaCaT и фибробластах. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.005. Так как ранее [200] было показано, что активация HSE может быть HSF1независимой мы решили проверить, связано ли влияние экспрессии белков Ras на активность люциферазного репортера с изменением содержания или внутриклеточной локализации HSF1. Как известно [215], неактивный HSF1 циркулирует в клетке между цитоплазмой и ядром; активация фактора приводит к его транслокации и накоплению в ядре. 64 Проведенный нами Вестерн-блот анализ показал, что экспрессия активированных мутантных форм белка Ras не изменяет тотального содержания белка HSF1, но приводит к изменениям его ядерной фракции: снижению количества ядерного HSF1 в фибробластах и накоплению HSF1 в ядрах клеток HaCaT. При этом воздействие двойных мутантов соответствует таковому при экспрессии люциферазазного репортера (Рис. 9). Рис. 9. Влияние экспрессии активных мутантов белка Ras на количество тотального, ядерного и цитоплазматического белка HSF1 в фибробластах и HaCaT. Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок гистон 3 использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов для ядерной фракции, а белок актин - для цитоплазматической и тотальной. . Для подтверждения результатов Вестерн-блот анализа мы также, используя антитела к HSF1, провели иммунофлюоресцентное окрашивание ядер клеток, экспрессирующих активный мутант RasV12, и контрольных культур клеток HaCaT и ФЧ. Как видно из рисунка 10 результаты иммунофлюоресценции согласуются с результатами Вестерн-блот анализа. 65 Рис. 10. Иммуногистохимическое окрашивание ядер клеток, экспрессирующих RasV12, и контрольных культур клеток HaCaT и ФЧ. Представлены типичные поля зрения для каждой экспериментальной группы. Влияние модификаций активности HSF1 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов Итак, выше мы показали, что экспрессия доминантно-активных мутантов белка Ras влияет на транскрипционную активность HSF1, причем это влияние противоположно в двух исследуемых типах клеток. Следующим шагом для подтверждения гипотезы, что влияние трансдукции активного Ras на уровень внутриклеточных АФК и экспрессию генов сестринов является HSF1-зависимым, было создание конструкций, экспрессирующих модифицированный HSF1, и проведение оценки их воздействия на содержание АФК и экспрессию сестринов. В качестве модифицированных форм HSF1 мы использовали конститутивно-активную форму HSF1 (HSF1-Act (Act); делеция аминокислотных остатков с 203 по 315) и доминантно-негативную форму HSF1 (HSF1-dN (dN); делеция аминокислотных остатков с 454 по 522), функциональность которых была ранее подтверждена [213] (рис. 11). Рис. 11. Модификации транскрипционного фактора HSF1. 66 Для создания таких конструкций использовался лентивирусный вектор pL6mod1 (см. Материалы и Методы). Путем трансдукции полученных плазмид, несущих конститутивно-активную и доминантно-негативную формы HSF1, в HaCaT и ФЧ, были получены клеточные культуры, стабильно экспрессирующие трансгены. Присутствие введенных последовательностей HSF1 в полученных сублиниях через 11-24 дня после инфекции было подтверждено с помощью ОТ-ПЦР (рис. 12А). Мы проверили функционирование данных конструкций путем анализа изменений уровня транскрипционной активности HSF1 при их совместном введении с репортерной конструкцией pLentiA-mCMV-HSE-Luc-puro, содержащей HSF1-респонсивные элементы и показали, что активный HSF1 повышает уровень экспрессии люциферазы, тогда как HSF1-dN понижает (рис. 12Б). Рис. 12. Подтверждение наличия (А) и функциональности (Б) конструкций HSF1Act и HSF1-dN в HaCaT и фибробластах. А) Присутствие мРНК введенных конструкций HSF1-Act и HSF1-dN в HaCaT и ФЧ. Б) Анализ влияния экспрессии HSF1-Act и HSF1-dN в HaCaT и ФЧ на активность люциферазного репортера. Представлены средние значения суммарной люминесценции в пяти экспериментах. Получив вышеперечисленные сублинии, мы оценили влияние экспрессии HSF1-Act и HSF1-dN на уровень АФК и экспрессию генов сестринов. Было обнаружено, что трансдукция HSF1-Act в HaCaT приводит к 1,3-кратному увеличению уровня АФК (рис. 13А) и уменьшению экспрессии SESN3 (рис. 13Б, В), тогда как результатом экспрессии активного HSF1 в фибробластах является 1,5-кратное снижение содержания АФК (рис. 13А) и повышение уровня мРНК SESN3 (рис. 13Б, В). Трансдукция HSF1-dN не оказывает 67 значимого влияния на уровень АФК и экспрессию сестринов ни в HaCaT, ни в фибробластах. Кроме того, отметим, что активный HSF1 влияет только на экспрессию SESN3, тогда как уровни мРНК SESN1 и SESN2 не изменяются (рис. 13А, Б, В). Это говорит о том, что эффект активных форм белка Ras только на экспрессию гена SESN3, по-видимому, является HSF1-зависимым. Рис. 13. Влияние экспрессии HSF1-Act и HSF1-dN на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в фибробластах человека (слева) и HaCaT (справа). А) Средние значения суммарной флюоресценции DCF в 5х104 клеток в трех экспериментах. Б) Результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК α-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. В) Относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESN1 и SESN2 к интенсивности полос α-тубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.05. Так как наши результаты показали, что экспрессия конститутивно-активной формы HSF1 оказывает противоположные эффекты на уровень АФК и содержание мРНК SESN3 в HaCaT и нормальных фибробластах, мы решили оценить влияние модификаций активности HSF1 в других типах клеток. Были выбраны две клеточные линии – HCT116 68 (клетки рака ободочной кишки человека) и HT1080 (фибросаркома). Путем трансдукции HSF1-Act и HSF1-dN в данные клеточные линии и оценки влияния их экспрессии на содержание АФК и уровень мРНК генов сестринов, было показано, что и в НСТ116, и в HT1080 экспрессия активного HSF1 приводит к увеличению содержания АФК (1,7кратному в НСТ116 и 1,2-кратному в HT1080) и снижению уровня мРНК SESN3 (рис. 14А, Б, В). То есть эффект трансдукции HSF1-Act в этих клеточных линиях схож с таковым в HaCaT. Кроме того в случае НСТ116 было также обнаружено, что экспрессия доминантно-негативной формы HSF1 приводит к 1,3-кратному снижению уровня АФК и повышению экспрессии SESN3 (рис. 14А, Б, В, слева). Рис. 14. Влияние экспрессии HSF1-Act и HSF1-dN на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в HCT116 (A) и HT1080 (Б). А) Средние значения суммарной флюоресценции DCF в 5 х 104 клеток в трех экспериментах. Б) Результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК α-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. В) Относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESN1 и SESN2 к интенсивности полос α-тубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.05. 69 Итак, полученные результаты показали, что экспрессия активного белка Ras приводит к повышению содержания АФК и снижению мРНК SESN3 в обоих типах исследуемых клеток (HaCaT и ФЧ); увеличению транскрипционной активности HSF1 в HaCaT и ее уменьшению в фибробластах. Кроме того, трансдукция активного HSF1 повышает уровень АФК и подавляет экспрессию SESN3 в HaCaT и приводит к противоположным эффектам в фибробластах. Согласно предположению об HSF1зависимом Ras-индуцируемом повышении содержания АФК и снижении экспрессии сестринов, подавление активности HSF1 в фибробластах должно было бы приводить к тем же эффектам, что и ее повышение в HaCaT (увеличению уровня АФК и подавлению экспрессии SESN3). Однако трансдукция доминантно-негативной формы HSF1 не приводила к подобным эффектам (рис. 13А, Б, В, справа). Мы предположили, что доминантно-негативный мутант HSF1 в недостаточной степени подавляет активность HSF1, поэтому была создана конструкция, содержащая shРНК к гену HSF1 (shHSF1). Для ее трансдукции в фибробласты использовали вектор pLSL-puro (в качестве контроля использовались клетки с введенным вектором pLSL-puro-shGFP). Экспрессия shHSF1 приводила к понижению активности люциферазного репортера при их совместном введении и уменьшению уровня тотального белка HSF1 (рис. 15А, Б). Эти эффекты сопровождались снижением уровня мРНК SESN3 и 1,5-кратным увеличением содержания АФК (рис. 16). Рис. 15. Влияние трансдукции shHSF1 на активность люциферазного репортера (А) и на количество тотального белка HSF1 (Б) в фибробластах. А) Представлены средние значения суммарной люминесценции в пяти экспериментах. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.05. Б) Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок актин использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов. 70 Рис. 16. Влияние трансдукции shHSF1 и на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в фибробластах. А) Средние значения суммарной флюоресценции DCF в 5 х 104 клеток в трех экспериментах. Б) Результаты ОТПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК α-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. В) Относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESN1 и SESN2 к интенсивности полос αтубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.05. Для дальнейшего подтверждения предположения о HSF1-зависимом характере Ras-индуцируемого снижения экспрессии SESN3 и повышения уровня АФК была проведена совместная трансдукция в клетки HaCaT shHSF1 и RasV12 (RasV12 был выбран вследствие того, что он оказывал наибольшее влияние на экспрессию SESN3 и уровень АФК). В качестве контролей использовались клеточные сублинии, экспрессирующие shHSF1 и «пустой» вектор pLXSN, вектор pLSL-puro-shGFP, а также RasV12. Сублинии, экспрессирующие shHSF1, демонстрировали снижение уровня тотального белка HSF1, а сублинии, экспрессирующие RasV12, - повышенное содержание белка Ras (рис. 17). Рис. 17. Влияние трансдукции shHSF1 и RasV12 на уровень тотального белка HSF1 и Ras в HaCaT. Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок актин использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов. В сублиниях HaCaT наблюдалось небольшое (1,2-кратное) снижение уровня АФК и повышение экспрессии SESN3 при инактивации HSF1 с помощью shРНК. Результаты 71 показали, что в сублиниях, экспрессирующих shHSF1, влияние экспрессии активного Ras на уровень АФК и содержание мРНК SESN3 отсутствует (рис. 18). Рис. 18. Влияние трансдукции shHSF1 и RasV12 на уровень АФК и экспрессию генов сестринов в HaCaT. А) Средние значения флюоресценции DCF в 5 х 10 4 суммарной клеток в трех экспериментах. Б) Результаты ОТ-ПЦР анализа уровня мРНК SESN1, SESN2, SESN3. Представлены типичные данные одного из трех экспериментов. мРНК α-тубулина использовали как контроль количества нанесенных образцов. В) Относительная интенсивность полос SESN3, SESN1 и SESN2 представлена как отношение интенсивности полос SESN3, SESN1 и SESN2 к интенсивности полос αтубулина. Среднее значение ± стандартное отклонение, p < 0.05. Влияние изменений активности HSF1 на размножение клеток in vitro Известно, что изменение уровня внутриклеточных АФК может влиять на многие клеточные процессы, включая скорость пролиферации, метаболизм и апоптоз. Причем эффект зависит от концентрации АФК. Например, если в клетке слегка повысить содержание АФК, то это может привести к стимуляции клеточного роста, однако, если концентрация будет выше, то результатом может являться ингибирование роста, а при очень больших концентрациях – клеточная смерть [63]. Транскрипционный фактор HSF1, в свою очередь, рассматривается в качестве мишени для терапии опухолей, поэтому исследование его связи, в частности, с процессами клеточной пролиферации является актуальным на настоящий момент. Вследствие того, что результатом трансдукции активной формы HSF1 в клетки HaCaT, HCT116, HT1080 является подавление экспрессии SESN3 и, как следствие, повышение уровня АФК, а в случае фибробластов к таким эффектам приводит инактивация HSF1, мы решили оценить влияние экспрессии модифицированных форм HSF1 на скорость роста клеток in vitro. Было показано, что трансдукция HSF1-Act приводит к снижению скорости роста HaCaT и HCT116; к подобному эффекту также приводит инактивация фактора HSF1 в фибробластах (рис. 72 19А). Однако, повышение уровня мРНК SESN3 и, как следствие, снижение содержания АФК за счет экспрессии доминантно-негативной формы HSF1 в клетках НСТ116, shHSF1 в HaCaT и активного мутанта HSF1 в фибробластах не влияет на скорость роста клеточных культур (рис. 19Б). Рис. 19. Влияние различных модификаций функции HSF1 на кинетику размножения и уровни АФК и мРНК SESN3 в культурах клеток HF, HaCaT и НСТ116. A) Влияние введения конструкций HSF1, уменьшающих экспрессию гена SESN3 и повышающих содержание АФК. Б) Влияние введения конструкций HSF1, увеличивающих экспрессию гена SESN3 и понижающих содержание АФК. Каждая точка – средняя величина для 3-х лунок; представлены типичные данные одного из трех экспериментов. Внизу представлены результаты влияния трансдукции модифицированных форм HSF1 и shHSF1 на уровни АФК и мРНК SESN3. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.05. 73 Так как мы предполагаем, что влияние трансдукции активной формы HSF1 (HaCaT, HCT116) и shHSF1 (фибробласты) на рост клеток связано с повышением уровня АФК вследствие ингибирования экспрессии гена SESN3, мы оценили эффект подавления экспрессии этого гена за счет введения shРНК к SESN3 (использовали вектор pLSL-puroshSESN3) на скорость пролиферации данных клеточных культур (HaCaT, HCT116, фибробласты). Как видно из рисунка 20 введение shSESN3 приводит к ожидаемому уменьшению количества мРНК SESN3 и увеличению уровня АФК, а также к снижению скорости роста клеточных культур. В качестве контроля мы использовали клетки, трансдуцированные вектором pLSL-puro-shGFP. Рис. 20. Влияние подавления экспрессии SESN3 в фибробластах, HaCaT и НСТ116 на скорость роста клеточных культур in vitro. Каждая точка – средняя величина для 3-х лунок; представлены типичные данные одного из трех экспериментов. Внизу представлены результаты влияния трансдукции shSESN3 на уровни АФК и мРНК SESN3. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.05. Как уже было показано ранее [127] возрастание уровня АФК может приводить к увеличению количества активного р53, белка, участвующего во многих ключевых процессах клеточной жизнедеятельности, в частности, в интересующем нас процессе 74 пролиферации [132]. Мы предположили, что р53, а также его мишень белок p21Cip/WAF1, являющийся ингибитором циклин-зависимых киназ, могут играть роль в SESN3зависимом снижении скорости роста клеточных культур. Поэтому мы оценили содержание белков р53 и р21 в клетках с подавленной экспрессией гена SESN3 (фибробласты, HaCaT, HCT116) (рис. 21). Было обнаружено, что уровень белка р21 значительно повышался во всех клеточных культурах, экспрессирующих shSESN3. В случае р53, его количество заметно увеличивалось в фибробластах с подавленной экспрессией SESN3, однако, в кератиноцитах и HCT116 повышение уровня р53 было не столь очевидно. Это указывает на возможное наличие р53-независимых механизмов увеличения содержания белка p21Cip1/WAF1 по крайне мере в HaCaT и HCT116. Рис. 21. Влияние трансдукции shSESN3 на уровень белков р53 и р21 в нормальных фибробластах, HaCaT и HCT116. Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Белок актин использовали в качестве контроля количества нанесенных образцов. Влияние изменений активности HSF1 на рост клеток in vivo Выше мы показали, что в зависимости от типа клеток различные модификации HSF1 приводят к снижению скорости роста клеточных культур. В частности, нами впервые было показано, что экспрессия активного HSF1 в кератиноцитах и HCT116 уменьшает скорость роста клеток in vitro. Мы решили оценить влияние конститутивноактивной формы HSF1 также и на рост подкожных ксенографтов у бестимусных мышей. В качестве контроля инъецировали НСТ116, содержащие «пустой» вектор pL6mod1. Было обнаружено, что скорость роста опухолевых ксенографтов, экспрессирующих активный 75 HSF1, замедляется (рис. 22), что согласуется с кинетикой роста клеток НСТ116, содержащих HSF1-Act, in vitro (рис. 19А). HCT116 Объем опухоли, мм3 200 Рис. 22. Влияние экспрессии активной pL6 Act 150 формы на HSF1 скорость роста подкожных опухолей. 100 Приведены средние значения, полученные 50 при анализе 8–12 опухолей в каждом из 0 0 5 10 15 20 трех экспериментов. Дни после прививки Рис. 23. Влияние трансдукции активной формы HSF1 на ангиогенез. Вверху, иммуногистохимическое окрашивание антителами срезов на опухолей CD34. экспериментальной группы Для НСТ116 каждой представлены типичные поля зрения. Внизу, приведены результаты подсчета CD34 положительных структур. Среднее значение ± стандартное отклонение, *p < 0.02. Известно, что скорость роста опухолей может зависеть не только от пролиферативной, но и от ангиогенной активности неопластических клеток, которая определяет степень васкуляризации опухолей. Чтобы оценить имеет ли место влияние экспрессии активного HSF1 на ангиогенную активность клеток был проведен иммуногистохимический анализ срезов опухолевых тканей, окрашенных антителами к CD34, узнающих эндотелиальные клетки кровеносных сосудов. Анализ показал, что результатом экспрессии конститутивно-активной формы HSF1 является уменьшение числа сосудов с просветами (p < 0.02) (рис. 23), то есть питание опухолевых клеток, 76 содержащих HSF1-Act, осуществляется менее интенсивно по сравнению с контрольными линиями. В основе воздействия изменений функции транскрипционного фактора HSF1 на пролиферативную и ангиогенную активность клеток могут лежать несколько механизмов, включая HSP-опосредованное изменение стабильности/активности MAPKs, Akt, mTOR и HIF-1α [196]. Так как ключевыми регуляторами клеточной пролиферации и ангиогенеза считаются, соответственно, MAP-киназы Erk1/2 и HIF-1α [68, 149], был проведен анализ содержания фосфорилированных (активных) форм Erk и белка HIF-1α в клетках НСТ116, экспрессирующих конститутивно-активную форму HSF1. Вестерн-блот анализ показал снижение содержания фосфорилированных форм Erk (р42 и р44) и уровня белка HIF-1α (рис. 24А). Результаты иммуногистохимического анализа опухолевых срезов, окрашенных антителами к HIF-1α, полностью согласовывались с данными вестерн-блот анализа (рис. 24Б). Рис. 24. Влияние трансдукции активной формы HSF1 на экспрессию белков Erk1/2 and HIF-1α. А) Вестерн-блот анализ клеточных культур. Представлены типичные результаты одного из трех экспериментов. Б) Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей антителами на HIF-1α. Для каждой экспериментальной группы представлены типичные поля зрения. Для количественной оценки уровня экспрессии HIF-1α ввели следующие обозначения: (+) — низкий, (++) — средний. 77 Глава 4. Обсуждение полученных результатов Целью настоящей работы являлось исследование вопроса о возможном влиянии экспрессии онкогенов Ras на активность транскрипционного фактора HSF1, и к каким биологическим последствиям могут привести изменения в активности HSF1 в различных типах клеток. На первом этапе нашей работы мы создали набор клеточных культур, используя клетки линии HaCaT (иммортализованные кератиноциты) и нормальные фибробласты человека, экспрессирующие доминантно-активные мутанты белка Ras. Мутации в белке Ras приводят к заменам аминокислот, следствием которых является активация мутантной формой белка Ras определенных эффекторов: RasV12- активирует PI3K, RalGDS и Raf; RasV12C40 - PI3K; RasV12G37 – RalGDS; RasV12S35 – Raf. Таким образом, мы смогли не только анализировать влияние гиперэкспрессии активного Ras на интересующие нас мишени, но и предполагать, через какие эффекторы белка Ras может осуществляться это воздействие. Оценив влияние экспрессии различных мутантных форм белка Ras на уровень внутриклеточных АФК и экспрессию генов сестринов, мы обнаружили, что и в нормальных фибробластах, и в кератиноцитах активный Ras приводит к повышению содержания АФК и к снижению уровня мРНК главным образом гена SESN3. Причем наибольший вклад в описанные эффекты дает сигнальный путь RasRaf. Отметим, что эти результаты согласуются с данными предыдущей работы, в которой подобные эффекты наблюдались на крысиных клеточных линиях и р53-/- клеточной линии человека [127]. Известно, что несколько механизмов могут быть вовлечены в Rasиндуцированное повышение уровня АФК, включая влияние на образование (генерацию) АФК [79, 191], а также на функционирование антиоксидантных систем клетки [67, 175]. Полученные данные о регулирующего неизвестного Ras-индуцированном снижении экспрессии регенерацию ранее пероксиредоксинов, механизма указывают Ras-индуцированного на повышения гена SESN3, существование уровня АФК посредством ослабления антиоксидантной защиты клетки. Однако промежуточные участники сигнального пути Ras-SESN3 оставались неизвестными. Используя базу данных TRANSFAC, содержащую информацию о сайтах связывания эукариотических факторов транскрипции в геномах, мы обнаружили, что в промоторах генов сестринов есть HSF1респонсивные элементы (HSE), что указывает на возможное участие транскрипционного фактора HSF1 в Ras-индуцированном снижении экспрессии гена SESN3. При проверке этой гипотезы мы показали, что гиперэкспрессия активного белка Ras действительно приводит к изменениям в активности HSF1. Однако неожиданным и интересным оказался тот факт, что в двух исследуемых типах Ras-экспрессирующих 78 клеток наблюдаемые изменения функционирования HSF1 были противоположны: повышение активности HSF1 в клетках HaCaT и ее снижение в нормальных фибробластах, что было подтверждено путем анализа экспрессии репортерной конструкции (pLentiA-mCMV-HSE-Luc-puro), а также содержания ядерного HSF1 с помощью Вестерн-блот и иммунофлуоресцентного анализов. Последствия активации онкогенного белка Ras зависят от типа клеток, в которых он экспрессируется, а также от условий проведения эксперимента [74, 193]. Так, например, в фибробластах гиперэкспрессия Ras приводит к преждевременному старению и снижению пролиферации [66, 242]. В кератиноцитах результатом активации Ras, по одним данным, является ингибирование размножения клеток, которое может быть как зависимым [134], так и независимым [181] от Ras-индуцируемых изменений активности белка p19ARF, осуществляющего, в частности позитивную регуляцию функции р53 [121, 240]. Наконец, по данным целого ряда других работ гиперэкспрессия Ras в определенных клеточных контекстах приводит к стимуляции пролиферации и снижению дифференцировки клеток [142, 243]. Используемые в нашей работе клетки отличаются по происхождения, а также по «нормальности», поэтому не удивительно, что программы, запускаемые активным белком Ras, в одних случаях могут приводить к снижению активности той или иной мишени, а в других - к ее повышению. Следующим шагом в настоящей работе была проверка, действительно ли Rasиндуцируемое снижение экспрессии гена SESN3 и, как следствие, повышение уровня внутриклеточных АФК является HSF1-зависимым. Для этого мы ввели созданные нами конструкции, экспрессирующие конститутивно-активную форму HSF1 и доминантнонегативный HSF1, в нормальные фибробласты человека и HaCaT. Результаты показали, что в HaCaT активный HSF1 приводит к тем же последствиям, что и экспрессия Ras в этих клетках – снижению уровня мРНК гена SESN3 и увеличение содержания АФК. В ФЧ мы наблюдали противоположные последствия введения активного HSF1 – увеличение экспрессии гена SESN3 и уменьшение уровня АФК. Однако присутствие в обоих типах клеток доминантно-негативного HSF1 не влияло на исследуемые внутриклеточные мишени. Поэтому, мы предположили, что, по крайней мере, в этих типах клеток экспрессия доминантно-негативной конструкции HSF1 не способна вызвать существенное снижение активности/функции HSF1. Подавление активности HSF1 за счет введения shHSF1 показало правомерность нашего предположения: в ФЧ мы обнаружили такие же эффекты, как и при экспрессии Ras в этих клетках – уменьшение уровня мРНК гена SESN3 и повышение содержания АФК; противоположные эффекты были продемонстрированы в HaCaT. 