Бактериофаги - Ульяновская государственная

Материалы международной
научно-практической конференции
«Бактериофаги:
Теоретические и практические аспекты
применения в медицине, ветеринарии
и пищевой промышленности»
Том I
Ульяновск - 2013
Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» / - Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, т. I - 184 с.
ISBN 978-5-905970-14-6
Редакционная коллегия:
д.б.н., профессор Д.А. Васильев
д.б.н., профессор С.Н. Золотухин
д.б.н., А.В. Алешкин
Технический редактор Д.Н. Хлынов
Авторы опубликованных статей несут ответственность за достоверность и точность приведенных фактов, цитат, экономико-статистических данных, собственных имен,
географических названий и прочих сведений, а также за разглашение данных, не подлежащих
открытой публикации.
Отпечатано в типографии
«Ульяновской ГСХА им. П.А.Столыпина»
432063, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
© ФГбОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», 2013
Биология фагов
Биология фагов
УДК 578.81
СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ФАГОВЫХ
И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕПТИДОГЛИКАНГИДРОЛАЗ, НОВОГО
КЛАССА АНТИСТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНЗИБИОТИКОВ
Абаев И.В., кандидат медицинских наук,
тел. 7(4967) 36-00-03, abaev@obolensk.org
Скрябин Ю.П., тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org
Печерских Э.И., тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org
Шишкова Н.А., кандидат биологических наук,
тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org
Светоч Э.А., доктор ветеринарных наук, профессор,
тел. 7(4967) 36-00-79, svetoch@obolensk.org
ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии
Ключевые слова: пептидогликангидролазы, эндолизины, аутолизины, бактериальный лизис, стафилококки.
Работа посвящена анализу известных структурных типов бактериальных и бактериофаговых пептидогликангидролаз, рассматриваемых в качестве основы для разработки
перспективных антистафилококковых препаратов, прежде всего, против антибиотикорезистентных штаммов Staphylococcus���������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������
aureus��������������������������������������������
. Функциональные характеристики доменов пептидогликангидролаз позволяют создание рекомбинантных белков узконаправленного спектра
действия против одного или более родов грамположительных бактерий, например, только
стафилококков и стрептококков.
Патогены с множественной лекарственной устойчивостью являются актуальной проблемой здравоохранения во всем мире. Бактериальные и бактериофаговые пептидогликангидролазы (ПГ) в виде очищенных рекомбинантных белков способны убивать грамположительные бактерии в результате осмотического лизиса и оцениваются как новый класс антибактериальных веществ, расщепляющих различные ковалентные связи пептидогликана бактерий. ПГ
представляют собой потенциальный источник нового поколения антимикробных препаратов
для лечения лекарственно-устойчивых форм возбудителей.
ПГ разрушают пептидогликан - основной компонент бактериальной стенки [1]. Характерными свойствами ПГ по сравнению с другими возможными источниками новых антибактериальных препаратов являются a�����������������������������������������������������
������������������������������������������������������
) низкая вероятность возникновения резистентности патогенов к ПГ, b) узкий спектр литического действия – способность разрушать только целевые
бактерии, c) эффективный лизис бактериальных биопленок.
Фаговые ПГ (эндолизины) - продукт ко-эволюция бактерий и фагов. Выживание фага
основывается на его способности деградировать пептидогликан и высвобождать новые фаговые частицы. Аналогично, бактериальные ПГ (аутолизины) необходимы для обеспечения
3
Биология фагов
процессов роста клеточной стенки, деления клеток, споруляции самой бактериальной клетки.
Случаи возникновения бактериальной устойчивости к эндолизинам не были выявлены, несмотря на неоднократные попытки [2]. Вполне вероятно, что ко-эволюция бактерий и фагов
сделала мишенью ПГ неизменяемые связи пептидогликана.
Родо – или даже видоспецифичность ПГ по отношению к патогенам позволяет целенаправленно воздействовать только на инфекционный агент, не затрагивая широкий спектр
сопутствующей микрофлоры. Специфичность ПГ позволяет избежать многих ошибок, связанных с использованием антимикробных препаратов широкого спектра действия, которые
приводят к селекции резистентных штаммов не только у целевого возбудителя, но и у комменсалов, на которые препарат воздействует. Согласно рекомендациям ВОЗ для снижения уровня
распространения антибиотикорезистентности следует избегать воздействия антибиотиков широкого спектра действия на бактериальные сообщества комменсалов. ПГ, вследствие родовой
и видовой специфичности, выгодно отличаются в этом отношении от антибиотиков.
Высокая степень резистентности к антибактериальным препаратам многих возбудителей и понижение их восприимчивости к фагоцитозу, как известно, обусловлена множественными изменениями в клетках патогена, сопровождающими рост биопленки. Благодаря фиксированным формам бактериальных колоний, биопленки могут закрепляться на поверхности механических или протетических устройств, или прикрепляться к слою клеток млекопитающих.
Бактерии в биопленке могут быть на несколько порядков более устойчивыми к воздействию
антибиотиков, чем в жидкой культуре [3]. Использование ферментов, способных разрушать
биопленки, делает более эффективным лечение стафилококковых инфекций [4]. Для стафилококковых ПГ показана эффективная способность разрушать биопленки S. aureus [5].
Перечисленные характеристики стафилококковых ПГ во многом определяются модульной структурой этих ферментов. По локализации гены стафилококковых ПГ разделяют на
два типа: 1) гены эндолизинов, которые входят в состав фагов/профагов, 2) гены аутолизинов,
которые локализуются в бактериальной хромосоме и плазмидах. Эндолизины и аутолизины
обладают доменной структурой: один-два каталитических домена и субстрат-связывающий
домен, который может быть в нескольких повторах. Организация доменной структуры имеет
различные варианты по составу и локализации доменов.
По каталитической активности выделяют три основных класса ПГ стафилококков,
способные расщеплять пептидные, амидные или гликозидные связи пептидогликана. Соответственно, выделяют эндопептидазные, амидазные и гликозаминидазные каталитические домены [1]. Каждый каталитический домен состоит из коротких последовательностей
в 100-200 аминокислот. Среди субстрат-связывающих доменов наиболее часто встречаются
два типа: SH3_5 домен и LysM домен. Для эндолизинов наиболее характерны три основных
типа структуры – a��
���
) ����������������������������������������������������������������
N���������������������������������������������������������������
-концевая эндопептидаза (цистеин-гистидин-зависимой амидогидролазы (CHAP) (pfam 05257; GO:0008745)), второй каталитический домен – амидаза-2 (pfam
01510; GO:0008745), и С-терминальный SH����������������������������������������������
������������������������������������������������
3���������������������������������������������
b��������������������������������������������
_5 домен (pfam08460); b���������������������
����������������������
) N������������������
�������������������
-концевая эндопептидаза (CHAP) и С-терминальный SH3b_5 домен; c) N-концевая эндопептидаза (CHAP) и
домен гликозаминидазы (cl00743). Отсутствие в составе ряда опубликованных эндолизинов
С-терминального SH������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������
3_5 домена, возможно, связано со сложностями идентификации нестандартных вариантов данного домена.
Принципиальным отличием известных аутолизинов от эндолизинов является локализация эндопептидазного домена на С-конце. Всего выделяются три основных варианта структуры: a����������������������������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������������������
) ��������������������������������������������������������������������������������
N�������������������������������������������������������������������������������
-концевой LysM�����������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������
домен и С-терминальная эндопептидаза; ��������������������������
b�������������������������
) С-терминальная эндопептидаза без идентифицированного LysM домена; и c) домен гликозаминидазы и С-терминальная
эндопептидаза.
На сегодняшний день идентифицировано, как минимум, шесть различных вариантов
эндопептидазного (��������������������������������������������������������������������
CHAP����������������������������������������������������������������
) домена, один вариант эндопептидазного M23A домена, и два варианта амидазного домена.
4
Биология фагов
Информация о наличии доменного разнообразия у ПГ стафилококков важна в свете
задач по получению рекомбинантных ферментов, обладающих набором новых свойств, неприсущих природным пептидогликангидролазам. Как правило, получению новых слитых белков
предшествует стадия идентификации ПГ, способных лизировать живые клетки стафилококков, и стадия делеционного анализа и идентификации функциональных литических доменов,
сохраняющих активность в виде отдельных белков.
Большинство ПГ, способных лизировать живые клетки S. aureus, представляют собой
классический вариант эндолизина, состоящего из трех доменов – двух каталитических (CHAP
и амидаза) и SH3_5 домена. Это эндолизин (LysK) фагаК, эндолизин фага phi11, эндолизин
фага ΦSH2 и эндолизин lysWMY фага M [6, 5, 7, 8] и др. Структуры из двух каталитических
доменов - гликозаминидазы и С-терминальной эндопептидазы, к которым относится белок 17
вириона фага P68 и белок gp61 фага MR11, также проявляли активность против живых клеток
клинических изолятов S. aureus [9;10].
Данные делеционного анализа показали исключительный вклад ������������������
CHAP��������������
доменов в литическую активность эндолизинов, тогда как амидазный домен в одиночку, как правило, не
имеет литической активности против живых клеток. Известен только один случай доминирующего положения амидазного домена [11], способного в виде изолированного белка эффективно убивать живые клетки стафилококков. Этот факт представляется важным в свете создания
химерных белков, состоящих из трех активных синергетически действующих каталитических
доменов.
Способ осуществления субстрат-специфичной функции ПГ остается неясным. Изолированные каталитические домены стафилококковых эндолизинов в полной мере сохраняют
специфичность, присущую полному белку [6, 7, 11]. При этом наличие субстрат-связывающего домена, как правило, мало влияет на литическую активность рекомбинантного белка,
но оказывает сильное влияние на такое свойство, как растворимость. Неожиданным фактом
является литическая активность против стрептококков и стафилококков рекомбинантной ПГ,
полученной на основе слияния каталитического пептидазного домена из стрептококкового эндолизина и субстрат-связывающего домена стафилококкового фага [12]. Таким образом, функциональные характеристики доменов ПГ позволяют создание рекомбинантных белков узконаправленного спектра действия против одного или более родов грамположительных бактерий,
например, только стафилококков и стрептококков.
Терапевтический потенциал ряда стафилококковых рекомбинантых ПГ уже продемонстрирован результатами экспериментов на мышах in vivo [10; 13, 14]. Защитное действие новых антимикробных препаратов in vivo свидетельствует о высоком потенциале слитых белков,
обладающих антимикробным действием, в качестве новых терапевтических средств лечения
инфекций, вызванных MRSA, а также других стафилококковых заболеваний.
Библиографический список
1. Lopez R, Garcia E. Recent trends on the molecular biology of pneumococcal capsules,
lytic enzymes, and bacteriophage // FEMS Microbiol Rev, 2004; 28: 553-580.
2. Fischetti VA. Bacteriophage lytic enzymes: novel anti-infectives // Trends Microbiolб
2005; 13: 491-496.
3. Amorena B, Gracia E, Monzon M, Leiva J, Oteiza C, Perez M, Alabart JL, HernandezYago J. Antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus in biofilms developed in vitro // J
Antimicrob Chemother, 1999; 44: 43-55.
4. Otto M. Bacterial evasion of antimicrobial peptides by biofilm formation // Curr Top Microbiol Immunol, 2006; 306: 251-258.
5. Sass P, Bierbaum G. Lytic Activity of Recombinant Bacteriophage {phi}11 and {phi}12
Endolysins on Whole Cells and Biofilms of Staphylococcus aureus // Appl Environ Microbiol, 2007;
73, 347-352.
5
Биология фагов
6. Becker SC, Dong S, Baker JR, Foster-Frey J, Pritchard DG, Donovan DM. LysK CHAP
endopeptidase domain is required for lysis of live staphylococcal cells // FEMS Microbiology letters,
2009; 294, 52-60.
7. Schmelcher M, Korobova O, Schischkova N, Kiseleva N, Kopylov P, Pryamchuk
S, Donovan DM, Abaev I. Staphylococcus haemolyticus prophage �����������������������������
����������������������������
SH2 endolysin relies on cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/peptidases activity for lysis ‘from without’ // J Biotechnol, 2012;162(2-3):289-98.
8. Yokoi KJ, Kawahigashi N, Uchida M, Sugahara K, Shinohara M, Kawasaki K, Nakamura
S, Taketo A & Kodaira K. The two-component cell lysis genes holWMYand lysWMYof the Staphylococcus warneri M phage var phiWMY: cloning, sequencing, expression, and mutational analysis in
Escherichia coli // Gene, 2005; 351: 97–108.
9. Takac M, and Blasi U. Phage P68 Virion-Associated Protein 17 Displays Activity
against Clinical Isolates of Staphylococcus aureus // Microbiology. Antimicrob Agents Chemother,
2005;49(7): 2934–2940.
10. Rashel, M., J. Uchiyama, I. Takemura, H. Hoshiba, T. Ujihara, H. Takatsuji, K. Honke,
and S. Matsuzaki. Tail-associated structural protein gp61 of Staphylococcus aureus phage phi MR11
has bifunctional lytic activity // FEMS Microbiol. Lett, 2008; 284:9-16.
11. Abaev I, Foster-Frey J, Korobova O, Shishkova N, Kiseleva N, Kopylov P, Pryamchuk
S, Schmelcher M, Becker SC, Donovan DM. Staphylococcal Phage 2638A endolysin is lytic for
Staphylococcus aureus and harbors an inter-lytic-domain secondary translational start site // Appl
Microbiol Biotechnol, 2012; [Epub ahead of print]
12. Becker SC, Foster-Frey J, Stodola AJ, Anacker D, Donovan DM. Differentially conserved staphylococcal SH3b_5 cell wall binding domains confer increased staphylolytic and streptolytic activity to a streptococcal prophage endolysin domain // Gene, 2009; 443:32– 41.
13. Daniel A, Euler C, Collin M, Chahales P, Gorelick KJ, Fischetti VA. Synergism between
a novel chimeric lysin and oxacillin protects against infection by methicillin-resistant Staphylococcus
aureus // Antimicrob Agents Chemother, 2010; 54(4):1603-12.
14. Fenton M, Casey PG, Hill C, Gahan CG, Ross RP, McAuliffe O, O’Mahony J, Maher F,
Coffey A. The truncated phage lysin CHAP(k) eliminates Staphylococcus aureus in the nares of mice
// Bioeng Bugs, 2010; 1(6):404-407.
SYSTEM ANALYSIS OF GENETIC STRUCTURE OF PHAGE
AND BACTERIAL PEPTIDOGLYCAN HYDROLASES, A NEW CLASS
OF ANTISTAPHYLOCOCCAL ENZYBIOTICS
Abaev IV, Skryabin YuN, Pechrskich EI, Shishkova NA, Svetoch EA
Key words: peptidoglycan hydrolases, endolysins, autolysins, bacterial lysis, staphylococci.
The aim of the study is to analyze known structural bacterial and bacteriophage peptidoglycan
hydrolases as a basis for developing novel antimicrobials against staphylococci especially against
MRSA. Functional properties of peptidoglycan hydrolases domains allow designing new recombinant
specific proteins against one or several genera of gram-positive bacteria, e.g. against staphylococci
and streptococci only.
6
Биология фагов
УДК 578:612.017.1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВЫХ ПЕПТИДНЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ
ИЗУЧЕНИЯ ЭПИТОПОВ, УЗНАВАЕМЫХ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ
ВИЧ-1 АНТИТЕЛАМИ ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ Z13E1,
VRC03 И VRC01
Ильичев А. А. , Чикаев А. Н. , Щербаков Д. Н., Федина Н. В. ,
Бакулина А. Ю. , Карпенко Л. И.
ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии
«Вектор», Кольцово, Новосибирская обл., 630559, Россия
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки
Российской Федерации (соглашение 8278 от 10.08.12), РФФИ (грант № 12-04-91452-НИЗ_а
и грант № 12-04-31948 мол_а)
отеки
Ключевые слова: фаговый дисплей, эпитопы, антитела, фаовые пиптидные библи-
Благодаря работам Дж.Смита в 1985 г. и А. Ильичева в 1989 г. был разработан метод, впоследствии названный фаговым дисплеем, который основан на способности нитчатых
бактериофагов М13 экспонировать на поверхности вириона случайные пептидные последовательности в составе белка p3 или p8 без потери инфекционности [1, 2].
Фаговый дисплей получил свое развитие как мощный метод для изучения белок-белковых взаимодействий, обеспечивающий прямую физическую связь между пептидной последовательностью, экспонированной на поверхности бактериофага и фрагментом ДНК, кодирующий данный пептид в фаговом геноме. Комбинаторные фаговые библиотеки состоят из
бактериофагов, в ген оболочечных белков которых встраиваются случайные (рандомизированные) олигонуклеотидные последовательности определенной длины. В результате получается
пул (библиотека) бактериофагов, экспонирующих рандомизованные последовательности аминокислот в составе одного из поверхностных белков. Библиотеки используются для селекции
специфических фагов, взаимодействующих с целевым лигандом. По окончании последнего
раунда селекции полипептиды, экспрессированные на поверхности фага, могут быть идентифицированы путем секвенирования ДНК индивидуальных клонов [3].
Технология фагового дисплея достаточно экономична и не требует дорого оборудования, однако при этом позволяет решить вопросы, которые не всегда удается решить с помощью
рентгеноструктурного анализа [4].
Одним из интересных применений технологии фагового дисплея является идентификация эпитопов, узнаваемых антителами, обладающими повышенной эффективностью нейтрализовать вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Эти особые антитела были обнаружены у ВИЧ-инфицированных долгожителей относительно недавно и были названы нейтрализующими антителами широкого спектра действия [5]. В настоящее время известно несколько
десятков таких антител. Среди них особый интерес представляют моноклональные антитела
(МКА) ������������������������������������������������������������������������������
Z�����������������������������������������������������������������������������
13���������������������������������������������������������������������������
e��������������������������������������������������������������������������
1, VRC03 и ���������������������������������������������������������������
V��������������������������������������������������������������
RC01, для которых показана нейтрализующая активность в отношении 91 % всех известных штаммов ВИЧ-1 [6].
Цель исследования – получить пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, взаимодействующих с антителами Z13e1, VRC03 и VRC01, с использованием фаговых пептидных библиотек.
7
Биология фагов
Материалы и методы
Моноклональные антитела (МКА) VRC01, VRC03 и Z13e1 были получены в рамках
программы NIH AIDS Research and Reference Program (США). В работе использовались коммерческие фаговые библиотеки Ph.D-12, Ph.D-7, Ph.D-c7c Phage Display Peptide Library Kit
(«�����������������������������������������������������������������������������������
New��������������������������������������������������������������������������������
England������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������
Biolabs����������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������
», США). Данные наборы содержат комбинаторную библиотеку случайных пептидных фрагментов длиной 12 или 7 аминокислотных остатков соответственно, объединенных с минорным белком оболочки pIII фага M13. Библиотека содержит приблизительно
3 × 109 индивидуальных фаговых клонов.
Аффинная селекция фаговых пептидных библиотек проводилась в соответствии с
протоколом, описанным в руководстве к наборам фаговых библиотек («New England Biolabs»,
США). Проводилось три цикла аффинной селекции, после чего из отобранных индивидуальных бактериофагов выделялась ДНК (в соответствии с рекомендациями производителя фаговой библиотеки) и определялась ее нуклеотидная последовательность. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в центре секвенирования ДНК ИХБФМ СО РАН. Иммуноблотинг (дот
блот) бактериофагов с соответствующими МКА проводили по методике, описанной в статье
[3].
Для определения соответствия между отобранными последовательностями пептидов
и антигеном gp120 использовались сервер Pepitope (http://pepitope.tau.ac.il/) и собственное программное обеспечение. Также использовалась разработанная нами программа pdMap, написанная на языке python с использованием библиотеки BioPython [7]. Она реализует аналогичный метод, но вместо пар остатков используются отдельные остатки, а район поиска эпитопа
на антигене задается пользователем.
Результаты и обсуждения
Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ-1, узнаваемые МКА VRC01
МКА VRC01 принадлежат к классу IgG1, несут легкую цепь типа κ (каппа) и взаимодействуют с областью белка gp120, являющейся сайтом связывания вируса с CD4-клетками.
VRC01 обладают нейтрализующей активностью против большинства субтипов ВИЧ-1 [6].
Отбор фаговых клонов, специфично связывающихся с антителами VRC01. Методика
аффинной селекции (биопэннинг) позволяет отбирать из пептидной библиотеки бактериофагов те из них, которые несут пептиды, обладающие наибольшим сродством к молекулам-мишеням. На первом этапе МКА иммобилизуются на пластиковой поверхности планшетов, после чего к ним добавляется фаговая пептидная библиотека. Далее, после наступления кинетического равновесия, несвязавшиеся с антителами фаги отмываются промывочным буфером,
оставшиеся специфично связанные фаговые клоны элюируются и размножаются для нового
цикла селекции. Обычно достаточно проведения трех раундов аффинной селекции, чтобы получить обогащенную популяцию фагов, содержащих целевые последовательности. Из обогащенной таким образом фаговой библиотеки после проведения нескольких раундов аффинной
селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют специфичность их связывания с соответствующими МКА с помощью ИФА или иммуноблоттинга. Аминокислотный
состав специфичных к МКА пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, определяют путем секвенирования фаговых ДНК в кодирующей пептид области.
Было проведено два независимых эксперимента, включающих 3 раунда аффинной селекции, с использованием антител VRC01 и библиотеки Ph.D-12. В результате отобраны индивидуальные фаговые клоны и определены структуры их рандомизированных вставок (табл.1).
8
Биология фагов
Таблица 1 - Аминокислотные последовательности, узнаваемые МКА VRC01, отобранные из фаговых пептидных библиотек. Цветом выделены совпадающие аминокислотные остатки (общие структурные мотивы)
Номер фагового
клона
Количество повторов
Аминокислотная
последовательность
экспонированного пептида
Характеристика антигенных свойств отобранных клонов. Специфичность связывания выделенных бактериофагов с МКА подтверждали с помощью дот-блот анализа. Результаты взаимодействия фаговых клонов с МКА VRC01 представлены на рис. 1. Показано, что
фаготопы № 15, 16, 26, 28, 36, 42, 49, 63 и 65 связываются с МКА VRC01 c наибольшей аффинностью. Большинство полученных фаговых клонов экспонируют пептиды, которые содержат
общий мотив вида UOXXJUXXWXXX, где X – любой аминокислотный остаток; U – гидрофобный неароматический (Leu, Ile либо Val); O – Ser либо Thr; J – отрицательно заряженный
(Asp либо Glu).
9
Биология фагов
VRC01.
Рис. 1 - Иммуноблот-гибридизация исследуемых фаговых клонов с антителами
На нитроцеллюлозную мембрану наносили последовательные пятикратные разведения фаговых частиц, суспендированных в 2 мкл PBS
Идентификация района связывания пептидов с VRC01. С целью определения возможного района связывания пептидов с VRC01 нами проанализирована структура комплекса
антитела VRC01 с gp120, которая получена методом рентгеноструктурного анализа. В данном
комплексе в структуре gp120 отсутствуют петли V3 и V1 / V2, так как они препятствуют кристаллизации gp120. В состав эпитопа входят следующие фрагменты gp120: остатки 123, 124 и
198 (остаток 198 в структуре следует непосредственно за 124, это район удаленной петли V1 /
V2), районы 276–283 (петля D), 365–371 (CD4-связывающая петля), 427–430, 455–474 (петля
V5). Мы предположили, что найденные методом фагового дисплея пептиды способны имитировать какие-либо фрагменты эпитопа VRC01 на поверхности gp120.
Сервер Pepitope не смог правильно определить соответствие пептидов и gp120, все
найденные варианты лежали за пределами известного эпитопа. Причиной этого могут быть
особенности структуры эпитопа либо пептидной библиотеки.
Программа pdMap обнаружила наилучшее соответствие консенсусной последовательности пептидов с gp120 в районе CD4-связывающей петли. Поиск соответствующего района
gp120 был изначально ограничен остатками, входящими в состав эпитопа антитела VRC01.
На рис. 2 представлено выравнивание фрагмента gp120 c пептидами из клонов, взаимодействие которых с VRC01 подтверждено методом иммуноблоттинга. В литературе отмечено, что
остатки Asp368 и Ile371 входят в число пяти ключевых остатков, вносящих наибольший вклад
в связывание gp120 с VRC01 (Wu et al., 2012). Эпитоп VRC01 не включает в себя ни одного
бокового радикала триптофана, фенилаланина или тирозина, поэтому С-концевая половина
пептидов XXWXXX, по всей видимости, не имитирует районы gp120, а связывается с антителом каким-то другим образом.
10
Биология фагов
Рис. 2 - Выравнивание пептидов из клонов, показавших наибольшую аффинность связывания в иммуноблотинге с VRC01 и фрагмента 365-371 gp120.
Выделены а.о., соответствующие консенсусной последовательности
Чтобы подтвердить возможность связывания пептидов с антителом VCR01 в районе взаимодействия с CD4-связывающей петлей, нами построена модель фрагмента пептида
VSWPELYKWTWS из наиболее распространенного клона отобранного в результате аффинной
селекции. В результате выявлено, что фрагмент SWPEL способен имитировать район 365–371
gp120 без каких-либо стерических ограничений (рис. 3).
Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ-1, узнаваемые МКА VRC03
С использованием антител VRC03 в качестве молекулы-мишени после проведения
процедуры аффинной селекции из пептидных библиотек Ph.D-12, Ph.D-C7C и Ph.D-7 было
отобрано 68, 20 и 12 фаговых клонов соответственно. Секвенирование и последующий компьютерный анализ с использованием онлайн инструмента MimoDB позволили выявить уникальные аминокислотные последовательности среди пептидов, полученных с помощью всех
трех библиотек (табл. 2). При сравнении пептидных последовательностей, полученных
с помощью библиотек Ph.D-12 и Ph.D-C7C
были выявлены критические для связывания
аминокислоты P (Pro) иL(Leu).Таким образом, общий мотив выглядит следующим образом: P (Pro), X, L(Leu)/V(Val). В результате аффинной селекции из библиотеки Ph.D7 был получен несколько отличный мотив
вида P(Pro)/L(Leu)/A(Ala), W(Trp), Y(Tyr), K
(Lys)/R(Arg), L(Leu)/V(Val)/I(Ile), P (Pro). При
сравнении пептидных последовательностей,
полученных с помощью библиотек Ph.D-12
и Ph.D-C7C были выявлены критические для
связывания аминокислоты P (Pro) и L(Leu).
Т.о., общий мотив выглядит следующим образом: P (Pro), X, L(Leu)/V(Val). В результате аффинной селекции из библиотеки
Рис. 3 - Модель взаимодействия
Ph���������������������������������������
.��������������������������������������
D�������������������������������������
-7 был получен несколько отличный мофрагмента пептида SWPEL с VRC01. Антитив вида P(Pro)/L(Leu)/A(Ala), W(Trp), Y(Tyr),
тело показано в виде поверхности, gp120 – в
K (Lys)/R(Arg), L(Leu)/V(Val)/I(Ile), P (Pro).
Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ- виде линии, соединяющей атомы основной
цепи, у фрагмента 365–371 показаны боко1, узнаваемые МКА Z13е1
В результате аффинной селекции с вые радикалы, пептид изображен толстой
использованием антител Z13e1 было отобрано полупрозрачной линией.
11
Биология фагов
Таблица 2 - Уникальные аминокислотные последовательности, полученные для
моноклонального антитела широкого спектра действия VRC03
12 мерная библиотека
с7с мерная библиотека
7 мерная библиотека
60 фаговых клонов из библиотеки ������������������������������������������������������
Ph����������������������������������������������������
.���������������������������������������������������
D��������������������������������������������������
-12 и 10 клонов из Ph.D-7. Секвенирование и последующий компьютерный анализ позволили выявить уникальные аминокислотные последовательности среди пептидов, полученных с помощью этих библиотек (табл. 3). Специфичность
связывания всех полученных бактериофагов с МКА Z13e1 подтверждали с помощью Вестернблот анализа. Результаты взаимодействия антител и фаговых клонов, отобранных в результате
аффинной селекции из библиотеки Ph.D-12, приведены на рис. 4. В результате было показано,
что из всех фаготопов c наибольшей аффинностью с МКА Z13e1 связываются фаги №№1, 7,
9 3, 23, 2, 28, 25, 37, 24, полученные в результате проведения биопэннинга с использованием
фаговой библиотеки Ph.D-12. При сравнении пептидных последовательностей был выявлен
мотив длиной 6 а.о. следующего вида: N(Asn), Y(Tyr)/W(Trp), X, D(Asp), I(Ile)/L(Leu)/V(Val),
T(Thr). Полученную пептидную последовательность сравнили с литературными данными об
аминокислотной последовательности эпитопа на поверхности gp41, с которым связывается
МКА Z13e1 [8].
