Современные методы лабораторной диагностики
advertisement
Современные методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний Иванов Андрей Михайлович доктор медицинских наук, профессор Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Лабораторная диагностика С.П. Боткин – Р. Вирхов ИСТОРИЯ Клиническая лабораторная диагностика • Лабораторная медицина в нашей стране имеет глубокие корни, формировалась она, как и многие другие медицинские дисциплины, на базе военной медицины. Первая клиническая лаборатория была открыта при кафедре факультетской терапии Военно-медицинской академии С.Петербурга в 1840 г.г. , начальником ее был доктор К.К. Зейдлиц. Первые лаборатории делали примитивные исследования : сахар в моче, мочевина, белок. Тем не менее, именно в этот период был открыт белок Бенс-Джонса. • С.П.Боткин создал клинико-экспериментальную лабораторию при кафедре факультетской терапии Военно-медицинской академии примерно в 1860 г для проведения клинико-экспериментальных исследований. Затем этой лабораторией руководил И.П.Павлов, он в этот период занимался фармакологией, затем перешел на кафедру нормальной физиологии, где приобрел мировую известность. Эти великие медики в пору становления лабораторной службы видели в лаборатории источник объективной информации о больном, который скрыт даже от самого опытного терапевта. Кафедра факультетской терапии ВМедА (Тыренко В.В. И соавт., 2011) Методы диагностики Автор, год Внедрен микроскоп для лабораторных исследований К.К. Зейдлиц, 1840 Организована клиническая лаборатория К.К. Зейдлиц, 1840 Организована физиологическая лаборатория С.П. Боткин, И.П. Павлов, 1876 Значительно расширена клиническая лаборатория С.П. Боткин, 1884 Организована бактериологическая лаборатория Л.В. Попов, 1891 Культивирование анаэробов (анаэростат) С.С. Боткин, 1891 Выявлена закономерность лейкоцитарной реакции при инфекционных болезнях и предложена методика определения лейкоцитоза С.С. Боткин, Н.Я. Чистович, 1891-92 гг. Кафедра факультетской терапии (Тыренко В.В. И соавт., 2011) Методы диагностики Обоснованы методы фракционного исследования желудочной секреции и мочеотделения Предложен метод морфологического исследования плевральных экссудатов Открыт и описан возбудитель «маньчжурского тифа» Автор, год С.С. Зимницкий, 1901-02 гг. В.Н. Стасевич, 1903 С.С. Боткин, С.С. Зимницкий , 1909 1884 год - Разделение кафедры химии: - Кафедра неорганической химии - Кафедра органической и физиологической химии с физиолого-химической лабораторией (фактическое разделение состоялось в 1892 году) Член-корреспондент Петербургской АН Данилевский А.Я. (1838 - 1923) C 1906 по 1910 год – начальник Военно-медицинской академии Конференция ВМедА (1906-1910) Современные тенденции и перспективы лабораторной диагностики инфекций • этиологическая диагностика • ускорение лабораторного цикла обследования пациентов • изучение резистентности возбудителей к антимикробным препаратам • молекулярный мониторинг распространения возбудителей Современные тенденции и перспективы лабораторной диагностики инфекций • этиологическая диагностика • ускорение лабораторного цикла обследования пациентов • изучение резистентности возбудителей к антимикробным препаратам • молекулярный мониторинг распространения возбудителей Проблемные вопросы при серологической диагностике инфекционных заболеваний • Активный процесс или анамнестическая инфекция? • Реинфекция или рецидив? • Контроль излеченности? • Целесообразность вакцинации? • Эффективность поствакцинального иммунитета? • Нейроинфекция? • Врожденная инфицированность? Повышение информативности серологической диагностики: • получение