Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный
advertisement
![](http://s1.studylib.ru/store/data/002293345_1-c1bcf0da87762f4745277af8198db504-768x994.png "Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный")
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи РАУШ Екатерина Рудольфовна ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВНУТРИБОЛЬНИЧНОГО ИНВАЗИВНОГО КАНДИДОЗА 03.02.12 – микология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Васильева Наталья Всеволодовна Санкт-Петербург – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..5 ГЛАВА 1 Внутрибольничный инвазивный кандидоз - проблемы современной лабораторной диагностики (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)………………………...10 1.1 Краткая историческая справка……………………………………………...10 1.2 Грибы рода Candida –возбудители инвазивного кандидоза………….…..14 1.3 Современные подходы к видовой идентификации возбудителей инвазивного кандидоза……………………………………………………...21 1.4 Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам……………………………………………..31 1.5 Современные методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам………………………………………….….35 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………..43 2.1 Объекты исследования………………………………………………………43 2.2 Подготовка культур Candida spp. ……………………………………….…43 2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК – секвенирования………….44 2.4 Идентификация Candida spp. методом MALDI-TOF массспектрометрии………………………………………………………………..46 2.4.1 Изучение комплекса видов C. parapsilosis………………………….48 2.5 Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2……………………..49 2.6 Изучение морфологических особенностей возбудителей инвазивного кандидоз ……………………………………………………………………...49 2.7 Методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам in vitro …………………………...………………………………50 2.7.1 Метод микроразведений в жидкой питательной среде - CLSI M27A3……………………………………………………………………….51 2.7.2 Диско-диффузионный метод определения чувствительности - CLSI M44-А……...…………………………………………………………...54 3 2.7.3 Определение чувствительности с помощью микробиологического анализатора Vitek 2 Compact…………..……………………………...55 2.8 Статистическая обработка результатов……………………………………55 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3 Определение видового спектра клинических изолятов Candida spp…………………………………………………………………………………56 3.1 Источники выделения возбудителей инвазивного кандидоза……..……………………………………………………………….56 3.2 Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp. методами ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии ………………57 3.3 Сравнение результатов видовой идентификации штаммов Candida spp. методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и тест-системой AUXACOLOR 2………………………………………………………………59 3.4 Видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в течение 2012-2014 гг……………………………………………………….66 3.5 Географические особенности этиологии инвазивного кандидоза ……….69 3.6 Морфологические особенности возбудителей инвазивного кандидоза....71 3.7 Протеомное профилирование возбудителей инвазивного кандидоза……81 3.8 Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного кандидоза ……………………………………………………………………..83 ГЛАВА 4 Определение чувствительности клинических изолятов Candida spp. к противогрибковым препаратам…………………………………...…………..89 4.1 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M27-A3…………………………………..……..89 4.1.1 МПК противогрибковых препаратов для различных видов Candida spp…………………………………………………….………………...92 4.2 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M44-А……..........................................................99 4.3Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза с помощью анализатора Vitek2 Compact.................................102 4 ГЛАВА 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………..108 ВЫВОДЫ………………………………………………………………….……119 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………….121 ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ…………………………………..…122 СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ………………………………….....123 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………...124 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы Микромицеты рода Candida из состава нормальной микробиоты тела человека могут быть возбудителями внутрибольничного инвазивного кандидоза. Ежегодно в мире выявляют до 200000 пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом (ИК), из которых 100000 больных умирают [115]. Несмотря на то, что основными возбудителями ИК остаются C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, в последнее десятилетие отмечают нарастание доли C. не-albicans видов, в том числе редких [37, 41]. Известно, что лишь у 50 - 75% больных ИК удается выявить Candida spp. при посевах крови. Даже в случаях, когда удается выделить культуру Candida, большинство используемых в микробиологической лаборатории методов видовой идентификации дрожжей обеспечивают получение результата только через 2 суток и более. Кроме того, особую проблему составляет быстрая и надежная идентификация C. не-albicans видов [37]. В последние годы все чаще сообщают о появлении резистентных штаммов возбудителей ИК [39]. Однако, существует не только проблема устойчивости Candida spp. к противогрибковым препаратам, но и проблема выбора метода определения чувствительности клинически значимых дрожжей к антимикотикам. Несмотря на перспективность современных методов молекулярной биологии для точной видовой идентификации и быстрого выявления резистентности грибов к противогрибковым препаратам, использование этих методов в повседневной диагностической практике ограничено. Таким образом, быстрое установление этиологии ИК и определение чувствительности возбудителей к противогрибковым препаратам современными методами является актуальной проблемой. Степень разработанности темы В последние годы, благодаря внедрению современных методов, в том числе ДНК-секвенирования и технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии, 6 этиология ИК в ряде зарубежных стран постоянно уточняется [35]. В исследовании ИК в отделениях реанимации и интенсивной терапии, проводившемся в России ранее, использовали только морфологические и биохимические методы видовой идентификации возбудителей [9]. При этом до 10% штаммов Candida spp. не удавалось определить до вида. В период с 2003 по 2008 гг. в России в рамках многоцентрового глобального исследования ARTEMIS DISK была определена чувствительность возбудителей ИК к флуконазолу (78%) стандартизованным диско-диффузионным методом CLSI M44-A [15]. Однако отсутствуют сведения о чувствительности возбудителей ИК в РФ к антимикотическим препаратам, в том числе сравнительно нового поколения: вориконазолу, каспофунгину и позаконазолу, полученные референтными методами. Введение новых критериев интерпретации результатов определения чувствительности для основных возбудителей ИК, предложенных Европейским комитетом по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (EUCAST, 2012 г.) и Институтом по клиническим и лабораторным стандартам (CLSI, США, 2012 г.) обусловило необходимость проведения оценки различных методов определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам [40]. Цель исследования - изучить особенности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза для оптимизации лабораторной диагностики. Задачи исследования: 1. Определить видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в стационарах РФ с помощью современных методов идентификации. 2. Сравнить используемые методы видовой идентификации Candida spp. и выявить наиболее эффективные для применения в рутинной практике. 3. Определить чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к современным антимикотикам с помощью стандартизованных методов (CLSI 7 M27-A3, CLSI M44-A) и микробиологического анализатора (VITEK 2 Compact). 4. Сравнить используемые методы определения чувствительности Candida spp. к современным антимикотикам и выявить наиболее эффективный для применения в рутинной практике. 5. Разработать алгоритм лабораторной диагностики внутрибольничного инвазивного кандидоза. Научная новизна исследования Впервые: 1. Установлена этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ современными молекулярно-биологическими методами. Соотношение видов C. albicans и C. не-albicans видов составляет 1:1,3. Выявлены географические особенности этиологии инвазивного кандидоза в различных регионах России. 2. Определены профили чувствительности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в России референтным методом CLSI M27-A3 к следующим противогрибковым препаратам: флуконазолу, вориконазолу, каспофунгину, позаконазолу. 3. Установлены вориконазола, диапазоны МПК, каспофунгина, МПК50, МПК90 позаконазола для флуконазола, возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в России. 4. Определены масс-спектро-профили возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза, в том числе редких видов Candida; внутри вида C. parapsilosis выявлено 5 субкластеров. Теоретическая и практическая значимость работы Результаты диссертационного исследования вносят вклад в изучение глобальных тенденций в этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза и определение чувствительности возбудителей ИК к антимикотическим препаратам; они также важны для быстрой и точной идентификации патогенов - возбудителей внутрибольничного инвазивного канди- 8 доза. Собранная в результате исследования коллекция чувствительных и резистентных к противогрибковым препаратам изолятов Candida spp. от пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом депонирована в Российскую коллекцию патогенных грибов и служит основой для изучения молекулярных механизмов резистентности к азоловым препаратам. Разработан алгоритм лабораторной диагностики возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза с помощью современных методов. Методология и методы исследования Данная диссертационная работа - многоцентровое исследование. Объекты исследования – культуры Candida spp., выделенные от пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом. Для выполнения работы использовали микробиологические, физико-химические, молекулярно-генетические и статистические методы. Положения, выносимые на защиту: 1. Возбудители внутрибольничного инвазивного кандидоза в России представлены основными видами Candida spp. (96%): C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii и редкими (4%): C. lusitanie, C. dubliniensis, C. pararugosa, C. bracarensis, C. kefyr, C. lipolytica, C. utilis, C. inconspicua. 2. Распространенность C. albicans как основного возбудителя инвазивного кандидоза в России снизилась с 54% в 2012 г. до 32,8% в 2014 г. (р=0,015), C. parapsilosis - возросла с 9,8% (2012 г.) до 27,8% (2014 г., р=0,01), тогда как уровень C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei остается неизменным. 3. Чувствительность изолятов C. не-albicans видов к флуконазолу in vitro составила 58%, к вориконазолу - 95,7%. К каспофунгину все штаммы возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза были чувствительны. Степень достоверности и апробация результатов диссертационного исследования 9 Степень достоверности результатов, полученных при проведении исследования, подтверждается достаточным и репрезентативным объёмом выборки выполненных исследований, подтверждена адекватными методами статистической обработки данных. Методы математической обработки полученных результатов соответствуют поставленным задачам. Материалы диссертационного исследования представлены на конференциях и конгрессах: международных – 12-я конференция Американского общества микробиологов «Candida и кандидоз», США, 2014 г., европейских: 23-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Германия, 2013г.; 6-й конгресс «Тенденции в медицинской микологии», Дания, 2013г.; 24-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Испания, 2014 г., российских: Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.); отчетные сессии научных подразделений СЗГМУ им. И.И.Мечникова, (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.). По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в т. ч. 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК. Личный вклад диссертанта. Автор лично выполнил основные микробиологические исследования по теме диссертации, статистическую обработку, анализ полученных данных, обобщение и оформление результатов. Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, результатов работы, заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация содержит 25 таблиц и 42 рисунка. В работе использованы 30 отечественных и 154 иностранных источников литературы. 10 ГЛАВА 1 Проблемы современной лабораторной диагностики возбудителей инвазивного кандидоза (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1 Краткая историческая справка История грибов рода Candida и вызываемых ими заболеваний началась более двух тысячелетий назад. Еще греческий ученый Гиппократ (460 – 377 гг. до н.э.) изучал заболевание «молочница» или aphta alba, названное так изза белых округлых язв на слизистых оболочках полости рта. Однако идентификация возбудителя «молочницы» слизистых оболочек была проведена лишь в XIX веке [14]. В период с 1839 по 1844 годы трое европейских ученых: Fredrik Berg (г. Стокгольм), David Gruby (г. Париж), John Bennett (г. Эдинбург), независимо друг от друга, провели исследование кандидоза слизистой оболочки щек у детей. В 1841 году F. Berg в результате микроскопического выявления нитей гриба между эпителиальными клетками удалось обнаружить, что причиной афтозного поражения слизистых оболочек щек являются грибы, схожие с плесенями. В 1853 году французский биолог Charles Robin зарисовал и назвал гриб Oidium albicans (рисунок 1). 11 Рисунок 1 – Первые печатные иллюстрации Candida (Oidium) albicans: гриба молочницы (champignon du muguet) - эпителиальные фрагменты с круглыми клетками Oidium albicans и нитями псевдомицелия с бластоспорами (C. Robin, 1853 г.) [32]. В 1864 году немецкий ученый Burchardt опубликовал результаты экспериментального микроскопического изучения возбудителя молочницы 12 (рисунок 2). Он изучал развитие возбудителя в препаратах эпителия на предметных стеклах в течение 2 – 3 дней и обнаружил септирование, разветвление нитей с боковыми почками, некоторые нити росли с образованием почек на концах нитей. Эти нити были названы псевдогифами [153]. Рисунок 2 – Филаментирующий рост возбудителя молочницы (Burchardt, 1864 г.) [32]. В 1869 году французский педиатр Joseph Parrot при изучении молочницы пищевода, желудка, кишечника, гортани, трахеи и легких, возникших в результате грибкового поражения ротоглотки, впервые произвел гистологическое описание проникновения гриба в ткани. В 1877 году немецкий ученый Paul Grawitz, культивируя возбудителя молочницы, обнаружил, что в кислых условиях образовались не нити гриба, а дрожжеподобные клетки, и назвал их Mycoderma vini. Одновременно немецкий ученый Max Reess, исследуя биопсийный материал от больных, описал возбудителя молочницы как дрожжеподобный микромицет, но назвал его Saccharomyces albicans. Таким образом, P. Grawitz и M. Reess первыми выявили диморфизм, характерный для Candida albicans, т.е. способность образовывать и дрожжеподобные, и нитчатые формы [14, 32]. В 1890 году немецкий ботаник Wilhelm Zopf переименовал возбудителя в Monilia albicans, 13 а заболевание соответственно стало именоваться «монилиаз» вплоть до 1923 года, когда датский микробиолог Christine Berkhout предложила назвать род Candida и вид Candida albicans. Название Candida albicans было образовано от двух латинских слов: toga candida (тога, которую носили кандидаты древнеримского сената) и albicans - от латинского слова albicare – «отбеливать», что связано с внешним видом колоний на питательной среде. Хорошо известное сейчас название рода Candida было закреплено лишь в 1954 году на VIII Ботаническом конгрессе в Париже и используется до сих пор [11]. Количество видов грибов рода Candida постоянно увеличивается и в настоящее время составляет около 150 видов, а включая синонимы - почти 800. Большинство Candida spp. являются сапротрофами. Основными патогенами для человека являются около 20 видов [8]. В соответствии с классификацией патогенных грибов, сформулированной в 1996 году американским микологом K.J.Kwon-Chung [96], в основу которой положены способы размножения грибов, Candida spp. относят к классу Ascomycetes и дрожжевым грибам. Ранее Candida spp. относили к классу Fungi imperfecti (или Несовершенным грибам, для которых половая стадия не была выявлена). С развитием методов диагностики возбудителей кандидоза, включая молекулярно-генетические, у многих видов Candida выявлена способность размножаться половым путем (половая стадия – телеоморфа). Для тех видов Candida, у которых половая стадия до сих пор не обнаружена, но молекулярно-генетическими исследованиями, характером метаболизма подтверждено, что эти грибы являются аскомицетами, введено понятие аффинитета, то есть сродства, в данном случае, к классу Ascomycetes. Названия половой стадии и бесполой (анаморфы) Candida spp. различны. В последние годы благодаря использованию современных молекулярно – генетических методов значительно уточнены межвидовые отношения внутри рода Candida. Так, описаны три клады в роде Candida spp.: клада 1 – Candida albicans, включает C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis; клада 2 – 14 Clavispora – Metschnikowia, включает C. guilliermondii, C. lusitaniae, Debaryomyces hansenii; клада 3 – включает Saccharomycetaceae, Saccharomyces cerevisiae, C. glabrata, C. krusei [95]. Современная классификация грибов рода Candida выглядит следующим образом. Надцарство – Eukaryota Царство – Fungi Отдел – Ascomycota Подотдел - Saccharomycotina Класс – Hemiascomycetes Порядок – Saccharomycetales Семейство - Saccharomycetaceae Род – Candida Вид – Candida albicans и т.д. [29] 1.2 Грибы рода Candida - возбудители инвазивного кандидоза Инвазивный кандидоз – инфекция, вызванная грибами Candida spp., как правило, внутрибольничная, возникающая при наличии следующих факторов риска: долгое пребывание в отделении реанимации и интенсивной терапии, сахарный диабет, хирургические манипуляции, парентеральное питание, трансплантация органов и тканей, применение центрального венозного катетера, антибиотиков широкого спектра действия, а также иммуносупрессивной терапии и системы гемодиализа [4]. Грибы рода Candida являются важными представителями нормальной микробиоты человека. Чаще всего Candida spp. можно обнаружить в желудочно-кишечном тракте, на слизистых оболочках ротовой полости и половых органов, коже. Также они широко распространены во внешней среде (растения, почва, продукты питания) [29,69]. 15 Дрожжи Candida spp. имеют общие характеристики: это одноклеточные микроорганизмы; образуют псевдомицелий (кроме C. glabrata и C. inconspicua); размножаются почкованием; размеры клеток в пределах 1,5 – 15 мкм; являются факультативными анаэробами, большинство видов растут при температуре 370С [95]. В соответствии принятыми в с России, санитарно-эпидемиологическими «СП Безопасность 1.3.2322-08. правилами, работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» [13], Candida spp. относят к III и IV группам патогенности, т.е. к условно-патогенным организмам, вызывающим оппортунистические системные микозы при понижении иммунного статуса человека (III группа) или являющимися возбудителями поверхностных микозов (IV группа). В соответствии с зарубежной классификацией по уровням биологического риска (BioSafety Level, BSL), принятой Всемирной Организацией Здравоохранения [98], Candida spp. относят к BSL-1 и BSL-2 возбудителям низкого уровня риска, так как они вызывают глубокие микозы на фоне иммунодефицита, критического состояния (BSL-1) или среднего уровня риска (BSL-2) [11]. К основным возбудителям инвазивного кандидоза (ИК) человека относят виды: C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis. Реже встречаются: C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. rugosa, C. inconspicua. Редкими возбудителями ИК являются C. kefyr, C. utilis, C. lipolytica, C. dubliniensis. Самым частым возбудителем кандидоза, в том числе инвазивного, является вид C. albicans, который входит в состав нормальной микробиоты тела человека, колонизируя слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта. Поэтому ИК обычно возникает в результате эндогенной диссеминации, реже – экзогенным путем. C. albicans растет при температуре 370С и 450С. При посеве на «голодные» среды (рисовый агар, голодный щелочной агар) образует терминальные хламидоспоры. При инкубировании 16 культуры C. albicans с сывороткой крови образуются «ростковые трубки» – короткие нити истинного мицелия. Аскоспор не образует [95]. C. parapsilosis обычно является экзогенным патогеном, обитает на коже человека. Этот вид распространен в окружающей среде больниц, на поверхностях катетеров и другом медицинском оборудовании. Образует псевдомицелий. В 2005 г. были описаны два новых вида, которые сформировали так называемый C. parapsilosis комплекс: собственно C. parapsilosis, C. orthopsilosis и C. metapsilosis. Два последних вида часто проявляют способность к формированию биопленок на биомедицинских устройствах, их идентификация возможна с помощью молекулярногенетических методов, а также MALDI-TOF масс-спектрометрии [29, 39, 68]. C. glabrata может входить в состав нормальной микробиоты тела человека. Псевдомицелий не образует. Ассимилирует глюкозу и трегалозу. Важной особенностью C. glabrata является ее способность замещать вид C. albicans на фоне лечения инфекции, вызванной этим видом. В 2005 году с помощью ДНК-секвенирования выявлен «криптический» вид, т.е. вид не отличающийся по морфологическим и биохимическим свойствам – C. nivariensis, который является более устойчивым к азоловым противогрибковым препаратам, чем C. glabrata [121], а в 2008 описан вид C. bracarensis [29, 34]. C. krusei (телеоморфа Pichia kudriavtsevii, прежнее название Issatchenkia orientalis) входит в состав микробиоты желудочно-кишечного тракта человека, однако может встречатся в почве и воде. Вид имеет способность к ассимиляции и ферментации глюкозы [29]. C. tropicalis входит в состав нормальной микробиоты человека. Образует псевдомицелий. Вызывает более тяжелые инфекции у онкогематологических больных, чем C. albicans [29, 94]. C. lusitaniae (телеоморфа Clavispora lusitaniae) может входить в состав нормальной микробиоты человека в качестве сапроба, однако может 17 вызывать ИК у пациентов с онкологическими заболеваниями крови и после трансплантации стволовых клеток [29]. C. guilliermondii (телеоморфа Pichia guilliermondii) входит в состав нормальной микробиоты человека, в частности, кожи и слизистых. Часто встречается как возбудитель ИК у онкологических пациентов. По биохимическим свойствам вид похож на C. famata, однако в отличие от C. famata образует псевдомицелий [29, 36]. C. rugosa может быть возбудителем ИК у пациентов ожоговых отделений. С 2006 года, после проведения молекулярно-генетической идентификации вида C. rugosa, стало известно, что данный вид образует комплекс, куда входят, кроме собственно C. rugosa, также C. mesorugosa, C. neorugosa, C. pseudorugosa. Близкородственным видом является и C. pararugosa, который отличается от C. rugosa по ряду биохимических свойств (усвоение L-сорбозы и L-арабинозы, отсутствие ассимиляции глицерина). Идентификация видов возможна также с помощью молекулярно- генетических методов, а также MALDI-TOF масс-спектрометрии [112]. C. inconspicua (телеоморфа Pichia cactophila) растет на агаре Сабуро при 370С и 420С. Не образует псевдомицелия. Вариабельно ферментирует глюкозу, по биохимическим свойствам похожа на C. glabrata [89]. C. kefyr (телеоморфа Kluyveromyces marxianus) является возбудителем ИК в основном у онкогематологических больных [29, 95]. C. utilis (телеоморфа Pichia jadinii) первоначально применяли в пищевой индустрии, однако в 1988 г. был описан первый случай возникновения ИК у пациента со СПИД после установления катетера [29]. C. lipolytica (телеоморфа Yarrowia lipolytica) является обитателем окружающей среды. Первое сообщение об этом виде как возбудителе ИК появилось в 1985 г., заболевание было связано с внутрисосудистой катетеризацией. Гриб не ферментирует сахара, ассимилирует только глюкозу. Вызывает заболевание у иммунодефицитных пациентов [29]. 