Таблица 3 - Уникальные аминокислотные последовательности, полученные для
моноклонального антитела широкого спектра действия Z13e1
12 мерная библиотека
7 мерная библиотека
12
Биология фагов
Рис. 4 - Результат Вестерн-блот анализа фаговых клонов с антителами Z13e1.
На нитроцелюллозную мембрану наносили последовательные десятикратные разведения фаговых частиц, суспендированных в 2 мкл PBS. В качестве отрицательного
контроля был использован бактериофаг №8, не содержащий искусственную пептидную встройку.
Данный эпитоп является линейным, в его состав входят следующие а.о. : WNWFDITN.
Было обнаружено, что последовательность gp41 ВИЧ-1 почти полностью совпадает с мотивом отобранных фаговых пептидов. Единственным заметным отличием отбираемых фаговых
пептидов является очень низкая встречаемость F (фенилаланина) в позиции между W и D. В
то же время в данной позиции он присутствует в пептидных встройках, экспонированных в
составе поверхностного белка фаговых частиц. Возможно, это связано с тем, что регион gp41
находится в альфа-спиральной конформации, и данный аминокислотный остаток находится на
противоположной стороне альфа-спирали, максимально удаленной от антигенсвязывающего
участка антитела. Поэтому нахождение в этой позиции фенилаланина не является строгим.
Эти результаты свидетельствуют о том, что с использованием фагового дисплея получены пептиды имитаторы эпитопа gp 41, с которыми связывается МКА Z13e1.
Библиографический список
1. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned
antigens on the virion surface // Science. – 1985. – V. 228(4705). – P. 1315–1317.
2. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев Н.Н., Ерошкин А.М., Петренко В.А., Сандахчиев Л.С. Получение жизнеспособного варианта фага М13 со встроенным
чужеродным пептидом в основной белок оболочки // Доклады Академии Наук. – 1989. – Т.307.
- 481-483.
3. Smith G. P., Scott J. K. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage
// Methods in enzymology. 1993. Vol. 217. P. 228–257.
4. Zolla-Pazner S. Identifying epitopes of HIV-1 that induce protective antibodies // Nat.
Rev. Immunol. 2004. Vol. 4, № 3. P. 199–210.
5. Mascola J. R., Montefiori D. C. The Role of Antibodies in HIV Vaccines // Annual Review
Immunology. 2010. Vol. 28. P. 413–444.
6. Wu X., Wang C., O’Dell S., Li Y., Keele B. F., Yang Z., Imamichi H., Doria-Rose N.,
Hoxie J. A., Connors M., Shaw G. M., Wyatt R. T., Mascola J. R. Selection Pressure on HIV-1 Envelope by Broadly Neutralizing Antibodies to the Conserved CD4-Binding Site // J. Virol. 2012. Vol.
86, № 10. P. 5844–5856.
7. Cock P. J., Antao T., Chang J. T., Chapman B. A., Cox C. J., Dalke A., Friedberg I., Hamelryck T., Kauff F., Wilczynski B., Hoon M. J. de. Biopython: freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, № 11. P. 1422–1423.
8. Zwick M.B., Bonnycastle L.L., Menendez A., Irving M.B., Barbas C.F. 3rd, Parren P.W.,
13
Биология фагов
Burton D.R., Scott J.K. Identification and characterization of a peptide that specifically binds the
human, broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody b12 // J. Virol. –
2001. – V. 75(14). - P. 6692-9.
УДК 578.81
ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ФАГОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ
БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ОБРАЗЦОВ КАРТОФЕЛЯ
Андрийчук Е.Н. , кандидат биологических наук
Киевский национальный университет им. Тараса Шевченка, Украина
+380675045549, aom502@ukr.net
Ключевые слова: Бактериофаги, фитопатогенные бактерии, литическая активность, БОЕ.
Работа посвящена исследованиям фагов фитопатогенных бактерий Х. axonopodis
pv. beticola 7325, Pseudomonas fluorescens 8573, Paenibacillus polymyxa 9034 с целью изучения
их влияния на патогенную микрофлору. Изучено морфологию негативных колоний, определен
спектр литической активности фагов до 20 штаммов бактерий. За особенностями строения
фаги были отнесены к таксономическим группам.
Введение. При выращивании и хранении сельскохозяйственных продуктов специалисты постоянно сталкиваются с проблемой поражения растений бактериальными заболеваниями. В связи с длительным использованием химических средств для защиты растений в Украине,
чрезвычайно важной является задача разработки новых, экологически чистых средств защиты
растений. Традиционные методы химической защиты растений не позволяют избирательно
воздействовать на отдельные микроорганизмы, не уничтожая нормальную микрофлору агроценозов. Бактериофаги (вирусы бактерий) не имеют этого существенного недостатка. Проявляя специфичность и поражая только определенные группы бактерий, фаги предотвращают
как распространение инфекционных заболеваний у растений, так и истощение черноземов.
Внедрение новой экологически обоснованной системы ведения сельского хозяйства и защиты
растений является важной научной задачей, что позволит получить полноценную конкурентоспособную продукцию сельскохозяйственного производства без остатков ядохимикатов. Их
основным преимуществом является безопасность для человека и окружающей среды, а также
более дешевое производство.
Целью работы было - получить и охарактеризовать изоляты фагов к бактериям - патогенов Solanum tuberosum и проведение их сравнительного анализа для дальнейшей разработки высокоэффективного и экологически безопасного антибактериального препарата на основе
вирусов микроорганизмов для борьбы с бактериальными болезнями растений.
Материалы и методы исследований. Объектом исследований были изоляты фагов, выделены к Х. axonopodis pv.beticola 7325- туберкулез сахарной свеклы; Pseudomonas
fluorescens 8573- мягкая гниль; Paenibacillus polymyxa 9034 - гниль картофеля. В работе использовали индикаторные культуры фитопатогенных бактерий, полученных из коллекции
музея Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, отдела
фитопатогенных бактерий (штаммы: Х. axonopodis pv. вeticola 7325; Pseudomonas fluorescens
14
Биология фагов
8573; Paenibacillus polymyxa 9034; Clavibacter michiganensis sumsp. sepedonicus 7750;
Erwinia carotovora (Pectobacterium carotovorum) 8982; Erwinia carotovora subsp. аtroseptica
(Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum 8446); Pseudomonas syringae pv. tabaci 223;
Erwinia caratovora 216; Pseudomonas syringae pv. atrofaciens1025; Pseudomonas syringae pv. ���
a��
ptata 185; Pseudomonas syringae pv. tabaci 8646; Pseudomonas chlororophis 8612; Burkholderia
gladicli pv. allicola 8494; Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola 4228; Pseudomonas savastanoi
pv. phaseolicola 4013; Pseudomonas viridiflava 8867; Pseudomonas syringae pv. aptata 8545;
Pseudomonas syringae pv. syringae 8653; Clavibacter michiganensis sumsp. sepedonicus 7750;
Erwinia carotovora subsp. atroseptica 8446.
Чистые линии бактериофагов получали путем шестикратного пассирования с использованием методом выкалывания отдельных негативных колоний. Были получены изоляты бактериофагов, которые использовали в дальнейшем для работы.
Для выращивания бактерий и титрования фагов использовали готовые коммерческие
агаризованные питательные среды, на основе рыбного гидролизата. Разведение фагов проводили на 0,9% растворе NaCl (физиологический раствор) или коммерческом мясном бульоне,
приготовленном согласно инструкции предприятия-изготовителя. Титр определяли по Грациа
и методом spot-test в бляшкообразующих единицах на мл (БОЕ / мл).
Концентрирования и очистку фагов проводили методами высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности CsCl. Дальнейшая очистка вируса (от остатков цезия
CsCl) проводилась методом дифференциального центрифугирования.
Контроль чистоты выделенных вирусных препаратов определяли спектрофотометрическим, электронномикроскопическим методами. Электронномикроскопический анализ образцов проводили по общепринятым методикам.
Морфологию вирусных частиц изучали с помощью электронного микроскопа Jeol
JEM - 1400. Препараты готовили методом негативного контрастирования уранилацетатом.
Анализ електроннограмм показал, что исследуемые фаги отличались по строению вирионов
и размеру.
Результаты исследований и их обсуждение.
Выделение бактериофагов проводили с проб корнеплодов картофеля, которые отбирали из отдельных овощехранилищ разных регионов Украины. Бактериофаги выделяли до
фитопатогенных бактерий семейств Pseudomonas, Paenibacillus, Xanthomonas. Выбор индикаторных культур был обусловлен высоким удельным весом фитопатогенных бактерий этих
семейств среди возбудителей, вызывающих болезни картофеля.
Образцы отбирали из клубней картофеля за характерными симптомами бактериального заболевания. В основном бактериальные болезни проявляются во время хранения. И именно поэтому образцы отбирали после хранения их в овощехранилищах. При поражении картофель размягчается и увлажняется, превращаясь в слизистую массу темно-бурой или розовой
окраски с неприятным запахом. В хранилище заболевание чаще наблюдается в верхнем слое
(20 - 25 см), где сохраняется повышенная влажность воздуха. Болезнь обостряется при резких
колебаниях температуры, повышенной влажности воздуха, переохлаждении или подмораживании клубней, механическими повреждениями, а также при заражении их другими болезнями
- бурой бактериальной гнилью, черной ножкой, мягкой гнилью, кольцевой гнилью. Для предотвращения заболевания необходимо своевременно и бережно убирать продукцию, тщательно отбирать здоровый посадочный материал и поддерживать оптимальный режим хранения.
В отдельных агроценозах было обнаружено колебание эффективности выделения фагов по числу положительных проб в зависимости от региона. О распределении положительных
результатов по регионам Украины, то можно акцентировать, что бактериофаги к Paenibacillus
15
Биология фагов
polymyxa 9034 и Pseudomonas fluorescens 8573 встречались чаще других. К бактерии Х.
axonopodis pv.beticola 7325 было обнаружено лишь один положительный результат.
Кроме этого, еще было замечено сильное колебание биологической активности выделения бактериофагов из природных биоценозов. Было очень тяжело выделить из почвы изоляты фагов. Этот факт свидетельствует о низкой вероятности распространения и сохранения
популяции бактериофагов именно в почве. Это может объясняться коротким сроком хранения
бактерий в почве и применением севооборотов на опытных полях [1].
Для получения чистых линий проводили не менее шести пассажей.
Сравнительная характеристика титров бактериофагов проводили с помощью тест культур (Х. axonopodis pv.beticola 7325; Pseudomonas fluorescens 8573; Paenibacillus polymyxa
9034, проведенных по разным методикам: титрование по Грация и титрования методом spottest.
Для дальнейшей работы были отобраны образцы с определенными симптомами гнили
- кольцевая гниль картофеля, мягкая гниль.
Изучены и исследованы негативные колонии бактериофагов, которые были получены
в лаборатории, различались по размерам, особенностями морфологии и скорости формирования их негативных колоний.
Для первого цикла исследований отбирали фаги 8573, 8573/гр, 8573/5 - чувствительная культура Pseudomonas fluorescens 8573, они образовывали прозрачные бляшки диаметром от 1 до 3 мм; фаги 7325\1 - чувствительная культура Х. axonopodis pv.
beticola 7325 образовывали прозрачные бляшки диаметром от 0,1 до 0,5 мм (рис. 1).
Фаги 9034/1, 9034/4, 9034/5, 9034/8 - чувствительная культура Paenibacillus polymyxa 9034 - образовывали прозрачные бляшки диаметром от 1 до 7 мм (рис. 2).
12
Рис. 1. - Морфология негативных колоний группы фагов: 1 – 7325 чувствительная
культура - Х. axonopodis pv. beticola 7325; 2 - 8573 чувствительная культура - Pseudomonas
fluorescens 8573
16
Биология фагов
Рис. 2 - Морфология негативных колоний группы фагов 9034 - чувствительная
культура - Paenibacillus polymyxa 9034
Сравнение морфологии негативных колоний исследуемых фагов показывает их различие. Более детальное изучение их свойств является важным для анализа распространения
фагов в агроценозах, изучение их спектра литической активности.
При изучении репродукции вирусов бактерий в экосистемах важным свойством является спектр их литической активности, определение которого позволяет учитывать возможные
пути переноса генетической информации в природе.
По спектру литической активности фаги были проверены на 20 штаммах бактерий,
которые относились к четырем семействам Pseudomonas, Bacillus, Xanthomonas и Erwiniа.
В пределах определенного штамма бактерий по спектру литической активности бактериофаги 9034\2, 9034\3, 9034\4, 8573\1, 7325\1 были узкоспецифические и не лизировали
другие штаммы фитопатогенных бактерий, кроме к тем, к которым они были и выделены, то
есть они являются моновалентными.
Широкий спектр литической активности имели фаги 9034\1, 8573\2, 8573\3. Они лизировали фитопатогенные бактерии родов Pseudomonas, Xanthomonas, относящихся к разным
видам. Изоляты фагов оказались поливалентными.
Среди исследуемых изолятов фагов три проявляли литическую активность по отношению к культурам, которые являются довольно широко распространенным в природе патогенами картофеля, возможно в процессе эволюции вирусы приспособились к репродукции на
различных чувствительных культурах.
Среди изолятов выявлено группу фагов, с икосаэдрической головкой и длинным хвостовым отростком, который несокращается, и относятся к семейству Siphoviridae, порядка
Caudovirales, с размерами: диаметр головки - 67 ± 2 нм, длина хвостового отростка - 120 ± 3
нм.
17
Биология фагов
8573
а) б) в)
Рис. 3 - Електрономикроскопическое изображение фагов: а) 7325 №1; б) 9034; в)
Другая группа фагов с икосаэдрической головкой и маленьким отростком, которые относятся к семейству Podoviridae, порядка Caudovirales и имели размеры: диаметр головки - 43
± 1 нм, длина хвостового отростка - 1нм [2]. Фотографии представлены на рис. 3.
Заключение.
Исследования, посвященные предупреждению развития бактериозов еще требуют
дальнейшего развития, однако показана перспективность проведения биологического контроля численности бактерий с помощью фагов на практике.
Библиографический список
1. Семчук Л.И. Токарчук Л.В. Распространение и специфичность бактериофагов фитопатогенных бактерий в природних биоценозах // Микробиологический журнал. –1994. –№56.
–c.102.
2. Ackermann H.-W., Calendar and S.T. Abedon (eds.). Classification of bacteriophages. The
Bacteriophages, 2nd edn. Oxford: Oxford University Press. - 2006. – p. 8–16.
CHARACTERIZATION ISOLATED PHAGES OF PHYTOPATHOGENIC
BACTERIA ISOLATED FROM POTATO
Andriychuk E.N.
Key words: bacteriophages, phytopathogenic bacteria, lytic activity, PFU.
Phages of phytopatogenic Х. axonopodis pv. beticola 7325, Pseudomonas fluorescens 8573,
Paenibacillus polymyxa 9034 were studied to evaluate their influence on pathogenic bacteria. Study
morphology of negative colonies. The range of their lytic activity to 20 bacterial strains was determined. During special morphological characteristics phages were referred to taxonomic groups.
18
Биология фагов
УДК 578.52.
ДЕТЕКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУЛЕНТНОСТИ
В ГЕНОМАХ БАКТЕРИОФАГОВ
Баннов В.А.*, тел. 8(4967) 36-00-79, bannov@online.stack.net;
Фурсова Н.К. *, кандидат биологических наук,
тел. 8(4967) 31-19-11, fursova@obolensk.org;
Воложанцев Н.В.*, кандидат биологических наук,
тел. 7-4967-36-01-47; nikvol@obolensk.org
Коровкин С.А.**, доктор медицинских наук, профессор,
тел. 8(495) 917–41–49, korovkin09@mail.ru;
Светоч Э.А. *, доктор ветеринарных наук, профессор,
тел. 8(4967) 36-00-79, svetoch@obolensk.org
*ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии»
Роспотребнадзора
**Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток
им. И.И. Мечникова РАМН
сти
Ключевые слова: бактериофаги, горизонтальный перенос генов, гены вирулентно-
Представлены данные литературы о роли бактериофагов в горизонтальном и вертикальном переносе генетических детерминант вирулентности у патогенных бактерий и результаты собственных исследований по выявлению генов токсинов в геномах бактериофагов.
Введение. Бактериофаги, в качестве мобильных генетических элементов (МГЭ),
играют чрезвычайную роль в эволюции бактерий. Профаги зачастую содержат генетические
детерминанты факторов вирулентоности, например: пирогенные и апирогенные токсические
суперантигены стрептококков группы А [1]; фитнес-факторы Salmonella enterica серовара Typhimurium; остров патогенности Vibrio cholerae; шига-токсин Escherichia coli серотипа
O157:H7; бактериоцины Pseudomonas aeruginosa; нейротоксин Clostridium botulinum; фитнесфакторы Streptococcus pyogenes, дифтерийный токсин Corynebacterium diphtheriae и др. [2].
Наличие в геноме большого количества профагов привносит в бактериальную клетку ряд эволюционных преимуществ: (i) повышенную генетическую мобильность и большую степень
представленности факторов вирулентности в популяции бактерий; (ii) эпистатическое взаимодействие между генами вирулентности и генами бактериофага; (iii) амплификацию генов
вирулентности в экосистеме за счет их переноса в бактерии-комменсалы, находящиеся в одном сайте инфекции с патогеном; (iv) повышение дарвиновского фитнеса бактерий в результате проявления свойств, модифицирующих экосистему [3]. Таким образом, взаимодействие
между умеренными фагами и бактериями-хозяевами характеризуется как симбиотическая ассоциация [4].
Показано, что профаги встречаются в геномах бактерий не равномерно, а локализуются в «горячих точках», в соответствии со статистически достоверно установленной адаптацией
к хромосомному генетическому окружению [5]. Именно встраивание профагов, несущих гены
вирулентности, является основным механизмом конверсии свободноживущих бактерий в патогены у представителей разных таксонов: Gammaproteobacteria (Escherichia и Pseudomonas),
Betaproteobacteria (Burkholderia) и Firmicutes (Bacillus) [6].
Ярким примером ключевой роли бактериофагов в горизонтальном переносе генов и
19
Биология фагов
возникновении новых штаммов является эволюция E. coli. Геномный анализ показал, что в
ДНК эпидемического штамма E. coli O157 Sakai присутствует множество мобильных генетических элементов (98 копий IS-элементов), большое число генов, кодирующих факторы вирулентности (энтерогемолизин, EspP протеазу и большой клостридиально-подобный токсин), 18
профагов или следов профагов, шесть больших хромосомных сегментов, которые представляют собой профаго-подобные генетические элементы [7]. Кроме того, бактериофаги играют
очень важную роль в контроле бактериальной плотности природных популяций, на основе
постоянно протекающей коэволюции фагов и бактерий-хозяев. Например, фаги играют ключевую роль в остановке эпидемий холеры [8].
В последние годы все более реальной становится возможная перспектива использования бактериофагов в качестве средств контроля инфекционных заболеваний. Предполагается,
что фаговая терапия будет основана на использовании безопасных (только литических), хорошо охарактеризованных (на геномном и протеомном уровнях) и наработанных в соответствии
с требованиями производства конвенциональных медицинских продуктов [9].
Целью данной работы является детекция генов вирулентности в препаратах ДНК
литических бактериофагов.
Материалы и методы исследований. Материалом для исследований явились 24 препарата ДНК литических бактериофагов, специфичных к Salmonella Enteritidis (n = 3), Salmonella Choleraesuis (n = 3), Salmonella Infantis (n = 3), Shigella spp. (n = 2), Yersinia pseudotuberculosis
(n = 2), Escherichia coli (n = 11), в том числе серотипов O157:H7 (n = 4) и O104:H4 (n = 7).
C целью удаления бактериальной ДНК фаголизаты, полученные при размножении
бактериофагов на культуре чувствительных бактерий, подвергали обработке ДНКазой и РНКазой в течение 2 ч при температуре 37 °С. Затем в фаголизат вносили хлористый натрий до концентрации 1 М и выдерживали в течение 2 ч на ледяной бане, центрифугировали, отбрасывали
осадок, а к супернатанту добавляли ПЭГ 8000 до концентрации 10 % и инкубировали еще 2 ч
на ледяной бане. После повторного центрифугирования осадок растворяли в 1 мл SM буфера,
обрабатывали протеиназой К в присутствии 0,5 % ДСН с последующей экстракцией фенолом
в буфере TE (pH 8,0). Водную фазу переосаждали изопропиловым спиртом. Дальнейшую отмывку проводили этиловым спиртом. Подсушенный осадок ресуспендировали в 0,3 мл буфера ТЕ. Количество и качество выделенной ДНК контролировали электрофоретически в 0,8 %
агарозном геле и спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Кроме того, подтверждали отсутствие генетического материала бактерий-хозяев с помощью мультипраймерных ПЦР
тест-систем TЭK-104 и ТЭК-157 (Оболенск, Россия), КОЛИПОЛ (Литех, Россия), АмплиСенс
Salmonella spp.-EPh (Интерлабсервис, Россия), АмплиСенс Эшерихиозы–FL (Интерлабсервис,
Россия), АмплиСенс EHEC-FL (Интерлабсервис, Россия).
Детекцию генов вирулентности проводили с помощью полимеразной цепной реакции в классическом режиме на термоциклерах PTC 100 (MJ Research, США) и GeneAmp 2700
(Applied Biosystems, США), а также в формате реального времени на приборе CFX96 (BioRad,
США). Для проведения реакции использовали 10× сульфатный буфер для ПЦР (650 mM TrisHCl (pH = 8,9), 160 mM (NH4)2SO4, 15 mM MgCl2, 0,5 % Tween 20). Реакционная смесь содержала 200 µM ДНТП, 0,25-0,5 µM праймеров и 1 ед. активности Taq-полимеразы. Режим
проведения ПЦР: начальная денатурация при 95 °С -5 мин; затем 30-35 циклов, включающих
в себя денатурацию при 95 °С -1 мин, отжиг праймеров при 50-60 °С – 1 мин и элонгацию при
72 °С – 1 мин; затем завершающая элонгация при 72 °С ‑ 5 мин. Температура отжига праймеров определялась характеристикой используемых праймеров (таблица 1).
Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле
в Трис-боратном буфере. Визуализацию ДНК проводили после окрашивания агарозных гелей
20
Биология фагов
в течение 20 мин в растворе (1 мг/л) бромистого этидия. Для документирования полученных
результатов использовали систему DOCPRINT (Vilber Lourmat, Франция).
Результаты исследований и их обсуждение. Результаты ПЦР-детекции показали, что
во всех 24 исследованных образцах ДНК литических бактериофагов, специфичных к S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Infantis, Shigella spp., Y. pseudotuberculosis и E. coli, отсутствуют
гены, детерминирующие синтез шига-подобных токсинов �������
S������
tx1 и �������������������������
S������������������������
tx2, термолабильного энтеротоксина LT, термостабильных энтеротоксинов ST и Еast, а также гены гемолизина Hly.
Полученные данные позволяют считать соответствующие литические бактериофаги достаточно безопасными с точки зрения возможной передачи генов токсинов при их использовании в
качестве средств контроля плотности бактериальных популяций энтеробактерий у сельскохозяйственных животных и в окружающей среде.
Заключение. Проведенные молекулярно-генетические исследования показали отсутствие генов, детерминирующих синтез шига-подобных токсинов ���������������������������
I��������������������������
- и II��������������������
����������������������
-типов, термолабильного энтеротоксина, термостабильных энтеротоксинов St и Еast, а также гемолизина (Hly) в
геномах 24 литических бактериофагов, специфичных к S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Infantis,
Shigella spp., Y. pseudotuberculosis и E. coli.
Таблица 1 – Праймеры, использованные для детекции генов бактерий
Праймер
Олигонуклеотидная последоваTm,
ГенПримечание
тельность, 5’— 3’
°С мишень
invA
AACAGTGCTCGTTTACGACC
58
invA Идентификации ДНК сальAAGACGACTGGTACTGATCG
монелл
rfbO157 CAGGTGAAGGTGGAATGGTTG
60
rfbO157 Идентификация ДНК E. coli
GAGTACATTGGCATCGTGTGG
O157:H7
rfbO104 TCCACGATCATCGGATAGA
60
rfbO104 Идентификация ДНК E. coli
O104:H4
CATACATCTCGCATGGAGC
stx1
TGTGGCAAGAGCGATGTTACG
ATCGCCGGACACATAGAAGG
60
stx1
stx2
ATCAGCAATGTGCTTCCGGAG
CTGAGCACTTTGCAGTAACGG
60
stx2
ltB
ATTTACGGCGTTACTATCCTC
TTTTGGTCTCGGTCAGATATG
58
ltB
stA
GCCTATGCATCTACACAATC
TGAGAAATGGACAATGTCCG
56
stA
eastA
TCCGTGAAACAACATGACGG
ATAACATCCAGCACAGGCAG
56
eastA
hlyA
AGTGACGCACATACAGGAAC
AATTTGAGCGAGCTAAGCAGC
56
hlyA
Выявление гена шига-подобного токсина типа I, синтезируемого штаммами STEC
Выявление гена шига-подобного токсина типа ����������
I���������
I, синтезируемого штаммами STEC
Выявление гена субъединицы В термолабильного энтеротоксина, синтезируемого
штаммами ETEC
Выявление гена субъединицы А термостабильного энтеротоксина, синтезируемого
штаммами ETEC
Выявление гена термостабильного энтеротоксина,
синтезируемого штаммами
EАEC
Выявление гена гемолизина
21
Биология фагов
Библиографический список
1. Banks D.J., Beres S.B., Musser J.M. The fundamental contribution of phages to GAS
evolution, genome diversification and strain emergence. // Trends Microbiol. – 2002. ‑ Vol. 10. – No.
11. – P. 515-521.
2. Brüssow H., Canchaya C., Hardt W.D. Phages and the evolution of bacterial pathogens:
from genomic rearrangements to lysogenic conversion. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2004. – Vol.
68. – No. 3. – P. 560-602.
3. Abedon
�������������������������������������������������������������������������������������
S.T., Lejeune J.T. Why bacteriophage encode exotoxins and other virulence factors. // Evol. Bioinform. Online. – 2007. – Vol. 1. – P. 97-110.
4. Roossinck M.J. The good viruses: viral mutualistic symbioses. // Nat. Rev. Microbiol. –
2011. ‑ Vol. 9. – No. 2. – P. 99-108.
5. Bobay L.M., Rocha E.P., Touchon M. The Adaptation of Temperate Bacteriophages to
Their Host Genomes. // Mol. Biol. Evol. – 2013. ‑ Jan 15. [Epub ahead of print]
6. Busby B., Kristensen D.M., Koonin E.V. Contribution of phage-derived genomic islands
to the virulence of facultative bacterial pathogens. // Environ. Microbiol. – 2013. – Vol. 15. – No. 2.
P. 307-312.
7. Ohnishi M., Kurokawa K., Hayashi T. Diversification of Escherichia coli genomes: are
bacteriophages the major contributors? // Trends Microbiol. – 2001. – Vol. 9. – No. 10. – P. 481-485.
8. ������������������������������������������������������������������������������������������
Faruque S.M., Naser I.B., Islam M.J. et al. Seasonal epidemics of cholera inversely correlate with the prevalence of environmental cholera phages. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2005. ‑ Vol.
102. – No. 5. – P. 1702–1707.
9. Pirnay J.-P., Verbeken G., Rose T., Jennes S., Zizi M., Huys I., Lavigne R., Merabishvili
M., Vaneechoutte M., Buckling A., DeVos D. Introducing yesterday’s phage therapy in today’s medicine. // Future Virol. – 2012. – Vol. 7. – No. 4. – P. 379–390.
DETECTION OF THE VIRULENCE DETERMINANTS
IN THE BACTERIOPHAGE GENOMES
Bannov V.A., Fursova N.K., Volozhantsev N.V., Korovkin S.A., Svetoch E.A.
