In vitro и in vivo визуализация гидрозолей магнетита
advertisement
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский Государственный Университет им. Н.Г. Чернышевского» На правах рукописи ГЕРМАН СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ IN VITRO И IN VIVO ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ГИДРОЗОЛЕЙ МАГНЕТИТА, МАГНИТОЛИПОСОМ И МАГНИТНЫХ МИКРОКАПСУЛ МЕТОДОМ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИИ 03.01.02 – биофизика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель: доктор химических наук, доцент Горин Дмитрий Александрович Саратов 2015 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. Обзор литературы........................................................................................ 11 1.1 Синтез магнитных наночастиц ........................................................................... 11 1.2. Подходы, используемые для стабилизации наночастиц ................................. 14 1.2.1 Низкомолекулярные стабилизаторы ............................................................ 15 1.2.3 Модификации поверхности наночастиц неорганическими материалами17 1.2.4 Методы векторизации наночастиц для биомедицинских приложений ... 18 1.3 Свойства и параметры наночастиц .................................................................... 19 1.3.1 Размер наночастиц......................................................................................... 19 1.3.2 Токсичность частиц ....................................................................................... 20 1.3.4 Магнитные свойства наночастиц ................................................................. 22 1.4 Применение наночастиц магнетита ................................................................... 24 1.4.1 Магнитная сепарация .................................................................................... 24 1.4.2 Гипертермия ................................................................................................... 25 1.4.4 Тераностика.................................................................................................... 26 1.4.5 Магнитно резонансная томография............................................................. 27 1.5 Композитные материалы, содержащие наночастицы оксида железа, и их применение ................................................................................................................. 32 1.5.1 Магнитолипосомы и их применение ........................................................... 33 1.5.2 Композитные микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции полиэлектролитов и наночастиц ........................................................ 34 Выводы к 1 главе ........................................................................................................ 36 ГЛАВА 2. Материалы и методы................................................................................... 38 2.1 Синтез коллоидов оксида железа ....................................................................... 38 2.1.1 Синтез водного раствора коллоидного магнетита стабилизированного цитрат-ионами......................................................................................................... 38 2.1.2 Методы характеризации полученных наночастиц магнетита................... 39 Характеризация полученных наночастиц магнетита.......................................... 39 2.1.4 Экстракция наночастиц магнетита в неполярный растворитель ............. 44 2.2 Приготовление и характеризация магнитолипосом ......................................... 44 2.3 Формирование объектов методом полиионной сборки ................................... 47 2.3.1 Формирование нанокомпозитных покрытий, содержащих катионные и анионные наночастицы магнетита........................................................................ 47 2.3.2 Исследование морфологии, состава и магнитных характеристик нанокомпозитных покрытий. ................................................................................ 48 3 2.3.3 Формирование и характеризация полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита ................................................................... 49 Выводы ко 2 главе ...................................................................................................... 51 ГЛАВА 3. Оценка воздействия наночастиц оксида железа на живые системы на клеточном и тканевом уровнях. Контрастирование наночастиц магнетита и магнитолипосом при мрт .............................................................................................. 52 3.1 Получение и характеризация наночастиц магнетита для оценки их воздействия на живые системы ................................................................................ 52 3.2 Взаимодействие коллоида магнетита с нейтрофильными гранулоцитами. Метод определения жизнеспособности клеток по результатам окрашивания постмортальным красителем пропидиумом йодидом (PI) .................................... 53 3.3 Исследование морфологических изменений органов лабораторных крыс с перевитым раком печени при внутрибрюшинном введении цитратстабилизированных наночастиц магнетита ............................................................ 53 3.4 Магнитно-резонансная томография ................................................................... 54 3.5 Интратуморальное введение магнитных липосом ........................................... 55 3.6 Взаимодействие коллоида магнетита с клетками крови .................................. 55 3.7 Исследование морфологических изменений органов лабораторных крыс с перевитым раком печени при внутрибрюшинном введении цитратстабилизированных наночастиц магнетита ............................................................ 56 3.8 Контрастирование наночастиц магнетита и магнитолипосом при МРТ ....... 58 3.9 Интратуморальное введение магнитных липосом ........................................... 61 Защищаемые результаты исследования ................................................................... 65 ГЛАВА 4. Полиэлектролитные слои и микрокапсулы .............................................. 66 4.1 Изучение магнитных свойств наночастиц оксида железа и полимерных структур, их содержащих .......................................................................................... 66 4.2 In vitro контрастирование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита .............................................. 73 4.3 Внутривенное введение магнитных микрокапсул ............................................ 78 Выводы к 4 главе ........................................................................................................ 84 Защищаемые результаты исследования ................................................................... 85 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 86 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ .............................................. 88 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. За сравнительно небольшое время, прошедшее с момента публикации в 1973 году в журнале «Nature» статьи Пола Лаутербура, где впервые была предложена идея «создания изображения с помощью индуцированного локального взаимодействия», магнитно-резонансная томография (МРТ) стала одним из наиболее эффективных и информативных методов неинвазивной диагностики в медицине [1]. В отличие от большинства других методов визуализации, применяемых в биомедицине, магнитно-резонансная томография позволяет получать изображения при помощи различных механизмов контрастирования: плотность протонов, T1, T2 и T2* [2]. В настоящее время, благодаря возможности визуализации гидрозолей магнетита, МРТ позволяет развивать новое направление медицины, называемое тераностикой [3], которое предполагает создание объектов, совмещающих в себе диагностическую и терапевтическую функции. Наночастицы магнетита отвечают требованиям, предъявляемым этой концепцией, так как позволяют не только оказывать локальное терапевтическое (термическое) воздействие на ткани за счет преобразования электромагнитной энергии в тепловую [4], но и могут применяться в качестве контрастирующих агентов для диагностики патологий с помощью МРТ [5]. В настоящее время контрастирующие препараты, содержащие суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, используются в качестве Т2 контрастирующих агентов, ускоряющих преимущественно спин-спиновую релаксацию [6]. При определенных условиях наночастицы магнетита могут уменьшать время спин-решеточной релаксации, т.е. контрастировать на Т1 взвешенных МР томограммах[2], но в настоящее время отсутствуют результаты систематического исследования зависимости интенсивности МР-сигнала на Т1 взвешенных изображениях от концентрации наночастиц магнетита, несмотря на то, что данная информация могла бы быть полезна для изучения распределения наночастиц магнетита in vivo с использованием МРТ. Возможность контрастирования области интереса на Т1 и Т2 взвешенных томограммах, предположительно, можно использовать, для повышения точности диагностирования при МРТ. На данный момент существует проблема различия влияния контрастирующих агентов и артефактов на МР изображения. Артефакты МРТ, которые обычно связаны с результатами протекания эндогенных процессов, например уплотнение тканей, наличие жира, кровоизлияний, сгустков крови и наличие воздуха, вызывают проблемы при диагностировании, поскольку они имитируют сигналы, поступающие от МР контрастирующих агентов. Благодаря использованию контрастирующих агентов, изменяющих Т1 и Т2 релаксацию 5 исключается возможность ложного диагностирования из-за влияния подобных артефактов. Одно из стремительно развивающихся направлений современной биомедицины связанно с созданием эффективных систем адресной доставки биологически активных веществ. В качестве подобных систем могут быть использованы, как липосомы[7], так и полиэлектролитные капсулы[8]. Для выбора биоактивного вещества для инкапсуляции во внутренний объем капсул или липосом, необходима информация о биораспределении самих средств доставки, которую можно получить, используя магнитные наночастицы в качестве маркеров для in vivo визуализации методом МРТ [9]. Полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции, предоставляют большие возможности для варьирования концентрации наночастиц, характера их распределения внутри оболочки по сравнению с липосомами. С другой стороны, для полиэлектролитных капсул до сих пор являются актуальными вопросы, связанные с изучением их биораспределения и исследования кинетики биодеградации их оболочек in vivo в зависимости от вида парентерального введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно). Цель и задачи исследования. Целью данной работы является in vitro и in vivo визуализация липосом и нанокомпозитных биодеградируемых микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита, методом магнитно-резонансной томографии, и сравнение их контрастирующих свойств с гидрозолем магнетита, а также получение микрокапсул с заданным контрастированием на Т1 и Т2 взвешенных изображениях. Для достижения этой цели были решены следующие задачи: 1. оптимизация метода получения гидрозоля магнетита и разработка принципиальной схемы химического реактора для получения гидрозоля магнетита с возможностью контроля окисления наночастиц и поддержания стерильных условий во всех внутренних емкостях устройства и ее практическая реализация; 2. оценка токсичности наночастиц магнетита на основе результатов их взаимодействия с нейтрофильными гранулоцитами, а также на основании морфологических исследований тканей органов крыс при внутрибрюшинном введении и биораспределения магнитных наночастиц на основе результатов МРТ исследований; 6 3. получение магнитолипосом с заключенными во внутреннем объеме наночастицами магнетита и изучение факторов, влияющих на их стабильность во времени методом динамического рассеяния света; 4. сравнительный анализ МРТ изображений фантомов, содержащих магнитолипосомы и гидрозоли магнетита в различной концентрации, а также in vivo визуализация магнитолипосом методом МРТ и изучение морфологических изменений в тканях при их интратуморальном введении; 5. изучение магнитных свойств и морфологии поверхности планарных нанокомпозитных структур, полученных методом последовательной адсорбции наночастиц магнетита и полиэлектролитов из их растворов на поверхность кремниевых подложек; 6. получение микрокапсул на основе наночастиц магнетита и биосовместимых биодеградируемых полимеров, их in vitro и in vivo визуализация методом МРТ, а также изучение их биораспределения и токсичности при внутривенном введении; 7. изучение закономерностей изменений МР сигнала, сопровождающих ферментативную деградацию нанокомпозитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита, in vitro и in vivo. Научная новизна работы. 1. Показана возможность использования цитрат-стабилизированных наночастиц магнетита и магнитолипосом для увеличения контрастирования области интереса на Т1 взвешенных изображениях и определения концентрации наночастиц, используя значения интенсивности Т1 и Т2 взвешенных сигналов. 2. Продемонстрировано, что использование наночастиц магнетита, изменяющих как продольную релаксацию протонов, так и поперечную релаксацию обеспечивает возможность повышения достоверности визуализации объектов и тканей in vitro и in vivo методом МРТ. 3. Показано, что магнитные микрокапсулы на основе биосовместимых полимеров, изначально не контрастирующие в МРТ, обнаруживают контрастирующие свойства после ферментативной деградации их оболочек вследствие высвобождения наночастиц магнетита. 4. Установлен характер биораспределения магнитных микрокапсул при внутривенном введении с течением времени. Практическая значимость работы. 1. Создана экспериментальная установка для синтеза гидрозолей магнетита, позволяющая сохранить стерильные условия во время синтеза и 7 промывки наночастиц и обеспечить проведение синтеза в инертной атмосфере, что минимизирует процесс окисления наночастиц. 2. Получены моноламеллярные магнитолипосомы с большой эффективностью загрузки гидрофильных наночастиц магнетита, которые могут быть использованы в качестве Т2 контрастирующих агентов для МРТ исследований. 3. Показано, что капсулирование наночастиц в липосомы позволяет контролируемо повысить эффективность контрастирования области интереса на Т2 взвешенных изображениях. 4. Получены биодеградируемые нанокомпозитные микрокапсулы с высоким содержанием наночастиц магнетита. 5. Предложен способ оценки деградации микрокапсул in vivo с помощью анализа МР томограмм. 6. Показана возможность управления контрастированием полиэлектролитных магнитных микрокапсул путем изменения в них концентрации наночастиц магнетита. Достоверность полученных результатов. Достоверность полученных результатов обусловлена применением в экспериментах апробированных методик измерения, использованием стандартной измерительной аппаратуры и подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных в пределах установленных погрешностей, а также их соответствием результатам, полученным другими исследователями. Основные положения и результаты исследований, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие результаты исследований: 1. Магнитолипосомы более эффективно уменьшают время поперечной релаксации (Т2) протонов по сравнению с гидрозолем аналогичных наночастиц при одинаковых концентрациях в расчете на магнетит. Следовательно, на Т2 взвешенных изображениях магнитолипосомы эффективнее увеличивают контраст области интереса по сравнению с гидрозолем наночастиц. 2. При ферментативной деградации оболочек микрокапсул на основе поли-L-аргинина и натриевой соли декстран сульфата, содержащих наночастицы магнетита с высокой концентрацией в составе оболочки, наблюдается контрастирование области интереса на МР изображениях, обусловленное увеличением среднего расстояния между наночастицами, в то время как микрокапсулы до деградации не являются контрастирующими. 8 3. При внутривенном введении магнитных нанокомпозитных микрокапсул диаметром 3-5 мкм на основе поли-L-аргинина и натриевой соли декстран сульфата, в дозировке 2,5х109 капсул/кг (в рассчете на магнетит - 15 мг/кг) максимальное накопление в почках обнаружено через 15 минут после введения, в легких - через 4 часа, в печени и сердце – через 1 час, а в селезенке через 24 часа. В печени микрокапсулы разрушаются через 24 часа после введения, и наночастицы магнетита, высвобожденные в результате разрушения оболочки, контрастируют в течение последующих 7 дней. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на российских и международных конференциях: 1. 3-я Международная школа-семинар «Nanoparticles, Nanostructured Coatings and Microcontainers: Technology, Properties, Applications» (5-9 мая, 2011, Анталия, Турция). 2. I Всероссийский симпозиум по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» – Казань, (июнь 2011). 3. Конференция «Post-Genome methods of analysis in biology and laboratory and clinical medicine» (22-24 ноября 2012 г., Казань, Россия). 4. 4-я Международная школа-семинар «Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications» (5-9 мая 2013, Гольм-Потсдам, Германия). 5. 1-ая Международная школа-семинар «Dual-Imaging of Nano/Microsized Theranostics» (2-6 сентября 2013 г., медицинский университет Шарите, Берлин, Германия). 6. 5-ая Международная школа-семинар «Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications» (9-12 мая 2014, Университет Гента, Гент, Бельгия). Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, включенных в перечень рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ, и 6 тезисов докладов. Гранты. Научные исследования, проводимые в рамках диссертационной работы, были поддержаны следующими грантами: «Функционализация поверхности дисперсной фазы эмульсионных систем неорганическими наночастицами» (проект РФФИ № 09-03-00245-а); 9 «Влияние морфологии, условия получения и внешних воздействий на диэлектрические и магнитные свойства нанокомпозитов» (проект РФФИ № 10-0891219СТ_а); «Создание мультифункциональных композитных структур с возможностью адаптации их физико-химических свойств под воздействием ионизирующего и лазерного излучений» (РФФИ № 11-08-12058-ОФИ-м); «Создание нанокомпозитных материалов на основе термочувствительных браш-полимеров с использованием технологии Ленгмюра-Блоджетт» (проект РФФИ №12-02-31533 (мол_а)); Грант Правительства Российской Федерации №14.Z50.31.0004 для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, научных учреждениях государственных академий наук и государственных научных центрах Российской Федерации ; Грант Евросоюза, программа IRSES(PI) (International Research Staff Exchange Scheme) FP7 — «Люди» (Marie Curie Actions) 2013, «Dual - Imaging Nano/Micro – sized Theranostics (against cancer), DINaMIT», (the Marie Curie project PIRSES-GA2013-612673); «Ворота гематоэнцефалического барьера: механизмы регуляции, их зависимость от состояния организма и возраста, способы коррекции с помощью супрамолекулярных транспортных систем» (проект РНФ №14-15-00128); «Управление физико-химическими характеристиками гетерогенных сред, содержащих неорганические наночастицы, с помощью электромагнитного излучения» (проект РФФИ №14-03-31344) ; «Синтез, модификация и применение магнитных наночастиц для концентрирования и определения биологически активных веществ» (проект РФФИ №15-03-99704). Личный вклад диссертанта. Личный вклад автора состоял в: создании установки для получения гидрозолей магнетита, получении наночастиц магнетита, нанокомпозитных покрытий и микрокапсул, исследовании образцов методами атомно-силовой микроскопии, динамического рассеяния света и магнитно-резонансной томографии, обработке и анализе экспериментальных данных, а также проведении анализа периодической литературы по соответствующей тематике. При использовании результатов, полученных в соавторстве, приведены ссылки на соответствующие источники. 10 Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы, включающего 387 источников, и приложения. Общий объем диссертации составляет 115 страниц, включая 27 рисунков и 6 таблиц. 11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Синтез магнитных наночастиц Магнитные наночастицы, в частности наночастицы оксидов железа, широко используются для биомедицинских целей in vivo, например, для усиления контрастирования и повышения диагностической чувствительности в магнитной резонансной томографии [1-6], целевой доставки и специфического связывания терапевтических агентов в биоткани [7-9], гипертемии с помощью переменного магнитного поля [10,11], тканевой инженерии [12]. Тематике магнитных наночастиц и их применению посвящено большое количество обзоров и монографий [13-16]. Распространенными модификациями оксидов железа являются гематит, маггемит и магнетит [17]. Анализ магнитных и токсикологических свойств показывает, что наночастицы на основе оксидов железа наряду с достаточно эффективными магнитными характеристиками обладают значительно меньшей токсичностью по сравнению с аналогами на основе никеля, кобальта и других элементов [18-20]. С точки зрения параметров и характеристик, описывающих магнитные свойства различных кристаллографических модификаций оксида железа, а значит и эффективность их дальнейшего медицинского применения в качестве контрастирующего агента для МРТ и для гипертермии переменным магнитным полем, наиболее оптимальным является магнетит. Множество химических методов может быть использовано для получения магнитных наночастиц – синтез в микроэмульсии [21], золь-гель синтез [22], сонохимические реакции [23], гидротермальные реакции [24], гидролиз и термолиз прекурсоров [25] и др. Наиболее простым в реализации методом синтеза магнитных наночастиц является метод химической преципитации из растворов солей двух- и трехвалентного железа в присутствии основания [26-29]. Хотя процесс преципитации оксидов железа из раствора достаточно прост в исполнении, на результат влияет значительное число факторов, поэтому важно добиться воспроизводимости состава, распределения по размерам, электрокинетического потенциала получаемых наночастиц [30]. Основополагающим принципом химического синтеза наночастиц является инициация химической реакции и последующий контроль над процессами нуклеации и роста образующегося продукта. Понимание сути этих процессов и уровень контроля над ними определяют успешность достижения цели – получения монодисперсных наночастиц с желаемым составом и формой. Современные методы получения наночастиц магнитных материалов можно разделить на две группы – основанные на получении наночастиц из компактных 12 материалов или же, в противоположность, основанные на сборке наночастиц из атомов, ионов, молекул. По сравнению с методами получения магнитных наночастиц путем измельчения (испарение-конденсация [31.], лазерная абляция [32.], дробление компактных материалов в шаровых мельницах [33], концепция сборки «снизу» располагает большим числом возможностей для контроля над размером, формой, составом, структурой, процессами самоорганизации и физическими свойствами наночастиц. Удобным инструментом воплощения такого подхода являются методы химического синтеза наночастиц, представляющие собой и сочетающие в себе подходы неорганического, металлорганического и органического синтеза с процессами гетерогенного фазообразования в коллоидных системах. Химический метод соосаждения, вероятно, является наиболее простым и эффективным способом получения магнитных частиц. Оксиды железа (Fe3O4 либо или γ-Fe2O3), как правило, получают путем смешивания солей двух и трехвалентного железа в пристутствии основания. Процесс можно представить следующим химическим уравнением для получения Fe3O4 Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH- = Fe3O4 + 4H2O (1) Согласно термодинамике этой реакции полного осаждения Fe3O4 следует ожидать при рН от 8 до 14, при стехиометрическом соотношении 2:1 (Fe3+/ Fe2+) в отсутствии кислорода [34]. Основным преимуществом процесса соосаждения является то, что может быть синтезировано большое количество наночастиц. Тем не менее, в данном случае контроль распределения частиц по размеру ограничен. Процесс соосаждения происходит в два этапа: [35-38] процесс быстрого зародышеобразования имеет место, когда концентрация вещества достигает критического пересыщения, а затем идет медленный рост зародышей путем диффузии растворенных веществ к поверхности кристалла. Для получения монодисперсных наночастиц оксида железа, эти две стадии должны быть разделены, т.е. зарождения следует избегать в период роста [39]. В перенасыщенном растворе, когда зародыши формируются одновременно, последующий их рост приводит к образованию частиц с очень узким размером распределением по размерам [40]. Контроль над размером и полидисперсностью, как правило, может быть осуществлен в течение очень короткого периода нуклеации, так как конечное число частиц определяется окончанием процесса зародышеобразования и оно не меняется в процессе роста частиц. В ряде исследований было рассмотрено влияние различных факторов на размер, магнитные характеристики или 13 поверхностные свойства получаемых частиц [41-44]. Размер и форма наночастиц может относительно успешно варьироваться путем регулирования рН, ионной силы, температуры, природы солей (перхлораты, хлориды, сульфаты, и нитраты) или соотношения концентраций Fe(II)/Fe(III). Было изучено влияние различных параметров на процесс соосаждения солей (состав среды, соотношение Fe(II)/Fe(III), скорость инжекции потоков, температура, присутствие кислорода) на магнитные свойства и размер частиц [45]. Процесс соосаждении без использования стабилизирующих добавок был описан Массартом и им же был получен первый стабильный образец суперпарамагнитных частиц оксида железа путем осаждения солей FeCl2 и FeCl3 в щелочной среде [46]. В исходном синтезе, частицы магнетита (Fe3O4) имели приблизительно сферическую форму, а их размер составлял 8 нм [47]. Тщательное исследование параметров этого процесса позволило продемонстрировать влияние типа выбранного основания (аммиак, метиламин, гидроксид натрия), величины рН, добавок катионов и Fe2+/Fe3+ и их соотношения на выход реакции, размер и полидисперсность наночастиц [47]. Другие исследования показали, что изменение формы наночастиц связано с изменением поверхностной плотности заряда [48]. В работе [49] была подробно исследована зависимость размеров наночастиц магнетита и его коллоидная стабильность в водных щелочных и кислотных растворах, а также составлена диаграмма окислительно-восстановительного равновесия в системе магнетит/гематит/Fe(II). В частности установлено, что средний гидродинамический диаметр (определенный методом динамического светорассеяния) наночастиц Fe3O4 в растворе соляной кислоты (pH 1.7-4.6) составляет 82 нм, а в растворе тетраметиламмония (pH 9.4-12.2) – 58 нм, а наиболее стабильные дисперсии образуются в интервалах pH 2-4 и 10-12. Вжно отметить, что частицы могут быть диспергированы в водном носителе или неполярных жидкостях, таких как масла или органические растворители, что позволяет получать магнитные эмульсии, капсулы, везикулы, липосомы [50-52]. Было показано, что увеличение концентрации цитрат-ионов в процессе соосаждения позволило уменьшить размер цитрат-стабилизированных наночастиц от 8 до 3 нм. Эффект добавок цитрата можно пояснить двумя процессами: 1) комплексообразование цитрата с ионами железа предотвращает нуклеацию, и 2) адсорбция цитрата на зародышевых частицах способствует гидролизу, что, в свою очередь, ингибирует рост частиц [53]. Размер частиц можно изменить путем пептизации, то есть добавления раствора электролита или осадителя к стабильному коллоидному раствору для его разрушения, в результате чего частицы большего размера образуют осадок, оставляя меньшие и 14 практически монодисперсные частицы в надосадочной жидкости [54, 55]. Соотношение ионов Fe2+/Fe3+ также влияет на состав, размер, морфологию и магнитные свойства осажденных наноразмерных частиц. Так, средний размер частиц увеличивается с ростом соотношения ионов Fe2+/Fe3+, что было подтверждено другими авторами [56]. Средний размер частиц магнетита также существенно зависит от кислотности и ионной силы [57, 58]. Так, чем выше рН и ионная сила, тем меньше размер частиц и ширина распределения по размерам, так как именно эти параметры определяют химический состав поверхности кристалла и, следовательно, ее электростатический заряд [39]. Некоторые другие факторы также оказывают влияние на размер наночастиц, например, увеличение скорости перемешивания приводит к его уменьшению. Таким же образом, уменьшение размера и полидисперсности наблюдается при добавлении основания к реакционной смеси [59]. Напротив, скорость инжекции потока, по-видимому, не имеет выраженного влияния на формирование наночастиц [60]. Было показано, что образование частиц магнетита уменьшается с ростом температуры [60]. Пропускание газообразного азота через реакционную смесь не только защищает магнетит от окисления, а также уменьшает размер частиц по сравнению с синтезами в присутствии кислорода [61, 62]. Однако немостря на простоту метода и его широкое использование, ряд вопросов, связанных с механизмом протекания реакции и факторами, влияющими на размер и стабильность наночастиц магнетита, остается не разрешенным до сих пор. 1.2. Подходы, используемые для стабилизации наночастиц Изучение влияния pH среды, температуры, наличия различных ионов и молекул в растворе направлено на решение более общей проблемы – эффективной стабилизации наночастиц, которая обеспечила бы присутствие индивидуальных наночастиц, а не агломератов в растворах, при этом, существенно не повлияв на магнитные свойства материала и сохранив поверхность частиц пригодной для дальнейшей функционализации. Важным вопросом для последующего использования коллоидных систем, является их устойчивость, которая приобретает особую значимость при биомедицинском применении коллоидов. С целью стабилизации магнитных наночастиц их поверхность покрывают материалами как органической, так и неорганической природы [63, 64]. При биомедицинском применении модификация поверхности наночастиц позволяет не только обеспечить их стабильность в биологических средах с высокой ионной силой, но и управлять характером их взаимодействия с объектами, который определяет биосовместимость наночастиц [65]. Для модификации поверхности наночастиц используют материалы как органической природы [66-72], так и 15 неорганической, такие как диоксид кремния [73] или золото [74, 75]. Подобные покрытия решают двойную задачу: во-первых, препятствуют агрегации наночастиц и окислению магнетита (обе проблемы являются принципиальными при транспорте наноматериалов через кровоток); во-вторых, позволяют модифицировать поверхность различными специфическими лигандами для биомедицинских применений. В частности, в качестве функциональных молекул для модификации поверхности используют инсулин [76], трансферрин [77,78], альбумин [79]. 