18 Вид C. dubliniensis по фенотипическим свойствам близок с C. albicans, образует ростковые трубки в сыворотке крови при температуре 370С, хламидоспоры на «голодных средах». Впервые описан в 1995 году как возбудитель орофарингеального кандидоза у больных СПИД. Является менее патогенным видом, чем C. albicans. Хотя в последнее время отмечают тенденцию к увеличению количества штаммов C. dubliniensis, устойчивых к азолам in vitro, клиническая устойчивость встречается редко. Отличается от C. albicans по максимальной температуре роста: C. albicans растет при температуре 450С, C. dubliniensis – не растет. Отличить два этих вида надежно можно молекулярно-генетическими методами [29,118]. Из вышеперечисленных представителей рода Candida вид C. albicans является основным возбудителем ИК [128]. Однако, в последние годы отмечают снижение встречаемости этого вида как возбудителя ИК и увеличение доли C. не-albicans видов. Второе место по распрострененности, в зависимости от географического положения региона, профиля стацонара и других факторов, занимают C. parapsilosis и C. glabrata [37]. Замечено, что C. glabrata часто выделяют у пациентов старшего возраста [162]. В исследовании (Аргентина, 2007-2008 гг.) доля C. albicans составила 38,4%, среди C. не-albicans видов - C. parapsilosis (26,4%) и C. tropicalis (15,4%) [99]. В рамках исследования, проведенного в Ломбардии (Италия), выявлено, что с 1999 г. по 2009 г. доля C. glabrata возросла с 12,8% до 20,3% [16]. При исследовании возбудителей ИК, выделенных из двух университетов Айовы (США), обнаружено, что в период с 2004 по 2007 гг. доля C. albicans составила 47%, C. glabrata – 29%, C. parapsilosis – 12%, C. tropicalis – 6% [155]. Также в последние годы регистрируют возрастание доли редких видов с природно сниженной чувствительностью к одному или нескольким противогрибковым препаратам азолового ряда: С. cifferrii, C. guilliermondii, C. inconspicua, C. humicola, C. lambica, C. lipolytica, C. norvegensis, C. palmioleophila, C. rugosa и С. valida, а также двух видов со сниженной 19 чувствительностью к эхинокандинам: С. fermentati и С. guilliermondii [77]. В исследовании, проведенном ранее (ARTEMIS DISK, 2005–2007 г.), доля редких видов составляла около 4%; в исследовании, проведенном в те же годы в Германии – 4,7%, а в рамках программы исследования CANDIPOP (39 госпиталей Испании) доля редких видов составляла уже более 6% [76, 131, 143]. Глобальные исследования эпидемиологии инвазивного кандидоза начали проводить в 90-х годах ХХ века. Так, в исследовании ARTEMIS DISK, которое проводили при участии 39 стран мира, в период 1997-2003 гг. была отмечена тенденция к снижению уровня C. albicans с 73,3% (1997 г.) до 62,3% (2003 г.), доля C. не-albicans также постепенно возрастала. При этом уровень C. glabrata вырос с 9,7% до 12%, доля C. tropicalis - c 4.6% до 7,5%, C. parapsilosis - с 4,2% до 7,3%, C. krusei – с 1,7% до 2,7%. Таким образом, доля C. не-albicans за 6 лет увеличилась с 26,7% до 37,7% [135]. По данным глобального исследования SENTRY, проведенного в 79 странах, в 2003 г. обнаружили, что видовой спектр возбудителей ИК в мире представлен C. albicans (48,7%), на втором месте C. glabrata и C. parapsilosis (по 17,3%), далее - C. tropicalis (10,9%). В аналогичном исследовании SENTRY в период с 2008 по 2009 гг. выявили незначительные изменения видового спектра среди штаммов C. не-albicans; так доля C. glabrata возросла до 18,2% и снизилась доля C. tropicalis – 10,6%. Наибольший процент C. albicans был определен в странах Азиатско-Тихоокеанского региона – 56,9, на втором месте были C. glabrata и C. parapsilosis - 13,7%, далее C. tropicalis – 11,7%. В европейских странах также преобладал вид C. albicans – 55,2%, далее - C. glabrata – 15,7% и C. parapsilosis – 13,7%. Однако, в странах Латинской Америки доля C. albicans была менее 50% (43,6%), штаммы C. parapsilosis составляли 25,6%, на третьем месте по встречаемости был вид C. tropicalis – 17,0% [163]. В национальных исследования видового спектра возбудителей ИК в США отмечено, что уже в период с 1995 по 1998 гг. наблюдали снижение 20 доли C. albicans как возбудителя ИК до 46%, а с 2008 года – до 38% с сохранением этого уровня до 2012 г. [51]. По данным других национальных исследований, в частности проведенных на территории Северной и Латинской Америки с 2001 по 2004 гг., доля C. albicans составляла 50 – 51 %, а с 2004 – 2008 гг. обнаружили снижение до 46% [66]. В Испании снижение уровня C. albicans (45,4%) было отмечено только с 2013 г. [65], тогда как в Греции такой же уровень наблюдали уже в период с 2005 по 2009 гг. В странах Азиатско-Тихоокеанского региона и Африке доля штаммов C. albicans составила от 35,6% в Тайланде до 45,9% в Южной Африке. Стоит заметить, что в странах Скандинавского региона, таких как Дания, Исландия, Финляндия, Швеция, с 2000 г. и до настоящего времени не выявлено уменьшение доли C. albicans среди возбудителей ИК - ниже 50%; в среднем доля C. albicans в этих странах находится в пределах 52,1-70 %, в Германии – 58,5% [41, 99,163]. Среди C. не-albicans видов в Северной Америке, в частности США, в Дании, Исландии, Финляндии, Швеции, Швейцарии, Германии, Великобритании в основном преобладали штаммы C. glabrata (16 – 29%), вид характеризующийся умеренной чувствительностью к противогрибковому препарату – флуконазолу. C. parapsilosis занимала второе место как возбудитель ИК в странах Средиземноморья: Греции (2005-2009 гг.) – 22,7 %, Испании – 24,9% (по настоящее время), Италии – 36,9%, Тайланде – 27,1%, Южной Африке – 25%, Китае – 23,8%. В Израиле, Латинской Америке, в Турции на втором месте по встречаемости находилась C. tropicalis 17-24,1% [64, 116]. В исследовании FUNGEMYCA (Испания, 2009-2011гг.) было выявлено, что среди возбудителей ИК доля C. albicans составила 44,6%, C. parapsilosis – 26,5%, C. glabrata - 11,4%, C. tropicalis – 8,2%, C. krusei – 1,96%, C.dubliniensis – 0,29% [160]. В многоцентровом исследовании этиологии ИК, проведенном во Франции (2007 – 2013гг.), установлено, что доля C. albicans составила 67,4%, 21 среди C. не-albicans второе место занимала C. glabrata - 15,3%, далее C. parapsilosis – 8,5%, C. tropicalis – 8,0%, C. krusei – 3,4% [26]. Таким образом, можно заключить, что этиология ИК в различных географических регионах не однородна. В последние десятилетия в большинстве стран мира наблюдается изменение видового спектра возбудителей ИК с увеличением распространенности C. не-albicans видов. 1.3 Современные подходы к видовой идентификации возбудителей инвазивного кандидоза Подтверждение диагноза ИК в России базируется на следующих критериях диагностики: получение роста Candida spp. при посеве крови и других в норме стерильных биосубстратов, биопсийного материала от пациента с клиническими признаками инфекции, а также при обнаружении Candida spp. при гистологическом исследовании глубоких тканей. Для получения культуры возбудителя ИК забор крови производят у пациентов с температурой более 380С или другими признаками генерализованной вопалительной реакции 2 раза в день в течение не менее 3 дней, серологические тесты не рекомендованы. Посев производят на жидкие питательные среды (бульон Сабуро, сусло) [4]. В соответствии с Европейскими рекомендациями по диагностике кандидоза (2012г.), забор крови производится ежедневно трехкратно из каждой локтевой вены с интервалом 30 минут, посев осуществляют во флаконы систем BacT/ALERT и других (для аэробных и анаэробных культур) с инкубацией не менее 5 суток [63], что позволяет определить наличие или отсутствие Candida spp. в крови [37]. Другие стерильные в норме биоматериалы засевают также на плотные питательные среды. Для этого в большинстве лабораторий используют агар Сабуро, сусло – агар. Применение хромогенных сред – питательных сред с субстратом, который, взаимодействуя с ферментами различных видов Candida, окрашивают их колонии в определенные цвета (CHROMAgar 22 Candida, BD Diagnostic) [136], помогает выявить разные виды Candida в смешанной культуре, однако точно идентифицировать вид Candida не позволяет [5, 21]. При выделении культуры микромицета для видовой идентификации в настоящее время в практике используют различные коммерческие методы, например тест-системы Remel BactiCard Candida Kit (Thermo Scientific™, США). При чувствительности и специфичности данной тест-системы – 98,7 % и 99,6% соответственно, за 5 минут данный тест позволяет дифференцировать вид C. albicans от других видов Candida [54]. Тест на образование «ростковых» трубок также позволяет отличить C. albicans, C. dubliniensis, образующих ростковые трубки в сыворотке крови, от других видов. Таким образом, заметим, что данных методов идентификации вида недостаточно, поскольку они расчитаны в основном на дифференцировку C. albicans от C. не-albicans видов. Более предпочтительны методы видовой идентификации, ориентированные на определение биохимических свойств, молекулярно-генетических особенностей и белкового масс-спектра профиля микромицета (рисунок 3). 23 Второе поколение Третье поколение Биохимическое направление (автоматические анализаторы ) Молекулярногенетическое направление (ДНК-секвенирование) Идентификация грибов Первое поколение Четвертое поколение Биохимическое направление (ручные тест-системы) Физико-химическое направление (MALDI-TOF массспектрометрия) Рисунок 3 – Развитие методов видовой идентификации грибов рода Candida spp. Методы видовой идентификации, основанные на изучении молекулярно-генетических особенностей, стали применяться сравнительно недавно, а протеомные технологии – начиная с 2000-х годов [60]. Одним из давно разработанных методов идентификации является определение видов Candida по биохимическим свойствам микромицета. Для определения ферментации углеводов раньше использовали жидкие питательные среды с углеводами, реактивом Андреде и стеклянными поплавками. Ассимиляцию углеводов проводили методом дисков, т.е. 24 использовали бумажные диски с нанесенными на них растворами углеводов [14]. За последние десятилетия появились промышленно приготовленные тест – системы как для ручной постановки теста, так и для автоматической. К числу «ручных» тест-систем относятся RapID Yeast Plus (Remel), API ID32C, AUXACOLOR2 (BioRad) и другие. Подобные тест-системы просты в использовании и обладают высоким процентом сопоставимости результатов с референтными молекулярно-биологическими методами. Так, в сравнительном исследовании трех биохимических тест-систем (Candifast, API 20C AUX, Fungichrom) с использованием 116 клинических изолятов, процент правильной идентификации составил 82,7 – 95,6, время определения видов составило от 24 до 48 часов [81]. Среди автоматических анализаторов наиболее часто используют Vitek2 Compact (bioMerieux) с картами VITEK2 YST, с их помощью в исследовании проведенном в Италии верно идентифицировали 98,2% из 750 клинических изолятов дрожжей, предварительно прошедших ДНК-секвенирование [76]. Также автоматическими анализаторами являются MicroScan plus WalkAway (Siemens), Phoenix (Becton Dickinson). Выявлено, что совпадение между результатами идентификации MicroScan plus WalkAway и VITEK2 YST составляет 94% [140]. При простой пробоподготовке и высокой сопоставимости результатов с результатами референтного метода (ДНКсеквенирование), длительность инкубации составляет до 18 часов, для анализатора MicroScan plus WalkAway – 4 часа. Во многих странах проводили сравнительные исследования эффективности биохимических методов идентификации. Так, сравнение тестсистем API ID32C, AUXACOLOR2 и Vitek2 Compact в рамках исследования в отделениях реанимации и интенсивной терапии в Греции в период с 2005 по 2010 гг. выявило, что из 253 изолятов с помощью Vitek2 Compact верно идентифицировано 84%, API ID32C – 83%, AUXACOLOR2 – 80%. Так, среди наиболее часто встречающихся видов, таких как C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis процент верно идентифицированных штаммов был выше (AUXACOLOR2 – 94,5%, API ID32C – 94%, Vitek2 Compact – 91%), чем в 25 отношении редких видов (AUXACOLOR2 -74%, API ID32C – 75%, Vitek2 Compact – 82%) [87]. С помощью трех систем точно идентифицировали более 91% часто встречающихся изолятов, и эти системы могут быть применены в рутинной практике; для редких видов рекомендовано применение молекулярно-генетических методов. В исследовании, проведенном в Бразилии, при сравнении результатов Vitek2 Compact и API ID20C AUX было обнаружено, что совпадение составляет 93,6 % [158]. Таким образом, основным недостатком методов видовой идентификации возбудителей ВБИК по биохимическим свойствам является длительность идентификации (18 – 48 часов), а также невысокий процент правильной идентификации редких видов. Молекулярно-генетические методы направлены на определение количественных и качественных характеристик первичной структуры ДНК. В настоящее время разработаны и широко применяются различные методы молекулярной генетики общим числом около ста. Основу подавляющего большинства таких методов составляет полимеразная цепная реакиця (ПЦР). Перечень наиболее часто используемых методов приведен в таблице 1[1]. Таблица 1 – Наиболее распространенные молекулярно-генетические методы № п/п Молекулярно-генетические методы 1 Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP) 2 Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFPL) 3 Расщепление резолвазой (EMD) 4 Методы, основанные на лигазной реакции (LDL, LCR, Radlock) 5 Инвазивное расщепление олигонуклеотидов (расщепление Clevase I) 6 Случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD, AP-PCR) 7 ПЦР с прямой терминацией синтеза (DT-PCR) 8 Анализ конформации одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) 9 Гетеродуплексный анализ 10 Секвенирование ДНК 11 Минисеквенирование 12 Аллель-специфическая ПЦР 13 Масс-спектрометрия 14 ПЦР в реальном времени 15 Микрочипы 26 В зависимости от целей исследования все молекулярно-генетические методы можно подразделить на две группы: методы, направленные на определение структуры ДНК (видовая идентификация, поиск новых мутаций), и на анализ известных генетических последовательностей (полиморфных вариантов генов или идентификация микроорганизмов по референтной идентификации генетических последовательности ДНК). Исторически первым последовательностей стал методом метод блот-гибридизации (Саузерн-блот), предложенный еще в 1975 году английским ученым Эдвардом Саузерном. С открытием термостабильной полимеразы, в практику молекулярных генетиков вошел метод ПЦР, произведший переворот в генетических исследованиях. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка нуклеиновой кислоты ДНК с помощью ферментов in vitro. Копирование происходит только того участка, что удовлетворяет заданным условиям и если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликация), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. Метод ПЦР лежит в основе всех методов, применяемых для диагностики и идентификации микромицетов в клинической практике [1]. В настоящее время референтным методом определения видовой принадлежности микромицетов является протокол M18-А Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), по которому идентификацию грибов необходимо проводить с применением ПЦР, с последующим секвенированием генов мишеней, которые имеют достаточно разнородный нуклеотидный состав, с высокой межвидовой дивергенцией. Идентификация устанавливается путем выравнивания анализируемой нуклеотидной последовательности с последовательностями, представленными в GenBank или в других базах данных генетической информации. Общие положения данного подхода для молекулярной биологии предложены Д. Сэмбруком и Д. Расселом в 2001 году (Sambrook & Russell) [141]. 27 GenBank является базой данных всех аннотированных нуклеотидных (ДНК и РНК) и аминокислотных последовательностей, которые они кодируют, представленных в свободном доступе для исследователей всего мира. Эту базу библиотека данных медицины поддерживает Национального Американская центра Национальная биотехнологической информации (NCBI). GenBank коллаборирует с другими информационными банками, такими как Европейская молекулярно-биологическая лаборатория (EMBL) и Банк данных ДНК Японии (DDBJ), осуществляют регулярный обмен данными между этими тремя архивами аннотированных нуклеотидных последовательностей [141]. Для видовой идентификации микромицетов выбран комплекс рибосомальных генов (рисунок 4), содержащих высоко консервативные домены, перемежающиеся с более вариабельными областями, которые содержат видоспецифические «подписи». Для упрощения субъединицы этого комплекса называют рДНК, подразумевая, что это гены, кодирующие рРНК молекулы. 5’ Малая субъединица 18S РНК ITS1 5.8S РНК ITS2 Большая субъединица 25-28S РНК IGS1 5S РНК IGS2 3’ Рисунок 4 – Организация рРНК генов микромицетов Внутри рДНК комплекса существует совокупность множества тандемных повторов нуклеотидов, находящихся по направлению от 5` к 3` концу между субъединицами 18S и 5.8S, а также 5.8S и 28S, называющихся вариабельными внутренними транскрибируемыми спейсерами (ITS), соответственно 1 и 2. Фланкируют ген большой рибосомальной субъединицы 28S два вариабельных нетранскрибируемых спейсер региона: IGS1-5S-IGS2. У Saccharomyces cerevisiae существует приблизительно 140 единиц повторов. У предшественника транскрипта РНК происходит ферментативное удаление ITS регионов, и, после дальнейших модификаций, формируются 18S, 5.8S и 28S зрелые рРНК, которые в комбинации с белками формируют 28 функциональные рибосомы. Биологическая роль ITS регионов - участие в ранней транскрипции РНК процессинга. Таким образом, они являются некодирующими регионами генома [141]. ITS1 и ITS2 регионы, фланкирующие 5.8S рДНК ген, показывают значимую нуклеотидную дивергенцию. Каждый ITS регион около 300 пар нуклеотидов в длину. Они очень хорошо подходят для видовой идентификации как дрожжей, так и нитчатых грибов (таблица 2) [90]. Тринадцать известных патогенов, включая потенциально инвазивные виды Aspergillus, можно идентифицировать путем сравнительного анализа их ITS1 и ITS2 последовательностей. При использовании двух спейсерных регионов достигается лучшая межвидовая дифференциация, чем при использовании одного региона. Таблица 2 – Видовая идентификация путем прямого анализа региона внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) рДНК [90]. Wangiella (Exophiala) dermatitidis Epidermophyton floccosum ITS1 Microsoporum (4 вида) Trichophyton (6 видов) Malassezia (6 видов) C. albicans, C. parapsilosis, 13 других видов Candida ITS2 Cryptococcus (5 видов) Rhodotorula Aspergillus (13 видов) (Hinrikson et al., 2005) Cryptococcus neoformans ITS1 и ITS2 Fonsecaea compacta, F.pedrosol Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis Pseudallescheria boydii Также для видовой идентификации дрожжей используют вариабельный регион (первые, приблизительно 600 пар нуклеотидов) большой 29 субъединицы РНК 28S (иногда в литературе описывается, как 26S), названный D1/D2 субрегионом, тогда как остальная последовательность 28S высоко консервативна [95]. Последовательности D1/D2 всех видов дрожжей аскомицетов и базидиомицетов известны и представлены в GenBank. Большинство видов дрожжей может быть идентифицировано по их различиям в нуклеотидной последовательности D1/D2 домена. Для восьми видов Candida spp. разработан метод быстрой диагностики с использованием микросфер, с нанесенными нуклеотидными последовательностями D1/D2, для проточной цитометрии [145]. Метод ДНК-секвенирования не зря признан «золотым стандартом» для видовой идентификации микромицетов. По современным данным, видовая идентификация по ITS региону клинических изолятов дрожжей (включая виды Candida) в 99,7% случаев корректна, даже для редких видов [35]. По нашим данным, согласие между результатами молекулярно-генетической и классической фенотипической идентификаций варьирует между исследованиями довольно значительно, в пользу ДНК секвенирования [4]. В настоящее время ДНК-секвенирование используют не только для определения вида внутри рода, но и для типирования внутри вида. Подобное внутривидовое типирование позволяет осуществить подход мультилокусного сиквенс-типирования (MLST), который позволяет изучать, как историческое развитие геномной наследственные последовательности, характеристики так (различные и приобретенные перестройки генома, приводящие к различным фенотипическим вариантам как приобретение резистентных свойств к антимикотической терапии). В исследовании Якобсена и соавторов [80] был проведен анализ изолятов C. albicans MLST, охватывающий семь регионов различных генов. Показано, что между различными сиквенс-типами существует значимая корреляция с географическим нахождением. Данные исследования позволяют определять схемы миграции клинически эпидемиологические вспышки. важных штаммов, и предсказывать 30 Одним из новых быстрых методов видовой идентификации грибов является технология масс-спектрометрии MALDI-TOF (матрично- ассоциированная лазерная десорбция/ ионизация время-пролетная массспектрометрия, от англ. MALDI-TOF MS – Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time-of-Flight Mass-spectrometry) – метод видовой идентификации микроорганизмов, основанный на анализе их белкового массспектро-профиля [132]. Технология MALDI-TOF масс-спектрометрии была разработана еще в середине 80-х годов учеными К. Танака, Ф. Гилленкампом, М. Карасом и использовалась высокомолекулярных для соединений, изучения в том строения числе различных биологического происхождения [102]. Лишь в начале XXI века метод впервые был применен для видовой идентификации патогенных грибов [101], несколько позже для Candida spp. [102]. В 2008 – 2009 гг. в Германии было проведено сравнительное исследование результатов видовой идентификации Candida spp., полученных методами AUXACOLOR2 и MALDI-TOF масс-спектрометрии, в сравнении с референтным методом молекулярно-генетическим MALDI-TOF масс – методом. спектрометрии Обнаружено, правильно что было идентифицировано 97,6%, а методом AUXACOLOR2 – 96,9% [138]. При этом AUXACOLOR2 не смог выявить виды, входящие в комплекс C. parapsilosis, а изолят C. bracarensis был определен как C. glabrata. В 2012 году в Италии было проведено исследование по оценке возможности с помощью метода MALDI-TOF масс-спектрометрии определять Candida spp. непосредственно в положительных посевах образцов крови (BC Bactec Mycosis, Becton Dickinson, BD). Полученные данные сопоставляли с результатами видовой идентификации культур Candida из крови, выделенных на плотных питательных средах. Обнаружено, что C. albicans в посевах крови непосредственно в жидкой среде определена в 95,9% образцов, C. не-albicans виды – в 86,5%. Среднее время проведения 31 анализа составило 30 минут при низких затратах на расходные материалы [56]. Следовательно, MALDI-TOF масс-спектрометрия является методом быстрой и точной идентификации с низкой себестоимостью. Однако, возможны затруднения в идентификации видов, если их масс-спектры отсутствуют или единичные в базе данных масс-спектрометра. Чувствительность микромицета к противогрибковым препаратам тесно связана с его видовой принадлежностью, в связи с чем необходим постоянный мониторинг и видового спектра и чувствительности к противогрибковым препаратам, в том числе нового поколения. 1.4 Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам Первые данные о появление устойчивости возбудителей ИК к группе азоловых противогрибковых препаратов появились еще в 90-х годах у больных СПИД с сопутствующим инвазивным кандидозом [105]. Оксман и соавторы в исследовании ИК в двух многопрофильных центрах в США обнаружили, что 19% Candida spp. были устойчивы к флуконазолу, причем каждый третий штамм имел приобретенную устойчивость [44]. Отмечают, что C. albicans является преимущественно чувствительным видом к антимикотикам, однако описаны механизмы устойчивости к флуконазолу с потенциальной перекрестной устойчивостью к противогрибковым препаратам азоловой группы. В исследовании ARTEMIS DISK (1997–2007 гг.) выявлено, что устойчивость штаммов C. albicans к флуконазолу с 2001 по 2007 гг. составляла в среднем от 1,0% – 1,6%. В исследовании бразильских ученых среди 212 изолятов Candida spp. уровень устойчивых к флуконазолу C. albicans составлял 7,1%, тогда как у C. glabrata - 14.9%, C. tropicalis - 18,4% [143]. В исследовании, проведенном в СанАнтонио (США), среди устойчивых к флуконазолу C. albicans была обнаружена также устойчивость к каспофунгину – 8,1%. Также обнаружена 32 тенденция, что значительно больше изолятов имею устойчивость к каспофинугину и вориконазолу, если у них наблюдается устойчивость к флуконазолу [51]. Известно, что в последнее время наблюдается смещение видового спектра возбудителей ИК от хорошо чувствительной С. albicans к малочувствительным к азолам изолятам C. не-albicans [133]. Так, у вида C. parapsilosis, который наряду с C. glabrata часто встречаются как возбудители ИК, стали обнаруживать сниженную чувствительность к препаратам азоловой группы и к эхинокандинам. Сообщают о высоком уровне устойчивости к флуконазолу, который стал встречаться намного чаще у C. parapsilosis (6,8%) и C. tropicalis (9,0%), чем у C. albicans (2,0%) и C. dubliniensis (3,9%) [58]. Ранее в исследовании SENTRY сообщали, что 99% штаммов Candida spp. были чувствительны к каспофунгину, однако в последние годы обнаружено, что в связи с частым использованием эхинокандинов возрос уровень ИК, вызванного C. parapsilosis [110]. В исследовании, проведенном в странах Африки и Ближнего Востока, было обнаружено, что доля штаммов со сниженной чувствительностью к флуконазолу составляет 20%, а к вориконазолу – 14% [156]. В исследовании ARTEMIS DISK (2001 – 2007 гг.) выявлено, что устойчивость к флуконазолу у штаммов C. parapsilosis составляла 3,6%, а к вориконазолу – 1,8%. C. glabrata обладала устойчивостью к флуконазолу в 15,7% случаев, к вориконазолу – 10% [36]. Также было отмечено, что среди редких видов, таких как C. lusitaniae, устойчивость к флуконазолу составила 5,4%, а к вориконазолу – 2,0%, у C. rugosa – 41,8% и 21,2%, соответственно. C. inconspicua была устойчива к флуконазолу в 53,2% случаев, к вориконазолу – 3,9%. Среди штаммов C. utilis к обоим противогрибковым препаратам устойчивости не наблюдали [66]. У штаммов комплекса C. glabrata (C. nivariensis, C. bracarensis) чувствительность к антимикотикам различна. У C. glabrata вероятно развитие множественной устойчивости к противогрибковым препаратам 33 [131]. По данным ARTEMIS DISK, доля штаммов C. glabrata, устойчивых к флуконазолу была от 6% до 30%. В глобальном исследовании SENTRY (2008 – 2009 гг.) обнаружили, что устойчивость C. glabrata к вориконазолу составила 11,1%, а к эхинокандинам – 16,7%, тогда как среди изолятов C. tropicalis обнаружено лишь 1,9% устойчивых к флуконазолу штаммов и 1,3% – к вориконазолу. В исследовании Oxman et al. также было выявлено 13% устойчивых к флуконазолу штаммов C. glabrata с перекрестной устойчивостью к эхинокандинам [44]. В настоящее время данный вид является умеренно-чувствительным к флуконазолу. В исследовании 137 штаммов C. glabrata, было выделено 3 изолята C. bracarensis, один из которых был устойчив к противогрибковым препаратам [29, 34]. C. krusei является природно устойчивым видом к флуконазолу, чувствительны из них к вориконазолу – 83% штаммов; к эхинокандинам, в частности к каспофунгину, изоляты как правило чувствительны. У штаммов C. lusitaniae отмечено быстрое развитие вторичной устойчивости к амфотерицину В [29, 94]. По данным исследования ARTEMIS DISK отмечено, что у C. guilliermondii снижается чувствительность к флуконазолу, эхинокандинам и амфотерицину В [29, 36]. У редкого вида C. rugosa зарубежными учеными обнаружена тенденция к снижению чувствительности к флуконазолу, эхинокандинам и амфотерицину В [113]. Вид C. inconspicua является чувствительным к каспофунгину, тогда как к азоловым антимикотикам чувствительность снижена. В исследовании ARTEMIS DISK доля устойчивых к флуконазолу составила изолятов C. inconspicua 53,2%, к вориконазолу – 3,9% [89]. Большинство штаммов C. kefyr являются чувствительными к противогрибковым препаратам, однако выявляют случаи устойчивости к каспофунгину [26, 29, 137]. В последнее время наравне с увеличением встречаемости C. dubliniensis возрастает и устойчивость этого вида к флуконазолу. Так, при исследовании 34 41 изолята C. dubliniensis и 44 штаммов C. albicans было обнаружено, что у C. dubliniensis начинает развиваться стабильная устойчивость к флуконазолу при длительном лечении этим препаратом [29, 117]. Национальные эпидемиологические исследования, проведенные в разных странах, обнаружили ряд особенностей в отношении использования противогрибковых препаратов для терапии ИК (амфотерицин В, флуконазол, и группе эхинокандинов), что может быть одной из причин появления резистентных штаммов. Имеются наблюдения о географических различиях в распространенности устойчивых к вориконазолу штаммов Candida spp., так в Северной Америке - 14,6%, в других странах - 8,2 –11,3% [69]. Исследование, проводившееся в Китае в период с 2009 – 2011 выявило, что среди C. albicans чувствительными к флуконазолу были 74,2%, к вориконазолу – 100%, среди изолятов C. parapsilosis – 57.7% и 100% соответственно, у C. glabrata чувствительность составила 9,1% и 100% к вышеуказанным антимикотикам. У C. tropicalis – 31.6% , к каспофунгину все 100% штаммов были чувствительны, кроме 91.3% C. tropicalis [24]. В испанском национальном исследовании FUNGEMYCA (2009 –2011 гг.) было выявлено, что устойчивых и умеренно чувствительных среди C. albicans к флуконазолу было 1,5%, к вориконазолу – 1,6%, к позаконазолу 1,9%. У C. parapsilosis сниженной чувствительностью к позаконазолу и каспофунгину обладали 0,3% штаммов, к флуконазолу и вориконазолу –не выявлено. Для изолятов C. glabrata наибольшая доля со сниженной чувствительностью наблюдалась для позаконазола – 14,5%, у флуконазола и вориконазола – 6,3% и 1,2% соотвественно, у каспофунгина устойчивых штаммов не обнаружено. Устойчивых к флуконазолу и вориконазолу у изолятов C. tropicalis было обнаружено – 5,3%, а к позаконазолу – 7,1%, к каспофунгину также устойчивых не было [79]. По данным исследования ROCANET в Италии (10 госпиталей, 2013 г.) среди 101 Candida spp. была установлена устойчивость к эхинокандинам у 2 штаммов (C. albicans и C. 35 tropicalis), к флуконазолу у 4 штаммов (2 C. glabrata), 1 штамм C. glabrata имели устойчивость к вориконазолу и позаконазолу (перекрестная устойчивость) [157]. В Российской Федерации исследований распространенности устойчивости к противогрибковым препаратам не проводили. 