79 Возникал вопрос, какие возможные отличия между этими двумя исследуемыми типами клеток могут определять, какая модификация HSF1 будет снижать экспрессию гена SESN3, а какая – повышать? Мы определили два параметра, по которым различаются ФЧ и HaCaT – их гистогенетическое происхождение и степень «нормальности». Затем нами были выбраны две опухолевые клеточные линии, одна из которых имеет эпителиальное происхождение (HCT116), а другая соединительнотканное (HT1080). То есть эти две клеточные линии являются «не нормальными» и имеют происхождение сходное с HaCaT и фибробластами, соответственно. Экспрессия конститутивно-активной формы HSF1 в данных клетках (HCT116 и HT1080) приводила к тем же эффектам, что и в иммортализованных кератиноцитах, что указывает на то, что не происхождение, а скорее выраженность признаков неопластически трансформированного фенотипа определяет влияние модификаций фактора HSF1 на экспрессию гена SESN3 и, как следствие, уровень АФК. Мы также показали, что в случае HCT116, снижение активности HSF1 за счет введения доминантно-негативной формы HSF1 является достаточным для изменения уровня экспрессии гена SESN3 и содержания АФК. Выявление механизмов, участвующих в регуляции HSF1 белком Ras равно как и в регуляции экспрессии гена SESN3 транскрипционным фактором HSF1 в различных клеточных контекстах, является одной из задач для будущих исследований. Итак, мы продемонстрировали зависимость Ras-индуцированного снижения экспрессии гена SESN3 и увеличения уровня внутриклеточных АФК от изменений транскрипционной активности белка HSF1. Кроме того, нами было установлено, что в клетках с подавленной за счет введения shHSF1 активностью HSF1 экспрессия белка RasV12 не влияет на уровень мРНК гена SESN3 и содержание АФК. Результаты данной работы показывают, что, в дополнение к ранее описанным механизмам регуляции экспрессии генов сестринов – транскрипционным фактором р53 [28] и белками семейства FoxO [39] – существует еще один путь, опосредованный транскрипционным фактором HSF1. р53 вовлечен в регуляцию экспрессии генов SESN1 и SESN2, тогда как белки FoxO – гена SESN3, поэтому можно предположить участие и HSF1, и белков FoxO в Rasиндуцированном снижении уровня мРНК гена SESN3. Однако наши данные об отмене влияния активного белка Ras на экспрессию гена SESN3 и уровень АФК в клетках с подавленной активностью HSF1 указывают на первичную роль HSF1 в осуществлении этих эффектов по крайне мере в иммортализованных кератиноцитах человека линии HaCaT. Идентифицированный нами сигнальный путь Ras/HSF1/SESN3 в конечном итоге приводит к увеличению содержания внутриклеточных АФК, которые, как известно, 80 являются вторичными мессенджерами и участвуют в регуляции разнообразных клеточных процессов: пролиферации, метаболизма, апоптоза, старения и др. [83, 145, 174]. Судьба клетки при повышении АФК зависит от того, насколько сильно изменилась их концентрация в клетке – они могут, как способствовать клеточной пролиферации, вызывать генетическую нестабильность и процесс трансформации, так и снижать скорость роста клеток, приводить к развитию преждевременного старения [63]. Влияние АФК на клеточные процессы также зависит от клеточного контекста: одно и то же изменение в содержании АФК в различных типах клеток может приводить к разным, и даже, противоположным эффектам [35]. Изменение скорости пролиферации клеток может являться одним из показателей по какому потенциальному пути – трансформации/опухолевой прогрессии или остановки пролиферации/апоптозу – пойдет клетка после повышения концентрации внутриклеточных АФК. Мы решили оценить скорость роста клеточных культур как одно из возможных последствий увеличения АФК. Нами было продемонстрировано, что уменьшение уровня экспрессии гена SESN3 как за счет модификаций фактора HSF1, так и при введении shSESN3 в различных типах клеток (нормальные фибробласты, HaCaT, HCT116) приводит к снижению скорости роста клеточных культур, тогда как повышение содержания мРНК гена SESN3 и, как следствие, уменьшение уровня АФК не влияет на время удвоения клеток in vitro. Эти данные указывают на то, что HSF1-индуцированное SESN3-зависимое снижение скорости роста клеток связано скорее с функциями гена SESN3, включающими регуляцию содержания внутриклеточных АФК, чем с какой-либо другой, независимой от процессов окислениявосстановления, его активностью, как например, способностью стресс-индуцированных или эктопически экспрессирующихся генов сестринов, включая SESN3, к уменьшению синтеза белка, клеточного рост и/или стимуляции аутофагию посредством активации аденозин-3’,5’-монофосфат (АМФ)-зависимой протеин киназы AMPK или за счет ингибирования мишеней рапамицин-чувствительного комплекса TORC1 [27]. Об этом свидетельствует тот факт, что независимое от окислительно-восстановительных процессов антипролиферативное влияние гена SESN3 наблюдали при его повышенной экспрессии, тогда как мы показали редокс-зависимое снижение скорости роста клеточных культур при пониженном уровне мРНК гена SESN3. Результаты нашей работы также указывают на то, что одним из возможных механизмов замедления скорости роста клеток при уменьшении уровня экспрессии гена SESN3 является р53-опосредованное повышение содержания белка p21Cip1/WAF1, являющегося ингибитором циклин-зависимой киназы 2 (Cdk2). Однако вследствие того, что в одном клеточном контексте (фибробласты) мы наблюдали заметную корреляцию 81 между повышением содержания белка р53 и уровнем p21Cip1/WAF1, а в других типах клеток эта взаимосвязь было либо менее выражена (HaCaT) или практически отсутствовала (HCT116), то мы предполагаем наличие дополнительных р53-независимых механизмов увеличения содержания белка p21Cip1/WAF1, особенно в иммортализованных и опухолевых клетках. Их выявление является темой дальнейших исследований. Принципиальная схема полученных результатов приведена на рисунке 25. Рисунок 25. Схематическое изображение полученных результатов. В последнее время ингибирование активности транскрипционного фактора HSF1 все чаще рассматривают в качестве мишени для таргетной терапии опухолей [196, 231]. Однако как было отмечено в главе «Обзор литературы» данные об участии HSF1 в процессах канцерогенеза противоречивы. Многие работы демонстрируют, что подавление активности HSF1 негативно влияет на развитие опухолей. Однако следует отметить, что в большинстве таких работ использовались опухолевые клеточные культуры, которые дополнительно подвергали либо воздействию онкогенов [123], либо ингибировали в них функции опухолевых супрессоров, в частности гена р53 [58]. Например, в одной из недавних работ [162] было показано противоположное влияние HSF1 на клоногенный рост клеток в зависимости от наличия в них мутантного р53 или р53 дикого типа. Результаты других работ показывают, что, наоборот, повышение активности HSF1 может препятствовать развитию процессов канцерогенеза в определенных условиях. Все эти противоречия могут объясняться условиями проведения экспериментов, различиями в 82 наборе факторов, которыми воздействовали на клеточные культуры, а также типом исследуемых клеток. Данные недавней работы с использованием ChIP-Seq анализа как раз указывают на то, что мишени транскрипционного фактора HSF1 (а, следовательно, и последствия воздействия на них) могут сильно варьировать в зависимости от клеточного контекста [150]. В настоящей работе мы решили оценить влияние экспрессии конститутивноактивного фактора HSF1 на скорость роста клеток HCT116 in vivo, не подвергая их никаким дополнительным воздействиям. Было обнаружено снижение скорости роста опухолей, экспрессирующих активную форму HSF1, что согласуется с нашими данными по анализу скорости пролиферации клеток in vitro. Наряду с пролиферативной мы также наблюдали снижение и ангиогенной активности, на что указывало уменьшение числа сосудов с просветами. Также было продемонстрировано снижение количества белков, являющихся ключевыми регуляторами пролиферативной и ангиогенной активностей – Erk1/2 и HIF1α, соответственно. Таким образом, мы показали, что в данном клеточном контексте (рак ободочной кишки человека) при отсутствии дополнительных факторов экспрессия конститутивно-активной формы HSF1 по крайне мере не способствует развитию опухолей. Данные многих работ показали, что мишенями транскрипционного фактора HSF1 являются не только так называемые «стрессовые» гены, то есть гены, участвующие в ответе на стресс, но и многие другие, вовлеченные в разнообразные клеточные процессы. Выбор мишеней зависит как от клеточного контекста, так и от внешних воздействий. Данные, полученные in silico, продемонстрировали существенное различие в наборе генов-мишеней фактора HSF1 в нормальных и опухолевых клетках. Результаты экспериментальных работ также указывают на различие последствий активации HSF1 в зависимости от типа опухоли и других условий, перечисленных выше. Поэтому работы, направленные на изучение функционирования HSF1 в различных клеточных контекстах, в том числе и наша, помогут в дальнейшем понять, в каких конкретных случаях ингибирование активности транскрипционного фактора HSF1 может быть использовано в качестве мишени для таргетной терапии опухолей, а в каких стоит с этим повременить в свете, например, недостаточного количества данных. Отметим еще раз, что следует с осторожностью (если вообще не следует) программы, запускаемые HSF1 в одних типах клетках (даже среди различных популяций опухолевых клеток), экстраполировать на другие типы клеток. 83 Глава 5. Выводы 1) Установлено, что гиперэкспрессия различных мутантных белков Ras в клетках человека приводит к временному увеличению уровня внутриклеточных АФК и снижению экспрессии гена SESN3. 2) Впервые продемонстрировано влияние экспрессии мутантных форм онкобелка Ras на активность транскрипционного фактора HSF1. При этом обнаружено, что данный эффект зависит от типа клеток: в нормальных фибробластах экспрессия Ras снижает активность HSF1, тогда как в иммортализованных кератиноцитах линии HaCaT транскрипционная функция HSF1 повышается. 3) Впервые продемонстрировано влияние изменений активности HSF1 на экспрессию гена SESN3 и уровень внутриклеточных АФК. Установлено, что результатом подавления активности HSF1 в нормальных фибробластах человека является снижение уровня мРНК SESN3 и, как следствие, увеличение содержания АФК. В клетках HaCaT, HCT116 и HT1080 к репрессии гена SESN3 и повышению уровня АФК приводит не уменьшение, а увеличение транскрипционной активности HSF1. 4) Обнаружено, что модификации активности HSF1, модулируя экспрессию гена SESN3, изменяют скорость пролиферации культур клеток разных типов. 