1.2.1 Низкомолекулярные стабилизаторы Низкомолекулярные вещества, имеющие в качестве функциональных групп карбоксилаты, фосфаты и сульфаты, как известно, могут связываться с поверхностью магнетита [80, 81]. Поверхность наночастиц магнетита может быть стабилизирована в водной дисперсии адсорбцией цитрат-ионов [82] путем формирования координационных связей одной или двух карбоксильных групп в зависимости от стехиометрической насыщенности поверхностных связей и кривизны поверхности частицы. Как минимум одна группа лимонной кислоты взаимодействует с растворителем и отвечает за гидрофильность и поверхностный отрицательный заряд наночастиц. Карбоксилат-ионы оказывают существенное влияние на рост наночастиц оксида железа и их магнитные свойства. Было исследовано влияние концентрации цитрат-ионов на размер частиц маггемита [53]. Повышение концентрации лимонной кислоты при синтезе оксида железа [83] приводит к значительному снижению кристалличности оксидов железа. Кроме того, в присутствии цитрата происходит изменение геометрии поверхности, что было подтверждено другими исследованиями [84-87]. Также в качестве стабилизаторов наночастиц на основе оксидов железа в водной среде были использованы димеркаптосукциновая кислота [88] и фосфорилхолин [89, 90]. В последнее время стал распространенным вариант, когда полученные соосаждением наночастицы магнетита или ферритов, после добавления олеиновой кислоты переводят в органические растворители, образуя гидрофобные магнитные жидкости [91]. Подробно механизм взаимодействия олеиновой кислоты с гидрофильными магнитными наночастицами и перенос их в неполярные растворители, а также влияние присутствия жирных кислот в процессе соосаждения наночастиц магнетита in situ на размер и монодисперсность наночастиц рассмотрены в работе [92]. 16 1.2.2 Высокомолекулярные стабилизаторы Принимая во внимание, что синтез в водной среде направлен в первую очередь на приготовление магнитных наночастиц для использования в медицине и биологии, одним из наиболее эффективных и перспективных методов стабилизации оказалось использование различных полиэлектролитов как in situ, так и при добавлении их к свежеприготовленным наночастицам. В первом подходе, наночастицы покрывают в процессе синтеза. Например, была разработана методика соосаждения в присутствии декстрана [93]. Второй подход состоит в прививке полимера на поверхность свежесинтезированных магнитных частиц [94-96] Стабилизация наночастиц полиэлектролитами в водных растворах, как правило, осуществляется за счет взаимодействия функциональных групп органических макромолекул с поверхностью наночастиц. Наиболее распространенными полиэлектролитами являются полиамиды [97], поликислоты, полиспирты, белки, или, что реже, различные блок-сополимеры [98], содержащие несколько функциональных групп. Полимерные материалы покрытий можно разделить на синтетические и натуральные. Полимеры на основе поли(винилпирролидона) (ПВП), поли(этиленгликоля) (ПЭГ), поли(винилового спирта) (ПВС) и т.д. являются типичными примерами синтетических полимерных систем [99-101]. Поли(этиленгликоль) является гидрофильным, растворимым в воде, биосовместимым полимером. Некоторые исследователи сообщали об использовании ПЭГ [102-107] для увеличения биосовместимости наночастиц оксидов железа и времени их циркулирования в кровотоке [108,109], так как пэгилирование делает частицы «невидимыми» для макрофагов [110, 111]. Покрытия на основе поливинилового спирта частиц предотвращает агломерацию, что приводит к монодисперсным частицам [112-115]. Также были использованы другие полимеры для стабилизации наночастиц полиметакриловая кислота [116], поливинилпирролидон (ПВП) [117], полиакриловая кислота (ПАА), [118,119], полимолочная кислота [120], этилцеллюлоза [121], поли(ε-капролактон) [122]. Природные полимерные системы включают в себя использование желатина, декстрана, хитозана, пуллулана и т.д. [123-127]. В литературе для стабилизации наночастиц наиболее часто применяют декстран и его производные, крахмал, гликозаминогликаны [128, 129]. Так, декстран используется в качестве стабилизирующего полимерного покрытия, в основном, благодаря его биосовместимости [130-133]. Были представлены подробные магнитные и структурные свойства наночастиц оксидов железа, полученных в присутствии декстрана [134]. Результаты анализа позволяют предположить, что наличие 17 полимера ограничивает размер частиц по сравнению с частицами, полученными без полимера. Важным фактором в выборе декстрана является выбор длины макромолекулы, которая обеспечит оптимальное полярное взаимодействие (в основном за счет комплексообразования и водородных связей) с поверхностью оксида железа. Несколько исследований было посвящено разработке способов получения наночастиц оксида железа, стабилизированных альгинатом [135-138]. Показано, что полученные таким образом наночастицы характеризуются стабильностью и суперпарамагнитными свойствами. [139]. Предполагается, что стабильность коллоида связана не только с силами электростатического отталкивания вследствие отрицательного заряда карбоксильных групп альгината, но также обусловлена их взаимодействием с ионами железа на поверхности наночастиц [140]. В настоящее время препараты магнитных наночастиц, инкапсулированных в хитозан привлекают значительный интерес [141-144]. Так, были синтезированы магнитные наночастицы сонохимическим методом для использования в качестве МРТ контрастирующих агентов путем модификации олеиновой кислотой в качестве поверхностно-активного вещества и последующего диспергирования в хитозане, который является подходящим носителем для биологических применений [145]. 1.2.3 Модификации поверхности наночастиц неорганическими материалами Наночастицы оксида железа типа «ядро-оболочка» имеют внутреннее ядро оксида железа с наружной оболочкой из неорганических материалов, в качестве которых, как правило, используют диоксид кремния или золото. Эти покрытия обеспечивают не только стабильность наночастиц в растворе, но также помогают в связывании различных биологических лигандов на поверхности наночастиц для различных биомедицинских применений [146-151]. Как правило, инертное покрытие на основе диоксида кремния на поверхности наночастиц магнетита предотвращает их агрегацию, улучшает их химическую стабильность, а также обеспечивает снижение токсичности [152]. Это покрытие стабилизирует наночастиц магнетита за счет двух различных процессов [153] - экранирования магнитного дипольного взаимодействия, а с другой стороны наночастицы диоксида кремния отрицательно заряжены, что усиливает электростатическое отталкивание магнитных наночастиц. Три различных подхода могут быть использованы для формирования покрытия на основе диоксида кремния. Первый способ основан на известной 18 методике, по которой диоксид кремния формируется in situ посредством гидролиза и конденсации золь-гель прекурсора, например, тетраэтоксиортосилана (ТЭОС) [154-158]. Показано, что конечный размер коллоидов покрытых диоксидом кремния зависит от концентрации наночастиц оксида железа и типа растворителя [159]. Второй способ основан на осаждении диоксида кремния из раствора кремниевой кислоты [160], причем этот способ представляется более эффективным и позволяет максимально эффективно покрывать поверхность магнетита, чем предыдущий подход [161]. Этот подход прост в реализации, и размер частиц можно регулировать от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров путем изменения соотношения SiO2/Fe3O4 или повторения процесса покрытия [162]. Третий способ представляет собой эмульсионный метод, при котором прямые или обратные мицеллы используются для контроля толщины формируемого покрытия диоксида кремния. Этот метод требует больших усилий, так как требуется отделить наночастицы «ядро-оболочка» от поверхностноактивных веществ, стабилизирующих эмульсию [163-165]. Одним из преимуществ покрытия на основе диоксида кремния является наличие поверхностных силанольных групп, которые могут легко вступать в реакцию с различными связующими агентами для ковалентного присоединения лигандов к поверхности наночастиц [166]. Так, например, аминогруппы могут быть введены на поверхность покрытых диоксидом кремния наночастиц магнетита путем гидролиза и конденсации кремнийорганических реагентов, например, аминопропилтриэтоксисилана [167-169]. Важно отметить, что покрытие на основе диоксида кремния обеспечивает высокую устойчивость коллоида частиц при высоких концентрациях, изменении рН или ионной силы [170]. Золото - другое неорганическое покрытие, подходящее для реализации функциональных возможностей магнитных наночастиц, а также для повышения их стабильности в водной среде [171]. Водорастворимые наночастицы магнетита с диаметром около 60 нм синтезировали путем восстановления Au III на поверхности наночастиц в присутствии гидроксиламина [173]. Золото также обеспечивает модификацию поверхности для последующей функционализации химическими или биологическими агентами [174]. 1.2.4 Методы векторизации наночастиц для биомедицинских приложений Различные биологические молекулы, такие как антитела, белки, специфичные лиганды, и т.д., также могут быть связаны с полимером на поверхности наночастиц с помощью химического связывания через амидные или 19 сложноэфирные связи, чтобы придать специфичность частицам для целевой доставки. Для молекулярной визуализации, биовекторы, способные распознавать биологическую мишень, должны быть привиты на поверхность наночастицы. Кроме того, векторизованные наночастицы должны быть очень стабильны в водных растворах при физиологическом значении рН, нетоксичными и способными циркулировать в кровотоке в течение времени, достаточного для достижения своей цели. Первая стратегия, используемая для векторизации наночастиц - это электростатическая адсорбция антител [175] или белков [176-177] на поверхности оксида железа. Однако этот метод не достаточно универсален, потому что трудно контролировать воспроизводимость этого процесса, стабильность в биологических средах, и, в зависимости от ионной силы, равномерность покрытия и число привитых векторов. Другой нековалентной стратегией является использование покрытых стрептавидином частиц оксида железа, которые связываются с биотиновыми лигандами [178-179]. Также существует несколько стратегий ковалентного конъюгирования с использованием амино-, карбокси-, альдегид-, или тиольных групп на поверхности наночастиц [180]. Биоконъюгирование с помощью глутаральдегида [181] или формирования амидных связей на карбоксилированных наночастицах оксида железа было исследовано для пептидов [182] и белков [183]. Была проведена биконъюгация наночастиц магнетита, покрытых диоксидом кремния, с фолиевой кислотой [184] и бычим сывороточным альбумином [185]. В нескольких исследованиях магнитные липосомы были использованы в качестве платформы для включения антител или пептидов в липидные мембраны для биовекторизации наночастиц [186-190]. 1.3 Свойства и параметры наночастиц 1.3.1 Размер наночастиц Размер частиц обычно относится к общему диаметру частиц, включая ядро и покрытие. Так как наименьший диаметр капилляров в организме составляет 4 мкм [191], более крупные частицы в основном будет захвачены и удержаны в легких [192], что может привести к эмболии в пределах капиллярного русла легких [193]. В зависимости от магнитных свойств, большинство наночастиц имеют тенденцию к агрегации, тем самым уменьшая их поверхностный заряд. Это может привести к образованию агрегатов, которые могут оказаться опасными при внутривенном введении. Таким образом, важно знать поверхностный заряд и агрегационное поведение частиц в кровотоке [194] Большинство внутривенно применяемых наночастиц распознаются организмом как «чужаки» и устраняются 20 непосредственно макрофагами ретикуло-эндотелиальной системы [195]. Частицы размером менее 4 мкм попадают через клетки ретикуло-эндотелиальной системы, в основном в печень (60-90%) и селезенку (3-10%) [193]. В то время как мелкие частицы до 100 нм будут фагоцитироваться через клетки печени (отверстия в эндотелий печени составляют от 100 до 150 нм), а для частиц размером более 200 нм существует тенденция к фильтрации селезенкой [196]. Таким образом, чем больше частица, тем короче период ее полураспада в плазме [197]. В зависимости от размера частиц, их поглощение может быть разделено на фагоцитоз (все размеры) или пиноцитоз (менее 150 нм) [195]. Активность фагоцитоза возрастает с увеличением размера частиц [198]. При физиологических условиях частицы размером более 10 нм не могут проникнуть в эндотелий [199]. Однако этот барьер проницаемости может быть увеличен при патологических состояниях, таких как воспаление или опухолевая инфильтрация. В этом случае порог проникновения может быть увеличен до 700 нм [196]. Таким образом, поглощение наночастиц из кровотока сильно зависит от размера частиц, как было доказано in vivo [200] . 1.3.2 Токсичность частиц Все фармацевтические вещества, предназначенные для использования в организме человека и животных, требуют тщательного тестирования на токсичные побочные эффекты. При оценке потенциальной токсичности самих магнитных наночастиц необходимо учитывать, что этот фактор в значительной степени зависит не только от состава частиц, но и от их размеров, площади поверхности, формы, покрытия и модификации поверхности [201]. Из простых геометрических расчетов следует, что при уменьшении размеров частиц возрастает соотношение поверхности к объему. Следовательно, в расчете на единицу веса частиц возрастает поверхность, где могут происходить различные химические процессы. Частицы, в состав которых входят металлы переменной валентности, например, железо, могут активировать процессы перекисного окисления, что может служить причиной их токсичности при попадании в кровь, дыхательные пути и легкие [202]. Токсичность может проявляться также опосредованно, например, продукты деградации частиц могут стимулировать секрецию медиаторов воспалительных процессов [203]. В целом, смешанный оксид железа (магнетит), входящий в состав многих магнитных частиц, считается слаботоксичным материалом. Железо связывается с белком ферритином, ответственным за хранение железа и его экзоцитоз из клетки, а также белком трансферрином, ответственным за удаление избытка железа через плазматическую мембрану [204]. Масштабные исследования фармакокинетики и токсичности суперпарамагнитных частиц оксида железа показали, что при введении в кровь животных 1 мг/кг окиси железа, 21 уже через 1 час 82% частиц захватывалось печенью и 6,2% - селезенкой [205]. Никаких признаков острого или подострого токсического эффекта не наблюдалось даже при увеличении концентрации до 150 мг/кг веса, что существенно превосходит терапевические дозы. Магнетит не влияет на кровяное давление, скорость сердцебиений, частоту дыхания и рассматривается как препарат, хорошо переносимый сердечно-сосудистой системой [206]. Его введение в русло крови человека разрешено FDA [207]. Помимо острой токсичности, должна быть изучена токсичность продуктов разложения в организме [208]. Первые указания на токсичность могут быть получены путем изучения клеточных культур гистологически после инкубации с наночастицами [209-212]. Тем не менее, цитотоксичность обычно намного выше in vitro по сравнению с in vivo. Это можно объяснить тем фактом, что продукты деградации, ответственные за токсичность, устраняются из области локализации наночастиц in vivo. Таким образом, токсичность испытаний, проведенных in vitro, может иметь ограниченное применение. Если наночастицы используются в живом организме, они должны быть гидрофильными и рН коллоида должен быть близок к 7.4 [213]. Кроме того, они должны деградировать в организме без остатков, иначе они могут накапливаться в определенных клеточных компартментах или тканях ретикулоэндотелиальной системы [214]. Один из возможных тестов на токсичность in vivo является внутрибрюшинное введение наночастиц у мышей [215, 216], что позволяет исследовать дозу LD50, митотический индекс (мутагенность), влияние частиц на макрофаги и другие клетки (печень, селезенка, почки), оцениваемое с помощью гистологии. Токсичность и фармакокинетика (биораспределение, метаболизм, биодоступность) наночастиц со средним диаметром 80 нм было исследовано ранее in vivo [217], при этом при проведении гистологического или серологических тестов крови токсичных побочных эффектов обнаружено не было. Дальнейшие испытания in vivo частиц 100-1000 нм с различными покрытиями, а также клинические испытания на людях показали отличную биосовместимость [218-220]. 22 1.3.3 Поверхностный заряд Дзета-потенциал - это электрический потенциал между краями диффузного слоя ионов в жидкости, окружающей заряженную коллоидную частицу, который возникает в результате накопления электрических зарядов на границе раздела твердой и жидкой фаз [221]. Для электростатической стабилизации магнитных наночастиц, необходимо высокое значение дзета-потенциала. Дзета-потенциал зависит от концентрации электролита, растворенного в среде in vitro или белков плазмы, дополнительно адсорбировавшихся на наночастице in vivo. Если дзетапотенциал меньше, чем заданное критическое значение для конкретной системы. агрегация и осаждение частиц неизбежны. Поверхностный заряд также играет важную роль во время эндоцитоза, например, в меньшей степени поглощаются отрицательно заряженные частицы из-за отталкивания от одноименно заряженной клеточной мембраны. Тем не менее, эндоцитоз in vitro минимален, если дзетапотенциал близок к нулю [222]. В отличие от него, фагоцитоз увеличивается с более высоким поверхностным зарядом независимо от знака заряда [195]. Чем выше поверхностный заряд, тем короче время пребывания частиц в кровеносной системе [197]. 1.3.4 Магнитные свойства наночастиц Магнитные свойства наночастиц определяются многими факторами, среди которых следует выделить химический состав, тип кристаллической решетки и степень ее дефектности, размер и форма частиц, их морфология (для частиц с комплексной структурой), взаимодействие частиц с окружающей их матрицей и соседними частицами. Изменяя размеры, форму, состав и строение наночастиц, можно в определенных пределах управлять магнитными характеристиками материалов на их основе. Однако контролировать все эти факторы при синтезе удается далеко не всегда, поэтому свойства однотипных наноматериалов могут сильно различаться. В применении магнитного поля для доставки веществ существуют определенные ограничения, главное из которых заключается в допустимых величинах силы магнитного поля. В теле человека имеется ряд белков, содержащих атомы железа и потенциально способных реагировать на внешнее магнитное поле, таких как гемоглобин, ферритин, трнсферрин, различные цитохромы. В то же время, клинические исследования действия поля 8Т не выявили никаких необратимых патологических нарушений [223]. В случае 10Т поля было показано, что хотя оно и влияет на кровоток, его можно рассматривать как безвредное [223], или вызывающее обратимые изменения при кратковременном действии [224]. 23 В медицинской практике для адресации наночастиц используются магнитные поля значительно меньшей напряженности. Поле 0,2Т вполне достаточно для этих целей, хотя длительность действия поля может составлять десятки минут [225]. Важен также выбор подходящего материала для создания частиц. Известно, что различные материалы по разному реагируют на действие внешнего магнитного поля. Парамагнитные материалы очень слабо магнетизируются вдоль направления магнитного поля. Диамагнитные материалы магнетизируются в направлении, противоположном внешнему полю. Ферромагнитные материалы магнетизируются строго в направлении магнитного поля и способны сохранять намагнитченность после того как внешнее магнитное поле удалено [226, 227]. При этом ферромагнитные материалы взаимодействуют друг с другом даже после исчезновения внешнего поля, проявляют тенденцию образовывать большие агрегаты, что может приводить к закупорке сосудов. Ферромагнетизм связан с размером частиц. Частицы достаточно малого размера испытывают быстрые температурные флуктуации, в результате которых суммарная величина намагниченности становится равной нулю. Такие частицы, даже если в их состав входит ферромагнетик, не имеют остаточной намагниченности после удаления поля и не образуют агрегатов. Однако в достаточно сильном магнитном поле их потенциальная энергия намагниченности превышает энергию тепловых флуктуаций, и они способны эффективно перемещаться в градиенте магнитного поля как ферромагнетики. При отключении внешнего магнитного поля такие частицы мгновенно теряют намагниченность. Это явление называется суперпарамагнетизмом. Однако слишком малый размер частиц уменьшает возможность воздействия на них магнитного поля [228]. Частицы на основе оксида железа обычно ведут себя по-разному в магнитном поле в зависимости от их размера. Как сообщалось ранее рядом исследователей [229, 230], резкие изменения магнитных свойств происходят, когда размер частиц уменьшается от микро- до нанометрового диапазона. Например, частицы имеют суперпарамагнитные свойства, когда их размер достаточно мал (6-15 нм), и они ведут себя как ферромагнетики, когда размер зерна лежит в микронном диапазоне. Было показано [231], что магнитное поведение зависит от температуры блокировки частиц (blocking temperature (температура блокировки) - это температура перехода между ферромагнитным и суперпарамагнитным состоянием), значение которой зависит от размера частиц. Частицы с более низкой температурой блокировки обладают суперпарамагнитными свойствами, тогда как частицы с более высокими температурами блокировки демонстрируют ферромагнитное поведение. Несмотря на рост суперпарамагнитного поведения частиц с уменьшением их размера, некоторые авторы отметили снижение 24 абсолютных значений намагниченности насыщения, когда размер частиц становится менее 10 нм [232, 233]. Модифицирование поверхности наночастиц оксида железа обычно приводит к образованию немагнитной оболочки из-за образования наружного слоя, толщина которого может составлять 1-20 нм [234]. Кроме того, было установлено, что покрытие поверхности наночастиц оксидов железа различными полимерами приводит к снижению величины намагниченности насыщения частиц [235]. 1.4 Применение наночастиц магнетита Благодаря своим уникальным свойствам, магнитные наночастицы имеют высокий потенциал для применения в различных биомедицинских областях, таких как [236-239]: модификация и сепарация клеток, в качестве инструмента для исследования клеточной биологии, в том числе для выделения и очистки клеточных популяций; (Б) восстановление биотканей; (C) для доставки лекарственных средств; (D) магнитно-резонансной томографии (МРТ); (Е) гипертермии и т.д. При этом эффективность частиц для конкретных биомедицинских применений зависит от: (а) магнитных свойств частиц; (б) размера [240]; (в) химии поверхности [241, 242]. 1.4.1 Магнитная сепарация Распространенное применение магнитных наночастиц – это магнитная сепарация, в которой для эффективного разделения требуются: значительный градиент магнитного поля и большой магнитный момент частицы. Данный метод является наиболее распространенным методом разделения клеток в естественных условиях [243], потому что меченые клетки могут быть обнаружены с помощью МРТ [244]. Большинство современных методов маркировки основываются на двух подходах: (а) прикрепление биосовместимых магнитных частиц к поверхности клетки [245] или (б) поглощение клетками биосовместимых магнитных частиц в жидкой фазе эндоцитоза [246], рецептор-опосредованного эндоцитоза [247] или фагоцитоза [248]. Также для эффективной маркировки клеток используют магнитные наночастицы, поверхность которых модифицирована лигандами, которые позволяют эффективно достигать клетокмишеней с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза [249, 250]. Существует большое разнообразие потенциальных лигандов, которые могут быть конъюгированы с поверхностью наночастиц для облегчения рецепторопосредованного эндоцитоза последних [251]. В качестве целевых агентов могут выступать различные белки трансферрин, лактоферрин, альбумин, инсулин, 25 факторы роста и т.д., так как рецепторы к этим лигандам часто избыточно экспрессируется на поверхности клеток млекопитающих [252]. 1.4.2 Гипертермия Магнитные наночастицы могут быть синтезированы так, что резонансным образом могут откликаться на внешнее переменное магнитное поле определенной частоты и амплитуды, при этом эффективно поглощая внешнюю электромагнитную энергию и передавая ее в виде тепла окружающим биологическим объектам. Магнитно-индуцированная гипертермия, один из методов лечения для лечения рака, означает экспозицию ткани опухоли в переменном магнитном поле. Магнитное поле не поглощается живыми тканями и может быть применено в глубоких областях живого организма. Количество тепла, генерируемого магнитными частицами при приложении магнитного поля, зависит от природы магнитного материала и параметров магнитного поля. Магнитные частицы, встроенные в область опухоли и размещенные в переменном магнитном поле, будут нагреваться до определенной температуры в зависимости от магнитных свойств материала, напряженности магнитного поля, частота колебаний и мощности кровотока. Раковые клетки разрушаются при температуре выше 43°С, в то время как нормальные клетки могут выживать при такой температуре. Таким образом, можно вызывать разрушение опухолей. Эффект гипертермии сильно зависит от размера магнитных наночастиц. Оптимальным является диаметр частиц около 14 нм [253, 254]. Теплопродукция также зависит от интенсивности и частоты магнитного поля. Нагрев до 41°С считается умеренной гипертермией. При таком нагреве можно активировать иммунную систему против клеток опухоли, поэтому данный подход рассматривают как неспецифическую иммунотерапию рака [255, 256]. Разрушение клеток и удаление опухоли (термоабляцию) можно наблюдать при нагреве до 46-56°С, при этом происходит некроз тканей [257]. При таких воздействиях очень важно не повредить окружающие ткани, поэтому необходима очень точная доставка наночастиц к злокачественным клеткам. Для решения этой задачи липосомы очень удобны, поскольку к их поверхности можно прикреплять различные лиганды, что позволяет увеличить специфичность адресации [258]. Использование липосом в целях гипертермии позволяет загружать в клетки большое количество магнитного материала и достигать высокой избирательности. 26 1.4.3. Доставка лекарств Одной из областей применения магнитных наночастиц в медицине является адресная доставка лекарств. К ее основным преимуществам относят возможность значительного уменьшения токсического действия лекарств на другие органы и системы организма, возможность направлять и удерживать в определенном месте наночастицы с лекарством при помощи градиента магнитного поля [259, 260], возможность визуализации процесса доставки с помощью ЯМР и магнитной резонансной томографии (МРТ) [261-264], а также инициации высвобождения доставляемого терапевтического агента путем нагрева частиц в магнитном поле [265-267]. Целевая направленность доставки может быть обеспечена как физическими силами (магнетик), так и с помощью коньюгирования к поверхности наночастиц антител (специфическими к данной опухоли). Для этих приложений размер, заряд и свойства поверхности магнитных частиц очень важны, так как оказывают значительное влияние на время их циркуляции в крови, а также биодоступность в организме [268]. Кроме того, магнитные свойства частиц и их распределение в организме определяются их размером [269] Например, после системного введения крупные частицы с диаметром более 200 нм, как правило, поглощаются в селезенке в результате механической фильтрации и, в конечном счете, удаляются фагоцитами, что приводит к значительному снижению времени циркуляции в крови. С другой стороны, частицы с диаметром менее 10 нм также быстро удаляются через сосуды и почки. Частицы с размером в пределах от 10 до 100 нм, являются оптимальными для внутривенного введения впрыска и демонстрируют самые длительные времена нахождения в кровотоке. Из-за развитой поверхности, магнитные наночастицы имеют тенденцию к агломерации и адсорбируют белки плазмы. Таким образом, покрытие поверхности наночастиц амфифильными полимерными поверхностно-активными веществами, такими как полоксамеры, полоксамины и поли(этиленгликоль) (ПЭГ) позволяет значительно увеличить время их циркуляции в крови путем минимизации адсорбции белка на наночастицах [270]. 1.4.4 Тераностика В настоящее время интенсивно развивается новое направление медицины, называемое тераностикой [271], которое предполагает создание объектов, совмещающих в себе диагностическую и терапевтическую функции. Требованиям, предъявляемым этой концепцией, отвечают магнитные наночастицы, которые позволяют не только оказывать локальное терапевтическое 27 (термическое) воздействие на ткани [272], но и осуществлять контроль их накопления с помощью МРТ [273-275]. Как было показано, дистанционный нагрев магнитных наночастиц в ткани можно реализовать воздействием переменного магнитного поля [276]. Магнетит является одним из перспективных материалов для биомедицинских применений благодаря сочетанию высокого значения магнитной проницаемости, относительно высокой биосовместимости и отработанных технологий синтеза и модификации поверхности [277]. Как правило, наночастицы магнетита способны изменять поперечную релаксацию Т2, и их присутствие вызывает более темное окрашивание ткани на МР изображении [275,278]. 