искусственных аналогов микробных антигенов и их использование в диагностических препаратах • раздельное выявление классов и подклассов специфических иммуноглобулинов (IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) • изменение трактовки результатов серологического тестирования Относительная концентрация Серологический профиль HIV-1 инфекции (пример информативности определения спектра антител) Anti-HIV Env Anti-HIV IgM Anti-HIV Core HIV Ag HIV-1 инфекция недели HIV Ag месяцы годы время Пример расположения антигенов в иммуноблоттинге TpN47 TpN17 стрептавидин Контроли ± 1+ 3+ TmpA TpN15 Антигены Биочипы Повышение информативности серологической диагностики: • получение искусственных аналогов микробных антигенов и их использование в диагностических препаратах • раздельное выявление классов и подклассов специфических иммуноглобулинов (IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) • изменение трактовки результатов серологического тестирования Биологические свойства иммуноглобулинов человека СВОЙСТВА Ig КЛАССЫ И ПОДКЛАССЫ A1 A2 G1 G2 G3 G4 D E M Активация комплемента - - ++ + ++ - - - - Перенос через плаценту - - + + + + - - - Перенос через слизистые + + - - - - - - - Связывание с FcαR1 + + - - - - - - - Связывание с FcγR-I - - ++ - ++ + - - - Связывание с FcγR-II - - + - + - - - - Связывание с FcγR-III - - + - + - - - - Связывание с FcδR-I - - - - - - + - - Связывание с FcεR (I и II) - - - - - - - ++ - Связывание с FcμR - - - - - - - - + Связывание РФ - - + + + + - - - Связывание с белком А - - + + - + - - - Связывание с белком G - - + + + + - - - Биологические свойства подклассов иммуноглобулинов человека Биологические свойства Подклассы IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 7,1 3,0 0,80 0,40 58-71 19-31 5-10 3-6 Экспрессия на В-лимфоцитах, % 40 48 8 1 % плазмоцитов-продуцентов 64 26 8 1 60-70 15-20 4-8 2-6 ++ + +++ - Связывание с FcγR-I +++ + +++ + Связывание с FcγR-II ++ + ++ + Связывание с FcγR-III ++ + ++ + + + - + Связывание с белком А ++ ++ - ++ Связывание с белком G ++ ++ ++ ++ Перенос через плаценту ++ + ++ ++ 12-21 12-21 7-8 11-21 Блокир. активность при аллергии - - - + Функциональная валентность 2 2 2 1 Содержание в сыворотке, мг/мл Содержание в сыворотке, % Частота миелом-продуцентов, % Связывание C1q Связывание с РФ Время полужизни в крови Перспективы совершенствования методов серологической диагностики • Использование Fab-фрагментов антител при конструировании биосенсоров • Использование аптамерных и пептидных лигандов • Проточная цитометрия Перспективные методы серологической диагностики • Клеточно-опосредованная детекция • Химическая детекция • Физическая детекция (поверхностные плазмон резонансные биосенсоры) Современные тенденции и перспективы лабораторной диагностики инфекций • этиологическая диагностика • ускорение лабораторного цикла обследования пациентов • изучение резистентности возбудителей к антимикробным препаратам • молекулярный мониторинг распространения возбудителей Современные тенденции и перспективы лабораторной диагностики инфекций • этиологическая диагностика • ускорение лабораторного цикла обследования пациентов • изучение резистентности возбудителей к антимикробным препаратам • молекулярный мониторинг распространения возбудителей Ускорение лабораторного цикла обследования пациентов • Рациональная организация лабораторного диагностического процесса • Использование методов экспресс-диагностики • Миниатюризация формата исследования, за счет новых биомедицинских технологий и высокотехнологичных платформ лабораторного анализа • Компьютеризация Современные тенденции и перспективы лабораторной