На правах рукописи Сухорукова Елена Геннадьевна
advertisement
На правах рукописи Сухорукова Елена Геннадьевна СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ АСТРОЦИТОВ НЕОКОРТЕКСА КРЫСЫ И ЧЕЛОВЕКА, СОДЕРЖАЩИХ ГЛИАЛЬНЫЙ ФИБРИЛЛЯРНЫЙ КИСЛЫЙ БЕЛОК 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Отделе общей и частной морфологии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН Научный руководитель: доктор медицинских наук Коржевский Дмитрий Эдуардович Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Быков Владимир Лазаревич Доктор медицинских наук, профессор Гололобов Валерий Григорьевич Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная И.И.Мечникова медицинская академия им. Защита диссертации состоится «___» июня 2011 г. в ___часов на заседании диссертационного совета Д 001.022.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН (Адрес: 197376, СанктПетербург, ул. акад. Павлова, 12) С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12 Автореферат разослан «___» мая 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук П.А. Дыбан ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) является одним из главных иммуноцитохимических маркеров астроцитов – важнейшего представителя макроглии в центральной нервной системе млекопитающих. В качестве маркера астроцитов он широко применяется в диагностических целях и в экспериментальных работах при исследовании функций нервной системы в норме и при патологии [Калиниченко С.Г. и др., 2004; Zhu, Dahlström, 2007; Paulus, 2009]. Постоянно возрастающее число работ, посвященных астроцитам, связано с многообразием функций, которые, как установлено за последние два десятилетия, выполняют в центральной нервной системе эти клетки. Одной из ключевых и наиболее исследуемых функций астроцитов является их участие в организации и регуляции проницаемости барьерной системы мозга (гематоэнцефалического и ликвороэнцефалического барьеров) [Abbott, 2002; Engelhardt, Sorokin, 2009; Li et al., 2010]. Известно, что именно накопление GFAP связано с обеспечением астроцитами барьерных функций [Pekny, 2001; Ribotta et al., 2004]. Среди анатомических зон локализации барьеров головного мозга наружная поверхность занимает особое место. Во всех областях большого мозга она образована I слоем коры, который формируется раньше других кортикальных слоев [Федосихина Л.А., 1984; Хожай Л.И., Отеллин В.А., 1999; Bystron et al., 2008] и играет ключевую роль в становлении характерной цитоархитектоники всего неокортекса [Marin-Padilla, 1992]. Кроме того, этот слой служит коллектором афферентных волокон кортикального и экстракортикального происхождения [Marin-Padilla, 1990; Отеллин В.А., Коржевский Д.Э., 2002]. Важнейшим элементом первого слоя коры, обеспечивающим поддержание целостности ликвороэнцефалического барьера (ЛЭБ), является поверхностная глиальная пограничная мембрана (ПГПМ), организация которой у различных животных и человека в разных областях неокортекса остается не до конца выясненной. Немаловажной проблемой, которая имеет отношение к оценке морфологических изменений астроцитов при реакции на повреждающие воздействия, является проблема правильной классификации их особых форм, обнаруживаемых в головном мозге различных животных и человека [Colombo, Reisin, 2004; Коржевский Д.Э., Отеллин В.А., Григорьев И.П., 2004; Oberheim et 3 al., 2006]. Эти клетки не всегда могут быть однозначно определены как протоплазматические или фиброзные (волокнистые), выделяемые современной гистологической номенклатурой [Банин В.В., Быков В.Л., 2009]. Без четкой классификации форм астроцитов, наблюдаемых в норме, и отсутствии знаний о том, в какой мере они сопоставимы у животных и человека, существенно снижается диагностическая ценность показателей, связанных с учетом морфологии астроцитов в клинико-патологических и экспериментальных исследованиях. До недавнего времени предполагалось, что морфологические характеристики астроцитов у человека и лабораторных животных не имеют существенных различий. Однако отдельные исследования [Colombo et al., 2000; Oberheim et al., 2009] свидетельствуют о наличии видовых особенностей структурной организации астроцитов коры у грызунов и приматов. Кроме того, остаются неизученными и региональные особенности астроцитов. Принимая во внимание противоречивые данные о строении астроцитов неокортекса млекопитающих, представляется актуальным проведение сравнительного исследования структурной и цитохимической организации астроцитов человека и крыс, наиболее часто используемых в экспериментальных исследованиях, связанных с моделированием заболеваний и повреждений головного мозга, характерных для человека. Цель и задачи исследования Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение структурной и цитохимической организации GFAP-иммунопозитивных астроцитов коры головного мозга крысы и человека. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: 1. Разработать унифицированный протокол выявления астроцитов, позволяющий получать сопоставимые результаты при постановке реакции на срезах головного мозга крысы и человека, а также проводить трехмерную реконструкцию. 2. Исследовать распределение и структурную организацию GFAPиммунопозитивных астроцитов в коре головного мозга крысы. 3. Исследовать распределение и структурную организацию GFAPиммунопозитивных астроцитов в коре головного мозга человека. 4 4. Провести сравнительный анализ особенностей структурной и цитохимической организации астроцитов коры головного мозга у крысы и у человека. 5. Изучить изменения структурной организации астроцитов неокортекса при механической травме головного мозга у человека. Научная новизна. Впервые проведено систематическое иммуноцитохимическое исследование астроцитов, содержащих GFAP, у крысы и человека. Показано, что не все клетки с морфологическими и цитохимическими признаками астроцитов содержат GFAP в концентрациях, обеспечивающих его иммуноцитохимическое определение. В работе выделены и охарактеризованы неизвестные ранее формы GFAP-иммунопозитивных астроцитов коры головного мозга крысы и человека, установлены сходство и различия в их структурной и цитохимической организации. Установлена возрастная зависимость накопления GFAP в астроцитах средних слоев неокортекса человека. Благодаря применению конфокальной лазерной микроскопии и возможности создания трехмерных реконструкций, установлен факт локализации амилоидных телец внутри отростков астроцитов. Показано, что у человека в условиях повреждения головного мозга наблюдается активация астроцитов, содержащих GFAP, как в области барьеров мозга, так и локально, в поврежденных участках неокортекса. Детально описаны преобразования астроцитов при механической травме головного мозга человека. Теоретическое и практическое значение исследования. Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований в области гистологии и нейроморфологии. Полученные данные о сходстве и различиях структурной организации гемато- и ликвороэнцефалического барьеров коры большого мозга человека и крысы позволят оценить адекватность экспериментального моделирования патологических состояний, связанных с повреждением барьерной системы головного мозга. Данные о возрастных изменениях астроцитов коры головного мозга человека могут быть использованы при создании новых экспериментальных моделей хронических нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, результаты исследования могут служить основой для разработки новых подходов, применяемых в судебномедицинской диагностике повреждений головного мозга. Разработанный в 5 рамках настоящего исследования протокол выявления GFAPиммунопозитивных астроцитов рекомендован для использования в диагностических целях (методическое пособие: «Особенности судебногистологического исследования головного мозга при смерти от тупой травмы головы», СПбМАПО, 2011). Основные положения, выносимые на защиту 1. У крысы GFAP определяется в астроцитах различных слоев коры, наиболее интенсивная реакция на этот белок промежуточных филаментов проявляется в астроцитах поверхностной части I слоя и субкортикального белого вещества. Для неокортекса крысы характерны следующие морфологические типы астроцитов: уплощенные астроциты, расположенные на поверхности коры, формирующие поверхностную глиальную пограничную мембрану, вариантом которых являются полигональные астроциты поверхностной части первого слоя базальной области коры; типичные звездчатые астроциты; веретеновидные астроциты субкортикального белого вещества. 2. У человека GFAP определяется в астроцитах различных слоев коры, наиболее интенсивная реакция на этот белок промежуточных филаментов проявляется в астроцитах I и VI слоев и субкортикального белого вещества. Для неокортекса человека характерны следующие морфологические типы астроцитов: два морфологических типа астроцитов I слоя (астроциты, формирующие своими отростками ПГПМ и трансламинарные астроциты), типичные протоплазматические астроциты, инвертированные трансламинарные астроциты VI слоя с длинными неветвящимися отростками, типичные фиброзные астроциты субкортикального белого вещества. С возрастом у человека наблюдается повышение иммунореактивности астроцитов III-V слоев коры. 3. Во всех исследованных областях неокортекса у крысы ПГПМ сформирована телами астроцитов, лежащих в один или несколько слоев, в части которых в области основания мозга имеется ассоциация GFAP с виментином. У человека ПГПМ образована сплетением тонких отростков астроцитов, тела которых лежат в глубоких отделах I слоя. 4. Структурная организация астроцитов при травме головного мозга существенно изменяется, в составе белков промежуточных филаментов 6 астроцитов появляется нестин. Количество GFAP-иммунореактивных астроцитов увеличивается, изменяется их распределение в слоях коры, наблюдается скопление измененных астроцитов на границе повреждения и отграничение ими травматического очага. Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (14 мая 2009г., Санкт-Петербург), III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2009» (2-4 декабря 2009 г., Санкт-Петербург), VI Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (5-15 июня 2010г., Судак, Украина), Петербургском научном обществе судебных медиков (636-е пленарное заседание, 20 октября 2010г., Санкт-Петербург), VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (11-12 ноября 2010 г., Москва). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК и 5 работ в сборниках трудов научнопрактических конференций. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 стр. машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 5 таблицами. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Материалом для исследования служил головной мозг половозрелых крыссамцов линии Вистар (n=40) и фрагменты коры большого мозга 83 человек в возрасте от 20 до 89 лет, полученные при плановой аутопсии. Часть фрагментов (16) была взята от трупов людей, получивших тупую травму головы различной давности (от 1 суток до 1,5 месяцев). Для удобства сравнительного анализа образцы головного мозга человека были разделены на 5 возрастных групп: I – 20-29 лет, II – 30-39 лет, III – 40-49 лет, IV – 50-59 лет, V – 60 лет и старше. Материал фиксировали 10% нейтральным формалином, этанолформальдегидом или цинк-этанол-формальдегидом, обезвоживали стандартным способом и заливали в парафин. Изготавливали срезы толщиной 7 7-8 мкм, 15-25 мкм и 100-300 мкм. Для обзорного исследования срезов использовали окраску по методу Ниссля раствором толуидинового синего и ШИК-реакцию (с подкраской гематоксилином). Иммуноцитохимически выявляли типоспецифические маркеры разных клеток: GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) – маркер астроглии (антитела фирм Dako (Дания), Spring Bioscience и Biocare Medical (США)); виментин – маркер радиальной глии и эпендимоцитов, который может экспрессироваться активированной астроглией (антитела фирм Dako (Дания) и Spring Bioscience (США)); нестин – маркер нейральных стволовых клеток, экспрессируется активированной астроглией (антитела фирм BD Pharmingen и Chemicon (США)); S-100 – экспрессируется глиальными клетками ЦНС (антитела фирмы Dako (Дания)); NeuN – маркер ядер зрелых нейронов (Dako (Дания)); Iba-1 – маркер микроглии и макрофагов (AbCam (Великобритания)). Для флюоресцентного выявления связавшихся первичных антител использовали конъюгаты BODIPY-FL, TRITC, FITC, QuantumDot 605 и QuantumDot 525 и красители Hoechst 33342, SYTOX Green, пропидия йодид (PI), Neuro Trace 633 (для подкраски ядер) фирм Dako (Дания), Invitrogen (США) и Chemicon (США). Изучение препаратов проводили с помощью световых (Leica DM750, Leica DM1000 и Leica DM2500 (Leica, Германия)), флюоресцентного (Axioplan 2 (Zeiss, Германия)) и конфокального лазерного (LSM 510 Meta (Zeiss, Германия)) микроскопов. Обработку изображений и трехмерную реконструкцию объектов проводили с применением компьютерных программ, входящих в пакет 3D-for LSM и LSM Image Browser (Zeiss, Германия). Измерения производили в компьютерных программах ImageJ 1.38 (NIH, США), LAS EZ (Leica, Германия) и LSM Image Browser (Zeiss, Германия). Полученные количественные данные обрабатывали с помощью программы Statistica (Stat Soft Inc., США). Для сравнения показателей использовали tкритерий (Стъюдента), различия считали значимыми при p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Проведенное исследование показало, что наибольшая иммунореактивность на GFAP свойственна клеткам коры головного мозга, участвующим в формировании ПГПМ. Причем эта закономерность характерна 8 как для крысы, так и для человека. Тем не менее, организация этой структуры у крысы и человека различается. У грызунов (мышей и крыс) ранее [Oberheim et al., 2009] определяли только протоплазматические и фиброзные астроциты. В противоположность этому, наши данные свидетельствуют, что в неокортексе у крысы имеются особые поверхностные астроциты, среди которых можно выделить несколько вариантов. У крысы на конвекситальной поверхности мозга, в теменной области коры, ПГПМ представлена монослоем вытянутых (распластанных) вдоль поверхности GFAP-иммунопозитивных астроцитов, соединенных широколопастными отростками. От этих астроцитов в подлежащую нервную ткань отходит небольшое число относительно длинных (некоторые из них длиной до 70 мкм), волнистых (максимальная амплитуда волны до 3 мкм) неветвящихся отростков толщиной 0,7-1 мкм (рис. 1). Рис. 