1.4.5 Магнитно резонансная томография МРТ является одним из самых мощных неинвазивных форм визуализации и широко используется в клинической медицине в настоящее время. Применение МРТ неуклонно расширяется в течение последнего десятилетия благодаря высокому пространственному разрешению и хорошему контрасту для различных тканей. Способность магнитных наночастиц повышать скорость протонной релаксации для конкретных тканей служит причиной того, что контрастирующие агенты на их основе имеют значительные перспективы. Благодаря своим уникальным физическим свойствам и способности функционировать на клеточном и молекулярном уровне взаимодействия с биологическими объектами, магнитные наночастицы активно исследуется в качестве следующего поколения контрастирующих МРТ агентов. В МРТ изображения можно получить при помощи различных механизмов контрастирования: плотность протонов, T1, T2 и T2*. Однако, не смотря на то, что МРТ позиционируется, прежде всего, как неинвазивный метод, в ряде случаев для повышения контраста области интереса на МР томограммах необходимо использовать контрастирующие вещества. Рассмотрим кратко основные механизмы контрастирования в МРТ и основные характеристики контрастирующих агентов, оказывающие наибольшее влияние на их контрастирующие свойства. Плотность протонов в ткани - это количество подвижных протонов водорода на единицу объема этой ткани. МР изображения, взвешенные по плотности протонов, представляют собой карту распределения подвижных протонов в организме и несут в себе относительно мало интересной в клинических исследованиях информации. Восстановление намагниченности в продольной плоскости называется Т1 релаксацией или продольной релаксацией. Причиной Т1 релаксации является 28 потеря ядром энергии в результате спин-решеточного взаимодействия. Восстановление намагниченности в продольной плоскости происходит по экспоненциальному закону с постоянным временем Т1. Под временем Т1 релаксации подразумевают время, при котором продольная намагниченность восстанавливается на 63%. При использовании контрастирующих агентов потеря ядром энергии в основном происходит посредством диполь-дипольного взаимодействия между неспаренными электронами парамагнитного иона и окружающими протонами. Это взаимодействие происходит под влиянием трех физико-химических характеристик: подвижность диполей, скорость реориентации молекул воды; число неспаренных электронов одного из диполей. Таким образом, при изменении размера молекул или частиц Т1 контрастирующих агентов, изменяется их подвижность, в результате чего может измениться время T1 релаксации системы. На релаксивность Т1 контрастирующих веществ также влияет число молекул воды, связанных с молекулами агента, или изменение среднего расстояния между молекулами агента и молекулами воды. Уменьшение намагниченности в поперечной плоскости называется Т2 релаксацией или поперечной релаксацией. В основе Т2 релаксации лежит процесс расфазировки прецессии магнитных моментов ядер, обусловленный спинспиновым взаимодействием. Уменьшение вектора намагниченности в поперечной плоскости также происходит по экспоненциальному закону. При этом под временем релаксации Т2 подразумевают время, при котором поперечная намагниченность уменьшается на 63%. Уменьшение времени Т2 релаксации в присутствии контрастных веществ основано на ускорении процесса расфазировки прецессии магнитных моментов ядер под действием локальных градиентов магнитного поля. Например, суперпарамагнитные частицы оксида железа создают сильные локальные градиенты магнитного поля, воздействующие на протоны, окружающие эти частицы. Это взаимодействие зависит от расстояния между суперпарамагнитными частицами и протонами. На время поперечной релаксации, прежде всего, влияет две физико-химические характеристики контрастирующего агента: подвижность наночастиц и их намагниченность. Таким образом, на контрастирующие свойства суперпарамагнитных частиц влияет их размер, степень агрегации и намагниченность, а также состояние наночастиц, обусловленное фазовыми переходами [279]. В результате того, что присутствие в исследуемом объекте контрастных веществ, изменяющих преимущественно продольную релаксацию, вызывает увеличение интенсивности МР сигнала, то такие вещества часто называют «позитивными контрастирующими агентами». Вещества, изменяющие преимущественно поперечную релаксацию, напротив, называют «негативными 29 контрастирующими агентами», т. к. они вызывают появление областей с низкой интенсивностью сигнала на МР изображениях. В настоящее время для контрастирования в клинической МРТ наиболее широко используется комплекс иона гадолиния Gd3+ с диэтилентриаминпентауксусной кислотой. Контрастные агенты на основе ионов гадолиния преимущественно уменьшают время спин-решеточной релаксации и даже при низкой концентрации обеспечивают увеличение интенсивности МР сигнала. В связи с тем, что данная диссертационная работа посвящена получению и исследованию свойств наночастиц оксида железа, изменяющих преимущественно поперечную и в некоторых случаях продольную релаксацию, изучение Т1 контрастных агентов на основе гадолиния и так называемых CEST (Chemical Exchange Saturation Transfer) контрастирующих агентов выходит за рамки этого обзора. В данном обзоре будут рассмотрены контрастирующие агенты на основе наночастиц оксида железа, и агенты, одновременно контрастирующие в Т1 и Т2 модах. В качестве Т2 контрастирующего агента рассматриваются препараты, содержащие суперпарамагнитные наночастицы оксида железа. Как было сказано выше, такие частицы преимущественно ускоряют спин-спиновую релаксацию. В результате на Т2 взвешенных МР изображениях уменьшается интенсивность сигнала и область, содержащая магнитные наночастицы, представляется более темной по сравнению с областью, не подверженной влиянию контрастирующего агента. В настоящее время выпускается ряд препаратов, содержащих суперпарамагнитные частицы на основе оксида железа – Sinerem, Resovist, Feridex, Ferumoxtran. Обычно в клинической МРТ суперпарамагнитные наночастицы оксида железа используются для определения заболеваний печени, так как они селективно поглощаются клетками Купфера в печени, селезенке и костном мозге [280]. Если при заболевании нормальное строение тканей печени нарушается, то данная область будет иметь недостаток клеток Купфера. Из-за незначительного поглощения наночастиц атипичной тканью печени, на МР томограммах виден сильный контраст между нормальной и атипичной тканью. Тем не менее, высокое поглощение наночастиц в печени приводит к их быстрой экскреции из плазмы крови, что сильно уменьшает время их циркуляции в кровотоке. На время циркуляции наночастиц в крови сильно влияет их размер. В клинической МРТ наночастицы оксида железа, имеющие размер <50 нм, применяются также для визуализации лимфатических узлов [281]. Поскольку наночастицы очень малы, может происходить их экстравазация из кровеносных сосудов в интерстициальное пространство, и, таким образом, наночастицы будут транспортироваться к лимфатическим узлам через лимфатические сосуды. С 30 помощью суперпарамагнитных частиц оксида железа, покрытых углеродом, и, поверх углерода, декстраном можно следить in vivo за стволовыми и иммунными клетками, которые были предварительно загружены данным Т2-контрастирующим агентом, а затем трансплантированы в организм [282-283]. Несмотря на многолетние исследования, суперпарамагнитные частицы оксидов железа долгое время было запрещено использовать в клинической МРТ в качестве контрастирующих агентов. Проблемы с переходом к клиническим испытаниям МР контрастирующих агентов на основе оксидов железа в первую очередь связаны с размером частиц, так как более крупные частицы имеют существенные ограничения для использования in vivo, и их дозировкой - для получения хорошего контраста необходимо относительно большое количество наночастиц оксида железа. Также проблема применения контрастных агентов на основе оксидов железа была связана с выбором воспроизводимого процесса синтеза, который мог бы быть легко автоматизирован и адаптирован для массового производства. Тем не менее, на данный момент много работ посвящены получению новых контрастных агентов на основе суперпарамагнитных наночастиц. Например, суперпарамагнитные наночастицы оксидов железа, покрытые аскорбиновой кислотой, можно рассматривать как потенциальный МР контрастирующий агент, одновременно обладающий антиоксидантными и лечебными свойствами [284]. Показано, что после адсорбции аскорбиновой кислоты на поверхность наночастиц оксида железа ее антиоксидантные свойства сохраняются. Значения времен релаксации таких частиц сопоставимы со значениями времен релаксации используемых сегодня клинических препаратов, например ферумокстрана (ferumoxtran). Для получения наночастиц, пригодных для использования в качестве МР контрастирующего агента, блок сополимеры использовали в процессе синтеза наночастиц во время соосаждения солей железа под действием основания [285]. Свойства наночастиц, в том числе коллоидную стабильность и релаксивность, можно варьировать путем изменения концентрации сополимера и тщательного подбора анкерных групп. Значение r2 для раствора таких наночастиц равнялось 370 мМ-1с-1, что аналогично характеристикам коммерческого препарата Resovist. Показано, что при использовании наночастиц, имеющих полимерное покрытие, усиление контраста в Т2 зависит в основном от степени агрегации этих наночастиц, при этом влияние на МР сигнал самого полимера относительно не велико [286]. Авторами работы выдвинуто предположение о том, что если образование агрегатов можно регулировать, то это может служить средством для достижения высокого контраста при сохранении коллоидной стабильности. 31 Однако стоит отметить, что при сильной агрегации наночастиц магнетита, магнитный момент агрегатов становится настолько большим, что на МР томограммах возникают артефакты. Это происходит в результате того, что в МРТ для пространственного кодирования информации используются градиенты магнитного поля, и сильная локальная его неоднородность, а также увеличение магнитной проницаемости области интереса (ROI - region of interest), нарушает этот процесс, приводя к образованию пространственных искажений на томограммах. Скорость релаксации протонов также сильно зависит от размера частиц оксидов железа, в меньшей степени от состава их покрытия и гидрофильности их поверхности [287]. В работе [288] описан синтез наночастиц оксида железа имеющих форму восьмилучевой звезды и показана возможность их применения в качестве Т2 контрастного агента для МРТ. В работе показано, что такие частицы эффективнее ускоряют спин-спиновую релаксацию по сравнению со сферическими частицами. Это решает проблему достижения необходимого контраста при относительно не большой концентрации. Хороший контраст in vitro был получен авторами при концентрации указанных наночастиц 0,2 мМ, что лучше в сравнении со сферическими частицами оксида железа, описанными в этой же работе (>0,4мМ). Однако стоит отметить, что метод термического разложения, которым были получены такие частицы, является достаточно сложным и проблема его адаптации для массового производства остается актуальной. К тому же пока неизвестно насколько стабильными будут наночастицы с подобным соотношением площади поверхности к объему в плане коллоидной устойчивости и химического состава. Для повышения точности диагностирования при МРТ разрабатываются контрастные агенты, изменяющие как продольную релаксацию протонов, так и поперечную. В работе [289] для изменения Т1 и Т2 релаксации предложена структура «ядро-оболочка». В качестве «ядра» используются суперпарамагнитные наночастицы оксида железа. Наночастицы покрывают оболочкой из диоксида кремния и затем на диоксид кремния адсорбируют слой парамагнитного соединения, изменяющего преимущественно продольную релаксацию. Существует проблема различия влияния контрастирующих агентов и артефактов на МР изображениях. Артефакты МРТ, которые происходят при определенных эндогенных условиях, таких как кальцификация, присутствие жира, кровоизлияния, сгустков крови, воздуха, являются проблематичными, поскольку они имитируют сигналы, поступающие от МР контрастных агентов. Благодаря использованию контрастирующих агентов, изменяющих Т1 и Т2 релаксацию исключается возможность ложного диагностирования из-за влияния подобных артефактов. 32 В ряде работ описывается концепция многофункциональных нанообъектов, которые могут быть визуализированы различными методами. В работе [290] показана возможность получения контрастирующих агентов на основе суперпарамагнитных наночастиц, ускоряющих поперечную релаксацию (Т2) при МРТ и обладающих люминесценцией. Концепция многофункциональных гибридных наночастиц может служить технологической платформой для нового поколения биологических датчиков. Используемые сегодня коммерческие частицы, покрытые декстраном бактериального происхождения, обладают также рядом недостатков, таких как повышенная аллергенность [291], низкая эффективность проникновения в клетку путем эндоцитоза жидкой фазы [292]. Декстран также неудобен для прикрепления дополнительных функциональных групп, которые могли бы улучшить интернализацию частиц в клетки. Кроме того, декстрановая оболочка быстро разрушается лизосомами, в результате чего происходит нежелательное высвобождение оксида железа в цитоплазму [293]. По сравнению с полимерными стабилизаторами наночастиц, оболочка из бислоя фосфолипидов обладает рядом существенных преимуществ, определяемых высокой биосовместимостью фосфолипидов [294]. Кроме того, фосфолипиды хорошо прикрепляются к поверхности частиц [295] и деградируют в цитоплазме значительно медленнее [296], что позволяет достигать больших концентраций частиц в клетках, необходимых для ЯМР-визуализации. Отмечалось, что использование больших моноламеллярных магнитолипосом позволяет получать очень хороший контраст в ангиографических исследованиях на животных [297]. 1.5 Композитные материалы, содержащие наночастицы оксида железа, и их применение Основной способ использования наночастиц как средств доставки – это либо сорбция на поверхность, либо в слой на поверхности, что ограничивает загрузочную эффективность и приводит к тому, что для обеспечения терапевтической эффективности необходимо вводить значительное количество наночастиц, 2) сложность обеспечения направленного высвобождения поверхностно инкапсулированных веществ, так как вся поверхность занята веществом и нет возможности придать ей адресность. Кроме того, так как эффективность взаимодействия с клетками и тканями определяется размером частиц, то остается небольшой интервал варьирования этого размера для наночастиц. В отличие от ультрадисперсных систем, таких как гидрозоли магнитных наночастиц композитные системы, например, магнитолипосомы, нанокомпозитные капсулы микронного и субмикронного размера имеют 33 несравнимо больший полезный объем для капсуляции биоактивных веществ, а также обеспечивают возможность применения внешних воздействия для управления пространственным перемещением и проницаемостью стенок указанных контейнеров. 1.5.1 Магнитолипосомы и их применение Использование магнитных микро- и наночастиц в качестве агентов терапевтического воздействия постоянно возрастает за последние годы [298,299]. Для инъекций в кровь реальный размер частиц не должен превышать 200 нм. Частицы большего размера должны обладать эластичностью для проникновения в мелкие капилляры и движения по ним. Для медицинской визуализации различных процессов, в том числе ЯМР-визуализации магнитных частиц, оптимальный размер может быть менее 100 нм [300]. Более широкому биомедицинскому применению наночастиц магнетита будут способствовать увеличение времени циркуляции наночастиц в кровотоке для накопления терапевтической дозы в целевой ткани и реализация адресной доставки. Одним из путей решения перечисленных выше задач является использование липосом, содержащих магнитные наночастицы [301]. Термин магнитолипосомы был впервые предложен в 1983 году в работе Марголиса с соавторами [301]. Различают два основных вида магнитолипосом: так называемые классические магнитолипосомы, в которых магнитное «ядро» ~15 нм в диаметре покрыто фосфолипидным бислоем, и большие моноламеллярные магнитолипосомы (от 100 до 500 нм в диаметре), содержащие магнитные наночастицы во внутреннем водном объеме [271, 302]. С точки зрения обеспечения навигации посредством градиента магнитного поля, а также возможности капсуляции биологически активных веществ во внутреннем объеме, более эффективны большие моноламеллярные липосомы [303,304]. Липосомы обладают высокой биосовместимостью, а их поверхность может быть модифицирована высокоспецифичными лигандами для адресной доставки в опухолевую ткань или место воспаления [305]. В настоящее время достаточно много работ посвящены получению и изучению магнитолипосом, содержащих магнитные наночастицы как во внутреннем объеме, так и внутри липидного бислоя. В работе [306] авторы для получения магнитолипосом использовали наночастицы маггемита, заключенные во внутреннем объеме везикул. Полученные магнитолипосомы использовались для увеличения контраста при магниторезонансной ангиографии. В работе [307] авторы использовали гидрофобные наночастицы маггемита, которые 34 впоследствии были заключены в липидном бислое. Присутствие наночастиц маггемита в оболочке липосом позволило обеспечить возможность дистанционного высвобождения инкапсулированного цитостатика (доксорубицина) с помощью переменного магнитного поля [307]. Магнитолипосомы с наночастицами магнетита имеют ряд преимуществ с точки зрения тераностики по сравнению с наночастицами маггемита, например, более высокая чувствительность к воздействию магнитного поля из-за рекордного значения магнитной проницаемости магнетита среди оксидов железа [308]. В процессе циркуляции в крови магнитолипосомы сохраняют целостность, способны адсорбироваться на поверхности клеток и проникать внутрь посредством эндоцитоза, что позволяет доставлять лекарственное вещество в цитоплазму [309]. Для дальнейшего увеличения специфичности адресации к поверхности липосом необходимо прикреплять специфические лиганды [310, 311]. Если на поверхности магнитолипосом находится специфический лиганд, лекарство может эффективно доставляться к соответствующим клеткам без проявления токсического эффекта на окружающие ткани [312]. Классические магнитолипосомы не имеют свободного пространства внутри везикулы и поэтому с их помощью могут транспортировать только гидрофобные вещества, которые можно интегрировать в гидрофобный бислой липидов. Значительно лучшие возможности для хранения водорастворимых агентов представляют большие моноламеллярные магнитолипосомы [271]. Если лекарство находится внутри больших моноламеллярных липосом, разогрев магнитных частиц в переменном магнитном поле до температуры плавления липидов позволяет высвобождать водорастворимые вещества из липосом. На этом приницпе основано действие термочувствительных магнитолипосом [313]. В дальнейшем этот принцип был применен для высвобождения веществ in vivo [314,315]. Кроме того, с помощью термочувствительных магниоолипосом исследовалась возможность адресации ЯМР-контрастных агентов [317]. 1.5.2 Композитные микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции полиэлектролитов и наночастиц Метод последовательной адсорбции полиэлектролитов является новым и перспективным методом получения наноразмерных планарных покрытий [317], в основе которого лежат силы кулоновского взаимодействия между противоположно заряженными группами полиионных макромолекул, образующих чередующиеся монослои на подложке. Этот метод был успешно применен для получения тонких пленок, содержащих наночастицы [318, 319]. Данный метод 35 позволяет формировать полиэлектролитные или нанокомпозитные пленки не только на плоских подложках, но и на поверхности сферических коллоидных частиц (ядер), после растворения которых остается полая микрокапсула. Процесс синтеза полиэлектролитных микрокапсул по сути не отличается от процесса формирования планарных полиионных покрытий (см. рис.1) Рис.1. Получение полиэлектролитных мультислойных микрокапсул Микрокапсулы привлекают большой интерес как системы доставки лекарственных средств для различных биомедицинских применений, так как они обеспечивают многочисленные преимущества (по сравнению, например, с липосомами), такие как высокая эффективная загрузка активных веществ и гибкость физико-химических свойств, что позволяет спроектировать их для конкретных приложений [320-322]. Микрокапсулы, при достаточно малом размере имеют большой внутренний объем и значительную площадь поверхности, что обеспечивается послойной самосборкой их оболочек методом последовательной адсорбции противоположно заряженных ионов, макромолекул и/или наночастиц [323-326]. Большое число исследований посвящено использованию различных органических или неорганических темплатов для инкапсуляции биоактивынх веществ и составу оболочек капсул, пригодных для направленной доставки и высвобождения вешеств [327-329] в месте патологии для терапевтических целей. Такая направленная доставка имеет огромное значение в медицинских и фармацевтических областях, где очень важно сделать минимальную дозировку максимально терапевтически эффективной, что позволяет снизить токсичность препарата наряду с повышением его эффективности. Таким образом, капсуляция веществ с помощью полиэлектролитных микрокапсул является перспективной для реализации систем их хранения и контролируемого транспорта. В связи с этим особую актуальность приобретает реализация возможности дистанционного управления проницаемостью оболочек микрокапсул с целью контролируемого высвобождения их содержимого. Управлять проницаемостью капсул можно различными способами, например, изменением температуры [330], кислотности среды [331, 332], воздействием лазерного излучения [333], ультразвука [334.] и т.д. Для обеспечения чувствительности оболочек микрокапсул к перечисленным внешним воздействиям необходимо ввести в состав их оболочек нанообъекты, чувствительные к тому или иному внешнему воздействию. Так, действие лазерного излучения основано на нагреве металлических наночастиц, встроенных 36 в оболочку капсул, которое дистанционно изменяет проницаемость оболочки или ее полностью разрушает, высвобождая инкапсулированное вещество [335-337]. Многообразие веществ, способных выступать в роли компонентов оболочек капсул, дает возможность настраивать свойства формируемых оболочек в очень широких пределах. Переменное магнитное поле, воздействуя на магнитные наночастицы, встроенные в объем оболочки, повышает проницаемость капсул для высокомолекулярных веществ. Микрокапсулы могут быть также функционализированные с помощью магнитных наночастиц для расширения терапевтических применений или с целью придания свойств распознавания цели с помощью функциональных молекул для реализации направленной доставки. Было продемонстрировано также использование высокочастотного магнитного поля для обеспечения высвобождения инкапсулированных веществ из композитных микрокапсул, в структуру оболочки которых встраивали магнитные наночастицы. Соответственно, магнитное поле высокой частоты 50-100 кГц ускоряет вращение и движение внедренных наночастиц оксида железа, с умеренным выделением тепла, которое впоследствии вызывает конформационные изменения полиэлектролитных макромолекул, что приводит к деградации капсулы и быстрому высвобождению инкапсулированных веществ [338] Следует отметить, что характеризация свойств композитных микрокапсул значительно упрощается, если использовать планарные слои аналогичной структуры в качестве моделей. Известны исследования, авторы которых для моделирования свойств микрокапсул первоначально формировали и исследовали планарные покрытия, имеющие такую же структуру, как и капсулы [339-340]. Достаточное число исследований посвящено исследованию магнитных свойств композитных покрытий полиэлектролит/наночастицы [341-344]. Проведенные исследования показали, что физические свойства нанокомпозитных покрытий зависит от многослойной архитектуры [345-348]. Выводы к 1 главе Как следует из обзора, существует значительное число методов синтеза наночастиц магнетита, однако наиболее простым в реализации является метод химической преципитации из растворов солей двух- и трехвалентного железа в присутствии основания. Хотя процесс преципитации оксидов железа из раствора достаточно прост в исполнении, на результат влияет значительное число факторов, поэтому для получения наночастиц оксидов железа с воспроизводимыми параметрами, такими как размер и химический состав, актуальной задачей является автоматизация экспериментальных условий синтеза, 37 которые позволят синтезировать монодисперсную фракцию наночастиц требуемого размера и адаптировать процесс для массового производства. Для реализации данной задачи не всегда оптимально использование коммерчески доступных автоматических систем для синтеза наночастиц для биомедицинских применений. В связи с этим необходимо разработать автоматизированный комплекс для получения монодисперсных частиц в инертной атмосфере и стерильных условиях. В случае реализации указанной задачи следующим шагом на пути к биомедицинскому приложению наночастиц должно явиться исследование их взаимодействия с клетками и тканями. Как следствие, важными являются вопросы токсичности и биораспределения наночастиц, так как они определяются многими факторами. Однако в настоящее время в исследованиях, посвященных возможным токсическим эффектам наночастиц металлов, не достаточно освещены вопросы изучения накопления и морфологических изменений во внутренних органах при однократном и многократном введении наночастиц. Наночастицы магнетита широко используются для биомедицинских целей, однако в силу трудно устраняемых недостатков, таких как низкая эффективная загрузка, сложность обеспечения контролируемого высвобождения биологически активных веществ, трудность синтеза частиц с размером, оптимальным для взаимодействия с тканями, более преспективно, например, для доставки биологически активных веществ, использовать композитные системы. В качестве таковых перспективны магнитолипосомы, нанокомпозитные капсулы микронного и субмикронного размера, которые имеют несравнимо больший полезный объем для капсуляции биоактивных веществ, а также обеспечивают возможность применения внешнего воздействия для управления пространственным перемещением и проницаемостью стенок указанных контейнеров. Присутствие магнитных наночастиц в составе подобных систем доставки дает возможность их in vivo визуализации с помощью метода МРТ. Однако в современной периодической литературе отсутствуют результаты исследований по оптимизации состава, концентрации наночастиц с целью получения максимально возможного контрастирования композитных объектов in vivo и возможность их распознавания на фоне артефактов, которые неизбежно возникают в ходе проведения МРТ исследования живых объектов. В отличие от липосомальных систем в литературе также отсутствуют результаты исследований биораспределения нанокомпозитных биосовместимых капсул во времени при различных способах введения. 38 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Синтез коллоидов оксида железа 2.1.1 Синтез водного раствора коллоидного магнетита стабилизированного цитрат-ионами Для получения наночастиц магнетита использовали гексагидрат хлорида железа (III) (99.8%, Aldrich), тетрагидрат хлорида железа (II) (99.8%, Aldrich), гидроксид натрия (99.8%, Fluka) и лимонную кислоту (99.8%, Aldrich). Все реагенты использовали без предварительной очистки. Синтез наночастиц магнетита вели с использованием реакционной установки, представленной на рисунке 2.1. Рис. 2.1 Схема установки для получения наночастиц магнетита Наночастицы магнетита получали методом химической преципитации из раствора солей двух- и трехвалентного железа под действием основания. Первоначально готовили растворы используемых реагентов: 0.65 г FeCl3·6H2O и 0.24 г FeCl2·4H2O растворяли в 12 мл воды при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре. В реакционную камеру помещали 100 мл 0.1М раствора NaOH. Для последующей стабилизации коллоида предварительно готовили 100 мл раствора лимонной кислоты с концентрацией 20 мг/мл. Через камеры с раствором солей, раствором для стабилизации и реакционную камеру, содержащую гидроксид натрия, барботировали поток азота в течение 10 мин для удаления растворенного кислорода (рисунок 2.1, канал 1). Далее, раствор солей железа под давлением азота в течение нескольких секунд впрыскивали при активном перемешивании в раствор гидроксида натрия (рисунок 2.1, канал 2) и оставляли при перемешивании на 30 минут в атмосфере азота. Полученный черный осадок наночастиц магнетита осаждали с помощью постоянного магнита и сливали надосадочную жидкость, вытесняя её азотом в сливную камеру (рисунок 2.1, канал 4). Затем, при перемешивании, к осадку добавляли 25 мл раствора лимонной кислоты с концентрацией 20 мг/мл (также под давлением 39 азота) (рисунок 2.1, канал 3), перемешивали и процесс осаждения повторяли. Подобную процедуру проводили 4 раза (пока не израсходуется раствор лимонной кислоты). Важно отметить, что за счет стабилизирующего эффекта карбоксилатионов лимонной кислоты размер частиц уменьшается и, соответственно, скорость осаждения коллоида в процессе промывки снижается. В процессе последней промывки оставляли 5-10 мл жидкости и интенсивно перемешивали. Полученный коллоидный раствор магнитных наночастиц помещали в диализную пленку и погружали в емкость с водой объёмом 1-1.5 л при слабом перемешивании и диализовали 4 дня. Все процессы смешивания реагентов и промывки проводили под атмосферой азота, управляя давлением газа в каналах системой клапанов. Концентрация полученного магнитного коллоида по методу сухого остатка составила 5 мг/мл. 2.1.2 Методы характеризации полученных наночастиц магнетита Измерение ζ-потенциала Измерение ζ-потенциала и размера частиц гидрозоля магнетита проводили с помощью анализатора ZetasizerNano-Z (MalvernInstrumentsLtd, Великобритания). Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) Капли водного коллоидного раствора магнетита помещали на медную сеточку, покрытую углеродной пленкой. Измерения проводились с помощью просвечивающего электронного микроскопа ZeissEM 912 Omega (Zeiss, Германия). Для получения распределения по размерам образца наночастиц проводили анализ ПЭМ-изображений в программном пакете ImageJ [349]. Спектроскопия комбинационного рассеяния Все спектры комбинационного рассеяния света были получены с помощью комбинированной системы ИНТЕГРА Спектра (NT-MDT), используя твердотельный лазер с длиной волны 473 нм (мощность лазера в точке 3.5 мВт). Измерения проводили с использованием ×100 объектива с числовой апертурой 0.90 и пространственным разрешением ~ 1 мкм. Время экспозиции составило 60 с. Спектроскопия Спектры поглощения гидрозоля магнетита измеряли с помощью спектрофотометра SpecordM40 ("Карл Цейс Йена", Германия). 2.1.3 Характеризация полученных наночастиц магнетита Химическое осаждение оксидов железа из смешанных растворов солей двухи трехвалентного железа в присутствии основания позволяет получать значительные количества наночастиц [350,351]. Химическая реакция, соответствующая формированию наночастиц магнетита, представлена ниже [352, 353, 354] 40 Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH– = Fe3O4 + 4H2O. Формирование наночастиц магнетита происходит в диапазоне значений pH от 9 до 14 при условии, что соотношение молярных концентраций Fe3+ : Fe2+ = 2:1, в отсутствии кислорода. Для предотвращения агрегации наночастиц их поверхность покрывали молекулами лимонной кислоты. ζ-потенциал наночастиц магнетита составлял –30 ± 2 мВ при pH 6.5 ± 0.1. Распределение наночастиц по размерам было изучено методами динамического рассеяния света (рис. 2.2) и ПЭМ (рис. 2.3), при этом средний размер наночастиц составил 12 ± 3 и 6 ± 2 нм соответственно. Значение размера наночастиц, установленное методом динамического рассеяния света, превышает таковое, полученное из анализа ПЭМ-изображений. Данный факт объясняется тем, что в первом случае измерение размера наночастиц происходило в водной среде, и, таким образом, полученный результат соответствует гидродинамическому радиусу частиц. Анализ ПЭМ-изображений (рис. 2.3) показал, что наночастицы достаточно монодисперсны и имеют форму, близкую к сферической. Рис. 2.2. Распределение наночастиц по размерам, полученное методом динамического рассеяния света. 41 Рис. 2.3. ПЭМ-изображение наночастиц магнетита (а) и гистограмма их распределения по размерам (б). С помощью спектрометра комбинационного рассеяния света зондовой нанолаборатории ИНТЕГРА Спектра регистрировали спектры различных образцов магнетита. На представленных на рисунке 2.4 спектрах можно видеть два основных пика: при 670 см–1 и около 700 см–1, относящихся к магнетиту [355] и маггемиту [356] соответственно. В образце 1, синтезированном в атмосфере азота, присутствует только магнетит, а образец 2 представляет собой смесь магнетита и маггемита, которая образуется при окислении магнетита на воздухе. Рис. 2.4. Спектры комбинационного рассеяния коллоидных растворов: 1 – магнетита (670 см–1), 2 – смеси магнетита (670 см–1) и маггемита (700 см–1). Рентгено-фазовый анализ порошка наночастиц магнетита проводили с помощью дифрактометра Xcalibur/Gemini (Oxford difraction) (излучение Cu-Kα, 42 коллиматор 0,8 мм). Полученный спектр представлен на рисунке 2.5, где основные дифракционные пики соответствуют гристаллографическим плоскостям кубической обращенной шпинели Fe3O4: (111), (220), (311), (222), (400), (333), (440), (533). Полученные результаты хорошо согласуются со спектрами, полученными из базы данных дифрактограмм. Так как окисление наночастиц происходит от поверхности к центру, то использование метода КР позволяет оценить кинетику их окисления на начальных стадиях благодаля тому, что данный метод, в отличие от РФА, позволяет исследовать приповерхностный слой. Рис. 2.5. Спектры, полученные методом РФА порошка наночастиц магнетита. В подписи к пикам указаны индексы Миллера для магнетита. 2.1.4 Управление электрокинетическим потенциалом Важным вопросом для последующего использования коллоидных систем, является их устойчивость, которая приобретает особую значимость при биомедицинском применении коллоидов. При биомедицинском применении модификация поверхности наночастиц позволяет не только обеспечить их стабильность, но и управлять характером их взаимодействия с объектами, который определяет биосовместимость наночастиц. Кроме этого тип стабилизатора определяет технологические особенности дальнейшего 43 использования частиц и свойства композитов, их содержащих. Одним из направлений применения наночастиц оксида железа в биомедицине является использование их в качестве компонента различных нанокомпозитных структур, таких как покрытия и микрокапсулы, получаемые методом последовательной адсорбции. Свойства таких структур сильно зависят от объемной доли наночастиц оксида железа, а на количество адсорбированных частиц магнетита влияет величина их электрокинетического потенциала. При этом изменение знака ζпотенциала позволяет применять различные материалы при получении подобных структур. Тем самым, используя различные полиэлектролиты для создания матрицы нанокомпозитных структур можно дополнительно управлять свойствами получаемых объектов. Для получения различного знака электрокинетического потенциала частиц в качестве стабилизатора применялись лимонная и соляная кислоты, а также полиэлектролиты: поли акриловая кислота-co-малеиновая кислота (ПАК/МК) и полиэтиленимин (ПЭИ). Процесс получения отрицательно заряженых наночастиц оксида железа стабилизированых цитрат-ионами был подробно описан в разделе 2.1. Частицы, стабилизированные цитрат-ионами были исследованы наиболее подробно в связи с тем, что основные исследования, связанные с биомедицинским применением магнитных коллоидов, проводились с использованием именно такого типа частиц. Для получения положительно заряженых наночастиц магнетита использовали раствор 2М HCl. Водный коллоид был получен по методике соосаждения солей, описанной выше за исключением этапа промывки. Промывка проводилась деионизованной водой в таком же количестве как и в случае с цитратстабилизированными частицами. После промывки к коллоиду приливали 400 мкл 2М раствора соляной кислоты. Затем коллоидный раствор центрифугировали 1 мин при 18000 G. Размер полученных таким способом наночастиц составлял 25-30 нм, а дзета-потенциал - +58±2 мВ (по данным ДРС). Также показана возможность перезарядки поверхности наночастиц с помощью полиэлектролитов. Для этого был использован раствор наночастиц магнетита (размер 8нм, дзета потенциал -31мВ) концентрацией 1,9 мг/мл. И был приготовлен водный раствор ПЭИ (молекулярная масса 10кДа) концентрацией 0,1 мг/мл. Раствор наночастиц магнетита медленно прикапывали к раствору ПЭИ в течение 5 мин при сильном ультразвуковом воздействии. При этом были получены частицы размером 66 нм, имеющие дзета-потенциал 73 мВ и индекс полидисперсности 0,194. Характеризация раствора проводилась методом динамического рассеяния света. 44 2.1.5 Экстракция наночастиц магнетита в неполярный растворитель Для получения коллоидного раствора магнетита в неполярной среде использовали наночастицы, предварительно синтезированные в воде. Водный раствор наночастиц магнетита получали методом химической преципитации из раствора солей двух- и трехвалентного железа по технологии, описанной выше, за исключением этапов промывки и диализа. Для перевода полученных наночастиц в неполярный растворитель использовались два способа. В первом случае для перевода частиц использовали ультразвук. Для этого сразу после промывки смешивали полученный водный коллоид и керосин в соотношении 1:1,5 соответственно и добавляли олеиновую кислоту. В результате перемешивания с помощью ультразвука в течение 30 мин частицы оксида железа переходили в керосин и были стабилизированы олеиновой кислотой. Затем коллоидный раствор в органическом растворителе и воду разделяли методом центрифугирования. Во втором случае для перевода частиц использовали ацетон. Для этого после промывки к раствору наночастиц приливали 5%(по объему) олеиновой кислоты и 75% ацетона при сильном перемешивании. После этого раствор центрифугировали 30 секунд при 1000 G и отбирали надосадочную жидкость. Затем наночастицы были диспергированы в неполярном растворителе. В случае избытка олеиновой кислоты частицы промывались аналогичным способом: раствор разбавляли ацетоном в несколько раз, затем центрифугировали 30 секунд при 4000 G и отбирали надосадочную жидкость. Осадок диспергировали в чистом неполярном растворителе. 2.2 Приготовление и характеризация магнитолипосом Синтез наночастиц магнетита проводили с использованием реакционной установки, подробно описанной в разделе 2.1. Концентрация магнитного коллоида, определяемая методом сухого остатка, составила 10 мг/мл. Величина pH концентрированного стабилизированного раствора составила 4. Значение ζпотенциала наночастиц магнетита составило–27±2 мВ при pH = 6.5 ± 0.1. На рис. 2.6(а) представлено ПЭМ-изображение гидрозоля магнетита. Распределение наночастиц по размерам исследовали методами динамического светорассеяния (рис.2.6(b)). Средний размер наночастиц по данным динамического рассеяния света составил 13±3 нм. 45 Рис. 2.6. (а) - Изображение наночастиц магнетита, полученное методом просвечивающей электронной микроскопии. (b) - Распределение по размерам наночастиц магнетита, полученное методом динамического светорассеяния. Спектр поглощения водного золя магнетита, вид которого хорошо согласуется с ранее полученными данными, представлен на рис. 2.7 [357]. Количественные измерения концентрации наночастиц магнетита были выполнены с использованием калибровочных кривых, полученных на значениях длин волн, соответствующих стандартным источникам оптического излучения (вставка в рис. 2.7). Из литературных данных [358] известно, что энергетический зазор на спектре плотности состояний составляет около 0,5 эВ, а максимальная энергия разрешенного перехода равна 3,5 эВ. Это соответствует диапазону поглощения 350-2500 нм с возрастанием количества возможных переходов при увеличении энергии перехода. Измеренный спектр поглощения гидрозоля магнетита обладает этими особенностями имея увеличение оптической плотности при уменьшении длины волны, в которое, по всей видимости, также вносит вклад рассеяние в диапазоне коротких длин волн. 46 Рис.2.7.Спектр оптической плотности водного золя магнетита, 0.1 мг/мл. На вставке изображена зависимость оптической плотности от концентрации наночастиц, измеренная на длинах волн 532, 633, 660 и 785 нм. Для инкапсулирования наночастиц магнетита в липосомы использовали природные фосфолипиды: фосфатидилхолин из яичного желтка (РС) и фосфатидилинозит (PI) из пекарских дрожжей, содержащие примерно половину остатков насыщенных жирных кислот (пальмитиновой и стеариновой), а остальные — ненасыщенных олеиновой и линоленовой кислот. Фосфатидилинозит используется как естественный стерический стабилизатор липосом в кровотоке [359,360]: показано, что остатки инозита молекул PI, составляющих примерно 10 % бислоя, создают на поверхности мембраны высокогидратированную стабилизирующую оболочку, подобно остаткам ПЭГ2000 (степень полимеризации 45–48) в стерически-стабилизированных Stealth® липосомах [361]. Магнитолипосомы готовили стандартным методом экструзии, аналогично [362]. Аликвоты растворов яичного фосфатидилхолина (56.0 мг) и фосфатидилинозита из пекарских дрожжей (6.9 мг) в смеси хлороформ–метанол, 2 : 1, соупаривали. К гидрозолю магнетита добавляли 20× фосфатный солевой буфер (PBS) до конечной концентрации солей в гидрозоле 8.0 г/л NaCl, 0.2 г/л KCl, 0.888 г/л Na2PO4, 0.15 г/л NaH2PO4 и 0.2 г/л KH2PO4. Липидные пленки гидратировали 2 мл (до конечной концентрации по липидам 40 мМ) гидрозоля магнетита в PBS в течение 2 ч, затем дисперсию подвергали пяти циклам замораживания/оттаивания (N2 жид/+40°С) и продавливали через поликарбонатные мембранные фильтры с калиброванным размером пор 200 нм (Whatman) с помощью мини-экструдера Avanti. Магнитолипосомы отделяли от невключившихся наночастиц с помощью гель-хроматографии на колонке с сефарозой CL-4B (70 мл). Эффективность загрузки липосом определяли по отношению содержания магнитных наночастиц во внутреннем водном объеме после гель-хроматографии к суммарному содержанию магнитных наночастиц в исходной липосомальной дисперсии. Содержание магнетита в липосомах определяли спектрофотометрически по предварительно полученной калибровочной зависимости поглощения гидрозоля на 532 нм от концентрации магнетита. Предварительно липосомы разрушали додецилсульфатом натрия (60 мкл 20% SDS на 250 мкл аликвоты дисперсии липосом) для высвобождения наночастиц из внутреннего водного объема и во избежание рассеивания света везикулами. Общая зависимость между размером наночастиц и временем их циркуляции в крови не известна. Тем не менее, в некоторых случаях, закономерности in vivo поведения наночастиц схожего химического состава, были определены как 47 функции от их размера [359]. Например, в случае недеформируемых полимерных наночастиц, покрытых фрагментами ПЭГ, пролонгированная циркуляция обеспечивается при размере <150 нм. Увеличение размера тех же частиц до 200 ± 250 нм приводит к быстрому выведению их из организма из-за интенсивной фильтрации через эндотелий венозного синуса селезенки [363]. Для липосом покрытых ПЭГ, было показано, что скорость их выведения относительно слабо зависит от их размера в диапазоне от 80 до 250 нм [364]. Размер липосом (200 нм) и концентрация липидов (40 мМ) выбраны из соображения увеличения общего внутреннего объема липосом для нагрузки их наночастицами. Используя суспензию магнитных наночастиц 10 мг/мл (0.043 M), удалось получить препарат магнитолипосом, содержащий ~0.2 моль Fe(III) на моль фосфолипидов, что соответствует эффективности загрузки 4.4% (доля наночастиц в липосомах после гель-фильтрации по отношению к общему добавленному количеству). Это достаточно высокий показатель по сравнению с литературными данными [365]. По данным динамического лазерного светорассеяния, средний диаметр магнитолипосом составил 147 ± 41 нм (указаны средний диаметр ± полуширина на половине высоты). Низкое значение индекса полидисперсности (PDI = 0.082) свидетельствует о монодисперсности липосом. Контроль размера липосом после разбавления в PBS до концентрации ~50 мкг/мл проводили с помощью динамического лазерного светорассеяния на приборе BI9000 (Brookhaven Instruments), а также Zetasizer Nano-Z (Malvern Instruments Ltd). По данным динамического рассеяния света размер липосом остается неизменным более 2 месяцев. 2.3 Формирование объектов методом полиионной сборки 2.3.1 Формирование нанокомпозитных покрытий, содержащих катионные и анионные наночастицы магнетита Для создания покрытий были использованы следующие материалы: поли(аллиламина гидрохлорид) (PAH = 70000, Sigma), растворенный в 0,15 М водном растворе хлорида натрия; водный раствор поли(этиленимина) (PEI, MW = 600000 - 1000000, Sigma), при концентрации 2 мг/мл. Водный коллоидный раствор оксида железа был приготовлен по методике, подробно описанной в разделе 2.1 с массовой концентрацией частиц 5 мг/мл. Нанокомпозитные пленки были сформированы на поверхности пластин монокристаллического кремния с ориентацией (111). Обработка подложек проводилась путем кипячения в четыреххлористом углероде. Поверхность кремниевой пластины, погруженная в воду, может частично покрываться за счет гидроксильных групп. В результате поверхность подложки приобретала отрицательный заряд в воде при нейтральном pH[18,19]. Для повышения 48 эффективности формирования полиэлектролитной пленки и уменьшения ее шероховатости в качестве вещества для создания первого полимерного слоя использовали полиэтиленимин [366].Толщина первого слоя PEI была найдена методом рентгеновской рефлектометрии и эллипсометрии [366] и с помощью АСМ [367] и составляет около 2 нм. Многослойные покрытия были созданы методом полиионной сборки при погружении подложек в растворы PAH и наночастиц оксида железа, которые имеют положительное и отрицательное значения дзетта-потенциала, соответственно. Каждый адсорбированный слой промывали три раза деионизированной водой, прежде чем начать следующий шаг адсорбции, для того, чтобы избавиться от некоторых заряженных молекул или наночастиц, которые не были адсорбированы на поверхности подложки. Полученные нанокомпозитные пленки сушили на воздухе при комнатной температуре. Нанесение многослойных плёнок на кремниевой подложке было проведено с помощью автоматической установки «ПОЛИИОН-1М» [368; 369]. Были подготовлены следующие многослойные структуры: (I) PEI/(оксид железа/PAH)6, (II) PEI/(оксид железа/PAH)11; (III) PEI/(оксид железа/PAH)16. 2.3.2 Исследование морфологии, состава и магнитных характеристик нанокомпозитных покрытий. Атомно-силовые микроскопические изображения были сделаны с помощью NT-MDT-SOLVER-PROM в полуконтактном режиме, используя зонды NSG01/Co. Поверхность была отсканирована при 2,08 Гц с разрешением изображения 256 линий, и затем к изображениям был применен фильтр. Для оптимизации чувствительности магнитно-силовой микроскопии (МСМ), МСМ измерения проводились с помощью двух проходной методики. В первом проходе, АСМ-изображение было сделано в режиме записи, чтобы определить рельеф. МСМ была выполнена с учетом этого рельефа с поднятым кантилевером, на его резонансной частоте. Фазовый сдвиг был определен из магнитного взаимодействия между зондом и образцом. Магнитные измерения проводились с помощью вибрационного магнитометра EV9 MicroSense в диапазоне температур 190 и 500 К в поле до 2 Т. магнитное поле создавалось электромагнитом с водяным охлаждением. Из петель магнитного гистерезиса, путем вычитания диамагнитного сигнала от подложки от общего числа зарегистрированных сигналов были получены правильные значения размагничивания, соответствующие сигналам образцов. Все спектры КР были получены с помощью комбинированной системы ИНТЕГРА Спектра, используя твердотельный лазер "Синий Кобальт" (λ0 = 473 нм, мощность лазера в точке, 3,5 мВт). Измерения проводились с использованием 49 ×100 объектива с числовой апертурой 0,90 и пространственным разрешением ~ 1 мкм. Время экспозиции составило 60 с и образцы были приклеены к поверхности стекла. Исследования наночастиц оксида железа проводились непосредственно после синтеза и через неделю. Изменения спектра не были обнаружены. Нанокомпозитные покрытия были изготовлены в течение трех дней при использовании коллоидного раствора наночастиц оксида железа через 6 недель после синтеза коллоида. МСМ и другие магнитные измерения проводились в течение двух недель после приготовления нанокомпозитных покрытий. Спектры КР нанокомпозитных покрытий измеряли через две недели после изучения их магнитных свойств. 2.3.3 Формирование и характеризация полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита Для получения магнитных микрокапсул были использованы следующие материалы: микрочастицы карбоната кальция (диаметр – 3-5 мкм); поли-Lаргинин и декстрансульфат, растворенные в 0,15 М водном растворе хлорида натрия в концентрации 1мг/мл; гидрозоль наночастиц магнетита в концентрации 1мг/мл. Полиэлектролитные микрокапсулы формировали на микрочастицах карбоната кальция, имеющих размер 3-4 мкм. Полиэлектролитная оболочка формировалась методом полиионной сборки. В качестве полиэлектролитов использовались полиаргинин и декстрансульфат. Полученные микрокапсулы содержат три слоя наночастиц магнетита и имеют состав: (поли-Lаргинин/МНЧ)3/декстрансульфат. Примерное содержание оксида железа в 1 мл суспензии полученных микрокапсул – 2,7 мг. Наночастицы магнетита получены по методике, описанной в разделе 2.1, имеют средний размер 20 нм и электрокинетический потенциал -30 мВ (по данным ДРС). Каждый адсорбированный слой промывали два раза деионизированной водой, прежде чем начать следующий шаг адсорбции, для того, чтобы избавиться от некоторых заряженных молекул или наночастиц, которые не были адсорбированы на поверхности микрокапсул. Количество капсул определяли в камере Гаряева. Примерное содержание микрокапсул в 1 мл суспензии –540 млн. Толщина оболочек микрокапсул, измеренная методом АСМ, составляет 54±5 нм (рис. 2.8(а)). Толщина одного слоя наночастиц в оболочке составляет 16±2 нм, что соответствует размеру наночастиц. Отсюда следует, что наночастицы образуют слой с высокой плотностью упаковки. Толщина оболочек микрокапсул 50 представленных в работе [370] составляет 45 нм для структур (PAH/Fe3O4)6, а толщина одного слоя наночастиц составляет 5 нм при размере наночастиц 8 нм. Это связано с тем, что наночастицы в процессе формирования микрокапсул укладываются не равномерно из-за недостаточно высокой плотности заряда. В случае полученных нами микрокапсул заряд слоя полиаргинина достаточно высок, чтобы наночастицы адсорбировались эффективно и образовали плотный последующий слой. Это подтверждается АСМ изображением поверхности микрокапсулы на рисунке 2.8(б). По данным АСМ видно, что толщина слоя наночастиц больше их среднего размера. Рис. 2.8. АСМ изображения биодеградируемой микрокапсулы, содержащей наночастицы магнетита (а) и поверхности ее оболочки (б). 51 Выводы ко 2 главе Предложена схема и реализована установка, позволяющая синтезировать гидрофильные наночастицы магнетита в инертной атмосфере, особенностью которой является то, что управление потоками реагентов происходит за счет изменения давления инертного газа в системе. 52 ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЖЕЛЕЗА НА ЖИВЫЕ СИСТЕМЫ НА КЛЕТОЧНОМ И ТКАНЕВОМ УРОВНЯХ. КОНТРАСТИРОВАНИЕ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА И МАГНИТОЛИПОСОМ ПРИ МРТ 3.1 Наночастицы магнетита, используемые для оценки их воздействия на живые системы На данном этапе диссертационного исследования целью являлась оценка токсической активности наночастиц оксида железа на культуре нейтрофильных гранулоцитов и изучение морфологических изменений тканей и органов лабораторных крыс методом МРТ при однократном и многократном внутрибрюшинном введении наноматериалов. Для проведения экспериментов по оценке воздействия наночастиц оксида железа на живые системы использовали образец гидрозоля магнетита, который был получен по методике, подробно описанной в разделе 2.1. Значение ζпотенциала составило -32±2 мВ при pH=6.5±0.1. Методом динамического светорассеяния было получено распределение наночастиц по размерам (рис. 3.1),а средний размер наночастиц составил 23±6 нм (индекс полидисперсности PDI 0.258). Концентрация магнитного коллоида, определяемая методом сухого остатка, составила 8 мг/мл. Концентрация лимонной кислоты в магнитном коллоиде составила 0.3 мг/мл, которую рассчитывали в предположении о том, что покрытие из стабилизатора представляет собой монослой органических молекул, и, зная геометрические размеры молекул и наночастиц, оценивали концентрацию молекул лимонной кислоты в коллоиде. Методом спектроскопии комбинационного рассеяния было показано, что дисперсная фаза синтезируемых нами золей представляет собой наночастицы магнетита, причем со временем возможно окисление магнетита и образование фракции маггемита [371]. Рисунок 3.1. Распределение наночастиц магнетита по размерам, полученное методом динамического светорассеяния 53 3.2 Взаимодействие коллоида магнетита с нейтрофильными гранулоцитами. Метод определения жизнеспособности клеток по результатам окрашивания постмортальным красителем пропидиумом йодидом (PI) Стандартным методом оценки жизнеспособности клеток является окраска постмортальными красителями [372]. Пропидиум йодид (PI) не проникает через интактную мембрану, поэтому маркирует исключительно ДНК погибших клеток. Нейтрофильные гранулоциты изолировали из венозной крови здоровых доноров на двойном градиенте фиколла-урографина [373], дважды отмывали забуференным физиологическим раствором и взвешивали в концентрации 1 млн. кл/мл. Число живых клеток к началу эксперимента по тесту с PI (Sigma, USA) оценивалось в 98 – 99%. Наночастицы оксида железа тестировались в двух концентрациях – 3.25 и 0.325 мг/мл. Клетки инкубировали с наноматериалами в течение 60 мин (37ºС), однократно отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) (200 g, 3 мин) и фиксировали 70% этиловым спиртом на чашках Петри (Corning, USA) в течение 10 мин. Затем окрашивали раствором PI (5·10-5 мг/мл, 30 сек). После пятикратного отмывания учитывали процент окрашенных (погибших) из 100 просмотренных клеток. Оценка мазков производилась на микроскопе Olympus IX71 (Japan) с объективом х100. В работе исследована кровь 7 здоровых доноров, каждый эксперимент повторяли по три раза. Оценивалась нормальность полученных распределений согласно критерию Шапиро-Уилка, после чего отличия между контролем (нейтрофилы, инкубированные без наноматериала) и опытом (нейтрофилы, инкубированные с наноматериалом) оценивали с использованием критерия Стьюдента. Различия признавались статистически значимыми при p< 0.05. 3.3 Исследование морфологических изменений органов лабораторных крыс с перевитым раком печени при внутрибрюшинном введении цитратстабилизированных наночастиц магнетита В эксперименте использовались 24 белые беспородные крысы самцы весом 180-200 г с перевитой опухолью – рак печени РС-1 (опухолевые штаммы получены в РОНЦ имени Н.Н.Блохина). Крысы получали однократные и многократные внутрибрюшинные инъекции стабилизированных лимонной кислотой наночастиц магнетита со средним размером 23±6 нм в дозе 700 мг/кг и 250 мг/кг веса, соответственно. Работа с лабораторными животными осуществлялась согласно протоколу исследований в соответствии с Женевской Конвенцией 1985 г. о «Международных 54 принципах биомедицинских исследований с использованием животных» и Хельсинкской декларацией 2000 г. о гуманном отношении к животным. В первой серии эксперимента каждая из 6 крыс получала по одной внутрибрюшинной инъекции наночастиц магнетита в дозировке 700 мг/кг. Во второй серии - 6 крысам вводили внутрибрюшинно один раз в сутки в течение 7 дней водный коллоид наночастиц магнетита в дозе 250 мг/кг Доза была рассчитана на основании предварительно проведенных экспериментов. При изучении острой токсичности используемых наночастиц магнетита внутрибрюшинное введение НЧ крысам в дозах от 250 до 750 мг/кг массы тела животного не влияло на их общее состояние и не приводило к гибели животных. Были введены две контрольные группы, состоявшие из 6 крыс в каждой: в первой группе животные получали однократно в инъекцию 1 мл физиологического раствора внутрибрюшинно, а во второй – один раз в сутки 1 мл физиологического раствора в течение 7 дней внутрибрюшинно. Магнитно-резонансная томография проводилась крысам через 24 часа после последнего введения наночастиц в дозировке 700 мг/кг однократно и 250 мг/кг один раз в сутки в течение 7 дней. Иммобилизация животных проводилась в положении на спине с фиксацией конечностей. Экспозиция иммобилизации в каждом случае составляла 60 мин. Для наркоза вводили Золетил в концентрации 4 мг/100 г веса животного внутримышечно. 3.4 Магнитно-резонансная томография Магнитно-резонансную томографию проводили на высокопольном томографе Philips Achieva 1.5T с использованием фазированной катушки. Использовали быстрые «спин-эхо» протоколы (turbospinecho –TSE), взвешенные по Т2 и по Т1. Присутствие в исследуемом объекте контрастных веществ, изменяющих преимущественно продольную релаксацию Т1, вызывает появление гиперинтенсивного сигнала на Т1 взвешенных изображениях (более светлое окрашивание), а контрастные вещества, изменяющие преимущественно поперечную релаксацию Т2, вызывают появление гипоинтенсивного сигнала на Т2 взвешенных изображениях (более темное окрашивание соответствующих маркированных областей ткани) [374, 375]. После проведения МРТ все животные выводились из эксперимента путем декапитации, и проводился забор тканей внутренних органов для гистологического исследования. Гистологическое исследование проводилось на парафиновых срезах окрашенных обзорными методами (гематоксилин и эозин) и по Перлсу (для выявления железа). 55 3.5 Интратуморальное введение магнитных липосом В эксперименте было использовано 10 самцов белых лабораторных крыс линии Wistar массой 160 ±20 г, которым имплантировалось подкожно в область лопатки по 0.5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса штамма рака почки – РА, полученного из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. При достижении опухолью диаметра 1.0 ±0.3 см животные с перевитыми опухолями методом случайной выборки были разделены на две группы по 5 крыс в каждой – 1-ая контрольная группа, 2-ая опытная группа, особям которой интратуморально вводилась суспензия магнитолипосом в физрастворе (концентрация 0,25 мг/мл в расчете на магнетит) по следующей методике: определяли объем опухоли, затем исследуемый раствор в количестве 10% от объема опухоли вводили местно в опухоль струйно со скоростью 0.1 мл в минуту. Введение липосом осуществляли за 1 час до проведения МРТ-исследования. Перед проведением МРТ для анестезии животные получали внутримышечно золетил (Zoletil50,Virbac, France) в дозировке 0.05 мг/кг. Работа с лабораторными животными осуществлялась согласно протоколу исследований в соответствии с Женевской Конвенцией 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных» и Хельсинкской декларацией 2000 г. о гуманном отношении к животным. 