5) Обнаружено, что в основе SESN3-зависимого снижения скорости роста клеток in vitro лежит повышение внутриклеточного содержания белка-ингибитора циклинзависимых киназ p21Cip1/Waf1. Анализ связи повышения содержания p21Cip1/Waf1 с активацией р53 в клетках разных типов указывает на существование как р53-завивимого, так и р53-независимых механизмов активации p21Cip1/Waf1 в ответ на репрессию SESN3 и/или повышение уровня АФК. 6) Впервые продемонстрировано снижение скорости роста подкожных ксенографтов рака ободочной кишки человека HCT116, экспрессирующих конститутивноактивную форму HSF1. Ингибирование транскрипционной активности HSF1, наоборот, увеличивает скорость роста ксенографтов HCT116. Эти изменения скорости опухолевого роста связаны с соответствующими изменениями в уровне фосфорилирования МАР-киназы ERK, экспрессии HIF-1 и ангиогенной активности опухолевых клеток. 84 Список литературы 1. Копнин Б.П. Канцерогенез / ред. Заридзе Д.Г. – М.: Медицина, 2004. – С.125-156. 2. Adachi, Y., Shibai, Y., Mitsushita, J., Shang, W. H., Hirose, K., Kamata, T. Oncogenic Ras upregulates NADPH oxidase 1 gene expression through MEK-ERK-dependent phosphorylation of GATA-6 // Oncogene. — 2008. — Vol. 27. — № 36. — pp. 49214932. 3. Ahn, S. G., Liu, P. C., Klyachko, K., Morimoto, R. I., Thiele, D. J. The loop domain of heat shock transcription factor 1 dictates DNA-binding specificity and responses to heat stress // Genes & development. — 2001. — Vol. 15. — № 16. — pp. 2134-2145. 4. Ahn, S. G., Thiele, D. J. Redox regulation of mammalian heat shock factor 1 is essential for Hsp gene activation and protection from stress // Genes & development. — 2003. — Vol. 17. — № 4. — pp. 516-528. 5. Akerfelt, M., Morimoto, R. I., Sistonen, L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan // Nature reviews. Molecular cell biology. — 2010. — Vol. 11. — № 8. — pp. 545-555. 6. Aldana-Masangkay, G. I., Sakamoto, K. M. The role of HDAC6 in cancer // Journal of biomedicine & biotechnology. — 2011. — Vol. 2011. — p. 875824. 7. Anckar, J., Sistonen, L. Heat shock factor 1 as a coordinator of stress and developmental pathways // Advances in experimental medicine and biology. — 2007. — Vol. 594. — pp. 78-88. 8. Anckar, J., Sistonen, L. Regulation of HSF1 function in the heat stress response: implications in aging and disease // Annual review of biochemistry. — 2011. — Vol. 80. — pp. 1089-1115. 9. Ancrile, B. B., O'Hayer, K. M., Counter, C. M. Oncogenic ras-induced expression of cytokines: a new target of anti-cancer therapeutics // Molecular interventions. — 2008. — Vol. 8. — № 1. — pp. 22-27. 10. Arber, N. Janus faces of ras: anti or pro-apoptotic? // Apoptosis : an international journal on programmed cell death. — 1999. — Vol. 4. — № 5. — pp. 383-388. 11. Archer, H., Bar-Sagi, D. Ras and Rac as activators of reactive oxygen species (ROS) // Methods in molecular biology. — 2002. — Vol. 189. — pp. 67-73. 12. Baines, A. T., Xu, D., Der, C. J. Inhibition of Ras for cancer treatment: the search continues // Future medicinal chemistry. — 2011. — Vol. 3. — № 14. — pp. 1787-1808. 85 13. Baler, R., Dahl, G., Voellmy, R. Activation of human heat shock genes is accompanied by oligomerization, modification, and rapid translocation of heat shock transcription factor HSF1 // Molecular and cellular biology. — 1993. — Vol. 13. — № 4. — pp. 24862496. 14. Bar-Sagi, D. A Ras by any other name // Molecular and cellular biology. — 2001. — Vol. 21. — № 5. — pp. 1441-1443. 15. Bernards, A., Settleman, J. GAPs in growth factor signalling // Growth factors. — 2005. — Vol. 23. — № 2. — pp. 143-149. 16. Bernards, A., Settleman, J. GEFs in growth factor signaling // Growth factors. — 2007. — Vol. 25. — № 5. — pp. 355-361. 17. Bharadwaj, S., Ali, A., Ovsenek, N. Multiple components of the HSP90 chaperone complex function in regulation of heat shock factor 1 In vivo // Molecular and cellular biology. — 1999. — Vol. 19. — № 12. — pp. 8033-8041. 18. Biamonti, G., Vourc'h, C. Nuclear stress bodies // Cold Spring Harbor perspectives in biology. — 2010. — Vol. 2. — № 6. — p. a000695. 19. Bishop, N. A., Guarente, L. Genetic links between diet and lifespan: shared mechanisms from yeast to humans // Nature reviews. Genetics. — 2007. — Vol. 8. — № 11. — pp. 835-844. 20. Bivona, T. G., Quatela, S. E., Bodemann, B. O., Ahearn, I. M., Soskis, M. J., Mor, A., Miura, J., Wiener, H. H., Wright, L., Saba, S. G., Yim, D., Fein, A., Perez de Castro, I., Li, C., Thompson, C. B., Cox, A. D., Philips, M. R. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis // Molecular cell. — 2006. — Vol. 21. — № 4. — pp. 481-493. 21. Bodemann, B. O., White, M. A. Ral GTPases and cancer: linchpin support of the tumorigenic platform // Nature reviews. Cancer. — 2008. — Vol. 8. — № 2. — pp. 133140. 22. Bos, J. L., Rehmann, H., Wittinghofer, A. GEFs and GAPs: critical elements in the control of small G proteins // Cell. — 2007. — Vol. 129. — № 5. — pp. 865-877. 23. Boyault, C., Zhang, Y., Fritah, S., Caron, C., Gilquin, B., Kwon, S. H., Garrido, C., Yao, T. P., Vourc'h, C., Matthias, P., Khochbin, S. HDAC6 controls major cell response pathways to cytotoxic accumulation of protein aggregates // Genes & development. — 2007. — Vol. 21. — № 17. — pp. 2172-2181. 24. Brown, S. A., Imbalzano, A. N., Kingston, R. E. Activator-dependent regulation of transcriptional pausing on nucleosomal templates // Genes & development. — 1996. — Vol. 10. — № 12. — pp. 1479-1490. 86 25. Brunet, A., Sweeney, L. B., Sturgill, J. F., Chua, K. F., Greer, P. L., Lin, Y., Tran, H., Ross, S. E., Mostoslavsky, R., Cohen, H. Y., Hu, L. S., Cheng, H. L., Jedrychowski, M. P., Gygi, S. P., Sinclair, D. A., Alt, F. W., Greenberg, M. E. Stress-dependent regulation of FOXO transcription factors by the SIRT1 deacetylase // Science. — 2004. — Vol. 303. — № 5666. — pp. 2011-2015. 26. Brunet Simioni, M., De Thonel, A., Hammann, A., Joly, A. L., Bossis, G., Fourmaux, E., Bouchot, A., Landry, J., Piechaczyk, M., Garrido, C. Heat shock protein 27 is involved in SUMO-2/3 modification of heat shock factor 1 and thereby modulates the transcription factor activity // Oncogene. — 2009. — Vol. 28. — № 37. — pp. 3332-3344. 27. Budanov, A. V., Lee, J. H., Karin, M. Stressin' Sestrins take an aging fight // EMBO molecular medicine. — 2010. — Vol. 2. — № 10. — pp. 388-400. 28. Budanov, A. V., Sablina, A. A., Feinstein, E., Koonin, E. V., Chumakov, P. M. Regeneration of peroxiredoxins by p53-regulated sestrins, homologs of bacterial AhpD // Science. — 2004. — Vol. 304. — № 5670. — pp. 596-600. 29. Burley, S. K., Petsko, G. A. Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of protein structure stabilization // Science. — 1985. — Vol. 229. — № 4708. — pp. 23-28. 30. Cacace, A. M., Michaud, N. R., Therrien, M., Mathes, K., Copeland, T., Rubin, G. M., Morrison, D. K. Identification of constitutive and ras-inducible phosphorylation sites of KSR: implications for 14-3-3 binding, mitogen-activated protein kinase binding, and KSR overexpression // Molecular and cellular biology. — 1999. — Vol. 19. — № 1. — pp. 229-240. 31. Calderwood, S. K., Khaleque, M. A., Sawyer, D. B., Ciocca, D. R. Heat shock proteins in cancer: chaperones of tumorigenesis // Trends in biochemical sciences. — 2006. — Vol. 31. — № 3. — pp. 164-172. 32. Campbell, P. M., Der, C. J. Oncogenic Ras and its role in tumor cell invasion and metastasis // Seminars in cancer biology. — 2004. — Vol. 14. — № 2. — pp. 105-114. 33. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway // Science. — 2002. — Vol. 296. — № 5573. — pp. 1655-1657. 34. Castellano, E., Downward, J. Role of RAS in the regulation of PI 3-kinase // Current topics in microbiology and immunology. — 2010. — Vol. 346. — pp. 143-169. 35. Cataldi, A. Cell responses to oxidative stressors // Current pharmaceutical design. — 2010. — Vol. 16. — № 12. — pp. 1387-1395. 36. Chai, Y., Koppenhafer, S. L., Bonini, N. M., Paulson, H. L. Analysis of the role of heat shock protein (Hsp) molecular chaperones in polyglutamine disease // The Journal of 87 neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. — 1999. — Vol. 19. — № 23. — pp. 10338-10347. 37. Chen, C., Pore, N., Behrooz, A., Ismail-Beigi, F., Maity, A. Regulation of glut1 mRNA by hypoxia-inducible factor-1. Interaction between H-ras and hypoxia // The Journal of biological chemistry. — 2001. — Vol. 276. — № 12. — pp. 9519-9525. 38. Chen, C., Xie, Y., Stevenson, M. A., Auron, P. E., Calderwood, S. K. Heat shock factor 1 represses Ras-induced transcriptional activation of the c-fos gene // The Journal of biological chemistry. — 1997. — Vol. 272. — № 43. — pp. 26803-26806. 39. Chen, C. C., Jeon, S. M., Bhaskar, P. T., Nogueira, V., Sundararajan, D., Tonic, I., Park, Y., Hay, N. FoxOs inhibit mTORC1 and activate Akt by inducing the expression of Sestrin3 and Rictor // Developmental cell. — 2010. — Vol. 18. — № 4. — pp. 592-604. 40. Chiaradonna, F., Sacco, E., Manzoni, R., Giorgio, M., Vanoni, M., Alberghina, L. Rasdependent carbon metabolism and transformation in mouse fibroblasts // Oncogene. — 2006. — Vol. 25. — № 39. — pp. 5391-5404. 41. Chin, L., Tam, A., Pomerantz, J., Wong, M., Holash, J., Bardeesy, N., Shen, Q., O'Hagan, R., Pantginis, J., Zhou, H., Horner, J. W., 2nd, Cordon-Cardo, C., Yancopoulos, G. D., DePinho, R. A. Essential role for oncogenic Ras in tumour maintenance // Nature. — 1999. — Vol. 400. — № 6743. — pp. 468-472. 42. Cho, H. J., Jeong, H. G., Lee, J. S., Woo, E. R., Hyun, J. W., Chung, M. H., You, H. J. Oncogenic H-Ras enhances DNA repair through the Ras/phosphatidylinositol 3kinase/Rac1 pathway in NIH3T3 cells. Evidence for association with reactive oxygen species // The Journal of biological chemistry. — 2002. — Vol. 277. — № 22. — pp. 19358-19366. 43. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family // Cellular signalling. — 2003. — Vol. 15. — № 5. — pp. 463-469. 44. Christians, E., Davis, A. A., Thomas, S. D., Benjamin, I. J. Maternal effect of Hsf1 on reproductive success // Nature. — 2000. — Vol. 407. — № 6805. — pp. 693-694. 45. Chu, B., Soncin, F., Price, B. D., Stevenson, M. A., Calderwood, S. K. Sequential phosphorylation by mitogen-activated protein kinase and glycogen synthase kinase 3 represses transcriptional activation by heat shock factor-1 // The Journal of biological chemistry. — 1996. — Vol. 271. — № 48. — pp. 30847-30857. 46. Chu, B., Zhong, R., Soncin, F., Stevenson, M. A., Calderwood, S. K. Transcriptional activity of heat shock factor 1 at 37 degrees C is repressed through phosphorylation on two distinct serine residues by glycogen synthase kinase 3 and protein kinases Calpha and 88 Czeta // The Journal of biological chemistry. — 1998. — Vol. 273. — № 29. — pp. 18640-18646. 47. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity // Science. — 2006. — Vol. 313. — № 5793. — pp. 1604-1610. 48. Cohen, E., Dillin, A. The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration // Nature reviews. Neuroscience. — 2008. — Vol. 9. — № 10. — pp. 759-767. 49. Cohen, E., Du, D., Joyce, D., Kapernick, E. A., Volovik, Y., Kelly, J. W., Dillin, A. Temporal requirements of insulin/IGF-1 signaling for proteotoxicity protection // Aging cell. — 2010. — Vol. 9. — № 2. — pp. 126-134. 50. Cohen, E., Paulsson, J. F., Blinder, P., Burstyn-Cohen, T., Du, D., Estepa, G., Adame, A., Pham, H. M., Holzenberger, M., Kelly, J. W., Masliah, E., Dillin, A. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice // Cell. — 2009. — Vol. 139. — № 6. — pp. 1157-1169. 