1. Трехмерная реконструкция астроцитов первого слоя теменной области коры головного мозга крысы. Стрелками отмечены отростки поверхностных астроцитов, оплетающие кровеносный сосуд. Об – область расположения мозговых оболочек. Иммуноцитохимическая реакция на глиальный фибриллярный кислый белок – зеленый цвет, ядра клеток – синий цвет. Конфокальная лазерная микроскопия. Объектив 63х. 9 На медиальной поверхности мозга, в поясной области коры, ПГПМ, представляет собой также монослой, но уже из астроцитов клиновидной формы. Широкое основание клетки обращено в сторону поверхности, а верхушка продолжается вглубь нервной ткани в виде толстого сужающегося (от 2,5 до 0,5 мкм), иногда разветвляющегося отростка, в перпендикулярном к поверхности направлении. По мере приближения к базальной поверхности мозга наблюдается утолщение ПГПМ. Она образована уже несколькими рядами уплощенных астроцитов, плотно прилежащих друг к другу. В области цистерн основания мозга и расположенных рядом кровеносных сосудов оболочки, крупные поверхностные астроциты также располагаются в несколько рядов, имеют сложную полигональную форму и короткие, толстые (около 4 мкм в диаметре), переплетенные отростки (рис. 2). Рис. 2. Трехмерная реконструкция астроцитов первого слоя базальной области коры головного мозга крысы. Об – область расположения мозговых оболочек. Иммуноцитохимическая реакция на глиальный фибриллярный кислый белок – зеленый цвет, ядра клеток – синий цвет. Конфокальная лазерная микроскопия. Объектив 63х. 10 Проведенные измерения показали, что у крысы толщина ПГПМ неодинакова (p<0,05) в разных областях головного мозга и составляет 7,0±0,5 мкм в теменной области, 5,1±0,2 мкм в поясной области и 27,2±2,1 мкм на базальной поверхности. В противоположность этому толщина ПГПМ у человека в различных отделах неокортекса не имеет значимых различий (p>0,05). В настоящем исследовании показано, что помимо GFAP в поверхностных клетках коры может обнаруживаться только виментин, причем в незначительном количестве. Такой состав белков промежуточных филаментов не характерен ни для эпендимы, ни для клеток радиальной глии [Kálmán, Ajtai, 2001; Shin et al., 2003; Гиляров А.В., 2007], но вполне укладывается в характеристику астроцитов. Так, при иммуноцитохимическом выявлении виментина положительная реакция наблюдалась в области основания мозга в части поверхностных астроцитов, формирующих ПГПМ. Этот факт является весьма интересным, поскольку виментин – белок, характерный для незрелых клеток. Можно было бы предположить, что выявленные астроциты обладают свойствами прогениторных клеток (по аналогии с нейрогенными астроцитами субвентрикулярной зоны [Kriegstein, Alvarez-Buylla, 2009; Коржевский Д.Э., 2010]). Однако нам кажется, что отсутствие в обнаруженных клетках нестина – белка промежуточных филаментов, свойственного нейральным стволовым клеткам [Lendahl et al., 1990; Johansson et al., 2002; ГиляровА.В., 2007], свидетельствует против возможности участия астроцитов базальных областей мозга в нейрогенезе. Выявленные региональные особенности в организации ПГПМ у крысы, по нашему мнению, обусловлены различиями в функциональных характеристиках ликвороэнцефалического барьера в разных областях головного мозга. Не исключено, что эти региональные особенности могут быть связаны и с различиями в функциональной специализации нервных структур I слоя коры. В коре головного мозга крысы, кроме типичных звездчатых астроцитов, которые характерны для средних и глубоких слоев, обнаружены атипичные веретеновидные астроциты, расположенные в субкортикальном белом веществе, которые ранее принимались за обычные фиброзные астроциты [Oberheim et al., 2009]. Только с применением современных походов, 11 обеспечивших успешное проведение трехмерной реконструкции, появилась возможность определить их сложную форму. В I слое неокортекса человека нами было определено два варианта астроцитов. Астроциты I слоя располагаются в 3-4 ряда. Как правило, они имеют типичную звездчатую форму, но по строению отростков они различаются. Общим признаком отростков различных астроцитов первого слоя можно считать отсутствие характерного для протоплазматических астроцитов густого ветвления. Часть этих отростков направлена в сторону поверхности мозга, где они образуют сплетение, составляющее поверхностную глиальную пограничную мембрану (ПГПМ) (рис. 3). Измерения толщины этой мембраны показали, что с возрастом имеется тенденция к ее увеличению (коэффициент корреляции (r) = 0,97, p<0,05). Рис. 3. Участок теменной коры головного мозга человека. Возрастная группа – III. Об – область расположения мозговых оболочек. Стрелки направлены в сторону поверхностной глиальной пограничной мембраны. Уровень прерывистой линии соответствует границе между первым и вторым слоями коры. Врезка: фрагмент второго слоя коры с трансламинарными отростками. Иммуноцитохимическая реакция на глиальный фибриллярный кислый белок. Конфокальная лазерная микроскопия. Результат проекции на плоскость 23 оптических срезов (величина Z-серии – 11 мкм). Инвертированное изображение. Объектив 20х, 40х (врезка). 