3.6 Взаимодействие коллоида магнетита с клетками крови Оценку биобезопасности необходимо производить на культурах клеток, которые интернализируют тестируемые вещества [351]. Поэтому в работе использованы нейтрофильные гранулоциты, для которых отмечены разные варианты интернализации наноматериалов (кавеол-зависимое, рафт-зависимое, клатрин-зависимое). В целом, нейтрофилы способны поглощать вещества субмикронных размеров, в том числе абиотические вещества (как правило, предварительно их поверхность модифицируется белками плазмы), представляя собой одну из основных систем клиренса в кровотоке. При этом они, с одной стороны, неизбежно запускают механизмы биодеструкции вновь поглощенных частиц, с другой – частицы в начальном или трансформированном состоянии могут оказывать негативное воздействие на различные звенья цитотоксического комплекса нейтрофилов [376]. Для тестируемой суспензии наночастиц магнетита выявлено зависимое от концентрации снижение жизнеспособности клеток. В частности, в концентрации 0.325 мг/мл жизнеспособность нейтрофилов сохранялась на уровне 88.6 ± 21.7%. Сравнение с контролем не выявило статистически значимых различий: при аналогичном времени инкубации культуры нейтрофилов без наноматериалов их жизнеспособность сохраняется на 56 уровне 96.3±4.3% (р<0.05). Однако увеличение концентрации магнетита до 3.25 мг/мл (в 10 раз) вызвало значительное и существенное падение жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов до уровня 34.2±10.3% (р<0.05). Результаты видеозахвата также демонстрируют изменения в морфологии клеток при повышении концентрации: отмечается уплощение ядра, в то время как инкубация с малыми дозами коллоида оксида железа не вызывала существенных морфологических видоизменений клеток. При практическом использовании магнетита важно правильно подбирать дозу для того, чтобы не нарушать жизнеспособность клеток. Результаты исследования взаимодействия нейтрофильных гранулоцитов с коллоидным магнетитом показывают, что морфология и выживаемость клеток зависят от концентрации используемого наноматериала. 3.7 Исследование морфологических изменений органов лабораторных крыс с перевитым раком печени при внутрибрюшинном введении цитратстабилизированных наночастиц магнетита При однократном и многократном внутрибрюшинном введении наночастиц магнетита отмечаются дистрофические изменения клеток в виде набухания и зернистой дистрофии эпителия извитых канальцев почек, зернистой дистрофии гепатоцитов и кардиомиоцитов, ишемические повреждения клеток Пуркинье, которые были более выражены при многократном введении, однако в обеих группах имели обратимый характер [377]. В селезенке при однократном введении магнетита отсутствовали выраженные изменения. В случае многократного введения отмечалось преобладание полнокровной красной пульпы над белой, формировались фолликулы с четкой мантийной зоной и гиперплазией светлых герминативных центров. В обеих группах в клетках выявлялись включения черного цвета (вероятно, конгломераты наночастиц). В головном мозге, миокарде, печени, легких развивались признаки нарушения крово- и лимфообращения, проявляющиеся в виде полнокровия сосудов, сепарации крови, отека, развитии диапедезных и очаговых кровоизлияний вплоть до появления нитей фибрина в сосудах печени (рис. 3.4). Данные изменения более выражены при многократном внутрибрюшинном введении наночастиц магнетита. Мы считаем, что обнаруженные в клетках головного мозга ишемические повреждения являются следствием гипоксии сосудистого генеза (рис. 3.4(а)). 57 Рисунок. 3.4. а - головной мозг. Дистрофические изменения клеток Пуркинье в мозжечке. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 400; б - эритроциты и конгломераты наночастиц в сосуде миокарда. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 400; в – печень, скопление гранул наночастиц в клетках Купфера. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 400; г - селезенка, скопление гранул синего цвета. Окраска по Перлсу с докрашиванием гематоксилином и эозином. Ув. х 400 При внутрибрюшинном однократном и многократном введении наночастиц магнетита, их скопления отмечались в месте введения, а также в лимфатических узлах брюшной полости. При длительном введении накопление наночастиц было настолько выраженным, что лимфатические узлы являлись контрастными на МРТ (рис. 3.5б). Наночастицы магнетита способны изменять поперечную релаксацию T2, и их присутствие вызывает более темное окрашивание тканей. Тот факт, что данные скопления были представлены наночастицами магнетита, в дальнейшем подтвердился данными аутопсии, гистологическими исследованиями (рис. 3.5 (а,в)) и результатами темнопольной микроскопии лимфатических узлов (рис. 3.5(г)). 58 Рисунок 3.5. а - скопление наночастиц в стенке брюшной полости по ходу их введения. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 400; б - МРТ снимок крыс с перевитым раком печени РС-1, справа опухоль, слева брюшной полости 3 лимфоузла, накопившие наночастицы; в селективное накопление справа наночастиц железа в лимфатическом узле. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 100; г - темнопольная микроскопия в режиме фазового контраста. Скопление наночастиц светится желтым цветом. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 600 Единичные скопления частиц обнаруживались в сосудах миокарда и клетках Купфера печени, в то время как в перевитой опухоли рака печени накопление наночастиц не подтвердилось ни морфологическими методами, ни данными МРТ (рис. 3.5). При гистологическом исследовании в перевитой опухоли не было выявлено изменений по сравнению с контрольной группой. 3.8 Контрастирование наночастиц магнетита и магнитолипосом при МРТ Для изучения возможности применения полученных магнитолипосом для усиления контрастирования in vivo исследовали зависимость интенсивности МР сигнала от их концентрации. Полученные нами магнитолипосомы имеют в составе наночастицы магнетита и молекулы фосфолипидов. Контраст области интереса на МР изображениях обусловлен взаимодействием магнитных наночастиц с окружающими их протонами, которые являются МР-активными ядрами в клинической МРТ. Так как молекулы фосфолипидов имеют в своем составе протоны, то они предположительно могут вносить вклад в формирование МР сигнала. Для 59 проверки влияния молекул фосфолипидов на интенсивность МР-сигнала были получены образцы незагруженных магнетитом липосом и образцы коллоидов магнетита с различной концентрацией (рис. 3.6). Эти образцы были исследованы на МР томографе. Концентрация липидов в микропробирках составляет 0,13; 0,26; 0,52; 1,05; 2,1 и 4,2 мг/мл, а наночастиц магнетита 0,005; 0,009; 0,021; 0,042; 0,084; 0,065 мг/мл. Эти значения соответствуют концентрациям фосфолипидов и магнитных наночастиц в магнитолипосомах, которые мы использовали для экспериментов invivo.Изполученных МР-изображений видно, что молекулы фосфолипидов при данных концентрациях не вносят вклад в интенсивность сигнала (Рис. 3.6). Рис. 3.6. МР-изображения образцов, содержащих не магнитные липосомы (контроль; концентрация липидов указана в мг/мл) и наночастицы магнетита в различной концентрации (концентрация магнетита указана в мг/мл). (a) – T1 взвешенное изображение; (b) – T2 взвешенное изображение. Также были приготовлены растворы магнитолипосом различной концентрации (0,005; 0,009; 0,021; 0,042; 0,084; 0,065 мг/мл в пересчете на магнетит) и исследован их МР контраст. На рис. 3.7 показаны Т1 и Т2 взвешенные изображения микропробирок, содержащих суспензии магнитолипосом. 60 Рис. 3.7. МР-изображения образцов, содержащих магнитные липосомы в различной концентрации (концентрация в расчете на магнетит, указана в мг/мл; Общее содержание липидов в наиболее концентрированном образце (0,165 мг/мл магнетита) на изображениях соответствует ~4.2 мг/мл). (а) – T1 взвешенное изображение; (b) – T2 взвешенное изображение. Зависимость интенсивности МР-сигнала от концентрации наночастиц магнетита на Т1 взвешенных изображениях представлена на рисунке 3.8(а) и имеет немонотонный характер как в случае отдельных наночастиц, так и в случае наночастиц в составе магнитолипосом. Это, предположительно, происходит в результате того, что наночастицы магнетита создают локальные интенсивные магнитные поля, флуктуирующие около резонансной частоты, обеспечивая ускорение спин-решеточной релаксации окружающих их протонов. При увеличении концентрации наночастиц, большее количество протонов воды попадает под влияние магнитных моментов наночастиц и, следовательно, интенсивность МР-сигнала увеличивается. Однако при увеличении концентрации наночастиц больше 0,02 мг/мл, существенным оказывается взаимодействие магнитных моментов частиц между собой, что предположительно изменяет частоту флуктуации этих магнитных моментов. При этом время спин-решеточной релаксации протонов, окружающих частицы, увеличивается, а интенсивность МРсигнала на Т1 взвешенных изображениях уменьшается. На рисунке 3.8 также видно, что магнитные наночастицы при таких же концентрациях, но внутри магнитолипосом дают интенсивность сигналана Т1 и Т2 взвешенных изображениях меньше по сравнению с гидрозолем наночастиц. Это означает, что магнитолипосомы, по сравнению с наночастицами, обеспечивают большее время продольной релаксации (Т1) и меньшее время поперечной релаксации (Т2) протонов. Следовательно на Т2 взвешенных изображениях магнитолипосомы лучше контрастируют чем гидрозоль 61 наночастиц. Так как наночастицы магнетита используются в основном для усиления контраста именно на Т2 взвешенных изображениях, то очевидно, что магнитолипосомы, в данном случае, более эффективны по сравнению с наночастицами магнетита. К тому же магнитолипосомы обладают более высокой биосовместимостью, а их поверхность может быть модифицирована высокоспецифичными лигандами для адресной доставки, что вместе с более эффективным контрастированием в Т2 позволяет говорить о значительном преимуществе использования магнитолипосом по сравнению с гидрозолем магнетита. Рис. 3.8. Зависимость интенсивности МР-сигнала от концентрации наночастиц магнетита (квадратные маркеры) и магнитолипосом (треугольные маркеры). Концентрация в расчете на магнетит. (а) – T1 взвешенное изображение; (b) – T2 взвешенное изображение. В то же время, как уже отмечалось, время релаксации Т1 в случае магнитолипосом больше по сравнению с коллоидом наночастиц магнетита. Отсюда следует, что коллоид наночастиц магнетита контрастирует на Т1 изображениях эффективнее, чем магнитолипосомы. Также видно, что в случае коллоида наночастиц магнетита более выражена зависимость интенсивности МР сигнала от концентрации контрастного агента. Мы предполагаем, что этот эффект можно использовать для определения концентрации наночастиц магнетита. Мы предполагаем, что этот эффект может быть использован для оценки распределения наночастиц магнетита in vivo с использованием МРТ при оценке концентрации наночастиц для гипертермии переменным магнитным полем. 3.9 Интратуморальное введение магнитных липосом Полученные суспензии магнитолипосом были примененены для invivo контрастирования в раковой опухоли путем интратуморального введения объема суспензии в количестве 10% от объема опухоли. МР изображения опухоли после 62 введения магнитолипосом и контроля приведены на рисунке 3.9. Объем области с измененной интенсивностью МР сигнала составил примерно 0.8 см3 на Т1 взвешенной томограмме, и 0.7 см3 на Т2 взвешенной томограмме, что составляет примерно 5% от объема опухоли. Средняя концентрация магнетита в данной области, определенная с помощью кривых интенсивности МР сигнала, представленных на рисунке 5 составила 0.035 мг/мл. Описание: Описание: Fig Рис. 3.9. МР-изображение крыс с перевитым раком почки:a), b)Т1 и Т2 взвешенные изображенияопухоли крысы с интратуморально введенным раствором магнитолипосом (0.25 мг/мл в расчете на магнетит) за 1 час до проведения МРТ-исследования; c), d) Т1 и Т2 взвешенные изображения опухоли контрольной крысы. В перевитой опухоли почки при интратуморальном введении липосом в месте введения наблюдали кровоизлияния. Опухолевые клетки располагаются разрозненно, между ними отсутствуют межклеточные контакты, выявляются дистрофические изменения и некроз опухолевых клеток, а также отмечали скопления липосом между клеток (Рис. 3.10); При проведении гистологического исследования срезов органов наблюдали: в почках набухание и зернистую дистрофию извитых канальцев, единично отмечался белок в просвете прямых канальцев; в селезенке отмечали преобладание красной пульпы над белой 63 пульпой, полнокровие красной пульпы, фолликулы округлой формы со светлым герминативным центром; в печени полнокровие сосудов различного калибра и зернистую дистрофию, что обусловлено некротическими изменениями в опухоли и соответственно интоксикацией. Таким образом, интратуморальное введение магнитолипосом не вызывает каких-либо существенных изменений во внутренних органах. Наблюдаемые изменения в органах характерны для растущей опухоли. Рис. 3.10. (а) - Гистологическое строение рака почки при интрутуморальном введении липосом, в клетках отмечается дистрофия и некроз, а между клетками скопление липосом имеющих синеватый оттенок.I- скопление липосом; II - дистрофия клеток опухоли; III - некроз клеток опухоли. Окраска гематоксилиноми эозином. Ув. 774; (b) - Гистологическое строение рака почки в контрольной группе. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 246. 64 Выводы к 3 главе Определен диапазон концентраций гидрозолей магнетита при их среднем размере 13±3 нм (0,005 – 0,3 мг/мл для Т1, 0,02 – 0,6 мг/мл для Т2) для эффективного использования в МРТ. Максимальное значение концентрации ограничено величиной эффективной магнитной проницаемости среды, увеличение которой вызывает искажения томограммы, а минимальное – величиной магнитного момента отдельной наночастицы. Выявлена низкая цитотоксичность in vitro малых концентраций магнетита (0,325 мг/мл, количество клеток – 106 клеток/мл) в отношении нейтрофильных гранулоцитов. В то же время часовая инкубация с наночастицами в концентрации 3.25 мг/мл приводит к падению жизнеспособности клеток ниже 50 %. Помимо выраженного цитоксического эффекта высоких концентраций магнетита выявлены существенные морфологические изменения клеток крови. Установлено, что основные изменения при внутрибрюшинном однократном и многократном введении наночастиц магнетита крысам с перевитой опухолью печени РС-1 представлены обратимыми дистрофическими и ишемическими повреждениями клеток паренхиматозных органов и нарушениями лимфо- и кровообращения, что позволяет сделать вывод о низком цитотоксическом эффекте исследованных наночастиц магнетита. Показано, что при внутрибрюшинном методе введения максимальное количество наночастиц накапливается и оседает в лимфатических узлах брюшной полости. Получены моноламеллярные липосомы размером 154±47нм на основе яичного фосфатидилхолина, содержащие МНЧ во внутреннем объеме с эффективностью загрузки 4,4%. Определена минимальная концентрация магнитолипосом (0,005 мг\мл по содержанию магнетита), при которой наблюдается контрастирование. При интратуморальном введении магнитолипосом обнаружено усиление контраста области интереса (ROI) на Т1 и Т2 взвешенных томограммах, и определен объем данной области и примерная концентрация в ней магнитолипосом. 65 Защищаемые результаты исследования Магнитолипосомы более эффективно уменьшают время поперечной релаксации (Т2) протонов по сравнению с гидрозолем аналогичных наночастиц при одинаковых концентрациях в расчете на магнетит. Следовательно, на Т2 взвешенных изображениях магнитолипосомы эффективнее увеличивают контраст области интереса по сравнению с гидрозолем наночастиц. 66 ГЛАВА 4 ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ СЛОИ И МИКРОКАПСУЛЫ 4.1 Изучение магнитных свойств наночастиц оксида железа и полимерных структур, их содержащих Целью настоящего исследования было изучение влияния числа слоев наночастиц на магнитные свойства нанокомпозитных пленок ПЭ/НЧ, полученных с помощью метода полиионной сборки с использованием коллоидов оксида железа. Для получения нанокомпозитных покрытий был синтезирован водный коллоидный раствор наночастиц оксида железа по методике, подробно описанной в разделе 2.1. Наночастицы оксида железа были характеризованы методами динамического рассеяния света и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (рис. 4.1). Дзетта-потенциал наночастиц оксида железа, стабилизированных лимонной кислотой, равен -35 ± 3 мВ. При этом средний размер наночастиц составил 12 ± 3 нм. Были изготовлены и изучены нанокомпозитные покрытия, которые состоят из чередующихся слоев отрицательно заряженных наночастиц оксида железа и катионных молекул полиаллиламина гидрохлорида. Магнитные свойства нанокомпозитных пленок изучались при помощи вибрационного магнетометра. Эти измерения были дополнены атомно-силовой микроскопией (АСМ) и магнитно-силовой микроскопией (МСМ). Химический состав нанокомпозитных покрытий изучали методом комбинационной спектроскопии. Рис. 4.1. ПЭМ изображение наночастиц магнетита 67 На рис.4.2 показаны полученные методами АСМ и МСМ фазовые и топографические изображения полиэлектролитных покрытий, содержащих различное количество слоев наночастиц оксида железа. АСМ изображения были обработаны с помощью программного средства визуализации СЗМ и анализа данных Gwyddion 2.5 для того, чтобы получить шероховатость (Ra, Rrms), толщину композитной пленки (dth), диаметр агрегатов наночастиц (Dagg), поверхностную концентрацию агрегатов наночастиц (Nagg), и среднее расстояние между агрегатами (Lagg). При помощи измерения методом АСМ была определена средняя шероховатость(Ra), которая составила 6,5, 6,7 и 5,9 нм (таблица 4.1) для образца 1(PEI/(оксид железа)/PAH)6, образца 2 (PEI/(оксид железа)/PAH)11 и образца 3 (PEI/(оксид железа)/PAH)16 соответственно. Рис.4.2. Топография(a), (с) и (е) и МСМ фазовые изображения при нулевом магнитном поле (b), (d) и (f) для образцов полимерных покрытий.(a), (b) – образец (PEI/(оксид железа)/PAH)6, (c), (d) –образец со структурой (PEI/(оксид железа)/PAH)11, (e), (f)-образец со структурой (PEI/(оксид железа)/PAH)16. 68 Таблица 4.1. Результаты АСМ исследования образцов (PEI(оксид железа /PEI)6, PEI(оксид железа /PEI)11 и PEI(оксид железа /PEI)16). Шероховатости (Ra, Rrms), толщина композитной пленки (dth), диаметр агрегатов наночастиц (Dagg), поверхностная концентрация агрегатов наночастиц (Nagg), среднее расстояние между агрегатами(Lagg), были определены методом АСМ. № образца (число слоев Ra, нм Rrms, dth, нм Dagg, нм Nagg, Lagg, нм -2 оксида железа(N)) нм мкм 1(6) 6,5 8,5 63 131 16 116 2(11) 6,7 9,2 97 139 22 76 3(16) 5,9 7,5 106 128 25 72 Это не характерно для этого типа нанокомпозитных слоев, поскольку шероховатость обычно возрастает с ростом числа слоев оксида железа [367, 368, 378-380]. Такой вариант зависимости можно объяснить более низким значением электрокинетического потенциала наночастиц оксида железа, используемых в наших экспериментах. Ранее были получены аналогичные результаты при изучении методом АСМ оболочек микрокапсул со встроенными наночастицами оксида железа [381]. Толщина композитного покрытия dth возрастает с увеличением числа слоев наночастиц (таблица 4.1). Однако небольшое различие между толщиной dth образцов с 11 и 16 слоями наночастиц оксида железа наблюдалось вместе с уменьшением шероховатости нанокомпозитных покрытий. Этот факт можно объяснить заполнением образованных на поверхности нанокомпозитных покрытий полостей при адсорбции наночастиц оксида железа из коллоидной суспензии наночастиц. Размер полости пропорционален шероховатости нанокомпозитных пленок. Средняя шероховатость нанокомпозитного покрытия, содержащего 11 слоев наночастиц оксида железа приблизительно равна среднему размеру одной наночастицы (табл. 4.1). Этот факт подтверждается результатами, полученными при расчете диаметра агрегатов наночастиц (Dagg), поверхностной концентрации агрегатов наночастиц (Nagg), и среднего расстояния между агрегатами (Lagg). Было отмечено, что увеличение поверхностной концентрации агрегатов наночастиц (Nagg) соответствует уменьшению среднего расстояния между агрегатами (Lagg) и росту числа слоев наночастиц оксида железа N. Зависимость размера агрегатов наночастиц (Dagg) от числа (N) слоев наночастиц имеет немонотонный характер с максимумом при 11 слоях наночастиц оксида железа. Результаты анализа МСМ изображений представлены в таблице 4.2. В отличие от результатов АСМ-изображений, размер агрегатов магнитных наночастиц Dagg рассчитанный по результатам МСМизображений уменьшается с увеличением числа слоев N. Этот факт можно объяснить, принимая во внимание различие агрегатов по химическому составу. Наночастицы оксида железа могут состоять из смеси фаз магнетита и маггемита 69 [355, 368, 382, 383]. Объемная доля маггемита увеличивается с ростом числа слоев и, следовательно, размер областей с более высокой магнитной проницаемостью меньше размера агрегатов. Но поверхностная концентрация магнитных агрегатов (Nagg м) и среднее расстояние между магнитными агрегатами (Lagg м) уменьшается с увеличением числа слоев наночастиц оксида железа. Подобное поведение для поверхностной концентрации агрегатов наночастиц (Nagg) и среднего расстояния между ними (Lagg) наблюдали при анализе АСМизображений. Для МСМ измерений мы использовали магнитные кантилеверы NSG01/Co и рассчитывали фазовый сдвиг (ΔΦ) используя уравнение (1). (1) Однако, величины градиентов магнитных сил были также рассчитаны с помощью уравнения (2) и результаты были представлены на рис. 4.3. (2) Здесь K -жесткость кантиллевера и это значение составляет около 5 Н/м. Q – добротность колебательной системы и его значение равно примерно 315. Рисунок 4.3. Градиент магнитных сил образца PEI(оксид железа/PAH)6 (a), PEI(оксид железа/PAH)11 (b) и PEI(оксид железа/PAH)16 (c) как функция магнитного поля. Для каждого образца, выбирали пять различных точек для построения зависимости градиента магнитной силы от поля. Магнитные домены образца 1, образца 2 и образца 3 полученные из MFM в отсутствии магнитного поля показаны на рис. 3 (б), (г) и (е), соответственно. С увеличением количества магнитных слоев, магнитные домены проявлялись более отчетливо (рис. 3 (с)). 70 Показано сравнение АСМ (рис. 4.2 (а, в, д)) и МFM (рис. 4.2 (б, г, е)) изображений. Исходя из АСМ изображений, шероховатость поверхности нанокомпозитных покрытий связана с образованием кластеров посредством роста нанокомпозитного покрытия. Эти результаты хорошо согласуются с ранее полученными данными[365, 367, 368, 382]. Таблица 4.2. Результаты, полученные путем анализа данных МСМ для образцов PEI(оксид железа /PAH)6, PEI(оксид железа /PAH)11 и PEI(оксид железа /PAH)16. Диаметр магнитных агрегатов (Dagg м), поверхностная концентрация магнитных агрегатов (Nagg м), среднее расстояние между магнитными агрегатами (Lagg м) определенные с помощью MFM. № образца (число слоев оксида Daggm, нм железа(N)) 1(6) 141 Naggm, мкм-2 Laggm, нм 13 134 2(11) 128 20 94 3(16) 114 25 86 На рис. 4.3 показана зависимость градиента магнитных сил образцов от приложенного магнитного поля. Тем не менее, для всех образцов, градиенты магнитных сил возрастают с увеличением магнитного поля для пяти различных точек, которые были выбраны, чтобы определить влияние приложенного магнитного поля на образец. Это соотношение описывается следующим уравнением: (3) При возрастании приложенного магнитного поля увеличиваются значения магнитных моментов образцов. В соответствии с этим отношением, увеличиваются значения градиента магнитных сил. Использование МСМ было необходимо для определения размера и формы магнитных агрегатов, а также их положения на поверхности структур (рисунок 4.2). Расчет намагниченности насыщения Ms проводили по кривым M(H). Для определения Ms были использованы масса и объем наночастиц оксида железа в нанокомпозитных покрытиях (см. таблицу 4.3). 71 Таблица 4.3. Намагниченность насыщения и магнитная проницаемость образцов, полученные по кривым намагничивания № образца (число Ms(193 K) Ms(473 K) µ µ слоев оксида железа (emu/cm3) (emu/g) (emu/cm3) (emu/g) (193 K) (473 K) (N)) 1(6) 286,91 57,38 128,92 25,78 5,4 2,6 2(11) 361,03 72,35 110,05 22,05 5,6 3,1 3(16) 318,59 63,97 286,14 57,45 4,8 3,9 Объем наночастиц оксида железа в нанокомпозитном покрытии представляет собой произведение объема нанокомпозитного покрытия (Vcoating) и объемной доли наночастиц оксида железа. Объем нанокомпозитного покрытия (Vcoating) равен произведению площади поверхности (А) на толщину покрытия (dth). Мы использовали значения толщины покрытий (dth), измеренные методом АСМ (таблица. 4.1). Оценку объемной фракции наночастиц оксида железа в нанокомпозитных пленках проводили в рамках модели эффективной диэлектрической среды с помощью приближения Бруггемана. При рассчете объемной фракции были использованы результаты измерений аналогичных структур методом эллипсометрии[368]. Метод эллипсометрии используется для характеризации не только поверхности нанокомпозитов, но и всего их объема. Значения объемной доли наночастиц оксида железа в нанокомпозитных покрытиях составили 0.37±0.02 для 6 слоев, 0.45±0.02 для 11 слоев и 0.75±0.12 для 16 слоев наночастиц оксида железа. Относительная погрешность при этом составила менее 15 %. Большой вклад в относительную погрешность расчета значений объемной доли наночастиц вносит погрешность определения площади поверхности (A). Массу наночастиц оксида железа рассчитывают как произведение объема наночастиц оксида железа в покрытии на плотность магнетита (5,15 г/см3). На рисунке 5 (а) - (с) показана зависимость намагниченности образцов от приложенного магнитного поля при 193 и 473 К. Кривые M (H), представленные на рис. 4.4 имеют типичную сигмоидальную форму с очень маленькой (приблизительно ноль) петлей гистерезиса в области слабого приложенного поля. Значения намагниченности насыщения MS зависят от числа магнитных слоев как при низкой, так и при высокой температуре (см. таблицу 4.3). Значения MS для наночастиц оксида железа хорошо коррелируют с данными, полученными в предшествующих работах[384]. 72 Рисунок 4.4. Зависимости М(Н) образцов при 193 и 473 К. (a) по числу слоев: 6 со структурой PEI(оксид железа/PAH)6, (b) по числу слоев: 11 со структурой PEI(оксид железа/PAH)11, (c) по числу слоев: 16 со структурой PEI(оксид железа/PAH)16. □ показывает намагниченность магнитной пленки и подложки при 193 К. Линия показывает, намагниченность диамагнитной подложки при температуре 193 K. ■ показывает намагниченность ферромагнитных пленок на 193 К. Звезды показывают намагниченность ферромагнитных пленок при 473 К. Данные, представленные в таблице 4.3, отражают немонотонную зависимость Ms от числа слоев наночастиц оксида железа при 193 К. Эта зависимость имеет максимум (72.35 emu/g.) при 11 слоях наночастиц оксида железа. Это значение хорошо согласуется с данными, полученными для наночастиц магнетита [384] и меньше чем значение Ms для объемного материала [385,386]. Обычно значение Ms для наночастиц меньше, чем для объемного материала [384]. Значения Ms равны 73.5 emu/g [385] и 92 emu/g [385] или 84 emu/g [386] для объемного маггемита и магнетита соответственно. 73 При высокой температуре мы получили достаточно высокую намагниченность насыщения для образца 3. Значение это очень близко к намагниченности насыщения, измеренной нами при более низкой температуре (193 К), поэтому, полученный результат является очень важным с практической точки зрения. В табл. 4.3 представлены значения магнитной проницаемости μ, полученные из кривой М(Н) для разных температур при 193K и 473 К. Магнитная проницаемость была рассчитана с помощью уравнения 4 [368]: (4) Где M – намагниченность, а H – приложенное магнитное поле. Зависимость магнитной проницаемости образцов от числа слоев оксида железа имеет немонотонный характер и имеет максимум при 11 слоях наночастиц. Немонотонный вид зависимости величины магнитной проницаемости от количества слоев оксида железа можно объяснить, используя предположение о различном химическом составе образцов. Поэтому было необходимо изучить химический состав полученных образцов. В данном случае наиболее удобным способом определения химического состава наноструктурированных материалов является спектроскопия комбинационного рассеяния [355, 383, 356]. Были изучены спектры КР образцов покрытий (оксид железа/PAH)n. Кремниевая подложка служила в качестве внутреннего стандарта для измерений КР. При этом использовался комбинационный сдвиг кремниевых пиков при 521 и 622 см-1 [387]. На КР спектрах присутствуют два характерных пика: при 670 см-1 и около 700 см-1, соответствующие магнетиту [355, 383] и маггемиту [356], соответственно. 4.2 In vitro контрастирование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита Для изучения влияния полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита, на формировние МР сигнала были получены биосовместимые композитные микрокапсулы на основе полиаргинина и декстран сульфата, содержащие три слоя наночастиц магнетита в составе оболочки. Было проведено in vitro исследование МР контрастирования суспензий микрокапсул в физиологическом растворе при их различных концентрациях. На рисунке 4.5(а,б) показаны Т1 и Т2 взвешенные томограммы пробирок, содержащих коллоид магнетита (левый столбец) и водную суспензию магнитных полиэлектролитных микрокапсул (правый столбец) в диапазоне концентраций 0,002 – 2,7 мг/мл в расчете на магнетит. Из рисунка видно, что микрокапсулы не контрастируют на 74 МР изображениях, но при концентрациях выше 1 мг/мл начинают создавать артефакты. В ходе эксперимента проводили ферментативную деградацию оболочек полученных микрокапсул путем добавления трипсина, который разрушает пептидные связи поли-L-аргинина и, следовательно, оболочку микрокапсулы. Т1 и Т2 взвешенные томограммы разрушенных микрокапсул изображены на рисунке 4.5(а,б, средний столбец). При деградации оболочек микрокапсул наночастицы, находящиеся в них, высвобождаются и начинают контрастировать на МР изображениях. Исследование суспензии высвобожденных наночастиц методом ДРС показало, что наночастицы в процессе формирования/разрушения микрокапсул агрегировали не значительно. Это подтверждается данными МРТ (рис. 4.5(а,б), средний столбец) и ПЭМ (рис.4.6(а,б)). Таким образом, продемонстрирована возможность оценки деградации полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита, in vitro и in vivo, используя МРТ. Рис. 4.5. (а), (б) - Т1 и Т2 взвешенные МР изображения растворов наночастиц магнетита и разрушенных и не разрушенных магнитных полиэлектролитных биодеградируемых микрокапсул в различной концентрации (концентрация указана в мг/мл). 