1.5 Современные методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам История развития референтных методов определения чувствительности насчитывает порядка 20 лет. Однако до этого дня основными были методы нестандартизованных серийных разведений и диско-диффузионные методы. Проблема внутрилабораторной и межлабораторной воспроизводимости данных методов привели к необходимости применения стандартизованных методов. На сегодняшний день в мире существуют два крупных мировых центра по разработке стандартных методов определения чувствительности микромицетов к противогрибковым препаратам – CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute – Институт клинических и лабораторных стандартов, США) и EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing –Европейский коммитет по исследованию противомикробной чувствительности). CLSI в 1992 году разработал первый вариант протокола метода разведений в жидкой питательной среде M27-P. Время проведения исследований этим методом составляло 48 – 72 часа [74]. Благодаря совершенствованию протокола в 2008 году был предложен готовый протокол M27-A3 с дополнением S3, где время получения результата составляло 48 часов [47]. Данный метод является референтным методом определения чувствительности. Однако, несмотря на точность получаемых результатов, является трудозатратным и дорогим. В связи с этим, в 2004 году был разработан протокол диско-диффузионного метода CLSI M44-A [46], 36 характеризующийся простой пробоподготовкой, автоматическим учетом результата и высокой сопоставимостью результатов с референтным методом CLSI M27-A3. В системе EUCAST также предложили вариант определения чувствительности дрожжей методом микроразведений в жидкой питательной среде (протокол Edef 7.2 Revision), однако время получения результата составило 24 часа, а не 48 - как у CLSI [75]. На протяжении нескольких лет между двумя центрами CLSI и EUCAST шли дебаты относительно критериев интерпретации минимальных ингибирующих концентраций, и лишь в 2012 году они были гармонизированы [48]. В проведенном в период 2012 – 2013 гг. исследовании по сравнению результатов, полученных в соотвествии с вышеуказанными протоколами было определено, что общая согласованность составляла от 78,9% (позаконазол) до 99,6% (флуцитозин). Совпадение по категориям чувствительности составило 95% для всех антимикотиков, кроме каспофунгина согласованность (84,6%). Наряду с при определении этим была обнаружена чувствительности C. низкая glabrata к амфотерицину В, анидулафунгину, у C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei – к каспофунгину и у большинства видов – к итраконазолу и позаконазолу. Высокая степень согласованности была обнаружена относительно флуконазола, вориконазола и микафунгина против C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei [126]. С развитием референтных методов стали появляться коммерческие аналоги: ручные тест-системы – MICRONAUT –AM, SensititreYeastOne (Trek Diagnostics), E – test (AB Biodisk), ATB Fungus 2 (bioMerieux) и автоматические – Vitek (bioMerieux), MicroScan WalkAway (Siemens) для удобства применения в практике. В исследовании 133 изолятов Candida spp. отмечали, что совпадение между этими системами для флуконазола составляет 82,7%, для триазолов (72,9 – 77,9%) [28]. При сравнении результатов чувствительности к антимикотикам 170 изолятов C. albicans, полученных тест-системой 37 MICRONAUT – AM с протоколам CLSI A27-A3, EUCAST, было обнаружено, что все изоляты C. albicans были чувствительны к флуконазолу и вориконазолу в сравнении с CLSI A27–A3, и 2% обладали промежуточной чувствительностью к флуконазолу по сравнению с EUCAST [107]. Многоцентровое исследование по сравнению МПК противогрибковых препаратов изолятов Candida spp., с использованием автоматической системы Vitek2 Compact и референтного метода микроразведений по протоколу CLSI M27–A3, показало, что совпадение между результатами вышеуказанных методов составило 99,5% (n=867) в отношении каспофунгина, 98,6% (n=867) – микафунгина и позаконазола - 95,6% (n=452) [127]. В исследовании, проведенном в Бразилии при сравнении результатов Vitek2 Compact и CLSI M27-A3, было обнаружено, что совпадение у C. parapsilosis составило 97,5%, C. glabrata - 85,5 % [158]. Таким образом, в начале XXI века остается проблема быстрой, точной идентификации и определения чувствительности к противогрибковым препаратам Candida spp. в клинической микробиологической лаборатории. В таблице 3 приведена эволюция методов диагностики в микробиологии. Таблица 3 – Эволюция методов диагностики, применяемых в микробиологии по Khardori N. [92]. Метод диагностики Интерпретация/время Микроскопия Общая морфология / минуты Окраска по Грамму Общая принадлежность / минуты Определение фенотипических свойств Рост и идентификация / дни-недели Антимикотическая/антимикробная чувствительность Обработка моноклональными антителами Выбор антимикотиков (антибиотиков) / дни-недели Идентификация / часы Определение антигена Идентификация / часы Идентификация микроорганизма методом Идентификация (сложность в определении ПЦР в реальном времени редких видов) / часы 38 Продолжение таблицы 3 Метод диагностики Интерпретация/время Идентификация микроорганизма методом Идентификация (даже для редких видов) / ДНК-секвенирования дни Определение генов резистентности методом Выбор антибиотика / часы Идентификация (даже для редких видов) / минуты после получения культуры Масс-спектрометрия В настоящее время перспективным направлением в определении чувствительности к противогрибковым препаратам является устойчивость к ним с помощью молекулярно-биологических методов [31] Один из них основан на масс-спектрометрии [104]. Этот метод хорошо себя зарекомендовал себя в видовой идентификации грибов, однако применение его для определения устойчивости к антимикотикам, только начинается и пока проведено небольшое количество исследований. Так в работе в серии разведений противогрибкового препарата определяли пороговую концентрацию, при которой меняется белковый профиль микромицета — C. albicans. Оказалось, что минимальная концентрация флуконазола, изменяющая белковый профиль, находится в хорошем соответствии с МПК, определенной по стандартам CLSI. Также при помощи масс-спектрометра возможно непосредственное выявление продуктов распада лекарственного вещества, ферментированного устойчивым штаммом патогенного микроорганизма. Работы в этом направлении были проведены пока только в отношении антибиотиков [104]. Известно, что при помощи масс-спектрометрии находят особенности белковых профилей, свойственные устойчивым штаммам микромицетов [138]. Такой подход можно назвать типированием. Следует отметить, что по литературным данным, подавляющая часть клинических изолятов вида C. parapsilosis sensu lato является чувствительной к противогрибковым препаратам: флуконазолу, миконазолу, итраконазолу и нистатину [38], флуконазолу и вориконазолу [25]. 39 Методы, основанные на масс-спектрометрии, позволяют получить результат за непродолжительное время — три часа по оценкам Постераро с соавторами [23]. Также их несомненным достоинством является возможность одновременного определения видовой принадлежности возбудителя и его лекарственной устойчивости. Несмотря на это, разработка методов определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, основанных на масс-спектрометрии, в частности, в отношении грибов рода Candida, ещё не завершена [139]. Ещё одним новшеством, которое появилось сравнительно недавно, стали методы определения чувствительности к противогрибковым препаратам, основанные на изучении геномных последовательностей. Здесь функциональный подход связан с изучением путей воздействия противогрибковых препаратов на клетку и механизмов устойчивости к ним. В настоящее время значительная часть фундаментальных разработок в этой области относится к изучению полиморфизма генов, кодирующих белкимишени лекарств и трансмембранные переносчики [55]. Существует несколько механизмов, по которым грибы вырабатывают устойчивость к действию лекарственных препаратов группы азолов. Вопервых, это пути, связанные с индукцией мембранных переносчиков семейств ABC (ATP-binding cassette) и MFS (Major Facilitator Superfamily). На первой стадии развития устойчивости соответствующие транскрипционные факторы связываются с промоторами генов этих белков, что приводит к повышению их экспрессии, увеличении числа переносчиков в клеточной мембране, и ускоренному выводу лекарственных веществ из цитоплазмы клеток гриба. С увеличением времени воздействия антимикотика гены транскрипционных факторов приобретают ряд мутаций. Аминокислотная последовательность транскрипционных факторов меняется таким образом, что они становятся постоянно связанными с промоторами генов мембранных переносчиков [145]. Во-вторых, за приобретение микромицетами 40 устойчивости к воздействию азолов отвечают механизмы, ассоциированные с ферментом CYP51. Ген CYP51 приобретает мутации. Аминокислотные замены в цитохроме ухудшают связывание с молекулами лекарственного препарата, активность же фермента меняется незначительно, что позволяет грибу в присутствии молекул лекарства в цитоплазме поддерживать приемлемую концентрацию эргостерола на мембране. Различные мутации в гене CYP51 могут быть коррелировать с развитием устойчивости к различным соединениям азольного ряда [146]. Также существуют изменения в транскрипционной регуляции экспрессии гена цитохрома, по подобию тех, которые были упомянуты для мембранных насосов. Они приводят к увеличению количества цитохрома на мембране клеток гриба и к повышению эффективной дозы лекарства. Интересно, что приобретение гиперактивного аллеля транскрипционного фактора белка CYP51 связано со снижением общей жизнеспособности и вирулентности патогена [57]. Эффекты мутаций, приводящих к изменению восприимчивости гриба к препарату азольного ряда и выраженные в МИК, арифметически суммируются [80]. Ещё один, менее распространённый у грибов рода Candida механизм устойчивости связан с мутационной инактивацией фермента Erg3: нарушение работы CYP51 не вызывает накопления токсичного стерола [19]. Мишенью препаратов эхинокандинового ряда так же, как и азолов, является поверхность клетки. Однако в случае с эхинокандинами это не липидный, а полисахаридный компонент. Эхинокандины ингибируют 1,3-βD-глюкан-синтазу. Это приводит к нарушению структуры клеточной стенки и лизису дрожжей и аберрантному гифальному росту у плесеней. Устойчивость грибов рода Candida к эхинокандинам обусловливается мутациями в гене, кодирующем элементы 1,3-β-D-глюкан-синтазного комплекса. Эти мутации приводят к значительному повышению МПК по сравнению с изолятами дикого типа. Мутации в гене 1,3-β-D-глюкан-синтазы 41 приводят к появлению устойчивости против всего класса эхинокандинов одновременно [125]. В литературе нет единодушного мнения по вопросу перспективности для клинической практики комплекса методов определения чувствительности к антимикотикам, основанных на изучение геномных последовательностей, хотя ряд ученых видят за ними будущее персонифицированных подходов к антифунгальной терапии [31]. Также следует отметить, что прямое или косвенное определение МПК не позволяет предсказать результат лечения. А вот обнаружение некоторых мутаций в генах, кодирующие белки-мишени воздействия антимикотических преапаратов, позволяет это сделать. Но для успешного применения этого подхода необходима разработка быстрых и эффективных методов определения мутаций [142]. Их примерами могут послужить ПЦР-РВ, ПДРФ, SPR-технология, методы ДНК-чипов и масс-спектрометрии [1, 10, 63, 84, 112]. Анализ полиморфизма рибосомальных межгенных транскрибируемых спейсеров (ITS), последовательности локуса D1/D2 гена большой рибосомальной субъединицы, последовательности гена бета-тубулина, являющиеся в настоящее время «золотым стандартом» видовой диагностики микромицетов, позволяющие изучать филогенетические отношения между близкородственными видами, а также изучать филогению между популяциями внутри вида и между отдельными видами, рассматривается и как предикторы проявления резистентных качеств изолятов грибов к антимикотической терапии.. В частности, Маккаллу с соавторами удалось соотнести генетические варианты C. albicans, определённые методом ПДРФ, с проявлением устойчивости к флуцитозину [104]. Аналогичные данные (по флуцитозину, но не по флуконазолу и итраконазолу) методом мультилокусного секвенирования-типирования для гриба того же вида получены в работе Таванти с соавторами [131]. Для рода Aspergillus с помощью молекулярно-филогенетических подходов описаны виды, не 42 различающиеся по морфологии, но проявляющие различную восприимчивость к противогрибковым препаратам [19]. Эти примеры показывают возможную перспективность изучения разнообразия геномных последовательностей, используемых ранее для типирования, грибов рода Candida, в частности локуса D1/D2 гена 28S рРНК, для выявления резистентных изолятов. Таким образом, в связи с актуальностью проблемы, выбор оптимальных методов определения чувствительности для применения в рутинной практике имеет решающее значение, особенно для пациентов с внутрибольничным ИК. 43 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Объекты исследования При проведении данного диссертационного исследования изучены 322 клинических изолята грибов рода Candida, выделенные от 284 пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом (37 стационаров, преимущественно – отделения реанимации и интенсивной терапии 12 городов России) в течение 2011-2014гг. Большая часть культур Candida spp. была получена в результате многоцентрового исследования внутрибольничного кандидоза. Исследуемые изоляты Candida spp. были выделены из плевральной образцов жидкостей, периферической содержимого крови, абсцессов перитонеальной внутренних и тканей, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), биоптатов (мочеточник, кишечник, легкие, тромб сердца при аутопсии), желчи и пунктата суставной жидкости при посеве на питательные среды. Возбудители ВБИК были идентифицированы до вида с помощью тест-системы AUXACOLOR2 (BioRad,США), Германия), методом MALDI-TOF ДНК-секвенирования. противогрибковым препаратам масс-спектрометрии Определение исследуемых (Bruker, чувствительности штаммов Candida к spp. проводили в соотвествии со стандартными протоколами CLSI M27-A3, CLSI M44-A, а также с помощью автоматического анализатора Vitek2Compact (BioMerieux). 2.2 Подготовка культур Candida spp. Для выделения культур Candida spp. полученные образцы крови засевали на жидкие питательные среды – бульон Сабуро, флаконы системы посева крови Signal, (Oxoid), и анализатора гемокультур BactAlert (BioMerieux), инкубировали при 35 – 370С до 10 суток. При выявлении 44 признаков роста ( при их отсутствии – через 10 суток) пересевали на плотную питательную среду Сабуро в чашках Петри. Другие биосубстраты сеяли непосредственно на агар Сабуро и в среду обогащения (бульон Сабуро). Параллельно с посевом биосубстраты микроскопировали, отмечали наличие дрожжевых клеток и псевдомицелия [3]. Часть изолятов Candida spp. были доставлены в лабораторию из других медицинских центров уже в виде культур. Их пересевали на агар Сабуро с антибиотиками для исключения бактериальной контаминации и после получения культуры микроскопировали при увеличении х 400 для проверки чистоты культуры. Выделенные чистые культуры Candida spp. хранили на скошенном агаре Сабуро в пробирках при температуре 4 – 60С. Для определения видовой принадлежности штаммов Candida spp. и их чувствительности к противогрибковым препаратам использовали суточные культуры гриба, выращенные на агаре Сабуро при 37 0С (в случае C. lipolityca – при 280С) [5]. 2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК-секвенирования Выделение ДНК микромицетов Для выделения ДНК использовали двухдневные культуры Candida spp. Выделение ДНК производили по модифицированому методу Doyle и Doyle [59]. Разрушение клеточной стенки гриба проводили с помощью гомогенизатора Precellys со стеклянными шариками 5 мм (Sigma, США). Фрагменты разрушенной клеточной стенки инкубировали с экстракционным буфером SDS 1% (100 mM NaCl, 500 mM Tris, pH 8.0, 10% SDS) в течение ночи при 650С. Далее проводили экстракцию хлороформ-изоамиловой (24:1) смесью в течение 10 мин при 13 000 об/мин на микроцентрифуге MiniSpin (Eppendorf). ДНК осаждали этанолом при -200С, после чего концентрировали центрифугированием в течение 10 мин при 20 000 об/мин. Полученный осадок дважды промывали 70% спиртом, высушивали и растворяли в буфере 45 ТЕ. Концентрацию выделенной ДНК измеряли на флуориметре Qubit (Invitrogen, США). Молекулярно-генетический анализ Молекулярно-генетическая идентификация с помощью секвенирования ДНК проводилась согласно рекомендациям СLSI ММ18-А [49]. Идентификация основывалась на определении нуклеотидной последовательности регионов нетранскрибируемого межгенного спейсера ITS1 и ITS2, и фрагмента D1/D2 гена, кодирующего большую рибосомальную субъединицу 28S рРНК, с использованием праймеров ITS4 и ITS5, и NL1 и NL4, для намножения соответствующих фрагментов генов ITS и D1/D2 [27], структура праймеров приведена в таблице 4. Полученные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере в присутствии бромистого этидия и визуализировали в УФ-свете. ПЦРпродукты очищали с помощью набора для очистки ДНК «Омникс» (Омникс, Санкт-Петербург). Таблица 4 – Структура праймеров, используемых для идентификации микромицетов Название праймера ITS 4 ITS 5 NL1 NL4 Последовательность (5` - 3`) tcc-tcc-gct-tat-tga-tat-gc gga-agt-aaa-agt-cgt-aac–aag-g gca-tat-caa-taa-gcg-gag-gaa-aag ggt-ccg-tgt-ttc-aag-acg-g Секвенирование ДНК выполнялось по методу Сэнджера на генетическом анализаторе ABI Prizm 3500 (Applied Biosystems, США). Реакцию проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в объеме 10 мкл согласно рекомендациям производителя. Очистку от терминирующих аналогов нуклеотидов осуществляли набором BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США). Секвенирование выполнялось в обоих направлениях. Все 46 несоответствия между фенотипической и молекулярно-генетической идентификациями были проверены повторным секвенированием. Подготовку последовательности и секвенирование образцов осуществляли по стандартным протоколам, как описано ранее [6, 49]. Последовательности прочитывали с обеих нитей ДНК, после удаления структур праймеров. Затем проводили сравнение полученных последовательностей с последовательностями, депонированными в базе данных GenBank и базе данных Центра биоразнообразия грибов при Центральном бюро грибных культур (Нидерланды). Поиск в базе данных GenBank осуществляли по алгоритму megablast. Размер слова был 28 нуклеотидов для GenBank и 20 на CBS, параметры по умолчанию. В анализ были взяты 414 нуклеотидов, кодирующих фрагмент транскрибируемого спейсера ITS1, ген 5,8S рибосомной РНК и фрагмент спейсера ITS2 и 416 нуклеотидов, кодирующие регион D1/D2 гена 28S pPНК [6, 27, 49, 59, 60, 121]. Данный метод видовой идентификации возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза проводили в НИЛ молекулярногенетической микробиологии НИИ медицинской микологии им. П. Н. Кашкина (зав. лабораторией Тараскина А. Е.). 2.4 Идентификация Candida spp. методом MALDI-TOF массспектрометрии В данном исследовании использовали прибор «Autoflex speed» TOF/TOF (Bruker, Германия) с программным обеспечением MALDI Biotyper 3.1. Из суточной культуры дрожжей выделяли белковый экстракт, содержащий, в основном, рибосомальные белки. Анализ проводили на масс-спектрометре с получением масс-спектро-профиля (МСП) и сравнивали МСП с базой данных для видовой идентификации. (программный пакет MALDI Biotyper 3.1). 47 На сегодняшний момент база данных MALDI Biotyper содержит сведения о 5627 видах микроорганизмов, в том числе о более чем 120 видах Candida spp. При исследовании нами клинических изолятов грибов рода Candida spp. использовали протокол полной экстракции белка с помощью этанола и муравьиной кислоты. Суточную культуру исследуемого изолята Candida spp., полученную рассевом на чашке Петри с агаром Сабуро суспендировали в 300 мкл деионизированной воды в пробирке-эппендорфе, затем гомогенизировали смесь с помощью вортекса (Bio-San, Латвия) в течение минимум 1 минуты. Далее, к смеси в пробирку-эппендорф добавляли 900 мкл этанола и снова смешивали с помощью вортекса в течение минимум 1 минуты, а затем центрифугировали в течение 2 минут при 13000 об/мин (Bio-San, Латвия). Образовавшуюся надосадочную жидкость полностью удаляли пипеткой. На следующем этапе к оставшемуся осадку добавляли 50 мкл 70% муравьиной кислоты и смешивали с помощью вортекса минимум в течение 1 минуты (70% муравьиную кислоту получали путем смешения 30 мкл дистиллированной воды и 70 мкл 100% муравьиной кислоты в чистой пробирке-эппендорф, перемешивая с помощью вортекса). Затем, к полученной смеси добавляли 50 мкл 100% ацетонитрила, смешивали с помощью вортекса в течение минимум 1 минуты и снова центрифугировали в течение 2 минут при 13000 об/мин. 1 мкл надосадочной жидкости наносили на 2 парные лунки 384-луночной стальной полированной мишени, сушили при комнатной температуре (23 °С, 5 минут) и затем наносили 1 мкл раствора матрицы (α-циано-4гидроксикоричной кислоты) и сушили при комнатной температуре. Подготовленную мишень помещали в масс-спектрометр. В качестве калибранта использовали тест-стандарт белкового экстракта E.coli. Процедуру калибровки и проверки выполняли на ячейке планшета, содержащей образец бактериального тест-стандарта. 48 Полученный масс-спектр анализировали на основе базы данных идентификации микроорганизмов MALDI Biotyper 3.1. Результат учитывали по данным значения коэффициента видовой идентификации. Использовали следующие критерии оценки результата MALDI-TOF массспектрометрии: коэффициент < 2 – вид и род определены с точностью 100%; 1,8–1,99 – 100% определение рода, неуверенное определение вида; > 1,79 – сомнительное определение рода [103, 164, 165, 167, 177, 182, 184]. 2.4.1 Изучение комплекса видов Candida parapsilosis Для определения внутривидового сходства исследуемых изолятов были отобраны штаммы C. parapsilosis, включая устойчивые к противогрибковым препаратам. Данные штаммы предварительно исследовали по вышеуказанной методике MALDI-TOF масс-спектрометрии, однако, с целью получения наиболее четких спектров, результаты фиксировали не с двух парных лунок, а с четырех. Полученные масс-спектры штаммов C. parapsilosis обрабатывали с помощью программного обеспечения MALDITOF Biotyper 3.1 Offline Classification, используя статистический анализ главных компонент (в приложении MATLAB). Далее с помощью метода PCA (Principal Component Analysis – анализ главных компонент) проводили построение дендрограммы, которая представляла собой графическое изображение близкородственных индивидуальных спектров по отношению к другим. Масс-спектры автоматически делились на кластеры, масс-спектры которых обозначались одним цветом [103]. 49 2.5 Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2 Видовую идентификацию изучаемых изолятов Candida spp. с помощью AUXACOLOR2 проводили в соответствии в прилагаемым к тесту руководством [30]. Помимо биохимических свойств гриба, учитывали и морфологические характеристики: способность к пигментации, образованию артроспор, хламидоспор, росту при 370С, наличие мицелия/псевдомицелия, капсулы. Затем по результатам характеристик гриба формировали цифровой код и сравнивали с таблицей кодов, прилагающихся к тест-системе AUXACOLOR2 [30, 165]. 