51. Coleman, M. L., Marshall, C. J., Olson, M. F. RAS and RHO GTPases in G1-phase cellcycle regulation // Nature reviews. Molecular cell biology. — 2004. — Vol. 5. — № 5. — pp. 355-366. 52. Conde, R., Xavier, J., McLoughlin, C., Chinkers, M., Ovsenek, N. Protein phosphatase 5 is a negative modulator of heat shock factor 1 // The Journal of biological chemistry. — 2005. — Vol. 280. — № 32. — pp. 28989-28996. 53. Cotto, J., Fox, S., Morimoto, R. HSF1 granules: a novel stress-induced nuclear compartment of human cells // Journal of cell science. — 1997. — Vol. 110 ( Pt 23). — pp. 2925-2934. 54. Cox, A. D., Der, C. J. The dark side of Ras: regulation of apoptosis // Oncogene. — 2003. — Vol. 22. — № 56. — pp. 8999-9006. 55. Crespo, P., Leon, J. Ras proteins in the control of the cell cycle and cell differentiation // Cellular and molecular life sciences : CMLS. — 2000. — Vol. 57. — № 11. — pp. 16131636. 56. Crews, C. M., Erikson, R. L. Extracellular signals and reversible protein phosphorylation: what to Mek of it all // Cell. — 1993. — Vol. 74. — № 2. — pp. 215-217. 57. D'Adamo, D. R., Novick, S., Kahn, J. M., Leonardi, P., Pellicer, A. rsc: a novel oncogene with structural and functional homology with the gene family of exchange factors for Ral // Oncogene. — 1997. — Vol. 14. — № 11. — pp. 1295-1305. 89 58. Dai, C., Whitesell, L., Rogers, A. B., Lindquist, S. Heat shock factor 1 is a powerful multifaceted modifier of carcinogenesis // Cell. — 2007. — Vol. 130. — № 6. — pp. 1005-1018. 59. Dai, R., Frejtag, W., He, B., Zhang, Y., Mivechi, N. F. c-Jun NH2-terminal kinase targeting and phosphorylation of heat shock factor-1 suppress its transcriptional activity // The Journal of biological chemistry. — 2000. — Vol. 275. — № 24. — pp. 18210-18218. 60. Datta, S. R., Dudek, H., Tao, X., Masters, S., Fu, H., Gotoh, Y., Greenberg, M. E. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery // Cell. — 1997. — Vol. 91. — № 2. — pp. 231-241. 61. Davies, H., Bignell, G. R., Cox, C., Stephens, P., Edkins, S., Clegg, S., Teague, J., Woffendin, H., Garnett, M. J., Bottomley, W., Davis, N., Dicks, E., Ewing, R., Floyd, Y., Gray, K., Hall, S., Hawes, R., Hughes, J., Kosmidou, V., Menzies, A., Mould, C., Parker, A., Stevens, C., Watt, S., Hooper, S., Wilson, R., Jayatilake, H., Gusterson, B. A., Cooper, C., Shipley, J., Hargrave, D., Pritchard-Jones, K., Maitland, N., ChenevixTrench, G., Riggins, G. J., Bigner, D. D., Palmieri, G., Cossu, A., Flanagan, A., Nicholson, A., Ho, J. W., Leung, S. Y., Yuen, S. T., Weber, B. L., Seigler, H. F., Darrow, T. L., Paterson, H., Marais, R., Marshall, C. J., Wooster, R., Stratton, M. R., Futreal, P. A. Mutations of the BRAF gene in human cancer // Nature. — 2002. — Vol. 417. — № 6892. — pp. 949-954. 62. Davis, R. J. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases // Cell. — 2000. — Vol. 103. — № 2. — pp. 239-252. 63. Day, R. M., Suzuki, Y. J. Cell proliferation, reactive oxygen and cellular glutathione // Dose-response : a publication of International Hormesis Society. — 2005. — Vol. 3. — № 3. — pp. 425-442. 64. Denegri, M., Chiodi, I., Corioni, M., Cobianchi, F., Riva, S., Biamonti, G. Stress-induced nuclear bodies are sites of accumulation of pre-mRNA processing factors // Molecular biology of the cell. — 2001. — Vol. 12. — № 11. — pp. 3502-3514. 65. Denegri, M., Moralli, D., Rocchi, M., Biggiogera, M., Raimondi, E., Cobianchi, F., De Carli, L., Riva, S., Biamonti, G. Human chromosomes 9, 12, and 15 contain the nucleation sites of stress-induced nuclear bodies // Molecular biology of the cell. — 2002. — Vol. 13. — № 6. — pp. 2069-2079. 66. Deng, Q., Liao, R., Wu, B. L., Sun, P. High intensity ras signaling induces premature senescence by activating p38 pathway in primary human fibroblasts // The Journal of biological chemistry. — 2004. — Vol. 279. — № 2. — pp. 1050-1059. 90 67. DeNicola, G. M., Karreth, F. A., Humpton, T. J., Gopinathan, A., Wei, C., Frese, K., Mangal, D., Yu, K. H., Yeo, C. J., Calhoun, E. S., Scrimieri, F., Winter, J. M., Hruban, R. H., Iacobuzio-Donahue, C., Kern, S. E., Blair, I. A., Tuveson, D. A. Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes ROS detoxification and tumorigenesis // Nature. — 2011. — Vol. 475. — № 7354. — pp. 106-109. 68. Diaz-Gonzalez, J. A., Russell, J., Rouzaut, A., Gil-Bazo, I., Montuenga, L. Targeting hypoxia and angiogenesis through HIF-1alpha inhibition // Cancer biology & therapy. — 2005. — Vol. 4. — № 10. — pp. 1055-1062. 69. Diehl, J. A., Cheng, M., Roussel, M. F., Sherr, C. J. Glycogen synthase kinase-3beta regulates cyclin D1 proteolysis and subcellular localization // Genes & development. — 1998. — Vol. 12. — № 22. — pp. 3499-3511. 70. Ding, X. Z., Tsokos, G. C., Kiang, J. G. Overexpression of HSP-70 inhibits the phosphorylation of HSF1 by activating protein phosphatase and inhibiting protein kinase C activity // FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. — 1998. — Vol. 12. — № 6. — pp. 451-459. 71. Ding, X. Z., Tsokos, G. C., Smallridge, R. C., Kiang, J. G. Heat shock gene-expression in HSP-70 and HSF1 gene-transfected human epidermoid A-431 cells // Molecular and cellular biochemistry. — 1997. — Vol. 167. — № 1-2. — pp. 145-152. 72. Donovan, S., Shannon, K. M., Bollag, G. GTPase activating proteins: critical regulators of intracellular signaling // Biochimica et biophysica acta. — 2002. — Vol. 1602. — № 1. — pp. 23-45. 73. Du, Z. X., Meng, X., Zhang, H. Y., Guan, Y., Wang, H. Q. Caspase-dependent cleavage of BAG3 in proteasome inhibitors-induced apoptosis in thyroid cancer cells // Biochemical and biophysical research communications. — 2008. — Vol. 369. — № 3. — pp. 894-898. 74. Ewen, M. E. Relationship between Ras pathways and cell cycle control // Progress in cell cycle research. — 2000. — Vol. 4. — pp. 1-17. 75. Fantin, V. R., St-Pierre, J., Leder, P. Attenuation of LDH-A expression uncovers a link between glycolysis, mitochondrial physiology, and tumor maintenance // Cancer cell. — 2006. — Vol. 9. — № 6. — pp. 425-434. 76. Feramisco, J. R., Gross, M., Kamata, T., Rosenberg, M., Sweet, R. W. Microinjection of the oncogene form of the human H-ras (T-24) protein results in rapid proliferation of quiescent cells // Cell. — 1984. — Vol. 38. — № 1. — pp. 109-117. 91 77. Ferro, E., Goitre, L., Retta, S. F., Trabalzini, L. The Interplay between ROS and Ras GTPases: Physiological and Pathological Implications // Journal of signal transduction. — 2012. — Vol. 2012. — p. 365769. 78. Ferro, E., Trabalzini, L. RalGDS family members couple Ras to Ral signalling and that's not all // Cellular signalling. — 2010. — Vol. 22. — № 12. — pp. 1804-1810. 79. Ferro, E., Visalli, G., Civa, R., La Rosa, M. A., Randazzo Papa, G., Baluce, B., D'Ascola, D. G., Piraino, B., Salpietro, C., Di Pietro, A. Oxidative damage and genotoxicity biomarkers in transfused and untransfused thalassemic subjects // Free radical biology & medicine. — 2012. — Vol. 53. — № 10. — pp. 1829-1837. 80. Filmus, J., Robles, A. I., Shi, W., Wong, M. J., Colombo, L. L., Conti, C. J. Induction of cyclin D1 overexpression by activated ras // Oncogene. — 1994. — Vol. 9. — № 12. — pp. 3627-3633. 81. Filmus, J., Zhao, J., Buick, R. N. Overexpression of H-ras oncogene induces resistance to the growth-inhibitory action of transforming growth factor beta-1 (TGF-beta 1) and alters the number and type of TGF-beta 1 receptors in rat intestinal epithelial cell clones // Oncogene. — 1992. — Vol. 7. — № 3. — pp. 521-526. 82. Finco, T. S., Westwick, J. K., Norris, J. L., Beg, A. A., Der, C. J., Baldwin, A. S., Jr. Oncogenic Ha-Ras-induced signaling activates NF-kappaB transcriptional activity, which is required for cellular transformation // The Journal of biological chemistry. — 1997. — Vol. 272. — № 39. — pp. 24113-24116. 83. Finkel, T. Oxidant signals and oxidative stress // Current opinion in cell biology. — 2003. — Vol. 15. — № 2. — pp. 247-254. 84. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia // Nature. — 1989. — Vol. 339. — № 6219. — pp. 58-61. 85. Foster, K. G., Fingar, D. C. Mammalian target of rapamycin (mTOR): conducting the cellular signaling symphony // The Journal of biological chemistry. — 2010. — Vol. 285. — № 19. — pp. 14071-14077. 86. Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis // The Journal of cell biology. — 1994. — Vol. 124. — № 4. — pp. 619-626. 87. Fujikake, N., Nagai, Y., Popiel, H. A., Okamoto, Y., Yamaguchi, M., Toda, T. Heat shock transcription factor 1-activating compounds suppress polyglutamine-induced neurodegeneration through induction of multiple molecular chaperones // The Journal of biological chemistry. — 2008. — Vol. 283. — № 38. — pp. 26188-26197. 92 88. Fujimoto, M., Hayashida, N., Katoh, T., Oshima, K., Shinkawa, T., Prakasam, R., Tan, K., Inouye, S., Takii, R., Nakai, A. A novel mouse HSF3 has the potential to activate nonclassical heat-shock genes during heat shock // Molecular biology of the cell. — 2010. — Vol. 21. — № 1. — pp. 106-116. 89. Galabova-Kovacs, G., Kolbus, A., Matzen, D., Meissl, K., Piazzolla, D., Rubiolo, C., Steinitz, K., Baccarini, M. ERK and beyond: insights from B-Raf and Raf-1 conditional knockouts // Cell cycle. — 2006. — Vol. 5. — № 14. — pp. 1514-1518. 90. Gangarosa, L. M., Sizemore, N., Graves-Deal, R., Oldham, S. M., Der, C. J., Coffey, R. J. A raf-independent epidermal growth factor receptor autocrine loop is necessary for Ras transformation of rat intestinal epithelial cells // The Journal of biological chemistry. — 1997. — Vol. 272. — № 30. — pp. 18926-18931. 91. Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing // Nature. — 2007. — Vol. 449. — № 7165. — pp. 1073-1077. 92. Giehl, K. Oncogenic Ras in tumour progression and metastasis // Biological chemistry. — 2005. — Vol. 386. — № 3. — pp. 193-205. 93. Gille, H., Downward, J. Multiple ras effector pathways contribute to G(1) cell cycle progression // The Journal of biological chemistry. — 1999. — Vol. 274. — № 31. — pp. 22033-22040. 94. Gonzalez-Garcia, A., Pritchard, C. A., Paterson, H. F., Mavria, G., Stamp, G., Marshall, C. J. RalGDS is required for tumor formation in a model of skin carcinogenesis // Cancer cell. — 2005. — Vol. 7. — № 3. — pp. 219-226. 95. Green, M., Schuetz, T. J., Sullivan, E. K., Kingston, R. E. A heat shock-responsive domain of human HSF1 that regulates transcription activation domain function // Molecular and cellular biology. — 1995. — Vol. 15. — № 6. — pp. 3354-3362. 96. Grunert, S., Jechlinger, M., Beug, H. Diverse cellular and molecular mechanisms contribute to epithelial plasticity and metastasis // Nature reviews. Molecular cell biology. — 2003. — Vol. 4. — № 8. — pp. 657-665. 97. Guettouche, T., Boellmann, F., Lane, W. S., Voellmy, R. Analysis of phosphorylation of human heat shock factor 1 in cells experiencing a stress // BMC biochemistry. — 2005. — Vol. 6. — p. 4. 98. Guicciardi, M. E., Gores, G. J. AIP1: a new player in TNF signaling // The Journal of clinical investigation. — 2003. — Vol. 111. — № 12. — pp. 1813-1815. 99. Guo, W., Giancotti, F. G. Integrin signalling during tumour progression // Nature reviews. Molecular cell biology. — 2004. — Vol. 5. — № 10. — pp. 816-826. 93 100. Hart, T. C., Zhang, Y., Gorry, M. C., Hart, P. S., Cooper, M., Marazita, M. L., Marks, J. M., Cortelli, J. R., Pallos, D. A mutation in the SOS1 gene causes hereditary gingival fibromatosis type 1 // American journal of human genetics. — 2002. — Vol. 70. — № 4. — pp. 943-954. 