РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СИНТЕЗА ПСЕВДОПЕПТИДОВ И

БА Р А Н О В
Александр Владимирович
Р А З Р А БО ТК А
М ЕТО Д О В СИ Н ТЕЗ А
П СЕВД О П ЕП ТИ Д О В
И М О Н О М ЕР О В
П ЕП ТИ Д Н О - Н У К ЛЕИ Н О ВЫХ
К И СЛО Т
02.00.10
Биоорганическая химия
Псевдопептиды
1. Билдинг-блоки для создания различных структур.
2. Инструменты для исследования механизмов действия
ферментов.
Пептидно-нуклеиновые кислоты
1. НК-миметики.
2. Лиганды для аффинной хроматографии.
3. Потенциальные материалы для использования в
нанобиотехнологии.
2
Цель настоящего исследования
заключалась в синтезе псевдопептидов
и их производных:
COOtBu
COOBzl
Ns
H
N
CbzHN
COOMe
H
N
BocHN
COOAll
N
BocHN
COOAll
N
NsN
COOBzl
B
COOBzl
O
NR
B
O
O
N
N
H
COOBzl
R = Boc
Cbz
H
BocHN
N
B = Thy
CbzCyt
COOH
BocHN
N
B = Thy
CbzCyt
CbzAde
COOH
COOBzl
3
Основные задачи
1. Оптимизация подходов к созданию псевдопептидной
(ψ) связи между остатками различных по строению
аминокислот и синтез псевдопептида состава
ProGly-ψ-Pro.
2. Разработка и препаративный синтез новых
цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК
из псевдопептидов различного строения.
3. Подтверждение структуры тимин-, цитозини аденинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе
псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu.
4
Основные положения,
выносимые на защиту
1. Изучение восстановления производных дикарбоновых α-аминокислот.
2. Препаративный синтез псевдопептида ProGly-ψ-Pro.
3. Препаративный синтез двух новых цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на
основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu.
4. Оптимизация схемы синтеза двух тимин- и одного аденинсодержащего мономера
ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu.
5. Изучение региоселективности реакции алкилирования бромацилированными
псевдопептидами Gly-ψ-Glu и Glu-ψ-Gly тимина и защищенных цитозина и
аденина методами двумерной ЯМР-спектроскопии.
5
Способы создания восстановленной пептидной связи
NO2
1. Реакция Мицунобу
R1
ZHN
O
OH +
S O O
HN
OY
DEAD
PPh3
THF
R2
O
R1
2. Восстановительное
аминирование
ZHN
H + H2N
O
3. Селективное восстановление
уже имеющейся пептидной
связи
OY
PhSH
K2CO3
MeCN
R1
STAB
TEA
DCM
ZHN
R2
O
H
N
OY
R2
R1
O
H
N
ZHN
O
OY
[H]
R2
6
Изучение стадии восстановления защищенных
дикарбоновых аминокислот
поиск оптимального метода синтеза защищенных β-аминоспиртов
O
NMM
R1HN
1a-c
O
OH
IBCF
NMM
DME
–20°C
R2
4a-c
O
R1HN
BH3 THF
–78°C
R1HN
3a-c
OH
R2
NaBH4
H2O/MeOH
–10°C
R2
O
NH
O
O
O
R2
< 50%
R1HN
O
2a-c
R1
a
b
c
R2
1 3
Boc (CH2)2CO2Bzl 55%
CH2CO2Bzl 33%
Boc
Cbz (CH2)2CO2tBu 40%
1 2 3
90%
71%
83%
7
Синтез защищенного псевдопептида Glu-ψ-Gly
предшественника мономеров ОЗ ПНК
NsGlyOAll (4)
PPh3
DEAD
THF
COOBzl
3a
BocHN
OH
COOBzl
65%
BocHN
Y
N
5 Y = Ns
COOAll
6Y=H
PhSH
K2CO3
CH3CN
67%
8
Синтез защищенного псевдопептида Gly-ψ-Glu
предшественника мономеров ОЗ ПНК
BocHN
COOH
AllBr
Cs2CO3
DMF
BocHN
COOAll
∼100%
7
COOBzl
BocHN
PhSH
K2CO3
CH3CN
62%
8
COOBzl
Y
N
COOAll
TFA
DCM
72%
1a
TFA H2N
NsCl
TEA
DCM
75%
Ns
(10)
COOAll BocHN(CH2)2OHPPh
HN
COOBzl
COOAll
3
DEAD
THF
11 Y = Ns
80%
COOBzl
9
COOBzl
12 Y = H
9
Синтез полностью защищенного псевдопептида
Glu-ψ-His
HisOMe
NsCl
TEA
DCM
0°C
Ns
HN