2.6 Изучение морфологических особенностей возбудителей инвазивного кандидоза Макроморфологические особенности исследуемых культур Candida spp. изучали на «гигантских» колониях. Для этого готовили суспензии из суточной культуры гриба в 5 мл. стерильного 0.85% раствора NaCl, наносили каплю суспензии на поверхность агара Сабуро в центр чашки Петри и инкубировали 14 суток при 370С. Фотографировали колонии с помощью стереоскопического люминисцентного микроскопа SteREO Lumar.V12 (Carl Zeiss, Германия). Особенности микроморфологии клеток культур грибов рода Candida изучали с помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager.Z1 (Carl Zeiss, Германия), использующего оптику Номарского. Для этого готовили микропрепараты: на предметное стекло наносили каплю дистиллированной воды, в которую вносили культуру исследуемого микромицета, взятую бактериологической петлей с центральной и периферической поверхности 50 колонии, полученную суспензию накрывали покровным стеклом и изучали особенности микроморфологии, проводили микрофотосъемку [7]. 2.7 Методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам in vitro Для 322 изолятов Candida spp. – возбудителей ВБИК была определена чувствительность к противогрибковым препаратам по протоколам CLSI (M27-A3, M44-A), а также на микробиологическом анализаторе Vitek2 Compact (BioMerieux). Использованные основные термины и понятия приведены в таблице 5 Таблица 5 – Определение категорий чувствительности к противогрибковым препаратам Категория чувствительности штамма к противогрибковому препарату Определение Чувствительная (Ч) изоляты подавляются обычно достижимыми концентрациями антимикробных препаратов, рекомендованной дозировкой Умеренно-чувствительная (УЧ) изоляты могут подавляться с применение дозы препарата, большей, чем обычно назначаемая дозировка препарата. Промежуточная (П) изоляты с МПК антимикробных препаратов, данные которых не позволяют ясно категорировать как точно «чувствительные» или «устойчивые». Буферная зона, которая может предотвратить небольшие, неконтролируемые, технические факторы, вызывающие основные расхождения в объяснениях. Устойчивая (У) изолят обычно не подавляется концентрацией препарата с нормальной дозировкой. 51 Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - самая низкая концентрация антимикробного препарата, который вызывает специфическую остановку видимого роста в агаре или при определении чувствительности методом разведении в жидкой питательной среде [45, 46]. 2.7.1 Метод микроразведений в жидкой питательной среде – CLSI M27A3 В данном исследовании применяется версия протокола (2008 г.) и критерии интерпретации результатов (2008 г. и 2012 г.). Инокулюм готовили из 5 колоний 24-часовой культуры Candida spp. на чашке Петри, суспендируя их в 5 мл 0,85% стерильного раствора NaCl до соответствия стандарту мутности 0,5 McFarland (1х106 – 5х106 клеток/мл). Рабочие суспензии далее разводили 1: 50 0,85% стерильным раствором NaCl, затем жидкой средой RPMI 1640 - 1: 20 (1х103 -5х103 ) клеток/мл. Для приготовления разведений субстанции противогрибковых препаратов промышленного приготовления (Sigma, Германия) флуконазол растворяли в стерильной воде, другие препараты (каспофунгин, позаконазол, вориконазол) – в диметилсульфоксид (ДМСО). Далее готовили основные растворы противогрибковых препаратов в концентрации 1280 мкг/мл. Затем, в соответствии со схемами, указанными в стандарте, разводили рабочие растворы противогрибковых препаратов: для вориконазола, позаконазола диапазон концентраций устанавливали от 0,0313 до 16 мкг /мл, для флуконазола - от 0,125 до 64 мкг /мл, для каспофунгина – от 0,015 до 8 мкг /мл. Выполнение микроразведений в жидких питательных средах проводили в стерильных одноразовых, 96-луночных планшетах с Uобразными лунками. Двукратные концентрации препаратов вносили в ряды с 1 по 10 лунки планшета в объеме 100 мкл микроканальными пипетками. Первые лунки рядов содержали самые высокие (64 или 16 мкг/мл) 52 концентрации препарата, а десятые лунки - самые низкие концентрации препарата (0,12 или 0,03 мкг/мл). Далее в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл соответствующего двойного разведения суспензии инокулюма, таким образом, получая разведения препарата и плотность инокулюма в конечной концентрации. Лунки контроля роста содержали 100 мкл стерильной среды, без препарата с соответствующим разведением суспензии инокулюма. Последнюю лунку планшета использовали для контроля стерильности (среда без препарата). В качестве контроля качества исследования использовали тест-культуру C. parapsilosis ATCC 22019 (РКПГY-1245). Планшеты инкубировали в термостате при температуре 350С в течении 24 часов. Учет результатов производили визуально с использованием следующей цифровой шкалы: 0 - оптически прозрачно,1легкая мутность, 2- заметное снижение (~ 50%) видимого роста, 3 – слабое подавление видимого роста, 4 – нет подавления видимого роста. Далее сравнивали с критериями интерпретации МПК флуконазола, вориконазола и каспофунгина (2008 г., 2012г) указаны в таблицах 6 и 7. Таблица 6 – Критерии интерпретации CLSI M27-S3 (2008 г.) Диапозон МПК (мкг/мл) Препарат УмеренноЧувствительные (Ч) чувствительные Усточивые (У) (УЧ) Флуконазол <8 16-32 > 64 Вориконазол <1 2 >4 Каспофунгин <2 - >2 53 Таблица 7 – Критерии интерпретации результатов определения чувствительности (CLSI M27-S4, 2012 г.) Диапозон МПК (мкг/мл) Препарат Виды Чувствительны е (Ч) Флуконазол Вориконазол Каспофунгин Критерии Умеренночувствительные Усточивые (У) (УЧ) C.albicans <2 4 >8 C. glabrata - < 32 > 64 природно устойчив к флуконазолу C.krusei C.parapsilosis <2 4 >8 C.tropicalis <2 4 >8 C.albicans < 0,12 0,25-0,5 >1 C. glabrata - - - C.krusei < 0,5 1 >2 C.parapsilosis < 0,12 0,25-0,5 >1 C.tropicalis < 0,12 0,25-0,5 >1 C.albicans < 0,25 0,5 >1 C. glabrata < 0,12 <0,25 > 0,5 C.krusei < 0,25 0,5 >1 C.parapsilosis <2 4 >8 C.guilliermondii <2 4 >8 C.tropicalis < 0,25 0,5 >1 интерпретации для позаконазола не установлены, предположительно МПК чувствительной категории для большинства штаммов < 1 мкг/мл [46, 47, 168, 169, 183]. 54 2.7.2 Диско-диффузионный метод определения чувствительности CLSI M44-A Использовали бумажные диски (производство Oxoid, Великобритания) диаметром 6 мм, пропитанные противогрибковыми препаратами (диски с вориконазолом содержали 1 мкг препарата, диски с флуконазолом – 25 мкг препарата) и плотную питательную среду Мюллер-Хинтона, содержащую 2% глюкозу и 0,5 мкг/мл красителя метиленового синего [45]. Для приготовления инокулюма использовали суточные культуры исследуемых Candida spp. Мутность инокулюма соотвествовала 0,5 McFarland (1х106 - 5х106 клеток/мл ). Посев инокулюма проводили не позднее, чем через 15 минут с момента его приготовления. Стерильный хлопковый тампон несколько раз погружали в инокулюм, затем переносили в чашку Петри со средой Мюллер-Хинтон и растирали по всей поверхности среды, постепенно вращая тампон, для получения роста «газоном» и полного впитывания инокулюма в среду. Диски с флуконазолом и вориконазолом наносили стерильным пинцетом на поверхность засеяной чашки, слегка придавливая для получения наибольшей площади соприкосновения со средой. Инкубировали при температуре 350С 18-24 часа. Учет результатов проводили автоматически с помощью микробиологического анализатора BIOMIC Vision (Giles Scientific, США) по диаметру зоны задержки роста (Таблица 8). [2, 45]. В качестве контроля качества исследования использовали тест-культуру C. parapsilosis ATCC 22019 (РКПГY-1245). Таблица 8 – Критерии интерпретации метода М44-А Категория чувствительности Чувствительный (Ч) Умеренно-чувствительный (УЧ) Устойчивый (У) Флуконазол Диаметр, МПК, мм мкг/мл > 19 15-18 < 14 <8 16-32 > 64 Вориконазол Диаметр, МПК, мм мкг/мл > 17 14-16 < 13 <1 2-4 >6 55 Определение чувствительности по стандарту CLSI M44-A было проведено в НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов НИИ медицинской микологии им.П.Н.Кашкина (Зав. лабораторией Богомолова Т.С., исполнитель - н.с. Выборнова И.В.) 2.7.3 Определение чувствительности с помощью микробиологического анализатора Vitek 2 Compact Использовали автоматический анализатор Vitek 2 Compact (bioMerieux). В качестве расходного материала использовали пластиковые карты ASTYS01 (bioMerieux), содержащие в запаянных лунках серийные разведения противогрибковых препаратов ( флуконазол, вориконазол, амфотерицин В, 5флуцитозин) [49,76]. Осуществление методики проводили в соотвествии с рекомендациями производителя. Из суточной культуры Candida spp. готовили суспензию в 3 мл 0,85% раствора NaCl в специальной пластиковой пробирке, затем пробирку вместе с картой AST-YS01 помещели в ячейки кассеты Vitek 2 Compact и устанавливали в прибор. Время определения чувствительности дрожжей к Полученный противогрибковым результат препаратам автоматически составляло выдавался после 18-35 часов. завершения определения чувствительности. Анализ данных проводили в соотвествии со стандартами интерпретации МПК CLSI M27-А3 S4 (2012). 2.8 Статистическая обработка результатов Результаты исследования обрабатывали с помощью программы STATISTICA for Windows версия 6.0. Использовали непараметрические и параметрические методы. Критерием статистической достоверности получаемых данных считали общепринятую в медицине величину р<0.05 [12]. 56 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОГО СПЕКТРА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPP. 3.1 Источники выделения возбудителей инвазивного кандидоза В период с 2011 по 2014 гг. исследовали биосубстраты от 284 пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом (из 37 стационаров, в 12 городах России). Образцы периферической крови, перитонеальной и плевральной жидкостей, содержимого абсцессов внутренних тканей, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), биоптатов (мочеточник, кишечник, легкие, тромб сердца при аутопсии), желчи и пунктата суставной жидкости на питательные среды высевали наагар Сабуро. Было выделено 322 изолята грибов рода Candida (рисунок 5). Биосубстраты были получены, преимущественно, в результате многоцентрового исследования из отделений реанимации и интенсивной терапии. 24 8 6 6 5 4 1 268 периферическая кровь ЦСЖ желчь перитонеальная жидкость плевральная жидкость пунктат коленного сустава содержимое абсцесса биоптат Рисунок 5 – Виды биоматериалов, из которых выделены возбудители ИК (n=322). 57 В большинстве случаев (83,2%) возбудители внутрибольничного инвазивного кандидоза выделены из крови (рисунок 7). Видовую идентификацию клинических изолятов Candida spp. осуществляли с помощью различных методов (ДНК-секвенирования, MALDI-TOF массспектрометрии, тест-системы AUXACOLOR2). 3.2 Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp. методами ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии Определили видовую принадлежность 97 штаммов грибов из рода Candida референтным методом - ДНК-секвенированием, в соответствии с международным протоколом CLSI MM18-A (рисунок 6) и методом MALDITOF масс-спектрометрии (рисунок 7). 7.2 11 1 1 50.5 11.4 12.5 14.3 C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. glabrata C. krusei C. bracarensis C. lipolytica C. lusitaniae C. kefyr Рисунок 6 – Спектр грибов рода Candida, идентифицированных методом ДНК-секвенирования (n=97). По результатам исследования 97 штаммов методом ДНК- секвенирования было определено 9 видов Candida, среди которых C. albicans - 50,5%, другие виды Candida - 49,5% (C. parapsilosis - 14,4%, C. tropicalis – 58 12,4%, C. glabrata - 11,4%, C. krusei - 7,3%, C. lipolytica,C. lusitanie, C. bracarensis, C. kefyr - по 1,0 %). По результатам видовой идентификации методом MALDI-TOF массспектрометрии 97 изолятов Candida spp. также определены 9 видов Candida (рисунок 9), среди которых 50,5% штаммов составляли C. albicans и 49,5 % составляли C. не - albicans виды (C. parapsilosis - 14,4%, C. tropicalis – 12,4%, C. glabrata – 11,4%, C. krusei - 7,3%; C. lipolytica, C. lusitanie, C. bracarensis и C. kefyr - по 1,0%). 7.2 11 1 1 50.5 11.4 12.5 14.3 C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. glabrata C. krusei C. bracarensis C. lipolytica C. lusitaniae C. kefyr Рисунок 7 – Видовой спектр Candida spp., определенный методом MALDITOF масс-спектрометрии (n=97). При сравнении результатов, полученных методом MALDI-TOF массспектрометрии и ДНК-секвенирования обнаружено совпадение в 100% случаев (таблица 9). 59 Таблица 9 – Результаты идентификации видов Candida spp. с помощью методов ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии (n=97) ДНК-секвенирование C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. glabrata C. krusei C. lipolytica C. lusitanie C. bracarensis C. kefyr Всего MALDI-TOF масс-спектрометрия n Верная ИД 49 14 12 11 7 1 1 1 1 97 49 14 12 11 7 1 1 1 1 97 Неверная ИД 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Примечание. ИД - идентификация Так как ДНК-секвенирование является дорогим, трудоемким, продолжительным по времени методом, требующим специально обученного персонала, в настоящее время его неприменяют в большинстве микробиологических лабораторий. Учитывая сопоставимость результатов двух методов, в качестве альтернативного мы применили метод быстрой и точной диагностики – MALDI-TOF масс-спектрометрии. В дальнейшем исследовании мы сравнили результаты видовой идентификации возбудителей ИК, полученных методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и биохимической тест-системой AUXACOLOR2. 3.3 Сравнение результатов видовой идентификации штаммов Candida spp. методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и тест-системой AUXACOLOR 2 Всего изучено 322 штамма Candida spp., выделенные от больных с ИК. По результатам видовой идентификации методом MALDI-TOF массспектрометрии выявлено, что исследуемые штаммы принадлежали к 14 60 видам грибов рода Candida: C. albicans – 139 (43,2%), C. parapsilosis – 65 (20,2%), C. glabrata – 37 (11,5%), C. tropicalis – 31 (9,6%), C. krusei – 20 (6,2%), C. guilliermondii – 17 (5,3%), C. lusitaniae – 4 (1,3%), C. pararugosa – 2 (0,6%), C. dubliniensis – 2 (0,6%), C. inconspicua – 1 (0,3%), C. bracarensis – 1 (0,3%), C. utilis- 1 (0,3%), C. kefyr – 1 (0,3%), C. lipolytica – 1 (0,3%). Таким образом, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, определено, что 43,2% клинических изолятов принадлежат к C. albicans, и 56,8% являются представителями C. не-albicans видов, а среди часто встречающихся штаммов C. не-albicans видов, выявлены также и более редкие виды - C. utilis, C. pararugosa и C. inconspicua (рисунок 8). 0.6 0.3 0.6 1.3 6.2 5.3 0.3 0.3 0.3 0.3 43.2 9.6 11.5 20.2 C. albicans C. tropicalis C. lusitaniae C. inconspicua C. kefyr C. parapsilosis C. krusei C. pararugosa C. bracarensis C. lipolytica C. glabrata C. guilliermondii C. dubliniensis C. utilis Рисунок 8 – Видовой спектр Candida spp., определенный методом MALDITOF масс-спектрометрией (n=322). С помощью тест-системы AUXACOLOR2 среди 322 исследуемых штаммов - возбудителей ИК идентифицировали 11 видов грибов рода Candida: C. albicans – 134 (41,6%), C. parapsilosis - 65 (20,2%), C. glabrata – 61 35 (10,9%), C.tropicalis –29 (9,0%), C.krusei –20 (6,2%), C.guilliermondii –16 (5,0%), C. dubliniensis –13 штаммов (4,0%), C.lusitaniae –3 штамма (0,9%), C.rugosa –2 (0,6%), C.kefyr –1 (0,3%), C.lipolytica – 1 (0,3%). Для двух штаммов видовая принадлежность неопределена (0,6%). 9 6.2 0.9 0.6 5 0.3 4 0.3 0.6 10.9 41.6 20.2 C. albicans C. parapsilosis C. glabrata C. tropicalis C. krusei C. rugosa C. guilliermondii C. kefyr C. dubliniensis C. lipolytica C. lusitaniae Candida spp. Рисунок 9 – Видовая идентификация Candida spp. с помощью тест-системы AUXACOLOR 2 (n=322). При сравнении полученных результатов видовой идентификации 322 штаммов совпадение составило 93,2%, (таблица 10 и 11), у C. albicans (139) доля неверной идентификации была - 7,9%, среди C.не- albicans видов - 6,0%. Таблица 10 – Сравнение результатов идентификации возбудителей ИК тестсистемой AUXACOLOR2 MALDI-TOF MС C. albicans (139) C. parapsilosis (65) C. glabrata (37) C. tropicalis (31) C. krusei (21) C. guilliermondii (17) AUXACOLOR 2 Верная ИД 128 64 35 29 20 16 Неверная ИД 11 1 2 2 1 1 62 Продолжение таблицы 10 MALDI-TOF MС AUXACOLOR 2 Верная ИД 3 0 0 2 1 1 0 0 300 (93,2%) C. lusitanie (4) C. pararugosa 2 C. bracarensis (1) C. dubliniensis 2 C. lipolytica (1) C. kefyr (1) C. inconspicua (1) C. utilis (1) Всего (322) (%) Неверная ИД 1 2 1 0 0 0 1 1 22 (6,8%) Таблица 11 – Причины расхожения результатов видовой идентификации MALDI-TOF MС AUXACOLOR 2 C. parapsilosis (1) C. guilliermondii (1) C. bracarensis (1) C. glabrata (1) C. tropicalis (2) C. pararugosa (2) C. albicans (2) C. rugosa (2) C. krusei (1) C. glabrata (1) C. inconspicua (1) C. albicans (1) C. guilliermondii (1) Candida spp. (1) C. utilis (1) Candida spp. (1) C. albicans (11) (11) C. dubliniensis Причины AUX: ассимиляция в лунке в целлобиозой Идентифицируется только молекулярно – генетическими методами AUX: ошибка тест-системы Идентифицируется только молекулярно – генетическими методами AUX: ошибка тест AUX: ошибка тест Идентифицируется только молекулярно – генетическими методами Идентифицируется только молекулярно- генетическими методами AUX: ошибка тест-системы При сравнении полученных данных с использованием тест-системы AUXACOLOR 2 и метода MALDI-TOF масс-спектрометрии достоверных различий между ними выявлено не было (рисунок 10). Вследствии выхода тест-системы AUXACOLOR 2 за пределы допустимой ошибки, для видовой идентификации, особенно, C.не- albicans видов лучше использовать метод MALDI-TOF масс-спектрометрии, в связи с тем, что именно среди этих видов постоянно появляются штаммы со сниженной чувствительностью к противогрибковым препаратам. 63 Рисунок 10 – Сравнение данных полученных методами MALDI-TOF массспектрометрии и AUXACOLOR 2 Таким образом, можно заключить, что использование современных методов видовой идентификации (ДНК-секвенирование и MALDI-TOF массспектрометрия) помогает точнее установить этиологию внутрибольничного инвазивного кандидоза в России (рисунок 11): 43,2% C. albicans и другие виды Candida spp. - 56.8%. 0.6 0.3 0.6 1.3 6.2 5.3 0.3 0.3 0.3 0.3 43.2 9.6 11.5 20.2 C. C. C. C. C. albicans tropicalis lusitaniae inconspicua kefyr C. C. C. C. C. parapsilosis krusei pararugosa bracarensis lipolytica C. C. C. C. glabrata guilliermondii dubliniensis utilis Рисунок 11 – Cпектр возбудителей внутрибольничного ИК в РФ (n=322) 64 Также был рассмотрен спектр Candida spp. в различных биосубстратах (рисунки 12 и 13) 45 40 38.8 35 30 25 % 22.3 20 15 11.6 11.2 10 5 6 5.2 1.5 0.7 0.7 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 C. C. al bi ca pa ns ra ps ilo sis C. gl ab ra C. ta tro pi ca lis C. C. gu krus ei ill ie rm on C. di lu i sit a C. ni ae pa ra r ug C. os du a bl in ien sis C. ke fy r C. C. ut ili in s co ns pi cu C. a lip o lyt C. ica br ac ar en s is 0 Рисунок 12 – Спектр Candida spp., выделенных их крови. Следует отметить, что в крови в качестве возбудителя ИК, преимущественно изолировали C. не-albicans виды – 61,2%, в том числе C. krusei (природно устойчивый к флуконазолу вид) – 6%, а также редкие виды (4,9%). В других биосубстратах (перитонеальная и плевральная жидкости, желчь, ЦСЖ) доминировали C. albicans, в биоптатах с одинаковой частотой выделяли C. albicans и C. glabrata. Таким образом, анализируя данные видового спектра Candida spp., было обнаружено, что среди 268 штаммов, выделенных из крови преобладали C. не-albicans виды (р=0,008), а среди 54 штаммов, выделенных из других биосубстратов - C. albicans (р=0,013). 65 Перитонеальная жидкость (n=24) % 75 80 70 60 50 40 30 20 8.3 10 0 C. albicans C. glabrata 8.3 4.2 C. krusei C. C. tropicalis parapsilosis Биоптаты (n=5) 45 40 Плевральная жидкость (n=6) 60 40 50 40 50 35 30 % 4.2 40 25 20 20 15 33.3 % 30 16.7 20 10 10 5 0 0 C. albicans C. glabrata C. krusei C. albicans ЦСЖ (n=6) Желчь (n=4) 90 80 75 83.3 80 70 70 60 % C. C. parapsilosis guilliermondii 60 50 % 40 50 40 25 30 20 30 16.7 20 10 10 0 0 C. albicans C. glabrata C. albicans C. guilliermondii 66 Содержимое абсцессов (n=8) 37.5 40 35 30 25 % 20 15 10 5 0 25 25 12.5 C. parapsilosis C. albicans C. glabrata C. krusei Рисунок 13 – Видовой спектр Candida spp., выделенный из других в норме стерильных биосубстратах. 3.4 Видовой спектр возбудителей ВБИК в течение 2012-2014 гг. Мониторинг видового спектра возбудителей ИК необходим для своевременного обнаружения его изменения. Мы проанализировали видовой спектр возбудителей ВБИК, выделенных нами в период исследования в 2012, 2013 и 2014 годах. В 2012 году нами изучен 61 изолят Candida spp.и было отмечено, что в данной группе преобладали C. albicans - 54 %, C. не-albicans составляет 46 % (рисунок 14). 100 80 60 % 40 20 54 46% 16.4 9.8 8.2 8.2 0 C. albicans C. glabrata C. parapsilosis C. krusei Рисунок 14 – Этиология ВБИК в 2012 гг (n=61) C. tropicalis 1.7 1.7 C. C. lipolytica bracarensis 67 Среди изученных в 2013 году 198 штаммов Candida spp., доля C. albicans составила 43,4 %, а C. не-albicans виды -56,6% (рисунок 15) 100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 43.4 56.6% 20.2 5.6 1.5 1 0.5 1 C. kr us ei ut ili s gu ill ie rm on di i C. lu sit an ia C. e pa ra ru go sa C. du bl in ien sis 6.1 C. C. a ra t C. gl ab ic al is tro p C. sil o 10.1 C. C. pa ra p al bi ca n s sis 10.6 Рисунок 15 – Этиология ВБИК в 2013 г (n=198). В 2014 году, среди возбудителей ВБИК (61 штамм), мы обнаружили, что доля штаммов C. albicans составила 32,8%, а C. не-albicans - 67,2% (рисунок 16). 100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0 67.2% 32.8 1.6 icu a 1.6 C. in co n sp ke fy r ni ae 1.6 lu sit a C. kr us ei C. ra t gl ab C. 3.3 C. 8.2 a gu ill ie rm on di i C. tro pi ca lis 9.8 C. C. pa ra ps ilo ca n s sis 13.2 al bi C. 27.9 Рисунок 16 – Этиология ВБИК в 2014 г (n=61). Таким образом, видовой спектр возбудителей внутрибольничного ИК в течение 2012, 2013, 2014 гг. изменился: во-первых, уровень C. albicans 68 снизился с 54% (2012г.) до 32,8% (2014 г.) (р=0,01) (рисунок 17); во-вторых, заметно возрос уровень C.не-albicans видов с 46% (2012г.) до 67,2% (2014 г.,р=0,001) (рисунок 17). При этом вырос также уровень C. parapsilosis: с 9,8 % (2012г.) до 27,8% (2014г., р=0,01) (рисунок 17). Доли часто встречающихся видов C. glabrata (16,4% и 13,2%), C. tropicalis (10,6% и 8,2%) и C. krusei (8,2% и 6,1%) существенно не изменились (рисунок 17). Также были выявлены редкие виды возбудителей ВБИК (рисунок 17). 60 18 54 50 16 43.4 40 13.2 14 32.8 10.6 10.1 12 % 30 10 8.2 8.2 8.2 % 8 20 6.1 6 10 4 0 2 2012 2013 3.2 0 2014 2012 C. albicans C. glabrata 2013 C. tropicalis 30 80 67.2 70 56.6 60 50 16.4 46 C. krusei 27.8 25 20.2 20 % 40 2014 15 % 30 9.8 20 10 10 5 0 2012 2013 C. не - albicans 2014 0 2012 2013 2014 C. parapsilosis Рисунок 17 – Видовой спектр возбудителей ВБИК в течение (2012-2014 гг.). 69 3.5 Географические особенности этиологии инвазвиного кандидоза Исследуемые штаммы грибов рода Candida были выделены от пациентов из стационарах 12 городов 6 федеральных округов (ФО) РФ: Южного (Ростовна-Дону, Краснодар), Центрального (Москва), Северо-Западного (СанктПетербург, Петрозаводск),Приволжского (Пермь, Нижний Новгород, Казань), Уральского (Тюмень, Сургут), Сибирского (Иркутск, Омск) (рисунок 18). 127 53 38 32 60 12 Рисунок 18 – Географическое распределение исследуемых штаммов Candida spp (n=322). При изучении видового спектра возбудителей ИК в федеральных округах установлены географические особенности. Так в Сибирском и Уральском (рисунок 19) федеральных округах доля C. albicans в структуре возбудителей ИК была достоверно выше, чем в Северо-Западном и Южным федеральных округах, р < 0.05. 70 100% 8.4 90% 8.3 80% 8.3 2.7 2.7 2.7 2.7 7.5 3.1 6.3 3.1 15.1 15.7 0.8 0.8 0.8 15.7 30.2 60% 1.6 11.8 9.3 8.7 6.3 8.7 12.5 7.8 3.1 70% 5 26.7 16.7 9.4 50% 23.6 15 40% 75 30% 57.8 47.2 20% 46.9 37 35 10% 0% Сибирский ФО* (12) C. albicans C. guilliermondii C. inconspicua Уральский ФО* (38) Центральный ФО (53) C. parapsilosis C. lusitaniae C. lipolytica Приволжский ФО Северо-Западный Южный ФО (60) (32) ФО (127) C. glabrata C. dubliniensis С. bracarensis C. tropicalis C. pararugosa C. kefyr C. krusei C. utilis Рисунок 19 – Распределение видов Candida spp. – возбудителей ИК в федеральных округах РФ. *– р <0.05 в сравнении с Северо-Западным и Южным ФО. При анализе видового распределения штаммов в различных городах РФ было выявлено, что между крупными городами (Санкт-Петербург и Москва) достоверных различий в видовом спектре нет (р=0,2), тогда как существуют видовые различия между долями C. albicans в структуре возбудителей ИК в Иркутске и Ростове на Дону, достоверно (р=0,0009) выявлено преобладание C. albicans в Иркутске. Помимо городов, указанных на рисунке 20 также были выделены единичные штаммы из следующих городов: Омск – C. tropicalis (1), Петрозаводск - *C.guilliermondii (1), Нижний Новгород – C. * parapsilosis (1), Казань – 3 штамма: C. tropicalis, C. parapsilosis, C.lusitaniae , Сургут – 4 штамма: C. albicans (2), C. krusei (1), C. inconspicua (1) 71 100% 9.1 6.2 3 3 3.5 7.1 6.2 9.1 17.6 80% 3.6 3.6 15.1 8.7 3.6 8.7 12.5 17.6 17.8 34.1 7.9 30.2 60% 2.3 4.5 11.2 3.6 12.5 0.8 0.8 0.8 7.5 3.6 23.8 40% 18.2 81.8 62.6 15.9 58.8 53.6 20% 47.2 37.3 25 0% Иркутск** (11) C. albicans C. guilliermondii C. lipolytica Краснодар Тюмень (34) Пермь (28) Москва (53) (16) C. parapsilosis C. lusitaniae С. bracarensis C. glabrata C. dubliniensis C. kefyr СанктРостов-на Петербург Дону** (44) (126) C. tropicalis C. krusei C. pararugosa C. utilis Рисунок 20 – Спектр видов Candida spp. в различных городах РФ ** – р <0.05 в сравнении с Санкт-Петербургом и Москвой. После установления видовой принадлежности каждого штамма Candida spp. было проведено описание обнаруженных видов, включая редкие. 3.6 Морфологические особенности возбудителей инвазивного кандидоза Были изучены морфологические особенности представителей 14 исследуемых видов Candida spp. – возбудителей инвазивного кандидоза. C. albicans (Berkhout, 1923). Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агар Сабуро получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 5 см. Окраска колони кремовая, консистенция мягкая, поверхность гладкая, блестящая по 72 краям, центр колонии имеет складчатую текстуру, край колонии ровный (рисунок 21а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены почкующиеся дрожжевые клетки, округлые или слегка эллипсовидной формы размером 3,0-6,5 х 3,5-12,5 мкм (рисунок 21б). C. dubliniensis (D.J. Sullivan, Western., K.A. Haynes, Dés.E. Benn. & D.C. Coleman, 1995). Макроморфология культур. На агаре Сабуро через 14 суток получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,5см. Окраска колонии белая, блестящая, консистенция мягкая, поверхность бугристая, край колонии неровный (рисунок 21в). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные почкующиеся дрожжевые клетки округлые и овальной формы размером 2,07,0 х 3,0 - 8,5 мкм (рисунок 21г). Рисунок 21 – Морфология культур C. albicans (изолят Дж-4) и C. dubliniensis (Пер-18): а – гигантская колония C. albicans, б – микроскопия культуры C. albicans; в – гигантская колония C. dubliniensis, г – микроскопия культуры C. dubliniensis; ДК – дрожжевые клетки 73 C. glabrata S.A. Mey. & Yarrow, 1978. Макроморфология культур. Гигантская колония на агаре Сабуро через 14 суток после посева имеет диаметр 5 см. Окраска колонии песочно-кремовая, консистенция мягкая, поверхность гладкая, блестящая, в центре слегка вдавленная, край колонии слегка волнистый (рисунок 22а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые клетки эллипсовидной формы размером 2,0 х 3,5 мкм (рисунок 22б). C. bracarensis A. Correia, P. Samp., S.A. James & C. Pais, 2006. Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агаре Сабуро получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 3,5 х 3,0см. Окраска колонии молочно-желтого цвета, консистенция мягкая, центральная часть слегка тонко-бугристая, блестящая, край колонии слегка зубчатый (рисунок 22в). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые клетки слегка округлой и эллипсовидной формы размером 3,0 - 3,5 х 4,04,5мкм (рисунок 22г). Рисунок 22 – Морфология культур C. glabrata (изолят М-3) и C. bracarensis (изолят Дж-1): а – гигантская колония C. glabrata, б – микроскопия культуры C. glabrata; в – гигантская колония C. bracarensis, г – микроскопия культуры C. bracarensis; ДК – дрожжевые клетки 74 C. guilliermondii Langeron & Guerra, 1938. Макроморфология культур. На агаре Сабуро через 14 суток после посева получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 5 см. Окраска колонии песочно-кремовая, консистенция мягкая, поверхность гладкая, блестящая, в центре слегка бугристая, край колонии слегка волнистый (рисунок 23а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые клетки округлые и слегка эллипсовидной формы размером 2,5-5,0 х 3,0-5,5 мкм (рисунок 23б). Рисунок 23 – Морфология культуры C. guilliermondii (изолят Рос-18): а – гигантская колония C. guilliermondii, б – микроскопия культуры C. guilliermondii; ДК – дрожжевые клетки C. inconspicua Lodder & Kreger-van Rij, S.A. Mey. & Yarrow, 1978. Макроморфология культур. Гигантская колония через 14 суток после посева на агар Сабуро имеет диаметр 4,5x3,5см. Окраска колонии молочная, консистенция мягкая, поверхность гладкая, тусклая, в центре слегка плоская приподнята. Край колонии выемчатый (рисунок 24 а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые клетки эллипсовидной формы, размером 1,5 – 3,0 х 3,0-5,0 мкм (рисунок 24б). 75 Рисунок 24 – Морфология культуры C. inconspicua (изолят Пер-27): а – гигантская колония C. inconspicua, б – микроскопия культуры C. inconspicua; ДК – дрожжевые клетки C. kefyr Uden & H.R. Buckley, S.A. Mey & Ahearn, 1983. Макроморфология культур. C. kefyr через 14 суток после посева на агар Сабуро формирует гигантские колонии диаметром 4,5 см. Окраска колонии кремовая, консистенция мягкая, поверхность гладкая, слегка приподнятая. Центр колонии мелко-зернистый; край – слегка волнистый, фестончатый (рисунок 25 а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые клетки округлой и овальной формы размером 3,1 – 4,8 х 4,6 – 9,0 мкм (рисунок 25 б) Рисунок 25 – Морфология культуры C. kefyr (изолят К.): а – гигантская колония C. kefyr, б – микроскопия культуры C. kefyr; ДК – дрожжевые клетки 76 C. krusei Berkhout, 1923. Макроморфология культур. На агаре Сабуро через 14 суток получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,5 x 3,5см. Окраска колонии кремовая, консистенция мягкая, поверхность тусклая, шероховатая, край колонии – слегка выемчатый (рисунок 26а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые клетки эллипсовидной формы размером 2,0 – 5,0 х 4,2 – 11,0 мкм (рисунок 26б). Рисунок 26 – Морфология культуры C.krusei (изолят М-10): а – гигантская колония C.krusei, б – микроскопия культуры C.krusei; ДК – дрожжевые клетки C. lipolytica F.C. Harrison, Diddens & Lodder, 1942. Макроморфология культур. C. lipolytica через 14 суток после посева на агаре Сабуро образует гигантскую колонию диаметром 4,5 см. Окраска колонии кремовая, консистенция мягкая, поверхность мелкоскладчатая, слегка приподнятая. Центральная часть колонии складчатой текстуры (рисунок 27а); край – слегка волнистый, фестончатый. Микроморфология. При микроскопии обнаружены удлиненные и овальной формы дрожжевые клетки размером 3,1-4,8 х 3,6-8,0 мкм (рисунок 27б) 77 Рисунок 27 – Морфология культуры C. lipolytica (изолят 39): а – гигантская колония C. lipolytica, б – микроскопия культуры C. lipolytica; ДК – дрожжевые клетки, ПК – почкующиеся клетки C. lusitaniae Uden & Carmo Souza, 1959. Макроморфология культур. На агаре Сабуро C. lusitaniae через 14 суток после посева получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 5,0 см. Окраска колонии кремовая, блестящая консистенция мягкая, поверхность по краю крупно-дольчатая, слегка приподнятая, в центре колонии – мелкоскладчатостая (рисунок 28а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые клетки округлой и овальной формы размером 2,0 – 5,0 х 3,0 – 7,0 мкм (рисунок 28б). Рисунок 28 – Морфология культуры C. lusitaniae (изолят Пер-25): а – гигантская колония C. lusitaniae, б – микроскопия культуры C. lusitaniae; ДК – дрожжевые клетки 78 C. parapsilosis Langeron & Talice 1932. Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агар Сабуро получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,8 х 5,0 см. Окраска колонии кремовая, блестящая, консистенция мягкая, поверхность – мелкозернистая, край в виде валика, мелко-фестончатый (рисунок 29а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены одиночные дрожжевые клетки округлой, эллипсовидные, овальной формы размером 3,1–4,8 х 4,0-9,0 мкм (рисунок 29б) . Рисунок 29 – Морфология культуры C. parapsilosis (изолят Дж-2): а – гигантская колония C. parapsilosis, б – микроскопия культуры C. parapsilosis; ДК – дрожжевые клетки C. pararugosa Nakase, Komag. & Fukaz, 1978. Макроморфология культур. На агаре Сабуро через 14 суток после посева гигантская колония имеет диаметр 4,0х3,0 см. Окраска колонии молочная, консистенция мягкая, поверхность – мелко-зернистая, слегка блестящая, приподнятая. Край колонии мелко-складчатый (рисунок 30а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены скопления клеток округлой и овальной формы клетки, размером 6,0 – 12,0 х 2,0 – 3,5 мкм (рисунок 30 б). 79 Рисунок 30 – Морфология культуры C. pararugosa (изолят Пер-7): а – гигантская колония C. pararugosa, б – микроскопия культуры C. pararugosa; ДК – дрожжевые клетки C. tropicalis Berkhout, 1923. Макроморфология культур. Колония диаметром 4,5 см получена через 14 суток после посева на агар Сабуро. Окраска колонии кремовая, слегка блестящая, консистенция мягкая, центр колонии имеет мелкозернистую текстуру, край колонии равномерно (рисунок 31а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены скопления дрожжевых клеток округлой и овальной формы размером 4,0-6,0 х 5,2-8,8мкм (рисунок 31б). Рисунок 31 – Морфология культуры C. tropicalis (изолят Ом-1): а –гигантская колония C. tropicalis, б – микроскопия культуры C. tropicalis; ДК–дрожжевые клетки 80 C. utilis Lodder & Kreger-van Rij, 1952. Макроморфология культур. Через 14 суток после посева на агар Сабуро получен рост гриба в виде гигантской колонии диаметром 4,5 см. Окраска колонии молочная, консистенция мягкая, поверхность – гладкая, слегка блестящая, приподнятая. Край колонии мелко-складчатый (рисунок 32а). Микроморфология. При микроскопии обнаружены скопления дрожжевых клеток округлой и овальной формы размером 7,0 – 10,0 х 2,0 – 3,0 мкм (рисунок 32б). Рисунок 32 – Морфология культуры C. utilis (изолят Пер-27): а –гигантская колония C. utilis, б – микроскопия культуры C. utilis ; ДК–дрожжевые клетки В результате изучения морфологических особенностей представителей 14 видов грибов рода Candida обнаружено, что клетки C. albicans и близкородственного ей вида C. dubliniensis при микроскопическом исследовании практически не отличались друг от друга, равно как и клетки C. glabrata и криптического вида – C. bracarensis. Было замечено значительное сходство культур C. pararugosa и C. utilis, а также C. krusei и C. inconspicua по макро- и микроморфологическим признакам. Стоит отметить, что дрожжевые клетки редких видов, таких как C. bracarensis, C. pararugosa, C. utilis, C. inconspicua достаточно мелкие при микроскопии, в сравнении с другими видами Candida. 81 Таким образом, выявлено, что у некоторых видов Candida существует сходство между собой как по внешнему виду колоний, так и дрожжевых клеток, что затрудняет их дифференцировку. Особенно важно, что подобные совпадения обнаружены между часто встречающимися и редкими видами. 3.7 Протеомное профилирование возбудителей инвазивного кандидоза В связи с установленной тенденцией к увеличению встречаемости комплекса видов C. parapsilosis среди C. не-albicans видов, нами был изучен состав Показатель отличия этого комплекса с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии (рисунок 33). Рисунок 33 – Дендрограмма белковых масс-спектров штаммов C. parapsilosis (n=65). №№ 1–5 –номера субкластеров Проведенным иерархическим кластерным анализом основных массспектропрофилей комплекса C. parapsilosis выявлено, что все исследуемые штаммы комплекса принадлежали только к виду C. parapsilosis. Изолятов C. 82 orthopsilosis, C. metapsilosis в России не обнаружено. Все полученные массспектры были распределены по 5 субкластерам сообразно их родству между собой. Дальнейшее, более подробное, деление также происходило по принципу родства. Были обнаружены близкородственные масс-спектры у некоторых изолятов, которые были выделены в одних и тех же городах, в одних и тех же стационарах, в один промежуток времени, но от разных пациентов (изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14, 15 – г. Тюмень, №№ 24, 42 – г. Санкт-Петербург). Также выявлено, что изоляты №№ 21 и 39, устойчивые к флуконазолу, располагались в субкластере № 2, а изоляты №№ 24 и 41 находились в субкластере №3 и обладали устойчивостью и к вориконазолу (изолят №41). В качестве дополнения базы данных масс-спектропрофилей Bruker 3.1 для улучшения идентификации редких видов Candida нами были добавлены их масс-спектры (рисунок 34). б а в г Рисунок 34 – Масс-спектро профили редких возбудителей ИК: а – С. utilis, б C. lusitaniae, в – C. kefyr, г – C. bracarensis. 83 При сравнении масс-спектров C. parapsilosis, выделенных в России с масс-спектрами тест-штаммов из зарубежных коллекций микроорганизмов, приведенныхв базе данных Bruker Biotyper обнаружили различие белковых масс-спектропрофилей C. parapsilosis исследуемых штаммов от зарубежных коллекций типовых культур (рисунок 35). Также установлено, что массспектр штамма C. bracarensis, выделенный в России отличается от массспектров штаммов находящимся в Центральном бюро грибных культур в Нидерландах (рисунок 36). При сравнении масс-спектро-профилей штамма C. utilis, выделенного в РФ, со штаммами из зарубежных коллекций наоборот выявлено близкое сходство между ними (рисунок 37). Таким образом, протеомные профили редких видов Candida spp. различны, что диктует необходимость дальнейшего наблюдения за видовым спектром, циркулирующим на территории России. 3.8 Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного кандидоза Для исследования полиморфизма региона D1/D2 гена 28S рРНК нами был выбран вид C. parapsilosis, которому принадлежит ведущая роль в развитии инвазивного кандидоза, вызванного C. не-albicans. В ходе исследования было получено 11 последовательностей данного региона для исследуемых штаммов C. parapsilosis, четырёх – для контрольных (типовые штаммы РКПГ), а также одного клинического штамма с не определённой чувствительностью к противогрибковым препаратам. Полученные последовательности были выравнены и обрезаны по самым коротким, длина окончательного выравнивания составила 416 пар нуклеотидов (рисунок 38). Исключение составил штамм A., для которого удалось получить последовательность длиной только в 318 п.н. 84 Показатель отличия Рисунок 35 – Масс-спектры исследуемых штаммов C. parapsilosis и штаммов из зарубежных коллекций. 85 Показатель отличия Рисунок 36 – Масс-спектры исследуемых штаммов и штаммов из зарубежных коллекций C. bracarensis. 86 Показатель отличия Рисунок 37 – Масс-спектры исследуемых штаммов и зарубежных коллекций C. utilis 87 Рисунок 38 – Выравненные последовательности региона D1/D2 гена 28S рРНК C. parapsilosis. В пределах полученного выравнивания нами было выявлено шесть полиморфных вариантов (однонуклеотидных замен) (таблица 12). 88 Таблица 12 – Обнаруженные Однонуклеотидные полиморфные варианты региона D1/D2 гена 28S рРНК C. parapsilosis. № п/п Однонуклеотидные замены C23G T73C 80delT A101G C372T T409C 1 2 3 4 5 6 Исследованный штамм St. Tyum_1 M_5 Tyum_1 RCPF 1206, RCPF 1321 Tyum_1 Однонуклеотидные замены нуклеотидов были зарегистрированы в анализируемой последовательности в позициях 23, 73, 80, 102, 372, 409, считая от начала выравнивания. Устойчивые к азолам штаммы C. parapsilosis (М4_2 и A.) оказались в группе 11 штаммов с основным типом последовательности региона D1/D2. Таким образом, ген 28S рРНК штаммов C. parapsilosis, выделенных от пациентов с микологической патологией г. Санкт-Петербурга, имеет однонуклеотидные полиморфные варианты. Однако имеющегося материала пока недостаточно для того, чтобы сделать определённые выводы о практической ценности изучения последовательности локуса D1/D2 гена 28S рРНК Candida spp. для выявления резистентных изолятов. Вместе с тем, в настоящей работе сделан задел для такого исследования — создана коллекция устойчивых изолятов, для которых может быть проведено молекулярно-генетическое типирование. 89 ГЛАВА 4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPP. К ПРОТИВОГРИБКОВЫМ ПРЕПАРАТАМ 4.1 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M27-A3. В период с 2011 по 2014 гг. был проведен мониторинг чувствительности возбудителей ВБИК к противогрибковым препаратам по протоколу CLSI M27-A3 (с оценкой по критериям CLSI M27-S3 (2008 г.) и M27-S4 (2012 г.) (таблица 13). Таблица 13 – Результаты определения чувствительности штаммов Candida spp. к азоловым антимикотикам (CLSI M27-A3). Виды Candida spp.( n= 322) C. albicans*(n = 139) C. parapsilosis*(n=65) C. glabrata*( n= 37) C. tropicalis* ( n= 32) C. krusei* ( n= 21) C. guilliermondii** ( n= 17) C. dubliniensis**(n= 2) C. lusitaniae ** ( n= 4) Противогрибковый препарат Распределение штаммов Candida spp. по чувствительности к антимикотикам, n(%) Ч УЧ У Флуконазол 136 0 3 Вориконазол 139 0 0 Флуконазол 57 0 8 Вориконазол 63 0 2 Флуконазол 0 37 0 Вориконазол 37 0 0 Флуконазол 30 0 2 Вориконазол 31 1 1 Флуконазол 0 0 21 Вориконазол 20 1 0 Флуконазол 8 3 5 Вориконазол 11 1 3 Флуконазол 2 0 0 Вориконазол 2 0 0 Флуконазол 4 0 0 Вориконазол 4 0 0 90 Продолжение таблицы 13 Виды Candida spp.( n= 322) C. pararugosa ** ( n= 2) C. lipolytica ** ( n= 1) C. kefyr**( n= 1) C. utilis ** ( n= 1) C. inconspicua ** ( n= 1) Противогрибковый препарат Распределение штаммов Candida spp. по чувствительности к антимикотикам,n(%) Ч УЧ У Флуконазол 2 0 0 Вориконазол 2 0 0 Флуконазол 1 0 0 Вориконазол 1 0 0 Флуконазол 1 0 0 Вориконазол 1 0 0 Флуконазол 0 0 1 Вориконазол 1 0 0 Флуконазол 1- 0 0 Вориконазол 1- 0 0 Примечание * критерии CLSI M27-S4, ** критерии CLSI M27-S4; Ччувствительный, УЧ-умеренно - чувствительный, У устойчивый Из 322 изолятов Candida spp. были чувствительны к флуконазолу 75%, умеренно – чувствительными - 13% штаммов, устойчивыми – 12%. C.albicans были чувствительны в 97% случаев, умеренно чувствительными - 0,7% и устойчивыми 2,3%. Среди C. не-albicans штаммов 58% были чувствительными, умеренно – чувствительными – 23%; устойчивыми -19% (рисунок 39а). Таким образом, наибольший процент штаммов со сниженной чувствительностью к флуконазолу наблюдали среди видов C. не-albicans: C. glabrata (37), C. krusei (21), C. parapsilosis (8), C. tropicalis (2). 91 100 12.1 90 2.2 0.7 100 19 2.7 1.6 80 70 23 70 60 % 0.3 0 90 13.4 80 1.6 0.9 У 60 50 97.1 40 % 50 99.7 97.5 95.7 УЧ 40 74.5 30 58 20 У 10 Ч 30 20 10 0 0 Candida spp. C. albicans C. не-albicans У Ч а Candida spp. C. albicans C. не-albicans б Рисунок 39 - Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к флуконазолу (а) и вориконазолу (б) (метод CLSI М27-А3, n=322); У – устойчивый, УЧ – умеренноCa чувствительный, Ч – чувствительный nd Установлено id распределение Candida spp. по категориям a чувствительности к вориконазолуsp(рисунок 39б): чувствительные - 97,5%, умеренно чувствительные – 0,9% штаммов, устойчивые – 1,6%. Следует отметить, что C. albicans были чувствительны в 99,7% случаев, устойчивыми – 0,3%. Среди C. не-albicans видов были чувствительными к вориконазолу 95,7% штаммов, умеренно – чувствительными – 1,6% и устойчивыми 2,7%. Сниженной чувствительностью к вориконазолу – C. parapsilosis 0,6% (2), C. tropicalis 0,6% (2) и C. krusei 0,3% (1). Наряду с этим, 6 штаммов – C. guilliermondii (2), C. parapsilosis (2), C. tropicalis (1), C. albicans (1) были устойчивы к флуконазолу и к вориконазолу. Таким образом, полирезистентных к азолам штаммов среди Candida spp. было 1,9% (C.albicans – 0,3%, C. не-albicans видов – 1,5 %). Среди Candida spp. – возбудителей ИК, 2,5% были устойчивы к вориконазолу. В период проведения исследований (2011 – 2014 гг.), не было выявлено (р=0,6) достоверного возрастания штаммов со сниженной чувствительностью. 92 4.1.1 МПК противогрибковых препаратов для различных видов Candida spp. C. albicans (n=139) C. parapsilosis (n=65) C.glabrata (n=37) C. tropicalis (n=31) C.guilliermondii (n=17) C. krusei (n=20) Рисунок 40 – МПК противогрибковых препаратов для 6 основных видов Candida spp. При определении МПК противогрибковых препаратов для 6 основных возбудителей ВБИК обнаружена наибольшая гетерогенность по этому показателю штаммов C. guilliermondii и C. parapsilosis (рисунок 40). 93 Далее мы определили МПК50, МПК90 и диапазоны МПК анти- микотиков у различных видов Candida. (таблица 14). Таблица 14 – Особенности распределения МПК у различных видов Candida Виды Candida C. albicans (n=139) C. glabrata (n=37) Противогрибковые препараты Диапазоны МПК50 МПК (мкг/мл) (мкг/мл) МПК90 (мкг/м л) флуконазол вориконазол каспофунгин позаконазол флуконазол вориконазол каспофунгин позаконазол 0.06-32 0,015-8 0,015-0,5 0,008-0,25 0.5-32 0.008-0.5 0,015-0,25 0,0080,125 32-128 0.5 0,03 0,125 0,03 16 0.03 0,06 0,03 2 0,125 0,25 0,06 16 0.125 0,125 0,06 64 64 0.06-1 0.03-0.25 0.015-0.25 0.25-64 0.03-8 0.06-1 0.015-0.25 0.125-16 0.015-0.25 0.03-0.25 0.0150.125 0.125-64 0.015-1 0.03-2 0,015-0,06 0.125 0.25 0,06 4 0.06 0.5 0,03 1 0.06 0.125 0,03 0.5 0.03 1 0,03 флуконазол C. krusei (n=20) C. guilliermondii (n=17) C. tropicalis (n=31) C. parapsilos is (n=65) вориконазол каспофунгин позаконазол флуконазол вориконазол каспофунгин позаконазол флуконазол вориконазол каспофунгин позаконазол флуконазол вориконазол каспофунгин позаконазол Критерии чувствительности CLSI M27-S3 и CLSI M27-S4 (мкг /мл) <2 <0,12 <0,25 Не установлен <32 (УЧ*) <1 <0,12 Не установлен Среднее геометрическое МПК (мкг/мл) 0,6 0,03 0,1 0,02 11,9 0,04 0,15 0,03 61,8 0.5 0.25 0,25 64 1 1 0,25 2 0.125 0.25 0,06 Природно устойчивый вид 0.5 <0,25 Не установлен <8 <1 <2 Не установлен <2 <0,12 <0,25 Не установлен 16 0.125 2 0,06 <2 <0,12 <2 Не установлен 1,33 0,03 0,15 0,03 0,15 0,13 0,03 4,17 0,1 0,19 0,03 1,09 0,05 0,14 0,03 Обнаружено, что для C. parapsilosis и C. guilliermondii значения МПК90, выходят за пределы категории чувствительности, а это есть тенденция на к формированию устойчивости к флуконазолу у этих видов Candida . 94 Таблица 15 – Чувствительность изолятов C. к parapsilosis противогрибковым препаратам в различных биосубстратах Биосубстрат (все Противогрибковые изоляты) препараты Периферическая кровь (268) Перитонеальная жидкость (24) Содержимое абсцесса (8) Плевральная жидкость (6) n исследуемых изолятов % исследуемых изолятов 60 22,3 1 4,2 3 37,5 1 16,7 Флуконазол Вориконазол Каспофунгин Флуконазол Вориконазол Каспофунгин Флуконазол Вориконазол Каспофунгин Флуконазол Вориконазол Каспофунгин % категорий Ч УЧ 85 0 98,3 0 100 0 100 0 100 0 100 0 У 15 1,7 0 0 0 0 67 67 100 100 100 100 33 33 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Таблица 16 – Географическое разнообразие C. parapsilosis по чувствительности к противогрибковым препаратам Федеральный округ n Флуконазол Вориконазол Каспофунгин Ч УЧ У Ч УЧ У Ч УЧ У СевероЗападный Центральный Южный Уральский Приволжский Сибирский 31 16 9 6 3 0 90 75 89 100 67 0 0 0 0 0 0 0 10 25 11 0 33 0 97 100 100 100 67 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 33 0 100 100 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Всего (%) 65 88 0 12 97 0 3 100 0 0 Наряду с этим, выявлено, что штаммы C. parapsilosis, выделенные из крови, чувствительны к флуконазолу – 85% случаев, к вориконазолу (98,3%), к каспофунгину (100%). Среди них наибольшее количество штаммов C. parapsilosis (31 штамм), были выделены в Северо-Западном ФО, были чувствительными к флуконазолу – 90%, к вориконазолу – 97%, к каспофунгину – все штаммы (таблица 15 и 16). 95 При определении чувствительности возбудителей ИК к противогрибковому препарату триазоловой группы нового поколения – позаконазолу, установлено, что все исследуемые штаммы Candida spp. были чувствительны. К настоящему времени для позаконазола критерии интепретации не определили, однако, по литературным данным признано, что МПК для чувствительных штаммов составляет 1мкг/мл (таблица 17). Таблица 17 – МПК позаконазола для Candida spp. Вид Candida spp. (n=322) Количество штаммов с соответствующими МПК (мкг/мл) 0,008 0,015 0,03 0,06 0,125 0,25 1 52 43 30 12 1 27 27 9 10 15 8 3 C. tropicalis ( n= 32) 5 17 6 4 C. krusei( n= 21) 1 2 7 7 1 C. guilliermondii ( n= 17) 2 9 2 1 3 C. dubliniensis (n= 2) 2 C. lusitaniae ( n= 3) 1 C. albicans (n = 139) C. parapsilosis (n=65) C. glabrata ( n= 37) 1 C. pararugosa ( n= 2) 2 2 C. lipolytica ( n= 1) 1 C. kefyr ( n= 1) 1 C. utilis ( n= 1) C. inconspicua ( n= 1) 1 1 Отмечено, что большинство исследуемых штаммов Candida spp. имели МПК 0,015-0,03 мкг/мл. и соответствуют категории «чувствительные» (рисунок 41). 96 Рисунок 41 – МПК позаконазола для различных видов Candida spp. Следует отметить, что 258 исследуемых клинических изолятов Candida spp. были выделены от пациентов при однократном заборе биосубстрата и 64 изолята - при повторных заборах. Выявление нескольких видов Candida у одних и тех же пациентов отмечали в 6 случаях. 97 Сведения о повторно выделеных клинических изолятах Candida приведены в таблице 18. Таблица 18 – Случаи повторного выделения Candida spp. от пациентов с инвазивным кандидозом Пациент Биосубстрат Количест во повторов Вид Candida spp. 1 кровь 3 C. glabrata 2 кровь 2 C. albicans 3 кровь 2 C. albicans 4 кровь 3 C. albicans 5 кровь 2 C. albicans 6 кровь 3 C. parapsilosis 7 1 C. albicans 8 ЦСЖ, перитонеальная жидкость кровь, биопсия 1 C. albicans 9 кровь 2 C. albicans 10 кровь 2 C. lusitaniae 11 кровь 3 C. krusei 12 кровь 2 C. albicans 13 кровь 3 C. albicans 14 кровь, содержимое абсцесса 1 C. parapsilosis 15 кровь, содержимое абсцесса 1 C. parapsilosis МПК флуконазола, вориконазола, каспофунгина, позаконазола (CLSI M27-A3), мкг/мл 16;0.125;0.06;0.06 16;0.06;0.06;0.06 16;0.06;0.06;0.06 2;0.06;0.25;0.03 2;0.06;0.25;0.015 1;0.06;0.06;0.03 1;0.06;0.015;0.015 0.25;0.015;0.25;0.015 0.5;0.06;0.125;0.015 0.5;0.125;0.125;0.015 0.5;0.03;0.125;0.03 0.5;0.03;0.125;0.015 2.0;0.06;1.0;0.03 (13.03.2013) 0.5;0.015;0.5;0.015 (14.03.2013) 16;0.06;1.0;0.015 (30.03.2013) 1.0;0.06;0.015;0.06 1.0;0.06;0.03;0.03 0.5;0.06;0.25;0.06 0.25;0.06;0.125;0.03 0.25;0.06;0.25;0.03 0.125;0.015;0.25;0.015 1.0;0.015;1.0;0.06 1.0;0.015;1.0;0.06 64.0;0.125;0.25;0.06 64.0;0.125;0.25;0.125 64.0;0.125;0.25;0.125 0.125;0.03;0.06;0.03 0.125;0.015;0.25;0.03 0.5;0.03;0.06;0.06 0.5;0.03;0.125;0.06 0.25;0.03;0.06;0.03 0.5;0.06;0.125;0.03 2.0;0.125;0.06;0.015 2.0;0.125;0.125;0.03 0.5;0.015;0.5;0.015 0.25;0.015;2.0;0.015 98 Продолжение таблицы 18 Пациент Биосубстрат Количество Вид Candida повторов spp. 16 C. albicans 17 кровь, перитоне- 1 альная жидкость кровь 3 18 кровь 2 C. glabrata 19 кровь 2 20 кровь 2 C. guilliermondii C. tropicalis C. albicans МПК флуконазола, вориконазола, каспофунгина, позаконазола (CLSI M27-A3), мкг/мл 0.5;0.03;0.5;0.015 0.5;0.125;0.5;0.015 0.25;0.06;0.125;0.125 0.5;0.03;0.125;0.06 1.0;0.03;0.125;0.06 32.0;0.03;0.015;0.03 16.0;0.03;0.015;0.03 64.0;1.0;0.5;0.25 64.0;1.0;0.5;0.25 1.0;0.06;0.06;0.03 0.5;0.06;0.06;0.03 Из 20 приведенных случаев повторного выделения биосубстрата от одного больного отмечено, что в 1 случае произошло выделение устойчивого к флуконазолу штамма C. parapsilosis, ранее чувствительного к данному антимикотику. Среди исследованных культур также было отмечено, что от одного пациента были случаи выделения нескольких видов Candida, характеризующимся различными МИК к противогрибковым препаратам (таблица 19). Таблица 19 – Случаи выделения нескольких видов Candida spp. от одного пациента Пациент Биосубстрат Вид Candida 1 кровь 2 кровь 1 кровь 2 3 кровь 1 C. lipolytica C. parapsilosis C. albicans C. parapsilosis C. albicans C. krusei C. albicans C. krusei C. albicans C. parapsilosis C. albicans кровь 2 4 кровь 1 кровь 2 содержимое абсцесса кровь 3 C. parapsilosis Даты выделения 12.08.2013 МИК флуконазола,вориконазола, каспофунгина, позаконазола (CLSI M27-A3), мкг/мл 8;0.125;0.25;0.25 0.5;0.015;2.0;0.06 0.25;0.03;0.125;0.015 2.0;0.03;0.125;0.015 0.5;0.03;0.125;0.06 64.0;0.06;0.25;0.25 0.5;0.03;0.125;0.03 64.0;0.06;0.25;0.06 1.0;0.06;0.125;0.03 0.5;0.03;0.125;0.015 1.0;0.06;0.25;0.03 13.08.2013 0.5;0.015;1.0;0.015 17.02.2012 11.03.2013 14.03.2013 05.06.2012 11.06.2012 29.07.2013 99 Продолжение таблицы 19 кровь 1 содержимое абсцесса кровь 2 5 плевральная жидкость кровь 6 C. albicans C. glabrata 02.08.2013 08.08.2013 0.5;0.03;0.25;0.03 16.0;0.03;0.06;0.03 C. guilliermondii C. albicans 19.08.2013 0.5;0.03;0.06;0.015 30.08.2013 0.25;0.03;0.25;0.03 C. glabrata 17.09.2013 16.0; 0.015; 0.015; 0.015 Следовательно, выявление нескольких видов Candida spp. у одного пациента является серьезной причиной для тщательного мониторирования чувствительности к противогрибковым препаратам. 