12 Трехмерные реконструкции клеток формирующих ПГПМ у человека и присутствие в их перинуклеарной цитоплазме и отростках GFAP однозначно свидетельствуют о том, что это астроциты, но астроциты атипичные. Они не похожи на клетки, представленные на графической реконструкции Р.Крстича (2001). Главное отличие их состоит в чрезвычайно сложном переплетении тонких, как правило, неветвящихся отростков вблизи поверхности коры и отсутствие регулярного расположения расширений их пиальных отростков по типу «булыжной мостовой». Существенный вопрос, относящийся к организации ПГПМ, состоит в неопределенности причин накопления в поверхностных астроцитах максимального количества GFAP. Известно, что этот белок необходим для обеспечения стабильной морфологии тел и отростков астроцитов [Eng, 1985; Lepekhin, 2001], формирования нормальной архитектоники нервной ткани, поддержания целостности гемато- и ликвороэнцефалического барьеров. Этот белок участвует в модуляции движения астроцитов, регуляции их объема [Ding et al., 1998], играет существенную роль в нейроно-глиальных взаимодействиях [McCall et al., 1996]. Поскольку ПГПМ – это барьерная структура, наиболее вероятно, что в поверхностных астроцитах роль GFAP состоит именно в поддержании целостности ЛЭБ и участии этого белка в формировании «барьерного» фенотипа астроцитов. Среди астроцитов первого слоя коры мозга человека определенный интерес представляет их второй вариант – трансламинарные астроциты, отростки которых пронизывают несколько слоев коры. Согласно имеющимся данным эти клетки встречаются только у человека и приматов [Colombo, Reisin, 2004; Oberheim et al., 2006]. Несмотря на то, что эти астроциты были описаны еще в 1995 году [Colombo et al., 1995], функциональное значение их остается неясным. В настоящем исследовании, благодаря использованию конфокальной микроскопии, удалось получить новые данные об особенностях строения их отростков. Так, было обнаружено, что наряду с волнистыми трансламинарными отростками существуют и горизонтальные (и близкие к горизонтальным) отростки астроцитов, проходящие в пределах I-II слоев коры. Учитывая важную роль, которая отводится астроцитам в восприятии и передаче информации в ЦНС [Fellin, Carmignoto, 2004], можно предположить, что 13 длинноотростчатые (трансламинарные) астроциты обеспечивают интеграцию клеток различных слоев и участков неокортекса. В средних и глубоких слоях неокортекса (III-V) GFAP-позитивные астроциты организованы в основном по типу протоплазматических, часть их многочисленных густо ветвящихся, извитых и одинаковых по толщине (1-2 мкм) отростков длиной до 60 мкм участвует в формировании периваскулярной глиальной пограничной мембраны. У части астроцитов этих слоев реакция на GFAP обнаруживалась только в перинуклеарной зоне и в начальных сегментах отростков. В VI слое коры, на границе с субкортикальным белым веществом расположены астроциты, от которых в сторону V слоя коры отходят отростки, схожие по морфологическим признакам с трансламинарными (по толщине, преимущественному направлению и амплитуде волнистости). Сходные клетки недавно были обнаружены у человека в биопсийном материале и обозначены как «астроциты с варикозно - расширенными отростками» [Oberheim et al., 2009]. По нашему мнению, эти расширения не являются постоянной морфологической характеристикой отростков астроцитов глубоких слоев неокортекса. В представленном нами материале у лиц, погибших от причин, не связанных с воздействием повреждающих факторов на головной мозг, подобные варикозности отсутствовали. В противоположность этому, материал, использованный группой американских исследователей [Oberheim et al., 2009], представлял собой фрагменты мозга, удаленные при проведении хирургических вмешательств, выполненных по поводу эпилепсии и новообразований. Поскольку, взятые для исследования ткани находились вблизи патологического очага, можно полагать, что присутствие варикозностей (четкообразных утолщений) в отростках астроцитов отражает реактивные изменения астроглии в ответ на развивающийся патологический процесс. Таким образом, более правильно акцентировать внимание на другой особенности этих клеток – наличии длинных отростков, проходящих в вышележащие слои коры. Эти отростки по своей организации напоминают трансламинарные отростки астроцитов I слоя, но направлены, по сравнению с ними, в обратном направлении. Особенности организации этих отростков не позволяют отнести эти астроциты к группе плазмоволокнистых, которые должны располагаться в VI слое коры согласно классификации, приведенной у Р.