Key words: bacteriophages, horizontal gene transfer, virulence genes
The study presents the review of the publications and the experimental data concerning role
of bacteriophages in horizontal and vertical gene transfer of the virulence determinants of the human
pathogens.
22
Биология фагов
УДК 619:576
ПОИСК И СЕЛЕКЦИЯ БАКТЕРИОФАГОВ PROVIDENCIA
Барт Н. Г. , ассистент , тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: bart 1967@mail.ru
Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор
тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: fvm.zol@yandex.ru
Васильев Д. А. , доктор биологических наук, профессор
тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: dav_ul@mail.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
Ключевые слова: Бактериофаги, бактерии рода Providencia, выделение, селекция,
пассирование, методики, индукция.
В данной статье представлены результаты работы по выделению бактериофагов
Providencia�����������������������������������������������������������������������������
, используя методики по выявлению профага и выделению фагов из объектов внешней среды. Профаги методом индукции не выделены. Из объектов внешней среды выделено 16
фагов.
Актуальность исследования. Бактерии рода Providencia ранее относились к одному из
видов рода Proteus семейства Enterobacteriaceae. Самостоятельное название род Providencia
он получил лишь в 1963 году на основе Международной классификации Enterobacteriaceae. В
9-ом издании «Определителя бактерий Берджи» (1997) род Providencia представлен 5 видами:
P.agalifaciens, P.rettgeri, P.stuartii, P.heimbachae, P.rustiginii, отличающиеся друг от друга некоторыми биохимическими свойствами [2].
Бактерии рода Providencia широко распространены в природе, их выделяют из воды,
почвы, фекалий и мочи животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника, однако среди них встречаются и варианты, способные вызывать
вспышки гастроэнтеритов, токсикоинфекций мочевых инфекций у детей и взрослых людей,
желудочно-кишечных заболеваний у молодняка животных [1, 3].
При постановке диагноза бактериологическим методом на заболевания, причиной
которых являются представители рода Providencia, существует ряд трудностей. Одна из них
состоит в том, что основой идентификации этих бактерий являются их культуральные и биохимические свойства, сходные с бактериями рода Proteus. Трудоемкость и материалоемкость
делают бактериологический метод неэффективным в современных условиях. В связи с этим
возникла необходимость в поиске ускоренного метода индикации и идентификации Providencia с использованием специфических бактериофагов [4, 5]. Исходя из этого, цель наших исследований – выделение и селекция фагов Providencia.
Материалы и методы. Индикаторными культурами при выделении изолятов фагов
служили штаммы Providencia. Исследование материала на присутствие фагов и изучение их
биологических свойств проводили по методикам: М. Адамс [1], Д.М. Гольдфарба [2], С.Н. Золотухиным [4], И.П. Ревенко [5].
Результаты исследований. Выделение фагов бактерий рода Providencia из исследуемого материала проводили, используя несколько методик. В первой серии опытов использовали
методику выделения фагов из бактерий без воздействия на них индуцирующего фактора. Во
второй серии опытов на культуры Providencia, исследуемые как «лизогенные», мы воздействовали индуцирующим фактором. Использовалась методика Гольдфарба (1962). На подсушенный газон 18-ти часовой культуры воздействовали ультрафиолетовыми лучами в течение 5-23
минут (интервал составил 2 минуты) при помощи бактерицидной лампы, 80 % энергии которой приходится на длину волны 2537 Ǻ, на расстоянии 50 см между лампой и объектом). Затем
делали смыв культуры Providencia стерильным физиологическим раствором, смыв фильтрова-
23
Биология фагов
ли и полученный фильтрат исследовали на наличие фага на индикаторной культуре Providencia методом агаровых слоев по Грациа. Поиск профага в исследуемых культурах Providencia
методом индукции не привел к положительным результатам.
Поэтому, третьим этапом наших исследований было использование методики по выявлению фагов из объектов внешней среды по Адамсу (1961). Первоначально готовили смесь
мясо-пептонного бульона с исследуемым объектом (почва, сточные воды, фекалии) в соотношении 10:1, добавляли индикаторные культуры и термостатировали посевы 2-3 суток при
температуре 37 0С. Затем смесь очищали от механических примесей фильтрованием, центрифугировали при 3000 об./мин, прогревали при 60 0С в течение 30 минут и исследовали на наличие фага методом «стекающая капля».
На поверхность 1,5 % мясо-пептонного агара в чашках Петри наносили пипеткой 3–4
капли 18–ти часовой бульонной культуры Providencia, которую стерильным шпателем растирали по поверхности среды. Чашки ставили в термостат при 37 0С для подсушивания газона
на 20-30 минут. Чашку делили на два сектора при помощи маркера. На поверхность засеянной
среды наносили исследуемый на наличие бактериофага субстрат и наклоняли чашку Петри
так, чтобы капля стекла, на вторую половину таким же образом наносили мясо-пептонный
бульон (для контроля). Посевы ставили в термостат (температура 37 0С), учет результатов проводили через 18 часов. Наличие зон лизиса на газоне роста свидетельствовало о присутствии
в исследуемом материале бактериофага Providencia.
Выделение чистых линий фага и их селекцию проводили путем последовательных
десяти пассажей морфологически однотипных негативных колоний на плотных питательных
средах на индикаторной культуре Providencia в соответствии с методикой, описанной и использованной Золотухиным [5].
В результате проведенных исследований по выявлению специфичных бактериофагов
рода Providencia, было установлено, что имеющиеся у нас 28 штаммов культур рода Providencia не проявляли лизогенных свойств. Феномен профага выявлен не был. Используя методику
выделения фагов из объектов внешней среды, нами было выделено 16 специфичных для рода
Providencia фагов, являющихся заведомо вирулентными. «Чистые линии» выделенных фагов
Providencia мы десятикратно пассировали на индикаторных культурах, что значительно повышало титр их литической активности.
Библиографический список
1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с английского) М., 1961. С. 521.
2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. С.297.
3. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных.
Ульяновск, 2004. С. 125.
4. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят
и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. Ульяновск, 2005. С.48-51.
5. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев:
«Урожай», 1978. С.20-21.
SEARCH AND SELECTION OF BACTERIOPHAGES PROVIDENCIA
Bart N.G., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.
Кey words: bacteriophages, bacteria of genus Providencia, allocation, selection, passaging,
methods, induction.
This article presents the results of the work on the allocation of bacteriophages Providencia,
using the methods of identification of the prophage and the allocation of phages from the objects
24
Биология фагов
of the environment. The prophages weren’t highlighted by the method of induction. 16 phages were
allocated from environmental objects.
УДК 619:576
ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ РОДА PROVIDENCIA
Барт Н. Г. , ассистент , тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: bart 1967@mail.ru
Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор
тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: fvm.zol@yandex.ru
Васильев Д. А. , доктор биологических наук, профессор
тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: dav_ul@mail.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
Ключевые слова: Бактериофаги, ����������������������������������������������
Providencia�����������������������������������
, литическая активность, терморезистентность, специфичность.
В данной статье представлены результаты работы по выделению и изучению некоторых биологических свойств бактериофагов Providencia. В результате исследований были
изучены: литическая активность, терморезистентность и специфичность.
Бактерии рода Providencia широко распространены в природе, их выделяют из воды,
почвы, фекалий и мочи животных и человека [4].
Некоторые штаммы, вероятно, входят в состав нормальной микрофлоры кишечника,
однако среди них встречаются и патогенные варианты, способные вызывать вспышки гастроэнтеритов, токсикоинфекций мочевых инфекций у детей и взрослых людей, раневые послеоперационных инфекций, желудочно-кишечных заболеваний у молодняка животных [5].
Эффективность лечебных мероприятий во многом зависит от своевременности диагностики болезни, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых указанными микроорганизмами, является актуальной проблемой.
При постановке диагноза бактериологическим методом на заболевания, причиной которых являются представители рода ��������������������������������������������������������
Providencia���������������������������������������������
, существует ряд трудностей. Одна из них состоит в том, что основой идентификации этих бактерий являются их биохимические свойства.
Трудоемкость и длительность изучения ферментативных свойств не позволяют быстро и точно
идентифицировать названные микроорганизмы.
В связи с этим возникла необходимость в поиске альтернативных методов лабораторной диагностики, которые были бы менее трудоемкими, более быстрыми и доступными для
лабораторий любого уровня. Одним из таких методов является фагодиагностика [1- 3, 5-8].
Поэтому целью наших исследований явилось изыскание активных бактериофагов,
лизирующих патогенные штаммы бактерий рода Providencia.
Материал и методы исследования.
Источником для выделения бактериофагов служили сточные воды взятые из животноводческих помещений разных хозяйств Ульяновской и Самарской областей и больниц города
Ульяновска.
В качестве индикаторных культур были использованы 26 патогенных штаммов рода
Providencia, полученные из музея кафедры и выделенные нами из патологического материала
и объектов внешней среды.
В основу метода для поиска фагов положена схема, предложенная Грациа [1-3]. Ис-
25
Биология фагов
следуемый материал (сточные воды) засевали с бактериями Providencia���������������������
��������������������������������
на МПБ. Бульон инкубировали при 37°С в течение 14-18 часов, затем фильтровали через бумажные фильтры. Полученный фильтрат подогревали при 60°С в течение 30 минут для инактивации сопутствующей
микрофлоры. Наличие фага в фильтрате выявляли при его посеве на плотные питательные
среды (1,5% мясопептонный агар) методом агаровых слоев.
Селекцию штаммов фагов производили методом пассирования штаммов на индикаторных культурах с последующим клонированием однородных негативных колоний, типичной для каждого изолята.
Активность выделенных фагов определяли по методам Грациа и Аппельмана [1- 3].
Результаты и выводы исследования
В результате проведенных исследований нами было выделено 16 термостабильных
изолята бактериофагов, образующих прозрачные колонии различного диаметра от 1,0 до 5,0
мм (рис.1) или стерильные пятна в виде зон лизиса, диаметром от 5,0 до 9,0 мм (рис.2). Литическая активность выделенных фагов по методу Аппельмана составляет от 10-6 до 10-9, по
методу Грациа – от 2,1х108 до 1,2х1011 фаговых корпускул в 1 мл среды.
Рис.1- Негативные колонии бактериофагов рода Providencia (штамм фага F-67 УГСХА)
Рис.2 - Негативные колонии бактериофагов рода Providencia (штамм фага F-87 УГСХА)
Изучение специфичности двух бактериофагов (F-67 УГСХА, F-87 УГСХА), имеющих
высокую активность и широкий диапазон литического действия проводили по отношению к
26
Биология фагов
представителям других родов семейства ��������������������������������������������������������
Enterobacteriaceae��������������������������������������
: Escherichia�������������������������
������������������������������������
spp���������������������
������������������������
., Proteus�����������
������������������
spp�������
����������
., Mor����
ganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Yersinia enterocolitica, а также
родов других семейств: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp. на плотном
питательном агаре методом нанесения капель фагов на газон исследуемой культуры [1- 3].
Для этого на поверхность МПА в чашках Петри пипеткой наносили 3 – 4 капли 18 часовой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по
поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15
– 20 минут. После чего, дно чашки маркером разделили на два сектора: на первый сектор засеянного
агара, пипеткой легким прикосновением капли, наносили исследуемый фаг; на второй - по центру в
качестве контроля наносили стерильный МПБ. Чашку наклоняли, чтобы капли стекли, а затем инкубировали при температуре 37°С, оценку результатов проводили через 24 часа.
В результате проведенных исследований было установлено, что селекционированные
фаги неактивны по отношению к представителям бактерий других родов и семейств, тоесть
явились специфичными для бактерий гомологичного рода.
Таким образом, нами было выделено и селекционировано 16 термостабильных изолятов фагов, активных в отношении бактерий вида Providencia rettgeri (табл.1).
Таблица 2 - Литическая активность бактериофагов рода Providencia
Активность фагов
№
Название фага
Индикаторная культура
пп
по Аппельману
по Грациа
1 F-67 УГСХА
10-9
1 х 1011
P.rettgeri Н67
-8
2 F-87 УГСХА
10
1,5 х 1010
P.rettgeri С87
3 F-3 УГСХА
10-8
7 х 109
P.rettgeri Н67
-7
4 F-4 УГСХА
10
5 х 108
P.rettgeri С87
5 F-5 УГСХА
10-8
1 х 109
P.rettgeri М45
-8
6 F-6 УГСХА
10
1,1 х 109
P.rettgeri Н67
7 F-7 УГСХА
10-8
1 х 109
P.rettgeri С87
-8
8 F-8 УГСХА
10
7 х 109
P.rettgeri С87
9 F-9 УГСХА
10-8
2 х 109
P.rettgeri М45
-6
10 F-10 УГСХА
10
4 х 107
P.rettgeri Н67
11 F-11 УГСХА
10-8
1 х 109
P.rettgeri Н67
-8
12 F-12 УГСХА
10
2 х 109
P.rettgeri Д1
13 F-13 УГСХА
10-8
2,5 х 109
P.rettgeri К1
-8
14 F-14 УГСХА
10
2,5 х 109
P.rettgeri К1
15 F-15 УГСХА
10-8
8 х 109
P.rettgeri Н67
-8
16 F-16 УГСХА
10
5 х 109
P.rettgeri М45
Были отобраны два специфичных штамма фагов с наиболее выраженными биологическими свойствами, которые позволяют использовать их для изготовления диагностических
биопрепаратов.
Библиографический список
1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с английского) // - М., - 1961. -521С.
2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии // Учебное пособие – Ульяновск. – 1988. – С.45.
3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// -М.: Медгиз. -1961. – С.297.
4. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных. 125 с., Ульяновск., -2004.
5. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят
27
Биология фагов
и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. – Ульяновск. – 2005. – С.48-51.
6. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:
«Урожай», 1978. –С.20-21.
CHARACTERISTICS OF BACTERIOPHAGES OF GENUS PROVIDENCIA
Bart N.G., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.
Кey words: bacteriophages, Providencia, lytic activity, thermoresistance, specificity.
This article presents the results of the work on the allocation and study of some biological
properties of bacteriophages Providencia. As a result of research were studied: lytic activity,
thermoresistance and specificity.
УДК 578.81:579.67
РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И СЕЛЕКЦИИ
БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA
Васильева Ю.Б. , кандидат ветеринарных наук, доцент
8(8422) 55-95-47, vet_yulua@mail.ru
Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор
8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Семанина Е.Н. , научный сотрудник НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
гов
Ключевые слова: Bordetella������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������
bronchiseptica���������������������������������������
, выделение фагов, свойства бактериофа-
В статье освещён вопрос по разработке методов выделения бактериофагов, активных в отношении �����������������������������������������������������������������������
Bordetella�������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������
bronchiseptica����������������������������������������������
. Приведены результаты собственных научных исследований биологических свойств выделенных бактериофагов: морфология негативных колоний, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, температурная устойчивость, устойчивость к действию хлороформа и изменение литической
активности при хранении.
Введение. В настоящее время отечественные и зарубежные исследователи особое внимание уделяют диагностике малоизученных инфекционных заболеваний животных и людей,
характеризующихся затяжным течением, а нередко и летальным исходом. К таким инфекциям
относится бордетеллёз - коклюшеподобное заболевание собак, кошек и других домашних и
сельскохозяйственных животных, возбудитель которого, Bordetella bronchiseptica, может вызывать и у людей респираторные заболевания по типу ОРВИ [2,8,10].
Учёными НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи охарактеризованы бактериофаги микроорганизмов рода Bordetella, выделенные из бактерий коллекции ВОЗ и клинических штаммов, бактериофаги BPP-1, BMP-1 и BIP-1 B.bronchiseptica. Эти данные использованы для разработки
тест-систем для идентификации ДНК возбудителя коклюша и его фазовых вариантов с помощью полимеразной цепной реакции. Метод рекомендуется для диагностики коклюша у детей
с симптомами затяжного кашля, а также выявления атипичных, бессимптомных форм заболе-
28
Биология фагов
вания [9].
Научно-исследовательской группой НИИМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» им.
П.А. Столыпина разработаны полимеразно-цепная реакция для идентификации возбудителя
бордетеллёза животных и бактериологическая схема выделения B.bronchiseptica с применением селективно – диагностической питательной среды УГСХА BBR�����������������������
��������������������������
57, позволяющая поставить диагноз в течение 96 часов [2,3].
Эти современные и эффективные методы диагностики также имеют и ряд недостатков
в практическом применении. Для проведения генетической диагностики необходимо наличие
специализированной лаборатории с дорогостоящей приборной базой и высококвалифицированными работниками. Микробиологические методы диагностики бордетеллёза достаточно
трудоёмки (выделение культуры возбудителя на селективных средах, биохимическая идентификация и т.п.), дорогостоящи и малопроизводительны.
Поэтому остро встает задача создания высокочувствительных и специфичных средств
и методов диагностики бордетеллёза не требующих больших затрат времени и труда, а также
экономически выгодных.
Мы считаем, что заслуживает пристального изучения разработка методов выделения бактериофагов B. bronchiseptica с перспективой создания биопрепарата для диагностики
бордетеллеза животных. Данное научное направление, по нашему мнению, весьма актуально,
представляет научный и практический интерес.
В связи с вышесказанным целью данной научной работы явилась разработка методов
выделения фагов B. Bronchiseptica с изучением их основных биологических свойств.
Для решения поставленной цели перед нами стояли следующие задачи:
1. Апробировать различные схемы выделения бактериофагов, активных в отношении
B. Bronchiseptica и подобрать наиболее эффективный метод.
2. Изучить основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфологию негативных колоний, литическую активность и её спектр, специфичность, температурную
устойчивость, устойчивость к хлороформу.
3. Провести селекцию выделенных фагов и подобрать оптимальный набор для дальнейшего конструирования на их основе нового диагностического биопрепарата.
Материалы и методы исследований. Объектами для наших исследований послужили 5 референс-штаммов B. bronchiseptica № 1, № 7, № 214, № 22067, № 8344 и штамм Bordetella parapertussis № 119; 24 референс-штамма бактерий других родов (Yersinia���������������
��������������
pseudotuberculosis № 0630, Morganella morganii, Staphylococcus aureus № АТСС 25923, Escherichia coli № 4,
№ АТСС 25922, ���������������������������������������������������������������������������
Proteus��������������������������������������������������������������������
mirabilis����������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������
№ 1, № 523, № 491, ��������������������������������������
Salmonella����������������������������
���������������������������
typhimurium����������������
№ 82, ���������
Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis № 189, Providencia rettgeri № 104а, №
102д, № 175, ������������������������������������������������������������������������������
Aeromonas���������������������������������������������������������������������
hydrophila����������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������
№ 01, № 02, ���������������������������������������������
Pseudomonas����������������������������������
putida���������������������������
���������������������������������
№ 12633, № 901, ����������
Enterobacter cloacae № 1487, № 10005, Bacillus cereus № 2527, Bacillus subtillis № 6633), полученные из
музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» им. П.А. Столыпина, которые, в соответствии
с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими,
культуральными и биохимическими свойствами; 48 штаммов B. bronchiseptica, выделенных от
собак и кошек (с клиническими проявлениями респираторных заболеваний); 8 штаммов фагов
B. bronchiseptica.
Объекты внешней среды: сточные воды, смывы с глотки больных животных, патологический материал от больных и павших животных.
Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар, среда
Эндо, казеиново-угольный агар, бордетелл-агар, кровяной агар и среда Борде-Жангу, среды
Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом, биохимические тест-системы
для ускоренной идентификации микроорганизмов, агар-агар, натрий хлорид, мочевина, перекись водорода, желатин, среда УГСХА BBR 57.
29
Биология фагов
В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения и
идентификации бактерий [4].
Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов проводили
с помощью методов, предложенных М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), И.М. Габриловичем (1973), С.Н. Золотухиным (2006) [1,4,5,6,7]. Постановку РНФ для индикации B.
bronchiseptica в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным Д.М. Гольдфарбом (1961) [6].
Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе исследований штаммов
B. bronchiseptica на наличие профага нами установлено, что культуры без воздействия на них
индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Проведено 17 опытов, без положительных результатов.
Вторым этапом наших исследований стало выделение бактериофагов B. bronchiseptica
из объектов внешней среды и от животных. Всего нами исследовано 104 пробы, бактериофаги
среди них не обнаружены.
В третьей серии опытов на культуры B. bronchiseptica воздействовали индуцирующим
фактором (ультрафиолетовыми лучами).
Опыты по облучению бактерий УФЛ проводили с изменением параметров экспозиции
в минутах и расстояния до объекта в см. В результате исследований по выделению профага из
бактериальных клеток наиболее эффективной показала себя следующая схема:
1 день: посев газоном суточной культуры B. bronchiseptica на мясопептонный агар,
подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее инкубирование чашек Петри с обработанными бактериями в термостате при 37˚С в течение суток.
2 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара,
облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37˚С) на сутки.
3 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара,
облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37˚С) на сутки.
4 день: смыв выросших колоний мясопептонным бульоном с чашек Петри, помещение
в пробирку со штаммами бордетелл. Культивирование в термостате в течение суток.
5 день: обработка хлороформом 1 часть хлороформа и 10 частей фаголизата в течение
15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин – 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в
стерильную пробирку.
6 день: учет результатов. Присутствие бактериофага определяли по наличию зон лизиса.
После выделения бактериофаги пассировали для повышения их литической активности. В процессе работы по выделению бактериофагов с применением УФЛ в общей сложности
нами было проведено 29 экспериментов. Описанным выше методом нам удалось выделить 8
фагов B. bronchiseptica из 14 штаммов бактерий. 6 штаммов бактерий B. bronchiseptica не проявили лизогенных свойств.
Далее мы изучили биологические свойства выделенных бактериофагов.
Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизиса, вторичного роста и величине колоний мы разделили на два типа. К первому типу отнесли
негативные колонии круглые, прозрачные, диаметром более 3 мм, с зоной неполного лизиса по
периферии 0,5 – 4 мм или без неё: B.br. – 7 УГСХА, B.br. –22067 УГСХА, B.br. – 214 УГСХА.
Ко второму типу причислили круглые, прозрачные или полупрозрачные колонии, с ровными
краями, диаметром до 2 мм: B.br. – 1 УГСХА, B.br. – 10 УГСХА, B.br. – 11 УГСХА, B.br. – 13
УГСХА и B.br. – 8344 УГСХА.
Литическая активность исследуемых бактериофагов варьировала от 5,3 х 107 до 4,3 х
30
Биология фагов
109. По исследованным параметрам для конструирования диагностического набора фагов отобраны наиболее активные их них: B. bronchiseptica - 1 УГСХА по Аппельману 10-7, по Грациа
3,1 х 108 и B. bronchiseptica - 7 УГСХА по Аппельману 10-8, по Грациа 4,3 х 109.
Для изучения спектра литического действия выделенных фагов мы использовали 53
культуры бактерий B. bronchiseptica.
По результатам исследований наибольшим совместным спектром литического действия обладали бактериофаги B. bronchiseptica - 1 УГСХА и B. bronchiseptica - 7 УГСХА. Они
лизировали 92,5 % имеющихся штаммов.
Учитывая литическую активность и спектр литического действия бактериофагов B.
bronchiseptica для дальнейших исследований нами было отобрано 2 фага – B. bronchiseptica – 1
УГСХА и B. bronchiseptica – 7 УГСХА.
При изучении специфичности действия исследуемых фагов B. Bronchiseptica в качестве гетерологичных культур использовали микроорганизмы указанные в материалах и методах. Нами было установлено, что бактериофаги ��������������������������������������������
B�������������������������������������������
. br���������������������������������������
�����������������������������������������
. - 1 УГСХА и B������������������������
�������������������������
. br��������������������
����������������������
. - 7 УГСХА не вызывали лизис ни одной из испытуемых культур других видов бактерий.
В результате исследований температурной устойчивости было установлено, что прогревание фагов B. br. – 1 УГСХА и B. br. – 7 УГСХА при температуре 60˚С в течении 30 минут
не оказало влияния на активность фагов, бактерии погибали при данной температуре. Нагревание бактериофагов свыше 65˚С приводило к потере их активности.
В результате проведенных исследований по изучению устойчивости бактериофагов к
воздействию хлороформом установлено, что бактерии инактивируются при 10 минутной обработке. Бактериофаги B.br. – 1 УГСХА и B.br. - 7 УГСХА проявили выраженную устойчивость
к воздействию хлороформа в течение 30 минут. Наблюдалось снижение активности фагов при
обработке хлороформом свыше 30 минут с 2,2 х 108 до 3,2 х 107 у B.br. – 1 УГСХА и с 2,1 х 109
до 5,3 х 107 у B.br. - 7 УГСХА по методу Грациа. Активность бактериофагов B.br. – 1 УГСХА
и B.br. – 7 УГСХА восстанавливалась после одного пассажа.
Затем мы провели селекцию выделенных бактериофагов по основным биологическим
свойствам для дальнейшего использования в конструировании диагностического биопрепарата. Отобранные фаги имели прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром
0,5-4,0 мм, литическую активность более 10-6 по Аппельману, и 5,3 х 107 по Грациа корпускул
в 1 мл фаголизата.
Заключение. Мы рекомендуем к применению разработанный нами метод выделения
фагов B. bronchiseptica путём многократного воздействия ультрафиолетовыми лучами на бактериальную клетку по схеме: 1 день: t = 5-7 мин; l = 1м. 2 день: t = 7-10 мин; = 1м. 3 день: t =
7-10 мин; l = 0,5м), где t – экспозиция, l – расстояние от лампы до объекта. По данной схеме
нами было выделено 8 штаммов бактериофагов B. bronchiseptica со следующими свойствами:
литической активностью от 10-6 до 10-9 по методу Аппельмана и от 5,3 х 107 до 4,3 х 109 по методу Грациа, спектром литического действия от 20,8 % до 81,1%. Выделенные бактериофаги
были строго специфичны по отношению к B. Bronchiseptica, не лизировали бактерии других
видов и родов; проявляли устойчивость при обработке хлороформом (1:10) в течение 30 минут
и выдерживали 30 минутное нагревание при 60˚С.
Проведённая селекция выделенных фагов позволила отобрать бактериофаги B.br. –
1 УГСХА и B.br. – 7 УГСХА, лизирующие 92,5% изученных культур, обладающие высокой
литической активностью по Аппельману 10-7 – 10-8 , по Грациа 3,1 х 108 – 4,3 х 109 активных
корпускул в 1 мл. Результаты исследований могут быть рекомендованы для дальнейшего конструирования диагностического биопрепарата.
Библиографический список
1. Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс // М.: Медгиз, 1961. – 521 с.
2. Васильев Д.А., Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б. Применение по-
31
Биология фагов
лимеразной цепной реакции при идентификации возбудителя бордетеллеза животных. // Естественные и технические науки. – 2010. - № 5 – С. 230-232.
3. Васильев Д.А., Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б. Выделение и
идентификация Bordetella bronchiseptica от животных // Естественные и технические науки.
– 2010. - № 5 – С. 233-235.
4. Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Никишина Н.М. Учебно-методическое пособие по
методам общей бактериологии. -Ульяновск, 1998. – 151 с.
5. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович //
Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.
6. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 1961. – 225 с.
7. Золотухин С.Н. Разработка оптимальных количественных параметров соотношения
культуры и фага для получения препаратов с высокой активностью / С.Н. Золотухин, Л.П.
Пульчеровская, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. – 2004. – № 12. – С. 50-53.
8. Bjornstad O.N. Evolution and emergence of Bordetella in humans / O.N. Bjornstad, E.T.
Harvill // Trends Microbiol. – 2005. – N 13. – Р. 355-359.
9. Karataev G.I., Lapajeva I.A., Ryabinina O.P., Mebel S. Detection of a new bacteriophage
in Bordetella.//FEMS- symposium Pertussis. Berlin, GDR.- 1988.- p.20.
10. Mattoo S. Role of Bordetella bronchiseptica fimbriae in tracheal colonization and development of a humoral immune response / S. Mattoo, J.F. Miller, P.A. Cotter // Infect. Immun. – 2000.
– N 68. – Р. 2024-2033.
DEVELOPMENT OF METHODS OF ALLOCATION AND SELECTION
OF BACTERIOPHAGES BORDETELLA BRONCHISEPTICA
Vasileva Y.B., Vasilev D.А., Semanina Е.N.