4.2 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M44 - A Учитывая что, метод серийных разведений (CLSI M27–A3) отличается трудозатратностью, высокой себестоимостью и его использование в рутинной практике затруднено, для определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам мы использовали метод CLSI M44 – A, несложеный в исполнении и обладающий невысокой себестоимостью. Определение чувствительности проводили в отношении флуконазола и вориконазола (таблицы 20, 21). Таблица 20 – Результаты определения чувствительности штаммов Candida spp. к флуконазолу методом М44-А (n=141) Виды Candida C. albicans (n=54) C. parapsilosis (n=34) C. glabrata (n=16) C. tropicalis (n=11) C. guilliermondii (n=11) C. krusei (n=10) Кол-во штаммов, распределенных в соответствии с диаметром зон задержки роста (мм)/МПК (мкг/мл) к флуконазолу >19 / <8 15-18/16-32 <14/ >64 53 1 26 1 7 2 13 1 7 3 1 2 4 5 10 100 Продолжение таблицы 20 Виды Candida Кол-во штаммов, распределенных в соответствии с диаметром зон задержки роста (мм)/МПК (мкг/мл) к флуконазолу >19 / <8 15-18/16-32 <14/ >64 2 1 1 1 - C. pararugosa (n=2) C. utilis (n=1) C. lipolytica (n=1) C. kefyr (n=1) На основании полученных результатов выявлено, что 32,6% штаммов Candida spp. обладали сниженной чувствительностью к флуконазолу: 14,9% (21) штаммов – умеренной чувствительностью и 17,7% (25) штаммов – устойчивые. Изоляты C. albicans были чувствительны к флуконазолу – 98,2% (53) и 1,8% (1) устойчивы. Среди 34 штаммов C. parapsilosis 20,5% (7) были устойчивы к флуконазолу и 2,9% (1) – обладал умеренной чувствительностью; 45,5% (5) штаммов C. guilliermondii были устойчивы и 36,3% (4) – умеренно чувствительными к флуконазолу. Таблица 21 – Результаты определения чувствительности штаммов Candida spp. к вориконазолу методом М44-А (n=141) Вид Candida Кол-во штаммов, распределенных в соответствии с диаметром зон задержки роста (мм)/МПК (мкг/мл) к вориконазолу >17 / <1 14-16/2-4 <13/ >6 C. albicans (n=54) 54 - - C. parapsilosis (n=34) 28 3 3 C. glabrata (n=16) 15 1 - C. tropicalis (n=11) 10 - 1 C. guilliermondii (n=11) 8 1 2 C. krusei (n=10) 7 3 - C. pararugosa (n=2) 2 - - C. utilis (n=1) 1 - - C. lipolytica (n=1) 1 - - C. kefyr (n=1) 1 - - 101 Среди 141 штамма Candida spp. чувствительными к вориконазолу были 90,0%, сниженной чувствительностью обладали 10%. Штаммы C. albicans были чувствительны к вориконазолу. Среди 34 штаммов C. parapsilosis сниженная чувствительность была отмечена у 17,6% (6) культур. При сравнении результатов определения чувствительности к флуконазолу и вориконазолу по протоколам CLSI M27-A3 и CLSI M44-A были получены следующие данные (рисунок 42 а, 42 б). 100 98.1 98.1 92 90 83 80 70 60 % 50 M27-A3 40 M44-A 30 20 10 2.3 1.8 1.8 9 5.7 7.9 0 C. albicans Ч C. albicans У C. не-albicans C. не-albicans C. не-albicans Ч УЧ У Рисунок 42 а – Результаты сравнения чувствительности к флуконазолу, определенной методом M44-A и M27-A3 (n=141) 100 96.3 96.3 90 80 70 60 48.8 % 50 M27-A3 46.6 M44-A 40 29.5 30 21.6 21.6 27.3 20 10 3.7 3.7 0 C. albicans Ч C. albicans У C. не-albicans Ч C. не-albicans УЧ C. не-albicans У Рисунок 42 б – Результаты сравнения чувствительности к вориконазолу, определенной методом M44-A и M27-A3 (n=141) 102 Таким образом, достоверных различий между результатами обоих методов не выявлено (p >0,05). Однако, несмотря на простоту использования метода CLSI M44-A, во многих лабораториях используют автоматические анализаторы, поэтому для сравнения результатов определения чувствительности к азолам у изолятов Candida spp., полученных стандартными методами, мы использовали автоматический анализатор Vitek 2 Compact. 4.3 Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза с помощью анализатора Vitek2 Compact Оценку результатов исследования проводили в соответствие с критериями интерпретации референтного протокола CLSI M27-S4 (2012 г.). В период 2011 – 2014 гг. было исследовано 82 штамма Candida spp. При определении чувствительности к флуконазолу среди исследованных 82 штаммов Candida spp. установлено, что к категории «чувствительные» относятся 66 (80,4%) штаммов, к категории «устойчивые» – 16 (19,5%) и 7 (8,5%) – к категории с «промежуточной чувствительностью». При определении чувствительности к вориконазолу к категории «чувствительные» отнесли 74 (90,2%) штаммов Candida spp., к категории «устойчивые» – 4 (4,8%) и 4 (4,8%) к категории с промежуточной чувствительностью (таблица 22). 103 Таблица 22 – Сравнение результатов МИК флуконазола и вориконазола, полученных с помощью Vitek2 Compact и методом микроразведений по протоколу CLSI M27 – А3 (n=82) Виды и число изолятов Candida spp. (n=82) C. albicans (n=21) Противогрибковые препараты Флуконазол Вориконазол Флуконазол Вориконазол Флуконазол C. glabrata (n=7) C. guilliermondii (n=8) Вориконазол Флуконазол Вориконазол Флуконазол C. krusei (n=6) Вориконазол C. lipolytica *(n=1) C. lusitaniae *(n=4) Флуконазол Вориконазол Флуконазол Вориконазол Метод CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 CLSI M27A3 Vitek2 МПК (мкг/мл) Диапазо 50% 90% н 0,25-128 1 64 Среднее геометри -ческое 2,8 % совпа дения 90,3 1-64 0,015-8 1 0,06 32 0,5 2,3 0,07 0,125-8 0,25-32 0,125 0,5 0,25 2 0,14 3,4 1-8 0,015-8 1 0,03 1 0,125 1,1 8 0,125 8-16 0,125 16 0,125 16 0,125 14,5 94 90,5 95,2 100 1-8 2 0,015-0,5 0,03 8 0,125 2,43 0,06 0,1250,25 2-64 0,125 0,125 0,14 4 64 10,3 100 100 2-64 0,03-8 2 0,125 64 1 8,7 2 0,125-8 64-128 0,125 64 4 64 5 71,8 100 100 4-32 0,125-1 8 0,25 16 0,5 11,3 1 0,125 8 0,125 8 0,125 8 0,125 8 83 100 2 0,125 2 0,125 2 0,125 2 0,125 100 0,125 0,25-1 0,125 0,5 0,125 1 0,125 1 1-2 0,015 1 0,015 2 0,015 1,4 0,015 100 100 0,125 0,125 0,125 0,125 104 Продолжение таблицы 22 Виды и число изолятов C. parapsilosis (n=23) C. pararugosa * (n=1) Противогрибковые препараты Флуконазол Вориконазол Флуконазол Вориконазол Флуконазол C. tropicalis (n=9) Вориконазол C. inconspicua * (n=1) Флуконазол Вориконазол Флуконазол C. utilis *(n=1) Вориконазол * – CLSI M27-S3 Сравнением Метод Диапазон 50% 90% Среднее геометри -ческое CLSI M27-A3 Vitek2 CLSI M27-A3 Vitek2 CLSI M27-A3 Vitek2 0,25-64 1 64 2,2 1-64 0,015-1 1 0,03 64 0,125 2,6 0,05 CLSI M27-A3 Vitek2 CLSI M27-A3 Vitek2 CLSI M27-A3 Vitek2 CLSI M27-A3 Vitek2 CLSI M27-A3 Vitek2 CLSI M27-A3 Vitek2 CLSI M27-A3 Vitek2 результатов, МПК (мкг/мл) % совпа дения 91,3 83 0,125-1 0,5 0,125 0,5 0,5 0,5 0,168 0,5 1 1 1 1 0,125 0,125 0,125 0,125 100 100 0,125 0,25-8 0,125 0,5 0,125 2 0,125 1 1-2 0,03-0,25 1 0,06 1 0,25 1 0,07 89 78 0,125 0,25 0,125 0,25 0,125 0,25 0,125 0,25 16 0,015 16 0,015 16 0,015 16 0,015 0,125 64 0,125 64 0,125 64 0,125 64 0 100 0. 2 0,015 2 0,015 2 0,015 2 0,015 0,125 0,125 0,125 0,125 100 полученных с помощью методов микроразведений по протоколу CLSI M27-A3 и Vitek 2Compact (таблица 22), показано, что большинство исследованых изолятов в отношении флуконазола обладали сниженной чувствительностью и демонстрировали МПК90 – 32 мкг/мл и 64 мкг/мл для Vitek 2 и CLSI M27-A3, соотвественно. Значения МПК вориконазола для данных методов составили соотвественно, 0,25 мкг/мл и 0,5 мкг/мл. Также было отмечено несовпадение результатов 105 определения чувствительности к флуконазолу в отношении штаммов редких видов – C. utilis и C. inconspicua. Поскольку оценку результатов Vitek 2 проводят по критериям интепретации протоколов CLSI M27–S3 и CLSI M27–S4, мы выяснили насколько важно своевременное обновление критериев, заложенных в приборе (таблица 23, 24). Таблица 23 – Сравнение критериев интерпретации CLSI M27 S3 (2008г.) и CLSI M27 S4 (2012г.) для МПК флуконазола (Vitek 2) МПК флуконазола (мкг/мл) 1 2 4 8 16 32 64 1-64 Виды Candida spp. C. albicans (n=19) C. parapsilosis (n=15) C. tropicalis (n=8) C. lusitaniae (n=2) C. glabrata (n=2) C. pararugosa (n=1) C. guilliermondii (n=4) C. glabrata (n=3) C. parapsilosis (n=2) C. utilis (n=1) C. tropicalis (n=1) C. albicans (n=1) C. lipolytica (n=1) C. lusitaniae (n=2) C. krusei (n=1) C. parapsilosis (n=1) C. glabrata (n=2) C. krusei (n=3) C. guilliermondii (n=1) C. krusei (n=2) C. inconspicua (n=1) C. parapsilosis (n=2) C. krusei (n=1) C. parapsilosis (n=3) C. guilliermondii (n=3) n=82 19 15 8 2 2 1 4 3 2 1 1 1 1 2 1 1 2 0 1 0 0 0 0 0 0 67 Категории чувствительности CLSI M27-S3 CLSI M27-S4 2008 г. 2012г. Ч УЧ У Ч УЧ У 0 0 19 0 0 0 0 15 0 0 0 0 8 0 0 0 0 н.д. 0 0 0 2 0 0 0 н.д. 0 0 н.д. 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 0 н.д. 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 н.д. 0 0 н.д. 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 2 0 0 3 0 0 3 0 0 н.д. 0 2 0 0 2 1 0 н.д. 2 0 0 0 2 0 1 0 0 1 0 3 0 0 3 0 3 н.д. 3 12 46 8 12 Таким образом, в соответствиии с критериями 2008 года, при определении чувствительности к флуконазолу среди исследованных 82 106 штаммов Candida spp., установлено, что к категории «чувствительные» относятся 67 (81,8%) штаммов, к категории «устойчивые» – 12 (14,6%) и 3 (3,6%) – к категории с «промежуточной чувствительностью». Отмечено, что процент несовпадения между критериями 2008 и 2012гг. составил 16% (11/66). Таблица 24 – Сравнение критериев интерпритации CLSI M27 S3 (2008г.) и CLSI M27 S4 (2012г.) для МПК вориконазола МПК вориконазола (мкг/мл) 0,125 0.25 0.5 1 4 8 0,125-8 Виды Candida spp. C. albicans (n=21) C. parapsilosis (n=17) C. tropicalis (n=9) C. krusei (n=7) C. glabrata (n=6) C. guilliermondii (n=4) C. lusitaniae (n=4) C. pararugosa (n=1) C. lipolytica (n=1) C. utilis (n=1) C. inconspicua (n=1) C. guilliermondii (n=1) C. glabrata (n=1) C. parapsilosis (n=1) C. parapsilosis (n=3) C. parapsilosis (n=1) C. guilliermondii (n=2) C. guilliermondii (n=1) n=82 Категории чувствительности CLSI M27-S3 CLSI M27-S4 2008 г. 2012г. Ч УЧ У Ч УЧ У 21 17 9 7 6 4 4 1 1 1 1 1 1 1 3 1 0 0 79 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 3 21 17 9 7 1 0 1 56 0 0 0 0 н.д. н.д. н.д. н.д. н.д. н.д. н.д. н.д. н.д. 0 3 0 н.д. н.д. 3 0 0 0 0 0 0 1 1 При определении чувствительности к вориконазолу, к категории «чувствительные» отнесли 79 (96,3%) штаммов Candida spp. и 3 (3,7%) - к категории «устойчивые» (по критериям 2008 года). С связи с тем, что у некоторых видов критерии чувствительности не установлены к вориконазолу, различия между критериями 2008 и 2012 гг. составил 6,6% (4/60). 107 Таким образом, определение чувствительности и выбор соответствующего метода имеют важное клиническое значение, так как, результаты определения чувствительности возбудителей ИК диско- диффузионным методом (CLSI M44 – A) и с помощью автоматического анализатора Vitek2Compact (в соответствии с новыми критериями интерпретации) были достоверно сопоставимы с референтным методом разведений в жидких питательных средах (CLSI M27 – A3), что позволяет рекомендовать оба метода для применения в рутинной клинической практике, CLSI M44 – A – в качестве основного, в связи с тем, что он также является стандартным методом как и CLSI M27 – A3, а автоматический анализатор Vitek2Compact - в качестве альтернативного метода. 108 ГЛАВА 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основными возбудителями инвазивного кандидоза (ИК) являются C. albicans, C. parasilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, реже другие виды. В последнее десятилетие установлено, что по уровню заболеваемости (200000 пациентов ежегодно) в мире инвазивный кандидоз занимает второе место среди микозов противогрибковых и, несмотря препаратов, на применение характеризуется современных стабильно высокой летальностью 46 –75% [156]. В связи с тем, что до 50 - 75 % посевов крови от больных ИК являются отрицательными, а методы идентификации Candida spp. позволяют получить результат только через 48 часов и более, проблема видовой идентификации и выбора ее методов представляется актуальной [88]. С учетом нарастания резистентности микромицетов к противогрибковым препаратам не чувствительности менее к серьезной проблемой противогрибковым явлется препаратам, а определение также выбор соответствующих методов [23]. В связи с этим, представляется актуальным изучение этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза и чувствительности возбудителей к антимикотикам на территории России с использованием современных методов диагностики. В проведенном нами многоцентровом исследовании, посвященном изучению особенностей возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в период 2011–2014 гг. в России, впервые изучена этиология ВБИК с применением современных методов видовой идентификации грибов (MALDI-TOF масс-спектрометрии и ДНК-секвенирования). Изучены 322 клинических изолята Candida spp., выделенных от 258 пациентов из 37 стационаров в 12 городах России (6 Федеральных округов). Исследование типов биоматериала (кровь и другие в норме стерильных биосубстраты), было обнаружено, что в 83,2% случаев изоляты Candida spp. были выделены из крови, в 7,5% – из перитонеальной жидкости. Зарубежные исследователи также отмечали, что изоляты Candida spp. из стерильных в 109 норме биосубстратов при ВБИК, чаще всего выделяются из крови [58]. Так, в многоцентровом исследовании SENTRY (2008-2009 гг.) 65% штаммов (2085 исследуемых культур Candida spp.) были выделены из крови [159]. Некоторые исследователи также отмечали, что Candida spp. высевали из крови в два раза чаще, чем из перитонеальной жидкости, в отделениях реанимации и интенсивной терапии [26]. Видовую идентификацию исследуемых штаммов Candida spp. ранее в мире проводили в основном с использованием морфологических и биохимических методов. Так, в исследовании, проведенном более 10 лет назад в РФ [9] при видовой идентификации этиологии инвазивного кандидоза в ОРИТ г. СанктПетербурга (1998-2003 биохимических методов гг.) с (тест использованием на ростковые морфологических трубки, и тест-системы Fongiscreen, AUXACOLOR, API 20C AUX) было выделено 117 штаммов Candida spp., при этом неидентифицировано до вида было 8,5% изолятов. Однако, в последние годы молекулярно-биологические методы (ДНКсеквенирование, MALDI-TOF масс-спектрометрия) тоже начали внедрять в практику микробиологических лабораторий. Определение видового спектра возбудителей ВБИК в нашем исследовании проведено методами ДНК-секвенирования, MALDI-TOF массспектрометрии и тест-системой AUXACOLOR2. ДНК-секвенирование является рефентным методом видовой идентификации микроорганизмов; и MALDI-TOF масс-спектрометрия, по данным ряда исследователей, также является методом, приближенным по точности к референтному, но превосходит по быстроте идентификации. Однако, сравнительных исследований такого рода проведено относительно мало и на ограниченном количестве штаммов. Результаты идентификации изолятов Candida spp. (97 штаммов) в нашем исследовании, полученные двумя методами (ДНК-секвенирование и MALDI-TOF масс-спектрометрия) совпали в 100% случаев. По данным 110 тайваньских ученых, при сравнительном исследовании результатов видовой идентификации 142 штаммов Candida spp. вышеуказанными методами, обнаружили совпадение в 98,6% случаев В [134]. сравнительном исследовании, проведенном в Кувейте, с использованием анализаторов Vitek МS, Bruker Biotyper МS и ДНК–секвенирования установлено, что методом MALDI-TOF масс-спектрометрии точно идентифицировано 86,7% изолятов. Не удалось определить 1 штамм C. famata, 2 штамма C. kefyr, 1 штамм C. guilliermondii. Были затруденения с идентификацией криптических видов комплекса C. parapsilosis [92]. Совпадение результатов по идентификации Candida spp. MALDI-TOF масс-спектрометрией с другими биохимическими системами (Vitek 2) составило 93,2% [68]. Голландские исследователи при изучении 19 изолятов клинически значимых дрожжей (8 видов из двух родов), идентифицированных методом ДНК-секвенирования, показали что, MALDI-TOF масс-спектрометрией и биохимической тест-системой API определено 94, 7% [161 ]. При исследовании 322 штаммов Candida spp. с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии и тест-системы AUXACOLOR2 нами обнаружено, что совпадение результатов идентификации составляет 93,2%. В аналогичном исследовании в Германии в 2010 г. совпадение между результатами MALDITOF масс-спектрометрии и AUXACOLOR2 составило 96,9% [86]. Наибольший процент несовпадений в нашем исследовании возникал из-за ошибочной идентифицикации некоторых изолятов Candida spp. тестсистемой AUXACOLOR2. Так, 11 штаммов C. albicans были идентифицированы как C. dubliniensis. Кроме того метод AUXACOLOR2 не обеспечивал выявление редких видов (C. utilis, C. inconspicua, C. bracarensis, C. pararugosa). Таким образом, тест-системой AUXACOLOR2 определили, что 39,7% клинических изолятов принадлежли к C. albicans, и 59,7% – являются представителями других видов Candida, у 0,6% штаммов вид не определен. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии установлено, что 43.2% клинических изолятов принадлежали к C. albicans, и 56.8% были 111 представителями других видов Candida. Данным методом также была уточнена видовая принадлежность у штаммов неидентифицированных тестсистемой AUXACOLOR 2 – C. utilis и C. lusitaniae. Состав C. не-albicans видов в нашем исследовании был представлен следующими патогенами: 20,2% – C. parapsilosis, 11,5% – C. glabrata, 9,6% – C. tropicalis, 6,2% – C. krusei, 5,3% – C. guilliermondii, 4% – остальные редкие виды (С. bracarensis, C. kefyr, C. utilis, C. lipolityca. C. inconspicua, C. dubliniensis, C. lusitaniae). Всего было определено 14 видов возбудителей ВБИК. Выявленное нами соотношение видов C. albicans / C. не-albicans (43,2%/56,8%) в структуре возбудителей ИК, выделенных их всех в норме стерильных биосубстратов, совпадает с рядом зарубежных исследований, которые были проведены ранее или одновременно с нашей работой. В глобальном исследовании SENTRY (79 центров из 4 регионов мира), проведенном в период 2008-2009 гг. при изучении этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза, отмечено, что в спектре видов Candida spp. доля C. albicans составила 48,4%, а C. неalbicans – 51,6% [33]. Сообщается, что в Испании, выявлено аналогичное соотношение: процент штаммов C. albicans был равен 45,4, C. не-albicans 54,6. Помимо этого, было отмечено сходство и среди C. не-albicans видов; как и в России, лидирующую позицию в Испании занимала C. parapsilosis – 24,9%, далее следовали 13,4% - C. glabrata и 7,7% - C. tropicalis [65]. Из крови в нашем исследовании было выделено 14 видов Candida spp., где содержание C. albicans составляло 38,8%, C. не-albicans виды – 61,2%, в том числе и редкие виды. В других стерильных биосубстратах, в среднем, было обнаружено от 2 до 5 видов Candida spp., причем преобладал C. albicans (р<0.05). По результатам международного исследования PATH доля C. albicans в крови составила 42,1%, видовой спектр был представлен 10 видами [66]. В Бельгии (2010 – 2012 гг.) в рамках отдельного госпиталя выявлено стабильное соотношение возбудителей ИК C. albicans / C. неalbicans видам как 37% / 63% [152]. 112 Таким образом, мы, наравне с рядом зарубежных исследователей выявили тенденцию к снижению встречаемости C. albicans вида и увеличения распространенности C. не-albicans видов как возбудителей инвазивного кандидоза. Нами проанализированы изменения видового состава возбудителей ВБИК на протяжении трех лет исследования. Выявлено, что имеется снижение доли C. albicans среди возбудителей ВБИК. Наряду с этим, имело место возрастание C. не-albicans видов, причем за счет C. parapsilosis (20,2%), тогда как уровень C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei (8,2%, 8,2% и 6,1%) оставался стабильным. По данным испанских ученых, в 2009 году в Испании, уровень вида C. albicans составлял 43%, C. parapsilosis – 29 %, а C. tropicalis – 10% [131]. В аналогичный период в Бразилии процентное соотношение видов было иное: C. albicans – 41%, C. tropicalis – 20 %, C. parapsilosis – 15%, а в Тайланде: C. albicans – 39%, C. tropicalis – 28%, C. glabrata – 22% [151]. В Греции доля C. parapsilosis составила 43,9 % (с 2007 – 2012 г.) [87]. В США в 2012 г. напротив на втором месте находилась C. glabrata – 29%, также как и в Дании и Норвегии, где доля C. glabrata составляет 21,1% и 20,3% соответственно [88]. Нами была выявлена географическая вариабельность видового состава возбудителей ВБИК в разных федеральных округах России. Доля C. albicans в Уральском (57,8%) и Сибирском (75%) федеральных округах в структуре возбудителей ИК была достоверно выше, чем в Южном (36%) и СевероЗападном (37%) федеральных округах (р < 0.05). По результатам нашего исследования было выявлено, что доли C. albicans в структуре возбудителей ИК в Иркутске и Ростове на Дону, достоверно выше были в Иркутске, тогда как между крупными городами (Санкт-Петербург и Москва) достоверных различий в видовом спектре возбудителей ИК не выявлено. В период 2003 – 2008 гг. в рамках международного проспективного исследования ARTEMIS DISK (127 центров, 39 стран) C. albicans была причиной кандидемии в 62% случаев, по сравнению с периодом в 1997 по 113 1998 гг. доля C. albicans была выше, 73,3% [143]. В Дании в период с 2005 по 2011 гг. отмечали снижение доли C. albicans в структуре кандидемии с 69,8 % до 63% [115, 147]. В США с 1999 по 2012 гг. обнаружили значительное снижение уровня C. albicans с 52% до 38% [86, 149, 155], в Испании с 2005 по 2013 гг. доля C. albicans снизилась с 51% до 45,4 % [82]. Различия в этиологии ВБИК могут быть обусловлены рядом факторов: географией региона, типом стационара, фоновыми заболеваниями, спектром противогрибковых препаратов и выбранным методом идентификации возбудителей [37]. Следует заметить, что обсуждаемые выше результаты получены различными методами идентификации возбудителей ВБИК. При этом методы молекулярной биологии (MALDI-TOF масс-спектрометрия, ДНКсеквенирование) использовали редко. Учитывая, что референтный метод идентификации грибов (ДНК-секвенирование) является трудоемким, длительным по времени, дорогостоящим, в отличие от MALDI-TOF массспектрометрии, сегодня, представляется нецелесообразным рекомендовать его для применения в повседневную микробиологическую практику (таблица 25). Таблица 25 – Краткая характеристика используемых методов диагностики. Вид исследования ДНК- MALDI-TOF мс AUXACOLOR2 секвенирование Время исследования (расчет на 1 культуру) 48 часов 10 минут 48 часов Себестоимость исследования (в зависимости от стоимости ~2000 р. ~10 руб ~750 р. оборудования и расходных материалов) Представителей всех обнаруженных видов Candida spp. (C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii, С. bracarensis, C. kefyr, C. utilis, C. lipolityca, C. inconspicua, C. dubliniensis, C. pararugosa, C. lusitaniae) помимо биохимических характеристик изучили 114 микро и - макроскопически. макроморфологические Обнаружено, характеристики совпали что с микро- приведенными и в определителях [29, 95]. Однако следует заметить, что некоторые виды имели сходные характеристики и по морфологии и по биохимическим свойствам, в связи, с чем их можно было идентифицировать с ошибкой. Поэтому мы уточняли видовую спектрометрии. И идентификацию следовательно методом в любой масс- MALDI-TOF лаборатории только фенотипический метод видовой идентификации возбудителей ВБИК нельзя считать достаточным. Кроме определения видов возбудителей ВБИК, важным является выяснение чувствительности штаммов возбудителей к антимикотическим препаратам, так как в последние годы все чаще сообщают о снижении чувствительности Candida spp. к флуконазолу. Французскими учеными было обнаружено, что чувствительность к этому антимикотику снизилось на 17% [72]. По данным глобального исследования ARTEMIS DISK в России (20032008 гг.) чувствительность возбудителей ИК составила 78% [15]. Первые результаты в рамках определения чувствительности возбудителей ИК к противогрибковым препаратам в России были получены в г. Санкт-Петербурге в период 1998 – 2004 гг. Методом CLSI M44-A определена чувствительность к флуконазолу у 50 штаммов Candida spp. Было обнаружено, что чувствительными были 58% изолятов, а 42% обладали сниженной чувствительностью (34% были устойчивыми к флуконазолу и 8% – умеренно-чувствительными) [124]. При проведении референтных антимикотикам: метода нашего исследования определения стандартные – CLSI мы использовали чувствительности M27-A3, CLSI два грибов к M44-A и микробиологический анализатор Vitek2 Compact. В соответствии с нашими данными, полученными по протоколу CLSI M27-A3, чувствительными к флуконазолу были 74,5% изолятов Candida spp. (n=322), умеренночувствительными - 13,4 % и 12,1% – устойчивыми. При этом, обнаружено 115 что C. albicans в 97,1% случаев были чувствительны к флуконазолу, умеренно-чувствительны в – 0,7 % и 2,2% – устойчивыми. Таким образом, вид C. albicans сохраняет высокую чувствительность к флуконазолу. Для C. не-albicans видов чувствительность к флуконазолу составляет 58% исследуемых штаммов; умеренно-чувствительными были 23% и 19% штаммов – устойчивыми. К вориконазолу чувствительность штаммов Candida spp. составила 97,5%, а доля умеренно-чувствительных и устойчивых составила – 0,9 % и 1,6%, соответственно. При этом 99,7% штаммов C. albicans были чувствительными к вориконазолу, а среди C. не-albicans – 95,7% штаммов, тогда как доля умеренно-чувствительных к вориконазолу составила 1,6%, устойчивых – 2,7%. Также было установлено, что 2 штамма C. guilliermondii, 2 штамма C. parapsilosis, 1 штамм C. tropicalis и 1 штамм C. albicans были устойчивы и к флуконазолу, и к вориконазолу. Таким образом, среди штаммов Candida spp. 1,9% были полирезистентны к азоловым антимикотикам. Наряду с этим, при изучении МПК противогрибковых препаратов, МПК50, МПК 90 было выявлено, что к флуконазолу у C. parapsilosis и C. guilliermondii начинает формироваться внутривидовая устойчивость. Такая же тенденция, как и в России была отмечена в исследовании в одном из госпиталей Бразилии в период исследования с 1998 по 2005 г [151]. В других исследованиях