75 Рис.4.6. Изображения, полученные методом ПЭМ: (а) – микрокапсула, содержащая наночастицы магнетита; (б) – наночастицы в оболочке микрокапсулы; (в,г) – разрушенная микрокапсула при различном увеличении. Предположительно эффект уменьшения контрастирования магнитных микрокапсул в МРТ с большой объемной фракцией магнетита, связан с тем, что расстояние между наночастицами магнетита в подобных микрокапсулах достаточно мало, чтобы магнитные моменты наночастиц взаимодействовали друг с другом настолько, что частота колебаний магнитных моментов молекул воды, находящихся в магнитном поле этих наночастиц, становится значительно выше частоты Лармора для протонов. При этом времена релаксации Т1 и Т2 окружающих протонов воды остаются достаточно большими, т.к. протон в таком случае медленно отдает энергию молекуле. Таким образом интенсивность МР сигнала от суспензии магнитных микрокапсул с большой объемной фракцией наночастиц приблизительно равна интенсивности МР сигнала от чистой воды. Однако при ферментативной деградации их оболочек расстояние между наночастицами магнетита увеличивается, а взаимодействие между ними уменьшается. При этом магнитные моменты молекул воды начинают 76 флуктуировать вблизи частоты Лармора, что приводит к значительному уменьшению времен релаксации Т1 и Т2. Для проверки предположения о зависимости усиления контрастирования от расстояния между наночастицами магнетита были получены микрокапсулы, содержащие один слой наночастиц магнетита, но разную плотность их упаковки в этом слое, т.е. различную объемную фракцию наночастиц. Для того чтобы при исследовании микрокапсул методом МРТ интенсивность МР сигнала зависела от расстояния между наночастицами магнетита в оболочке микрокапсул, а не от их (наночастиц) общей концентрации в суспензии, во всех образцах использовали одинаковое количество наночастиц, а количество микрокапсул, на которые наночастицы адсорбировались, варьировали. Таким образом, при сохранении одинакового количества наночастиц во время адсорбции изменяли площадь, на которую они адсорбировались (табл. 4.4). Таблица 4.4. Концентрации полимеров и наночастиц магнетита при получении микрокапсул с различной поверхностной плотностью наночастиц в оболочке. Образец Концентрация Концентрация Поверхностная Среднее Концентрация наночастиц микрочастиц плотность расстояние полимеров при магнетита, CaCO3 мг/мл упаковки между каждом цикле мг/мл наночастиц, наночастицами адсорбции, мг/мл 2 шт/м d, нм ПА ДС 14 а 0,064 46,4 2,02х10 55 0,52 1,04 14 б 0,064 23,2 4,04х10 35 0,26 0,52 14 в 0,064 11,6 8,08х10 20 0,13 0,26 г 0,064 5,8 16,2х1014 10 0,065 0,13 14 д 0,064 2,9 32,3х10 3 0,03 0,06 Полученные образцы были исследованы методом МРТ. На рисунке 4.7 изображены Т1 и Т2 взвешенные МР томограммы образцов с различной объемной фракцией (образцы а-д). На изображениях видно, что при уменьшении объемной фракции наночастиц магнетита в оболочках микрокапсул контрастирование увеличивается. На рисунке 4.8 представлены зависимости интенсивности МРсигнала от среднего расстояния между наночастицами магнетита в оболочках микрокапсул. Значения среднего расстояния между наночастицами были вычислены по известным значениям среднего размера и концентрации микрочастиц карбоната кальция и наночастиц магнетита. При вычислении использовали значения плотности ватерита и магнетита 1600 кг/м3 и 5000 кг/м3 соответственно. 77 Рис. 4.7. Т1 и Т2 взвешенные МР изображения магнитных полиэлектролитных биодеградируемых микрокапсул с различно объемной фракцией магнетита в оболочках. На изображениях в пробирке слева контрольный образец гидрозоля наночастиц магнетита (концентрация - 0,064 мг/мл). Рис.4.8. Зависимости интенсивности МР сигналов на Т1 и Т2 взвешенных изображениях от среднего расстояния между наночастицами магнетита внутри оболочек микрокапсул, вычисленного по значениям массы, плотности и среднего размера микрочастиц CaCO3 и наночастиц магнетита. Таким образом показано, что влияние магнитных микрокапсул на МР сигнал определяется поверхностной плотностью наночастиц магнетита в их оболочках и как следствие, расстоянием между этими наночастицами. Чем меньше поверхностная плотность наночастиц магнетита в оболочке, тем сильнее изменяется интенсивность МР сигнала. 78 4.3 Внутривенное введение магнитных микрокапсул Целью данной части работы является определение возможной токсичности, накопления и биораспределения исследуемых нанокомпозитных микрокапсул при внутривенном введении у лабораторных животных без перевитых опухолей. Исследования проведены на 11 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях (12 часовой период освещения, комнатная температура 18-22 0С, влажность 5070%) вивария ГБОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России на обычном пищевом рационе. В первом эксперименте было задействовано 5 крыс. Четырем, из которых однократно, внутривенно, было введено по 1 мл суспензии биодеградируемых магнитных микрокапсул (~500 млн)ю. Через сутки после введения животные были выведены из эксперимента путем декапитации, с последующим забором крови, внутренних органов (селезенки, печени, почек, легких) для морфологических исследований и определения накопления и биораспределения железа, а так же возможной токсичности. Во втором эксперименте было задействовано 12 крыс, которым однократно, внутривенно, было введено по 1 мл суспензии микрокапсул (~500 млн), включающих в состав оболочки магнитные наночастицы с полимерным биодеградируемым покрытием. Вывод животных из эксперимента осуществлялся в разные временные промежутки: через 15 минут, 1 час, 4 часа, 24 часа, 7 дней и 30 дней (по две крысы на каждую временную точку) с последующим забором крови, внутренних органов (селезенки, печени, почек, легких) для морфологических исследований и определения накопления и биораспределения железа, а так же возможной токсичности. В легких по данным гистологии через 15 минут после внутривенного введения отмечали выраженное капиллярное полнокровие в микроциркуляторном русле, в межальвеолярных перегородках наблюдали микрокапсулы до 7-10 в поле зрения. Через 1 час после введения отмечали выраженное полнокровие, диапедезный кровоизлияния в межальвеолярных перегородках, их утолщение, вплоть до участков полного спадания (ателектаза). Наблюдали феномен сепарации крови в крупных сосудах. Микрокапсулы встречаются до 5-7 в поле зрения. Через 4 часа отмечали резко выраженное полнокровие крупных сосудов и очаговые кровоизлияния, эритроциты в просвете альвеол. Микрокапсулы встречаются в просвете сосудов среднего калибра, а так же между бронхов, в строме, в количестве 18-25 в поле зрения. Встречается перибронхиальная 79 эозинофильная инфильтрация бронхов среднего и мелкого калибра, до 60-70 клеток в поле зрения. Через сутки после введения микрокапсул в легких наблюдали уменьшение полнокровия по сравнению 4 часами после введения. Сохраняется перибронхиальная эозинофильная инфильтрация, до 30-40 эозинофилов в поле зрения. Микрокапсулы единичны в поле зрения. Через неделю после введения микрокапсул в легких эозинофильная инфильтрация сохраняется перебронхиально до 30±8 эозинофилов, также инфильтрация переваскулярно, преимущественно вокруг сосудов мелкого калибра. Наблюдали очаги ателектазов и отложения пигмента на периферии легочной ткани. Через месяц после введения микрокапсул в легких отмечали резчайшую гиперплазию лимфоидной ткани вокруг главного бронха, гиперплазия мышечного слоя сосудов, с лимфоидной инфильтрацией вокруг сосудов всех калибров. Таким образом, максимальные изменения в легочной ткани наступают через 4 часа от момента введения, в виде резко выраженного полнокровия крупных сосудов, очаговых кровоизлияний, перибронхиальной эозинофильной инфильтрации, выраженность данных изменений уменьшается к суткам от внутривенного введения капсул. Наибольшее количество капсул, также через 4 часа в среднем количестве 20 в поле зрения в просвете сосудов среднего калибра, между бронхов, в строме. При этом, после суток к неделе выраженность аллергической реакции нарастает, с вовлечением бронхов и сосудов. В селезенке через 15 минут отмечается полнокровие красной пульпы. В фолликулах, наряду с гемосидерином, наблюдали микрокапсулы до 2 в поле зрения. Также есть подозрения на разрушенные капсулы или гранулы гемоседерина, что дифференцировать очень сложно. Через 1 час отмечали увеличение количества микрокапсул до 3-4 в поле зрения. Нельзя исключить деградацию микрокапсул. Через 4 часа от момента введения отмечается выраженное полнокровие, микрокапсулы встречаются до 9 в поле зрения, в красной пульпе до 4 в поле зрения, а так же гранулы гемосидерина, при этом капсулы лежат конгломератами по 4 ли 5 микрокапсул. Через сутки после введения отмечали сохранение полнокровия красной пульпы. Количество микрокапсул уменьшилось: В белой пульпе до 3, в красной – до 6-7 капсул, которые лежат в макрофагах. Наблюдали косвенные признаки деструкции микрокапсул: в стенках сосудов наблюдается большое скопление оболочек капсул, а так же диффузное увеличение количества пигмента, нельзя исключить, что это их содержимое. Через неделю после введения микрокапсул в селезенки целые микрокапсулы определяются единично, но отмечали резкое увеличение содержания пигмента как в белой, так и красной пульпе. Граница между красной и белой пульпы четкие. Через месяц после введения микрокапсул в селезенки 80 уменьшение пигмента в красной пульп, в белой пульпе остается пигмент. Границы между белой и красной пульпой четкие, фолликулы оформлены. Таким образом, максимальные изменения в селезенке наступают через 4 часа от момента введения, в виде резко выраженного полнокровия, увеличения количества микрокапсул (в белой пульпе до 9 в поле зрения, в красной до 4), через сутки наибольшее накопление микрокапсул и также отмечаются косвенные признаки их деградации. При этом важным фактом является то, что признаки деградации отмечаются во все временные промежутки. Через неделю единичные капсулы отмечали в белой пульпе, пигмент диффузно. Через месяц в красной пульпе пигмент исчезает, в белой пульпе остается. В почках по данным гистологии через 15 минут после введения отмечали умеренное полнокровие сосудов клубочков, расширение, а так же некроз эпителия извитых канальцев, ближе к базальным мембранам эпителия извитых канальцев наблюдали обрывки капсул. В просвете каждого клубочка встречается до 3 микрокапсул. Подозрение на белок в собирательных трубочках. Через 1 час отмечали выраженное полнокровие сосудов среднего калибра, в мозговом веществе, клубочков. Микрокапсулы наблюдали по 2 штуки в 20% клубочков. Через 4 часа клубочки полнокровны, в мозговом веществе кровообращение восстанавливается. В эпителии извитых канальцев наблюдали содержимое капсул – раствор магнетита. Микрокапсулы встречаются единично, только в 10% клубочков. Через сутки отмечали кровоизлияния в корковом веществе, петли расширены, встречается содержимое капсул, локализующееся вокруг ядра, иногда встречаются целые микрокапсулы в эпителии извитых канальцев. Через неделю после введения микрокапсул в почках отмечали нормальное строение, но сохранялось полнокровие стромы и клубочков, в эпителии извитых канальцев единично встречаются гранулы магнетита. Через месяц после введения микрокапсул в почках наблюдали нормальное строение, пигмента не обнаружено. Таким образом, максимальные изменения в почках наблюдаются через сутки от момента введения, в виде кровоизлияний в корковом веществе, расширения петель, а также отмечается деградации капсул с накоплением содержимого в эпителии извитых канальцев, что не дает однозначного ответа: капсулы проходят через мочевой фильтр и содержимое реабсорбируется с мочой назад в канальца или капсулы попадают в эпителий через капилляры питающие эпителий. При этом максимальное содержание целых капсул наблюдается в первый периоды от введения (15 минут и час). Через неделю целых капсул не обнаружено. Но выявлен магнетит в эпителии извитых канальцев. Через месяц наблюдается нормальное строение почек и отсутствие пигмента. 81 В сердце через 15 минут после введения отмечали умеренный отек, выраженное полнокровие сосудов. Отмечали зернистую дистрофия кардиомиоцитов. Микрокапсулы в межклеточном пространстве до 1- в поле зрения. Через 1 час после введения отек нарастает. Наблюдали единичные небольшие очаговые кровоизлияния. Зернистая дистрофия сохраняется. Микрокапсул не более 2-3 в поле зрения. Через 4 часа отмечали выраженный отек, уменьшение полнокровия. Микрокапсулы единичны в поле зрения. Через сутки отмечали выраженный отек, нарастающий к эндокарду, полнокровие не выражено. Капсул нет, сохраняется зернистая дистрофия и отмечается набухание единичных кардиомиоцитов. Через неделю после введения микрокапсул отмечали зернистую дистрофию, полнокровие крупных артерий и микро-циркуляторного русла, зонально участки отека. Через месяц наблюдали нормальное строение миокарда. Таким образом, в сердце, максимальные изменения наблюдаются через 1 час после введения в виде выраженного отек и единичных очаговых кровоизлияний и максимального содержания капсул до 2-3 в поле зрения. Через час выраженность изменений уменьшается и капсулы не выявляются, так умеренно выраженный отек и зернистая дистрофия сохраняются к неделе после введения и через месяц наблюдается нормальное строение. В печени через 15 минут от момента введения отмечали полнокровие и периваскулярное, а так же в капиллярах расположение конгломератов микрокапсул по 4 в поле зрения с количеством капсул в конгломерате до 10 штук. Через 1 час наблюдали единичные кровоизлияния, появление белковых капель, микрокапсулы видны в виде конгломератов, по 6-7 в поле зрения, содержащих до 5-6 капсул. Через 4 часа полнокровие в синусоидах ярко выражено, конгломераты из микрочастиц лежат группами по 2-4, иногда встречаются, в просвете сосудов вместе с эозинофилами. Через сутки не наблюдали конгломератов. Отмечали деструкцию микрокапсул, а часть лежащими не разрушенными и по большей части в макрофагах. Через неделю после введения микрокапсул в почках сохранялось балочное строение, отмечали полнокровие крупных сосудов, умеренную дистрофию гепатоцитов и пигмент в клетках Купфера и пигмент и едичные капсулы в синусоидах между гепатоцитами. Через месяц после внутривенного введения микрокапсул в печени отмечали нормальное строение, пигмент и капсулы отсутствуют. Таким образом, в печени содержание микрокапсул нарастает к 1 часу после введения, при этом возникают выраженные изменения в виде нарушения кровообращения и дистрофии гепатоцитов, через 4 часа содержание капсул остается таким же, но изменения в ткани менее выражены, хотя появляется аллергическая реакция в виде эозинофилов в просвете сосудов. К суткам 82 отмечается распад капсул в клетках Купфера и гепатоцитов с выходом содержимого, эозинофилия уже не отмечается. Через неделю содержание пигмента большое, целые капсулы только между гепатоцитами или их фрагменты. Через месяц полностью нормализовалось строение, пигмент отсутствовал. Данные, по накоплению микрокапсул в органах подопытных животных, полученные методом гистологии, представлены в таблице 4.5. Из таблицы видно, что по данным гистологии максимальное накопление микрокапсул происходит в печени. Наименьшее накопление наблюдалось в сердце и почках. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС) определяли количество ионов железа в сердце, легких, печени, почках и селезенке подопытных животных. Полученные результаты представлены в таблице 4.6. Таблица №4.5 Динамика распределения микрокапсул в органах по данным гистологии Контроль 15 мин 1 час 4 часа 24 часа 7 дней 30 дней Легкое 0 9±1 4,5±0,7 18±3 1,5±0,3 пигмент - Печень 0 6,0 ±1,3 33 ±1 17±3 1,5±0,3 пигмент - Селезенка 0 1,5±0,3 3,5±0,3 6,5±1,2 5±1 пигмент - Почки 0 3,0±0,4 1,5±0,3 1,0±0 1,5±0,3 пигмент пигмент Сердце 0 1,5±0,3 2,5±0,3 1,5±0,3 1,0±0 - Таблица №4.6 Динамика распределения микрокапсул в органах по данным ААС Группа 15 мин 1 час 4 часа 24 часа контроль Печень 0,185±0,42 0,27±0,04 0,21±0,006 0,14±0,0006 0,14±0,0044 Селезенка 0,62±0,71 0,69±0,02 0,71±0,03 0,33±0,08 0,39±0,0029 Почка 0,125±0,01 0,07±0,0025 0,05±0,0001 0,063±0,001 (p<0.05) Легкие 0,14±0,001 0,15±0,01 0,22±0,017 (p<0.05) (p<0.05) Представленные выше результаты коррелируют с результатами исследований методом МРТ, согласно которым сразу после введения микрокапсулы на МР изображениях не контрастируют. Это связано с тем, что для экспериментов in vivo использовались микрокапсулы с большой объемной фракцией наночастиц в оболочке. Такие микрокапсулы, как было показано в разделе 4.2, не контрастируют при МРТ, однако при их ферментативной деградации in vitro наблюдается контрастирование, которое обусловлено увеличением среднего значения расстояния между наночастицами магнетита (рис.4.7). При разрушении микрокапсул в селезенке, почках и печени высвобожденные наночастицы магнетита начинают контрастировать на МР томограммах (рис. 4.9). На рисунке 4.10 представлена схема, показывающая время, через которое наблюдается 83 максимальное накопление микрокапсул по данным морфологического исследования, их целостность и время, через которое наблюдается контрастирование высвобожденных наночастиц в легких, сердце, селезенке, печени и почках при внутривенном введении суспензии микрокапсул. T2 T1 Рис. 4.9. МР изображения крыс через 24 часа после внутривенного введения магнитных микрокапсул. Крыса слева с внутривено введенной суспензией магнитных микрокапсул, справа – контрольная крыса. Стрелками отмечена контрастирующая область (печень) Рис.4.10. Схема, показывающая время, через которое наблюдается максимальное накопление микрокапсул по данным морфологического исследования (МИ), их целостность и время, через которое наблюдается контрастирование высвобожденных наночастиц в легких, сердце, селезенке, печени и почках при внутривенном введении суспензии микрокапсул. 84 Выводы к 4 главе Показано, что с ростом числа циклов адсорбции в нанокомпозитном покрытии полиэлектролит/наночастицы оксида железа наблюдается изменение морфологии поверхности, проявляющееся в увеличении шероховатости, вызванном ростом агрегатов наночастиц оксида железа и уменьшении расстояния между ними. Показано, что МР контрастирование микрокапсул на основе полиаргинина и натриевой соли декстран сульфата, содержащие наночастицы магнетита увеличивается с уменьшением концентрации наночастиц в оболочках микрокапсул. Установлено, что вышеописанные микрокапсулы, содержащие наночастицы магнетита в высокой концентрации, первоначально не контрастируют в МРТ, однако при их ферметативной деградации in vitro и in vivo наблюдается контрастирование, которое связано с увеличением среднего значения расстояния между наночастицами магнетита. При внутривенном введении нанокомпозитных микрокапсул (диаметр 3-5 мкм) у лабораторных животных с помощью гистологических методов установлено, что максимальное их накопление в почках обнаружено через 15 минут после введения, в легких - через 4 часа, в печени и сердце – через 1 час, а в селезенке - через 24 часа. Максимальное контрастирование области интереса на МР томограммах при разрушении микрокапсул наблюдается через 24 часа после внутривенного введения в селезенке, почках и печени. 85 Защищаемые результаты исследования При ферментативной деградации оболочек микрокапсул на основе поли-Lаргинина и натриевой соли декстран сульфата, содержащих наночастицы магнетита с высокой концентрацией в составе оболочки, наблюдается контрастирование области интереса на МР изображениях, обусловленное увеличением среднего расстояния между наночастицами, в то время как микрокапсулы до деградации не являются контрастирующими. При внутривенном введении нанокомпозитных микрокапсул (диаметр 3-5 мкм) в дозировке 2,5х109 капсул/кг (в расчете на магнетит - 15 мг/кг) у лабораторных животных с помощью гистологических методов установлено, что максимальное их накопление в почках наблюдается через 15 минут после введения, в легких - через 4 часа, в печени и сердце – через 1 час, а в селезенке через 24 часа. Максимальное контрастирование области интереса на МР изображениях при разрушении микрокапсул наблюдается через 24 часа после внутривенного введения в селезенке, почках и печени. 86 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе выполнения работы были получены следующие результаты: 1. В работе найдены физико-химические подходы, позволяющие реализовать in vitro и in vivo МРТ визуализацию липосом и нанокомпозитных биодеградируемых микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита с заданным контрастированием на Т1 и Т2 взвешенных изображениях и проведено сравнение их контрастирующих свойств с гидрозолем магнетита. Показано, что интенсивность сигнала на Т1 взвешенных изображениях зависит от концентрации исследуемых гидрозолей магнетита, магнитолипосом и магнитных микрокапсул не монотонно, магнитолипосомы по сравнению с гидрозолем магнетита эффективнее контрастируют на Т2 взвешенных изображениях, а магнитные микрокапсулы позволяют варьировать контрастирующие свойства в широких пределах. 2 Предложена схема и реализована установка, позволяющая синтезировать гидрофильные наночастицы магнетита в инертной атмосфере, особенностью которой является то, что управление потоками реагентов происходит за счет изменения давления инертного газа в системе. 3 Показано, что с ростом числа циклов адсорбции в нанокомпозитном покрытии полиэлектролит/наночастицы оксида железа наблюдается изменение морфологии поверхности, проявляющееся в увеличении шероховатости, вызванном ростом агрегатов наночастиц оксида железа и уменьшении расстояния между ними. Температурная обработка нанокомпозитных покрытий, содержащих наночастицы магнетита, приводит к уменьшению их магнитной проницаемости, величина изменения которой уменьшается с увеличением толщины покрытия и содержания магнетита. Такое поведение магнитной проницаемости объясняется тем, что соотношение магнетита и маггемита в покрытии при окислении наночастиц магнетита зависит от толщины покрытия. 4 Определен диапазон концентраций гидрозолей магнетита при их среднем размере 13±3 нм (0,005 – 0,3 мг/мл для Т1, 0,02 – 0,6 мг/мл для Т2) для эффективного использования в МРТ. Максимальное значение концентрации ограничено величиной эффективной магнитной проницаемости среды, увеличение которой вызывает искажения томограммы, а минимальное – величиной магнитного момента отдельной наночастицы. 5 Выявлена низкая цитотоксичность in vitro малых концентраций магнетита (0,325 мг/мл, количество клеток – 106 клеток/мл) в отношении нейтрофильных гранулоцитов. В то же время часовая инкубация с наночастицами в концентрации 87 3.25 мг/мл приводит к падению жизнеспособности клеток ниже 50 %. Помимо выраженного цитоксического эффекта высоких концентраций магнетита выявлены существенные морфологические изменения клеток крови. 6 Установлено, что основные изменения при внутрибрюшинном однократном и многократном введении наночастиц магнетита крысам с перевитой опухолью печени РС-1 представлены обратимыми дистрофическими и ишемическими повреждениями клеток паренхиматозных органов и нарушениями лимфо- и кровообращения, что позволяет сделать вывод о низком цитотоксическом эффекте исследованных наночастиц магнетита. Показано, что при внутрибрюшинном методе введения максимальное количество наночастиц накапливается и оседает в лимфатических узлах брюшной полости. 7 Получены моноламеллярные липосомы размером 154±47нм на основе яичного фосфатидилхолина, содержащие МНЧ во внутреннем объеме с эффективностью загрузки 4,4%. Определена минимальная концентрация магнитолипосом (0,005 мг\мл по содержанию магнетита), при которой наблюдается контрастирование. При интратуморальном введении магнитолипосом обнаружено усиление контраста области интереса (ROI) на Т1 и Т2 взвешенных томограммах, и определен объем данной области и примерная концентрация в ней магнитолипосом. 8 Показано, что МР контрастирование микрокапсул на основе полиаргинина и натриевой соли декстран сульфата, содержащие наночастицы магнетита увеличивается с уменьшением концентрации наночастиц в оболочках микрокапсул. Установлено, что вышеописанные микрокапсулы, содержащие наночастицы магнетита в высокой концентрации, первоначально не контрастируют в МРТ, однако при их ферметативной деградации in vitro и in vivo наблюдается контрастирование, которое связано с увеличением среднего значения расстояния между наночастицами магнетита. 9 При внутривенном введении нанокомпозитных микрокапсул (диаметр 3-5 мкм) в дозировке 2,5х109 капсул/кг (в расчете на магнетит - 15 мг/кг) у лабораторных животных с помощью гистологических методов установлено, что максимальное их накопление в почках наблюдается через 15 минут после введения, в легких через 4 часа, в печени и сердце – через 1 час, а в селезенке - через 24 часа. Максимальное контрастирование области интереса на МР изображениях при разрушении микрокапсул наблюдается через 24 часа после внутривенного введения в селезенке, почках и печени. 88 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1.Weissleder R., Bogdanov A., Neuwelt E.A., Papisov M. Longcirculating iron oxides for MR imaging. // Adv. Drug Delivery Rev. 1995. V.16. P.321. 2.Reimer P., Weissleder R. Development and experimental application of receptorspecific MR contrast media. // Radiologe. 1996. V.36. P.153. 3.Chouly C., Pouliquen D., Lucet I., Jeune JJ., Jallet P. Development of superparamagnetic nanoparticles for MRI: effect of particle size, charge and surface nature on biodistribution. // J. Microencapsulation. 1996. V.13. P.245. 4.Okon E., Pouliquen D., Okon P., Kovaleva Z.V., Stepanova T.P., Lavit S.G., Kudryavtsev B.N., Jallet P. Biodegradation of magnetite dextran nanoparticles in the rat: A histologic and biophysical study. // Lab Invest. 1994. V.71. P.895. 5.Jung C.W., Jacobs P. Physical and chemical properties of superparamagnetic ironoxide MR contrast agents; ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. // Magn. Reson. Imaging. 1995. V.13. P.661. 6.Jun Y., Lee J.-H., Cheon J. Chemical Design of Nanoparticle Probes for HighPerformance Magnetic Resonance Imaging. // Angewandte Chemie International Edition. 2008. V.47. P.5122. 7.Gupta P.K., Hung C.T. Magnetically controlled targeted microcarrier systems. // Life Sci. 1989. V.44. P.175. 8.Lubbe A.S., Bergemann C., Huhnt W., Fricke T., Riess H., Brock J.W., Huhn D. Preclinical experiences with magnetic drug targeting: tolerance and efficacy. // Cancer Res. 1996. V.56. P.4694. 9.Gupta A.K, Curtis A.S.G. Lactoferrin and ceruloplasmin derivatized superparamagneticiron oxide nanoparticles for targeting cell surface receptors. // Biomaterials. 2004. V.25. P.3029. 10. Chan D.C.F, Kirpotin D., Bunn P.A. Synthesis and evaluation of colloidal magnetic iron-oxides for the site-specific radio frequency induced hyperthermia of cancer. // J. Magn. Magn. Mater. 1993. V.122. P.374. 11.Häfeli U., Schütt W., Teller J., Zborowski M. Scientific and clinical applications of magnetic carriers. New York: Plenum Press, 1997. p. 569. 12.Levy M., Lagarde F., Maraloiu V.-A., Blanchin M.-G., Gendron F., Wilhelm C., Gazeau F. Degradability of superparamagnetic nanoparticles in a model of intracellular environment: follow-up of magnetic, structural and chemical properties. // Nanotechnology. 2010. V.21.P. 395103 13.Mrinmoy De, Ghosh P. S., Rotello V. M. Applications of Nanoparticles in Biology. // Advanced Materials. 2008. V. 20. P.4225. 14.Laurent S., Forge D., Port M., Roch A., Robic C., Vander Elst L., Muller R.N. Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Vectorization, 89 Physicochemical Characterizations, and Biological Applications. //Chem. Rev. 2008. V.108. P.2064. 15.Cornell R.M., Schertmann U. Iron oxides in the laboratory; preparation and characterization. Weinheim: VCH; 1991. 16.Cotton F.A., Wilkinson G. In: Advanced inorganic chemistry. New York: Wiley Interscience; 1988. 17.Jubb A.M., Allen H.C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition // Appl. Mater. & Interf. 2010. V.10. P.2804. 18 Weissleder R., Stark D.D., Engelstad .B.L., Bacon B.R., Compton C.C., White D.L., Jacobs P., Lewis J. Superparamagnetic iron oxide: pharmacokinetics and toxicity. // AJR Am. J. Roentgenol. 1989. V.152. P.167. 19.Lubbe A.S., Alexiou C., Bergemann C. Clinical applications of magnetic drug targeting. // J. Surg. Res. 2001. V.95. P.200. 20. Kaminski M.D., Rosengart A.J. Detoxification of blood using injectable magnetic nanoparticles: a conceptual technology description. // J. Magn. Magn. Mater. 2005. V.293. P.389. 21. Chin A.B., Yaacob I.I. Synthesis and Characterization of magnetic Iron Oxide Nanoparticles via microemulsion and Massart’s procedure. // J. Mater. Process Technol. 2007. V.191. P.235. 22. Albornoz C., Jacobo S.E. Preparation of a biocompatible magnetic film from an aqueous ferrofluid. // J. Magn. Magn. Mater. 2006. V.305. P.12. 23. Kim E.H., Lee H.S., Kwak B.K., Kim B.K. Synthesis of ferrofluid with magnetic nanoparticles by sonochemical method for MRI contrast agent. // J. Magn. Magn. Mater. 2005. V.289. P.328. 24. Wan J., Chen X., Wang Z., Yang X., Qian Y. A soft-template-assisted hydrothermal approach to single-crystal Fe3O4 nanorods. // J. Cryst. Growth. 2005. V.276. P.571. 25. Kimata M., Nakagawa D., Hasegawa M. Preparation of monodisperse magnetic particles by hydrolysis of iron alkoxide.// Powder Technol. 2003. V.132. P.112. 26. Martinez-Mera I., Espinosa M.E., Perez-Hernandez R., Arenas-Alatorre J. Synthesis of magnetite (Fe3O4) nanoparticles without surfactants at room temperature. // J. Mater. Lett. 2007. V.61. P.4447. 27. Sun Y.-K., Ma M., Zhang Y., Gu N. Synthesis of nanometer-size maghemite particles from magnetite. // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2004. V.245. P.15. 28. Lee S.-J., Jeong J.-R., Shin S.-C., Kim J.-C., Kim J. Synthesis and characterization of superparamagnetic maghemite nanoparticles prepared by coprecipitation technique. // J. Magn. Magn. Mater. 