ИЗУЧЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2011, ¹ 1 (77), Часть 1
УДК 579.61:582.31:616.981.51
А.М. Шариков, И.А. Новицкий, В.Т. Манчук
ИЗУЧЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИТОВ ГРИБОВ
РОДА TRICHODERMA В ОТНОШЕНИИ ВАКЦИННОГО ШТАММА ВОЗБУДИТЕЛЯ
СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск)
Изучали методом лунок действие метаболитов грибов рода Trichoderma:: видов T.. citrinoviridae,, T.. asperellum, T. harzianum, T. hamatum и нетипированного штамма Trichodermа sp. на штамм грампозитивного
микроорганизма Bacillus anthracis CТИ-1.
ТИ-1. Изучали также действие метаболитов грибов T.. asperellum и T. citrinoviridae на условно-патогенный штамм Bacillus subtilis. Показана антибиотическая
бактериостатическая активность всех изученных метаболитов на изученные микроорганизмы.
Данные метаболиты перспективны как продуценты новых антибиотических препаратов.
Ключевые слова: бактерицидное действие, метаболиты грибов рода Trichoderma,, метод лунок, грампозитивные микроорганизмы
THE STUDY OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF METABOLITES OF FUNGI
OF THE GENUS TRICHODERMA FOR VACCINE STRAIN OF ANTHRAX
A.M. Sharikov, I.A. Novitskiy, V.T. Manchouk
Institute of Medical Problems of the North, Krasnoyarsk
The action of metabolites of fungi of genus Trichoderma: species T. citrinoviridae, T. asperellum, T. harzianum,
T. hamatum and untyped strain Trichoderma sp. on the culture of gram-positive microorganism Bacillus anthracis
CTI-1 was studied by the method of small holes. We also studied the action of metabolites of fungi T. asperellum and T. citrinoviridae on the conditional-pathogenic culture of Bacillus subtilis. Antibiotic bacteriostatic
activity of all studied metabolites on the studied microorganisms was shown. These metabolites are prospective
as producers of new antibiotic drugs.
Key words: bactericidal action, metabolites of fungi of the genus Trichoderma, method of the holes, gram-positiv e
bacteria
Изучение новых веществ с антимикробной
активностью есть одно из важнейших направлений преодоления лекарственной устойчивости
микроорганизмов. В настоящее время число таких
антимикробных препаратов постоянно увеличивается [12].
Способность образовывать вторичные метаболиты, по сути, антибиотики, широко распространена
в природе, однако она неравномерно распространена между различными таксономическими группами
микроорганизмов. Наибольшее количество антибиотиков получено из актиномицетов – до 10000;
значительное количество, около полутора тысяч,
получено из несовершенных грибов, причем около
трети образуется представителями родов Penicillium
и Aspergillus, хотя и лишь немногие из них имеют
практическое значение [1, 2, 4–6, 10, 11, 13].
Известно, что культуральная жидкость несовершенных грибов содержит вещества с антибиотическими свойствами. Исследования в этой
области ведутся достаточно активно; постоянно
обнаруживаются новые метаболиты с полезными
свойствами [3, 6, 9, 14].
Как продуценты биологически активных веществ грибы рода Trichoderma известны давно, из
них получают целый ряд биологически активных
препаратов [3].
Часть из них достаточно широко применяется в медицине – гриб Trichoderma polysporum
продуцирует циклоспорин, антибиотик противогрибкового действия, широко применяемый при
пересадках органов и тканей в качестве иммуносупрессора [1].
При этом поиск механизмов, позволяющих таковым несовершенным грибам успешно противостоять в конкурентной борьбе за ресурсы с другими
микроорганизмами, мог бы помочь найти очень
эффективные лекарственные препараты [1].
Тем не менее, систематические исследования биологической активности штаммов грибов
рода Trichoderma, изолированных в Центральной
Сибири и изучение их метаболитов в отношении
условно-патогенных и патогенных микроорганизмов к настоящему времени проводятся не в должном объеме [8, 7, 15].
Целью настоящей работы являлось изучение
антибиотической активности метаболитов грибов
рода Trichoderma в отношении штамма Bacillus
anthracis СТИ-1.
Изучали также антибиотическую активность
метаболитов на штамм Bacillus subtilis, относимый
к условно патогенным микроорганизмам.
МЕТОДИКА
Объектами исследования служили стерильные
метаболиты, полученные из штаммов К-12, 01-00 и
штамма 30 гриба вида T. asperellum; штаммов ТН 4
и МК гриба вида T. citrinoviridae; штамма М 99/5
Экспериментальные исследования в биологии и медицине
249
ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2011, ¹ 1 (77), Часть 1
гриба T. harzianum; штамма T. hamatum MO и из нетипированного штамма Trichoderma sp. 119-85.
Грибы культивировали на бульоне Чапека методом глубинного культивирования на качалке в
течение пяти суток при температуре 25 ± 2 °С.