COOMe
92%
CbzGlu(OtBu)-ol (3c)
PPh3
DEAD
THF
COOtBu
Ns
N
30%
13
N
14
NsN
CbzHN
COOMe
15
N
NsN
10
Синтез защищенного псевдопептида ProGly-ψ-Pro
H2N
OH
16
Boc2O
H 2O
BocHN
81%
17
OH
N
OH
BocHN
21
BocHN
COOBzl
59% (23a)
54% (23b)
20
COOBzl
18
ProOBzl (19)
STAB
TEA, DCM
75%
N
NR
N
N
O
O
RPro 22a R = Boc
22b R = Cbz
PivCl, TEA, CH3CN
TEA
78%
TFA
DCM
∼100%
× 2TFA
H2N
OH
KIO4
H2O
N
H 23a R = Boc
23b R = Cbz
COOBzl
24a R = H (× 2TFA)
(R = Boc)
TFA
DCM
∼100%
– BzlOH
O
N
H 25
11
Два метода получения мономеров ПНК
первоначально разработаны для синтеза незаряженных ПНК
B
O
B
OH
Hal
Hal
O
R1
ZHN
R1
H
N
X
COOY
ZHN
R2
ZHN
Nielsen, 1991
N
COOY
R2
B
R1
O
O
N
COOY
R2
Meltzer, 1995
12
Синтез производных нуклеиновых оснований
A
Thy
ClCH2COOH
KOH
H2O
40°C
O
NH
Cyt
70%
27a
NHCbz BrCH2COOEt NHCbz
B
N
CbzCl
Py
N
O
H 27b
OH
NH2
2
N
73%
N
DCM/DMF
0°C
37
N
35 Y = Et
OY
28b Y = H
N
38
O
NHCbz
NaOH
H 2O
66%
N
N
O
O
NHCbz
CbzOIm+EtBF4–
35%
N
O
N
NaOH (aq.)
87%
C BrCH COOEt
N
75%
28a
O
NaH
DMF
N
34
O
NaH
DMF
40%
N
N
N
N
28c
O
N
Ade
OEt
36
CbzCl
NaH
DMF
26%
NHCbz
N
N
N
H 27c
OEt
OH
N
a
b
c
Base
27
28
Thy
Cyt
Ade
—
75%
26%
70%
26%
17%
13
Синтез мономеров ОЗ ПНК
на основе псевдопептида Glu-ψ-Gly
COOBzl
BocHN
COOBzl
H
N
COOAll
O
BrCH2COBr
TEA
DCM
78%
Br
BocHN
6
N
COOAll
26
BCH2CO2H
(28a,b)
IBCF
NMM, TEA
DMF
–20°C
O
a
b
Thy
CbzCyt
6 29 26 29 6 26 29
56%
—
56%
39%
43%
30%
K2CO3
DMF
N
BocHN
B
B
(27a,b)
B
COOBzl
COOY
30
29a,b Y = All
99%
92%
30a,b Y = H
[Pd(PPh3)4]
morpholine
THF
14
Синтез мономеров ОЗ ПНК
на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu
Br
H
N
BocHN
COOAll
O
BrCH2COBr
TEA
DCM
86%
BocHN
12
BCH2CO2H
(28a-c)
COOBzl
N
BocHN
a
b
c
COOBzl
B
O
12 32
Thy
CbzCyt
CbzAde
64%
10%
26%
COOAll
31
IBCF
NMM, TEA
DMF
–20°C
B
N
COOY
B (27a-c)
K2CO3 (27a)
NaH (27b)
K2CO3/Cs2CO3 (27c)
DMF
31 32 12 31 32 33
91%
60%
41%
78%
52%
35%
45%
47%
53%
32a-c Y = All
COOBzl
33a-c Y = H
[Pd(PPh3)4]
morpholine
THF
15
Конкурирующие процессы
в ходе реакции алкилирования
O
проблема идентификации изомеров
NH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
NH
N
N
H
N
H
O
O
O
O
O
HN
N
O N-1 vs. N-3
Cyt
O
N
N
N
H
N
O
O
O
HN
O
N
N
H
O N-1 vs. N-3
Thy
N
H
O
Br
O
O
N
N
H
O
O
O
NH
O
O
O
O
N
N
N-9 vs. N-7
Ade
16
Ключевые корреляции для тиминсодержащего
мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu
O
28
H3C
29
27
28
NH
N
O
25
24
6
HN
7
8
N
26
N
31
O
O
O
13
9
10
O
11
12
+
C25–H26
C26–H25
C31–H25
–
C29–H25
19
16
3
24
15
4
1
30
N
H
O
14
O
29
27
5
O
25
H3C
30
31
26
O
O
O
17
18
20
2
23
21
22
17
26
25
25
26
Thy[Gly-ψ-Glu] COSY-спектр
18
25
26
25
26
Thy[Gly-ψ-Glu] HSQC-спектр
19
26
25
25
27
26
31
29
Thy[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр
20
26
25
25
27
26
31
29
Thy[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр
20
Ключевые корреляции для цитозинсодержащего
мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu
O
30
HN
O
34
34
31
O
32
33
35
28
N
27
N
O
25
24
HN
7
8
37
N
25
38
27
37
24
N
29
N
O
O
O
10
O
11
12
+
C25–H26
C26–H25
C29–H25
–
C28–H25
15
19
16
3
NH
28
36
O
13
9
30
14
O
4
1
O
31
26
5
O
32
29
26
6
36
38
33
35
O
O
17
18
20
2
23
21
22
21
25
26
27
25
27
26
29
28
Cyt[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр
22
25
26
27
25
27
26
29
28
Cyt[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр
22
Ключевые корреляции для цитозинсодержащего
мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Glu-ψ-Gly
O
30
HN
34
34
31
O
32
33
35
28
20
21
19
27
22
18
26
23
O
O
O
N
N
O
15
14
6
HN
7
5
O
O
O
O
N
9
10
31
30
NH
25
28
36
38
24
N
27
37
29
26
O
25
24
8
37
32
29
16
17
36
38
33
35
N
O
O
13
O
11
12
+
C25–H26
C26–H25
C29–H25
–
C28–H25
4
3
1
2
23
26
27
25
25
27
26
29
28
Cyt[Glu-ψ-Gly] HMBC-спектр
24
26
27
25
25
27
26
29
28
Cyt[Glu-ψ-Gly] HMBC-спектр
24
Ключевые корреляции для аденинсодержащего
мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu
O
31
HN
N
26
25
HN
7
8
N
32
O
27
N
31
O
N
37
26
32
O
33
34
36
39
37
28
N
27
38
30
N
29
HN
25
35
N
29
O
10
O
11
12
+
C25–H26
C26–H25
C30–H25
–
C27–H25
15
19
16
3
24
14
O
4
1
36
38
13
9
34
39
N
5
O
33
30
24
6
35
28
N
O
O
O
O
17
18
20
2
23
21
22
25
26
25
25
27
26
30
Ade[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр
26
26
25
25
27
26
30
Ade[Gly-ψ-Glu] HMBC-спектр
26
Выводы
1. Разработан новый метод восстановления дикарбоновых α-аминокислот.
2. Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида
ProGly-ψ-Pro.
3. Впервые осуществлен синтез двух цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК
на основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu.
4. Проведена оптимизация схемы синтеза полученных ранее двух тиминсодержащих
мономеров ОЗ ПНК на основе псевдопептидов Glu-ψ-Gly и Gly-ψ-Glu и одного
аденинсодержащего мономера ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu.
5. Проведен анализ структуры полученных по разработанной в ходе настоящей
работы схеме тимин-, цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК на основе
псевдопептидов Gly-ψ-Glu и Glu-ψ-Gly, а также аденинсодержащего мономера
ОЗ ПНК на основе псевдопептида Gly-ψ-Glu с помощью методов двумерной ЯМРспектроскопии, который показал однозначность структуры выделенных продуктов
реакции алкилирования гетероциклических нуклеиновых оснований
бромацильными производными защищенных псевдопептидов Glu-ψ-Gly и
Gly-ψ-Glu.
27
Публикации
1. Баранов А. В., Прохоров Д. И., Боярская Н. П., Кириллова Ю. Г.
Синтез нового аналога пептида ProGlyPro.
Вестник МИТХТ. — 2006. — Том 1, № 6. — с. 77–80.
2. Баранов А. В., Цвид Н. С., Лукьянченко В. И., Прохоров Д. И., Кириллова Ю. Г., Швец В. И.
Исследование путей синтеза цитозинового мономера отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых
кислот.
Вестник МИТХТ. — 2007. — Том 2, № 5. — с. 28–32.
3. Боярская Н. П., Прохоров Д. И., Баранов А. В.
Разработка универсального подхода к синтезу мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых
кислот.
III Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. —
2005. — Ч. 1. — С. 142–143.
4. Баранов А. В., Льянов М. А., Лукьянченко В. И., Прохоров Д. И.
Синтез хиральных мономеров пептидно-нуклеиновых кислот.
II Молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии».
Москва. — 2007. — Т. 1. — С. 34.
5. Баранов А. В., Кириллова Ю. Г.
Синтез псевдопептидных фрагментов для получения негидролизуемых аналогов физиологически активного
пептида СЕМАКС.
Третий съезд общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова. Москва. — 2005. — С. 31–32.
28
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!