101. Hay, D. G., Sathasivam, K., Tobaben, S., Stahl, B., Marber, M., Mestril, R., Mahal, A., Smith, D. L., Woodman, B., Bates, G. P. Progressive decrease in chaperone protein levels in a mouse model of Huntington's disease and induction of stress proteins as a therapeutic approach // Human molecular genetics. — 2004. — Vol. 13. — № 13. — pp. 1389-1405. 102. He, H., Chen, C., Xie, Y., Asea, A., Calderwood, S. K. HSP70 and heat shock factor 1 cooperate to repress Ras-induced transcriptional activation of the c-fos gene // Cell stress & chaperones. — 2000. — Vol. 5. — № 5. — pp. 406-411. 103. Herrmann, C. Ras-effector interactions: after one decade // Current opinion in structural biology. — 2003. — Vol. 13. — № 1. — pp. 122-129. 104. Hietakangas, V., Ahlskog, J. K., Jakobsson, A. M., Hellesuo, M., Sahlberg, N. M., Holmberg, C. I., Mikhailov, A., Palvimo, J. J., Pirkkala, L., Sistonen, L. Phosphorylation of serine 303 is a prerequisite for the stress-inducible SUMO modification of heat shock factor 1 // Molecular and cellular biology. — 2003. — Vol. 23. — № 8. — pp. 29532968. 105. Hietakangas, V., Anckar, J., Blomster, H. A., Fujimoto, M., Palvimo, J. J., Nakai, A., Sistonen, L. PDSM, a motif for phosphorylation-dependent SUMO modification // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2006. — Vol. 103. — № 1. — pp. 45-50. 106. Holmberg, C. I., Hietakangas, V., Mikhailov, A., Rantanen, J. O., Kallio, M., Meinander, A., Hellman, J., Morrice, N., MacKintosh, C., Morimoto, R. I., Eriksson, J. E., Sistonen, L. Phosphorylation of serine 230 promotes inducible transcriptional activity of heat shock factor 1 // The EMBO journal. — 2001. — Vol. 20. — № 14. — pp. 3800-3810. 107. Homma, S., Jin, X., Wang, G., Tu, N., Min, J., Yanasak, N., Mivechi, N. F. Demyelination, astrogliosis, and accumulation of ubiquitinated proteins, hallmarks of CNS disease in hsf1-deficient mice // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. — 2007. — Vol. 27. — № 30. — pp. 7974-7986. 108. Hrycyna, C. A., Clarke, S. Maturation of isoprenylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Multiple activities catalyze the cleavage of the three carboxyl-terminal amino acids from farnesylated substrates in vitro // The Journal of biological chemistry. — 1992. — Vol. 267. — № 15. — pp. 10457-10464. 94 109. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor // Science. — 2003. — Vol. 300. — № 5622. — pp. 11421145. 110. Hu, Y., Mivechi, N. F. HSF-1 interacts with Ral-binding protein 1 in a stress-responsive, multiprotein complex with HSP90 in vivo // The Journal of biological chemistry. — 2003. — Vol. 278. — № 19. — pp. 17299-17306. 111. Huber, M. A., Kraut, N., Beug, H. Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression // Current opinion in cell biology. — 2005. — Vol. 17. — № 5. — pp. 548-558. 112. Jacobs, A. T., Marnett, L. J. HSF1-mediated BAG3 expression attenuates apoptosis in 4hydroxynonenal-treated colon cancer cells via stabilization of anti-apoptotic Bcl-2 proteins // The Journal of biological chemistry. — 2009. — Vol. 284. — № 14. — pp. 9176-9183. 113. Jedlicka, P., Mortin, M. A., Wu, C. Multiple functions of Drosophila heat shock transcription factor in vivo // The EMBO journal. — 1997. — Vol. 16. — № 9. — pp. 2452-2462. 114. Johannessen, C. M., Reczek, E. E., James, M. F., Brems, H., Legius, E., Cichowski, K. The NF1 tumor suppressor critically regulates TSC2 and mTOR // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2005. — Vol. 102. — № 24. — pp. 8573-8578. 115. Jolly, C., Konecny, L., Grady, D. L., Kutskova, Y. A., Cotto, J. J., Morimoto, R. I., Vourc'h, C. In vivo binding of active heat shock transcription factor 1 to human chromosome 9 heterochromatin during stress // The Journal of cell biology. — 2002. — Vol. 156. — № 5. — pp. 775-781. 116. Jolly, C., Lakhotia, S. C. Human sat III and Drosophila hsr omega transcripts: a common paradigm for regulation of nuclear RNA processing in stressed cells // Nucleic acids research. — 2006. — Vol. 34. — № 19. — pp. 5508-5514. 117. Jolly, C., Morimoto, R., Robert-Nicoud, M., Vourc'h, C. HSF1 transcription factor concentrates in nuclear foci during heat shock: relationship with transcription sites // Journal of cell science. — 1997. — Vol. 110 ( Pt 23). — pp. 2935-2941. 118. Jolly, C., Usson, Y., Morimoto, R. I. Rapid and reversible relocalization of heat shock factor 1 within seconds to nuclear stress granules // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1999. — Vol. 96. — № 12. — pp. 67696774. 95 119. Jones, R. G., Thompson, C. B. Tumor suppressors and cell metabolism: a recipe for cancer growth // Genes & development. — 2009. — Vol. 23. — № 5. — pp. 537-548. 120. Kamal, A., Thao, L., Sensintaffar, J., Zhang, L., Boehm, M. F., Fritz, L. C., Burrows, F. J. A high-affinity conformation of Hsp90 confers tumour selectivity on Hsp90 inhibitors // Nature. — 2003. — Vol. 425. — № 6956. — pp. 407-410. 121. Kamijo, T., Weber, J. D., Zambetti, G., Zindy, F., Roussel, M. F., Sherr, C. J. Functional and physical interactions of the ARF tumor suppressor with p53 and Mdm2 // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1998. — Vol. 95. — № 14. — pp. 8292-8297. 122. Kennedy, N. J., Sluss, H. K., Jones, S. N., Bar-Sagi, D., Flavell, R. A., Davis, R. J. Suppression of Ras-stimulated transformation by the JNK signal transduction pathway // Genes & development. — 2003. — Vol. 17. — № 5. — pp. 629-637. 123. Khaleque, M. A., Bharti, A., Sawyer, D., Gong, J., Benjamin, I. J., Stevenson, M. A., Calderwood, S. K. Induction of heat shock proteins by heregulin beta1 leads to protection from apoptosis and anchorage-independent growth // Oncogene. — 2005. — Vol. 24. — № 43. — pp. 6564-6573. 124. Khokhlatchev, A. V., Canagarajah, B., Wilsbacher, J., Robinson, M., Atkinson, M., Goldsmith, E., Cobb, M. H. Phosphorylation of the MAP kinase ERK2 promotes its homodimerization and nuclear translocation // Cell. — 1998. — Vol. 93. — № 4. — pp. 605-615. 125. Kim, E. H., Lee, Y. J., Bae, S., Lee, J. S., Kim, J., Lee, Y. S. Heat shock factor 1mediated aneuploidy requires a defective function of p53 // Cancer research. — 2009. — Vol. 69. — № 24. — pp. 9404-9412. 126. Kim, S. A., Yoon, J. H., Lee, S. H., Ahn, S. G. Polo-like kinase 1 phosphorylates heat shock transcription factor 1 and mediates its nuclear translocation during heat stress // The Journal of biological chemistry. — 2005. — Vol. 280. — № 13. — pp. 12653-12657. 127. Kopnin, P. B., Agapova, L. S., Kopnin, B. P., Chumakov, P. M. Repression of sestrin family genes contributes to oncogenic Ras-induced reactive oxygen species up-regulation and genetic instability // Cancer research. — 2007. — Vol. 67. — № 10. — pp. 46714678. 128. Kotlyarov, A., Neininger, A., Schubert, C., Eckert, R., Birchmeier, C., Volk, H. D., Gaestel, M. MAPKAP kinase 2 is essential for LPS-induced TNF-alpha biosynthesis // Nature cell biology. — 1999. — Vol. 1. — № 2. — pp. 94-97. 129. Kranenburg, O., Gebbink, M. F., Voest, E. E. Stimulation of angiogenesis by Ras proteins // Biochimica et biophysica acta. — 2004. — Vol. 1654. — № 1. — pp. 23-37. 96 130. Lee, Y. J., Kim, E. H., Lee, J. S., Jeoung, D., Bae, S., Kwon, S. H., Lee, Y. S. HSF1 as a mitotic regulator: phosphorylation of HSF1 by Plk1 is essential for mitotic progression // Cancer research. — 2008. — Vol. 68. — № 18. — pp. 7550-7560. 131. Lee, Y. J., Lee, H. J., Lee, J. S., Jeoung, D., Kang, C. M., Bae, S., Lee, S. J., Kwon, S. H., Kang, D., Lee, Y. S. A novel function for HSF1-induced mitotic exit failure and genomic instability through direct interaction between HSF1 and Cdc20 // Oncogene. — 2008. — Vol. 27. — № 21. — pp. 2999-3009. 132. Levine, A. J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell. — 1997. — Vol. 88. — № 3. — pp. 323-331. 133. Lim, K. H., Baines, A. T., Fiordalisi, J. J., Shipitsin, M., Feig, L. A., Cox, A. D., Der, C. J., Counter, C. M. Activation of RalA is critical for Ras-induced tumorigenesis of human cells // Cancer cell. — 2005. — Vol. 7. — № 6. — pp. 533-545. 134. Lin, A. W., Lowe, S. W. Oncogenic ras activates the ARF-p53 pathway to suppress epithelial cell transformation // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2001. — Vol. 98. — № 9. — pp. 5025-5030. 135. Lis, J. Promoter-associated pausing in promoter architecture and postinitiation transcriptional regulation // Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology. — 1998. — Vol. 63. — pp. 347-356. 136. Lis, J. T., Mason, P., Peng, J., Price, D. H., Werner, J. P-TEFb kinase recruitment and function at heat shock loci // Genes & development. — 2000. — Vol. 14. — № 7. — pp. 792-803. 137. Liu, J., Zhang, D., Mi, X., Xia, Q., Yu, Y., Zuo, Z., Guo, W., Zhao, X., Cao, J., Yang, Q., Zhu, A., Yang, W., Shi, X., Li, J., Huang, C. p27 suppresses arsenite-induced Hsp27/Hsp70 expression through inhibiting JNK2/c-Jun- and HSF-1-dependent pathways // The Journal of biological chemistry. — 2010. — Vol. 285. — № 34. — pp. 2605826065. 138. Liu, P. C., Thiele, D. J. Modulation of human heat shock factor trimerization by the linker domain // The Journal of biological chemistry. — 1999. — Vol. 274. — № 24. — pp. 17219-17225. 139. Lock, R., Roy, S., Kenific, C. M., Su, J. S., Salas, E., Ronen, S. M., Debnath, J. Autophagy facilitates glycolysis during Ras-mediated oncogenic transformation // Molecular biology of the cell. — 2011. — Vol. 22. — № 2. — pp. 165-178. 140. Lu, M., Kim, H. E., Li, C. R., Kim, S., Kwak, I. J., Lee, Y. J., Kim, S. S., Moon, J. Y., Kim, C. H., Kim, D. K., Kang, H. S., Park, J. S. Two distinct disulfide bonds formed in 97 human heat shock transcription factor 1 act in opposition to regulate its DNA binding activity // Biochemistry. — 2008. — Vol. 47. — № 22. — pp. 6007-6015. 141. Lu, M., Lee, Y. J., Park, S. M., Kang, H. S., Kang, S. W., Kim, S., Park, J. S. Aromaticparticipant interactions are essential for disulfide-bond-based trimerization in human heat shock transcription factor 1 // Biochemistry. — 2009. — Vol. 48. — № 18. — pp. 37953797. 142. Mainiero, F., Murgia, C., Wary, K. K., Curatola, A. M., Pepe, A., Blumemberg, M., Westwick, J. K., Der, C. J., Giancotti, F. G. The coupling of alpha6beta4 integrin to RasMAP kinase pathways mediated by Shc controls keratinocyte proliferation // The EMBO journal. — 1997. — Vol. 16. — № 9. — pp. 2365-2375. 143. Malliri, A., van der Kammen, R. A., Clark, K., van der Valk, M., Michiels, F., Collard, J. G. Mice deficient in the Rac activator Tiam1 are resistant to Ras-induced skin tumours // Nature. — 2002. — Vol. 417. — № 6891. — pp. 867-871. 144. Marco, E. J., Abidi, F. E., Bristow, J., Dean, W. B., Cotter, P., Jeremy, R. J., Schwartz, C. E., Sherr, E. H. ARHGEF9 disruption in a female patient is associated with X linked mental retardation and sensory hyperarousal // Journal of medical genetics. — 2008. — Vol. 45. — № 2. — pp. 100-105. 145. Martindale, J. L., Holbrook, N. J. Cellular response to oxidative stress: signaling for suicide and survival // Journal of cellular physiology. — 2002. — Vol. 192. — № 1. — pp. 1-15. 146. Mattson, M. P., Magnus, T. Ageing and neuronal vulnerability // Nature reviews. Neuroscience. — 2006. — Vol. 7. — № 4. — pp. 278-294. 147. Mayo, M. W., Baldwin, A. S. The transcription factor NF-kappaB: control of oncogenesis and cancer therapy resistance // Biochimica et biophysica acta. — 2000. — Vol. 1470. — № 2. — pp. M55-62. 