диагностики инфекций • этиологическая диагностика • ускорение лабораторного цикла обследования пациентов • изучение резистентности возбудителей к антимикробным препаратам • молекулярный мониторинг распространения возбудителей Современные тенденции и перспективы лабораторной диагностики инфекций • этиологическая диагностика • ускорение лабораторного цикла обследования пациентов • изучение резистентности возбудителей к антимикробным препаратам • молекулярный мониторинг распространения возбудителей Современные тенденции и перспективы лабораторной диагностики инфекций • этиологическая диагностика • ускорение лабораторного цикла обследования пациентов • изучение резистентности возбудителей к антимикробным препаратам • молекулярный мониторинг распространения возбудителей Молекулярный мониторинг распространения возбудителей инфекционных заболеваний • Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов хромосомной и плазмидной ДНК • Саузерн-блоттинг • Пульс-электрофорез • ДНК-секвенирование Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР •Дает возможность индикации геномной ДНК разных микроорганизмов одномоментно в одной пробе биологического материала •Особенно перспективной при диагностике является мультипраймерная модификация ПЦР, позволяющая за один анализ из одной пробы определять несколько типов возбудителей. Прямая протеомная идентификация микроорганизмов Метод позволяет проводить прямой масс-спектрометрический анализ белковой фракции микробной клетки (прямое белковое профилирование) и получать уникальные масс-спектры с высокой точностью и разрешением, характеризующие исследуемый объект по типу “отпечатков пальцев”. Достоинства метода: Высокая аналитическая чувствительность достаточно 10-15 – 10-18 вещества Быстрая и простая пробоподготовка: 10 – 15 минут Высокая скорость измерения: 1 минута на образец Возможность автоматизации и роботизации всех стадий исследования Возможность идентификации более 3000 бактерий и грибов Nobel Prize 2011 and Shaw Prize 2011 (medicine) Charles Janeway – идея о существовании PRR Bruce A. Beutler – экспериментальное подтверждение PRR* мыши Jules A. Hoffmann – экспериментальное подтверждение PRR дрозофил Ruslan Medzhitov – экспериментальное подтверждение PRR человека 100-летие Нобелевской премии И.И. Мечникова и П. Эрлиха 2008 год «Лекции о сравнительной патологии воспаления» 1892 год Максимов Александр Александрович [4.2.1874 4.12.1928] - выдающийся российский учёный, гистолог и эмбриолог. •А.А.Максимов родился в СанктПетербурге, где в 1896 году с отличием окончил Военномедицинскую академию. С 1903 по 1922 гг. А.А.Максимов занимал пост профессора кафедры гистологии Военномедицинской академии. • В 1922 г. эмигрировал в США, где с 1922 по 1928 годы являлся профессором кафедры анатомии медицинского факультета Чикагского университета. Строение бактериальной клеточной стенки Свойства патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (ПАМП) • Синтезируются только микроорганизмами, их синтез отсутствует в клетках макроорганизма. • Являются наиболее общими для микроорганизмов структурами. • Структуры в составе ПАМП, распознаваемые ПРР (а значит и врожденной иммунной системой), являются важными для выживания и патогенности микроорганизмов – отличаются консервативностью и неподверженностью мутациям. Специфичность сигнальных рецепторов врожденного иммунитета Тип патогена PRR Лиганды TLR-1 Триациллипопептиды, модулин M. tuberculosis грам-[+], грам-[–] TLR-2 Липопротеиды большинства патогенов, пептидогликаны, липотейхоевые и маннуроновые кислоты, порины Neisseria, атипичные ЛПС, факторы вирулентности Yersinia, вирионы CMV, зимозан