2004. V.282. P. 147. 90 29. Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media. // IEEE Transactions on Magnetics. 1981. V.17. P.1247. 30. Chem. Rev. 2008, 108, 2064–2110 Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Vectorization, Physicochemical Characterizations, and Biological Applications Sophie Laurent, Delphine Forge, Marc Port, Alain Roch, Caroline Robic, Luce Vander Elst, and Robert N. Muller. 31. Zhang J., Takahashi Y.K., Gopalan R., Hono K., Microstructures and coercivities of SmCox and Sm(Co,Cu)5 films prepares by magnetron spttering, JMMM, 2007, 310, 1-7. 32. Seto T., Koga K., Akinaga H., Takano F., Orii T., Hirasawa M., Laser ablation synthesis of monodispersed magnetic alloy nanoparticles, Journal of Nanoparticle Research, 2006, 8, 371-378. 33. Khedr M.H., Omar A.A., Abdel-Moarty S.A. Magnetic nanocomposites: preparation and characterization of Co-ferrite nanoparticles, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 2006, 281, 8-14. 34. Jolivet, J. P.; Chaneac, C.; Tronc, E. Iron oxide chemistry. From molecular clusters to extended solid networks Chem. Commun. 2004, 5, 481-487. 35. Cornell, R. M.; Schwertmann, U. The Iron Oxides; VCH Publishers: Weinheim, Germany, 1996. 36. Boistelle, R.; Astier, J. P. Crystallization Mechanisms In Solution J. Cryst. Growth 1988, 90, 14-30. 37. Sugimoto, T. Formation of Monodispersed nano- and microparticles controlled in size, shape and internal structure Chem. Eng. Technol. 2003, 26, 313-321. 38. Schwarzer, H.-C.; Peukert, W. Chem. Eng. Commun. 2004, 191, 580-606. 39-Tartaj, P.; Morales, M. P.; Veintemillas-Verdaguer, S.; Gonzalez-Carreno, T.; Serna, C. J. Synthesis, properties and biomedicalapplications of magnetic nanoparticles. Handbook of Magnetic Materials; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2006; p 403. 40. Lefebure, S.; Franck, R.; Massart, R.; Perzynski, Synthesis and mangeitc properties of managanese and cobalt ferrite ferrite ferrofluids R. Prog. Colloid Polym. Sci. 1989, 79, 128-134. 41. Sjorgren, C. E.; Briley-Saebo, K.; Hanson, M.; Johansson, C. Magnetic characterization of iron oxides for magnetic resonance imaging Magn. Reson. Med. 1994, 31, 268-272. 42. Itoh, H.; Sugimoto, T. Systematic control of size, shape, structure, and magnetic properties of uniform magnetite and maghemite particles J. Colloid Interface Sci. 2003, 265, 283-295. 43. Thapa, D.; Palkar, V. R.; Kurup, M. B.; Malik, S. K. Mater. Lett. 2004, 58, 2692. 91 44. Pardoe, H.; Chua-anusorn, W.; St. Pierre, T. G.; Dobson, J. J. Magn. Magn. Mater 2001, 225, 41. 45. Babes, L.; Denizot, B.; Tanguy, G.; Le Jeune, J. J.; Jallet, P. J. Colloid Interface Sci. 1999, 212 (2), 474. 46. Massart R., “Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media”, IEEE Trans. Magn., 1981, Mag-17, 2, 1247-1248. 47. Massart, R.; Cabuil, V. J. Chim. Phys. 1987, 84, 7. 48. Jolivet, J. P.; Froidefond, C.; Pottier, A.; Chaeneac, C.; Cassaignon, S.; Tronc, E.; Euzen, P. J. Mater. Chem. 2004, 14 (21), 3281. 49. Pang S.C., Chin S.F., Anderson M.A., “Redox Equilibria of iron oxides in aqueousbased magnetite dispersions: Effect of the pH and redox potential”, J. Colloid and Interface Sci., 2007, 311, 94-101. 50. Bacri, J. C.; Perzynski, R.; Salin, D.; Cabuil, V.; Massart, R. J. Magn. Magn. Mater. 1990, 85, 27. 51. Massart, R.; Roger, J.; Cabuil, V. Braz. J. Phys. 1995, 2, 135. 52. Neveu-Prin, S.; Cabuil, V.; Massart, R.; Escaffre, P.; Dussaud, J. J. Magn. Magn. Mater. 1993, 122, 42. 53. Bee, A.; Massart, R.; Neveu, S. J. Magn. Magn. Mater. 1995, 149, 6. 54. Massart, R.; Dubois, E.; Cabuil, V.; Hasmonay, E. J. Magn. Magn. Mater. 1995, 149, 1. 55. Cabuil, V.; Dubois, E.; Neveau, S.; Bacri, J. C.; Hasmonay, E.; Perzynski, R. Prog. Colloid Polym. Sci. 1995, 98, 23. 56. Tronc, E.; Belleville, P.; Jolivet, J.-P.; Livage, J. Langmuir 1992, 8, 313. 57. Vayssieres, L.; Chaneac, C.; Tronc, E.; Jolivet, J.-P. J. Colloid Interface Sci. 1998, 205, 205. 58. Jiang, W.; Yang, H.-C.; Yang, S. Y.; Horng, H. E.; Hung, J. C.; Chen, Y. C.; Hong, C.-Y. J. Magn. Magn. Mater. 2004, 283, 210. 59. Massart, R.; Cabuil, V. J. Chim. Phys. 1987, 84, 7. 60. Babes, L.; Denizot, B.; Tanguy, G.; Le Jeune, J. J.; Jallet, P. J. Colloid Interface Sci. 1999, 212 (2), 474.]. 61. Gupta, A. K.; Wells, S. IEEE Trans. Nanobiosci. 2004, 3, 66. 62. Kim, D. K.; Zhang, Y.; Voit, W.; Rao, K. V.; Muhammed, M. J. Magn. Magn. Mater. 2001, 30, 225.]. 63. Liz-Marzaґn L.M., Kamat P.V. Nanoscale Materials. Boston: Kluwer Academic Publishers; 2003. 64. Kim D.K., Zhang Y., Voit W., Rao K.V., Muhammed M. Synthesis and characterization of surfactant-coated superparamagnetic monodispersed iron oxide nanoparticles. // J Magn. Magn. Mater. 2001. V.225. P.30. 92 65. Zhang Y., Kohler N., Zhang M. Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake. // Biomaterials. 2002. V.23. P.1553. 66. Miller E., Peppas N.A., Winslow D.N. Morphological changes of ethylene/vinyl acetate based on controlled delivery systems during release of water-soluble solutes. // J. Memb. Sci. 1983. V.14. P.79. 67. Zhao X., Harris J.M. Novel degradable poly(ethylene glycol) hydrogels for controlled release of protein. // J. Pharm. Sci. 1998. V 87. P.1450. 68. Ruiz J.M., Benoit J.P. In vivo peptide release from poly(lactic-coglycolic acid) copolymer 50/50 microspheres. // J. Cont. Rel. 1991. V.16. P.177. 69. Li J.K., Wang N., Wu X.E. A novel biodegradable system based on gelatin nanoparticles and poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres for protein and peptide drug delivery. // J. Pharm. Sci. 1997. V. 86. P.891. 70. Akiyoshi K., Sunmoto J. Supramolecular assembly of hydrophobized polysaccharides. // Supramol. Sci. 1996. V.3. P.157. 71. Schwick H.G., Heide K. Immunochemistry and immunology of collagen and gelatin. // Bibliotheca Haematol. 1969. V.3. P.111. 72. Massia S.P., Stark J., Letbetter D.S. Surface immobilized dextran limits cell adhesion and spreading. // Biomaterials. 2000. V.21, P. 2253. , 73. Yu J, Lee C-W, Im S-S, Lee J-S. Structure and magnetic properties of SiO2 coated Fe2O3 nanoparticles synthesized by chemical vapor condensation process. // Rev. Adv. Mater. Sci. 2003. V.4. P.55. , 74. Chen M., Yamamuro S., Farrell D., Majetich S.A. Gold-coated iron nanoparticles for biomedical applications. // J. Appl. Phys. 2003. V.93. P.7551. 75. Lin J., Zhou W., Kumbhar A., Fang J., Carpenter E.E., O’Connor C.J. Gold-coated iron (Fe@Au) nanoparticles: synthesis, characterization, and magnetic field-induced self-assembly. // J. Solid State Chem. 2001. V. 159. P.26. . 76. Gupta A.K., Berry C., Gupta M., Curtis A. Receptor-mediated targeting of magnetic nanoparticles using insulin as a surface ligand to prevent endocytosis. // IEEE Trans. Nanobiosci. 2003. V. 2. P.256, 77. Moore A., Basilion J., Chiocca E.A., Weissleder R. Measuring transferrin receptor gene expression by NMR imaging. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1402. P.239. 78. Berry C.C., Charles S., Wells S., Dalby M.J., Curtis A.S.G. The influence of transferrin stabilised magnetic nanoparticles on human dermal fibroblasts in culture. // Int. J. Pharm. 2004. V. 269. P.211. 79. Baker M.E. Albumin’s role in steroid hormone action and the origins of vertebrates: is albumin an essential protein. // FEBS Lett. 1998.V.439. P.9. 93 80. Cornell, R. M.; Schertmann, U. The Iron Oxides: Structure, Properties, Reactions, Occurrence and Uses; VCH Publishers: Weinheim, Germany, 1996. 81. Sahoo, Y.; Pizem, H.; Fried, T.; Golodnitsky, D.; Burstein, L.; Sukenik, C. N.; Markovich, G. Langmuir 2001, 17, 7907. 82. Sahoo, Y.; Goodarzi, A.; Swihart, M. T.; Ohulchanskyy, T. Y.; Kaur, N.; Furlani, E. P.; Prasad, P. N. J. Phys. Chem. B 2005, 109, 3879. 83. Liu, C.; Huang, P. M. Soil Sci. Soc. Am. J. 1999, 63, 65. 84. Fauconnier, N.; Bee, A.; Roger, J.; Pons, J. N. J. Mol. Liq. 1999, 83, 233., 85. (283) Kodama, H.; Schnitzer, M. Geoderma 1977, 19, 279. 86. (284) Kandori, K.; Kawashima, Y.; Ishikawa, T. J. Colloid Interface Sci. 1992, 125, 284. 87. (285) Kandori, K.; Kawashima, Y.; Ishikawa, T. J. Mater. Sci. 1991, 26, 3313.]. 88. Fauconnier, N.; Pons, J. N.; Roger, J.; Bee, A. J. Colloid Interface Sci. 1997, 194, 427. 89. Denizot, B.; Tanguy, G.; Hindre, F.; Rump, E.; LeJeune, J.-J.; Jallet, P. J. Colloid Interface Sci. 1999, 209, 66. 90 Portet, D.; Denizot, B.; Rump, E.; LeJeune, J.-J.; Jallet, P. J. Colloid Interface Sci. 2001, 238, 37. 91Liu X., Kaminski M.D., Guan Y., Chen H., Liu H., Rosengart A.J., “Preparation and characterization of hydrophobic superparamagnetic magnetite gel”, JMMM, 2006, 306, 248-253. 92Chen K., Bakuzis A.F., Luo W. “Improving surfactant grafting in magnetic colloids”. Appl. Surf. Sci., 2006, 252, 6379–6382. 93Palmacci, S.; Josephson, L.; Groman, E. V. U.S. Patent 5,262,176, 1995; Chem. Abstr. 1996, 122, 309897. 94. Hafeli, U.; Schutt, W.; Teller, J.; Zbrorowski, M. Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers; Plenum Press: New York, 1997. 95. Arshady, R. Radiolabeled and Magnetic Particles in Medicine and Biology; Critrus Books: London, U.K., 2001; Vol. 3. 96. Okassa, L. N.; Marchais, H.; Douziech- Eyrolles, L.; Cohen-Jonathan, S.; Souce, M.; Dubois, P.; Chourpa, I. Int. J. Pharm. 2005, 302 (1-2), 187. 97. Roy S., Ghose J., “Moessbauer study of nanocrystalline cubic CuFe2O4 synthesized by precipitation in polymer matrix”, JMMM, 2006, 307, 32-37. 98. Ditsch A., Laibinis P.E., Wang D. I. C., Hatton T.A. “Controlled Clustering and Enhanced Stability of Polymer-Coated Magnetic Nanoparticles”. Langmuir, 2005, 21, 6006-6018. 94 99. Miller E, Peppas NA, Winslow DN. Morphological changes of ethylene/vinyl acetate based on controlled delivery systems during release of water-soluble solutes. J Memb Sci 1983; 14:79–92. 100. Zhao X, Harris JM. Novel degradable poly(ethylene glycol) hydrogels for controlled release of protein. J Pharm Sci 1998; 87(11):1450–8. 101. Ruiz JM, Benoit JP. In vivo peptide release from poly(lactic-co-glycolic acid) copolymer 50/50 microspheres. J Cont Rel 1991;16:177–86. 102. Kim, D. K.; Zhang, Y.; Kehr, J.; Klason, T.; Bjelke, B.; Muhammed, M. J. Magn. Magn. Mater. 2001, 225, 256. 103. Tamaura, Y.; Takahasi, K.; Kodera, Y.; Saito, Y.; Inada, Y. Biotechnol. Lett. 1986, 8, 877. 104. Shultz, M. D.; Calvin, S.; Fatouros, P. P.; Morrison, S. A.; Carpenter, E. E. J. Magn. Magn. Mater. 2007, 311, 464. 105. Butterworth, M. D.; Illum, L.; Davis, S. S. Colloids Surf., A 2001, 179, 93. 106. Kohler, N.; Fryxell, G. E.; Zhang, M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7206. 107. Zhang, Y.; Kohler, N.; Zhang, M. Biomaterials 2002, 23, 1553. 108. Tiefenauer, L. X.; Tschirky, A.; Kuhne, G.; Andres, R. Y. Magn. Reson. Imaging 1996, 14, 391. 109. Moghimi, S. M.; Hunter, A. C.; Murray, J. C. Pharmacol. ReV. 2001, 53, 283. 110. Papisov, M. I.; Bogdanov, A.; Schaffer, B.; Nossiff, N.; Shen, T.; Weissleder, R.; Brady, T. J. J. Magn. Magn. Mater. 1993, 122, 383. 111. Hogemann, D.; Josephson, L.; Weissleder, R.; Basilion, J. P. Bioconjugate Chem. 2000, 11 (6), 941. 112. Yokoi, H.; Kantoh, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993, 66, 1536. 113. Sairam, M.; Naidu, B. V. K.; Nataraj, S. K.; Sreedhar, B.; Aminabhavi, T. M. J. Membr. Sci. 2006, 283, 65. 114. Schopf, B.; Neuberger, T.; Schulze, K.; Petri, A.; Chastellain, M.; Hofmann, M.; Hofmann, H.; von Rechenberg, B. J. Magn. Magn. Mater. 2005, 293, 411.. 115. Lee, J.; Isobe, T.; Senna, M. J. Colloid Interface Sci. 1996, 177, 490. 116. Mendenhall, G. D.; Geng, Y.; Hwang, J. J. Colloid Interface Sci. 1996, 184, 519. 117. Lee, H. Y.; Lim, N. H.; Seo, J. A.; Khang, G.; Kim, J.; Lee, H. B.; Cho, S. H. Polymer 2005, 29, 266. 118. Iijima, M.; Yonemochi, Y.; Tsukada, M.; Kamiya, H. J. Colloid Interface Sci. 2006, 298, 202. 119 Kim, D. K.; Mikhaylova, M.; Wang, F. H.; Kehr, J.; Bjelke, B.; Zhang, Y.; Tsakalakos, T.; Muhammed, M. Chem. Mater. 2003, 15, 4343. 120. Gomez-Lopera, S. A.; Arias, J. L.; Gallardo, V.; Delgado, A. V. Langmuir 2006, 22, 2816. 95 121. Arias, J. L.; Lopez-Viota, M.; Ruiz, M. A.; Lopez-Viota, J.; Delgado, A. V. Int. J. Pharm. 2007, doi: 10.1016/j.ijpharm.2007.02.028. 122. Flesch, C.; Delaite, C.; Dumas, P.; Bourgeaut-Lami, E.; Duguet, E. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 2004, 42, 6011. 123. Li JK, Wang N, Wu XE. A novel biodegradable system based on gelatin nanoparticles and poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres for protein and peptide drug delivery. J Pharm Sci 1997; 86(8):891–5. 124. Akiyoshi K, Sunmoto J. Supramolecular assembly of hydrophobized polysaccharides. Supramol Sci 1996;3:157–63. 125. Jeong Y, Nah J-W, Na K, Cho CS, Kim SH. Self assembling nanospheres of hydrophobized pullulans in water. Drug Dev Ind Pharm 1999;25(8):917–27. 126. Schwick HG, Heide K. Immunochemistry and immunology of collagen and gelatin. Bibliotheca Haematol 1969;3:111–25. 127. Massia SP, Stark J, Letbetter DS. Surface immobilized dextran limits cell adhesion and spreading. Biomaterials 2000;21: 2253–61 128. Zhang, Y.; Kohler, N.; Zhang, M. Biomaterials 2002, 23, 1553. 129. Lacava, L. M.; Lacava, Z. G. M.; Da Silva, M. F.; Silva, O.; Chaves, S. B.; Azevedo, R. B.; Pelegrini, F.; Gansau, C.; Buske, N.; Sabolovic, D.; Morais, P. C. Biophys. J. 2001, 80, 2483. 130. Berry, C. C.; Wells, S.; Charles, S.; Curtis, A. S. G. Biomaterials 2003, 23, 4551. 131. Lee, K. M.; Kim, S.-G.; Kim, W.-S.; Kim, S. S. Korean J. Chem. Eng. 2002, 19, 480. 132. Laurent, S.; Nicotra, C.; Gossuin, Y.; Roch, A.; Ouakssim, A.; Vander Elst, L.; Cornant, M.; Soleil, P.; Muller, R. N. Phys. Status Solidi 2004, 12, 3644. 133. Gamarra, L. F.; Brito, G. E. S.; Pontuschka, W. M.; Amaro, E.; Parma, A. H. C.; Goya, G. F. J. Magn. Magn. Mater. 2005, 289, 439. 134. Pardoe, H.; Chua-anusorn, W.; St. Pierre, T. G.; Dobson, J. J. Magn. Magn. Mater. 2001, 225, 41. 135. Nishio, Y.; Yamada, A.; Ezaki, K.; Miyashita, Y.; Furukawa, H.; Horie, K. Polymer 2004, 45, 7129. 136. Llanes, F.; Ryan, D. H.; Marchessault, R. H. Int. J. Biol. Macromol. 2000, 27, 35. 137. Finotelli, P. V.; Morales, M. A.; Rocha-Leao, M. H.; Baggio Saitovitch, E. M.; Rossi, A. M. Mater. Sci. Eng. 2004, 24, 625. 138. Kroll, E.; Winnik, F. M.; Ziolo, R. F. Chem. Mater. 1996, 8, 1594. 139. Ravi Kumar, M.N., Bakowsky, U., Lehr, C.M., 2004. Preparation and characterization of cationic PLGA nanospheres as DNA carriers. Biomaterials 25, 1771–1777. 96 140. Preparation and characterization of superparamagnetic iron oxide nanoparticles stabilized by alginate Hui-li Ma , Xian-rong Qi, Yoshie Maitani b , Tsuneji Nagai International Journal of Pharmaceutics 333 (2007) 177–186. 141. Jia, Z.; Yujun, W.; Yangcheng, L.; Jingyu, M.; Guangsheng, L. React. Funct. Polym. 2006, 66, 1552. 142. Sipos, P.; Berkesi, O.; Tombacz, E.; St. Pierre, T. G.; Webb, J. J. Inorg. Biochem. 2003, 95, 55. 143. Bhattarai, S. R.; Bahadur, K. C.; Aryal, S.; Khill, M. S.; Kim, H. Y. Carbohydr. Polym. 2007, doi: 10.016/j.carbpol.2007.01.006. 144. Kim, E. H.; Ahn, Y.; Lee, H. S. J. Alloys Compd. 2006, doi: 10.1016/ j.allcom.2006.08.311. 145. Kim, E. H.; Lee, H. S.; Kwak, B. K.; Kim, B.-K. J. Magn. Magn. Mater. 2005, 289, 328. 146. Tartaj P, Gonzalez-Carreno T, Serna CJ. Synthesis of nanomagnets dispersed in colloidal silica cages with applications in chemical separation. Langmuir 2002;18:4556–8. 147. Tartaj P, Gonzalez-Carreno T, Serna CJ. Single-step nanoengineering of silica coated maghemite hollow spheres with tunable magnetic properties. Adv Mater 2001;13:1620–4. 148. Santra S, Tapec R, Theodoropoulou N, Dobson J, Hebard A, Tan W. Synthesis and characterization of silica-coated iron oxide nanoparticles in microemulsion: the effect of non-ionic surfactants. Langmuir 2001;17:2900–6, 149. Zhang, C.; Wangler, B.; Morgenstern, B.; Zentgraf, H.; Eisenhut, M.; Untenecker, H.; Kruger, R.; Huss, R.; Seliger, C.; Semmler, W.; Kiessling, F. Langmuir 2007, 23 (3), 1427. 150. Mulvaney, P.; Liz-Marzan, L. M.; Giersig, M.; Ung, T. J. Mater. Chem. 2000, 10, 1259. 151. Zhou, W. L.; Carpenter, E. E.; Lin, J.; Kumbhar, A.; Sims, J.; O’Connor, C. J. Eur. Phys. J. D 2001, 16, 289. 152. Lesnikovich, A. E.; Shunkevich, T. M.; Naumenko, V. N.; Vorobyova, S. A.; Baykov, M. W. J. Magn. Magn. Mater. 1990, 17, 7907. 153. Sun, Y.; Duan, L.; Guo, Z.; DuanMu, Y.; Ma, M.; Xu, L.; Zhang, Y.; Gu, N. J. Magn. Magn. Mater. 2005, 285, 65. 154. Stober, W.; Fink, A.; Bohn, E. J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, ̈62. 155. Philipse, A. P.; van Bruggen, M. P. B.; Pathmamanoharan, C. Langmuir 1994, 10, 92. 156. Lu, Y.; Yin, Y.; Mayers, B. T.; Xia, Y. Nano. Lett. 2002, 2, 183. 97 157. Deng, Y.-H.; Wang, C.-C.; Hu, J.-H.; Yang, W.-L.; Fu, S.-K. Colloids Surf., A 2005, 262, 87. 157. Barnakov, Y. A.; Yu, M. H.; Rosenzweig, Z. Langmuir 2005, 21, 7524. 158. Im, S. H.; Herricks, T.; Lee, Y. T.; Xia, Y. Chem. Phys. Lett. 2005, 40 (1-3), 19. 159. Im, S. H.; Herricks, T.; Lee, Y. T.; Xia, Y. Chem. Phys. Lett. 2005, 40 (1-3), 19. 160. Butterworth, M. D.; Bell, S. A.; Armes, S. P.; Simpson, A. W. J. Colloid Interface Sci. 1996, 183, 91. 161. Liu, X.; Xing, J.; Guan, Y.; Shan, G.; Liu, H. Colloids Surf., A 2004, 238, 127. 162. Salazar-Alvarez, G. Doctoral Thesis, Stockholm, Sweden, 2004. 163. Tartaj, P.; Serna, C. J. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 15754. 164. (334) Tartaj, P.; Serna, C. J. Chem. Mater. 2002, 14, 4396. 165. (335) Gao, X.; Yu, K. M. K.; Tamb, K. Y.; Tsang, S. C. Chem. Comm. 2003, 2298. 166. Ulman, A. Chem. ReV. 1996, 96, 1533. (338) Liu, Q.; Finch, J. A.; Egerton, R. Chem. Mater. 1998, 10, 3936. 167. Mornet, S.; Portier, J.; Duguet, E. J. Magn. Magn. Mater. 2005, 293, 127. 168. (340) del Campo, A.; Sen, T.; Lellouche, J.-P.; Bruce, I. J. J. Magn. Magn. Mater. 2005, 293, 33. 169(341) Yamaura, M.; Camilo, R. L.; Sampaio, L. C.; Macedo, M. A.; Nakamuro, M.; Toma, H. E. J. Magn. Magn. Mater. 2004, 279, 210. 170. Mulvaney P, Liz-Marzan LM, Giersig M, Ung T. Silica encapsulation of quantum dots and metal clusters. J Mater Chem 2000;10:1259–70. 171. Lin, J.; Zhou, W.; Kumbhar, A.; Fang, J.; Carpenter, E. E.; O’Connor, C. J. J. Solid State Chem. 2001, 159, 26. 173. Lyon, J. L.; Fleming, D. A.; Stone, B.; Schiffer, P.; Willians, M. E. Nano. Lett. 2004, 4, 719. 174. Lin J, Zhou W, Kumbhar A, Fang J, Carpenter EE, O’Connor CJ. Gold-coated iron (Fe@Au) nanoparticles: synthesis, characterization, and magnetic field-induced self-assembly. J Solid State Chem 2001;159:26–31 175. Weissleder, R.; Lee, A. S.; Khaw, B. A.; Shen, T.; Brady, T. J. Radiology 1992, 182, 381. 176. Suwa, T.; Ozawa, S.; Ueda, M.; Ando, N.; Kitajima, M. Int. J. Cancer 1 998, 75, 626. 177. Wadghiri, Y. Z.; Sigurdsson, E. M.; Sadowski, M.; Elliott, J. I.; Li,Y.; Scholtzova, H.; Tang, C. Y.; Aguinaldo, G.; Pappolla, M.; Duff, K.; Wisniewski, T.; Turnbull, D. H. Magn. Reson. Med. 2003, 50, 293. 178. Jung, H. I.; Kettunen, M. I.; Davletov, B.; Brindle, K. M. Bioconjugate Chem. 2004, 15 (5), 983. 179. Artemov, D.; Mori, N.; Okollie, B.; Bhujwalla, Z. M. Magn. Reson. Med. 2003, 49, 403. 98 180. Sun, E. Y.; Josephson, L.; Kelly, K. A.; Weissleder, R. Bioconjugate Chem. 2006, 17, 109. 181. Renshaw, P. F.; Owen, C. S.; Evans, A. E.; Leigh, J. S. Magn. Reson. Imaging 1986, 4, 351. 182. Leuschner, C.; Kumar, C. S. S. R.; Hansel, W.; Hormes, J. J. Biomed. Nanotechnol. 2005, 1, 229. 183. Peng, Z. G.; Hidajat, K.; Uddin, M. S. J. Colloid Interface Sci. 2004, 271, 277. 184. Zhang, Y.; Zhang, J. J. Colloid Interface Sci. 2005, 2832, 352. 185. Mornet, S.; Vasseur, S.; Grasset, F.; Duguet, E. J. Mater Chem. 2004, 14, 2161. 186. Shinkai, M.; Suzuki, M.; Iijima, S.; Kobayashi, T. Biotechnol. Appl. Biochem. 1994, 21, 125. 187. Domingo, J. C.; Mercadal, M.; Petriz, J.; De Madariaga, M. A. J. Microencapsulation 2001, 18 (1), 41. 188. Ito, A.; Kuga, Y.; Honda, H.; Kikkawa, H.; Horiuchi, A.; Watanabe, Y.; Kobayashi, T. Cancer Lett. 2004, 212 (2), 167. 189. Ito, A.; Ino, K.; Kobayashi, T.; Honda, H. Biomaterials 2005, 26 (31), 6185. 190. Hodenius, M.; De Cuyper, M.; Desender, L.; Muller-Schulte, D.; Steigel, A.; Lueken, H. Chem. Phys. Lipids 2002, 120 (1- 2), 75. 191. R.F. Schmidt, G. Thews, Physiologie des Menschen, 26th ed., Springer, Berlin, 1995, p. 515. 192. J. Kreuter, Factors influencing the body distribution of polyacrylic nanoparticles, in: P. Buri, A. Gumma (Eds.), Drug Targeting, Elsevier, Amsterdam, 1985. 193. J. Kreuter, Pharm. Acta Helv. 58 (1983) 196. 194. G. Strom, S.O. Belliot, T. Daemen, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 17 (1995) 31. 195. R.H. Muller, M. Luck, S. Harnisch, et al., in: U. Hafeli, et al. (Eds.), Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers, Plenum Press, New York, 1997, p. 135. 196. M.M. Moghimi, A.C. Hunter, J.C. Murray, Pharmacol. Rev. 53 (2001) 283. 197. C. Chouly, D. Polyquen, I. Lucet, et al., J. Microencapsulation 13 (1996) 245. 198. S. MaaXen, E. Fattal, R.H. Muller, et al., STP Pharma Sci. 3 (1993) 11. 199. W. Schutt, C. Gruttner, U. Hafeli, et al., Hybridoma 16 (1997) 109. 200. Karino A., Hayashi H., Yamada K., et al. Effect of particle size and emulsifiers on the blood clearance and deposition of injected emulsions // J. Pharm. Sci. 1987. V.76. P.273. 201. Park S.I., Lim J.H., Kim J.H., Yun H.I., Kim C.O. Toxicity estimation of magnetic fluids in a biological test // J.Magn.Magn. Mater. 2006. V.304. P.406-408. 202. Duncan R., Izzo L. Dendrimer biocompatibility and toxicity // Adv.Drug Deliv.Rev. 2005. V.57. P.2215-2237. 99 203. Ncubcrgcr T., Schopf B., Hermann H., Hofmann M., von Rechenbcrg B. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications: possibilities and limitations of a new drug delivery system // JMagn.Magn.Maier. 2005 V.293. P.483496. 204. Bonkovsky H.L., Ponka P., Bacon B.R., Drysdale J., Grace N.D., Tavill A.S. An update on iron metabolism: summary of the Fifth International Conference on Disorders of Iron Metabolism // Hepatology. 1996. V.24(3). P.718-729. 205. Weissleder R., Stark D.D., Engelstad B.L., Bacon B.R., Compton C.C., White D.L., Jacobs P., Lewis J. Superparamagnetic iron oxide: pliannacokinetics and toxicity // AJR Am.J. Roentgenol. 1989. V.152. P.167-173. 206. Lubbc A.S., Alexiou C., Bergemann C. Clinical applications of magnetic drug targeting // J.Surg.Res. 2001. V.95. P.200-206. 207. Kaminski M.D., Rosengart A.J. Detoxification of blood using injeclable magnetic nanoparticles: a conceptual technology description // J.Magn.Magn.Mater. 2005. V.293. P.389-403. 208. MaaXen S., Fattal E., Muller R.H., et al. Cell cultures for the assessment of toxicity and uptake of polymeric particulate drug carrier // STP Pharma Sci. 1993. V.3(1). P.11-22. 209. Papatheofanis F.J., Barmada R., Biomed J.. Polymorphonuclear leukocyte degranulation with exposure to polymethylmethacrylate nanoparticles // Mater. Res. 1991. V.25(6). P.761. 210. Muller R.H., MaaXen S., Weyhers H., et al. Phagocytic uptake and cytotoxicity of solid lipid nanoparticles (SLN) sterically stabilized with poloxamine 908 and poloxamer 407 // J. Drug Targeting. 1996. V.4. P.161-170. 211. Dodd C.H., Hsu H.C., Chu W.J., et al. Normal T-cell response and in vivo magnetic resonance imaging of T cells loaded with HIV transactivator-peptide-derived superparamagnetic nanoparticles // J. Immunol. Methods. 2001. V.256. P.89-105. 212. Lewin M., Carlesso N., Tung C.H., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells // Nature Biotechnol. 2000. V.18(4). P.410. 213. Schutt W., Gruttner C., Hafeli U., et al. Applications of magnetic targeting in diagnosis and therapy--possibilities and limitations: a mini-review // Hybridoma. 1997. V.16(1). P.109. 214. MaaXen S., Fattal E., Muller R.H., et al. Cell cultures for the assessment of toxicity and uptake of polymeric particulate drug carrier // STP Pharma Sci. 1993. V.3(1). P.11-22. 215. Lacava Z.G.M., Azevedo R.B., et al. Toxic effects of ionic magnetic fluids in mice // J. Magn. Magn. Mater. 1999. V.194. P.90-95. 100 216. Lacava Z.G.M., et al. Biological effects of magnetic fluids: toxicity studies // J. Magn. Magn. Mater. 1999. V.201. P.431-434. 217. Weissleder R., Stark D.D., Engelstad B.L., et al. Superparamagnetic iron oxide: pharmacokinetics and toxicity // Am. J. Roentgenol. 1989. V.152(1). P.167. 218. Lubbe A.S., Bergmann C., Brock J., et al. Physiological aspects in magnetic drug targeting // J. Magn. Magn. Mater. 1999. V.194. P.149. 219. Kuznetsov A.A., Harutyunyan A.R., et al., in: Hafeli U., et al. (Eds.). Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers. New York: Plenum Press, 1997. P. 379. 220. Lubbe A.S., Bergmann C., et al., in: U. Hafeli, et al. (Eds.). Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers. New York: Plenum Press, 1997. P. 457. 221. MaaXen S., Fattal E., Muller R.H., et al. Cell cultures for the assessment of toxicity and uptake of polymeric particulate drug carrier // STP Pharma Sci. 1993. V.3(1). P.11-22. 222. Kissel T., Roser M. Influence of chemical surface-modifications on the phagocityc properties of albumin nanoparticles // Proceedings of the International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials. 1991. V.18. P.275. 223. Chakeres D.W., de Vocht F. Static magnetic field effects on human subjects related to magnetic resonance imaging systems // Prog.Biophys.Moi.BioL. 2005. V.87. P.255-265. 223. Seiyama A., Seki J., Iwamoto M., Yanagida T. Paramagnetic artifact and safety criteria for human brain mapping // Dyn.Med. 2005. V.4. P.5. 224. Chan P., Eng L.F., Lee Y.L., Lin V.W. Effects of pulsed magnetic stimulation of GFAP levels in cultured astrocytes // J.Neurosci.Res. 1999. V.55. P.238-244. 225. Polyak B., Friedman G. Magnetic targeting for site-specific drug delivery: applications and clinical potential // Expert.Opin.DmgDeliv. 2009. V.6. P.53-70. 226. Polyak B., Friedman G. Magnetic targeting for site-specific drug delivery: applications and clinical potential // Expert.Opin.DmgDeliv. 2009. V.6. P.53-70. 227. Olsvik O., Popovic T., Skjerve F,., Cudjoe K.S., Homes E., Ugelstad J., Uhlen M. Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology // Clin.Microbiol.Rev. 1994. V.1. P.43-54. 228. Pankrmrst Q.A., Connolly J., Jones S.K., Dobson J. Application of magnetic nanoparticles in biomedicine // J PHYS D APPL PHYS. 2003. V.36(13). P.167-181. 229. Lefebure S, Dubois V, Cabuil V, Neveu, Massart S. Monodisperse magnetic nanoparticles: preparation and dispersion in water and oils // J Mater Res. 1998. V.10. P.2975. 230. Bean CP, Livingstone JD. Superparamagnetism // J Appl Phys 1959. V.30. P.120129. 101 231. Chatterjee J, Haik Y, Chen C-J. Size dependent magnetic properties of iron oxide nanoparticles // J Magn Magn Mater. 2003. V.257(1). P.113-118. 232. Li Y., Xiong P., Molnar S.V., Wirth S., Ohno Y., Ohno H. Hall magnetometry on a single iron nanoparticle // Appl Phys Lett. 2002. V.80(24). P.4644-4646. 233. Han D.H., Wang J.P., Luo H.L. Crystallite size effect on saturation magnetization of fine ferrimagnetic particles // J Magn Magn Mater. 1994. V.136(1–2). P.176-182. 234. Tourinho F., Franck R., Massart R., Perzynski R. Synthesis and magnetic properties of manganese and cobalt ferrofluids // Prog Colloid Polym Sci. 1989. V.79. P.128. 235. Voit W., Kim D.K., Zapka W., Muhammed M., Rao K.V. Magnetic behavior of coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles in ferrofluids // Mater Res Soc Symp Proc. 2001. V.676. P.1-6. 236. Gupta A.K., Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications // Biomaterials. 2005. V.26. P.3995-4021. 237. Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., Dobson J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine // J Phys D: Appl Phys. 2003. V.36. P.167-181. 238. Ha¨feli U., Schu¨tt W., Teller J., Zborowski M., editors. Scientific and clinical applications of magnetic carriers. New York: Plenum Press, 1997. 239. Berry C.C., Curtis A.S.G. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine // J Phys D: Appl Phys. 2003. V.36. P.198-206. 240. Chatterjee J., Haik Y., Chen C.-J. Size dependent magnetic properties of iron oxide nanoparticles // J Magn Magn Mater. 2003. V.257(1). P.113-118. 241. Tartaj P., Morales M.P., Veintemillas-Verdaguer S., Gonza´lezCarren˜o T., Serna C.J. The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine // J Phys D: Appl Phys. 2003. V.36. P.182-197. 242. Jordan A., Scholz R., Maier-Hauff K., et al. Presentation of a new magneticfield therapy system for the treatment of human solid tumors with magneticfluid hyperthermia // J Magn Magn Mater. 2001. V.225. P.118-126. 243. Olsvik O., Popovic T., Skjerve E., Cudjoe K.S., Hornes E., Ugelstad J., Uhlen M. Magneticseparation techniques in diagnostic microbiology // Clin Microbiol Rev. 1994. V.7. P.43-54. 244. Yeh T.C., Zhang W., Ldstad S.T., Ho C. Intracellular labeling of Tcells with superparamagnetic contrast agents // Magn Reson Med. 1993. V.30. P.617-625. 245. Handgretinger R., Lang P., Schumm M., Taylor G., Neu S., Koscielnak E., Niethammer D., Klingebiel T. Isolation and transplantation of autologous peripheral CD34+progenitor cells highly purified by magnetic-activated cell sorting // Bone Marrow Transplant. 1998. V.21. P.987-993. 102 246. Schoepf U., Marecos E., Jain R., Weissleder R. Intracellular magneticlabelling of lymphocytes for in vivo trafficking studies // BioTechniques. 1998. V.24. P.642-651. 247 Cuatrecasas P., Roth T.F., editors. Receptor-mediated endocytosis. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1983 [Hardbound, ISBN 0-412-24820-4]. 248. Weissleder R., Cheng H.C., Bogdanova A., Bogdanov A. Magnetically labelled cells can be detected by MR imaging // J Magn Reson Imaging. 1997. V.7. P.258– 263. 249. Cuatrecasas P., Roth T.F., editors. Receptor-mediated endocytosis. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1983 [Hardbound, ISBN 0-412-24820-4]. 