среди 1029 изолятов C. guilliermondii (127 медицинских центров) было отмечено снижение чувствительности к флуконазолу – до 25% штаммов [36]. В Турции при проведении исследования (2008 – 2009 гг.) по определению чувствительности возбудителей ВБИК к флуконазолу методом CLSI M27-A3 установили, что Candida spp. были чувствительными в 81,1%, умеренно-чувствительными – 8,1 % и 10,8% - устойчивыми. В отношении вориконазола доли умеренно-чувствительных и устойчивых были по 0,9 % [61]. Таким образом, процентное соотношение категорий чувствительности 116 видов Candida spp., полученных нами, совпадает с данными, полученными другими исследователями. К каспофунгину штаммов со сниженной чувствительностью нами обнаружено не было. При определении чувствительности к позаконазолу мы ориентировались на значение МПК90 > 1 мкг/мл, также как и большинство зарубежных исследователей, В нашем исследовании МПК90 позаконазола составило 0,125 мкг/мл. В исследовании, проведенном в Бразилии, МПК90 позаконазола составляла 0,25 мкг/мл. [43]. При определении чувствительности Candida spp к противогрибковым препаратам диско-диффузионным методом - протокол CLSI M44-A (141 клинический изолят) мы выявили, что 67,4% штаммов были чувствительны к флуконазолу, 32,6% – обладали сниженной чувствительностью. Результаты, полученные в соответствии с двумя стандартными протоколами (CLSI M27A3, критерии 2012 г. и CLSI M44-A) были сравнимы. Количество чувствительных штаммов C. albicans составило 96,3% и 3,7% - устойчивых к флуконазолу. Среди C. не-albicans видов чувствительными были 48,8 % (CLSI M27-A3) и 46,6% (CLSI M44-A), умеренно-чувствительными 21,6% (оба метода), устойчивыми – 29,5% и 27,3%. Чувствительных штаммов C. albicans к вориконазолу было обнаружено 98,1%, а устойчивых – 1,8% по обоим протоколам. Среди C. не-albicans видов чувствительными к вориконазолу было 92% (CLSI M27-A3) и 83% (CLSI M44-A), умеренночувствительных – 2,3% и 9%, устойчивых – 5,7% и 7,9%. Достоверных различий в результатах, полученных двумя методами, не выявлено. Для определения чувствительности к противогрибковым препаратам использовали также коммерческий метод Vitek2 Compact (82 изолята). Сопоставимость результатов, полученных с использованием протокола CLSI M27-A3 и метода Vitek2 Compact (по критериям интепретации CLSI M27-A3, 2012 г.) составляла от 78 до 100% в зависимости от вида изолята. Однако при сравнении результатов по критериям CLSI M27-A3, 2008 г. были отмечены несовпадения (12% в отношении флуконазола и 4,8% в отношении 117 вориконазола). В исследовании американских ученых в 2011 г., при сравнении результатов определения чувствительности к каспофунгину и позаконазолу методами CLSI M27-A3 и Vitek2 Compact, обнаружено, что совпадение для каспофунгина составило 99,5%, для позаконазола – 95,6%. Однако, в зависимости от вида Candida spp. вариации в совпадении по категориям чувствительности составляли от 30% (C. krusei) до 100% (C. guilliermondii, C. parapsilosis) для каспофунгина [108, 109]. Совпадение результатов чувствительности к флуконазолу и вориконазолу методами CLSI M27-A3, Vitek2 Compact, E-test в исследовании французских ученых (2010 г.) варьировало от 25% до 100% (25% – C. glabrata) [22]. В крупном проспективном исследовании FUNGINOS (Швейцария, 2004-2009 гг.), анализируя 1090 изолятов крови, сравнивали результаты их чувствительности по критериям интерпретации EUCAST и CLSI M27-A3 (2008 и 2012 гг.). Для C. albicans не было выявлено значимых отличий МИК флуконазола, вориконазола и каспофунгина, 98% штаммов были чувствительны. Среди C. не-albicans наблюдали возрастание устойчивых изолятов среди C. tropicalis и C. parapsilosis для азолов, а также C. glabrata и C. krusei для каспофунгина в соответствии с новыми критериями EUCAST и CLSI 2012 г. по сравнению с критериями CLSI 2008 г. [40]. Следовательно, на основании наших исследований можно заключить, что в качестве метода выбора определения чувствительности к противогрибковым препаратам возбудителей ВБИК в микробиологической практике можно рекомендовать диско-диффузионный метод (протокол M44A) и микробиологический анализатор Vitek2 Compact с критериями CLSI M27-A3 (2012 г). Метод разведения в жидких питательных средах (протокол CLSI M27-A3), в связи с его трудоемкостью, можно рекомендовать к использованию в основном в референтных лабораториях. Учитывая возрастающее значение комплекса видов C. parapsilosis при инвазивном кандидозе мы проанализировали 65 масс-спектро-профилей этого комплекса. Были выявлены только штаммы, принадлежащие к виду C. 118 parapsilosis sensu stricto, криптические виды C. metapsilosis, C. orthopsilosis не были обнаружены. Однако, в зарубежных исследованиях отмечают обнаружение и криптических видов комплекса C. parapsilosis – C. orthopsilosis, C. metapsilosis как методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, так и рефентным методом (ДНК-секвенирование). В Италии при сравнительном исследовании комплекса C. parapsilosis, в который входят такие виды как C. metapsilosis, C. orthopsilosis и собственно C. parapsilosis, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и AFLP (молекулярно- генетический метод) были выявлены все виды с высокой степенью точности, входящие в комплекс. Путем проведения кластерного анализа нами выявлены сходные штаммы от разных пациентов – изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14, 15 – г. Тюмень, №№ 24, 42 – г. Санкт-Петербург (в одном отделении и в один промежуток времени). Также выявлено, что в субкластере № 2 располагаются устойчивые к флуконазолу изоляты №№ 21 и 39, а в субкластере №3 находятся изоляты №№ 24 и 41, обладавшие устойчивостью также и к вориконазолу (изолят № 41). Следует заметить, что поскольку среди исследуемых штаммов C. parapsilosis были выявлены сходные масс-спектры штаммов, к тому же имевшие устойчивость к азоловым препаратам в одном и том же субкластере, мы использовали ДНК – секвенирование в качестве метода поиска полиморфизма у данных устойчивых штаммов. Полиморфизм в регионе D1/D2 гена 28S рРНК, в том числе и множественный, был выявлен у чувствительных к флуконазолу и вориконазолу штаммах C. parapsilosis, у устойчивых штаммов полиморфизма не наблюдали. Следовательно, изучение в дальнейшем полиморфных вариантов генов Candida spp. будет перспективным при разработке быстрых методов определения устойчивости возбудителей внутрибольничного противогрибковым препаратам. инвазивного кандидоза к 119 ВЫВОДЫ 1. Этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ (2011– 2014 гг.) представлена следующими основными видами Candida (C. albicans – 43,2%, C. parapsilosis – 20,2%, C. glabrata – 11,5%, C. tropicalis – 9,6%, C. krusei – 6,2%, C. guilliermondii – 5,3%) и редкими (C. lusitaniae – 1,3%, C. dubliniensis – 0,6%, C. pararugosa – 0,6%, C. bracarensis – 0,3%, C. kefyr – 0,3%, C. lipolytica – 0,3%, C. utilis – 0,3%, C. inconspicua – 0,3%). 2. Установлено, что в этиологической структуре основных возбудителей инвазивного кандидоза возросла доля C. не-albicans (с 46% в 2012 г. до 67,2% в 2014 г.), при этом увеличилась доля C. parapsilosis (9,8% в 2012 г. против 27,8% в 2014 г., р <0,05). Уровень C. albicans достоверно выше в Сибирском (75%) и Уральском (57,8%) федеральных округах, р<0,05, по сравнению с другими федеральными округами (СевероЗападный – 37%, Южный – 35%). 3. MALDI-TOF масс-спектрометрия является методом выбора для определения вида возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза. 4. Чувствительными к флуконазолу были 97% штаммов C. albicans, к вориконазолу - 99,7%. Среди штаммов C. не-albicans видов чувствительными к флуконазолу были 58%, к вориконазолу – 95,7 %. К каспофунгину устойчивых штаммов не обнаружено. 5. Диско-диффузионный метод CLSI M44-A является методом выбора для определения кандидоза к чувствительности противогрибковым микробиологических лабораторий. возбудителей препаратам инвазивного в практике 120 Алгоритм диагностики возбудителей инвазивного кандидоза ПОСЕВ КРОВИ И ДРУГИХ СТЕРИЛЬНЫХ В НОРМЕ БИОСУБСТРАТОВ (аназаторы гемокультур) альтернатива среда Сабуро, системы культивирования крови ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ CANDIDA SPP. ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ MALDI-TOF масс-спектрометрия – метод выбора ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ПРОТИВОГРИБКОВЫМ ПРЕПАРАТАМ CLSI M44-A -метод выбора альтернатива биохимические тестсистемы, автоматические анализаторы альтернатива Vitek 2 Compact CLSI M27-A3-в референс лабораториях 121 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. У пациентов с признаками инвазивного кандидоза проводить исследование всех стерильных в норме биосубстратов (кровь, ЦСЖ, перитонеальная жидкость) на наличие грибов рода Candida. 2. Обязательно определять до вида все культуры Candida spp., выделенные из различных локализаций от пациентов с инвазивным кандидозом современными методами. Для точной идентификации C. не-albicans видов рекомендуется использовать метод MALDI-TOF масс-спектрометрии. 3. Обязательно определять чувствительность всех культур Candida spp., выделенных из стерильных противогрибковым препаратам. в норме биосубстратов к 122 ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ 1. Анализ главных компонент белков масс-спектра (PCA-анализ) с построением PCA-дендрограмм является перспективным для внутривидового типирования штаммов Candida spp. и анализа эпидемиологического процесса в отделениях реанимации и интенсивной терапии, а также изучения способности штаммов к образованию биопленок. 2. Разработка новых быстрых некультуральных методов обнаружения Candida spp. в крови и определения их чувствительности на основе геномики и протеомики. 123 СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВБИК – внутрибольничный кандидоз ДК – дрожжевая клетка ДМСО – диметилсульфоксид ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИД – идентификация ИК – инвазивный кандидоз MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time-of-Flight Mass-spectrometry) – MALDI-TOF масс-спектрометрия (Матричноассоциированная лазерная десорбция/ионизация – время-пролетная массспектрометрия) МПК – минимальная подавляющая концентрация МСП – масс-спектро-профиль ПЦР – полимеразная цепная реакция рРНК – рибосомальная рибонуклеиновая кислота ЦСЖ – церебро-спинальная жидкость У – устойчивый УЧ – умеренно-чувствительный Ч – чувствительный ATCC (American Type Culture Collection) - американская коллекция типовых культур BSL (BoiSafety Level) – уровень биологического риска CLSI ( Clinical and Laboratory Standards Institute) – Институт клинических и лабораторных стандартов EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) – Европейский комитет по исследованию противомикробной чувствительности РСА (Principal cluster analysis) – анализ главных компонент RPMI – среда для культур клеток spp. – виды (грибов) 124 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Баранов В.С. Геномика на пути к предиктивной медицине // Acta Nature. – 2009. – №3. – 77-86 c. 2. Выборнова И. В. Определение чувствительности Candida spp. к флуконазолу двумя вариантами диско-диффузионного метода / И. В. Выборнова, Н. В. Васильева, Т. С. Богомолова // Проблемы медицинской микологии. – 2007. – Т.9, №2. – С. 5-7. 3. Диагностика микозов/ Р. А. Аравийский, Н. В. Васильева, Н. Н. Климко // СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2004. – 186 с., ил 4. Диагностика и лечение микозов в отделениях реанимации и интенсивной терапии. Российские национальные рекомендации. / А.Б. Бакиров, А. В. Веселов, А. В. Власенко и др. (под ред. Климко Н. Н.) // Москва: Изд.дом «Компания Боргес», 2010 г. – 92 с. 4. Идентификация возбудителей микозов с помощью секвенирования ДНК / Ю. В. Михайлова, М. В. Руднева, Г. А. Чилина и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т. 15, №2. – С. 105-106. 5. Микологические культуральные исследования. Методические рекомендации / Н. В. Васильева, Н. П. Елинов, Т. С. Богомолова и др. // ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова. – СПб. – 2013 г. – 40с. 6. Михайлова Ю.В. Молекулярная идентификация представителей Aspergillus spp. из Российской Коллекции Патогенных Грибов / Ю. В. Михайлова, Г. А. Чилина, А. Г. Полищук // Проблемы медицинской микологии. – 2012. – Т. 14, №4. – С. 46-49. 7. Мухитов А.Р., Архипова С.С. Никольский Е.Е. Современная световая микроскопия в биологических и медицинских исследованиях. М.: Наука, 2011.-140с. 8. Патогенные и условно-патогенные макро- и микромицеты как объекты царства грибов (Fungi), их характеристика с учётом требований международного кодекса ботанической номенклатуры: 125 учебное пособие, выпуск I. / Н.П. Елинов, Н. В. Васильева, А. А. Маметьева и др. (под ред. Елинова Н. П. // СПб.:КОСТА, 2011. – 64 с. 9. Пестова, Л.А. Кандидемия и острый диссеминированный кандидоз у больных в отделениях интенсивной терапии: дис. канд. мед. наук 03.00.24, 14.00.37 / Пестова Любовь Альбертовна. – СПб, 2004. – 160 с. 10. ПЦР в реальном времени /Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. (под ред. Д.В. Ребрикова). // М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2014. - 223 с. 11. Рациональная научно-практическая терминология патогенных и условно-патогенных грибов и вызываемых ими заболеваний: учебное пособие, выпуск III. / Н. П. Елинов, Н. В. Васильева, Е. Р. Рауш и др. (под ред. Елинова Н. П. // СПб.:ООО «МГК», 2014. – 72 c. 12. Реброва, О.В. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ «Статистика» / О.В. Реброва – 3-е изд. – Москва: Медиа Сфера, 2006. – 312 с. 13. СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. – М., Российская газета, 2011. – 13 июля . 14. Candida. Кандидозы. Лабораторная диагностика / под ред. Н. П. Елинов, Н. В. Васильева, А. А. Степанова и др. ( под ред. Елинова Н.П.) // СПб.: КОСТА, 2010. – 224 с. 15. In vitro активность флуконазола и вориконазола в отношении более 10000 штаммов дрожжей: результаты 5-летнего проспективного исследования ARTEMIS Disk в России / А. В. Веселов, Н. Н. Климко, О. И. Кречикова и др. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2008. – Т. 10.,№ 4. – С. 345-354. 16. A 1-year prospective survey of candidemia in Italy and changing epidemiology over one decade / A. M. Tortorano, A. Prigitano, C. Lazzarini et al. // Infection. – 2013. – Vol.41. – P.655–662. 126 17. A.V. Espinel-Ingroff /Medical Mycology in the United States. A historical analysis (1894-1996)/ Kluwer Academic Publishers, the Netherlands, 2003 18. Alastruey-Izquierdo A. Antifungal susceptibility profile of cryptic species of Aspergillus. / A. Alastruey-Izquierdo, L.Alcazar-Fuoli, M.CuencaEstrella // Mycopathologia. – 2014. – Vol.178. – P.427–433. 19. Amino acid substitutions in the Candida albicans sterol Δ5,6-desaturase (Erg3p) confer azole resistance: characterization of two novel mutants with impaired virulence / F. Morio, F. Pagniez, C. Lacroix et al. // J. Antimicrob. Chemother. – 2012. – Vol.67. – P.2131–2138. 20. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics / White T. J., Bruns T., Lee S. et al. // PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. – 1990. – P. 315-322. 21. An Implementation Strategy for the Use of Chromogenic Media in the Rapid, Presumptive Identification of Candida Species / H. J. Adam, S.E. Richardson, M. Roscoe et al. // The Open Mycology Journal. – 2010. – Vol.4. – P. 33-38. 22. Antifungal susceptibility of 205 Candida spp. isolated primarily during invasive Candidiasis and comparison of the Vitek 2 system with the CLSI broth microdilution and Etest methods / N. Bourgeois, L. Dehandschoewercker, S. Bertout et al. // J. Clin. Microbiol. – 2010. – Vol.48. – P.154-161. 23. Antifungal susceptibility testing: current role from the clinical laboratory perspective / B. Posteraro, R. Torelli, E. De Carolis // Mediterr. J. Hematol. Infect. Dis. – 2014. – Vol.6. – e2014030. 24. Antifungal susceptibilities of Candida glabrata species complex, Candida krusei, Candida parapsilosis species complex and Candida tropicalis causing invasive candidiasis in China: 3 year national surveillance / M. Xiao, X. Fan, S. C. Chen et al. // J. Antimicrob. Chemother. – 2014. – Vol.3. – P. 152-161 127 25. Application of MALDI-TOF MS for requalification of a Candida clinical isolates culture collection / R. Lima-Neto, C. Santos, N. Lima et al. // Braz. J. Microbiol. – 2014. – Vol.45. – P. 515–522. 26. Arendrup M. Epidemiology of invasive candidiasis / M. Arendrup // Current Opinion in Critical Care. – 2010. – Vol.16. – P. 445–452. 27. Assesment of ribosomal Large-Subunit D1-D2, Internal Transcribed Spacer 1, and Internal Transcribed Spacer 2 regions as targets for molecular identification of medically important Aspergillus species / H. P. Hinrikson, S. F. Hurst, T. J. Lott et al. // J. Clin. Microbiol . – 2007. – Vol. 43, № 5. – P. 2092-2103. 28. ATB fungus Comparative evaluation of ATB Fungus 2 and Sensititre YeastOne panels for testing in vitro Candida antifungal susceptibility / E. Eraso, M. Ruesga, M. Villar-Vidal et al. // Rev. Iberoam. Micol. – 2008. – Vol.25. – P. 3-6. 29. Atlas of clinical fungi: electronic version 3.1. [Electronic resource] / Hoog G.S. de, Guarro J., Gene J. et al. - Utrecht, Reus, 2011. – (СD-ROM). 30. AUXACOLOR2. User manual book. BioRad – USA. – 2003. – 79 p. 31. Balashov S. V. Assessing resistance to the echinocandin antifungal drug caspofungin in Candida albicans by profiling mutations in FKS1 / S. V. Balashov, S. Park, D. S. Perlin // Antimicrob. Agents Chemother. – 2006. – Vol.50. – P. 2058-2063. 32. Barnett J. A. A history of research on yeasts 12: medical yeasts part 1, Candida albicans / J. A. Barnett // Yeast. – 2008. – Vol.25. – P.385–417. 33. Candida bloodstream infections: comparison of species distributions and antifungal resistance patterns in community-onset and nosocomial isolates in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 2008-2009 / M. A Pfaller, G. J. Moet, S. A. Messer et al. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. – 2011. –Vol. 55. – P. 561-566. 34. Candida bracarensis detected among isolates of Candida glabrata by peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization: susceptibility data 128 and documentation of presumed infection / J. A. Bishop, N. Chase, S. S. Magill et al. // J. Clin. Microbiol. – 2008. – Vol.46. – P. 443–446. 35. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology / M. Z. Alam, Q. Alam, A. Jiman-Fatani et al. // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2014. – Vol. 30. – P. 1437-1451. 36. Candida guilliermondii, an Opportunistic Fungal Pathogen with Decreased Susceptibility to Fluconazole: Geographic and Temporal Trends from the ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program / M. A. Pfaller, D. J. Diekema, M. Mendez et al. // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol.44. – P.3551–3556. 37. Candidiasis: New Insights for the Healthcare Professional / Q. Ashton Acton (eds.) – Scholarly Editions, Atlanta, 2013. – P.57 38. Candida parapsilosis sensu stricto and the closely related species Candida orthopsilosis and Candida metapsilosis in vulvovaginal candidiasis / Y. Zhu, Y. Shan, S. Fan et al. // Mycopathologia. – 2014. – Vol. 17. – P.17-23 39. Candida parapsilosis,Candida orthopsilosis, and Candida metapsilosis virulence in the non-conventional host Galleria mellonella / S. Gago, R. Garcнa-Rodas, I.Cuesta et al. // Virulence. – 2014. – Vol. 5 - P.278–285. 40. Candida species distribution and antifungal susceptibility testing according to European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing and new vs. old Clinical and Laboratory Standards Institute clinical breakpoints: a 6year prospective candidaemia survey from the fungal infection network of Switzerland / C. Orasch, O. Marchetti, J. Garbino et al. // Clin. Microbiol. and Infect. – 2014. – Vol.20. – P. 698–705. 41. Candidemia in Europe: epidemiology and resistance. / A. M. Tortorano, C. Kibbler, J. Peman et al. // Int J Antimicrob Agents. – 2006. – Vol.27. – P.359–366. 42. Candidemia at intensive care units (ICU) in Saint-Petersburg, Russia / L. Pestova, N. Klimko, T. Bogomolova et al. // Clinical microbiology and infection. – 2004. – Vol. 10. – P. 639-640. 129 43. Candidemia epidemiology and susceptibility profile in the largest Brazilian teaching hospital complex / A. Lopes Motta, G. Madeira, D. de Almeida et al. // Braz. J. Infect. Dis. – 2010. – Vol.14. – P.15-24. 44. Candidaemia associated with decreased in vitro fluconazole susceptibility: is Candida speciation predictive of the susceptibility pattern? / D. A. Oxman, J.K. Chow, G.Frendl et al. // J. Antimicrob. Chemother. – 2010. – Vol.65. – P.1460-1465. 45. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; approved guideline // CLSI document M44-A. – 2004. – CLSI, Wayne, PA, USA. 46. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: third edition // CLSI document M27-A3. – 2008. - CLSI, Wayne, PA, USA. 47. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: third edition // CLSI document 3rd Informational Supplement M27-S3. – 2008. - CLSI, Wayne, PA, USA. 48. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: third edition // CLSI document 3rd Informational Supplement M27-S4. – 2012. - CLSI, Wayne, PA, USA. 49. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; approved guideline. // CLSI document MM18-A. – 2008. – CLSI, Wayne, PA, USA. 50. Clinically achievable caspofungin, micafungin and anidulafungin concentrations within the bloodstream:experience from a mycology reference laboratory /N. P. Wiederhold, , D. A. Sutton, A. W. Fothergill et al. // Mycoses. – 2013. – Vol. 56. –P. 58. 51. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America / P. G. Pappas, C. A. 130 Kauffman, D. Andes et al. // Clinic. Infect. Dis. – 2009. – Vol.48. – P. 503535. 52. Comparison of results of fluconazole and voriconazole disk diffusion testing for Candida spp. with results from a central reference laboratory in the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Program / M. A. Pfaller, L. Boykena, R. J. Hollisa et al. // J. Clin. Microbiol. – 2009. – Vol.48. – P.1358–1365. 53. Comparison of minimal inhibitory concentration elevation in Candida dubliniensis and Candida albicans after fluconazole exposure in vitro / K. Chaicumpar, S. Srichangwang, K. Samerpitak et al. // Mycoses. – 2013. – Vol.56. – P.63. 54. Crist A.E. Jr. Comparison of the MUREX C. albicans, albicans-Sure, and BactiCard Candida test kits with the germ tube test for presumptive identification of Candida albicans / A.E.Jr. Crist, T.J. Dietz, K. Kampschroer // J. Clin. Microbiol. – 1996. – Vol. 34. – P. 2616–2618. 55. Cuenca-Estrella M. Antifungal drug resistance mechanisms in pathogenic fungi: from bench to bedside / M. Cuenca-Estrella // Clin. Microbiol. Infect. – 2014. – Vol. 20, Suppl. 6. – P.54–59. 56. Direct MALDI-TOF Mass Spectrometry Assay of Blood Culture Broths for Rapid Identification of Candida Species Causing Bloodstream Infections: an Observational Study in Two Large Microbiology Laboratories / T. Spanu, B. Posteraro, B. Fiori et al. // J. Clin. Microbiol. – 2012. - Vol. 50. – P. 176179. 57. Distinct roles of Candida albicans drug resistance transcription factors TAC1, MRR1, and UPC2 in virulence / A. Lohberger, A. T. Coste, D. Sanglard et al. // Eukaryot. Cell – 2014. – Vol.13. – P.127–142. 58. Delaloye J Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient / Delaloye J, Calandra T // Virulence. – 2014. – Vol.5. – P.161-169. 131 59. Doyle, J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue / J. J. Doyle, J. L. Doyle // Phytochem. Bull. – 1987. – Vol.19. – P. 11-15. 60. Doyle S. Fungal proteomics: from identifcation to function / S. Doyle // Jour. Federation of European Microbiological Societies. – 2011. – Vol.321. – P.18-23. 61. Eksi F. In Vitro Susceptibility of Candida Species to Four Antifungal Agents Assessed by the Reference Broth Microdilution Method / F. Eksi, E. D. Gayyurhan, I. Balci // The Scientific World Journal – 2013. – Vol. 6 . – P.214-219. 62. Elucidating drug resistance in human fungal pathogens / J.L. Xie , E.J. Polvi, T. Shekhar-Guturja // Future Microbiol. – 2014. – Vol.9. – P.523– 542. 63. ESCMID guideline for the diagnosis and management of Candida diseases 2012: diagnostic procedure / M. Cuenca-Estrella, P. E. Verweij, M. C. Arendrup et al. //Clinical Microbiology and Infection diseases. – 2012. – Vol.18.suppl. 7. – P.9-18. 64. Epidemiology of invasive fungal infections in the intensive care unit: Results of a multicenter Italian survey (AURORA Project) / M.T. Montagna, G. Caggiano, G. Lovero et al. // Infection. – 2013. – Vol.41. – P. 645–653. 65. Epidemiology and predictive factors for early and late mortality in Candida bloodstream infections: a population-based surveillance in Spain / M. PuigAsensio, B. Padilla, J. Garnacho-Montero et al. // Clin Microbiol Infect. – 2014. – Vol.20. – O245-254. 66. Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance) registry, 2004–2008 / M. Pfaller, D. Diekema, H.-U. Meier-Kriesche et al. // Diagnostic Microbiology & Infectious Disease. – 2012. – Vol.74. – P.323–331. 132 67. Evaluation of New Colorimetric Vitek 2 Yeast Identification Card by Use of Different Source Media / G. Valenza, J. Strasen, F. Schäfer et al. // J. Clin. Microbiol. – 2008. – Vol.46. – P.3784-3787. 68. Evolution of Mating within the Candida parapsilosis Species Group / S. Sixiang , L. M. Holland, C. F. McGee et al. // Eukaryot Cell. –2011. – Vol.10. – P. 578–587. 69. Evolution of pathogenicity and sexual reproduction in eight Candida genomes / G. Butler, M. D. Rasmussen, M. F. Lin et al // Nature. – 2009. – Vol. 459. – P.657-662. 70. Espinel-Ingroff A.V. Medical Mycology in the United States. A historical analysis (1894-1996) / A.V. Espinel-Ingroff // Mycopathologia – 2005. – Vol/ 160/ - P. 187-188. 71. Espinel-Ingroff A. EUCAST and CLSI: Working Together Towards a Harmonized Method for Antifungal Susceptibility Testing / A. EspinelIngroff, M.Cuenca-Estrella, E. Cantón // Clinical Microbiology and Infection. – 2013. – Vol.7. – p 59-67 72. Epidemiology, management, and risk factors for death of invasive Candida infections in critical care: A multicenter, prospective, observational study in France (2005–2006) / O. Leroy, J.