TLR-3 Двунитчатая РНК вирусы TLR-4 ЛПС грам-отрицательных бактерий, HSP60, полимерные маннуроновые кислоты, флаволипиды, тейхуроновые кислоты, пневмолизин, оболочечный белок RSV грам-[+], грам-[–], вирусы TLR-5 Флагеллин грам-[+] TLR-6 Диациллипопептиды, модулин, липотейхоевая кислота, зимозан грам-[+], грибы TLR-7 Однонитчатая РНК, синтетические вещества вирусы TLR-8 Однонитчатая РНК, синтетические вещества вирусы TLR-9 Неметилированная СpG ДНК грам-[+], грам-[–] TLR-10 Неизвестны TLR-11 Уропатогенные бактерии NOD1 Пептидогликаны (GM-Tridap) грам-[+] NOD2 Пептидогликаны (ГМДП) грам-[–] грам-[+], грам-[–], грибы, вирусы Специфичность распознавания ПАМП различными TLR ПАМП Патоген Триацетилированные липопептиды (липо­гликаны липоманнан и липоарабиноманнан), Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae фосфатидилинозитолдиманнозид и липопротеин 19 кД) Диацетилированные липопептиды Липополисахарид Leptospira interrogans, Porphyromonas gingivalis, Helicobacter pylori Белки вирусной оболочки цитомегаловирус, вирус кори, вирус герпеса HSV-1 Гликозилфосфатидилинозитол простейшие (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Toxoplasma gondii, Leishmania major, Plasmodium falciparum) Липопротеины, пептидогликаны, липотейхоевые кислоты Зимозан Гликолипиды Модулин Двуцепочечная РНК Липополисахарид F(fusion)-протеин вирусной оболочки Грам-позитивные бактерии (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae) грибы (дрожжи) Treponema pallidum вирусы и бактерии TLR2 TLR1/TLR2, TLR2/TLR6 TLR3 RSV Бактериальный флагеллин Legionella pneumophila, Salmonella typhimurium REP-последовательности ДНК TLR2/TLR6 Грам-негативные бактерии Гликозилфосфатидилинозитол CpG ДНК TLR1/TLR2 Staphylococcus epidermis простейшие (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Toxoplasma gondii, Leishmania major и Plasmodium falciparum) Одноцепочечная РНК Рецептор вирус HCV Mycobacterium tuberculosis, вирусы HCV, HIV-1, RSV вирусы герпеса HSV-1 и HSV-2, HIV, простейшие (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Toxoplasma gondii, Leishmania major и Plasmodium falciparum) Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis TLR4 TLR5 TLR7 TLR8 TLR9 Активация сигнальных рецепторов (TLR, NOD) • • • • NF-kB AP-1 Fos Jun ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ Биологические эффекты цитокинов Фагоциты Эффект цитокинов реализуется в трех направлениях: Фагоциты – активация фагоцитоза, презентация антигена, продукция Зрелые Ти В- клетки свободных радикалов Зрелые Т- и В-клетки – усиление функций (увеличение продукции Ig, активация киллеров) Наивные Ти В- клетки Наивные Т- и В-клетки – активация и подготовка к иммунному ответу Алгоритм иммунологического обследования при сифилисе Клинико-лабораторная и серологическая диагностика сифилиса (скрининг + верификация) Положительный результат (сифилис) Отрицательный результат Сифилис исключается Определение IFN-γ, IL-1β, IL-2, ФЧ Выраженных изменений иммунологических показателей не выявлено Вероятность развития серорезистентности низкая IFN-γ ↑, IL-1β ↑, IL-2 ↑, ФЧ ↓ Вероятность развития серорезистентности высокая Влияние факторов иммунитета на эффективность лечения хронического трихомониаза Хронический трихомониаз IFN-γ ↑, IL-1β ↑ CD19+↓, IL-8(N) Th1 Неблагоприятный прогноз эффективности терапии Определение IFN-γ, IL-1β, IL-8, CD19+ CD19+↑, IL-8↑ IFN-γ(N), IL-1β(N) Th2 Благоприятный прогноз эффективности терапии Критерии прогноза течения ХГС TNF-α ↑ Ig A ↑ IL-10 ↑ Неблагоприятный прогноз течения ХГС ФЧ ↓ IFN-γ ↑ Ig G ↑ Прогноз при инфекционных заболеваниях определяется активацией иммунной системы