250. Bilbao G., Gomez-Navarro J., Curiel D. In: Walden P, et al., editors. Targeted adenoviral vectors for cancer gene therapy. New York: Plenum Press. 1998. P.365374. 251. Weissleder R., Cheng H.C., Bogdanova A., Bogdanov A. Magnetically labelled cells can be detected by MR imaging // J Magn Reson Imaging. 1997. V.7. P.258– 263. 252. Qian Z.M., Li H., Sun H., Ho K. Targeted drug delivery via transferrin receptormediated endocytosis pathway // Pharmacol Rev. 2002. V.54(4). P.561–587. 253. Laurent S., Forge D., Port M., Roch A., Robic C., Vandcr E.L., Mullcr R.N. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis, stabilization, vectori/atioti, physicochemical characterisations, and biological applications // Chem.Rev. 2008. V.108. P.2064-2110. 254. Fortin J.P., Wilhclm C., Scrvais J., Mcnagcr C., Bacri J.C. Gazcau F. Size-sorted anionic iron oxide nanomagnets as colloidal mediators for magnetic hyperthermia // J.Am.Ckem.Soc. 2007. V.129. P.2628-2635. 255. Ho A., Shinkai M., Honda H., Kobayashi T. Medical application of functionalized magnetic nanoparticles // J.Biosci.Bioeng. 2005. V.100. P.1-11. 256. Kawai N., Ito A., Nakahara Y., Futakuchi M., Shirai T., Honda H., Kobayashi T., Kohri K. Anlicancer effeci of hyperthermia on prostate cancer mediated by magnetite cationic liposomcs and immune-response induction in transplanted syngcncic rats // Prostate. 2005. V.64. P.373-381. 257. Gupta A.K., Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedica] applications // Biomaterials. 2005. V.26. P.3995-4021. 258. Shinkai M., Le B., Honda H., Yoshikawa K., Shimizu K., Saga S., Wakabayashi T., Yo-shida J., Kobayashi T. Targeting hypcrthcrmia for renal cell carcinoma using human MN antigen-specific magnetoliposomes // JpnJ.Cancer Res. 2001 V.92. P.1138-1145. 103 259. Alexiou C., Jurgons R., Seliger C., Brunke O., Iro H., Odenbach S. Delivery of superparamagnetic nanoparticles for local chemotherapy after intraartcrial infusion and magnetic drug targeting // Anticancer Res. 2007. V.27. P.2019-2022,1286. 260. Jurgons R., Scligcr C., Hilpert A., Trahms L., Odenbach S., Alexiou C. Drug loaded magnetic nanoparticles for cancer therapy // J.Phyf.:Condens.Matter. 2006. V.18. P.82893-82902. 261. Caruthers S.D., Winter P.M., Wickline S.A., Lanza G.M. Targeted magnetic resonance imaging contrast agents // Methods MoiMed. 2006. V.124. P.387-400. 262. Cunningham C.H., Arai T., Yang P.C., McConnell M.V., Pauly J.M., Conolly S.M. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles // Magn Reson.Med. 2005. V.53. P.999. 263. Waters H.A, Wickline S.A. Contrast agents for MRI // Basic Res.Cardiol. 2008. V.103. P.114-121. 264. Yoo B., Pagel M.D. An overview oCresponsive MRI contrast agents for molecular imaging // Front Biosci. 2008. V.13. P.1733-1752. 265. Johannsen M., Gneveckow U., Eckelt L., et al. Clinical hypcrthcrmia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: presentation of a new interstitial technique // Int.J.Ifyperthermia. 2005. V.21(7). P.637-647. 266. Hergt R., Dutz S., Mullcr K., Zcisberger M. Magnetic particle hyperthermia: nanoparticles magnetism and materials development for cancer therapy // J.Phyx.:Condens.Matter. 2006. V.18. P.2919-2934. 267. Goya G.F., Grazu V., Ibarra M.R. Magnetic nanoparticles for cancer therapy // Curr.Nanosci. 2008. V.4. P.1-16. 268. Chouly C., Pouliquen D., Lucet I., Jeune P., Pellet J.J. Development of superparamagnetic nanoparticles for MRI: effect of particles size, charge and surface nature on biodistribution // J Microencapsul. 1996. V.13. P.245-255. 269. Jordan A., Scholz R., Maier-Hauff K., Johannsen M., et al. Presentation of a new magneticfield therapy system for the treatment of human solid tumors with magneticfluid hyperthermia // J Magn Magn Mater. 2001. V.225. P.118-126. 270. Storm G., Belliot S.O., Daemen T., Lasic D.D. Surface modification of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclear phagocyte system // Adv Drug Del Rev. 1995. V.17. P.31–48. 271. Soenen S.J., Hodenius M., De Cuyper M., Magnetoliposomes: versatile innovative nanocolloids for use in biotechnology and biomedicine // Nanomed. 2009. V.4. P.177-191. 272. Akira Ito, MasashigeShinkai, Hiroyuki Honda, Takeshi Kobayashi. Medical Application of Functionalized Magnetic Nanoparticles // Journal Of Bioscience And Bioengineering. 2005. V.100. P. 1-11. 104 273. Akira Ito, MasashigeShinkai, Hiroyuki Honda, Takeshi Kobayashi. Medical Application of Functionalized Magnetic Nanoparticles // Journal Of Bioscience And Bioengineering. 2005. V.100. P. 1-11. 274. Catherine C. Berry, Adam S. G. Curtis. Functionalisation Of Magnetic Nanoparticles For Applications In Biomedicine // Journal Of Physics D: Applied Physics. 2003. V.36. P.198-206. 275. Ruirui Qiao, Chunhui Yang, Mingyuan Gao. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: from preparations to in vivo MRI applications // J. Mater. Chem. 2009. V.19. P.6274–6293. 276. Ioannis Rabias, Danai Tsitrouli, Eleni Karakosta, Thomas Kehagias, Georgios Diamantopoulos et al. Rapid magnetic heating treatment by highly charged maghemite nanoparticles on Wistar rats exocranial glioma tumors at microliter volume // Biomicrofluidics. 2010. V.4. P.02411. 277. Sophie Laurent, Delphine Forge, Marc Port, Alain Roch, Caroline Robic, Luce Vander Elst, Robert N. Muller. Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Vectorization, Physicochemical Characterizations, and Biological Applications // Chemical Reviews. 2008. V.108(6). P.2064–2110. 278. Haw C.Y., Mohamed F., Chia C.H., Radiman S., Zakaria S., Huang N.M., Lim H.N.. Hydrothermal synthesis of magnetite nanoparticles as MRI contrast agents // Ceramics International. 2010. V.36. P.1417–1422. 279. Dina V. Hingorani, Adam S. Bernstein, Mark D. Pagel. A review of responsive MRI contrast agents: 2005–2014 // Contrast Media Mol. Imaging. 2014. DOI: 10.1002/cmmi.1629. 280. Na H. B., Song I. C., Hyeon T. Inorganic Nanoparticles for MRI Contrast Agents // Adv. Mater. 2009. V.21. P.2133–2148. doi: 10.1002/adma.200802366 281. Harisinghani M. G., Barentsz J., Hahn P. F., Deserno W. M., Tabatabaei S., van de Kaa C. H., de la Rosette J., Weissleder R. Noninvasive detection of clinically occult lymph-node metastases in prostate cancer // N. Engl. J. Med. 2003. V.348. P.2491. 282. Lepore A.C., Walczak P., Rao M.S., Fischer I., Bulte J. W. MR imaging of lineagerestricted neural precursors following transplantation into the adult spinal cord // Exp.NeuroL. 2006. V.201. P.49-59. 283 Qiu B., Gao K., Walczak P., Zhang J., Kar S., Bulte J. W, Yang X. In vivo MR imaging of bone marrow cells trafficking to atherosclerotic plaques // J.Magn Rexon.lmaging. 2007. V.26. P.339-343. 284. Sreeja V., Jayaprabha K. N., Joy P. A. Water-dispersible ascorbic-acid-coated magnetite nanoparticles for contrast enhancement in MRI Water-dispersible ascorbic-acid-coated magnetite nanoparticles for contrast enhancement in MRI // Applied Nanoscience. 2014. V.5(4). P.435-441. DOI 10.1007/s13204-014-0335-0 105 285. Johan S. Basuki, Alexandre Jacquemin, Lars Esser, Yang Li, Cyrille Boyer, Thomas P. Davis. A block copolymer-stabilized co-precipitation approach to magnetic iron oxide nanoparticles for potential use as MRI contrast agents // Polym. Chem. 2014. V.5. P.2611–2620. DOI: 10.1039/c3py01778h 286. Matthew R. J. Carroll, et al. The effect of polymer coatings on proton transverse relaxivities of aqueous suspensions of magnetic nanoparticles // Nanotechnology. 2011. V.22. P.325702. 287. Hongwei Duan, Min Kuang, Xiaoxia Wang, Wang Y. Andrew, Hui Mao, Shuming Nie. Reexamining the Effects of Particle Size and Surface Chemistry on the Magnetic Properties of Iron Oxide Nanocrystals: New Insights into Spin Disorder and Proton Relaxivity // J. Phys. Chem. 2008. V.112(22). P. 8127–8131. 288. Zhao, Z. et al. Octapod iron oxide nanoparticles as highperformance T2 contrast agents for magnetic resonance imaging // Nat. Commun. 2013. V.4. P.2266. doi: 10.1038/ncomms3266 289. Tae-Hyun Shin, Jin-sil Choi, Seokhwan Yun, Il-Sun Kim, Ho-Taek Song, Youngmee Kim, Kook In Park, Jinwoo Cheon. T1 and T2 Dual-Mode MRI Contrast Agentfor Enhancing Accuracyby Engineered Nanomaterials // ACSNano. 2014. V.8(4). P.3393-3401. 290. Jae-Hyun Lee, Young-wook Jun, Soo-In Yeon, Jeon-Soo Shin, Jinwoo Cheon. Dual-Mode Nanoparticle Probes for High-Performance Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging of Neuroblastoma // Angew. Chem. 2006. V.118. P.83408342. 291. Mornet S., Portier J., Duguet E. A method for synthesis and [unetionaltzation of ultrasmall superparamagnetie eovalent carriers based on maghemite and dexlran // J.Magn.Magn.Mater. 2005. V.293. P.127-134. 292. Wilhclm C., Gazeau F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles // Biomaterials. 2008. V.29. P.3161-3174. 293. Arbab A.S., Bashaw L.A, Miller B.R., Jordan E.K.., Lewis B.K., Kalish H., Frank J.A. Characterization of biophysical and metabolic properties of cells labeled with Superparamagnetic iron oxide nanoparlicles and transfection agent for cellular MR imaging // Radiology. 2003. V.229. P.838-846. 294. Lacava Z.G.M., Garcia V.A.P., Lacava L.M. Biodistribution and biocompalibility investigation in magnctoliposome treated mice // Spectroscopy. 2009. V.18. P.597603. 295. De Cuypcr M., Joniau M. Magnetoliposomes. Formation and structural charactcrization // Eur.BiophysJ. 1988. V.15. P.311-319. 296. Al Jamal W.T., Kostarelos K. Liposome-nanoparticle hybrids tor muhimodal diagnostic and therapeutic applications // Nanomed. 2007. V.2. P.85-98. 106 297. Martina M.S., Fortin J.P., Mcnager C., Clement O., Barratt G., GrabielleMadelmont C., Gazcau F., Cabuil V., Lesieur S. Generation of Superparamagnetic liposomes revealed as highly efficient MRi contrast agents for in vivo imaging // J.Am.Ctiem.Soc. 2005. V.127. P.10676-10685. 298. Polyak B., Friedman G. Magnetic targeting for site-specific drug delivery: applications and clinical potential // Expert.Opin.DmgDeliv. 2009. V.6. P.53-70. 299. Amiebo M., Femandez-Pacbeco R., rbarra M.R., Santamaria J. Magnetic nanoparticles for drug delivery // Nanotoday. 2007. V.2. P.22-32. 300. Moghimi S.M., Bonnemain B. Subcutaneous and intravenous delivery of diagnostic agents to the lymphatic system: applications in lymphoscintigraphy and indirect lymphography // Adv. DrugDeliv.Rev. 1999. V.37. P.295-312. 301. Margolis L.B., Namiol V.A., Kljukin L.M. Magnetoliposomes: another principle of cell sorting // Hinckim.Biophys.Acta. 1983. V.735. P.193-195. 302. Tarahovsky Y. S. “Smart” Liposomal Nanocontainers in Biology and Medicine // Biochemistry. 2010. V.75(7). P.811-824. 303. Fortin-Ripoche J.P., Martina M.S., Gazeau F., Menager C., Wilhelm C., Bacri L.C., Lesieur S., Clement O. Magnetic targeting of magnetoliposomes to solid tumors with MR imaging monitoring in mice: feasibility // Radiology. 2006. V.239. P.415424. 304. Dandamudi S., Campbell R.B. Development and characterization of magnetic cationic liposomes for targeting tumor microvasculature // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V.1768. P.427-438. 305. Shinkai M., Le B., Honda H., Yoshikawa K., Saga S., Wakabayashi T., Yoshida J., Kobayashi T. Targeting hyperthermia for renal cell carcinoma using human MN antigen-specific magnetoliposomes // Jpn.J.Cancer Res. 2001. V.92. P.1138-1145. 306. Martina M. S., et al. Generation of Superparamagnetic Liposomes Revealed as Highly Efficient MRI Contrast Agents for in Vivo Imaging // J. Am. Chem. Soc. 2005. V.127. P.10676-10685. 307. Yanjing Chen, Yuan Chen, Da Xiao, Arijit Bose, Ruitang Deng, Geoffrey D. Bothun. Low-dose chemotherapy of hepatocellular carcinoma through triggeredrelease from bilayer-decorated magnetoliposomes // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2014. V.116. P.452–458. 308. Ilker Dincer, Onur Tozkoparan, Sergey V. German, Alexey V. Markin, Oguz Yildirim, Gennady B. Khomutov, Dmitry A. Gorin, Sergey B. Venig, Yalcin Elerman. Effect of the Number of Iron Oxide Nanoparticle Layers on the Magnetic Properties of Nanocomposite LbL Assemblies // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2012. V.324. P.2958–2963. 107 309. Martina M.S., Wilhelm C., Lesieur S. The effect of magnetic targeting on the uptake of magnetic-fluid-loaded liposomes by human prostatic adenocarcinoma cells // Biomaterials. 2008. V.29. P.4137-4145. 310. Al Jamal W.T., Kostarelos K. Liposome-nanoparticle hybrids tor muhimodal diagnostic and therapeutic applications // Nanomed. 2007. V.2. P.85-98. 311. Escorcia F.E., McDevitt M.R., Villa C.H., Seheinberg D.A. Targeted nanomaterials for radiotherapy // Nanomed. 2007. V.2. P.805-815. Sofou S. Surface-active liposomes for targeted cancer therapy // Nanomed. 2007. V.2. P.711 -724. 312. Jain S., Mishra V., Singh P., Dubey P.K., Saraf O.K., Vyas S.P. RGD-anchored magnetic liposomes for monocytcs/neutrophils-mediated brain targeting // Int.J.Pharm. 2003. V.215. P.45-50. 313. Viroonchatapan R., Ueno M., Sato H., Adachi I., Nagae H., Tazawa K., Horikoshi. Preparation and characterization of dextran magnetite-incorporated thermosensitive liposomes: an on-line flow system for quantifying magnetic responsiveness // Phann.Res. 1995. V.12. P.1176-1183. 314. Viroonchatapan E., Sato H., Ucno M., Adachi L, Muraia J., Saiki L, Tazawa K., HorikoshiI. Microdialysis assessment of 5-fluorouracil release from thermosensitive magnetoliposomes induced by an electromagnetic field in tumorbearing mice // J.Drug Target. 1998. V.5. P.379-390. 315. Viroonchatapan E., Sato H., Ueno M., Adachi L, Tazawa K., Horikoshi. Magnetic targeting of thermosensitive magnetoliposomes to mouse livers in an in situ on-line perfusion system // Life Sci. 1996. V.58. P.2251-2261. 316. Frich L., Bjomerud A., Fossheim S., Tillung T., Gladhaug. Experimental application of thermosensitive paramagnetic liposomes for monitoring magnetic resonance imaging guided thermal ablation // Magn ResonMed. 2004. V.52. P.13021309. 317. Decher G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposite // Science. 1997. V.277. P.1232-1237. 318. Iler R.K. Multilayers of colloidal particles // Journal of Colloid and Interface Science. 1966. V.21(6). P.569-594. 319. Lvov Y., Decher G., Moehwald H.. Assembly, structural characterization, and thermal behavior of layer-by-layer deposited ultrathin films of polyvinyl sulfate) and poly(allylamine) // Langmuir. 1993. V.9. P.481-486. 320. Ma, Y.; Dong, W. F.; Hempenius, M. A.; Mo¨hwald, H.; Vancso, G. J. Redoxcontrolled molecular permeability of composite-wall microcapsules // Nat. Mater. 2006. V.5. P.724-729. 108 321. Lvov, Y.; Antipov, A. A.; Mamedov, A.; Mo1hwald, H.; Sukhorukov, G. B. Urease Encapsulation in Nanoorganized Microshells // Nano Lett. 2001. V.1. P.125128. 322. Dong W. F., Ferri J. K., Adalsteinsson T., Schonhoff M., Sukhorukov G. B., Mohwald H. Influence of different salts on micro-sized polyelectrolyte hollow capsules // Chem. Mater. 2005. V.17. P.2603–2611. 323. Angelatos A. S., Johnston A. P. R., Wang Y., Caruso F. Probing the permeability of polyelectrolyte multilayer capsules via a molecular beacon approach // Langmuir. 2007. V.23. P.4554-4562. 324. Shutava T., Prouty M., Kommireddy D., Lvov Y. pH responsive decomposable layer-bylayer nanofilms and capsules on the basis of tannic acid // Macromolecules. 2005. V.38. P.2850-2858. 325. Lvov Y. M., Lu Z., Schenkman J. B., Zu X., Rusling J. F. Direct electrochemistry of myoglobin and cytochrome P450cam in alternate layer-by-layer films with DNA and other polyions // J. Am. Chem. Soc. 1998. V.120. P.4073-4080. 326. Dubas S. T., Schlenoff J. B. Polyelectrolyte multilayers containing a weak polyacid: Construction and deconstruction // Macromolecules. 2001. V.34. P.37363740. 327. De Geest B. G., Dejugnat C., Verhoeven E., Sukhorukov G. B., Jonas A. M.; Plain, J., Demeester J., De Smedt S. C. Layer-by-layer coating of degradable microgels for pulsed drug delivery // J.Controlled Release. 2006. V.116. P.159-169. 328. Ibarz G., Da¨hne L., Donath E., Moehwald H. Smart micro-and nanocontainers for storage, transport, and release // AdV. Mater. 2001. V.13. P.1324-1327. 329. Ai H., Jones S. A., de Villiers M. M., Lvov Y. M. Nano-encapsulation of furosemide microcrystals for controlled drug releas // J. Controlled Release. 2003. V.86. P.59–68. 330. Koehler K., Moehwald H., Sukhorukov G. B. Thermal Behavior of Poyelectrolyte Multilayer Microcapsules. 2. Insight into Molecular Mechanisms for the PDADMAC/PSS System // J. Phys. Chem. B. 2006. V.110. P.24002-24010. 331. Feng Z., Wang Z., Gao C., Shen J. // Chem. Mater. 2007. V.19. P.4648-4658. 332. An Z., Moehwald H., Li J. pH controlled permeability of lipid/protein biomimetic microcapsules // Biomacromolecules. 2006. V.7. P.580-585. 333. Angelatos A. S., Radt B., Caruso F. Light-responsive polyelectrolyte/gold nanoparticle microcapsules // J. Phys. Chem. B. 2005. V.109. P.3071-3076. 334. Shchukin D. G., Gorin D. A., Moehwald H. Ultrasonically induced opening of polyelec-trolyte microcontainers // Langmuir. 2006. V.22(17). P.7400-7404. 109 335. Skirtach A. G., Dejugnat C., Braun D., Susha A. S., Rogach A. L., Parak W. J., Moehwald H., Sukhorukov G. B. The role of metal nanoparticles in remote release of encapsulated materials // Nano Lett. 2005. V.5. P.1371-1377. 336. Radt B., Smith T. A., Caruso F. Optically addressable nanostructured capsules // AdV. Mater. 2004. V.16. P.2184-2189. 337. Skirtach A. G., Javier A. M., Kreft O., Koehler K., Alberola A. P., Moehwald H., Parak W. J., Sukhorukov G. B. Laser-induced release of encapsulated materials inside living cells // Angew. Chem., Int. Ed. 2006. V.45. P.4612-4617. 338. Shang-Hsiu Hu, Chia-Hui Tsai, Chen-Fu Liao, Dean-Mo Liu, San-Yuan Chen. Controlled Rupture of Magnetic Polyelectrolyte Microcapsules for Drug Delivery // Langmuir. 2008. V.24. P.11811-11818. 339. Gorin D.A., Portnov S.A., Inozemtseva O.A., Luklinska Z., Yashchenok A.M., Pavlov A.M., Skirtach A.G., Möhwald H., Sukhorukov G.B. Magnetic/gold nanoparticle functionalized biocompatible microcapsules with sensitivity to laser irradiation // Phys. Chem. Chem. Phys. 2008. V.10. P.6899 – 6905. 340. Yashchenok A., Masic A., Gorin D., Shim B. S., Kotov N. A., Fratzl P., Möhwald H., Skirtach A. Nanoengineered Colloidal Probes for Raman-based Detection of Biomolecules inside Living Cells // Small. 2013. V.9(3). P.351-356. 341. Luo Y.L., Fan L.H., Xu F., et al. Synthesis and characterization of Fe3O4 /PPy/P(MAA-co-AAm) trilayered composite microspheres with electric, magnetic and pH response characteristics // Materials Chemistry and Physics. 2010. V.120. P.590–597. 342 Dey S., Mohanta K., Pal A.J. Magnetic-field-assisted layer-by-layer electrostatic assembly of ferromagnetic nanoparticles // Langmuir. 2010. V.26(12). P.9627–9631. 343. Klechkovskaya V.V., Nikitin L.V., Stepina N.D., et al. Self-assembly of magnetic multilayer polymer films on the base of polyelectrolytes and magnetic suspensions // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2003. V.258/259. P.480–483. 344. Wang L., Luo J., Maye M.M., et al. Iron oxide-gold core-shell nanoparticles and thin film assembly // Journal of Materials Chemistry. 2005. V.15. P.1821–1832. 345. Grigoriev D., Gorin D., Sukhorukov G.B., et al. Polyelectrolyte/magnetite Nanoparticle Multilayers: Preparation and Structure Characterization // Langmuir. 2007. V.23(24). P.12388–12396. Yashchenok A. M., Gorin D. A., Badylevich M., Serdobintsev A. A., Bedard M., Fedorenko Y. G., Khomutov G. B., Grigoriev D. O., Moehwald H. Impact of magnetite nanoparticle incorporation on optical and electrical properties of nanocomposite LbL assemblies // Phys. Chem. Chem. Phys. 2010. V.12. P.1046910475. 110 346. Suda M., Einiga Y. Sequential Assembly of Ferromagnetic Ultra-Thin Films with Perpendicular Magnetic Anisotropy // Angewandte Chemie International Edition. 2009. V.48. P.1754–1757. 347. Pauly M., Pichon B.P., Albouy P.A., et al. Monolayer and multilayer assemblies of spherically and cubic-shaped iron oxide nanoparticles // Journal of Materials Chemistry. 2011. V.21(40). P.16018–16027. 349. (http://rsb.info.nih.gov/ij/) 350. Gupta A.K., Curtis A.S.G. Lactoferrin and ceruloplasmin derivatized superparamagneticiron oxide nanoparticles for targeting cell surface receptor // Biomaterials. 2004. V.25. P.3029. 351. Gupta A.K., Gupta M. Cytotoxicity suppression and cellular uptake enhancement of surface modified magnetic nanoparticles // Biomaterials. 2005. V.26. P.1565. 352. Sjogren C.E., Briley_Saebo K., Hanson M., Johansson C. Magnetic characterization of iron oxides for magnetic resonance imaging // Magn. Reson. Med. 1994. V.31. P.268. 353. Cornell R.M., Schertmann U. Iron Oxides in the Laboratory: Preparation and Characterization. Germany, Weinheim: VCH, 1991. 354. Cotton F.A., Wilkinson G. Advanced Inorganic Chemistry. New York: WileyInterscience, 1988. 355. Shebanova O.N., Lazor P. Raman study of magnetite (Fe3O4): laser‐induced thermal effects and oxidation // Journal of Raman Specroscopy. 2003. V.34(11). P.845-852. 356. Jubb A.M., Allen H.C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition // Applied Materials & Interfaces. 2010. V.2(10). P.2804-2812. 357. German S.V., Inozemtseva O.A., Navolokin N.A., Pudovkina E.E., Zuev V.V., Volkova E.K., Bucharskaya A.B., Pleskova S.N., Maslyakova G.N., Gorin D.A. Synthesis of magnetite hydrosols and assessment of their impact on living systems at the cellular and tissue levels using MRI and morphological investigation // Nanotechnologies in Russia. 2013. V.8(7/8). P.573-580. 358. Arras R, Calmels L, Warot-Fonrose B Electronic structure and interface states at the Fe3O4/MgO(100) interface // Journal of Physics: Conference Series 200. (2010). 07200. P.1-4 359. Gabizon A., Papahadjopoulos D. Liposome formulations with prolonged circulation time in blood and enhanced uptake by tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V.85. P.6949-6953. 111 360. Peng A., Straubinger R.M., Balu Iyer S.V. Phosphatidylinositol containing lipidic particles reduces immunogenicity and catabolism of factor VIII in hemophilia a mice // AAPS J. 2010. V.12. P.473-481. 361. Muller M., Zschornig O., Ohki S., Arnold K. Fusion, leakage and surface hydrophobicity of vesicles containing phosphoinositides: influence of steric and electrostatic effects // J. Membrane Biol. 2003. V.192(1). P.33-43. 362. Martina M. S., et al. Generation of Superparamagnetic Liposomes Revealed as Highly Efficient MRI Contrast Agents for in Vivo Imaging // J. Am. Chem. Soc. 2005. V.127. P.10676-10685. 363. Moghimi S.M., Hunter A.C., Andresen T.L. Factors controlling nanoparticle pharmacokinetics: an integrated analysis and perspective // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2012. V.52. P.481-503. 364. Drummond D.C., Meyer O., Hong K., Kirpotin D.B., Papahadjopoulos D. Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors // Pharmacol Rev. 1999. V.51(4). P.691-743. 365. Su T.-L., Chiou C.-S., Chen H.-W. Preparation, Photocatalytic Activity and Recovery of Magnetic Photocatalyst for Decomposition of Benzoic Acid // International Journal of Photoenergy. 2012. V. 2012. P.1-8. DOI:10.1155/2012/909678 366. Kolasinska M., Krastev R., Warszynski P. Characteristics of polyelectrolyte multilayers: Effect of PEI anchoring layer and posttreatment after deposition // Journal of Colloid and Interface Science. 2007. V.305. P.46-56. 367. Gorin D.A., Yashchenok A.M., Manturov A.O., et al. ffect of Layer-by-Layer Electrostatic Assemblies on the Surface Potential and Current Voltage Characteristic of Metal-Insulator-Semiconductor Structures // Langmuir. 2009. V.25(21). P.12529– 12534. DOI:10.1021/la901379d 368. Portnov S.A., Yashchenok A.M., Gubskii A.S., et al. An Automated Setup for Production of Nanodimensional Coatings by the Polyionic Self-Assembly Method // Instruments and Experiment Techniques. 2006. V.49(6). P.849-854. 369. Yashchenok A.M., Gorin D.A., Badylevich M., et al. Impact of magnetite nanoparticle incorporation on optical and electrical properties of nanocomposite LbL assemblies // Physical Chemistry Chemical Physics. 2010. V.12. P.10469-10475. 370. Andreeva D.V., Gorin D.A., Shchukin D.G., Sukhorukov G.B. Magnetic Microcapsules with Low Permeable Polypyrrole Skin Layer // Macromol. Rapid Commun. 2006. V.27. P.931-936. 371. Dincer I., Tozkoparan O., German S.V., Markin A.V., Yildirim O., Khomutov G.B., Gorin D.A., Venig S.B., Elerman Y. Effect of the Number of Iron Oxide 112 Nanoparticle Layers on the Magnetic Properties of Nanocomposite LbL Assemblies // J. Magnetism and Magnetic Materials. 2012. V. 324. P. 2958. 372. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. 373. Подосинников И.В., Нилова Л.Г., Бабиченко И.В. Метод определения хемотаксической активности лейкоцитов // Лабораторное дело. 1981. Т.8. C. 68. 374. Qiao R., Yang C., Gao M. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: from preparations to in vivo MRI applications // J. Mater. Chem. 2009. V.19. P.62746293. 375. Westbrook C., Roth C.K., Talbot J. MRI in Practice, Fourth Edition. UK: WileyBlackwell, 2011. P.372-395. 376. Плескова С.Н., Горшкова Е.Н., Михеева Э.Р., Шушунов А.Н. Исследование биосовместимости наночастиц с флюоресцентным центром Er/Yb в системе с нейтрофильными гранулоцитами // Цитология. 2011. Т.53. №5. С.444. 377. Аничков Н.М., Пальцев М.А. Патологическая анатомия в 2-х томах. М.: Издательство «Медицина», 2001. 378. Paterno L.G., Soler M.A.G., Fonseca F.J., et al. Magnetic Nanocomposites Fabricated via the Layer-by-Layer Approach // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2010. V.10. P.2679-2685. 379. Grigoriev D., Gorin D., Sukhorukov G.B., et al. Polyelectrolyte/magnetite Nanoparticle Multilayers: Preparation and Structure Characterization // Langmuir. 2007. V.23(24). P.12388–12396. 380. Santoyo-Salazar J., Castellanos-Roman M.A., Gomez L. B. Structural and magnetic domains characterization of magnetite nanoparticles // Materials Science and Engineering. 2007. V.27. P.1317-1320. 381. Kolesnikova T.A., Khlebtsov B.N., Shchukin D.G., et al. Atomic Force Microscopy Characterization of Ultrasound-Sensitive Nanocomposite Microcapsules// Nanotechnologies in Russia. 2008. V.3(9/10). P.554–563. 382. Dante S., Hou Z., Risbud S., et al. Nucleation of iron oxy-hydroxide nanoparticles by layer-by-layer polyionic assemblies // Langmuir. 1999. V.15. P.2176-2182. 383. Slavov L., Abrashev M.V., Merodiiska T., et al. Raman spectroscopy investigation of magnetite nanoparticles in ferrofluids // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2010. V.322. P.1904-1912. 384. Asmatulu R., Zalich M.A., Claus R.O., et al. Synthesis, characterization and targeting of biodegradable magnetic nanocomposite particles by external magnetic fields // Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 2005. V.292. P.108-119. 113 385. Woo K., Hong J., Choi S., et al. Easy synthesis and magnetic properties of iron oxide nanoparticles // Chemistry of Materials. 2004. V.16. P.2814-2818. doi: 10.1021/cm049552x 386. Kim T., Shima M. // Journal of Applied Physics. 2007. V.101(9). 09M516-109M516-3. 387. /http://rruff.info/SiliconS (RRUFF ID: R040145). 114 БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, профессору кафедры физики полупроводников СГУ, д.х.н., Горину Дмитрию Александровичу и доценту кафедры материаловедения, технологии и управления качеством СГУ, к.х.н., Иноземцевой Ольге Александровне за профессиональное руководство выполнением диссертационной работы, конструктивную критику и помощь в проведении экспериментов. Автор выражает глубокую признательность и благодарность коллективу кафедры физики полупроводников СГУ и, особенно, заведующему кафедрой, д.ф.-м.н., профессору Михайлову Александру Ивановичу за конструктивную критику и профессиональные консультации при подготовке диссертационной работы. Автор выражает глубокую признательность и благодарность профессору кафедры аналитической химии и химической экологии Института химии, д.х.н., Штыкову Сергею Николаевичу за конструктивную критику и профессиональные консультации при подготовке диссертационной работы. Автор выражает глубокую признательность и благодарность коллективу кафедры патологической анатомии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского, и, особенно, руководителю ЦКП НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии, к.б.н. Бучарской Алле Борисовне и ассистенту кафедры патологической анатомии Наволокину Никите Александровичу за проведение совместных исследований и помощь в интерпретации полученных результатов. Автор выражает глубокую признательность и благодарность ассистенту кафедры лучевой диагностики и лучевой терапии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского Зуеву Виктору Викторовичу за проведение МРТ исследований. Автор выражает глубокую признательность и благодарность коллективу лаборатории химии липидов Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, особенно, заведующей лабораторией, д.х.н. Водовозовой Елене Львовне и научному сотруднику, к.х.н. Онищенко Наталье Ростиславовне за синтез образцов липидов и липосом для проведения МРТ in vivo исследований. Автор выражает глубокую признательность и благодарность ведущему научному сотруднику лаборатории нанобиотехнологий Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, д.ф.-м.н., Хлебцову Борису Николаевичу за проведение просвечивающей электронной микроскопии образцов микрокапсул. 115 Автор выражает глубокую признательность и благодарность профессору кафедры оптики и биофотоники СГУ, д.ф.-м.н. Кочубею Вячеславу Ивановичу и доценту, профессору кафедры общей и неорганической химии СГУ, д.х.н. Горячевой Ирине Юрьевне за ценные замечания и конструктивную критику работы. Автор выражает глубокую признательность и благодарность коллективу лаборатории «Дистанционно управляемые системы для тераностики» Образовательно-научного института наноструктур и биосистем СГУ за всестороннюю помощь и поддержку.