148. Medema, R. H., Kops, G. J., Bos, J. L., Burgering, B. M. AFX-like Forkhead transcription factors mediate cell-cycle regulation by Ras and PKB through p27kip1 // Nature. — 2000. — Vol. 404. — № 6779. — pp. 782-787. 149. Meloche, S., Pouyssegur, J. The ERK1/2 mitogen-activated protein kinase pathway as a master regulator of the G1- to S-phase transition // Oncogene. — 2007. — Vol. 26. — № 22. — pp. 3227-3239. 150. Mendillo, M. L., Santagata, S., Koeva, M., Bell, G. W., Hu, R., Tamimi, R. M., Fraenkel, E., Ince, T. A., Whitesell, L., Lindquist, S. HSF1 drives a transcriptional program distinct from heat shock to support highly malignant human cancers // Cell. — 2012. — Vol. 150. — № 3. — pp. 549-562. 98 151. Mercer, K. E., Pritchard, C. A. Raf proteins and cancer: B-Raf is identified as a mutational target // Biochimica et biophysica acta. — 2003. — Vol. 1653. — № 1. — pp. 25-40. 152. Mercier, P. A., Winegarden, N. A., Westwood, J. T. Human heat shock factor 1 is predominantly a nuclear protein before and after heat stress // Journal of cell science. — 1999. — Vol. 112 ( Pt 16). — pp. 2765-2774. 153. Metchat, A., Akerfelt, M., Bierkamp, C., Delsinne, V., Sistonen, L., Alexandre, H., Christians, E. S. Mammalian heat shock factor 1 is essential for oocyte meiosis and directly regulates Hsp90alpha expression // The Journal of biological chemistry. — 2009. — Vol. 284. — № 14. — pp. 9521-9528. 154. Min, J. N., Huang, L., Zimonjic, D. B., Moskophidis, D., Mivechi, N. F. Selective suppression of lymphomas by functional loss of Hsf1 in a p53-deficient mouse model for spontaneous tumors // Oncogene. — 2007. — Vol. 26. — № 35. — pp. 5086-5097. 155. Mohideen, F., Capili, A. D., Bilimoria, P. M., Yamada, T., Bonni, A., Lima, C. D. A molecular basis for phosphorylation-dependent SUMO conjugation by the E2 UBC9 // Nature structural & molecular biology. — 2009. — Vol. 16. — № 9. — pp. 945-952. 156. Morimoto, R. I. Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators // Genes & development. — 1998. — Vol. 12. — № 24. — pp. 3788-3796. 157. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones // Molecular biology of the cell. — 2004. — Vol. 15. — № 2. — pp. 657-664. 158. Murshid, A., Chou, S. D., Prince, T., Zhang, Y., Bharti, A., Calderwood, S. K. Protein kinase A binds and activates heat shock factor 1 // PloS one. — 2010. — Vol. 5. — № 11. — p. e13830. 159. Nalca, A., Qiu, S. G., El-Guendy, N., Krishnan, S., Rangnekar, V. M. Oncogenic Ras sensitizes cells to apoptosis by Par-4 // The Journal of biological chemistry. — 1999. — Vol. 274. — № 42. — pp. 29976-29983. 160. Neef, D. W., Turski, M. L., Thiele, D. J. Modulation of heat shock transcription factor 1 as a therapeutic target for small molecule intervention in neurodegenerative disease // PLoS biology. — 2010. — Vol. 8. — № 1. — p. e1000291. 161. Neininger, A., Kontoyiannis, D., Kotlyarov, A., Winzen, R., Eckert, R., Volk, H. D., Holtmann, H., Kollias, G., Gaestel, M. MK2 targets AU-rich elements and regulates biosynthesis of tumor necrosis factor and interleukin-6 independently at different post- 99 transcriptional levels // The Journal of biological chemistry. — 2002. — Vol. 277. — № 5. — pp. 3065-3068. 162. Nguyen, C. H., Lang, B. J., Chai, R. C., Vieusseux, J. L., Kouspou, M. M., Price, J. T. Heat-shock factor 1 both positively and negatively affects cellular clonogenic growth depending on p53 status // The Biochemical journal. — 2013. — Vol. 452. — № 2. — pp. 321-329. 163. O'Callaghan-Sunol, C., Sherman, M. Y. Heat shock transcription factor (HSF1) plays a critical role in cell migration via maintaining MAP kinase signaling // Cell cycle. — 2006. — Vol. 5. — № 13. — pp. 1431-1437. 164. Panniers, R., Henshaw, E. C. Mechanism of inhibition of polypeptide chain initiation in heat-shocked Ehrlich ascites tumour cells // European journal of biochemistry / FEBS. — 1984. — Vol. 140. — № 1. — pp. 209-214. 165. Park, J., Liu, A. Y. JNK phosphorylates the HSF1 transcriptional activation domain: role of JNK in the regulation of the heat shock response // Journal of cellular biochemistry. — 2001. — Vol. 82. — № 2. — pp. 326-338. 166. Park, J. M., Werner, J., Kim, J. M., Lis, J. T., Kim, Y. J. Mediator, not holoenzyme, is directly recruited to the heat shock promoter by HSF upon heat shock // Molecular cell. — 2001. — Vol. 8. — № 1. — pp. 9-19. 167. Pearson, G., Robinson, F., Beers Gibson, T., Xu, B. E., Karandikar, M., Berman, K., Cobb, M. H. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions // Endocrine reviews. — 2001. — Vol. 22. — № 2. — pp. 153183. 168. Peng, W., Zhang, Y., Zheng, M., Cheng, H., Zhu, W., Cao, C. M., Xiao, R. P. Cardioprotection by CaMKII-deltaB is mediated by phosphorylation of heat shock factor 1 and subsequent expression of inducible heat shock protein 70 // Circulation research. — 2010. — Vol. 106. — № 1. — pp. 102-110. 169. Petesch, S. J., Lis, J. T. Rapid, transcription-independent loss of nucleosomes over a large chromatin domain at Hsp70 loci // Cell. — 2008. — Vol. 134. — № 1. — pp. 74-84. 170. Pirkkala, L., Nykanen, P., Sistonen, L. Roles of the heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond // FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. — 2001. — Vol. 15. — № 7. — pp. 1118-1131. 171. Pylayeva-Gupta, Y., Grabocka, E., Bar-Sagi, D. RAS oncogenes: weaving a tumorigenic web // Nature reviews. Cancer. — 2011. — Vol. 11. — № 11. — pp. 761-774. 100 172. Quilliam, L. A., Rebhun, J. F., Castro, A. F. A growing family of guanine nucleotide exchange factors is responsible for activation of Ras-family GTPases // Progress in nucleic acid research and molecular biology. — 2002. — Vol. 71. — pp. 391-444. 173. Rabindran, S. K., Haroun, R. I., Clos, J., Wisniewski, J., Wu, C. Regulation of heat shock factor trimer formation: role of a conserved leucine zipper // Science. — 1993. — Vol. 259. — № 5092. — pp. 230-234. 174. Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling // Cellular signalling. — 2012. — Vol. 24. — № 5. — pp. 981-990. 175. Recktenwald, C. V., Kellner, R., Lichtenfels, R., Seliger, B. Altered detoxification status and increased resistance to oxidative stress by K-ras transformation // Cancer research. — 2008. — Vol. 68. — № 24. — pp. 10086-10093. 176. Repasky, G. A., Chenette, E. J., Der, C. J. Renewing the conspiracy theory debate: does Raf function alone to mediate Ras oncogenesis? // Trends in cell biology. — 2004. — Vol. 14. — № 11. — pp. 639-647. 177. Richard, D. E., Berra, E., Gothie, E., Roux, D., Pouyssegur, J. p42/p44 mitogen-activated protein kinases phosphorylate hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) and enhance the transcriptional activity of HIF-1 // The Journal of biological chemistry. — 1999. — Vol. 274. — № 46. — pp. 32631-32637. 178. Riquelme, C., Barthel, K. K., Liu, X. SUMO-1 modification of MEF2A regulates its transcriptional activity // Journal of cellular and molecular medicine. — 2006. — Vol. 10. — № 1. — pp. 132-144. 179. Robles, A. I., Rodriguez-Puebla, M. L., Glick, A. B., Trempus, C., Hansen, L., Sicinski, P., Tennant, R. W., Weinberg, R. A., Yuspa, S. H., Conti, C. J. Reduced skin tumor development in cyclin D1-deficient mice highlights the oncogenic ras pathway in vivo // Genes & development. — 1998. — Vol. 12. — № 16. — pp. 2469-2474. 180. Rodriguez-Viciana, P., Sabatier, C., McCormick, F. Signaling specificity by Ras family GTPases is determined by the full spectrum of effectors they regulate // Molecular and cellular biology. — 2004. — Vol. 24. — № 11. — pp. 4943-4954. 181. Roper, E., Weinberg, W., Watt, F. M., Land, H. p19ARF-independent induction of p53 and cell cycle arrest by Raf in murine keratinocytes // EMBO reports. — 2001. — Vol. 2. — № 2. — pp. 145-150. 182. Roy, S., McPherson, R. A., Apolloni, A., Yan, J., Lane, A., Clyde-Smith, J., Hancock, J. F. 14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo // Molecular and cellular biology. — 1998. — Vol. 18. — № 7. — pp. 3947-3955. 101 183. Sa, G., Stacey, D. W. P27 expression is regulated by separate signaling pathways, downstream of Ras, in each cell cycle phase // Experimental cell research. — 2004. — Vol. 300. — № 2. — pp. 427-439. 184. Sahai, E., Marshall, C. J. RHO-GTPases and cancer // Nature reviews. Cancer. — 2002. — Vol. 2. — № 2. — pp. 133-142. 185. Sandqvist, A., Bjork, J. K., Akerfelt, M., Chitikova, Z., Grichine, A., Vourc'h, C., Jolly, C., Salminen, T. A., Nymalm, Y., Sistonen, L. Heterotrimerization of heat-shock factors 1 and 2 provides a transcriptional switch in response to distinct stimuli // Molecular biology of the cell. — 2009. — Vol. 20. — № 5. — pp. 1340-1347. 186. Sapetschnig, A., Rischitor, G., Braun, H., Doll, A., Schergaut, M., Melchior, F., Suske, G. Transcription factor Sp3 is silenced through SUMO modification by PIAS1 // The EMBO journal. — 2002. — Vol. 21. — № 19. — pp. 5206-5215. 187. Sawaoka, H., Kawano, S., Tsuji, S., Tsujii, M., Gunawan, E. S., Takei, Y., Nagano, K., Hori, M. Cyclooxygenase-2 inhibitors suppress the growth of gastric cancer xenografts via induction of apoptosis in nude mice // The American journal of physiology. — 1998. — Vol. 274. — № 6 Pt 1. — pp. G1061-1067. 188. Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells // Genes & development. — 2001. — Vol. 15. — № 8. — pp. 981-994. 189. Scita, G., Nordstrom, J., Carbone, R., Tenca, P., Giardina, G., Gutkind, S., Bjarnegard, M., Betsholtz, C., Di Fiore, P. P. EPS8 and E3B1 transduce signals from Ras to Rac // Nature. — 1999. — Vol. 401. — № 6750. — pp. 290-293. 190. Seigneurin-Berny, D., Verdel, A., Curtet, S., Lemercier, C., Garin, J., Rousseaux, S., Khochbin, S. Identification of components of the murine histone deacetylase 6 complex: link between acetylation and ubiquitination signaling pathways // Molecular and cellular biology. — 2001. — Vol. 21. — № 23. — pp. 8035-8044. 191. Seru, R., Mondola, P., Damiano, S., Svegliati, S., Agnese, S., Avvedimento, E. V., Santillo, M. HaRas activates the NADPH oxidase complex in human neuroblastoma cells via extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway // Journal of neurochemistry. — 2004. — Vol. 91. — № 3. — pp. 613-622. 192. Shamovsky, I., Ivannikov, M., Kandel, E. S., Gershon, D., Nudler, E. RNA-mediated response to heat shock in mammalian cells // Nature. — 2006. — Vol. 440. — № 7083. — pp. 556-560. 193. Shields, J. M., Pruitt, K., McFall, A., Shaub, A., Der, C. J. Understanding Ras: 'it ain't over 'til it's over' // Trends in cell biology. — 2000. — Vol. 10. — № 4. — pp. 147-154. 102 194. Simizu, S., Osada, H. Mutations in the Plk gene lead to instability of Plk protein in human tumour cell lines // Nature cell biology. — 2000. — Vol. 2. — № 11. — pp. 852-854. 195. Smakman, N., Borel Rinkes, I. H., Voest, E. E., Kranenburg, O. Control of colorectal metastasis formation by K-Ras // Biochimica et biophysica acta. — 2005. — Vol. 1756. — № 2. — pp. 103-114. 196. Solimini, N. L., Luo, J., Elledge, S. J. Non-oncogene addiction and the stress phenotype of cancer cells // Cell. — 2007. — Vol. 130. — № 6. — pp. 986-988. 197. Soncin, F., Zhang, X., Chu, B., Wang, X., Asea, A., Ann Stevenson, M., Sacks, D. B., Calderwood, S. K. Transcriptional activity and DNA binding of heat shock factor-1 involve phosphorylation on threonine 142 by CK2 // Biochemical and biophysical research communications. — 2003. — Vol. 303. — № 2. — pp. 700-706. 