Кey words: Bordetella bronchiseptica, allocation of phages, properties of bacteriophages
The article considers the question on the development of methods of allocation of
bacteriophages, active in respect of Bordetella bronchiseptica. There are the results of own scientific
researches of biological properties of the selected bacteriophages: morphology negative colonies,
lytic activity, the spectrum of lytic action, the specificity of action, thermal stability, resistance to the
action of the chloroform and the change of lytic activity during storage.
УДК 619:616
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ УМЕРЕННЫХ
И ВИРУЛЕНТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ
Викторов Д.А., кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник,
Тел. 9084775573, viktorov_da@mail.ru
Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор
Тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор
Тел. 9272703480, fvm.zol@yandex.ru
Гринева Т.А. , соискатель,
32
Биология фагов
Tел. 9033201410, e-mail: tag78@mail.ru
Горшков И.Г., научный сотрудник,
Тел. 9170572024, i.o.gun@mail.ru
Куклина Н.Г. , научный сотрудник,
Тел. 9176192488, ul_nk@mail.ru
Насибуллин И.Р. , соискатель, Тел. 9053484611, nir72@mail.ru
Парамонова Н.А., аспират кафедры МВЭиВСЭ
Тел. 9170590057, paramonnat@rambler.ru
Артамонов А.М. , соискатель кафедры МВЭиВСЭ
Воротников А.П., студент факультета ветеринарной медицины
Тел. 9279807993, vorot.ru@mail.ru
Антошкин П.А. , студент факультета ветеринарной медицины
Тел. 9603604787, vita1468@mail.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
Ключевые слова: Умеренные бактериофаги, вирулентные бактериофаги, лизогения,
дифференцирование, микробиология
По данным ряда исследователей, разделение бактериофагов на умеренные и вирулентные условно и относительно. Однако показатели умеренности/вирулентности бактериофагов целесообразно выражать так называемым коэффициентом лизогенизации – отношением количества лизогенизированных бактериальных клеток к общему количеству бактерий,
подвергнутых единичному циклу фаговой инфекции. Коллективом авторов разработана и
апробирована методика дифференцирования умеренных и вирулентных бактериофагов, основанная на выявлении образования лизогенных клеток.
Актуальность.
Критерии умеренности / вирулентности бактериофагов играют существенную роль
при их селекции для использования в составе терапевтических препаратов и средств деконтаминации, поскольку воздействие умеренных бактериофагов на культуру фагочувствительных
бактериальных клеток приводит к её частичной лизогенизации, результатом которой является появление фагорезистентных вариантов. По этой причине в состав биопрепаратов важно
подбирать наиболее вирулентные (литические) бактериофаги. Однако к настоящему времени
отсутствуют достоверные методы, позволяющие дифференцировать умеренные бактериофаги
от вирулентных. Коме того, согласно мнению многих авторов (Ревенко, 1978; Хейс, 1965) разделение бактериофагов на умеренные и вирулентные весьма условно и относительно.
Предлагаемая методика основана на отличительной особенности умеренных бактериофагов обусловливать лизогенизацию отдельных клеток чувствительной бактериальной культуры, то есть интегрироватья в генетический аппарат бактерии в виде профага, не вызывая
при этом лизис; и позволяет с достаточной объективностью оценивать критерии умеренности
/ вирулентности бактериофагов.
Ход исследования:
Для исследования готовится мясопептонный агар, разливается в стерильные чашки
Петри и тщательно подсушивается при 37 ºС не менее 24 часов в целях избавления от капель
конденсата и усиления гигроскопичных свойств поверхности агара. Суспензию 24-часовой
индикаторной культуры бактерий титруют в мясопептонном бульоне до третьего разведения.
Исходная суспензия 24-часовой индикаторной культуры бактерий и каждое из трёх полученных разведений засевается газоном на отдельные подготовленные чашки Петри с подсушенным мясопептонным агаром. Для этого суспензия в количестве 0,7 мл с помощью стерильной
пипетки вносится на поверхность МПА и равномерно распределяется по поверхности агара
покачивающими движениями, после чего излишек суспензии удаляется стерильной пипеткой,
33
Рис. 1. Схема исследования по дифференциации умеренных и вирулентных бактериофагов.
Биология фагов
34
Биология фагов
а чашки переворачиваются крышкой вниз и подсушиваются в термостате при оптимальной
для исследуемой бактериальной культуры температуре около 10-30 минут. После полного подсыхания остатков суспензии, полученные четыре чашки с различным разведением бактерий
разделяются на сектора, в которые раздельно вносится по 50 мкл исследуемых суспензий бактериофагов в виде капель. Аналогичным образом проводится засев бактериофагов на чашки
Петри со стерильным мясопептонным агаром – для контроля на отсутствие жизнеспособных
бактерий в исследуемых фаговых суспензиях. Чашки термостатируются при оптимальной для
размножения фагов и индикаторных бактерий температуре в течение 18-24 часов.
Индикаторная культура бактерий должна быть гомогенной, не содержать в своём составе постороннюю микрофлору. Препараты бактериофагов должны быть полностью освобождены от бактериальных клеток надлежащими способами обработки.
Для того, чтобы избежать растекания и взаимного перемешивания нанесённых на поверхность агара капель суспензий исследуемых бактериофагов, агар целесообразно разрезать
стерильным скальпелем таким образом, чтобы сектора были отделены друг от друга пространством в 2-3 мм (рис. 2, 3).
Схема исследования представлена на рисунке 1.
Оценка результатов:
При оценке результатов, во-первых, учитывается отсутствие роста бактерий на контрольной чашке, куда были засеяны бактериофаги без посева бактериального газона. При обнаружении роста бактериальных колоний на контрольной чашке, результаты исследования
нельзя считать достоверными, так как наличие жизнеспособных бактериальных клеток в фаголизате может ввести в заблуждение при оценке роста лизогенных бактерий в опытных чашках.
В данном случае исследование следует повторить, предварительно применив дополнительные
способы обработки фаголизата.
Необходимо отметить, что разграничение бактериофагов на умеренные и вирулентные относительно и во многом зависит от особенностей бактериальной тест-культуры и других условий (Ревенко, 1978).
На секторах опытных чашек должен наблюдаться лизис бактериального газона в области нанесения капель испытуемых бактериофагов. Кроме того, в зоне лизиса в той или иной
степени может присутствовать рост бактерий, утративших чувствительность к данному бактериофагу вследствие лизогенизации, то есть интеграции профага в генетический аппарат бактериальных клеток, что указывает на умеренность бактериофага. В случае, если во всех четырёх
опытных чашках в зоне лизиса определённого бактериофага роста лизогенных бактерий не
наблюдается ни в форме менее интенсивного бактериального «газона», ни в форме отдельных колоний лизогенных клеток, данный бактериофаг считается вирулентным. Бактериофаг, в
зоне лизиса которого наблюдается рост колоний лизогенных бактерий, считается умеренным.
Причём, степень вирулентности / умеренности бактериофагов оценивается тем наименьшим
разведением исходной бактериальной суспензии, при котором наблюдается полный лизис газона без роста лизогенных бактерий. То есть, чем при большей концентрации бактериальных
клеток на «газоне» наблюдается полный лизис, без роста лизогенных бактерий, тем данный
бактериофаг более вирулентен.
Вывод: Таким образом, было экспериментально установлено, что процесс образования фагорезистентных клеток в культуре чувствительных бактерий зависит, во-первых, от
степени вирулентности/умеренности бактериофага, во-вторых, от множественности фаговой
инфекции. Очевидно, что с понижением множественности фаговой инфекции возрастает частота лизогенизации.
35
Биология фагов
Рис. 2. Лизис бактериального газона (без разведения) 24-часовой индикаторной
культуры Pseudomonas putida ATCC 12633 штаммами бактериофагов:
1 – Psp102-УГСХА (неполный лизис, в зоне которого бактериальный газон менее чёткий);
2 – Psp101-УГСХА (неполный лизис, формирование отдельных колоний лизогенных бактерий);
3 – Psp6-УГСХА (неполный лизис, в зоне которого бактериальный газон менее чёткий);
4 – Psp1-УГСХА (неполный лизис, в зоне которого бактериальный газон менее чёткий).
Рис. 3. Лизис бактериального газона (разведение -3) 24-часовой индикаторной
культуры Pseudomonas putida ATCC 12633 штаммами бактериофагов:
1 – Psp102-УГСХА (неполный лизис, формирование отдельных колоний лизогенных
бактерий);
2 – Psp101-УГСХА (полный лизис);
3 – Psp6-УГСХА (неполный лизис, формирование отдельных колоний лизогенных бактерий);
4 – Psp1-УГСХА (неполный лизис, формирование отдельных колоний лизогенных бактерий).
Библиографический список
1. Азизбекян Р.Р. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии /
Р.Р. Азизбекян // В кн. Микробиология. Генетика микроорганизмов. Итоги науки и техники
ВИНИТИ АН СССР. – М., 1974. – Т.3. – С. 191-233.
36
Биология фагов
2. Висконти Р. Генетика бактериофага / Р. Висконти // В кн.: Онтогенез вирусов. – М.,
1956. – 141 с.
3. Выделение и анализ фагоустойчивых мутантов Pseudomonas putida с помощью новых бактериофагов / В.Н. Крылов [и др.] // Генетика. – 1981. – Т.17, №2. – С.239-245.
4. Выделение и общая характеристика группы умеренных фагов Pseudomonas
aeruginosa / А.С. Яненко [и др.] // Микробиология. – 1979. – Т.48, №1. – С.109-113.
5. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.
6. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 1961. – 225 с.
7. Жиленков Е.Л. Изучение начальных стадий взаимодействия умеренного фага phi04
с клеткой Pseudomonas aeruginosa / Е.Л. Жиленков // Микробиология. – 1997. – Т.66, №4. – С.
532-538.
8. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный
мир, 2012. – 636 с.
9. Крылов, В.Н. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий / В.Н. Крылов // Генетика. – 2003. – Т.39. - №5. – С. 595-619.
10. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:
Урожай. – 1978. – С. 41-88.
11. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий / Г. Стент – М.: Мир, 1965. – 452 с.
12. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов / У. Хейс – М.: «Мир», 1965. – С. 288-294.
13. Adams M. H. Bacteriophages / M.H. Adams – Interscience Publishers, Inc., New York,
1959. – 473 p.
14. Burnet F.M. Induced lysogenicity and mutation of bacteriophage within lysogenic bacteria / F.M. Burnet, D. Lush. // Australian J. Exptl. Biol. Med. Sci. – 1936. – V.14. – P. 27-38.
15. Djordjevic M. Quantitative analysis of a virulent bacteriophage transcription strategy /
Djordjevic M. [et al.] // Virology. – 2006. – Т. 354. – С. 240.
16. Holloway B. W. Lysogenic conversion in Pseudomonas aeruginosa / B.W. Holloway,
G.N Cooper. // J. Bacteriol. – 1962. – V.84. – P. 321-324.
17. Nechaev S. Bacteriophage-induced modifications of host RNA polymerase / Nechaev S.,
Severinov K. // Annual Review of Microbiology. – 2003. – T. 57. – P. 301-322.
18. Severinova E. Localization of the Escherichia coli RNA polymerase β′ subunit residue
phosphorylated by bacteriophage t7 kinase gp0.7 / Severinova E., Severinov K. // Journal of Bacteriology. – 2006. – T. 188. – N 10. – P. 3470-3476.
DEVELOPMENT OF A TECHNIQUE OF THE DIFFERENTIATION OF THE
MODERATE AND VIRULENT BACTERIOPHAGES
Viktorov D.А., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N., Grineva Т.А., Gorshkov I.G.,
Kuklina N.G., Paramonova N.А., Аrtamonov А.М., Vorotnikov А.P.
Key words: Temperate phages virulent bacteriophages lysogenicity, differentiation,
мicrobiology
According to some researchers, the division of bacteriophages in the moderate and virulent
is conditional and relative. However, the moderation/virulence of bacteriophages is appropriate to
express by the so-called coefficient of lysogenization – ratio of the number of lysogenizated bacterial
cells to the total number of bacteria, subjected to a single cycle of phage infection. The group of
authors developed and tested the technique of the differentiation of the moderate and virulent phages,
based on the detection of formation of lysogenic cells.
37
Биология фагов
УДК 619:616
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ФАГОРЕЗИСТЕНТНЫХ
МУТАНТОВ НА ПРИМЕРЕ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS
Викторов Д.А., кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник, Тел. 9084775573, viktorov_da@mail.ru
Гринева Т.А., соискатель, Tел. 9033201410, e-mail: tag78@mail.ru
Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор
Тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Артамонов А.М., соискатель кафедры МВЭиВСЭ
Воротников А.П., студент факультета ветеринарной медицины
Тел. 9279807993, vorot.ru@mail.ru
Антошкин П.А. , студент факультета ветеринарной медицины
Тел. 9603604787, vita1468@mail.ru
Золотухин С.Н. , доктор биологических наук, профессор
Тел. 9272703480, fvm.zol@yandex.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
Ключевые слова: бактериофаги, фагоустойчивость, фагорезистентность, �������
Pseudomonas, лизогения.
Проведено
экспериментальное
получение
фагорезистентных
вариантов
бактериальных штаммов. Механизм фагоризестентности в рассматриваемом случае
заключается в лизогенном состоянии бактериальных клеток, обусловленном редуктивной
инфекцией штаммами умеренных бактериофагов. Однако в ряде исследований признак
фагоустойчивости не был обусловлен лизогенией. Эксперименты проведены на примере
бактерий Pseudomonas putida и гомологичных умеренных бактериофагов серии Psp-УГСХА.
Актуальность темы
На явление фагоустойчивости обращали внимание отечественные и зарубежные авторы. Beryani�������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������������������������
G�����������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������������
. (1953), изучая умеренные бактериофаги и явление лизогении бактерий, установил, что лизогенные штаммы бактерий всегда иммунны к литической инфекции, осуществляемой тем же умеренным или близкородственным фагом. Koibong Li с соавторами в 1961 году
высказали предположение, что при лизисе инфицированные фагом бактерии освобождают
фермент, который удаляет фаговые рецепторы из оболочек клеток, оставшихся неинфицированными, делая их устойчивыми к адсорбции фага. Dettori R. с соавторами (1961) и М. Монк
(1962) обнаружили, что мужские штаммы E.coli К12 способны к приобретению фенотипической устойчивости к фаговой инфекции путём утраты антигена, к которому прикрепляется
фаг. Ряд исследователей (Fraser, 1957; Zinder, 1958; Luria et al., 1958) установили, что бактерии
могут являться носителями фага, при этом не подвергаясь лизису.
Однако данные, полученные различными авторами при изучении фагоустойчивости
бактерий, не систематизированы, а механизмы таких явлений изучены недостаточно.
В связи с этим встает вопрос о детальном и всестороннем изучении явления устойчивости бактерий к фаговой инфекции, систематизации полученных результатов.
Цель исследования: кспериментальное получение фагорезистентных мутантов на
примере бактерий рода Pseudomonas.
Объект, материалы и методы исследования.
В работе использовались ранее выделенные и изученные культуры бактериофагов
38
Рис. 2. Схема получения фагорезистентных мутантов бактерии Pseudomonas putida.
Биология фагов
39
Биология фагов
Psp�������������������������������������������������������������������������������
101-УГСХА, Psp�����������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������
102-УГСХА, Psp���������������������������������������������������
������������������������������������������������������
1-УГСХА, Psp���������������������������������������
������������������������������������������
6-УГСХА, а так же референс-штамм бактерии Pseudomonas putida ATCC 12633, чувствительный к перечисленным бактериофагам.
Основываясь на утверждении W��������������������������������������������������
���������������������������������������������������
. Hayes�������������������������������������������
������������������������������������������������
(1964), согласно которому умеренные бактериофаги, в отличие от вирулентных, формируют «мутные» негативные колонии, в зоне лизиса
которых размножаются лизогенные бактерии, нами была составлена схема получения фагорезистентных бактериальных штаммов.
Первоначально по стандартной методики готовили мясопептонный агар, разливали
его в стерильные чашки Петри и тщательно подсушивали при 37 ºС не менее 24 часов в целях
избавления от капель конденсата и усиления гигроскопичных свойств поверхности агара. Для
исследования был отобран бактериофаг �����������������������������������������������
Psp��������������������������������������������
101-УГСХА, особенности формирования негативных колоний которого аналогичны умеренным фагам (Hayes, 1964). Суспензию бактериофага
Psp101-УГСХА с титром 4х1010 вносили в количестве 0,7 мл на поверхность МПА в заранее
подготовленных чашках и равномерно распределяли по поверхности агара покачивающими
движениями, ставили в термостат крышкой вверх при 28 ºС на 10-30 минут для подсушивания.
После полного подсыхания остатков суспензии чашки переворачивали крышкой вниз и термостатировали при 28 ºС в течение 24 часов для проверки отсутствия во внесённой суспензии
бактериальных клеток. Чашки Петри с обнаруженными на поверхности агара бактериальными
колониями должны были быть отбракованы, так как наличие нечувствительных к исследуемому фагу бактериальных клеток ввело бы в заблуждение при получении последующих результатов. В наших исследованиях использовалась суспензия фага, полностью очищенная от
жизнеспособных бактериальных клеток надлежащими и тщательно подобранными способами
обработки фаголизата: воздействие хлороформа в соотношении 1:10 в течение 15 минут при
постоянном перемешивании суспензии. Вследствие этого на чашках Петри с внесёным бактериофагом Psp101-УГСХА роста бактериальных колоний не обнаруживалось.
Полученные таким образом чашки с питательной средой, содержащей избыточное количество бактериофага Psp101-УГСХА, засевали газоном 24-х часовой культуры штамма P.
putida ���������������������������������������������������������������������������������
ATCC�����������������������������������������������������������������������������
12633. Для этого 0,7 мл бактериальной взвеси в мясопептонном бульоне, содер8
жащей 10 к.о.е./мл вносили на поверхность агара и равномерно распределяли покачивающими движениями, ставили в термостат при 28 ºС крышкой вверх и после подсыхания остатков
суспензии (через 10-30 минут) переворачивали крышкой вниз. Одновременно аналогичным
образом засевали суточную бактериальную культуру штамма P. putida ATCC 12633 на МПА
без предварительного внесения бактериофага – для контроля роста бактериального газона;
засевали суточную культура на МПА штрихом по методу Дригальского – для контроля однородности колоний и отсутствия посторонней микрофлоры; проводили контрольное определение к.о.е. в суточной культуре; 1-2 чашки с внесённым бактериофагом оставляли без засева
бактериальной культурой – для дополнительного контроля на стерильность питательных сред
и отсутствия жизнеспособных бактериальных клеток в суспензии бактериофага.
Полученные результаты:
После термостатирования перечисленных посевов при 28 ºС в течение 24 часов были
получены следующие результаты:
1. На чашках с бактериофагом без внесения бактериальной культуры рост бактерий не
выявлялся (после 48 часов культивирования при 28 ºС), что указывает на отсутствие посторонней микрофлоры в питательных средах и фаговой суспензии.
2. В 1 мл 24-часовой бульонной культуры штамма P. putida ATCC 12633 содержалось
108 колониеобразующих единиц.
3. На чашках, засеянных суточной культурой штамма P. putida ATCC 12633 штрихом
по методу Дригальского, наблюдался однородный рост бактериальных колоний, характерных
40
Биология фагов
для данного штамма – мелкие (1-2 мм), правильной округлой формы, с ровным краем, рельеф
куполообразный, поверхность гладкая, влажная, блестящая, цвет молочно-мутный, прозрачны
в проходящем свете, структура однородная, консистенция пастообразная. Наличие посторонней микрофлоры в посевах не наблюдалось, что указывает на гомогенность суточной культуры
штамма P. putida ATCC 12633.
4. Контрольный газон суточной культуры штамма P. putida ATCC�����������������
���������������������
12633 на поверхности МПА без предварительного внесения бактериофага представлял собой сплошной, однородный, равномерный рост бактерий молочно-мутного цвета по всей поверхности агара в
чашке Петри.
5. На чашках с МПА, содержащем избыточное количество бактериофага Psp101УГСХА и внесённой суспензией суточной культуры штамма P. putida ATCC 12633, в отличие
от контрольного газона, сплошного роста бактерий не наблюдалось. Вместо этого рост бактериальной культуры был представлен отдельными бактериальными колониями, равномерно
распределёнными по поверхности агара. Данные колонии имели аналогичные характеристики
с колониями, полученными на контрольном посеве штамма P. putida ATCC 12633 штрихом по
методу Дригальского – мелкие (1-2 мм), правильной округлой формы, с ровным краем, рельеф
куполообразный, поверхность гладкая, влажная, блестящая, цвет молочно-мутный, прозрачны
в проходящем свете, структура однородная, консистенция пастообразная (рис. 1).
6. Количество бактериальных колоний, образовавшихся на МПА, содержащем бактериофаг Psp101-УГСХА, после внесения 0,7 мл суспензии суточной культуры, содержащей 108
клеток штамма P. putida ATCC 12633 в 1 мл, составило 104 колоний, что соответствует примерно 1:7000 части от изначального количества клеток в суспензии суточной культуры бактерий.
Однако данный показатель определён приблизительно, для получения более точных данных
требуется проведение серии дополнительных исследований.
Колония штамма P. putida ATCC������������������������������������������������
����������������������������������������������������
12633, образованная на мясопептонном агаре, содержащем избыточное количество бактериофага Psp101-УГСХА, была отвита на полужидкий
агар для дальнейших исследований. Полученному таким образом фагорезистентному штамму
P. putida присвоен номер Pp02phr1.
Общая схема исследования представлена на рисунке 2.
Вывод:
Принимая во внимание отсутствие роста бактерий на контрольных чашках, что говорит о стерильности питательных сред и об отсутствие посторонней микрофлоры в фаголизате
Psp101-УГСХА, особенности роста колоний штамма P. putida ������������������������������
Pp����������������������������
02��������������������������
phr�����������������������
1 на мясопептонном агаре, содержащем избыточное количество бактериофага Psp101-УГСХА в сравнении с ростом
бактериального газона, полученного при аналогичном посеве на мясопептонный агар, не содержащий бактериофаг, а так же однородность колоний штамма P. putida �����������������
ATCC�������������
12633, полученного на чашках, засеянных штрихом по методу Дригальского и их морфологическая однотипность с колониями P. putida Pp02phr1 на опытных чашках с бактериофагом, правомерно
сделать вывод о том, что последние колонии образованы бактериальными клетками штамма P.
putida Pp02phr1, резистентными к бактериофагу Psp101-УГСХА.
41
Биология фагов
Рис. 1 - Образование колоний фагорезистентного штамма P. putida Pp02phr1 на
агаре, содержащем избыточное количество бактериофага Psp101-УГСХА.
Библиографический список
1. Азизбекян Р.Р. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии / Р.Р.
Азизбекян // В кн. Микробиология. Генетика микроорганизмов. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. – М., 1974. – Т.3. – С. 191-233.
2. Викторов, Д.А. Система тестов для диагностики псевдомоноза рыб, вызываемого бактерией Pseudomonas putida / Д.А. Викторов, И.И. Богданов, А.Г. Шестаков // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых
учёных, ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ - Покров, 2009. – С. 136-140.
3. Висконти Р. Генетика бактериофага / Р. Висконти // В кн.: Онтогенез вирусов. – М.,
1956. – 141 с.
4. Выделение и анализ фагоустойчивых мутантов Pseudomonas putida с помощью новых
бактериофагов / В.Н. Крылов [и др.] // Генетика. – 1981. – Т.17, №2. – С.239-245.
5. Выделение и общая характеристика группы умеренных фагов Pseudomonas aeruginosa
/ А.С. Яненко [и др.] // Микробиология. – 1979. – Т.48, №1. – С.109-113.
6. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы
бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.
7. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 1961. – 225 с.
8. Жиленков Е.Л. Изучение начальных стадий взаимодействия умеренного фага phi04
с клеткой Pseudomonas aeruginosa / Е.Л. Жиленков // Микробиология. – 1997. – Т.66, №4. – С.
532-538.
9. Золотухин С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий / С.Н. Золотухин //
Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Ульяновск, 2007. – 39 с.
10. Зуева, Л.П. Бактериофаги – факторы эволюции госпитальных штаммов и средства
борьбы с инфекциями / Л.П. Зуева, Б.И. Асланов, А.А. Долгий, А.Е. Гончаров, А.И. Архангельский // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. – 2012. - №1. – С. 9-13.
11. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулак-
42
Биология фагов
велидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир,
2012. – 636 с.
12. Крылов, В.Н. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий / В.Н. Крылов // Генетика. – 2003. – Т.39. - №5. – С. 595-619.
13. Кульба А.М. Биологические свойства и нуклеотидный состав ДНК бактериофагов
Pseudomonas / А.М. Кульба, А.С. Горелышев // Микробиология. – 1981. – Т.50. – C. 536-542
14. Методы получения, концентрации и очистки бактериофагов, поражающих фитопатогенные бактерии рода Pseudomonas / Ж.И. Оемчук [и др.] // Пробл.общ.и молекул. биол. – Киев
,1988. – №7. – С. 97-100.
15. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:
Урожай. – 1978. – С. 41-88.
16. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий / Г. Стент – М.: Мир, 1965. – 452 с.
17. Тимаков В.Д. Об условиях взаимодействия фага и бактериальной клетки / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // Вестник АМН СССР. – 1958. – №2. – С. 37.
18. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий / А.С. Тихоненко – М.: Наука,
1968. – С. 89-168.
19. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов / У. Хейс – М.: «Мир», 1965. – С. 288-294.
20. Adams M. H. Bacteriophages / M.H. Adams – Interscience Publishers, Inc., New York,
1959. – 473 p.
21. Berdygulova Z. Temporal regulation of gene expression of the Thermus thermophilus bacteriophage p23-45 / Berdygulova Z. [et al.] // Journal of Molecular Biology. – A cademic Press. – 2011.
– T. 405. – N 1. – P. 125-142.
22. Bradley D.E. The structure and infective process of a Pseudomonas aeruginosa bacteriophage containing ribonucleic acid / D.E. Bradley // J. Gen. microbiol. – 1966. – V.45. – P. 83-96.
23. Burnet F.M. Induced lysogenicity and mutation of bacteriophage within lysogenic bacteria
/ F.M. Burnet, D. Lush. // Australian J. Exptl. Biol. Med. Sci. – 1936. – V.14. – P. 27-38.
24. Djordjevic M. Quantitative analysis of a virulent bacteriophage transcription strategy /
Djordjevic M. [et al.] // Virology. – 2006. – Т. 354. – С. 240.
25. Enikeeva F.N. Restriction-modification systems and bacteriophage invasion: who wins?
/ Enikeeva F.N., Gelfand M.S., Severinov K.V. // Journal of Theoretical Biology. – Academic Press. –
2010. – T. 266. – N 4. – P. 550-559.
26. Holloway B. W. Lysogenic conversion in Pseudomonas aeruginosa / B.W. Holloway, G.N
Cooper. // J. Bacteriol. – 1962. – V.84. – P. 321-324.
27. Minakhin L. Transcription regulation by bacteriophage t4 asia / Minakhin L., Severinov K.
// Protein Expression and Purification. – Academic Press. – 2005. – T. 41. – N 1. - 1-8.
28. Minakhin L. Genome comparison and proteomic characterization of Thermus thermophilus bacteriophages p23-45 and p74-26: siphoviruses with triplex-forming sequences and the longest
known tails / Minakhin L. [et al.] // Journal of Molecular Biology. – 2008. – T. 378. – N 2. – P. 468-480.
29. Nechaev S. Bacteriophage-induced modifications of host RNA polymerase / Nechaev S.,
Severinov K. // Annual Review of Microbiology. – 2003. – T. 57. – P. 301-322.
30. Savalia D. The role of the t7 gp2 inhibitor of host RNA polymerase in phage development
/ Savalia D. [et al.] // Journal of Molecular Biology. – Academic Press. – 2010. – T. 402. – N 1. – P.
118-126.
31. Severinova E. Localization of the Escherichia coli RNA polymerase β′ subunit residue
phosphorylated by bacteriophage t7 kinase gp0.7 / Severinova E., Severinov K. // Journal of Bacteriology. – 2006. – T. 188. – N 10. – P. 3470-3476.