В работу был взят детально охарактеризованный вакцинный штамм Bacillus anthracis линии
СТИ-1. Для сравнения антибиотических свойств
изучаемых метаболитов также изучали их влияние
на условно-патогенный штамм Bacillus subtilis.
Предварительное культивирование штаммов
осуществлялось на питательном агаре (ГРМ-агар
производства ФГУП «Государственный научный
центр прикладной микробиологии и биотехнологии») с последующим инкубированием в термостате
в течение трех суток при 37 °С. Полученные изолированные типичные колонии отбирали бактериологической петлей и суспендировали в пробирках
со стерильным физиологическим раствором по
стандарту мутности. Посевная доза взвеси микроорганизма составляла 1,5 × 108 КОЕ/мл (0,5 по стандарту мутности McFarland). Посев приготовленных
суспензий осуществляли отжатым ватным тампоном
в трех направлениях на пластины подсушенного
агара Мюллера – Хинтон, разлитого толстым слоем в чашках Петри. Определение бактерицидной
активности исследуемых экстрактов осуществляли
методом лунок.
Сразу после посева стандартизованной взвеси
микроорганизмов в каждой засеянной чашке Петри
стерильным пробочным сверлом диаметром 10 мм
делали на одинаковом расстоянии шесть лунок, затем автоматической пипеткой постоянного объема в
каждую лунку одноразовым стерильным наконечником вносили 100 мкл исследуемого метаболита. Контролем в опыте служил физиологический раствор.
После внесения метаболита чашки Петри
инкубировали не переворачивая в термостате
при температуре 37 °С в течение шести суток. Все
опыты проводились в пятикратной повторности.
Наблюдения за ростом тест-культуры начинали
после суток инкубирования.
Измерение диаметра задержки роста микроорганизмов проводили на вторые и пятые сутки
инкубирования.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ
S����S��C� v.6.0. Рассчитывали среднее значение
и среднеквадратичное отклонение, достоверность
отличий определяли по непараметрическому критерию Манна – Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В ходе проведенной работы было установлено, что изученные метаболиты T. citrinoviridae и
T. asperellum обладают выраженным бактериостатическим действием в отношении изучаемого
штамма.
Наибольшая величина зоны подавления роста
(17,0 ± 2,0 мм, р < 0,05) наблюдалась при действии
на B. subtilis метаболитов штамма ТН 4 T.. citrinoviridae (табл. 1).
Таблица 1
Величина зон отсутствия роста штамма B. subtilis вокруг лунок, содержащих растворы
культуральной жидкости изученных штаммов грибов (M ± σ, мм)
Штамм
Длительность инкубирования штамма B. subtilis, сутки
2-е
5-е
T. asperellum К-12
12,0 ± 2,0
12,0 ± 1,0
T. asperellum 01-00
15,0 ± 2,0
12,0 ± 2,0
T. asperellum 30
16,0 ± 2,0
13,0 ± 2,0
T. citrinoviridae ТН 4
17,0 ± 2,0
15,0 ± 1,0
Таблица 2
Величина зон отсутствия роста штамма B.anthrasis СТИ-1 вокруг лунок, содержащих растворы
культуральной жидкости изученных штаммов грибов (M ± σ, мм)
Штамм
250
Длительность инкубирования штамма B. anthracis СТИ-1, сутки
2-е
5-е
T. asperellum К-12
15,0 ± 4,0
12,0 ± 2,0
T. asperellum 01-00
18,0 ± 2,0
16,0 ± 2,0
T. asperellum 30
19,0 ± 2,0
15,0 ± 3,0
T. citrinoviridae ТН 4
18,0 ± 2,0
16,0 ± 2,0
T. citrinoviridae МК
15,0 ± 2,0
12,0 ± 1,0
T. harzianum М 99/5
15,0 ± 1,0
15,0 ± 2,0
T. hamatum MO
14,0 ± 3,0
12,0 ± 1,0
Trichoderma sp. 119-85
14,0 ± 2,0
12,0 ± 2,0
Экспериментальные исследования в биологии и медицине
ÁÞËËÅÒÅÍÜ ÂÑÍÖ ÑÎ ÐÀÌÍ, 2011, ¹ 1 (77), Часть 1
Все изученные метаболиты подавляют и штамм
Bacillus anthracis СТИ-1: максимальная зона подавления роста наблюдалась при действии метаболита T. asperellum 30 – 19,0 ± 2,0 мм (табл. 2).
Однако действие антибиотических веществ,
присутствовавших в метаболитах изучаемых
грибов, носило скорее бактериостатический, чем
бактерицидный характер.
Полученные результаты позволяют предположить вероятный механизм действия антибиотических веществ, выделенных из изучаемых грибов.
По-видимому, он связан с влиянием на клеточную
стенку микроорганизмов.