Крстича [Крстич, 14 2001]. Более целесообразно именовать эти клетки инвертированными трансламинарными астроцитами. В нашей работе, при проведении реакции на GFAP у человека, наблюдалось повышение выявляемости астроцитов III-V слоев неокортекса с увеличением возраста. В срезах головного мозга людей первой и второй возрастных групп (до 40 лет), в средних и глубоких слоях коры GFAPиммунопозитивные астроциты встречаются редко и, как правило, вблизи кровеносных сосудов. С увеличением возраста наблюдается увеличение их количества и, помимо периваскулярных, выявляются астроциты, не связанные с кровеносными сосудами. При этом накопление астроцитов происходит преимущественно в одном из средних слоев коры (III, IV, реже V) таким образом, что этот слой отчетливо контурируется на не подкрашенных препаратах, сканированных с малым увеличением (рис. 4). Обнаруженный факт хорошо согласуется с имеющимися данными об активации астроцитов и увеличении экспрессии ими GFAP при развитии возрастных дистрофических и дегенеративных процессов [Davis et al., 2002], однако, то, что эти клетки могут образовывать в неокортексе своеобразный иммунопозитивный слой, ранее не было известно. а б Рис. 4. Фрагменты коры из теменной области головного мозга человека. Об – область расположения мозговых оболочек. Бв – субкортикальное белое вещество. а – возрастная группа I. б – возрастная группа III. Стрелкой отмечена полоса, образованная иммунопозитивными астроцитами и расположенная на уровне IV-V слоев коры. Иммуноцитохимическая реакция на глиальный фибриллярный кислый белок без подкраски. Увеличение: 6х. 15 При постановке на срезах головного мозга человека ШИК-реакции в 69% случаев были обнаружены шаровидные гомогенные и слоистые образования («амилоидные» или «полисахаридные» тельца [Hoyaux et al., 2000]) диаметром 0,5-25 мкм. В срезах головного мозга людей молодого возраста (первой и второй возрастных групп) они встречались нечасто – единичные, мелкие, диффузно расположенные в глубоких слоях коры. С возрастом наблюдалась тенденция к увеличению их встречаемости (r=0,76 p<0,05), количества и размеров. Интересным фактом явилось существование зон преимущественной аккумуляции амилоидных телец – областей глиальных пограничных мембран. Причина преимущественной концентрации этих структур в области пограничных мембран в настоящее время не известна, равно как и не имеется достоверных данных о происхождении этих образований. Считается, что амилоидные тельца могут служить показателями текущего нейродегенеративного процесса [Singhrao et al., 1993; Cavanagh, 1999]. В то же время, несмотря на широкое распространение экспериментального моделирования нейродегенеративных заболеваний, у лабораторных животных не удается получить подобных структур, даже при длительных сроках наблюдения [Чумасов Е.И. и др., 2010], что противоречит распространенной концепции о связи их с нейродегенерацией. Согласно данным конфокальной микроскопии часть амилоидных телец локализуется внутри отростков астроцитов и окружается ободком их цитоплазмы, содержащим GFAP. Морфологическая характеристика астроцитов головного мозга человека после механической травмы. Данная группа объектов характеризовалась следующими гистологическими признаками. Во всех препаратах имелись кровоизлияния. Они были полиморфными и, как правило, располагались в виде сплошного геморрагического очага, иногда разделенного небольшими островками относительно сохранной нервной ткани. Нервная ткань по краю геморрагического очага (участок некроза) представляла собой бесструктурную мелкозернистую массу, лишенную клеточных элементов. В перифокальной зоне отмечалось разрежение нейропиля с образованием сотовидных пустот, а также расширение периваскулярных и перицеллюлярных пространств (отек нервной ткани). По мере удаления от очага мозговой деструкции выраженность отека уменьшалась. Сохранившиеся по краю кровоизлияний нейроны часто имели признаки сморщивания (гиперхромия, уменьшение объема цитоплазмы и 16 ядра). Также встречались нейроны с ишемическими изменениями и явлениями центрального, периферического и тотального хроматолиза. Астроциты вблизи зоны деструкции были незначительно набухшими, с нечеткими контурами и зернистой цитоплазмой, с плохо различаемым ядром. Отростки этих астроцитов выглядели фрагментированными и находились в состоянии распада (клазматодендроза). Часть трансламинарных отростков астроцитов I и VI слоев имели выраженные четкообразные утолщения по всей длине, а часть были фрагментированными, что отражает реактивные и деструктивные изменения астроглии в ответ на развивающийся патологический процесс [Wilhelmsson et al., 2006; Laird et al., 2008]. В цитоплазме многих астроцитов обнаруживались ШИК-позитивные гранулы, которые при