43
Биология фагов
EXPERIMENTAL DETERMINATION OF PHAGORESISTANT MUTANTS
BY THE EXAMPLE OF BACTERIA OF THE GENUS PSEUDOMONAS
Viktorov D.А., Grineva Т.А., Vasilev D.А., Аrtamonov А.М., Vorotnikov А.P.,
Antoshkin P.A., Zolotukhin S.N.
Key words: bacteriophage, phage resistance, fagorezistentnost, Pseudomonas, lysogens.
Experimental getting of phagoresistant variants of the bacterial strains was conducted. The
mechanism of phagoresistance in the case under consideration is in lysogenic state of bacterial cells,
caused by the reductive infection by strains of temperate phages. However, in a number of researches
the sign of phagoresistance was not motivated by lysogenic. Experiments were carried out by the
example of bacteria of Pseudomonas putida and homologous temperate phages of series Psp-USAA.
УДК 578.81
БАКТЕРИОФАГИ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS: ВЫДЕЛЕНИЕ,
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ И
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
Воложанцев Н.В., кандидат биологических наук,
тел. 7-4967-36-01-47; nikvol@obolensk.org
Баннов В.А.,
Веревкин В.В., кандидат биологических наук
Красильникова В.М., кандидат биологических наук,
Мякинина В.П. , Левчук В.П.,
Светоч Э.А., доктор ветеринарных наук, профессор,
тел. 7-4967-36-00-79; svetoch@obolensk.org
Дятлов И.А., чл. корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор;
тел. 7-4967-36-00-03; dyatlov@obolensk.org
ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
B.S. Seal, PhD, Poultry Microbiological Safety Research Unit, R.B. Russell Agricultural
Research Center, Agricultural Research Service, USDA
Phone: 1-706-546-3549; bruce.seal@ars.usda.gov
Ключевые слова: бактериофаги, Clostridium perfringens, геномный анализ, амидаза
Представлены результаты изучения биологических и молекулярно-генетических
свойств бактериофагов, лизирующих бактериальные клетки Clostridium��������������������
�������������������������������
perfringens��������
�������������������
. Обсуждаются перспективы использования бактериофагов и их литических ферментов для контроля
C. perfringens - инфекций
Введение.
Clostridium perfringens - одна из основных причин заболеваний людей, передающихся
с продуктами питания [1,��������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������
2]. Кроме того, эти грамположительные анаэробные бактерии вы-
44
Биология фагов
зывают некротический энтерит птиц – болезнь широко распространённую во многих странах
мира, занимающихся интенсивным птицеводством [3]. Существенное сокращение, а в последующем и полное исключение применения антибиотиков - стимуляторов роста при производстве птицы требуют от исследователей поиска новых научных подходов для разработки
средств, позволяющих эффективно бороться с такими патогенами человека и животных, как
C. perfringens.
Использование литических бактериофагов и их литических ферментов для контроля
C. perfringens – один из возможных подходом в борьбе с этим патогеном на птицеводческих
фермах и на перерабатывающих предприятиях.
Материалы и методы исследований.
Бактериофаги идентифицировали с помощью спот-теста и последующего титрования
на чувствительных штаммах C. perfringens. «Чистые» препараты фагов получали из изолированной негативной колонии после трёх последовательных пересевов на газоне чувствительного штамма. Специфичность и спектр антибактериального действия фагов определяли методом
спот-тестирования и стандартным двуслойным методом с использованием 50 штаммов C������
. ����
perfringens.
Оценку эффективности препарата бактериофага CpV1 в экспериментах in vivo проводили на четырнадцатидневных бройлерных цыплятах, которых инфицировали per os суспензией двух штаммов C. perfringens, содержащих маркер устойчивости к рифампицину и чувствительных к фагу, в объеме 0,2 мл (3×107 - 1×108 КОЕ) на 19, 20, 21 и 22 дни жизни. Препарат
фага в объеме 0,2 мл вводили птице per os дважды в день в те же сроки.
Фаговую ДНК выделяли из обработанного протеиназой К фаголизата на колонках
фирмы QIAGEN����������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������
(��������������������������������������������������������������������
QIAamp��������������������������������������������������������������
DNA����������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������
Midi�����������������������������������������������������
���������������������������������������������������������
Kit�������������������������������������������������
����������������������������������������������������
). Эксперименты по клонированию гена амидазы бактериофагов C. perfringens в клетках E.coli проводили по стандартным протоколам [4]. Полноразмерный ген амидазы нарабатывали в ПЦР с использованием специфических праймеров, в
состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции.
Для оценки антибактериальной активности продуктов клонированных генов использовали белковую фракцию, выделенную из клеток штамма E.coli, содержащих рекомбинантную плазмиду. В качестве контроля использовали белковый препарат, выделенный из изогенного штамма E.coli с нативной плазмидой. Активность препаратов оценивали методом споттеста на газоне живой культуры C. perfringens (культивирование 18 час. при температуре 37°С
в анаэробных условиях).
Результаты исследований и их обсуждение.
При анализе материала, отобранного на птицефабриках Московской и Калужской областей России, выделено 30 бактериофагов, обладающих литической активностью против бактерий C. perfringens.
На основании рестрикционного анализа ДНК бактериофаги были разделены на шесть
групп. Наиболее многочисленными оказались группы ��������
CpV�����
1- и �������������������������
CpV����������������������
4-подобных короткохвостых фагов, отнесенных к семейству Podoviridae. Установлено, что все фаги имеют высокую
специфичность и способны размножаться не более чем на одном–шести штаммах C����������
. ��������
perfringens. Однако при множественности инфицирования более 100 БОЕ/КОЕ фаги способны задерживать рост бактерий в питательном бульоне и формировать негативные пятна роста на
газонах около 30 % штаммов.
С целью выбора оптимальной схемы применения бактериофагов для предотвращения
С. perfringens инфекций у птицы провели серию экспериментов по изучению персистенции
одного из литических фагов, CpV1, в желудочно-кишечном тракте бройлерных цыплят (при
однократном введении фага per os в дозе 6×108 БОЕ/особь). Полученные результаты показали,
45
Биология фагов
что через час после обработки фаг выявлялся в зобе в концентрации 7×107 БОЕ/г.
В железистом желудке его концентрация
колебалась от 2×103 до 3×105 БОЕ/г. В период между 3 и 12 час. после обработки
концентрация фага достигала 107 БОЕ/г в
слепом отростке и в подвздошной кишке.
Присутствие фага в этих отделах ЖКТ в
высоких концентрациях – чрезвычайно
важный фактор с точки зрения фаготерапии C. perfringens-ассоциированных инфекций, поскольку, подвздошная кишка
и слепой отросток являются основными
Рис. 1 - Титры Clostridium perfringens и участками колонизации и размножения
фага CpV1 в нижних отделах ЖКТ бройлерных этого возбудителя.
Модельные эксперименты по
цыплят. Группы 1 и 3 – бройлеры, инфицирооценке
терапевтического
действия препаванные культурой двух RifR-штаммов �����������
C����������
. ��������
perfrinратов бактериофагов показали, что обраgens (1 раз в день, в течение 4-х дней); группы 2
ботка фагом CpV1 приводит к снижению
и 3 - бройлеры, получающие бактериофаг CpV1 уровня колонизации кишечника бройлер(дважды в день в течение 4-х дней).
ных цыплят культурой C.perfringens, чувствительной к этому фагу, на фоне роста
титра фага (рис.�������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������
2). В тоже время, эксперименты по фаготерапии бройлеров, естественно инфицированных C. perfringens, с использованием коктейля фагов не увенчались успехом (данные не представлены), что, очевидно, связано с узким спектром литической активности фагов.
Естественные изоляты C. perfringens, выделенные из бройлеров, оказались резистентными к
фагам, которые использовали в экспериментах.
Одним из научных направлений, которое, возможно, позволит преодолеть трудности в
практике применения бактериофагов в борьбе с C.perfringens, является изучение геномов бактериофагов с помощью секвенирования фаговой ДНК и идентификации генов, ответственных
за синтез литических ферментов, которые могут иметь самостоятельное терапевтическое значение и оказаться более перспективными, чем препараты нативных фагов. В связи с этим были
проведены эксперименты, позволившие более детально изучить геномы трех выделенных
нами бактериофагов семейства Podoviridae �����������������������������������������������
CpV��������������������������������������������
1, �����������������������������������������
CpV��������������������������������������
4 и ����������������������������������
ZP��������������������������������
2 [5, 6]. Результаты полногеномного анализа показали, что геномы этих бактериофагов представлены двунитевой линейной
ДНК, содержащей соответственно 16747, 17972 и 18078 пар нуклеотидов (п.н.) с короткими
концевыми инвертированными повторами (25, 28 и 30 п.н., соответственно) и кодируют от 22
до 28 потенциальных генов. Бактериофаги �����������������������������������������������
CpV��������������������������������������������
4 и ����������������������������������������
ZP��������������������������������������
2 по структуре генома оказались наиболее близкими (88 % гомологии на уровне ДНК). Интересно отметить, что еще более высокий
процент идентичности (95 %) выявлен между фагами CpV4 и CP7R, последний из которых
выделен в лаборатории из Richard B. Russell Agricultural Research Center, т.е. гомологичные
фаги выявлены в двух существенно отдаленных географических регионах, России и США [6].
В геноме исследованных фагов идентифицированы, по крайней мере, четыре геномных кластера, ответственные за репликацию фаговой ДНК, ее упаковку, синтез структурных
компонентов фага и литические свойства. К последним отнесены предполагаемые пептиды,
имеющие гомологию с N-acetylmuramoyl-L-alanine амидазой и lysozyme-эндопептидазой.
Гены фагов CpV1 и CpV4, кодирующие N-acetylmuramoyl-L-alanine амидазу, были
клонированы и экспрессированы в клетках E. coli. Показано, что белковый препарат из рекомбинантного штамма E.coli (pUC19-4H3) с геном амидазы фага CpV4 обладает выраженной
литической активностью по отношению к тестируемым штаммам C. perfringens (рис.2). При-
46
Биология фагов
Рис. 2 - Литическая активность амидазы фага CpV4 по отношению к бактериям
C. perfringens ATCC3624 (A), cp0650 (B) и ATCC13124 (C).
1 – бактериофаг CpV4 (1010 БОЕ/мл); 2 – белковый препарат из рекомбинантного штамма E.coli DH5a (pUC19-4H3) с геном амидазы фага CpV4; 3 – белковый препарат из штамма
E.coli DH5a с нативной плазмидой pUC19.
чем, препарат лизирует как чувствительные, так и устойчивые к фагу CpV4 штаммы (табл. 1).
Таблица 1 - Сравнение литической активности препарата амидазы и бактериофага
CpV4
Штамм
C. perfringens
Белковый препарат из штамма
E.coli DH5a (pUC19-4H3)
E.coli DH5a
(pUC19)
Бактериофаг CpV4
(10 10 БОЕ/мл)
Штаммы, на которых фаг CpV4 способен размножаться
ATCC3624
+
-
+
ATCC 10543
+
-
+
ATCC 13124
+
-
+
СР-25
+
-
+
СР-26
+
-
+
СР-27
+
-
+
Штаммы, устойчивые к фагу CpV4
СР-13
+
-
-
Д5
+
-
-
cp0183
+
-
-
cp0650
+
-
-
cp1030
+
-
-
cp1036
+
-
-
“+” – выраженное пятно лизиса; “-” – отсутствие лизиса
Заключение. Бактериофаги являются потенциальными средствами лечения бактериальных инфекций. Однако узкая специфичность фагов, возможное развитие устойчивости
бактерий к своим вирусам - все это указывает на необходимость постоянного поиска новых
47
Биология фагов
изолятов фагов для использования их в терапевтических целях. Еще в 1959 г. ���������������
H��������������
.�������������
W������������
.�����������
Smith������
обратил внимание на отсутствие чувствительности многих штаммов C. perfringens к выделенным
бактериофагам [7]. То же самое мы наблюдали в наших исследованиях, где большинство литических бактериофагов C. perfringens имели ограниченный диапазон хозяев. В связи с этим, кажется маловероятным, что какой-либо «коктейль» бактериофагов окажется эффективным против всех бактериальных изолятов C. perfringens, которые существуют в окружающей среде. В
этом отношении, кажется более перспективным использование фаговых литических ферментов для контроля C. perfringens-инфекций. Полученные нами данные свидетельствуют о том,
что ген амидазы фага CpV4, клонированный в рекомбинантном штамме E.coli, детерминирует
синтез продукта, обладающего литической активностью против бактерий C. perfringens. Причем, этот продукт лизирует не только бактериальные штаммы, чувствительные к фагу CpV4,
но и штаммы устойчивые к этому фагу.
Таким образом, амидазы фагов, осуществляющие расщепление пептидогликана бактериальной клеточной стенки, могут расцениваться как потенциальные терапевтические средства против C. perfringens.
Библиографический список
1. Brynestad S. Clostridium perfringens and foodborne infections / Brynestad S., Granum
P.E. // Int. J. Food Microbiol. – 2002. – Vol. 74(3). – P.195-202.
2. Lindström M. Novel insights into the epidemiology of Clostridium perfringens type A
food poisoning / Lindström M., Heikinheimo A., Lahti P., Korkeala H.// Food Microbiol. – 2011. –
Vol.28(2). – P.192-198.
3. Van Immerseel F. Clostridium perfringens in poultry: an emerging threat for animal and
public health / Van Immerseel F., De Buck J., Pasmans F., Huyghebaert G., Haesebrouck F., Ducatelle
.R // Avian Pathol. – 2004. – Vol.33 (6). – P. 537-549.
4. Sambrook J., Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, NY.1989
5. Volozhantsev N.V. The genome sequence and proteome of bacteriophage ΦCPV1 virulent
for Clostridium perfringens / Volozhantsev N.V., Verevkin V.V., Bannov V.A., Krasilnikova V.M.,
Myakinina V.P., Zhilenkov E.L., Svetoch E.A, Stern N.J., Oakley B.B., Seal B.S. // Virus Res. – 2011.
– Vol. 155. – P. 433–439.
6. Volozhantsev N.V. Molecular Characterization of Podoviral Bacteriophages Virulent for
Clostridium perfringens and Their Comparison with Members of the Picovirinae / Volozhantsev N.V.,
Oakley B.B., Morales C.A., Verevkin V.V., Bannov V.A., Krasilnikova V.M., Popova A.V., Zhilenkov
E.L., Garrish J.K., Schegg K.M., Woolsey R, Quilici D.R, Line J.E, Hiett K.L, Siragusa G.R, Svetoch
E.A, Seal B.S. // PLoS ONE – 2012. – 7(5): e38283.
7. Smith H.W. The bacteriophages of Clostridium perfringens // J Gen Microbiol. – 1959. –
Vol.21. – P. 622-630
BACTERIOPHAGES OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS: ISOLATION,
BIOLOGCAL PROPERTIES, GENOMIC ANALYSIS AND POTENTIALITY
OF PRACTICAL USE
Volozhantsev N.V., Bannov V.A., Verevkin V.V., Myakinina V.P., Levchuk V.P.,
Svetoch E.A., Dyatlov I.A., Seal B.S.
Key words: bacteriophage, Clostridium perfringens, genome analysis, amidase
Results from studying of biological and genomic properties of bacteriophages lytic for
Clostridium perfringens are presented. Potential use of bacteriophages and their lytic enzymes to
control C.perfringens infections is discussed
48
Биология фагов
УДК 579.6
ДЕТЕКЦИЯ БАКТЕРИИ РОДА AZOSPIRILLUM С ПОМОЩЬЮ
БАКТЕРИОФАГОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ AZOSPIRILLUM BRASILENSE
ШТАММОВ SP7 И SR75
Гулий О.И.*, Караваева О.А.*, Макарихина С.С.*,
Павлий С.А.**, Игнатов О.В.*
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
**Национальный исследовательский Саратовский государственный
университет им. Н.Г. Чернышевского
Тел.: 8(8452)970444, e-mail:guliy_olga@mail.ru
Ключевые слова: Azospirillum brasilense, бактериофаг, детекция.
Работа посвящена исследованию возможности применения бактериофагов, выделенных из почвенных микроорганизмов Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75, для детекции
клеток Azospirillum с помощью метода электрооптического (ЭО) анализа микробных суспензий. При проведении исследований авторами определен минимальный предел детекции клеток,
который составляет 104 клеток/мл. Установлена возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции клеток азоспирилл при их взаимодействии со специфическими бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры
Введение. Одной из актуальных проблем современной биотехнологии является разработка новых подходов для детекции бактерий с помощью бактериофагов [1-2]. Этому вопросу посвящено сравнительно большое количество научных статей, однако, развитию методов
детекции почвенных микроорганизмов, уделяется недостаточное внимание, хотя роль этих
микроорганизмов весьма значительна как для развития фундаментальных исследований, так и
для современной сельскохозяйственной биотехнологии.
Перспективным направлением исследований является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов, в том числе бактериофагов Azospirillum brasilense, а
также разработка новых методов индикации почвенных бактерий с помощью бактериофагов.
Целью работы являлось изучение возможности применения бактериофагов, выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75 для детекции бактерий рода Azospirillum с
помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы.
В работе использовали микроорганизмы A. brasilense штаммов Sp7, Cd, Sp107, Sp245,
Jm6B2, Br14, KR77, S17, S27, SR55, SR75, A. amazonense Am14, A. halopraeferans Au4, A�������
��������
. irak�����
ense штаммов KBC1, KА3, A. lipoferum штаммов Sp59b, SR65, RG20a, Escherichia coli штаммов
B-878, XL-1, из коллекции культур Федерального государственного бюджетного учреждения
науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)
(Саратов). Микроорганизмы хранились при +4°С на чашках Петри с картофельным агаром
(3%) и пересевались каждые 2 недели.
Условия культивирования микробных клеток: культуры бактерий выращивали в 250
мл колбах Эрленмейера на жидкой среде LB [3] – следующего состава (г/л): NaCl (Becton,
Dickinson and Company, Франция) – 10,0, пептон (Becton, Dickinson and Company, Франция)
49
Биология фагов
– 5,0, дрожжевой экстракт (������������������������������������������������������������
DIFCO�������������������������������������������������������
, США) – 5,0. Инкубирование клеток о�������������������
c������������������
уществляли на круговой качалке при интенсивности перемешивания 160 об/мин при температуре 30±1°С в течение
18-20 ч.
Методы. В ходе выполнения работы применяли традиционные методы культивирования микроорганизмов на питательных средах [4]. Выделение бактериофагов проводили методами, предложенными [4]. Инфицирование клеток бактериофагом проводили согласно [5].
Изучение электрооптических параметров суспензий клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75
с использованием выделенных бактериофагов проводили согласно методике [5].
Кривые на рисунках строились по средним значениям, полученным в результате не
менее 5 повторностей. Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом [6]. Для статистической обработки экспериментальных данных также использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2000.
Результаты и обсуждение. Для выполнения исследований использовали бактериофаги, выделенные из клеток Azospirillum brasilense штаммов ���������������������������������
Sp�������������������������������
7 и ���������������������������
SR�������������������������
75 [7]. Изучалась возможность использования выделенных бактериофагов для детекции клеток азоспирилл с помощью
метода электрооптического (ЭО) анализа клеточных суспензий. Методы ЭО анализа микробных суспензий основаны на регистрации изменения оптических свойств микробной суспензии
под влиянием переменного электрического поля. При воздействии на бактериальные клетки
антителами [8] и вирусами [5] происходит изменение ЭО параметров бактериальных суспензий. И наоборот, если вещество или частица присутствует в среде роста, но не взаимодействует с клетками, изменения величины ЭО параметров не происходит [5; 8; 9; 10].
Первоначально проводилась оптимизация условий измерения ЭО параметров суспензии клеток A. brasilense штаммов Sp�����������������������������������������������������
7 и SR�����������������������������������������������
�������������������������������������������������
75, которая включала в себя напряженность электрического поля 17 В/см при времени приложения электрического поля 16 сек и проведение
измерений на частотах 740, 1000, 1450, 2000 и 2800 кГц. Электропроводность воды во всех
случаях составляла 1,6 µ���������������������������������������������������������������
S��������������������������������������������������������������
/�������������������������������������������������������������
m������������������������������������������������������������
. В предварительных экспериментах было показано, что изменение величины ЭО сигнала происходит при внесении бактериофага из расчета 20 бактериофагов на 1 бактерию, поэтому мы использовали те же условия.
Далее изучали динамику изменений величины ЭО сигнала суспензии клеток A��������
. brasi������
lense Sp7 и A. brasilense SR75 при их инфицировании бактериофагами ΦAb-Sр7 и ΦAb-SR75.
Для этого в суспензию клеток A. brasilense Sp7 и A. brasilense SR75 (108 клеток/мл) вносили
соответствующий бактериофаг, затем проводили инкубацию при температуре 37°С в течение
1, 5, 10, 20 и 30 минут. При инфицировании клеток A. brasilense штаммов Sp7 (рис. 1 (А)) и
SR75 (рис. 1 (Б)) соответствующими бактериофагами наблюдалось изменение величины ЭО
сигнала уже через 1 мин от начала инфекции, что, вероятно, связано с адсорбцией бактериофага на поверхности клетки. Следует отметить, что изменения величины ЭО сигнала суспензий
клеток A. brasilense штаммов Sp7 и SR75 после 5, 10, 20 и 30 мин от начала инфекции клеток
бактериофагом фиксировались в пределах 5%.
50
Биология фагов
1200
800
А
1000
Б
700
О Д относительных единиц
δ
О Д, относительных единиц
δ
600
800
600
1
6
5
4
3
2
400
200
1
500
400
2
3
4
5
6
300
200
100
0
100
1000
0
100
10000
Частота, кГц
1000
10000
Частота, кГц
Рис. 1. - Динамика изменений ОС суспензии клеток �����������������������������
A����������������������������
. ��������������������������
brasilense����������������
Sp�������������
���������������
7 (А) при добавлении бактериофага ΦAb-Sр7 и суспензии клеток A����������������������������������
�����������������������������������
. brasilense����������������������
��������������������������������
���������������������
SR�������������������
75 (Б) при добавлении бактериофага ΦAb-SR75: (1) – контроль – суспензия клеток без бактериофагов; время от
начала инфекции: (2) –1 мин; (3) – 5 мин; (4) –10 мин; (5) –20 мин; (6) – 30 мин
Одним из важных параметров при развитии нового метода детекции клеток является
определение минимального количества детектируемых клеток. Поэтому проводили измерения
при количестве клеток в ячейке 106, 104 и 102 клеток/мл. Установлено, что предел детекции
микробных клеток A. brasilense штаммов ��������������������������������������������������
Sp������������������������������������������������
7 (рис. 2 (А)) и SR�����������������������������
�������������������������������
75 (рис. 2 (Б)) при их инфекции бактериофагами ΦAb-Sр7 и ΦAb-SR75 с помощью метода электрооптического анализа
микробных суспензий составляет 104 клеток/мл.
1000
900
Б
1000
800
700
О Д относительных единиц
δ
О Д относительных единиц
δ
1200
А
1
600
500
400
2
300
200
800
1
600
400
2
200
100
0
100
1000
Частота, кГц
10000
0
100
1000
10000
Частота, кГц
Рис. 2. - Изменение величины ЭО сигнала суспензии клеток A. brasilense Sp7 (А)
при их инфекции бактериофагом ΦAb-Sр7 и A������������������������������������������
�������������������������������������������
. ����������������������������������������
brasilense������������������������������
�����������������������������
SR���������������������������
75 (Б) при их инфекции бак4
териофагом ΦAb-SR75. Количество клеток в ячейке – 10 клеток/мл. (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) – суспензия клеток с добавлением бактериофагов
Важным этапов в развитии метода детекции клеток является получение аналитического сигнала при наличии мешающих факторов и, прежде всего, в присутствии посторонней микрофлоры. Поэтому нами проводились измерения ЭО параметров суспензии клеток A.
brasilense штаммов Sp7 и �������������������������������������������������������������
SR�����������������������������������������������������������
75 при их инфекции бактериофагами ΦAb-Sр7 и Φ��������������
Ab������������
-�����������
SR���������
75, соответственно, в присутствии клеток E. coli штаммов B-878 и XL-1.
51
Биология фагов
1000
400
900
350
А
800
700
δОД, относительных единиц
О Д относительных единиц
δ
Для этого к смешанной суспензии A. brasilense Sp7, E. coli B-878 и E. coli XL���������
�����������
-1 и смешанной суспензии A. brasilense SR75, E. coli B-878 и E. coli XL�����������������������������
�������������������������������
-1 (количество клеток в изме4
рительной ячейке 10 клеток/мл, взятых в равном соотношении (1:1:1), вносили определенный
бактериофаг. В качестве контроля использовалась смешанная суспензия A. brasilense Sp7, E.
coli B-878 и E. coli XL���������������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������
-1 без внесения бактериофага. В результате было показано, что при инфекции клеток A. brasilense штамма Sp7 бактериофагом ΦAb-Sр7 (рис. 3 (А)) и клеток штамма
SR75 бактериофагом ΦAb-SR75 (рис. 3 (Б)) в присутствии клеток E. coli В-878 и E. coli XL-1,
происходит значительное снижение величины ЭО сигнала.
Дополнительно проводились контрольные эксперименты по изучению неспецифического взаимодействия бактериофагов ΦAb-Sр7 и ΦAb-SR75 с клетками E. coli штаммов B-878
и XL-1, при этом было показано, что изучаемые бактериофаги не инфицируют клетки E. coli
штаммов B-878 и XL-1.
1
600
2
500
400
300
200
100
0
100
1000
Частота, кГц
10000
Б
300
1
250
200
150
2
100
50
0
100
1000
10000
Частота, кГц
Рис. 3. - (А) Изменение величины ЭО сигнала смешанной суспензии клеток E. coli
B-878 + E. coli XL-1 + A. brasilense Sp7 ������������������������������������������������
при���������������������������������������������
добавлении����������������������������������
��������������������������������������������
бактериофага���������������������
���������������������������������
�������������������
��������������������
Ab-S���������������
������������
7; (����������
Б���������
) суспен�������
зий клеток E. coli B-878 + E. coli XL-1 + A. brasilense SR75, при добавлении бактериофага
ΦAb-SR75. (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) – суспензия
клеток с добавлением бактериофагов
Полученные результаты показывают возможность использования бактериофагов
ΦAb-Sр7 и ΦAb-SR75 для детекции микробных клеток с помощью метода электрооптического
анализа клеточных суспензий в присутствии посторонней микрофлоры.
Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность детекции микробных клеток азоспирилл при их инфекции специфическим бактериофагом с помощью
метода электрооптического анализа микробных суспензий. Определен минимальный предел детекции клеток, который составляет 104 клеток/мл. Установлена возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции клеток азоспирилл при
их взаимодействии со специфическими бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение №8852 «Разработка методологии и приборного обеспечения
электрооптического анализа вирусов микроорганизмов» (номер заявки в информационной
компьютеризированной системе 2012-1.5-14-000-2021-004 (2012-2013 гг.)
52
Биология фагов
Библиографический список
1 Schofield D. A., Sharp N. J., Westwater C. Phage-based platforms for the clinical detection
of human bacterial pathogens // Bacteriophage. 2012. Vol. 1;2(2). P.105-283.
2. Schofield DA, Molineux IJ, Westwater C. Rapid identification and antibiotic susceptibility
testing of Yersinia pestis using bioluminescent reporter phage.// J Microbiol Methods. 2012. Vol.
90(2). P.80-82.
3. Sambrook J., Fritsch D.F., Maniatis T. Molecular Сloning: A Laboratory Manual. 2nd ed.
(v.1–3). Cold Spring Harbor; New York; Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. – 1659 p.
4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер с англ. – М.: Мир, 1984. – 480 с.
5. Bunin V.D., Ignatov O.V., Guliy O.I., Zaitseva I.S., Dykman L.A., O’Neil D., Ivnitski D.
Electro-optical analysis of the Escherichia coli–phage interaction. // Anal. Biochem. – 2004b. – Vol.
328. – P.181-186.
6. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. – Л.:
Химия, 1984. – 168 с.
7. Караваева О.А. Детекция бактерий рода Azospirillum с помощью бактериофагов,
выделенных из Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и SR75// Дис. … кандидата биол. наук. –
Саратов. – 2012. – 173 с.