Таким образом, помимо прочих штаммов бактерий
противомикробная активность метаболитов аборигенных штаммов грибов рода Trichoderma наблюдается
также против возбудителя сибирской язвы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На данном этапе исследований не представляется возможным указать, влияние ли это какого-то
из описанных антибиотиков или их сочетание. Очевидно, что заимствование способа, применяемого
несовершенными грибами для увеличения своей
конкурентоспособности в меняющихся условиях
чрезвычайно перспективно. В то же время, все
чаще возникает необходимость увеличивать и
без того высокие дозировки традиционных антибиотиков, используемых в медицине. К тому же
ко многим из таких лекарственных препаратов
выработалась практически повсеместная устойчивость, и получение экономически перспективного
способа выделения новых противомикробных
средств из субстрата с малым количеством отходов
может рассматриваться как одно из приоритетных
направлений в современной фармакологии.
Полученные результаты позволяют обосновать
важность и перспективность полученных метаболитов как сырья для новых микробиологических
препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дудник Ю.В. Вторичные метаболиты грибов
// Современная микология в России. Первый съезд
микологов в России : Тез. докл. – М. : Изд. Нац.
Акад. экологии, 11–13 апреля 2002 года. – С. 263.
2. Ершова Е.Ю. Поиск продуцентов антибиотиков грибного происхождения, эффективных в
отношении метициллинрезистентных стафилококков : автореф. дисс. … канд. биол. наук. – М.,
2003. – 26 с.
3. Сейкетов Г.Ш. Грибы рода Trichoderma и их
использование в практике. – Алма-Ата : Наука,
1982. – 245 с.
4. Филиппова И.А. Естественное лекарство
нового тысячелетия: грибы против рака. – СПб. :
Диля, 2005. – 128 с.
5. Чхенкели В.А. и др. Некоторые аспекты
медико-биологических исследований высших
дереворазрушающих базидиомицетов как источника биологически активных веществ // Сиб. мед.
журнал. – 2001. – № 1. – С. 59–65.
6. Чхенкели В.А.; Шкиль Н.А. Противотуберкулезная активность базидиомицета CO��OLUS
�U�ESCENS (SHUM.: F�.) QUEL. и препарата,
получаемого на его основе // Сиб. мед. журнал. –
2005. – № 1. – С. 67–71.
7. Шариков А.М. Выраженная антибиотическая активность грибов рода TRICHODERMA в
отношении штамма BACILLUS ANTHRASIS СТИ-1
// Научная перспектива. – 2010. – № 10. –
С. 92–93.
8. Шариков А.М. Изучение антибиотической
активности метаболитов грибов рода TRICHODERMA в отношении бактерий рода VIBRIO // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных
наук. – 2010. – № 10. – С. 24–25.
9. Шариков А.М. Исследование антибактериальной активности метаболитов некоторых высших
грибов Средней Сибири // Современные наукоемкие технологии. – 2010. – № 6. – С. 128–129.
10. Шариков А.М., Пашенова Н.В., Нешумаев Д.А., Новицкий И.А. Исследование антибиотический активности гриба чаги в отношении возбудителя туляремии // Тихоокеанский медицинский
журнал. – 2010. – № 1. – С. 64–65.
11. Шариков А.М., Пашенова Н.В., Новицкий И.А. Выраженность бактерицидной активности
гриба �NONO�US O�L�QUUS ��L�� в отношении
F��NC�SELL� �UL��ENS�S линии 15 НИИЭГ
// Сиб. мед. обозрение. – 2008. – № 1 (49). –
С. 19–21.
12. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Перспективы
создания и внедрения новых антимикробных препаратов // Инфекции и антимикроб. химиотерапия. – 2002. – № 4 (2). – С. 1–5.
13. Lumsden �.�., Lewis �.�., Locke J.C.
Managing soilbome plant pathoges with fungal
antagonists. �n: �est Management: �iologically �ased
�echnologies / eds. �.�. Lumsden, J.L. Vaughn. –
1993. – �. 196–203.
14. Molitoris H.�. Mushrooms in medicine // Folia
Mikrobiol. – 1994. – Vol. 39, N 2. – �. 91–98.
15. Sharikov �.M. et al. �o the issue of using of
the fungi of Trichoderma kind as the producent of the
biologically active substances // �rogram & abstracts:
�he X�� Symposium of the �ussia – Japan medical
exchange. – Krasnoyarsk, 2005. – �. 661–662.
Сведения об авторах
Шариков Андрей Михайлович – научный сотрудник лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии НИИ
медицинских проблем Севера СО РАМН (660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 3, корпус «Г»; тел.: (391) 22806-83; e-mail: loengrinionessi@bk.ru)
Новицкий Иван Александрович – доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории
клеточно-молекулярной физиологии и патологии УНИИ медицинских проблем Севера СО РАМН
Манчук Валерий Тимофеевич – доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, директор НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН
Экспериментальные исследования в биологии и медицине
251