проведении флюоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии (в режиме спектрального анализа) проявляли автофлюоресценцию, характерную для липофусцина, что было не свойственно астроцитам интактного мозга. После травмы структура астроцитов неокортекса менялась. Клетки увеличивались, деформировались, их ядра становились пузырьковидными и смещались к периферии. Отростки измененных астроцитов иногда утолщались и становились извитыми, в других случаях «втягивались», становясь практически неразличимыми. В случаях, когда кровоизлияние располагалось в субкортикальном белом веществе, во всех слоях коры над очагом повреждения наблюдалось увеличение количества астроцитов с высокой интенсивностью иммуноцитохимической реакции на GFAP. С увеличением срока травмы, вокруг очага повреждения отмечалось увеличение количества иммунопозитивных гипертрофированных и деформированных астроцитов, которые сначала располагались диффузно и неупорядоченно, а затем формировали подобие пограничной зоны. При этом образующийся глиосоединительнотканный рубец в центральной своей части всегда был иммунонегативен к GFAP, но в периферической его части наблюдалось врастание GFAP-иммунопозитивных астроцитов веретенообразной формы с утолщенными, сильно извитыми отростками. Результаты систематизации структурных изменений активированных астроцитов, выявляемых в неокортексе человека после травмы представлены на рис. 5. 17 Рис. 5. Различные морфологические формы активированных астроцитов, наблюдаемых при травме коры головного мозга у человека. а – фиброзный астроцит интактного головного мозга (возрастная группа – II). б – фиброзный астроцит с повышенной иммунореактивностью к GFAP (возрастная группа – IV). в – фиброзный астроцит с эксцентрично расположенным ядром (возрастная группа – III). г – двухядерный астроцит (возрастная группа – IV). д – гипертрофированный астроцит с увеличенным ядром и повышенной иммунореактивностью к GFAP (возрастная группа – IV). е – тучный («откормленный») астроцит с краевым расположением ядра (возрастная группа – IV). Иммуноцитохимическая реакция на глиальный фибриллярный кислый белок с подкраской гематоксилином. Масштабный отрезок равен 10 мкм. Иммуноцитохимическая реакция на виментин позволила выявить крупные астроциты, расположенные по краю очага повреждения. У этих клеток нередко наблюдалась вакуолизация цитоплазмы, а их отростки были короткими ветвистыми и переплетающимися. Данные клетки напоминают виментиниммунопозитивные астроциты, обнаруженные ранее у крысы при моделировании ишемического инсульта [Коржевский Д.Э. и др., 2007]. С увеличением срока после травмы количество виментин-иммунопозитивных астроцитов в перифокальной зоне уменьшалось, но они сохраняли морфологические признаки тучных («откормленных» по П.Н.Ермохину и А.П.Авцыну (1969)) астроцитов. Некоторые из этих клеток давали 18 положительную цитоплазматическую реакцию на другой белок промежуточных филаментов – нестин, который считают маркером нейральных стволовых клеток [Fukuda et al., 2003]. Реэкспрессия эмбриональных белков – виментина и нестина – и кополимеризация их с GFAP в активированных астроцитах является закономерной, поскольку известно, что именно такой состав белков промежуточных филаментов обеспечивает способность астроцитов к пролиферации и миграции к очагу повреждения [Frisén et al., 1995]. Кроме астроцитов, реакция на нестин была свойственна и клеткам микроглии, расположенным вблизи зон повреждения и формирования глиального рубца. Их микроглиальная природа в настоящей работе была подтверждена при постановке реакции на кальций-связывающий белок Iba-1, являющийся маркером микроглии и ряда других фагоцитирующих клеток [Yamada et al., 2006]. При проведении исследований на лабораторных животных нестин ранее был обнаружен в активированных астроцитах, но не выявлялся в клетках микроглии [Nakamura et al., 2003; Коржевский Д.Э. и др. 2007; Yang et al., 2008]. Полученные результаты свидетельствуют об определенном межвидовом консерватизме изменений состава промежуточных филаментов астроцитов, наблюдаемых при реакции на повреждение головного мозга. На основании представленных данных можно сделать заключение о том, что в неокортексе у крысы присутствует не менее трех морфологических вариантов астроцитов, тогда как у человека их определяется пять. Настоящее исследование позволило определить ряд существенных структурных и цитохимических характеристик ПГПМ неокортекса крысы и человека, которые свидетельствуют о наличии межвидовых различий, недооценка которых не должна иметь место при экспериментальном моделировании патологии, свойственной человеку. Сравнение полученных данных с установленными ранее фактами показывает, что динамика структурных преобразований астроцитов у человека и лабораторных животных после повреждения головного мозга имеет общую направленность. Настоящая работа может послужить первым этапом для дальнейших исследований, направленных на разработку новых критериев морфологической диагностики повреждений головного мозга. 