8. Bunin V.D., Ignatov O.V., Guliy O.I., Voloshin A.G., Dykman L.A., O’Neil D., Ivnitski
D. Studies of Listeria monocytogenes-antibody binding using electro-orientation // Biosens. Bioelectron. – 2004a. – Vol. 19, Is. 2. – P. 1759-1761.
9. Гулий О.И., Маркина Л. Н., Игнатов О.В., Щеголев C. Ю., Зайцева И. С., Бунин В.Д.,
Игнатов В.В. Влияние ампициллина на электрофизические свойства клеток Escherichia coli //
Микробиология. – 2005. – Т.74, №1. – С. 126-131.
10 Гулий О. И., Маркина Л. Н., Бунин В. Д., Игнатов В.В., Игнатов О. В. Исследование
электрооптических параметров суспензий клеток Escherichia coli при действии канамицина //
Микробиология. – 2008. – Т .77, №3. – С. 380-385.
DETECTION OF BACTERIA AZOSPIRILLUM BY BACTERIOPHAGES
ISOLATED FROM AZOSPIRILLUM BRASILENSE STRAINS SP7 AND SR75
Guliy O.I., Karavaeva O.A., Makarihina S.S., Pavliy S.A., Ignatov O.V.
Key words: Azospirillum brasilense, bacteriophage, detection
Paper investigates the possibility of using phages isolated from soil microorganisms
Azospirillum brasilense strains Sp7 and SR75, for the detection of Azospirillum cells using the electrooptic (EO) analysis of microbial suspensions. In research by the authors determined the minimum
detection limit of the cells, which is 104 cells / ml. The possibility of using the method of electrooptical analysis for the detection of microbial suspensions azospirill cells through their interaction
with specific bacteriophages in the presence of extraneous microflora.
53
Биология фагов
УДК 578.819.1
ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА НОВОГО КОЛИФАГА PHIKT,
БЛИЗКОРОДСТВЕННОГО ФАГУ CAULOBACTER CRESCENTUS CD1
Куликов Е. Е. *, Тарасян К. К. *, Голомидова А. К. *, Прохоров Н. С. *,
Исаева А. С. *, Строцкая А. В. *, Татарский Е. В.*, Летарова М. А. *,
Кутузова Н. М.**, Клунова С. М. **, Летаров А. В. *
* ФГБУН «Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН», 113719,
г. Москва, пр. 60-летия Октября, 7/2, тел. +7(499)135-21-39, inmi@inmi.host.ru
**ФГБОУ ВПО «Московский государственный педагогический университет»,
119991, г. Москва, ул. Малая Пироговская, 1/1, тел. +7(499)245-03-10, biochem_
mpgu@mail.ru
Автор для корреспонденции Летаров А. В., letarov@gmail.com
Ключевые слова: геном бактериофага, Caulobacter crescentus, Escherichia coli, phiKT
Приведены результаты предварительного анализа генома нового вирулентного бактериофага phiKT, выделенного из фекалий лошади, и активного против кишечной палочки
Escherichia coli. Показано, что новый фаг имеет высокое сходство ряда генов обмена нуклеиновых кислот и структурных генов с ранее описанным фагом phiCD1, инфицирующим подвижные формы значительно отдалённой от E. coli свободноживущей олиготрофной водной
альфа-протеобактерии Caulobacter crescentus. Полученный результат показывает возможность значительного изменения спектра активности бактериофагов определённых групп путём модификации генов, лежащих вне “корового” участка генома фага, ответственного за
репликацию вирусного генома, взаимодействие с макромолекулами клетки-хозяина, и структуру вирусной частицы.
Введение
В 2010 году сотрудниками лаборатории вирусов микроорганизмов ИНМИ РАН из фекалий лошади был выделен новый бактериофаг phiKT, обладающий типичной для подовирусов морфологией (типа фага Т7), и проявляющий литическую активность против достаточно
узкого спектра штаммов кишечной палочки Escherichia coli, выделенных параллельно из тех
же образцов фекалий (штаммы 53 и 30/70) в рамках получения коллекции штаммов бактерий,
обладающих различной устойчивостью к природным изолятам колифагов.
Материалы и методы
Свежие фекалии лошади, отобранные стерильно, разводили в соотношении 1+4
(масса/масса) фаговым раствором (200 mM NaCl, 100 мг/л азида натрия, 1 мл/л Tween 20),
и инкубировали 1 час на ротаторе (120 оборотов в минуту). Полученные экстракты осветляли фильтрованием через марлю, и осветлённые препараты фильтровали через бактериальный
фильтр (Acrodisc, 0.22 мкм) с префильтром. Аликвоту осветлённого препарата высевали на
селективную для энтеробактерий среду LTA (Lauryl-tryptose agar), содержащую 0.1 г лаурилсульфата натрия на литр, полученные колонии дополнительно идентифицировали на способность утилизировать лактозу на индикаторной среде Эндо. Полученные колонии микробов
отсевали, и тестировали на чувствительность изолированных штаммов к бактериофагам из
отфильтрованных стерильных экстрактов методом посева по Грациа. Отдельные бляшки фагов
перекалывали на газоны штамма E. coli, на которых было проведено первичное выделение, и
затем получали жидкие фаговые лизаты этих же штаммов. После скрининга лизатов на гомогенность морфологии вирионов методом трансмиссионной электронной микроскопии прово-
54
Биология фагов
дили препаративное ультрацентрифугирование фагов (ротор Beckman SW28, 1 час при 100000
g). Осадки фагов использовали для выделения ДНК фенольным методом [10]. Выделенную
ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции, и оценивали примерную длину генома фага.
Секвенирование проводили методом пиросиквенса на приборе FLX Roche (Roche Biosciences).
Анализ последовательностей вели с помощью программного пакета Lasergene DNAStar.
Результаты и обсуждение
Выделенный бактериофаг phiKT отличается типичной для подовирусов морфологией [9]. Диаметр его капсида составляет около 55 нм (рис. 1), что позволило оценить размер
его генома как примерно 40 т. п. н. (по сходству с бактериофагом Т7 [2]), и считать геном
линейным и состоящим из дцДНК. При суммировании длин фрагментов генома, полученных
гидролизом рестриктазами EcoRV и SspI, это предположение было подтверждено. При секвенировании геномной ДНК была получена последовательность длиной 42608 п. н. Посредством компьютерной симуляции положений сайтов гидролиза рестриктазами было определено
ориентировочное местоположение физических концов генома, при этом результаты практического рестрикционного анализа полностью совпали с предсказанными по последовательности
результатами. Полученная нуклеотидная последовательность была депонирована в GenBank
под номером NC_015920.
Рис. 1 - Бактериофаг phiKT и бактериофаг Т7 для сравнения (трансмиссионная
электронная микроскопия, х40000, контрастирование молибдатом аммония, масштаб –
100 нм).
Дальнейший биоинформатический анализ позволил установить тонкую структуру генома бактериофага phiKT (рис. 2).
Всего нами была обнаружена 31 открытая рамка считывания (см. аннотацию, GenBank
NC_015920), причём необычным оказалось то, что все эти рамки находились только в прямой
ориентации относительно начала генома.
Методом сравнения с базами последовательностей регуляторных элементов (программы BPROM (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gf
indb) и РРР (http://bioinformatics.biol.rug.nl/websoftware/ppp/ppp_start.php)) нами были предсказаны сайт связывания сигма-А субъединицы РНК-полимеразы E. coli в самом начале генома
(координаты 96-126), промоторный участок (1924-1964), и сайт связывания регуляторного бел-
55
Биология фагов
Рис. 2 - Карта генома бактериофага phiKT
ка fis (1950-1957), находящийся в зоне промотора. Таким образом, можно сказать, что начальная фаза экспрессии генома фага phiKT скорее всего целиком зависит от клеточных факторов
и ферментов. Ранние гены фага представлены модулем обмена нуклеиновых кислот, и кодируют ферменты и белки, необходимые фагу для переключения синтетических процессов клетки
на репликацию фагового генома – праймазу, хеликазу, ДНК-фосфатазу, белок инициации репликации, ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, набор эндо- и экзонуклеаз, dNMP-киназу, ДНКзависимую РНК-полимеразу, и несколько белков с неустановленной функцией. Этот модуль,
занимающий в геномной карте позиции с 2105 по 15330 (31% размера генома), заканчивается
достаточно длинным спейсерным участком (15330-16895, 1565 п. н.), лишённым открытых
рамок считывания. В этом участке, однако, нам удаётся предсказать существование второго
промоторного участка (позиции 16401-16450, программа NNPP (http://www.fruitfly.org/seq_
tools/promoter.html)), предположительно ассоциированного с экспрессией второго геномного
модуля (координаты 16895-36093, 43% генома). Этот модуль содержит гены фаговых белков,
необходимых для построения вириона (head-tail белок, scaffold-белок, основной белок капсида, белки трубки хвоста (А и В), внутренний белок вириона, белок слияния мембран, белок
хвостовой фибриллы), и для упаковки генома фага в капсид (белок ДНК-матураза В). Этот модуль, равно как и предыдущий, обращает на себя внимание высокой плотностью генов – в нём
практически отсутствуют межгенные участки, что дополнительно свидетельствует о наиболее
вероятной транскрипции этого модуля как единого целого фаговой РНК-полимеразой, кодируемой в первом модуле [1]���������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������
. Дополнительным подтверждением этой гипотезы можно считать ис-
56
Биология фагов
чезновение чувствительности фаговой инфекции к блокированию клеточной РНК-полимеразы
E. coli рифампицином, начиная с 10 минуты инфекции (данные не приведены).
Непосредственно за этим модулем следует короткий (36093-36780, 687 п. н.) спейсер,
в котором не удаётся предсказать промоторных и регуляторных элементов. Далее располагаются поздние гены, кодирующие белки, ассоциированные с лизисом клетки хозяина (эндолизин, трансмембранный белок, холин). Интересно то, что уже за геном холина – ближе к
физическому концу генома фага – обнаруживаются ещё две рамки считывания, также прямые,
и кодирующие белок неизвестной функции и белок, сходный с белком-рулеткой (tape measure
protein) фагов семейства Siphoviridae. Роль второго белка у лямбда-подобных вирусов состоит
в инициации полимеризации хвоста фага, и определении его физической длины ��������������
[7]�����������
. Для установления функции данного белка в физиологии фага phiKT необходим протеомный анализ
зрелого вириона. До получения данных о белках, входящих в структуру зрелой вирусной частицы, остаётся только догадываться о роли гомолога белка, необходимого сифовирусам, для
фактически лишённого хвоста подовируса.
При анализе последовательностей открытых рамок считывания генома фага phiKT
методом транслирующего поиска гомологий BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) была выявлена очень высокая степень гомологии ряда важнейших генов (хеликазы, ДНК-полимеразы,
5’-3’ экзонуклеазы, РНК-полимеразы, всех структурных белков) и генов с неустановленными
Рис. 3 - Dot-plot матрица геномов фагов phiKT и Cd1. Координаты соответствуют
геномным координатам. Внизу цифрами и серыми линиями указаны примерные границы модулей генома, чёрными отрезками над ними – зоны максимальной нуклеотидной
гомологии.
57
Биология фагов
функциями (ORF 7, 14) с генами морфологически сходного с фагом Т7 бактериофага Cd1, специфичного против очень филогенетически удалённой от E. coli бактерии Caulobacter crescentus
(GenBank GU393987) [6; 8]. Этот микроорганизм относится к группе альфа-протеобактерий, и
отличается от кишечной палочки не только олиготрофным образом жизни в пресных водах, но
и двухстадийным жизненным циклом – наличием свободно плавающей формы, снабжённой
жгутиками, и прикреплённой формы [5]���������������������������������������������������
������������������������������������������������������
. Репликация генома происходит только в прикреплённой форме, а фаг Cd1 активен только против подвижной формы бактерии [4]. Таким образом,
биология этого вида бактерий настолько отличается от биологии E. coli, что было бы странно,
если бы бактериофаги этих бактерий были бы сходны.
Для выяснения уровня ДНК-гомологии между геномами бактериофагов phiKT и Cd1
использовали метод множественного локального попарного выравнивания (программа YASS,
http://bioinfo.lifl.fr/yass/index.php).
Полученный график dot-plot (рис. 3) однозначно показывает существование значительных по своей протяжённости непрерывных участков высокой гомологии этих геномов на
нуклеотидном уровне. Более того, эти участки гомологии полностью совпадают с ранее обозначенными нами границами геномных модулей – раннего, среднего и позднего.
Сам факт того, что бактериофаги, имеющие настолько различных хозяев, способны
иметь весьма высокую структурную и функциональную гомологию на уровне генома, оказывается весьма неожиданным. Даже предварительные грубые оценки геномов бактерий и их
фагов по GC-составу (61.21%GC у фага Cd1 и 67.2%GC у его хозяина Caulobacter crescentus
CB15 против 51.59%GC у фага phiKT и 50.79%GC у Escherichia coli K12) могут указывать на
продолжительную и раздельную коэволюцию геномов этих объектов [3]. Вероятной причиной
возникновения двух крайне сходных фагов, способных инфицировать столь разные бактерии,
можно назвать специализацию некоторого исходного бактериофага, закреплённую посредством отбора на дистантных группах организмов. Тщательный сравнительный анализ пары
фагов phiKT-Cd1 способен пролить свет на механизмы, позволяющие коровому набору белков
бактериофага одинаково хорошо и сходно выполнять свои функции в различных объектах,
принципиально отличающихся по биологии клетки.
Библиографический список
1. Amemiya K., Shapiro L. In vitro transcription of the early region of Caulobacter phage
phi Cd1 deoxyribonucleic acid by host RNA polymerase // Biochemistry. 1982. Т. 21. № 19. — C.
4707-13.
2. Dunn J.J., Studier F.W. Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7 DNA and the
locations of T7 genetic elements // J Mol Biol. 1983. Т. 166. № 4. — C. 477-535.
3. Gibbs A., Primrose S. A correlation between the genome compositions of bacteriophages
and their hosts // Intervirology. 1976. Т. 7. № 6. — C. 351-5.
4. Jollick J.D. Differential phage sensitivity of cell types in Caulobacter // J Gen Virol. 1972.
Т. 16. № 3. — C. 405-7.
5. Laub M.T., Shapiro L., McAdams H.H. Systems biology of Caulobacter // Annu Rev
Genet. 2007. Т. 41. — C. 429-41.
6. Raboy B., Shapiro L., Amemiya K. Physical map of Caulobacter crescentus bacteriophage
phi Cd1 DNA // J Virol. 1980. Т. 34. № 2. — C. 542-9.
7. Sanger F., Coulson A.R., Hong G.F., Hill D.F., Petersen G.B. Nucleotide sequence of
bacteriophage lambda DNA // J Mol Biol. 1982. Т. 162. № 4. — C. 729-73.
8. West D., Lagenaur C., Agabian N. Isolation and characterization of Caulobacter crecentus
bacteriophage phi Cd1 // J Virol. 1976. Т. 17. № 2. — C. 568-75.
58
Биология фагов
9. Calendar R. The bacteriophages. 2nd — Oxford ; New York ‌: Oxford University Press,
2006. — xiii, 746 p.
10. Kutter E., Sulakvelidze A. Bacteriophages : biology and applications. — Boca Raton, FL
‌: CRC Press, 2005. — 510 p.
A NOVEL COLIPHAGE PHIKT, CLOSELY RELATED TO CAULOBACTER
PHAGE CD1: GENOME ANNOUNCEMENT
Kulikov, E. E., Tarasyan K. K., Golomidova, A. K., Prokhorov, N. S., Isaeva, A. S.,
Strotskaya A. V., Tatarsky, E. V., Letarova, M. A., Kutuzova, N. M., Klunova, S. M.,
Letarov A. V.
Keywords: bacteriophage genome, Caulobacter crescentus, Escherichia coli, phiKT
A preliminary analysis of genome structure of the novel coliphage phiKT, isolated from horse
feces, was performed. It has a very strong genetic affinity with Caulobacter phage Cd1, including
high nucleotide homology of nearly all of its structural protein genes and nucleic acid metabolism
genes. This is a very unusual finding, showing the ability of some phages to adapt to the host bacteria
of different phylogenetic classes by changes of some of the genes outside of the core region of phage
genome.
УДК 578.81
ТРАНСДУКЦИЯ ПЛАЗМИД БАКТЕРИОФАГАМИ Т4-ТИПА (ОБЗОР)
Зимин А.А., кандидат биологических наук
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К.Скрябина РАН
zimin@ibpm.pushchino.ru
Ключевые слова: бактериофаги Т4-типа, горизонтальный перенос генетической информации, фаговая трансдукция
Для изучения трансдукции плазмид бактериофагами Т4-типа были проведены следующие эксперименты. Была исследована трансдукция в природных условиях – в кишечнике
лабораторного животного – мыши. Было проведено изучение трансдукции плазмид в отсутствии селекции антибиотиком и изучение трансдукция низкокопийных плазмид.
Работа была поддержана грантами РФФИ: №07-04-01563а, №08-04-10149-к,
№08-04-99111офи_р, №09-04-90824-моб_ст, 13-04-00991-а.
Введение. Бактериофаг Т4 дикого типа не способен осуществлять трансдукцию, так
как содержит гидроксиметилцитозин вместо цитозина в своей ДНК и его геном кодирует ферменты, которые разрушают цитозиновую ДНК бактерии. Для мутантов бактериофага Т4, со-
59
Биология фагов
держащих цитозиновую ДНК, была показана способность к трансдукции плазмидной ДНК [13]. Трансдукция плазмид была показана и для природных бактериофагов Т4-типа, содержащих
цитозин, так называемых псевдо – Т – четных бактериофагов: RB42, RB43, RB 49 [4-6]. В этих
исследованиях было показано, что трансдукция плазмид приводит к появлению псевдолизогенных клонов трансдуктантов на твердой агаризированной среде, содержащей антибиотик.
В ходе этого процесса геном плазмиды может как оставаться интактным, так и претерпевать
изменения. Могут происходить, например, делеции части плазмиды или образовываться плазмиды большей длины. В ходе этих исследований были получены плазмиды большего размера,
чем исходная, которые могли образоваться за счет включения фаговой ДНК в плазмидный
геном. Исследование изменений, индуцируемых процессом трансдукции в геномах плазмиды,
фага и бактерии могут пролить свет на роль этого процесса в эволюции бактериального генома, а также существенны для развития технологии конструирования новых препаратов для фаговой терапии. Кроме этого нас интересовал вопрос можно ли отобрать плазмидосодержащие
клоны-трансдуктанты на среде без селективного антибиотика и трансдуцировать природные
плазмиды со строгим контролем копийности. Исследования трансдукции в природных условиях были проведены с использованием лабораторных животных.
Трансдукция в природных условиях. Трансдукция маркера антибиотикорезистентности к ампицилину в лабораторный штамм E.coli в кишечнике мышей [7]. Было
получено несколько трансдуцирующих фагов. Был установлен их титр на ��������������������
C�������������������
600, а также частота трансдукции в штамм ���������������������������������������������������������������
CR�������������������������������������������������������������
204, устойчивый к канамицину. Для использования в эксперименте с животными был выбран вариант ��������������������������������������������������
RB������������������������������������������������
43/���������������������������������������������
pET������������������������������������������
15����������������������������������������
b���������������������������������������
, как обладающий наиболее лучшими показателями. Был поставлен эксперимент по трансдукции плазмиды pET15b фагом RB43/pET15b
в штамм �������������������������������������������������������������������������������
CR�����������������������������������������������������������������������������
204 в кишечнике мыши. Для этого вводили по 150 мкл клеток. Через 6 часов вводили 150 мкл фага с множественностью 1 в первом опыте и 100 во втором. Количество клеток
к этому моменту принимали за 105. Пробы отбирали через 2, 3, 4 часа после введения фага.
Данный экперимент показал, что в выбранных нами условиях (количество введенных
клеток и фаговых частиц, а также выбранное нами время взятия пробы) можно наблюдать
трансдукцию маркера антибиотикорезистентности плазмиды.
Таблица 1 - Результаты трансдукции маркера антибиотикорезистентности к ампицилину в лабораторный штамм E.coli в кишечнике лабораторных мышей.
Антибиотик, V
Множественность фага - 1
Множественность фага - 100
2 часа
3 часа
4 часа
2 часа
3 часа
4 часа
пробы (мл)
3
3
Кан., 01
1,7*10
4,4*10
9
14
800
141
Амп.+ Кан., 0,1
3
1
0
1
7
0
Амп.+ Кан., 0,1
96
5
1
18
138
2
Амп., 0,1
8
0
0
3
22
0
Частота этого процесса выше при множественности заражения 100. При этом больше
всего трансдуктантов высевается через 3 часа после введения фага. В то время, как при множественности заражения 1, больше всего клонов, имеющих устойчивость к двум антибиотикам,
высевается через 2 часа после введения фага. Кроме того, по результатам этого опыта видно,
что клетки штамма-реципиента сохраняют свою жизнеспособность и остаются в достаточном
количестве и через 9 часов после введения.
Исследование трансдукции плазмид в отсутствии селекции антибиотиком [7].
Бактериофагом RB43 были заражены клетки штамма E.coli C600, содержащие плазмиду
pBR322. Полученным лизатом заражали клетки этого же штамма в экспоненциальной фазе
60
Биология фагов
роста. Инфекцию проводили с множественностью 0,1. Зараженные клетки высевали на твердую среду, как содержащую антибиотик, так и без антибиотика. На среде содержащей антибиотик выросло 49 клонов, а на среде без антибиотика 168 клонов. Определение титра клеток
без заражения фагом соответствовало данным плотности культуры. Заражение фагом приводило к снижению титра примерно в 105 раз. Повтор этого опыта неоднократно приводил к
появлению клонов выживших после заражения на среде без антибиотика. Пересев данных
клонов на среду, содержащую ампицилин показал, что от 50 до 75% клонов устойчивы к ампицилину или тетрациклину, а примерно 25% - 40% клонов устойчивы к обоим антибиотикам.
Аналогичные опыты были проведены с бактериофагами RB42, RB 49 и было показано, что и
в отсутствии антибиотика можно получить отдельные клоны-трансдуктанты. Данные клоны
выростали в присутствии бактериофага на поверхности агаризованной среды и могли бы быть
просто устойчивыми к бактерифагу клонами, отобранными в таких условиях. Проверка пересеянных на новые чашки с твердой средой клонов на устойчивость к фагу показала, что из 6
проверенных все оказались чувствительны к фагу φ����������������������������������������
VZ��������������������������������������
7. Скорее всего, псевдолизогенные клоны-трансдуктанты, образующиеся на среде в присутствии фага в данных условиях проявляют
временную устойчивость к нему, а наличие этого свойства служит селективным фактором для
их отбора.
Было проведено исследование плазмидной ДНК, содержащейся в полученных трансдуктантах. Для этого были взяты клоны с исходной чашки с твердой средой без антибиотика,
на которой они были получены. Эти клоны были пересеяны также на твердую среду уже содержащую ампицилин в концентрации 50 мкг на мл. Из 18 пересеянных клонов выросло только 15. Клоны были пересеяны еще раз, при этом наблюдался лизис части посева как в начале,
так и конце «штриха» , в некоторых случаях росли только отдельные колонии. Лизис культуры
мог быть связан и с наличием внеклеточного фага в инокуляте, и с лизисом псевдолизогенов
за счет продолжения литического пути развития. После выращивания в жидкой среде из 13
клонов было проведено выделение плазмидной ДНК, оставшиеся два клона лизировались в
жидкой среде и дали очень малое количество биомассы недостаточное для выделения.
Трансдукция низкокопийных плазмид бактериофагом RB43 [7]. На втором этапе исследований, мы начали изучение трансдукции низкокопийных плазмид IncN-группы.
Был проведен ряд экспериментов на способность бактериофагов φVZ7 и φVZ4 к трансдукции
плазмид IncN-группы, на примере R15, N3, а также плазмиды RSF1010, представителя IncQгруппы несовместимости, широко используемой в качестве вектора для широкого круга бактерий-хозяев. В качестве контроля были выбраны псевдо-Т-чётные бактериофаги RB43 и RB49.
Трансдукцию плазмиды N3 проводили из штамма E. сoli С600(N3) в штамм E. сoli
СR204 и E. сoli С600. Титр фага RB43, содержащий плазмиду, на штамме-реципиенте составил
2,2х108 БОЕ/мл. При стандартных условиях трансдукции и множественности заражения – 0,1
трансдуктантов получено не было.
Трансдукцию плазмиды R15 проводили при модифицированных условиях эксперимента: увеличение концентрации реципиента в 10 раз. Трансдукцию плазмиды R15 проводили
из штамма E. сoli С600(R15) в штамм E. сoli С600. На сегодняшний день нам удалось получить
клоны, содержащие плазмиду R��������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������
15, только с помощью фага RB����������������������������
������������������������������
43. Титр фага RB43, содержащий плазмиду, на штамме-реципиенте (E. coli C600) составил 1х109 БОЕ/мл. При проведении
трансдукции бактериофагом RB43 с множественностью заражения реципиента – 0,1 и 0,004,
в ряде опытов было получено от 10 до 27 клонов, соответственно. Таким образом, частота
трансдукции плазмиды R15 бактериофагом RB43 составила 2,7х10-5 (множественность 0,004)
и 4х10-6 (множественность 0,1). При аналогичных условиях трансдукции другими бактериофагами клонов-трансдуктантов получено не было. Клоны были проанализированы на содер-
61
Биология фагов
жание плазмиды R15.
Трансдукция плазмиды RSF1010 была осуществлена из штамма E. сoli К802 в штамм
E. сoli СR204. Титр фага RB43, содержащий плазмиду, на штамме-реципиенте составил 7х107
БОЕ/мл. При стандартных условиях трансдукции и множественности заражения – 0,1 было
получено 18 клонов, таким образом, частота трансдукции составила 7,2х10 -6.
Таким образом, нами было впервые показано, что бактериофаги Т4-типа способны к
трансдукции природных низкокопийных плазмид, в том числе и такой большой – 62 тысячи
пар нуклеотидов – плазмиды ������������������������������������������������������������
IncN��������������������������������������������������������
-группы несовместимости как R15. Плазмида R15 [8] содержит в своем геноме ряд генов устойчивости к антибактериальным препаратам в составе транспозона, систему рестрикции и модификации гомологичную EcoRII и гены, ответственные за
конъюгационный перенос плазмидной ДНК,, которые эволюционно сходны с системой секреции IV типа и характерны для ряда патогенных бактерий. Все это говорит о возможном участии
горизонтального переноса генов в эволюции энтеробактерий, посредством трансдукции бактериофагами Т4-типа. Бактериофаги Т4-типа – постоянные компонены терапевтических препаратов. Наши опыты показывают возможность горизонтального переноса генов резистентности к антибиотикам и генов ответственных за патогенез с помощью трансдукции фагами этой
группы от патогенных бактерий к представителям нормальной микрофлоры кишечника. Это
говорит о необходимости осторожного подхода к их использованию в фаговой терапии.
Библиографический список
1. Wilson G.G. High-frequency generalised transduction by bacteriophage T4 / G.G.Wilson,
K.K.Y.Young, G.J.Edlin, W.J.Konigsberg // Nature. - 1979. - V. 280. - No 5717. - p. 80-82.
2. Young K.K.Y. Genetic analysis of bacteriophage T4 transducing bacteriophages /
K.K.Y.Young, G.J.Edlin, G.G.Wilson // J.Virol. - 1982. - V. 41. - No 1. - p. 345-347.
3. Young K.K.Y. Physical and genetical analysis of bacteriophage T4 generalized transduction
/ K.K.Y.Young, G.J.Edlin // Molec.Gen.Genet. - 1983. - V. 192. - p. 241-249.
4. Таняшин В.И. Трансдукция детерминант антибиотикорезистентности плазмиды
pBR322 псевдо-Т-четными бактериофагами / В.И.Таняшин, А.М. Боронин / Докл. РАН. - 1998.
- Т. 363. - № 6. - С. 849-852.
5. Таняшин В.И. Котрансдукция плазмид системы pET мутантами бактериофагов T4 и
RB43 / В.И.Таняшин, А.А.Зимин, А.М.Боронин // Микробиология. - 2003. - Т. 72. - №6. - С.785791.