198. Sondermann, H., Soisson, S. M., Boykevisch, S., Yang, S. S., Bar-Sagi, D., Kuriyan, J. Structural analysis of autoinhibition in the Ras activator Son of sevenless // Cell. — 2004. — Vol. 119. — № 3. — pp. 393-405. 199. Sparmann, A., Bar-Sagi, D. Ras-induced interleukin-8 expression plays a critical role in tumor growth and angiogenesis // Cancer cell. — 2004. — Vol. 6. — № 5. — pp. 447458. 200. Stanhill, A., Levin, V., Hendel, A., Shachar, I., Kazanov, D., Arber, N., Kaminski, N., Engelberg, D. Ha-ras(val12) induces HSP70b transcription via the HSE/HSF1 system, but HSP70b expression is suppressed in Ha-ras(val12)-transformed cells // Oncogene. — 2006. — Vol. 25. — № 10. — pp. 1485-1495. 201. Stevenson, M. A., Zhao, M. J., Asea, A., Coleman, C. N., Calderwood, S. K. Salicylic acid and aspirin inhibit the activity of RSK2 kinase and repress RSK2-dependent transcription of cyclic AMP response element binding protein- and NF-kappa Bresponsive genes // Journal of immunology. — 1999. — Vol. 163. — № 10. — pp. 56085616. 202. Sullivan, E. K., Weirich, C. S., Guyon, J. R., Sif, S., Kingston, R. E. Transcriptional activation domains of human heat shock factor 1 recruit human SWI/SNF // Molecular and cellular biology. — 2001. — Vol. 21. — № 17. — pp. 5826-5837. 203. Takahashi, K., Kohno, T., Ajima, R., Sasaki, H., Minna, J. D., Fujiwara, T., Tanaka, N., Yokota, J. Homozygous deletion and reduced expression of the DOCK8 gene in human lung cancer // International journal of oncology. — 2006. — Vol. 28. — № 2. — pp. 321328. 103 204. Takahashi, T., Sano, B., Nagata, T., Kato, H., Sugiyama, Y., Kunieda, K., Kimura, M., Okano, Y., Saji, S. Polo-like kinase 1 (PLK1) is overexpressed in primary colorectal cancers // Cancer science. — 2003. — Vol. 94. — № 2. — pp. 148-152. 205. Takaki, E., Fujimoto, M., Sugahara, K., Nakahari, T., Yonemura, S., Tanaka, Y., Hayashida, N., Inouye, S., Takemoto, T., Yamashita, H., Nakai, A. Maintenance of olfactory neurogenesis requires HSF1, a major heat shock transcription factor in mice // The Journal of biological chemistry. — 2006. — Vol. 281. — № 8. — pp. 4931-4937. 206. Tang, D., Khaleque, M. A., Jones, E. L., Theriault, J. R., Li, C., Wong, W. H., Stevenson, M. A., Calderwood, S. K. Expression of heat shock proteins and heat shock protein messenger ribonucleic acid in human prostate carcinoma in vitro and in tumors in vivo // Cell stress & chaperones. — 2005. — Vol. 10. — № 1. — pp. 46-58. 207. Therrien, M., Wong, A. M., Kwan, E., Rubin, G. M. Functional analysis of CNK in RAS signaling // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1999. — Vol. 96. — № 23. — pp. 13259-13263. 208. Tokunaga, T., Tsuchida, T., Kijima, H., Okamoto, K., Oshika, Y., Sawa, N., Ohnishi, Y., Yamazaki, H., Miura, S., Ueyama, Y., Nakamura, M. Ribozyme-mediated inactivation of mutant K-ras oncogene in a colon cancer cell line // British journal of cancer. — 2000. — Vol. 83. — № 6. — pp. 833-839. 209. Trinklein, N. D., Murray, J. I., Hartman, S. J., Botstein, D., Myers, R. M. The role of heat shock transcription factor 1 in the genome-wide regulation of the mammalian heat shock response // Molecular biology of the cell. — 2004. — Vol. 15. — № 3. — pp. 1254-1261. 210. Velho, S., Oliveira, C., Ferreira, A., Ferreira, A. C., Suriano, G., Schwartz, S., Jr., Duval, A., Carneiro, F., Machado, J. C., Hamelin, R., Seruca, R. The prevalence of PIK3CA mutations in gastric and colon cancer // European journal of cancer. — 2005. — Vol. 41. — № 11. — pp. 1649-1654. 211. Vivanco, I., Sawyers, C. L. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer // Nature reviews. Cancer. — 2002. — Vol. 2. — № 7. — pp. 489-501. 212. Voellmy, R. On mechanisms that control heat shock transcription factor activity in metazoan cells // Cell stress & chaperones. — 2004. — Vol. 9. — № 2. — pp. 122-133. 213. Voellmy, R. Dominant-positive and dominant-negative heat shock factors // Methods. — 2005. — Vol. 35. — № 2. — pp. 199-207. 214. Volpert, O. V., Alani, R. M. Wiring the angiogenic switch: Ras, Myc, and Thrombospondin-1 // Cancer cell. — 2003. — Vol. 3. — № 3. — pp. 199-200. 104 215. Vujanac, M., Fenaroli, A., Zimarino, V. Constitutive nuclear import and stress-regulated nucleocytoplasmic shuttling of mammalian heat-shock factor 1 // Traffic. — 2005. — Vol. 6. — № 3. — pp. 214-229. 216. Wang, X., Asea, A., Xie, Y., Kabingu, E., Stevenson, M. A., Calderwood, S. K. RSK2 represses HSF1 activation during heat shock // Cell stress & chaperones. — 2000. — Vol. 5. — № 5. — pp. 432-437. 217. Wang, X., Grammatikakis, N., Siganou, A., Calderwood, S. K. Regulation of molecular chaperone gene transcription involves the serine phosphorylation, 14-3-3 epsilon binding, and cytoplasmic sequestration of heat shock factor 1 // Molecular and cellular biology. — 2003. — Vol. 23. — № 17. — pp. 6013-6026. 218. Wang, X., Grammatikakis, N., Siganou, A., Stevenson, M. A., Calderwood, S. K. Interactions between extracellular signal-regulated protein kinase 1, 14-3-3epsilon, and heat shock factor 1 during stress // The Journal of biological chemistry. — 2004. — Vol. 279. — № 47. — pp. 49460-49469. 219. Wang, X., Khaleque, M. A., Zhao, M. J., Zhong, R., Gaestel, M., Calderwood, S. K. Phosphorylation of HSF1 by MAPK-activated protein kinase 2 on serine 121, inhibits transcriptional activity and promotes HSP90 binding // The Journal of biological chemistry. — 2006. — Vol. 281. — № 2. — pp. 782-791. 220. Wang, Y., Kedei, N., Wang, M., Wang, Q. J., Huppler, A. R., Toth, A., Tran, R., Blumberg, P. M. Interaction between protein kinase Cmu and the vanilloid receptor type 1 // The Journal of biological chemistry. — 2004. — Vol. 279. — № 51. — pp. 5367453682. 221. Wang, Y., Theriault, J. R., He, H., Gong, J., Calderwood, S. K. Expression of a dominant negative heat shock factor-1 construct inhibits aneuploidy in prostate carcinoma cells // The Journal of biological chemistry. — 2004. — Vol. 279. — № 31. — pp. 32651-32659. 222. Waters, S. B., Holt, K. H., Ross, S. E., Syu, L. J., Guan, K. L., Saltiel, A. R., Koretzky, G. A., Pessin, J. E. Desensitization of Ras activation by a feedback disassociation of the SOS-Grb2 complex // The Journal of biological chemistry. — 1995. — Vol. 270. — № 36. — pp. 20883-20886. 223. Weickhardt, A. J., Tebbutt, N. C., Mariadason, J. M. Strategies for overcoming inherent and acquired resistance to EGFR inhibitors by targeting downstream effectors in the RAS/PI3K pathway // Current cancer drug targets. — 2010. — Vol. 10. — № 8. — pp. 824-833. 224. Weighardt, F., Cobianchi, F., Cartegni, L., Chiodi, I., Villa, A., Riva, S., Biamonti, G. A novel hnRNP protein (HAP/SAF-B) enters a subset of hnRNP complexes and relocates in 105 nuclear granules in response to heat shock // Journal of cell science. — 1999. — Vol. 112 ( Pt 10). — pp. 1465-1476. 225. Welch, W. J., Suhan, J. P. Morphological study of the mammalian stress response: characterization of changes in cytoplasmic organelles, cytoskeleton, and nucleoli, and appearance of intranuclear actin filaments in rat fibroblasts after heat-shock treatment // The Journal of cell biology. — 1985. — Vol. 101. — № 4. — pp. 1198-1211. 226. Wennerberg, K., Rossman, K. L., Der, C. J. The Ras superfamily at a glance // Journal of cell science. — 2005. — Vol. 118. — № Pt 5. — pp. 843-846. 227. Westerheide, S. D., Anckar, J., Stevens, S. M., Jr., Sistonen, L., Morimoto, R. I. Stressinducible regulation of heat shock factor 1 by the deacetylase SIRT1 // Science. — 2009. — Vol. 323. — № 5917. — pp. 1063-1066. 228. Westerheide, S. D., Morimoto, R. I. Heat shock response modulators as therapeutic tools for diseases of protein conformation // The Journal of biological chemistry. — 2005. — Vol. 280. — № 39. — pp. 33097-33100. 229. Westermarck, J., Li, S. P., Kallunki, T., Han, J., Kahari, V. M. p38 mitogen-activated protein kinase-dependent activation of protein phosphatases 1 and 2A inhibits MEK1 and MEK2 activity and collagenase 1 (MMP-1) gene expression // Molecular and cellular biology. — 2001. — Vol. 21. — № 7. — pp. 2373-2383. 230. Westwick, J. K., Cox, A. D., Der, C. J., Cobb, M. H., Hibi, M., Karin, M., Brenner, D. A. Oncogenic Ras activates c-Jun via a separate pathway from the activation of extracellular signal-regulated kinases // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1994. — Vol. 91. — № 13. — pp. 6030-6034. 231. Whitesell, L., Lindquist, S. Inhibiting the transcription factor HSF1 as an anticancer strategy // Expert opinion on therapeutic targets. — 2009. — Vol. 13. — № 4. — pp. 469478. 232. Woods, D., Cherwinski, H., Venetsanakos, E., Bhat, A., Gysin, S., Humbert, M., Bray, P. F., Saylor, V. L., McMahon, M. Induction of beta3-integrin gene expression by sustained activation of the Ras-regulated Raf-MEK-extracellular signal-regulated kinase signaling pathway // Molecular and cellular biology. — 2001. — Vol. 21. — № 9. — pp. 31923205. 233. Wu, L., Nam, Y. J., Kung, G., Crow, M. T., Kitsis, R. N. Induction of the apoptosis inhibitor ARC by Ras in human cancers // The Journal of biological chemistry. — 2010. — Vol. 285. — № 25. — pp. 19235-19245. 106 234. Xia, W., Voellmy, R., Spector, N. L. Sensitization of tumor cells to fas killing through overexpression of heat-shock transcription factor 1 // Journal of cellular physiology. — 2000. — Vol. 183. — № 3. — pp. 425-431. 235. Xiao, X., Zuo, X., Davis, A. A., McMillan, D. R., Curry, B. B., Richardson, J. A., Benjamin, I. J. HSF1 is required for extra-embryonic development, postnatal growth and protection during inflammatory responses in mice // The EMBO journal. — 1999. — Vol. 18. — № 21. — pp. 5943-5952. 236. Xing, H., Mayhew, C. N., Cullen, K. E., Park-Sarge, O. K., Sarge, K. D. HSF1 modulation of Hsp70 mRNA polyadenylation via interaction with symplekin // The Journal of biological chemistry. — 2004. — Vol. 279. — № 11. — pp. 10551-10555. 237. Xu, Y. M., Huang, D. Y., Chiu, J. F., Lau, A. T. Post-translational modification of human heat shock factors and their functions: a recent update by proteomic approach // Journal of proteome research. — 2012. — Vol. 11. — № 5. — pp. 2625-2634. 238. Yamamoto, N., Takemori, Y., Sakurai, M., Sugiyama, K., Sakurai, H. Differential recognition of heat shock elements by members of the heat shock transcription factor family // The FEBS journal. — 2009. — Vol. 276. — № 7. — pp. 1962-1974. 239. Zhang, R., He, X., Liu, W., Lu, M., Hsieh, J. T., Min, W. AIP1 mediates TNF-alphainduced ASK1 activation by facilitating dissociation of ASK1 from its inhibitor 14-3-3 // The Journal of clinical investigation. — 2003. — Vol. 111. — № 12. — pp. 1933-1943. 240. Zhang, Y., Xiong, Y., Yarbrough, W. G. ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor suppression pathways // Cell. — 1998. — Vol. 92. — № 6. — pp. 725-734. 241. Zhao, C., Du, G., Skowronek, K., Frohman, M. A., Bar-Sagi, D. Phospholipase D2generated phosphatidic acid couples EGFR stimulation to Ras activation by Sos // Nature cell biology. — 2007. — Vol. 9. — № 6. — pp. 706-712. 242. Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf // Genes & development. — 1998. — Vol. 12. — № 19. — pp. 2997-3007. 243. Zhu, W., Zou, Y., Aikawa, R., Harada, K., Kudoh, S., Uozumi, H., Hayashi, D., Gu, Y., Yamazaki, T., Nagai, R., Yazaki, Y., Komuro, I. MAPK superfamily plays an important role in daunomycin-induced apoptosis of cardiac myocytes // Circulation. — 1999. — Vol. 100. — № 20. — pp. 2100-2107. 107