19 ВЫВОДЫ 1. У крысы астроциты, содержащие GFAP, обнаружены во всех слоях неокортекса, однако наиболее интенсивную реакцию на этот белок промежуточных филаментов проявляют клетки, расположенные в первом слое, вблизи поверхности коры, а также астроциты субкортикального белого вещества. В головном мозге крысы выявлены ранее не описанные морфологические формы астроцитов – уплощенные поверхностные («эпителиоморфные») астроциты, которые принимают участие в формировании поверхностной глиальной пограничной мембраны и веретеновидные астроциты субкортикального белого вещества. 2. У человека GFAP-иммунопозитивные астроциты обнаружены во всех слоях неокортекса. Наиболее интенсивную реакцию на этот белок, как и у крысы, проявляют клетки, расположенные в первом слое коры и субкортикальном белом веществе, однако структурная организация этих клеток у крысы и человека различается. Так, у человека отсутствуют «эпителиоморфные» поверхностные астроциты, а в белом веществе определяются преимущественно типичные фиброзные астроциты. Для коры головного мозга человека установлено присутствие особых морфологических форм астроцитов, которые отсутствуют у крысы. Это – трансламинарные астроциты первого слоя и инвертированные трансламинарные астроциты шестого слоя. 3. Одной из характерных особенностей неокортекса человека является зависимое от возраста накопление в зоне поверхностной и периваскулярной глиальных пограничных мембран сферических образований полисахаридной природы, часть из которых инкорпорирована в отростки астроцитов, что свидетельствует о возможном участии астроцитов в формировании этих структур. 4. Структурная организация астроцитов при травме головного мозга существенно изменяется. Они увеличиваются в размерах, отростки их укорачиваются и утолщаются, теряется звездчатая форма, ядро смещается на периферию клетки, появляются двухядерные формы, в их цитоплазме происходит накопление липофусцина. В составе промежуточных филаментов астроцитов появляются виментин и нестин. Количество GFAPиммунореактивных астроцитов увеличивается, наблюдается скопление 20 измененных астроцитов на границе повреждения и отграничение ими травматического очага, что свидетельствует об их активном участии в ответной реакции на травму и ведущей роли в формировании глиального рубца. 5. Разработанный в ходе настоящего исследования протокол иммуноцитохимического исследования пригоден для изучения структурной организации GFAP-иммунопозитивных астроцитов как у крысы, так и у человека. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Гиляров А.В., Соловьев К.В., Грудинина Н.А. Изучение пространственной организации астроцитов головного мозга при помощи конфокальной лазерной микроскопии. // Морфология. – 2009. – Т. 135, вып. 3. – С. 76-79. 2. Сухорукова Е.Г. Выявление популяции активированных астроцитов при черепно-мозговой травме. // Тезисы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». СПб: СПб МАПО. – 2009. – С. 32-33. 3. Сухорукова Е.Г. Структурная организация астроцитов I слоя коры головного мозга человека и крысы. // Тезисы III Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские чтения – 2009». СПб: СПБГМУ им. акад. И.П. Павлова. – 2009. – С. 14. 4. Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Коржевская В.Ф. Иммуногистохимическое выявление астроцитов головного мозга при черепномозговой травме. // Судебно-медицинская экспертиза. – 2010. – № 1. – С. 14-16. 5. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Гиляров А.В. Применение полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек) в иммуноцитохимических исследованиях. // Морфология. – 2010. – Т. 137, вып. 3. – С. 71-75. 6. Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э. Кальций-связывающий белок Iba-1/AIF1 в клетках головного мозга крысы. // Морфология. – 2010. – Т. 136, вып. 2. – С. 5-7. 7. Сухорукова Е.Г. Астроциты поверхностных слоев коры головного мозга и организация поверхностной глиальной пограничной мембраны. // Тезисы VI 21 Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Украина. – 2010. – С. 283. 8. Сухорукова Е.Г. Структурная организация астроцитов I слоя коры головного мозга человека. // Морфология. – 2010. – Т. 137, №. 4. – С. 185. 9. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г. Современные методы изучения пространственной организации клеток головного мозга. // Материалы VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. Москва. – 2010 – С. 119-121 Настоящая работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (10-04-0080а и 1004-00676а) и Правительства Санкт-Петербурга (ПСП 10660). 22