6. Таняшин В.И. Трансдукция детерминант антибиотикорезистентности плазмид
псевдо-Т-четными бактериофагами / В.И.Таняшин, А.А.Зимин, М.Г.Шляпников, А.М. Боронин // Генетика. - 2003. - Т.39. - №7. - С. 914-926
7. Зимин А.А. Исследование трансдукции плазмид бактериофагами Т4-типа: трансдукция в природных условиях, выделение новых трансдуцирующих бактериофагов, изучение
трансдукции плазмид в отсутствии селекции антибиотиком и трансдукция низкокопийных
плазмид / Зимин А.А., Васильева Е.Л., Васильева Е.А., Фишман К.С., Сузина Н.Е. // Бюллетень
Московского общества испытателей природы. 2009. - отдел биологический. - том 114. - выпуск
3. - приложение 1. - часть 1. - C. 330-337.
8. Добрица А.П.Сравнительный анализ структуры плазмид N,P и W групп несовместимости / А.П.Добрица, Л.В.Дергунова, Т.Г.Михайлова, А.А. Зимин // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, - 1987. - №12, - C.3-10,
62
Биология фагов
THE PLASMID TRANSDUCTION BY T4-TYPE BACTERIOPHAGES
Zimin A.A.
(REVIEW)
Keywords: T4-type bacteriophages, horizontal transfer of genetic information, phage
transduction
To study plasmid transduction by bacteriophage T4-type following experiments were
conducted. We investigated transduction in nature - in the intestines of laboratory animal - mice.
It was investigated the transduction of plasmids in the absence of antibiotic selection and studied
transduction of low copy number plasmids.
УДК 619:616.9
О СПЕЦИФИЧНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ HAFNIA ALVEI
Золотухин Д. С.*, аспирант, тел. 8(8422)559547
Васильев Д. А. *, доктор биологических наук, профессор, тел. 8(8422)559547
Золотухин С. Н. *, доктор биологических наук, профессор
тел. 8(927)2703480, fvm.zol@yandex.ru
Семенов А. М., доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, тел.
(495) 939-27-76
Летаров А.В., кандидат биологических наук, зав. лабораторией вирусов
микроорганизмов, тел.: (499) 135-21-39, Факс: (499) 135-65-30,
E-Mail: inmi@inmi.host.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
**ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова»
***ФГБУН «Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН»
Ключевые слова: бактериофаги, �������
Hafnia� alvei������������������������������������
�����������������������������������������
, гафниоз пчел, изоляты фагов, специфичность.
Определена специфичность бактериофагов Hafnia alvei, выделенных из сточных вод
животноводческих ферм и мясокомбинат.
Актуальность исследования.
Энтеробактерии рода Hafnia с единственным видом Hafnia alvei – грамотрицательные
микроорганизмы не образующие спор и капсул, хемоорганотрофы, факультативные анаэробы.
Hafnia alvei получила своё название от латинского существительного alveus, что означает улей.
Имя рода Hafnia является историческим именем (Havn) для города Копенгагена, Дания.
Эти бактерии хорошо растут на простых питательных средах при 22—37°C, рН 7,2—
7,4. На средах для энтеробактерий (Эндо, Левина) образуют бесцветные колонии S-типа, напоминающие колонии шигелл. На среде Плоскирева растут скудно, на висмут-сульфит-агаре
не растут. Могут использовать цитрат и ацетат в качестве единственного источника углерода.
Ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа; кислоты — маннит, арабинозу, рамнозу, трегалозу, ксилозу. Не ферментируют лактозу, инозит, дульцит, желатину, мочевину, не
63
Биология фагов
образуют сероводород и индол, пробы на лизин- и орнитиндекарбоксилазу положительные.
При 22 °C подвижны, дают положительную реакцию ФП, отрицательную — с МР, при 37 °C
часто неподвижны, проба с МР положительна, с ФП отрицательна. Hafnia alvei по различиям в
специфичности О-Аг дифференцируют на 29 серогрупп, Н-Аг — на 49 сероваров (С.Н. Золотухин, 2004). Наиболее полное изучение антигенной структуры и антигенных связей гафний
было проведено японскими исследователями, установившими 68 серологических О- групп и
34 - Н-антигена, образующих 192 серовара. В России наиболее распространены бактерии серогрупп 04, 06, 037 [1].
Широко распространены в природе, обитают во внешней среде (почва, вода, пищевые
продукты). По данным разных авторов патогенные штаммы этих микроорганизмов способны
вызывать кишечные инфекции у людей и животных, уроинфекции, пневмонии и даже сепсис
[3,4,5,6] в ветеринарии существует самостоятельная нозологическая единица – гафниоз пчел
[7]. В настоящее время на вооружении ветеринарных и медицинских специалистов отсутствуют специфические средства диагностики, лечения и профилактики заболеваний, вызываемых
этими микроорганизмами. Такими средствами могли бы быть препараты на основе бактериофагов [10].
Нами было выделены и селекционированы бактериофаги, активные в отношении патогенных штаммов ����������������������������������������������������������������������
Hafnia����������������������������������������������������������������
alvei����������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������
, изолированных от больных животных и людей. Одним из ключевых свойств бактериофагов, определяющих их диагностическую и лечебно-профилактическую ценность, является специфичность.
Целью исследований было изучение специфичности селекционированных нами бактериофагов.
Материалы и методы
Специфичность определяли методом «стекающая капля» на МПА, засеянном гетериологичными культурами микроорганизмов [2]. Для этого на поверхность МПА в чашках Петри
пастеровской пипеткой наносили 3-4 капли 18-ти часовой бульонной культуры исследуемых
микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут. На поверхность засеянной
среды пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили фаг и наклоняли, чтобы капли стекли, а затем инкубировали при температуре 37°С, оценку результатов проводили
через 18-20 часов.
Контролем служили чашки, засеянные гомологичными культурами (положительный
контроль) и чашки с питательной средой, засеянные испытуемыми культурами, куда наносили вместо фага стерильный питательны бульон (отрицательный контроль). В качестве гетерологичных культур использовали бактерии родов Morganella, Klebsiella, Proteus, Enterobacter,
Citrobacter, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus, Streptococcus, Listeria, видов E.
coli, Y. pseudotuberculosis.
Результаты и выводы исследования
В результате нами было изучено 4 изолята фагов, лизирующих бактерии вида Hafnia
alvei.
Результаты изучения специфичности селекционированных гафниозных бактериофагов отражены в таблице 1.
64
12
0
0
0
0
10
0
0
0
0
14
0
0
0
0
8
0
0
0
0
2
0
0
0
0
18
0
0
0
0
3
0
0
0
0
18
0
0
0
0
Listeria spp
Streptococcus spp
Bacillus spp
Staphylococcus spp
5
0
0
0
0
Pseudomonas spp
7
0
0
0
0
Y. pseudotuberculosis
Salmonella spp
Enterobacter spp
Klebsiella spp
Proteus spp
Morganella spp
21
0
0
0
0
Y. enterocolitica
18
0
0
0
0
Citrobacter spp
Haf-1
Haf-2
Haf-3
Haf-4
Таблица 1 - Cпецифичность гафниозных бактериофагов
Название рода (вида) микроорганизмов
Количество исследуемых штаммов из них чувствительных к фагу
E. coli
Название фага серии
УГСХА
Биология фагов
14
0
0
0
0
2
0
0
0
0
Таким образом, все четыре изолята селекционированных нами гафниозных бактериофага имеют строгую видовую специфичность (не лизирует микроорганизмы других родов и
семейств).
Библиографический список
1. Бессарабов Б. Ф., Вашутин А. А., Воронин Е. С. и др.; Под ред. Сидорчука А. А.
Инфекционные болезни животных. — М.: Колос, 2007. – С. 525-527.
2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии.��������
–������
�������
Улья�����
новск, 1988.
3. Жумагельдина З.Т. Клинико-эпидемиологические особенности гафниоза человека.
- Алма-Ата, 2009. - С. 4, 7, 13, 37-40, 45, 57, 58-64.
4. Золотухин Д.С., Васильев Д.А. Характеристика энтеробактерий рода Hafnia. – Ульяновск, 2011, -с. 73-75.
5. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных.
Монография. - Ульяновск, 2004, 152 С.
6. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят
и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. – Ульяновск, 2005. -108 С..
7. Новиков В. Б. Пчёлы, цветы и здоровье//Пчеловодство. – 2005. - №1. – С. 12-15.
8. Тарасова А.В., Феоктистова Н.А. Бактерии рода �������������������������������
Hafnia�������������������������
– возбудители инфекционной болезни пчёл. - ФГОУ ВПО «Ульяновская ГСХА», 2007. – С. 172-174.
9. Характеистика биологических свойств бактериофагов вида Bacillus subtilis / Д.А.
Васильев [и др.] // Вестник УГСХА. – 2011. - №1(13) – С. 79-84
10. Чанишвили Т.Г., Чанишвили Н.А. Научные и методологические основы практического применения бактериофагов// Перспективы использования препаратов бактериофага для
превенции и лечения инфекции, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами: матер. междунар. семинара. – Тбилиси, 2005. – С. 9-10.
THE ISOLATION, SELECTION AND OBSERVATION OF BIOLOGICAL
CHARACTERISTICS OF HAFNIA ALVEI BACTERIOPHAGES
Zolotukhin D.S., Vasiliev D.A., Zolotukhin S.N.,
65
Биология фагов
Semenov A.M., Letarov A.V.
Keywords: enterobacteria, bacteriophages, Hafnia alvei, gafnioz of bee, selection of strains,
isolates of phages, lytic activity, specificity, range of lytic activity.
Hafnia alvei bacteriophages were isolated from sewage of livestock farms and slaughterhouses. We selected 3 strains of specific phages having consistently high-lytic activity, a wide range
of lytic activity and the strict species specificity.
УДК 619:616-07
ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЙ МЕТОД АНАЛИЗА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ФАГ-БАКТЕРИЯ
Игнатов С.Г., доктор биологических наук, тел. 8(4967)36-07-73, ignatov@
obolensk.org
Денисенко Е.А., 8(4967)36-07-73, EgorD1988@gmail.com
Веревкин В.В., кандидат биологических наук,
8(4967)36-07-73, info@obolensk.org
Волошин А.Г., кандидат биологических наук,
8(4967)36-07-73, voloshinag@mail.ru
ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
Ключевые слова: Бактериофаги, электрооптика, идентификация микроорганизмов
Работа посвящена изучения взаимодействия фаг-бактерия с помощью электрооптического метода. Электрооптический метод анализа, основанный на исследовании клеток как
электрофизических объектов со слоистой структурой и измерении поляризационных характеристик клеточных структур, представляет собой новый подход к оценке прижизненных
физиологических параметров клеток и их гетерогенности. Выявлены электрооптические изменения микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при анализе взаимодействия бактерий с фагами.
Введение. Широкое использование бактериофагов как инструмента в молекулярной
биологии, а также их успешное применение в медицине и ветеринарии, биотехнологии и пищевой промышленности требует развития современных методов анализа взаимодействия фагбактерия для более успешного понимания и реализации уникальных способностей фагов. С
этой точки зрения, весьма привлекательным видится применение электрооптического метода
анализа. В основе электрооптического анализа лежит эффект Керра [1]. Суть эффекта состоит
в изменении оптических свойств суспензии, в частности суспензии клеток, при воздействии
на нее электрического поля. Воздействие электрического поля на суспензию клеток вызывает
появление на суспендированных клетках индуцированных зарядов. Их распределение и величина определяются действующим механизмом поляризуемости [2]. В зависимости от частоты
электрического поля и электрических свойств клеток, направление преобладающей ориентации клеток может совпадать с направлением вектора электрического поля или быть ортогональным ему. Ориентация клеток длинной осью вдоль светового потока будет приводить к
66
Биология фагов
увеличению сечения рассеяния и уменьшению интенсивности светового потока. Этот метод
измерений является прижизненным, он не использует дополнительных меток и не вызывает
изменений в исследуемом объекте. Преимуществом данного метода является то, что влияние
среды на точность измерения поляризационных параметров является незначительным и предсказуемым. Воздействие на бактериальные клетки измерительной процедуры также незначительно, и при этом микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. В данной работе
было изучено взаимодействие бактериофагов с бактериальными клетками с помощью электрооптического метода.
Материалы и методы исследований. ������������������������������������������
Бактериальные к���������������������������
ультуры получены из коллекции Государственного Научного Центра Прикладной Микробиологии и Биотехнологии (ГНЦ
ПМБ). Лизирующие фаги А157 и 39 для клеток E. coli и S. enteriditis были любезно предоставлены отделом ГНЦ ПМБ Светоча Э.А.. Рост бактерий осуществляли в жидкой среде – L-бульон
(10 г триптона; 5 г дрожжевого экстракта; 5 г хлористого натрия; дистиллированная вода – до 1
л) или на поверхности плотной среды – L-агар (L-бульон с добавлением 18 г сухого агара на 1 л
среды). Для получения инокулята из отдельных колоний чистых суточных культур микроорганизмов, выросших на плотной питательной среде (LB-агар), небольшое количество материала
с помощью петли переносили в пробирки с жидкой питательной средой. В качестве жидкой
среды использовали LB-бульон. Культуру бактерий выращивали на качалке при температуре
37°С и 190 об/мин до плотности 0.6 (длина волны 600 нм, кювета 1 см). Обычно рост осуществляли в течение 20 час, после чего пробирки снимали с качалки и культуру трижды отмывали в
физиологическом растворе. Из осадка готовили суспензию клеток с концентрацией 109 кл/мл.
Измерения проводили при длине волны света 670 нм. Использовали дискретный набор частот
ориентирующего электрического поля: 10, 100, 250 и 500 кГц. Электрооптические измерения
выполняли на приборе ЭАК (электрооптический анализатор клеток), который обеспечивает
непрерывное выполнение четырех базовых операций с минимальным периодом 6 мин. Перед
проведением анализа клетки отмывали 20% фосфатным буфером трехкратным центрифугированием при 2800×g в течение 5 мин, затем ресуспендировали в небольшом количестве деионизованной воды. Для устранения конгломератов суспензию клеток вновь центрифугировали
при 1100´g в течение 1 мин и использовали суспензию, оставшуюся в надосадочной жидкости.
Ориентационный спектр (ЧДАП - частотная дисперсия анизотропии поляризуемости) представляли в виде частотной зависимости разности значений оптической плотности суспензий
d������������������������������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������������������
D����������������������������������������������������������������������������������
, измеренных при распространении пучка неполяризованного света вдоль и поперек направления ориентирующего поля. Эта разность была нормирована на значение оптической
плотности при хаотической ориентации клеток. Есть основания допустить, что общий вид
ориентационного спектра при подобранных экспериментальных условиях (длина волны света,
амплитуда напряженности ориентирующего электрического поля и др.) определяется, главным образом, частотной зависимостью анизотропии поляризуемости клеток [3].
Результаты исследований и их обсуждение. Была изучена возможность использования электрооптического метода для идентификации микроорганизмов путем анализа специфического взаимодействия микробных клеток с бактериофагом. На рис. 1 представлены ЧДАП
контрольной суспензии бактерий E. coli и ЧДАП тех же бактерий после 30-минутной инкубации с фагом V18/А157.
67
Биология фагов
E.c.контроль
от. ед
400,00
350,00
E.c./V18
300,00
250,00
200,00
150,00
100,00
50,00
kHz
0,00
1
10
100
1000
10000
100000
Рис. 1. - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток E. coli 057
c фагом V18/A157
На рис. 2 показаны ЧДАП контрольной суспензии S. enteriditis и суспензии тех же
бактерий после 30-минутной инкубации с фагом 39. Здесь же представлена ЧДАП суспензии
бактерий S. enteriditis после 30-минутной инкубации с фагом V18/А157 – специфичных для
E. coli, но, очевидно, не взаимодействующих с бактериями S. enteriditis. Полученные данные
подтверждают идею о возможности использования использования электрооптического анализатора для идентификации микроорганизмов с использованием специфических фагов.
S.e.контроль
от. ед.
400,00
350,00
S.e./39
S.e./V18
300,00
250,00
200,00
150,00
100,00
50,00
kHz
0,00
1
10
100
1000
10000
100000
Рис. 2. - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток S�����������
. enteridi���������
tis c фагами V18/A157 и 39
Заключение. Проведенные электрооптические исследования показали возможность
идентификации микроорганизмов при анализе взаимодействия бактерий с фагами.
68
Биология фагов
Библиографический список
1. Castro-Chacón J.H., Khomenko A.V., Rangel-Rojo R. Phase matched vectorial threewave mixing in isotropic Kerr media.// Optic. Communcat., 2009, V. 282, N. 7, P. 1422-1426
2. Stoylov S.P., Gyurova A., Georgieva R., Danova S. Do bacteria have an electric permanent
dipole moment? //Colloids and Surfaces B, 2008, V. 64, N. 2, P. 255-259.
3. Bunin V. D., Voloshin A. G. Determination of cell structures, electrophysical parameters
and cell population heterogeneity. // J. of Colloid and Interface Sci.-1996.-V.180.-P. 122-126.
ELRCTROOPTICAL STUDY OG PHAGE-BACTERIA INTERACTION
Ignatov S.G., Denisenko E.A., Verevkin V.V., Voloshin A.G.
Key words: bacteriophages, electrooptic, identification of bacteria
The electrooptical studies have been used to analyze phage-bacteria interaction. The
possibility of electrooptical measurements for identification of bacteria has been investigated.
УДК 579.61
ПОИСК ЛИЗОГЕННЫХ ШТАММОВ ВАГИНАЛЬНЫХ ЛАКТОБАЦИЛЛ
Исаева А.С. *, Летаров А. В. *, Ильина Е.Н.**,
Муравьёва В.В. ***, Анкирская А.С. ***
* ФГБУН Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, Москва,
letarov@gmail.com, isaeva_alina@list.ru
** ФГУ НИИ Физико-химической медицины, Москва
*** ФГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии
им.академика В.И.Кулакова Минздравсоцразвития России, Москва
Ключевый слова: Лактобактерии, бактериофаги, MALDI-TOF масс-спектрометрия,
митомициновая индукция профагов
В результате проведенных исследований удалось показать высокую степень видовой
и внутривидовой гомогенности индивидуальных популяций влагалищных лактобацилл. Кроме того с помощью ПЦР-системы были обнаружены лизогенные изоляты лактобактерий.
Детекция свободной фаговой частицы после митомициновой индукции лизогенных культур
может говорить в пользу гипотезы о роли фаговой инфекции в развитии бактериального
вагиноза.
Введение
С момента первого описания в 1892г. А. Дедерлейном лактобактерий как преобладающего микроба нормального влагалищного биоценоза [1], их значимость в поддержании колонизационной резистентности женской мочеполовой системы и до настоящего времени остается неоспоримой. Известно также, что первыми признаками вагинальных дисбиотических нарушений является снижение концентрации лактофлоры или потеря ею биологических свойств.
69
Биология фагов
Существуют различные факторы, способные отрицательно влиять на лактобацилл.
Исследование возможных причин возникновения бактериального вагиноза, состояния, характеризующегося значительным снижением численности лактофлоры или полной ее элиминацией, привело к появлению гипотезы о роли фагов в развитии симптомов данного дисбиоза [2].
Виды и штаммы вагинальных лактобацилл варьируют у различных индивидуумов [3]. Плотность колонизации довольно высока, и составляет около 106 – 107 КОЕ на вагинальный мазок.
Таким образом, можно предположить, что это сообщество может подвергаться массовому лизису бактериофагами. Попадание лизогенного штамма в популяцию с высокой плотностью,
представленную штаммами чувствительными к внесенному в среду фагу, может действительно привести к сокращению популяции из-за фагового лизиса резидентной флоры. В этот момент свободная ниша может быть заселена строгими анаэробами (Prevotella/Porphyromonas
spp., Peptostreptococcus spp., Fusobacteium spp., Mobiluncus spp.) и гарднереллой.
Результаты исследования Kilic et al.[4], показали преобладание лизогенных штаммов
лактобацилл в образцах, отобранных у группы пациенток, выделенные фаги оказались вирулентными для изолятов лактобацилл полученных от тех же или других женщин. Однако позже
Martin����������������������������������������������������������������������������������
et�������������������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������������������
al����������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������������
. [5] не обнаружили в своей коллекции лактобактерий лизогенных штаммов, способных высвобождать жизнеспособные фаговые частицы.
Частота лизогенизации клеток хозяина умеренными фагами, как правило, не велика
-7
(10 – 10-2) [6, 7], таким образом, размножение этих вирусов в экологической нише, плотно
заселённой чувствительным штаммом хозяина происходит главным образом по литическому
пути, что приводит к гибели большинства клеток, которые потом могут быть замещены потомками клеток лизогенного штамма, исходно высвободившего фаг, а также вновь образованными
лизогенными бактериями, либо, при менее благоприятном стечении обстоятельств, другими
видами бактерий. Такой сценарий был смоделирован математически и экспериментально [7]
на модели популяций E. coli. Принимая во внимание, что частота спонтанной индукции многих лизогенных штаммов вагинальных лактобацилл составляет менее чем 10-8 БОЕ на клетку
[4] в лабораторных культурах, любой фактор, способствующий повышению частоты индукции, может увеличивать вероятность «экологической катастрофы» в вагинальном микробном
сообществе. Это может объяснить существующую эпидемиологическую связь между курением и риском бактериального вагиноза [2], так как компоненты табачного дыма могут вызывать
индукцию профагов у лактобацилл [8]. Однако вышеописанный механизм нарушения сообщества вагинальных лактобацилл может работать только при условии, что индивидуальные популяции этих бактерий достаточно гомогенны и составлены одним, максимум двумя доминирующими штаммами. В противном случае маловероятно одновременное попадание в систему
фагов, способных лизировать все основные компоненты лактобактериального сообщества, а,
следовательно, существенного снижения общей численности не произойдёт. Поэтому для верификации гипотезы фаговой этиологии (по меньшей мере, части случаев) бактериального
вагиноза необходимо получить данные о степени гетерогенности индивидуальных популяций
лактобацилл.
Материалы и методы
Клинические образцы лактобактерий отбирались в поликлинике при Федеральном государственном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени
академика В.И.Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи». Идентификацию лактобацилл проводили методом MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Для записи, обработки и анализа масс-спектров использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия): FlexControl 3.0 и Biotyper 2.0. Дифференциацию лактобацилл
осуществляли методом REP-ПЦР. ДНК из клеток лактобацилл выделялась с помощью набора
70
Биология фагов
ДНК-Экспресс (Литех, Россия) в соответствии с инструкцией. �����������������������������
Rep��������������������������
-ПЦР проводилась, как описано в работе May��������������������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������
et�����������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������
al��������������������������������������������������������������������
. [3]. Секвенирование гена 16���������������������������������������
S��������������������������������������
лактобацилл проводилось с использованием набора для секвенирования BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и секвенатора
3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA) согласно инструкциям производителя.
Поиск изолятов, содержащих профаг, проводился с помощью ПЦР - системы. Изоляты положительные на наличие интегразы, подвергали митомициновой индукции [9]. Наличие свободных фаговых частиц в индуцированной культуре детектировали с помощью ПЦРсистемы [10].
Результаты и обсуждение
Для того чтобы изучить видовой состав индивидуальных популяций лактобацилл
влагалища человека, были получены клинические образцы от 44 пациенток с разной формой
микроценоза влагалища. За время исследований удалось сформировать довольно богатую коллекцию изолятов лактобацилл, включающую в себя 897 изолятов, представленных 11 видами.
Следует отметить, что среди 44 пациенток, от которых были получены и идентифицированы лактобациллы, у 43 лактофлора была представлена одним или двумя (в 6-ти случаях) видами. И только у одной разнообразие лактобацилл доходило до 3-х видов. С помощью
REP-ПЦР удалось установить и относительную штаммовую гомогенность индивидуальных
популяций лактобацилл. При таких условиях фаговая инфекция может действительно явиться
причиной снижения численности лактофлоры. Однако, при предварительном анализе выборки
изолятов, в количестве 45, из сформированной коллекции на способность выделять фаги, инфекционные в отношении этих же наборов культур при индукции митомицином С, лизогенных
штаммов не было обнаружено, что находится в противоречии с ранее опубликованными данными [4] . Вероятно, изоляты этой выборки не содержали профагов, поэтому, для полноценной
проверки гипотезы о фаговой этиологии части случаев вагиноза нами была проведена дополнительная работа, а именно, поиск изолятов, содержащих профаг, с помощью ПЦР-системы.
Нами были созданы пары праймеров, отжигающиеся на участки ДНК гена интегразы, белка,
ответственного за встраивание ДНК фага в геном бактерии-хозяина. Для этого мы использовали геномы, известных на данный момент, лактофагов kc5a и phiadh. При анализе выборки
изолятов L.gasseri, мы обнаружили наличие участка этого гена требуемой длины у некоторых
из них (рис.1 дорожки 5, 6, 7, 8), что было подтверждено секвенированием выделенных фрагментов из геля.
Рис. 1 - Фрагменты гена интегразы фага phiadh. Маркер - 1kb DNA ladder
(Fermentas).
Для того чтобы детектировать наличие свободных фаговых частиц после индукции,
нами были синтезированы праймеры, отжигающиеся вблизи концов генома профага. При эксцизии профага вирусная ДНК замыкается в кольцо и при упаковке в вирионы раскрывается по
другому сайту, поэтому на матрице ДНК из свободных вирусных частиц, мы получим ПЦРпродукт известной длины (Рис.2).
71
Биология фагов
Нами был обнаружен один изолят, из которого после
митомициновой индукции выделяются свободные фаговые
частицы. Однако пока остается неизвестным, способны ли
данные частицы инфицировать какие-либо изоляты лактобацилл. Данная ПЦР-система поможет нам отобрать лизогенные культуры, с целью выделения фагов и изучения их
инфекционности по отношению к коллекции клинических
изолятов лактобацилл.
Заключение
Очевидная гомогенность индивидуальных популяций лактобацилл показывает, что популяция не подвергается
постоянному воздействию штамм специфичных селективных факторов, зависящих от плотности популяции (таких,
Рис. 2. - Обнаружекак фаговая инфекция). В то же время, существование попуние свободных вирусных чаляции с относительно высокой плотностью делает возможстиц в одном из лизатов (доным редкие явления массового фагового лизиса, что было
рожка №2), полученных в
предложено Blackwell [2] в качестве одного из триггерных
результате индукции профамеханизмов при развитии бактериального вагиноза. Такое
гов митомицином. Маркер событие может произойти в результате попадания лизоген1kb DNA ladder (Fermentas).
ного штамма, высвобождающего фага, активного против резидентной популяции. Тем не менее, низкий (если он есть)
уровень внутривидового разнообразия является просто фактором, способствующим вмешательству фагов в развитие вагиноза. Детальное исследование временной динамики штаммов
лактобацилл во влагалище и феномена лизогении у этих культур также может дать ключ к проверке этой гипотезы.
Библиографический список
1. Анкирская А.С., Муравьёва В.В. Лабораторная диагностика оппортунистических
инфекций влагалища // Consilium medicum, 2005, Т. 7. № 3, с. 206-210.
2. Blackwell A.L. Vaginal bacterial phaginosis?// Sexually Transmitted Infections,1999, 75,
352-353.
3. Antonio May A. D., Hillier S. L. DNA Fingerprinting of Lactobacillus crispatus Strain
CTV-05 by Repetitive Element Sequence-Based PCR Analysis in a Pilot Study of Vaginal Colonization//Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41(5), 1881–1887.
4. Kiliç A. O, Pavlova S. I., Alpay S.,Kiliç S. S.,Tao L. Comparative Study of Vaginal Lactobacillus Phages Isolated from Women in the United States and Turkey: Prevalence, Morphology, Host
Range, and DNA Homology// Clinical and diagnostic laboratory immunology, 2001, 31-39.
5. Martin R., Soberon N., Escobedo S., Suarez J.E. Bacteriophage induction versus vaginal
homeostasis: role of H2O2 in the selection of Lactobacillus defective prophages// International Microbiology, 2009, 12(2),131-6.
6. Riipinen, K.A., Raisanen, L. and Alatossava, T. Integration of the group c phage JCL1032
of Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis and complex phage resistance of the host//Journal of Applied Microbiology, 2007, 103, 2465–2475.
7. Brown S.P., Chat L., Paepe M. and Taddel F. Ecology of microbial invasions: Amplification allows virus carriers to invade more rapidly when rare// Current Biology, 2006, 16, 2048-2052.