в направлении наиболее эффективного пути (Th1/Th2) элиминации этиологического агента АЛГОРИТМ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА В ПРОФИЛАКТИКЕ И ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Генетические факторы Фенотипические факторы Предрасположенность к инфекции Геномный анализопределение SNP Риск развития заболевания Течение заболевания Исход заболевания Генетический полиморфизм рецепторов TLR-семейства Ген TLR1 TLR2 TLR6 TLR4 TLR5 TLR7 Полиморфизм гена 1805G/T 944C/Т 743A/G 914A/Т Полиморфизм белка Фенотипическая ассоциация серин-602/изолейцин пролин-315/лейцин аспарагин-248/серин гистидин-305/лейцин Туберкулез, лепра 2408G/A аргинин-753/глутамин 2180C/T аргинин-677/триптофан 2021C/A пролин-631/гистидин 597T/C аспарагин-199/аспарагин 745Т/С 752Т/А 2069А/С 460/461Del AATAA 896A/G пролин-680/гистидин серин-249/пролин лейцин-251/стоп-кодон аспарагин-690/треонин ? аспарагин-299/глицин 1196C/T треонин-399/изолейцин 1174С/Т 32A/T 2403G/A аргинин-392/стоп-кодон ? ? септический шок, туберкулез, менингит, лепра, остеомиелит туберкулез, менингит, лепра (особенно лепроматозная) системная менингококкемия туберкулез (особенно милиарный) Туберкулез Грам-негативные инфекции, в том числе сепсис и септический шок, вирус RSV пневмония хроническая HCV-инфекция Полиморфизм молекул иммуногенного сигналинга Протеин Генный сайт SNP* Фенотип** rs6853 A/G IL-10, Ig rs11466004 85С/Т IL-10, Ig rs5029748 С/А IL-4 rs3747811 Т/А IL-10 rs1801 C/G IL-12p40 rs230494 A/G rs230544 С/Т провоспалительные rs230547 С/Т цитокины rs1585213 G/A TRAF6 rs5030419 С/G IRAK1 rs1059703 6434С/Т*** IRAK3 rs3782347 48836A/G rs4251520 13423Т/С ? 877С/T ? 620–621del MyD88 MD2 IK NFB IRAK4 Jun ? 34C/T (Arg12Cys) rs11688 750G/A IFN-γ вакциноиндуцированные Ig IL-1, IL-18 провоспалительные цитокины IL-6, TNF- Ассоциации генотипа по HLA и фенотипа при инфекции Ген Аллели и гаплотипы Патоген Фенотипическая ассоциация DRB1*1101 HCV устойчивость к инфекции DRB1*1101 спонтанный клиренс инфекции DRB1*06, *08, *16 хронический гепатит DRB1*07, DRB1*1101/1104, DRB1*1201 устойчивость к инфекции спонтанный клиренс инфекции DRB1*1301, *1302 DRB1*14 HLA-DR HBV ответ на лечение интерфероном DRB1*03, *07, *09, *12, *15 хроническая инфекция DR6, DR13 спонтанный клиренс инфекции DR9 хроническая инфекция DR10, DRB1*0301 хронический гепатит DRB1*0101, *1101, *1104, *1501 HCV спонтанный клиренс инфекции DR13 H. pylori-ассоциированный DRB1*0301 H. pylori аутоиммунный тиреоидит и аутоиммунный гастрит DQB1*1001 P. falciparum тяжелая нецеребральная малярия устойчивость к малярии DRB1*1302 DQB1*0303, DQB1*0301/*0304, DQB1*0502, DQB1*0201, DQB1*0301, HLA-DQ хронический гепатит DQB1*0301, DQ9 DQB1*0301 DQB1*0501, DQA1*0301,*0302 HLA-DQ HBV HCV DQВ1*0501 P. falciparum DQ6 (B*0602) HPV16 DQB1*0503 устойчивость к инфекции спонтанный клиренс инфекции устойчивость к малярии прогрессирующие эпителиальные поражения прогрессирование туберкулеза Ассоциации генотипа по HLA и фенотипа при инфекции Ген Аллели и гаплотипы Патоген А*02, A* 0301 HBV A*1101 HCV HLA-А В*08, В*35, 44-Cw 1601, 44-Cw 0501 B*57 HLA-В HBV HCV Bw53 Cw*0102 HLA-C Cw4 С*1507 инфекции спонтанный клиренс инфекции хроническая инфекция, хронический гепатит спонтанный клиренс инфекции прогрессирования HIV ускоренное прогрессирование B*1801, *3520, В*57, В*5801 В*46, В*56 спонтанный клиренс долговременное отсутствие B*57, B*14, B*27, Bw-4, B*5701 B*3501 Фенотипическая ассоциация хроническая инфекция P. falciparum HCV церебральная малярия устойчивость к малярии спонтанный клиренс инфекции ускоренное HIV прогрессирование хроническая инфекция Ассоциация