-P. Gangneux et al. // Crit. Care Med. – 2009. – Vol.37. – P. 1612-1618. 73. Espinel-Ingroff A. International and multicenter comparison of EUCAST and CLSI M27-A2 broth microdilution methods for testing susceptibilities of Candida spp. to fluconazole, itraconazole, posaconazole, and voriconazole / A. Espinel-Ingroff, F. Barchiesi, M. Cuenca-Estrella // J. Clin. Microbiol. – 2005. – Vol.43. – P.3884-3889. 74. Espinel-Ingroff A. EUCAST and CLSI: Working Together Towards a Harmonized Method for Antifungal Susceptibility Testing / A. EspinelIngroff, M. Cuenca-Estrella, E. Cantуn // Clinical Microbiology and Infection. – 2013. – Vol.7. – P.59-67 133 75. European Committee for Antifungal Susceptibility Testing (EUCAST). Method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts // EUCAST definitive document EDef 7.1. – 2004. – EUCAST, Geneva. 76. Evaluation of VITEK 2 and RapID yeast plus systems for yeast species identification: experience at a large clinical microbiology laboratory. / M. Sanguinetti, Porta, M. Sali et al. // J. Clin. Microbiol. – 2007. – Vol.45. – P.1343–1346. 77. First report of a clinical isolate of Candida haemulonii in Brazil / J.Nobrega de Almeida, A. Lopes Motta, F. Rossi et al. // Clinics (Sao Paulo). – 2012. Vol.67. – P.1229–1231. 78. Fleck R. In vitro susceptibility of Candida species to five antifungal agents in a German university hospital assessed by the reference broth microdilution method and Etest. / R. Fleck, D. Annebärbel, H. Herbert // J. Antimicrob. Chemother. – 2007. – Vol.59. – P. 767–771. 79. FUNGEMYCA Study Group Epidemiology, species distribution and in vitro antifungal susceptibility of fungaemia in a Spanish multicentre prospective survey / J. Pemán, E. Cantón, G. Quindós, et al. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. – 2012. – Vol. 67. – Suppl. 5. – P. 1181– 1187. 80. Genetic dissection of azole resistance mechanisms in Candida albicans and their validation in a mouse model of disseminated infection / D. M. MacCallum, A. Coste, F. Ischer et al. // Antimicrob. Agents Chemother. – 2010. – Vol. 54. – P.1476–1483. 81. Gundes S. G. Comparative performance of Fungichrom I, Candifast and API 20C Aux systems in the identification of clinically significant yeasts / S. G. Gundes, S. Gulenc, R. Bingol // J. Med. Microbiol. – 2011. – Vol. 50. – p.1105-1110. 134 82. Guinea J. Global trends in the distribution of Candida species causing candidemia / J. Guinea // Clin. Microbiol. and Infect. – 2014. – Vol.20, Suppl.6. – P.5–10. 83. Hameed S. Novel regulatory mechanisms of pathogenicity and virulence to combat MDR in Candida albicans / S. Hameed, Z. Fatima // Int. J. Microbiol. – 2013. - Vol.2013 – P.1-10. 84. Hidden Killers: Human Fungal Infections / G. D. Brown, D. W. Denning, A. R. Gow et al. // Sci. Transl. Med. – 2012. – Vol. 4. – P.165 85. Improved clinical laboratory identification of human pathogenic yeasts by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry / O. Bader, M. Weig, L. Taverne-Ghadwal et al. // Clin Microbiol Infect. – 2011. – Vol.17. – P.1359-65. 86. Incidence of bloodstream infections due to Candida species and in vitro susceptibilities of isolates collected from 1998 to 2000 in a populationbased active surveillance program / R. A. Hajjeh, A. N. Sofair, L. H. Harrison et al. // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol.42. – P.1519–1527. 87. Invasive candidiasis in pediatric intensive care in Greece: a nationwide study / L. Vogiatzi, S. Ilia, G. Sideri et al. // Intensive Care Medicine. – 2013. – Vol. 39. – P. 2188 – 2195. 88. Invasive candidemia in Norway a comparison of 2 decades / L. Hesstvedt, P. Gaustad, R. Hannula et al. // Mycoses. – 2013. – Vol.56. – 15. 89. Invasive infections due to Candida norvegensis and Candida inconspicua: report of 12 cases and review of the literature / J. Guitard, A. Agoulvant, V. Letscher-Bru et al. // Medical Mycology. – 2013. – Vol.51. – P.795-799. 90. Iwen P.C. Utilization of the internal transcribed spacer regions as molecular targets to detect and identify human fungal pathogens / P. C. Iwen, S. H. Hinrichs, M. E. Rupp // Med Mycol. – 2002. – Vol. 40. – P.87-109. 91. Jamal W. Y. Comparative evaluation of two matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) 135 systems for the identification of clinically significant yeasts / W.Y. Jamal, S. Ahmad // Intern. J. Infect. Dis. – 2014. – Vol.26. – P. 14-21. 92. Khardori N. Future of diagnostic microbiology / N. Khardori // Indian J Med Microbiol. – 2014. – Vol. 32. – P. 371-377. 93. Kofteridis D.P. Caspofungin-non-susceptible Candida isolates in cancer patients / D.P. Kofteridis, R. E. Lewis, D. P. Kontoyiannis // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. – 2010. – Vol.65. – P. 293-295. 94. Non-albicans Candida spp. causing fungaemia: pathogenicity and antifungal resistance / A. J. Barnes // J. hosp.infect. – 2002. – Vol.50. – P.243-260. 95. Kurtzman C. P. Systematics and taxonomy of yeasts / C. P. Kurtzman // Contrib. Microbiol. – 2000. – Vol.51. – P.14. 96. Kwon-Chung K. J. Phylogenetic spectrum of fungi that are pathogenic to humans / K.J. Kwon-Chung // Clinical Infect. Dis. – 1996. – Vol.19. – P.1-7. 97. Lachance M.-A. Kluyveromyces van der Walt (1971)/ M.-A. Lachance, T. Boekhout, J.W. Fell // The yeasts: a taxonomic study / C.P. Kurtzman, J.W.Fell, T. Boekhout (eds.) – Elsevier Science & Technology, Amsterdam, 2011. – Р. 477-479. 98. Laboratory biosafety manual. WHO. 3rd ed – Geneva, 2004. – 170 p. 99. Latin American Invasive Mycosis Network. Epidemiology of candidemia in Latin America: a laboratory-based survey / M. Nucci, F. Queiroz-Telles, T. Alvarado-Matute et al. // PLoS ONE. – 2013. – Vol.8. – e59373. 100. Li T. Y. Characterization of Aspergillus spores by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry / T. Y. Li, B. H. Liu, Y. C. Chen // Rapid Commun. Mass Spectrom. – 2000. – Vol.14. – P.2393– 2400. 101. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for fast and reliable identification of clinical yeast isolates / G. Marklein, M. Josten, U. Klanke et al. // J. Clin. Microbiol. – 2009. – Vol.47. –P.29122917. 136 102. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds / M. Karas, D. Bachmann, D. Bahr et al. //Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. – 1987. – Vol. 78. – P. 53-68. 103. MALDI Biotyper 3.1. User manual revision 1. Bruker Daltonics. – Bremen. – 2012. – 212 p. 104. MALDI-TOF MS: an upcoming tool for rapid detection of antibiotic resistance in microorganisms / M. Kostrzewa, K. Sparbier, T. Maier et al. // Prot. Clin. Appl. – 2013. –Vol.7. – P.767–778. 105. McIlroy, M. A. Failure of fluconazole to suppress fungemia in a patient with fever, neutropenia, and typhilitis / M. A. McIlroy // J. Infect. Dis. – 1991. – Vol.163. – P.420–421. 106. MFS multidrug transporters in pathogenic fungi: do they have real clinical impact? / C. Costa, P. J. Dias, I. Sá-Correia et al. // Front. Physiol. – 2014. – Vol. 5. – P.197. 107. Mnichowska-Polanowska M. In vitro susceptibility testing of candida albicans by using Micronaut-Am method / M. Mnichowska-Polanowska // Mycoses – 2013. - Vol. 56. – P.68. 108. Multicenter Evaluation of the New VITEK 2 Advanced Colorimetric Yeast Identification Card / D. J. Hata, L. Hall, A.W. Fothergill et al. // J Clin Microbiol. – 2007. – Vol. 45. – P.1087–1092. 109. Multicenter Comparison of the Vitek 2 Antifungal Susceptibility Test with the CLSI Broth Microdilution Reference Method for Testing Caspofungin, Micafungin, and Posaconazole against Candida spp. / J. F. Peterson, M. A. Pfaller, D. J. Diekema et al. // J. Clin. Microbiol. – 2011. – Vol.49. – P.1765–1771. 110. Messer S.A. International surveillance of Candida spp. and Aspergillus spp.: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2003) / S. A. Messer, R. N. Jones, T.R. Fritsche // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol.44. – P.1782-1787. 137 111. Metabolic control of antifungal drug resistance / N. Robbins , C. Collins , J. Morhayim et al. // Fungal Genet. Biol. – 2010. – Vol. 47. – P.81–93. 112. Molecular Identification and Antifungal Susceptibility Testing of Clinical Isolates of the Candida rugosa Species Complex and Proposal of the New Species Candida neorugosa / K. Paredes, A. Deanna, J. Sutton et al. //J. Clin. Microbiol. – 2012. – Vol. 50. – P. 2397-2403. 113. Molecular Identification and Antifungal Susceptibility of Yeast Isolates Causing Fungemia Collected in a Population-Based Study in Spain in 2010 and 2011/ J. Guinea, O. Zaragoza, P. Escribano et al. // Antimicrob Agents Chemother. – 2013. – Vol.58. – P. 1529-1537. 114. Moran G, Coleman D, Sullivan D. An introduction to the medically important Candida Species / R. A. Calderone, C. J. Clancy // Candida and Candidiasis / R. A. Calderone, C. J. Clancy. (eds). – ASM Press, Washington, DC, 2002. – P. 11- 27. 115. National surveillance of fungemia in Denmark (2004 to 2009) / M. C. Arendrup, B. Bruun, J. J. Christensen et al. // J Clin Microbiol. – 2011. – Vol.49. – P.325–334. 116. No increase in primary nosocomial candidemia in 682 German intensive care units during 2006 to 2011/ E. Meyer, C. Geffers, P. Gastmeier et al. // Euro Surveill. – 2013. – Vol.18. – P.10-12. 117. Odds F. C. One year prospective survey of Candida bloodstream infections in Scotland / F. C. Odds, M. F. Hanson, A. D. Davidson // J. Med. Microbiol. – 2007. – Vol.56. – P. 1066–1075. 118. Page B. T. Rapid identification of Candida species and other clinically important yeast species by flow cytometry / B. T. Page, C. P. Kurtzman // J. Clin. Microbiol. – 2005. – Vol.43. – P.4507-4514. 119. Pappas P. G. Antifungal Clinical Trials and Guidelines: What We Know and Do Not Know / P. G. Pappas // Cold Spring Harbor Perspectives in medicine. – 2014. – Vol.12. – P. 15-21 138 120. Pappas PG. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America / Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, Benjamin DK Jr // Clinical Infection Diseases. – 2009. – Vol.48. – P.503-535. 121. PCR protocol for specific identification of Candida nivariensis, a recently described pathogenic yeast / J. Alcoba-Flórez , M. del Pilar, F.J. A. González-Paredes et al. // J. Clin. Microbiol. – 2005. – Vol.43. – P. 6194– 6196. 122. Perlin D.S. Antifungal drug resistance: do molecular methods provide a way forward? / D. S. Perlin // Curr. Opin. Infect. Dis. – 2009. – Vol.22. – P.568– 573. 123. Perlroth J. Nosocomial fungal infections: epidemiology, diagnosis, and treatment / J. Perlrot, B. Choi, B. Spellberg // Medical Mycology. – 2007. – Vol.45. – P. 321-346. 124. Pestova L. Candidemia at intensive care units (ICU) in Saint-Petersburg, Russia / Pestova L., Klimko N., Bogomolova T. et al. // Clinical microbiology and infection. – 2004. – Vol. 10. – P.639-640. 125. Pfaller M.A. Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment / M. A. Pfaller // Am. J. Med. – 2012. – Vol.125. – S3–S13. 126. Pfaller M. A. Comparison of EUCAST and CLSI broth microdilution methods for the susceptibility testing of 10 Systemically active antifungal agents when tested against Candida spp. / M. A. Pfaller, M. Castanheira // Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. – 2014. – Vol.79. –P.198– 204. 127. Pfaller M. A. Triazole and Echinocandin MIC Distributions with Epidemiological Cutoff Values for Differentiation of Wild-Type Strains from Non-Wild-Type Strains of Six Uncommon Species of Candida / M. A. Pfaller, M. Castanheira, D. J. Diekema // J. Clin. Microbiol. – 2011. – Vol.49. – P. 3800–3804. 139 128. Pfaller M. A. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem / M. A. Pfaller,D. J. Diekema // Clin. Microbiol. Rev. – 2007. – Vol.20. – P.133–163. 129. Pfaller M. A. Candida guilliermondii, an Opportunistic Fungal Pathogen with Decreased Susceptibility to Fluconazole: Geographic and Temporal Trends from the ARTEMIS DISK Antifungal Surveillance Program / M. A. Pfaller, D. J. Diekema, M. Mendez // J.Clin.Microbiol. – 2006. – Vol. 44. – P.3551–3556. 130. Population structure and properties of Candida albicans, as determined by multilocus sequence typing / A. Tavanti, A.D. Davidson, M.J. Fordyce et al. // J. Clin. Microbiol. – 2005. – Vol. 43. – P.5601–5613. 131. Prevalence of Candida bracarensis and Candida nivariensis in a Spanish collection of yeasts: comparison of results from a reference centre and from a population-based surveillance study of candidemia / M. Cuenca-Estrella, A. Gomez-Lopez, G. Isla et al. // Med Mycol. – 2011. –Vol. 49. – P.525529. 132. Protein and polymer analyses up to m⁄z 100000 by laser ionization time-offlight mass-spectrometry / K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido et al. // Rapid Commun. Mass Spectrom. – 1988. – Vol. 2. – P. 151-153. 133. Qiao-Ting C. Comparison of the Accuracy of Two Conventional Phenotypic Methods and Two MALDI-TOF MS Systems with That of DNA Sequencing Analysis for Correctly Identifying Clinically Encountered Yeasts / C. Qiao-Ting, L.Tai-Fen, T. Shih-Hua // J Clin Microbiol. – 2014. – Vol.60. – P. 3225–3235. 134. Quantitation of Candida CFU in Initial Positive Blood Cultures /Christopher D. Pfeiffer, Gregory P. Samsa et al. // Journal of Clinical Microbiology. – 2011. – Vol.49, p.2879–2883. 135. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study: a 6.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole by Standardized Disk Diffusion Testing / M. 140 A. Pfaller, D. J. Diekema, M. G. Rinaldi et al. //J. Clin. Microbiol. – 2005. – Vol.43. – P.5848–5859. 136. Raju S.B. Isolation and Identification of Candida from the Oral Cavity / S. B. Raju, Rajappa S. // International Scholarly Research Notices. – 2011. – Vol. 201. – P. 1-8. 137. Rapid Emergence of Echinocandin Resistance during Candida kefyr Fungemia Treatment with Caspofungin / A. Fekkar, I. Meyer, J. Y. Brossas // Antimicrob. Agents Chemother. – 2013. – Vol.57. – P.2380–2382. 138. Rapid antifungal susceptibility testing by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry analysis / A. Vella, E. De Carolis, L. Vaccaro et al. / J. Clin. Microbiol. – 2013. – Vol.51. – P. 2964– 2969. 139. Rapid identification and susceptibility testing of Candida spp. from positive blood cultures by combination of direct MALDI-TOF mass spectrometry and direct inoculation of Vitek 2 / E. A. Idelevich, C. M. Grunewald, J. Wüllenweber et al. // (2014) PLoS ONE 9: e114834]. 140. Recommendations for the diagnosis of candidemia in Latin America / A. Lopes Colombo, J. A. Cortes J. Zurita et al. // Revista Iberoamericana de Micología. – 2013. – Vol. 30. – P.150–157. 141. Reiss E., Shadomy H.J., Lyon G.M. Fundamental medical mycology. – 2011. – 624p. 142. Resistance of Candida spp. to antifungal drugs in the ICU: where are we now? / D. Maubon, C. Garnaud, T. Calandra et al. // Intensive Care Med. – 2014. – Vol.40. – P.1241–1255. 143. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study, 1997 to 2007: a 10.5-Year Analysis of Susceptibilities of Candida Species to Fluconazole and Voriconazole as Determined by CLSI Standardized Disk Diffusion / M.A. Pfaller, D.J. Diekema, D. L. Gibbs et al. // J Clin Microbiol. – 2010. – Vol.48. – P. 1366–1377. 141 144. Risk prediction for invasive candidiasis / A. Ahmed, A. Azim, A. K. Baronia et al. // Indian Journal of Critical Care Medicine. – 2014. - Vol. 18, P. 682-688. 145. Sanglard D. Antifungal drug resistance mechanisms in fungal pathogens from the perspective of transcriptional gene regulation / D. Sanglard, A. Coste, S. Ferrari // FEMS Yeast Res. – 2009. – Vol. 9. – P.1029–1050 146. Screening for amino acid substitutions in the Candida albicans Erg11 protein of azole-susceptible and azole-resistant clinical isolates: new substitutions and a review of the literature / F. Morio, C. Loge, B. Besse et al. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2010. – Vol. 66. – P.373–384. 147. Seminational Surveillance of Fungemia in Denmark: Notably High Rates of Fungemia and Numbers of Isolates with Reduced Azole Susceptibility / M. C. Arendrup, K. Fuursted, B.Gahrn-Hansen et al. // J. Clin. Microbiol. – 2005. – Vol.43. – P. 4434-4440. 148. Species distribution and antifungal resistance profiles among Candida spp. isolated from bloodstream infections in a Belgian university hospital / I. Montesinos, A. Cardentey-Reyes, M.Dodemont et al. // Mycoses. – 2013. Vol.56. – P.21. 149. Species identification and antifungal susceptibility of Candida bloodstream isolates from population-based surveillance in two US cities: 2008-2011 / S. R. Lockhart, N. Iqbal, A. M. Ahlquist et al. // J. Clin. Microbiol. – 2012. – Vol.50. – P.3435–3442. 150. Species distribution and susceptibility profile of Candida species in a Brazilian public tertiary hospital / A. Bruder, N.,Carlos, H. Camargo et al. // BMC Research Notes. – 2010. – Vol.3. - P. 514-518. 151. Species distribution and susceptibility profile of Candida species in a Brazilian public tertiary hospital / A Bruder-Nascimento, CH Camargo, MF Sugizaki et al.// BCM Res Notes. – 2010. – Vol.3. – P.1-5. 152. Shawn R. Lockhart Lodderomyces elongisporus Masquerading as Candida parapsilosis as a Cause of Bloodstream Infections / S. R. Lockhart, M. A. 142 Pfaller, D.J. Diekema // Journal of Clinical Microbiology. – 2008. – Vol.46. – P.1374–1376. 153. Sudbery P. The distinct morphogenic states of Candida albicans / P. Sudbery, N. Gow, J. Berman // Trends in Microbiology. – 2004. – Vol.12. – P.317- 324. 154. St-Germain G. Epidemiology and antifungal susceptibility of bloodstream Candida isolates in Quebec: Report on 453 cases between 2003 and 2005 / G. St-Germain, M. Laverdière, R. Pelletier // Infection Diseases and Medical Microbiology. – 2008. – Vol.19. - P. 55–62. 155. The epidemiology of candidemia in two United States cities: results of a population-based active surveillance / A. S. Kao, M. E. Brandt, W. R. Pruitt et al. // Clin. Infect. Dis. – 1999. – Vol.29. – P.1164–1170. 156. The changing epidemiology of healthcare-associated candidemia over three decades / D. Diekema, S. Arbefeville, L. Boyken et al. // Diagn Microbiol Infect Dis. – 2012. – Vol.73. – P.45–48. 157. The ROCANET study: preliminary results from anprospective observational survey of candidaemia in the Rome city / M. Sanguinetti, N. Petrosillo, B. Posteraro et al. // Mycoses – 2013. - Vol. 56. – P.101. 158. Use of the VITEK 2 system to identify and test the antifungal susceptibility of clinically relevant yeast species / M.S.C. Melhem, A. Bertoletti, H.R.L. Lucca et al. // Braz. J. Microbiol. – 2013. – Vol.44. – P.1257-1266. 159. Variation in Candida spp. distribution and antifungal resistance rates among bloodstream infection isolates by patient age: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2008-2009) / M. A. Pfaller, M. Castanheira, S. A. Messer et al. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2010. – Vol. 68. – P. 278–283. 160. Variación de la epidemiologia de las fungemias y de la sensibilidad a fluconazol de los aislamientos en los últimos 10 años en España: resultados del estudio FUNGEMYCA. J. Pemán, E. Cantón, M. J. Linares-Sicilia et al. // Rev. Iberoam. Micol. – 2011. – Vol.28. – P.91–99. 143 161. van Veen S. Q. High-Throughput Identification of Bacteria and Yeast by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry in Conventional Medical Microbiology Laboratories / S. Q. van Veen, E. C. J. Claas, E. J. Kuijper // J Clin Microbiol. – 2010. – Vol.48. – P. 900–907. 162. Variation in Susceptibility of Bloodstream Isolates of Candida glabrata to Fluconazole According to Patient Age and Geographic Location in the United States in 2001 to 2007 / M. A. Pfaller, S. A. Messer, R. J. Hollis et al. // J Clin Microbiol. – 2009. – Vol.47. – P. 3185–3190. 163. Yapar N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis / N. Yapar// Ther. Clin. Risk Manag. – 2014. – Vol.10. – P.95–105. Работы по теме диссертации: 164. Видовая идентификация возбудителей инвазивного кандидоза методом MALDI-TOF масс-спектрометрии / Е.Р. Рауш, Ю.В. Михайлова, Н.В. Васильева и др. // Фундаментальные исследования в современной медицине: достижения и перспективы. Сборник материалов 1-ой отчетной сессии научных подразделений СЗГМУ им. И.И.Мечникова.СПб.,2013. – С.25-26. 165. Идентификация Candida spp. с помощью MALDI-TOF масс- спектрометрии / Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, Е.В. Шагдилеева и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №2. – С. 115-116. 166. Инвазивный кандидоз на отделениях реанимации и интенсивной терапии Ленинградской областной клинической больницы / Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, Н.В. Васильева и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2014. – Т 16, №2. – С. 147 167. Определение видов возбудителей инвазивного кандидоза: в поиске быстрых решений / Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, Н.Н. Климко и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №4. – С. 87-91. 144 168. Случай успешного лечения микст-микоза – инвазивного кандидоза (кандидемии) и инвазивного аспергиллеза (легких, придаточных пазух и мягких тканей носа) у пациента с неходжкинской лимфомой / Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, С.Н. Хостелиди и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №1. – С. 22-28. 169. Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам методами CLSI M27-A3 и CLSI M44-A / Е.Р. Рауш, Т.С. Богомолова, Н.В. Васильева и др. // Фундаментальные исследования в современной медицине: достижения и перспективы. Сборник материалов 1-ой отчетной сессии научных подразделений СЗГМУ им. И.И.Мечникова.- СПб., 2013. – С.24-25. 170. Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к флуконазолу и вориконазолу по международным стандартам / Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №1. – С. 60-63. 171. Первое описание случая успешного лечения микотического менингита, обусловленного Candida albicans и Trichosporon asahii / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2013. – Т 15, №2. – С. 138-139 172. Случай успешного лечения микст-микоза, обусловленного Candida krusei и Aspergillus flavus / Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, С.Н. Хостелиди и др. // Сборник научных трудов Всероссийской конференции с международным участием Пятые научные чтения, посвященные памяти член-корр. РАМН, з.д.н. РФ, профессора О.К. Хмельницкого "Современные подходы в клинико- морфологической диагностике и лечении заболеваний человека". - 2013. - C. 374-375. 173. Случай успешного лечения рецидивирующего диссеминированного кандидоза с поражением ободочной кишки и легких у пациентки, получающей хронический гемодиализ / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, 145 Т.С. Богомолова и др. // Научное издание «Успехи медицинской микологии». - 2014. - Т. XIII. – Гл. 11. - С. 280-281. 174. Случаи микст-микозов (инвазивных кандидоза и аспергиллеза) у гематологических больных / Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, Т.С. Богомолова и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2014. – Т 16, №2. – С. 147-148. 175. Случай успешного лечения микотического перитонита (возбудитель – Candida albicans) у пациентки с острым панкреонекрозом / Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, Т.С. Богомолова и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2014. - T. 16. - № 2. - С. 131-132. 176. Случай успешного лечения кандидозного перитонита (возбудительCandida albicans) у пациентки с острым панкреонекрозом / Е.Р. Рауш, С.Н. Хостелиди, Е.В. Шагдилеева и др. // Проблемы медицинской микологии. – 2014. – Т 16, №3. – С. 26-31. 177. Успешное лечение сочетанного микоза - инвазивного кандидоза и инвазивного аспергиллеза у пациента с неходжкинской лимфомой / Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева, С.Н. Хостелиди и др. // Сборник материалов 86-ой конференции « Мечниковские чтения-2013» (г. Санкт- Петербург, 23 апреля 2013 г.).- Санкт-Петербург, 2013. – С.9495 178. Antifungal susceptibility profiles of pathogens of invasive candidiasis in Russia / E. Raush, N. Vasilyeva, E.Shagdileeva et al. // Final Program European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Barcelona, Spain, 10-13 May 2014) – P.103 179. Combination of invasive candidiasis and invasive aspergillosis in hematological patients / E. R.Raush, S. N. Khostelidi, T. S. Bogomolova et al. // Final Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and Candidiasis (New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) –P.107 146 180. Combination of invasive aspergollosis and invasive candidiasis in hematological / E.Raush, S.Khostelidi, T. Bogomolova et al. // 6th advances against aspergillosis. - 2014. - P. 164. 181. Identification of the etiologic agents of invasive candidosis by matrixassisted laser desorption/ionisationtime of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) / N.V. Vasilyeva, E.R. Raush, S.V. Sidorenko et al. // Final Programm European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Berlin, Germany, 29 April 2013) – P.148 182. Invasive candidiasis in intensive care units of the tertiary hospital in St. Petersburg, Russia./ E. R. Raush, E. V. Shagdileeva, N.V. Vasilyeva et al. // Final Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and Candidiasis (New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) –P. 106107 183. Species distribution and antifungal susceptibility profiles among Candida spp. in Russia / E. Raush, N. Vasilyeva, E.Shagdileeva et al. // Final Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and Candidiasis (New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) – P. 87 184. Susceptibility testing of invasive candidosis pathogens to fluconazole by CLSI M27-A3 method / E. Raush, N.V.Vasilyeva, E.Shagdileeva et al. // Mycoses.- 2013.-Volume 56, Supplement 3.-P.109 185. Successful treatment of combination of invasive candidiasis (C. krusei) and aspergillosis (A. flavus) in haematological patient / E.R. Raush, E.Shagdileeva, T.S.Bogomolova et al. // Mycoses.- 2013.-Volume 56, Supplement 3.- P.116