полиморфизмов генов цитокинов с инфекциями и их исходом Ген Полиморфизмы и Патоген Фенотипическая ассоциация HBV хроническая инфекция +874A/T M. tuberculosis туберкулез –764G/С HСV спонтанный клиренс HBV хронический гепатит В –308G/–238G HBV хроническая инфекция –308G/A H. pylori гастрит и рак желудка СА-повторы HPV18 рак шейки матки –1082G/А,–819T/C, –592A/C HCV хронический гепатит С и цирроз гаплотипы +874A/T IFNG СА-повторы –238G/A –857C/T TNF –592 C/A IL10 +734 G/T RSV и другие возбудители пневмония, осложненная сепсисом +3367 G/A –592A/C M. tuberculosis –174G/С разные возбудители туберкулез хроническое воспаление и тяжелый сепсис сепсис, острый респираторный IL6 –174G/С разные возбудители дистресс-синдром, генерализованное воспаление –236G HIV и KSHV саркома Капоши +4272C/T вирус кори корь Фармакогенетика в персонализированной медицине Фармакогенетика Полиморфизм генов-кандидатов Скрининг SNP или других полиморфизмов Идентификация фармакологических мишеней Идентификация локусов предрасположенности к болезни Определение функционального значения полиморфизма Молекулярная диагностика Индивидуальная пациентоспецифичная терапия Инновационная биосенсорная технология PLEX Метод основан на сочетании мультиплексной ПЦР с времяпролетной масс-спектрометрии нуклеиновых кислот Возможности технологии • • • • • SNP-генотипирование Количественный анализ экспрессии генов Идентификация микроорганизмов (практически все бактерии, вирусы, грибы, определенные виды простейших, в том числе информация о лекарственной устойчивости, вирулентности, токсикогенности) Количественный анализ метилирования ДНК Профилирование редких соматических мутаций Апоптоз Энергозависимый, генетически детерминированный процесс упорядоченной гибели отдельных клеток, который происходит в нормальных и патологически измененных тканях эукариотов под действием внутри- и внеклеточных стимулов. “Термин “апоптоз” предложен для обозначения до сих пор недостаточно понятного механизма контролируемого разрушения клеток … это активный, по сути программируемый феномен, для которого доказана возможность активации или подавления различными стимулами окружающей среды, как физиологическими, так и патологическими”. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. (из статьи “Апоптоз: фундаментальный биологический феномен, широко участвующий в кинетике тканей”, 1972 г.) Сравнительная морфология апоптотического и некротического типов гибели клетки (по: Wyllie et al., 1998) Механизмы программированной гибели клеток • Внеклеточный (лиганд-рецепторное взаимодействие) • Внутриклеточный - митохондриальные рецепторы (белки суперсемейства Bcl-2) - каспазы - протеазы - белки теплового шока Методология исследования апоптоза • Маркеры апоптотических процессов отличаются лабильностью, а изменения регуляции апоптоза зачастую предшествуют развитию клинической картины; • При различных патологических процессах устойчивость клеток к индукции апоптоза, механизмы его развития могут существенно искажаться; • Применение адекватных методов исследования апоптоза при различных патологических процессах является необходимым условием изучения патогенеза заболеваний; • В лабораторной практике требуется определение нескольких показателей, а комплекс методов должен быть взаимодополняющим по информативности (феноменологические признаки, состояние молекулярных механизмов инициации и регулирования); Выделяют две группы исследований - Морфофункциональные (клеточный и субклеточный уровень) - Молекулярно-диагностические (уровни: генетический, рецепторный, регуляторный, эффекторный) Морфофункциональные исследования • Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза • Определение специфичных для апоптоза изменений плазматической мембраны клеток • Оценка митохондриальных процессов • Изучение характера фрагментации ДНК Морфофункциональные исследования • Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза • Определение специфичных для апоптоза изменений плазматической мембраны клеток • Оценка митохондриальных процессов • Изучение характера фрагментации ДНК Характеристика флюорохромов, применяемых для изучения апоптоза Проникающая способность в клетку Характеристика окраски Краситель интактная мембрана повреждѐнная мембрана ядро (ДНК) цитоплазма (РНК) Акридиновый оранжевый + + зелѐная красно-оранжевая Hoecsht 33342 + + голубая нет Hoecsht 33258 - + голубая нет DAPI (4’,6-диамидин-2’фенилиндолдигидрохлорид) - + ярко голубая нет Этидиум бромид - + оранжевая слегка красная Пропидиум йодид - + красная нет Морфофункциональные исследования • Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза • Определение специфичных для апоптоза изменений плазматической мембраны клеток • Оценка митохондриальных процессов • Изучение характера фрагментации ДНК Проточно-цитометрический анализ клеток линии Jurkat в состоянии апоптоза: до (а) и после (б) обработки камптотецином. На левом графике в нижнем правом квадранте расположены клетки, находящиеся в состоянии апоптоза (аннексин V – позитивные, PI – негативные). Клетки, не обработанные индуктором апоптоза, первоначально негативны по аннексин V-FLUOS и PI. После обработки камптотецином и инкубации клеток в течение нескольких часов выявляется довольно высокая доля клеток, находящихся в состоянии апоптоза. Люминесцентно-микроскопическое изображение клеток линии SKW6.4, окрашенных препаратами и их сочетаниями: а – аннексин V-FLUOS (окрашены только мембраны); б – DAPI (видна характерная для апоптоза конденсация ядер); в – аннексин V-FLUOS и пропидиум йодид (четко дифференцируются апоптотические и некротические клетки). а б в Морфофункциональные исследования • Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза • Определение специфичных для апоптоза изменений плазматической мембраны клеток • Оценка митохондриальных процессов • Изучение характера фрагментации ДНК Морфофункциональные исследования • Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза • Определение специфичных для апоптоза изменений плазматической мембраны клеток • Оценка митохондриальных процессов • Изучение характера фрагментации ДНК Выявление апоптотических клеток TUNEL-методом в эндометрии Морфофункциональные исследования Не позволяют определить состояние ключевых молекулярно-патологических звеньев апоптоза Молекулярно-диагностические исследования • Оценка эффективности рецепторных механизмов активации апоптоза • Оценка экспрессии ключевых регуляторных белков • Определение активности каспаз Молекулярно-генетические исследования • Мутационные изменения • Идентификация спонтанных и индуцированных апоптотических процессов • Малые интерферирующие РНК Современные представления об апоптозе – сформированы единые представления о типах гибели клеток; – изучаются молекулярные механизмы и феноменология программированной гибели клеток; – разрабатывается методология исследований апоптоза как основного типа программированной гибели клеток; – идентифицируются молекулярные мишени ключевых звеньев нарушений апоптоза при различных заболеваниях; – создаются фармакологические средства для целенаправленного регулирования программированной гибели клеток при различных патологических процессах. Кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики ВМедА им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!