8. Pavlova S.I., Kilic A.O., Mou S.M., Tao Lin. Phage infection in vaginal lactobacilli: An in
vitro study//Infectious diseases in obstetrics and gynecology, 1997, 5, 36-44.
72
Биология фагов
9. Raya R., Kleeman E. G., Luchansky J. B and Klaenhammer T. R. Characterization of the
Temperate Bacteriophage fadh and Plasmid Transduction in Lactobacillus acidophilus ADHt // Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55, 9, 2206-2213
10. Ventura M., Canchaya C., Bernini V., Altermann E., Barrangou R.,McGrath S., Claesson M. J., Li Y., Leahy S., Walker C.D., Zink R., Neviani E.,Steele J., Broadbent J., Klaenhammer T.
R.,Fitzgerald G.F., O’Toole P.W. and Sinderen D. Comparative genomics and transcriptional analysis
of prophages identified in the genomes of Lactobacillus gasseri, Lactobacillus salivarius, and Lactobacillus casei// Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72, 5, 3130–3146.
SEARCH FOR LYSOGENY AMONG VAGINAL LACTOBACILLI ISOLATES
Isaeva A. S., Letarov A.V., Ilina E.N., Muravieva V. V., Ankirskaya A.S.
Key words: Lactobacilli, bacteriophages, MALDI-TOF mass-spectrometry, induction of
prophages.
Lactobacilli are the dominant bacteria of healthy womens’ vagina. These bacteria can inhibit the growth of other potentially harmful microorganisms. However, during bacterial vaginosis,
lactobacilli decrease for unknown reason. Phages are the natural inhibitors of bacteria. They can
infect vaginal lactobacilli, that induce the reduction of lactobacilli, though, no attempts to detect free
bacteriophages in vaginal swab gave positive results. Instead of this, the lysogenic strains of lactobacilli were found in human vagina.
УДК 619:616 -07
ПОДБОР И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ
ПАРАМЕТРОВ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ АНАЭРОБНЫХ
БАКТЕРИЙ DESULFOVIBRIO DESULFURICANS
Карамышева Н. Н., ассистент
8(8422)55-95-47, Natali – kar@inbox.ru
Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор
8(8422)55-95-47, dav ul@mail.ru
Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор
8(8422)55-95-47, fvm.zol@yandex.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
тры.
Ключевые слова: Desulfovibrio desulfuricans, биопрепарат, технологические параме-
Работа посвящена подбору и усовершенствованию технологических параметров выделения бактериофагов анаэробных бактерий Desulfovibrio desulfuricans.
Введение
Исследование биотехнологических процессов с участием D. desulfuricans приобретает большое значение в связи с развитием и усовершенствованием методов регулирования их
жизнедеятельности.
Материалы и методы исследований
73
Биология фагов
Штамм Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans (Beijerinck 1895) Kluyver et van
Niel 1936 VKM B-1799 полученный из музея ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН Московская обл.,
г. Пущино, а также 9 штаммов бактерий, выделенных из объектов окружающей среды, типирование которых позволило отнести их к роду Desulfovibrio, бактериофаги Ddr 57 – УГСХА и
Ddu 48 – УГСХА.
Работа выполнена на базе научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии УГСХА.
Результаты исследований и их обсуждение
Результаты исследования температурных показателей культивирования бактериофагов Ddr 57 – УГСХА и Ddu 48 – УГСХА показали, что диапазон оптимальных температур
культивирования фага ������������������������������������������������������������������
Ddr���������������������������������������������������������������
57 – УГСХА составляет 30-36 º���������������������������������
C��������������������������������
. Наиболее оптимален режим инкубирования системы фага Ddr 57 – УГСХА с D. desulfuricans VKM B – 1799 при температуре 3032 °С. Режим инкубирования системы фага Ddu 48 – УГСХА с D. desulfuricans VKM B –1799
при температуре 30 ºС. Данные представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Температурные показатели культивирования бактериофагов Ddr 57
– УГСХА и Ddu 48 – УГСХА
Температура культивирования фага
фаг
22,0 ºC 22,2 ºC 22,4 ºC 22,6 ºC 22,8 ºC 33,0 ºC 32,0 ºС 34,0 ºС 36, ºС
Ddr 57--УГСХА
–
–
–
–
–
+
+
–
–
Ddu 48 -УГСХА
–
–
–
–
–
+
–
–
–
Примечание – «–» – отсутствие лизиса, «+»– наличие лизис.
При исследовании условий культивирования выделенного бактериофага ������������
Ddr���������
57 – УГСХА D. desulfuricans VKM������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������
B����������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������
– 1799 необходимо выяснить оптимальное количественное соотношение фага и индикаторной культуры D. desulfuricans VKM B – 1799 для производства
диагностического препарата. В опытную пробирку, содержащую стерильную среду Постгейта
«В» в объеме 4,5 мл (рН 7,2), вносили 0,2 мл фага Ddr 57 – УГСХА, затем в пробирку вносили
24-х часовую культуру штамма D. desulfuricans VKM B – 1799 в количестве от 0,2 до 1 мл с
шагом 0,2 мл. Параллельно ставился контроль. Для этого в пробирку, содержащую стерильную
среду Постгейта «В» в объеме 4,5 мл (рН 7,2), вносили культуру штамма D. desulfuricans VKM
B – 1799 по 0,2 мл. Пробирки помещали в термостат и культвировали при температуре 30 ºC.
Затем подсчитывали количество активных корпускул фага в 1 мл по методу Грациа. Результаты
исследований приведены в таблице 2.
Таблица 2 – Зависимость титра бактериофага от соотношения с количеством суточной бактериальной культуры.
Объём культуры, мл на 0,2 мл фага
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Количество активных корпускул фага Ddr 578х108 6х107 3х107 2х107
–
УГСХА в 1 мл
Количество активных корпускул фага Ddu 489х107 8х106 4х106 3х105
–
УГСХА в 1 мл
В результате проведенных исследований было установлено, что для бактериофага Ddr
57 – УГСХА оптимальным соотношением бактериофага и культуры является 1:1, т.е. 0,2 мл
фага х 0,2 мл индикаторной культуры.
Для выяснения оптимального соотношения между временем пассажа
74
Биология фагов
и активностью фага в пробирку с 4,5 мл среды Постгейта «В» добавляли 0,2 мл индикаторной
культуры штамма D. desulfuricans VKM B – 1799 и 0,2 мл фага Ddr 57 – УГСХА. Параллельно
ставили контроль: среда Постгейта «В», засеянная индикаторной культурой без фага. Посевы
инкубировали при температуре 30 оС в течение 12, 24, 36, 48 часов. После культивирования
пробирки с фагом обрабатывали хлороформом в соотношении 1:10. Литическую активность
полученных фаголизатов исследовали методами Аппельмана и Грациа (Таблица 3).
Таблица 3 – Зависимость титра фага от времени пассажа
Вариант
Литическая активность
Время пассажа,
по методу
по методу
Название фага
эксперимента с
часы
Аппельмана
Грациа
фагом
1
12
0
0
2
24
10-8
8 х 10-7
Ddr
57-УГСХА
3
36
10-8
5 х 10-7
-8
4
48
10
3 х 10-7
1
12
0
0
2
24
10-9
7 х 10-8
Ddu
48-УГСХА
3
36
10-9
4 х 10-8
-9
4
48
10
1 х 10-8
Установлено, что оптимальное время пассажа при температуре 30 оС для фага Ddr 57
– УГСХА составляет 24 часа. Литическая активность фага составляет 10-8 по методу Аппельмана и 8х10-7 по методу Грациа. оптимальное время пассажа при температуре 30оС для фага
Ddu 48 – УГСХА составляет 24 часа. Литическая активность фага составляет 10-9 по методу
Аппельмана и 7х10-8 по методу Грациа.
Заключение
1. Проведённые исследования подбора оптимальных параметров показали, что диапазон оптимальных температур культивирования бактериофагов Ddr 57 – УГСХА и Ddu 48
– УГСХА составляет 30-36 ºC.
2. Наиболее оптимальным соотношением бактериофага и культуры является 1:1, т.е.
0,2 мл фага х 0,2 мл индикаторной культуры.
3. Оптимальное время пассажа при температуре 30 оС для фага Ddr 57 – УГСХА и Ddu
48 – УГСХА составляет 24 часа. Литическая активность фагов составляет 10-8 и 10-9 по методу
Аппельмана; 8х10-7 и 7х10-8 по методу Грациа.
Библиографический список
1. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов. Основы бактериофагии/
И.М.Габрилович // Минск. 1973. – 56 с.
2. Kamimura K. Isolation and Characterization of a Bacteriophage Lytic for Desulfovibrio
salexigens, a Salt-Requiring, Sulfate-Reducing Bacterium/ K.Kamimura and M.Araki //Appl. Envirion. Microbiol. 1989. – Р. 645.
3. Oberhoter T.R. J.Clin Microbiol / T.R. Oberhoter // Microbiol.2008. V.7. Р. – 312 – 313.
75
Биология фагов
SELECTION AND IMPROVEMENT OF TECHNOLOGICAL PARAMETERS
OF ALLOCATION OF BACTERIOPHAGES OF ANAEROBIC BACTERIA
DESULFOVIBRIO DESULFURICANS
Каramysheva N.N. , Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.
Кey words: Desulfovibrio desulfuricans, biopreparation, technological parameters.
The work is devoted to the selection and improvement of the technological parameters of
allocation of bacteriophages of anaerobic bacteria Desulfovibrio desulfuricans.
УДК 616.316.5-002-053.2:616.8
ЛЕКТИН-ГЛИКОКОНЪЮГАТНЫЕ ОТНОШЕНИЯ В СИСТЕМАХ
«БАКТЕРИОФАГИ - БАКТЕРИИ»
Лахтин В.М., доктор биологических наук
Тел. 8(903)503-11-80, lakhtinv@yandex.ru
Алешкин А.В., доктор биологических наук
Тел. 8(964)646-43-79, ava@gabri.ru
Лахтин М.В., кандидат биологических наук
Тел. (007-495)452-18-16, info@gabrich.com
Афанасьев С.С., доктор биологических наук, профессор,
заслуженный деятель науки РФ
Алешкин В.А., доктор биологических наук, профессор,
заслуженный деятель науки РФ
ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора
Ключевые слова: бактериофаги, бактерии, лектины, гликоконъюгаты, системы,
узнавание
В обзоре рассмотрено применение лектин-гликоконъюгатных принципов организации
и функционирования систем «Бактериофаги – Бактерии», что расширяет возможности конструирования и контроля таких макросистем.
Введение. Исследование бактериофагов (БФ) открывает широкие перспективы [1-3].
Узнавание бактерий бактериофагами, их первые этапы взаимоотношений являются ключевыми - инициирующими последующие реакции. Нами сформулированы основные принципы организации и функционирования лектинов (Л), лектиновых систем и лектин-гликоконъюгатных
(Л-ГК) отношений, вовлекающих организм человека и его биотопную микрофлору [4-10]. Целью является применить принципы взаимосвязей Л-ГК в системе «БФ - Бактерии».
Структурно-функциональные взаимоотношения типа Л-ГК, наблюдаемые и в
системе «БФ - Бактерии». К Л относятся пептид/белок-содержащие структуры и комплексы,
связывающие, чувствующие, распознающие углеводы и ГК. Л имеют пространственные участки узнавания ГК, часто являются олигомерами, не относятся к иммуноглобулинам (Ig) (могут
иметь Ig-подобные домены) и ферментам углеводного обмена (есть исключения), участвуют в
76
Биология фагов
иммунитете, обладают организующими (в том числе строительными [протеогликаны, клеточные слои, упорядоченная слизь, поверхность органелл], носительными/доставочными) и сигнальными свойствами (информосомными); являются вспомогательными, корректирующими
и стабилизирующими по отношению к доминирующей активности в составе всех классов и
групп белковых эффекторов (ферментов [в том числе цитолизинов с модульным независимым
расположением активностей], гормонов, клеточных рецепторов, цитокинов, дефензинов, антибиотиков, узнающих пептидов [в том числе укороченных Л]). Молекулы Л часто ассимметричны (активны), гидрофобны, зависят от катионов Ca2+ и других металлов, могут иметь 2 и
более участков узнавания (в том числе разного типа; включать межсубъединичные области),
склонны к направленной сборке (особенно в интерфазных областях, включая клеточную поверхность). Молекула Л обычно представлена системой множественных сборочных форм с
различными активностями. Система Л направлена на систему мишеней - ГК, которые могут
быть ранжированы по степени сродства (обратимого или необратимого) к молекуле Л (возможность одновременного узнавания несколько различных ГК/мишеней, разобщенных в пространстве). Системы Л являются мозаичными (например, их распределение при визуализации
зависит от типа ГК); им свойственен синергизм (не конкурирующая система из одного и того
же источника) при достижении конечного результата действия, в том числе антимикробный
при сочетании с другими антимикробными соединениями. К ГК относятся гликопротеины,
гликолипиды (в том числе липополисахариды [ЛПС]), протео/пептидо-гликаны (в том числе
пептидогликаны [ПГ] бактерий), арабиногалактановые слои (микобактерии), полисиаловые
капсулы (E.coli, нейссерии), другие. Один тип ГК может одновременно взаимодействовать с
несколькими различными Л (или системами Л), которые могут быть ранжированы по степени
сродства к Л (или системам Л). Л способны собираться в частичковые латексные и филаментные узнающие макролектиновые формы, которые также образуются и в случае сенсибилизации клеток посредством Л (клетки как модельные макролектины). Л могут проявлять литическое, деградирующее и регулирующее действие в отношении микробных массивов.
Примеры систем «БФ - Бактерии», использующие взаимодействия типа «Л - ГК».
C одной стороны, в БФ (голове/капсиде, шее, туловище и, особенно, хвосте [участвующем в
правильной посадке/рецепции на клеточную поверхность]) много гликопротеинов, как экспонированных, так и участвующих во внутренней сборке/упаковке (между белками и гликопротеинами и между белками и нуклеиновыми кислотами - ГК), что предусматривает принципы
Л-ГК связывания/узнавания. С другой стороны, в оболочке и клеточной стенке бактерий/мишеней присутствуют наборы потенциальных рецепторов (ГК) БФ (смотри ниже).
Синтезированные в родительских бактериях системы БФ, попадают во внеклеточное
пространство и взаимодействуют с бактериями-мишенями (например, патогенами, которые
необходимо обезвредить), распределяясь по клеточной поверхности неравномерно - мозаично (благодаря обратимому связыванию и передислокации (слабо Са2+-зависимой в случае БФ
SPP1 B.subtilis) на клеточной поверхности, в зависимости от ее особенностей [11]: полюсные, септированные, с повышенным уровнем метаболизма [возможности для БФ более полно
использовать активные ресурсы бактерии]). Описанная выше «неопределенность» или ограниченная определенность поведения системы частиц БФ с использованием слабоаффинных
взаимодействий и особенностей бактерии-мишени коэволюционно оправдана и обеспечивает
необходимый выбор эффективных пар и достаточное количество таких пар, что повышает, в
конечном счете, надежность конечного результата – цитолиза. В процессе рецепции хвостовые
(БФ порядка Caudovirale) составляющие (белки и их ассоциаты - паттерны) находят адекватные аффинные площадки сорбции (вначале обратимой {например, связывание БФ SPP1 Glcтейхоевой кислотой B.subtilis или эндолизина PlyP35 БФ Listeria – �������������������������
c������������������������
�����������������������
GlcNAc�����������������
-тейхоевой кисло-
77
Биология фагов
той [12, 13]} и позже – необратимой [последующее связывание SPP1 с рецепторным белком
YueB как вторичным рецептором] [12]). В качестве первичных рецепторов БФ (T4, T7, A1122
, другие) могут служить коровые олигосахариды из состава ЛПС грамотрицательных бактерий (E.coli, Y.pestis {рецептор для the A1122 – область ЛПС Hep/Glc-Kdo/Ko}[14], другие);
капсулярный галактозилированный фосфорамидат (Campylobacter jejuni) (рецептор для БФ
F336 - GalfNAc MeOPN) [15], ПГ и гликозилированные (обязательное условие для попадания
в клетку по сравнению с БФ сем. Myoviride) тейхоевые кислоты (например, S.aureus в случае
узнавания посредством БФ сем. Siphoviridae [16]). Создание на основе ЛПС, ПГ, тейхоевых
кислот и других ГК уникальных или с повышенной специфичностью рецепторов с высоким
сродством к типу БФ является путем повышения селективности (в отношении патогенов) и
быстродействия (ускоренного цитолиза) БФ. Возможно Fc-Ig-рецептор-опосредованное (Igзависимое) попадание БФ в клетки [17]. ������������������������������������������������
Ig����������������������������������������������
-технологии поддерживаются широким распространением Ig-подобных доменов (I-set, FN3, and BIG-2) у представителей Caudovirales (семейства
[сем.] Myoviridae (например, T4), Podoviridae [например, T7] и Siphoviridae [например, λ, БФ
лактококков), инфицирующих грамположительные и грамотрицательные бактерии [18].
В БФ в составе острых хвостовых выступов присутствуют белки первичной и вторичной рецепции, включая латеральные эндолизины, узнающие и разрушающие маскирующие
клеточную мембрану слои (ПГ, ЛПС, [глико/липо]тейхоевые кислоты), что является необходимым для последующего введения в клетку упакованных нуклеиновых кислот капсида. К ним
относятся эндогликангидролазы/полисахаридазы (мурамидазы и лизоцим-подобные [действие
на ПГ]; эндосиалидазы [в том числе эндосиалидаза F]), эндорамнозидазы, другие гидролазы
(амидазы), деполимеразы (пектинлиазы), литические трансгликозилазы и инвертированные
гликозил-гидролазы. Для эндолизинов БФ характерна модульная с высокой термостабильностью организация: наличие пространственного модуля узнавания/связывания с рецепторами бактерии (часто в С-концевой аминокислотной последовательности в виде нескольких
повторов) и отдельного модуля литической активности (обычно в �������������������������
N������������������������
-концевой области), разрушающей клеточную стенку в месте связывания. Так, в случае БФ Cp-7 (S.pneumoniae) ���
повторы CW_7 связывают в ПГ муропептиды GlcNAc-MurNAc-l-Ala-d-isoGln [18]. Активность
последующего введения нуклеиновых кислот сцеплена/спарена в пространстве и во времени
с обеими вышеуказанными активностями эндолизинов (в процессе биосинтеза и сборки БФ
на генетическом и конечном [структурно-упаковочном] уровнях). Использование коктейля БФ
расширяет спектр эндолизинов и повышает надежность достижения конечного результата –
клеточного лизиса (например, разрушение ПГ может достигаться ПГ-гидролазами различных
типов, в соответствии с Международной классификацией ферментов). Разнообразие модулей
БФ позволяет путем их комбинирования создавать новые составляющие литических наномашин – ключевых механоузлов (рецепции и инъекции) хвоста БФ [19]. В этом смысле БФ можно рассматривать как функционирующие совместно с бактериями/мишенями нанороботы.
В составе биопленок БФ способны не только изменять фенотип бактерий и определять
аномальное формирование пленок, но и, благодаря, например, нарушенной сборке биопленки, вызывать их усиленный лизис [20]. В сочетании с антибиотиками группы аминогликозидов (ГК) (например, гентамицином) БФ проявляет синергидное действие против биопленки
S.aureus [21]. Механизм синергизма – в усилении деградирующего действия БФ в отношении
сформированных агрегатов бактерий (гентамицин индуцировал сильно выраженный агрегационный фенотип популяций стафилококков). Пектинлиаза-подобные домены хвостовых белков
БФ (стафилококков) рассматриваются как перспективные для лизиса и деградации биопленок
[22].
Заключение. Приведенные данные указывают на перспективность представлений
78
Биология фагов
Л-ГК для более полной оценки типов рецепторных взаимодействий БФ и бактерий, что важно
для биоконтроля и конструирования терапевтических БФ. Кроме того, технологии с использованием БФ позволяют разрабатывать пептидные имитаторы и миметики углеводов/олигосахаридов и ПГ – перспективные для использования в качестве антивирусных средств (ингибиторы клеточной сорбции) и при разработке вакцин [23].
Библиографический список
1. Aleshkin A.V., Lakhtin V.M., Afanasiev S.S., Lakhtin M.V., Aleshkin V.A. // Materialy
VIII Miedzynarodowej naukowi-praktycnej konferensji “Nauka i inowacija - 2012”. - Vol. 16. – P.
17-36. - Nauk biologicznych.: Przemysl. Nauka i studia.
2. Лахтин В.М., Алешкин А.В., Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. // Бюлл.
ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 5 (87); Часть 1. – С. 382 – 385.
3. Aleshkin A.V. Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Afanas’ev S.S., Lakhtin
������������������������
V.M. �����������
// Proceednd
ings 2 Int. Conf. on Antimicrobial Research (Nov. 21-23, 2012, Lisbon).
4. Лахтин В.М. // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Серия Биотехнология. Том 2.
Лектины в исследовании белков и углеводов / под ред. профессора Клесова А.А. – Москва:
ВИНИТИ, 1987. – С. 4-290.
5. Lakhtin V.M., Lakhtin M.V., Alyoshkin V.A. // Anaerobe. - 2011. – V. 17; No 6. - P. 452455.
6. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Алешкин А.В. Лектины
и ферменты в биологии и медицине // Москва: Издательство «Династия», 2010. - 496 с.
7. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Alyoshkin V.A. // Int. J. Mol. & Clin. Microbiol. – 2011. - V.
1. – P. 9 – 14.
8. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Alyoshkin V.A., Afanasyev S.S. // Beneficial Microbes. 2011. – V. 2; No 2. – P. 155 – 165.
9. Лахтин М.В., Караулов А.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др. //
Иммунопатология, аллергология, инфектология, 2012. - № 1. – С. 27 – 36.
10. Lakhtin M., Lakhtin V., Aleshkin A., Bajrakova A., Afanasiev S., Aleshkin V. // in the
book: “Probiotics - 2012”, Edited by E.C. Rigobelo. – 2012. – P. 417 – 432.
11. Jakutytė L., Baptista C., São-José C., Daugelavičius R., Carballido-López R. et al. // J.
Bacteriol. – 2011. – V. 193(18). – P. 4893-4903.
12. Jakutytė L., Lurz R., Baptista C., Carballido-Lopez R., São-José C. et al. // Virology. –
2012. – V. 422(2). – P. 425-434.
13. Eugster M.R., Haug M.C., Huwiler S.G., Loessner M.J. // Mol. Microbiol. - 2011. – V.
81(6): P. 1419-1432.
14. Kiljunen S., Datta N., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P., Knirel Y.A. et al. // J. Bacteriol.
– 2011. – V. 193(18). – P. 4963–4972.
15. Sørensen M.C.H., van Alphen L.B., Harboe A., Li J., Christensen B.B., Szymanski C.M.,
Brøndsted L. // J. Bacteriol. – 2011. – V. 193(23). – P. 6742–6749.
16. Xia G., Corrigan R.M., Winstel V., Goerke C., Gründling A., Peschel A. // J. Bacteriol.
– 2011. – V. 193(15). – P. 4006–4009.
17. Sapinoro R., Volcy K., Shanaka W.W., Rodrigo I., Schlesinger J.J., Dewhurst S. // Virology. – 2008. – V. 373(2). – P. 274–286. 18. Bustamante N., Rico-Lastres P., García E., García P., Menéndez M. // PLoS One. – 2012.
– V. 7(10): e46654. 19. Veesler D., Cambillau C. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2011. – V. 75(3). – P. 423–433.
20. Webb J.S., Lau M., Kjelleberg S. // J. Bacteriol. – 2004. – V. 186(23). – P. 8066–8073.
79
Биология фагов
21. Kirby A.E. // PLoS One. – 2012. – V. 7(11):e51017. doi: 10.1371/journal.pone.0051017.
Epub 2012 Nov 30.
22. Gutiérrez D., Martínez B., Rodríguez A., García P. // BMC Genomics. – 2012. – V. 13:
228.
23. Matsubara T. // J. Nucleic Acids. – 2012. – V. 2012:740982. doi: 10.1155/2012/740982.
Epub 2012 Oct 10.
LECTIN-GLYCOCONJUGATE RELATHIONSHIPS IN THE SYSTEMS
“BACTERIOPHAGES - BACTERIA”
Lakhtin V.M., Aleshkin A.V., Lakhtin M.V., Afanasiev S.S., Aleshkin V.A.
Key words: bacteriophages, bacteria, lectins, glycoconjugates, systems, recognition.
The review is devoted to possibilities of application of structure-function principles of lectinglycoconjugate relationships to the systems “Bacteriophages - Bacteria”. The data described will
allow extending constructions and control of such coupled macrosystems.
УДК 619:579
ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВАВЫДЕЛЕННЫХ
БАКТЕРИОФАГОВ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBSIELLA
Ляшенко Е.А., кандидат биологических наук, доцент
тел. 8(8422) 55-95-47, elena-l18@mail.ru
Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор
тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор
8(8422) 55-95-47, fvm.zol@yandex.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
Ключевые слова: биологические свойства, бактериофаги, бактерии рода Klebsiella
Изучены основные биологические свойства бактериофагов бактерий рода Klebsiella.
По результатам проведенных исследований были отобраны два бактериофага с высокой литической активностью и широким диапазоном литического действия, строго специфичные
бактериофаги К- 10 и К- 81 для практического использования.
Введение. Бактериофаги – это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному
штамму или антигенно-гомологичным штаммам одного вида или рода [1].
По литературным данным фаги могут использоваться для обработки инструментария
и оборудования больниц, предприятий пищевой промышленности, полуфабрикатов или готовой продукции, а также непосредственно человеком в виде пищевых добавок или иных форм
[2].
80
Биология фагов
Возможность использования выделенных бактериофагов в той или иной сфере практической деятельности человека связана с изучением их биологических свойств, например,
фаги, применяемые для диагностических целей должны быть вирулентными и обладать определенными биологическими свойствами. Цель исследования: изучить основные биологические свойства выделенных фагов бактерий рода Klebsiella и обозначить возможность их практического применения.
Материалы и методы исследований. Исследованию подвергался 21 изолят бактериофагов, выделенных из объектов окружающей среды, а также 38 штаммов бактерий рода Klebsiella,
123 штамма других родов семейства Enterobacteriaceae: Escherichia spp., Proteus spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Providensia spp., Yersinia����������
enteroco���������
litica, а также родов семейств Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp.
В работе руководствовались методиками М. Адамса, Гольдфарба, Тихоненко, Габриловича,
Ганюшкина, ���������������������������������������������������������������������������������
H��������������������������������������������������������������������������������
.-������������������������������������������������������������������������������
W�����������������������������������������������������������������������������
. ���������������������������������������������������������������������������
Ackermanna�����������������������������������������������������������������
[1, 4, 5, 6, 7, 8]. Морфологию негативных колоний изучали в раз-7
-9
ведении фагов 10 – 10 с индикаторной культурой на питательном агаре в посевах методом
агаровых слоев. Учет проводили через 18 – 24 часа инкубации в термостате при температуре
37 °С. Отмечали величину негативных колоний, форму, степень прозрачности, характер краев
колоний, наличие и величина неполного лизиса. Литическая активность бактериофага оценивали по
его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах.
Активность по методу Аппельмана выражалась максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической
активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема (по методу Грациа). Для изучения спектра литической активности использовали метод нанесения капель бактериофагов на газон исследуемой культуры [5]. В качестве исследуемых
культур использовали 28 (5 референс-штаммов, 11 музейных и 12 выделенных нами) штаммов бактерий рода Klebsiella.Два отобранных бактериофага исследовали дополнительно на 10
штаммах клебсиелл изколлекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ).
Изучение специфичности бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА проводили по
отношению к представителям гетерологичных бактерийна плотном питательном агаре, методом нанесения капель фагов на газон исследуемой культуры.
Результаты исследований и их обсуждения. По морфологии образовавшиеся негативных колоний разделили на два типа [3]. Колонии первого типа - круглые, прозрачные в центре
негативные колонии диаметром от 2 мм и более с зоной неполного лизиса по периферии шириной 1 – 8 мм. Негативные колонии первого типа образовывали фаги серии УГСХА: К - 4,
К - 2, К - 60, К - 0х1, К - 33, К - 12, К - 24, К - 210, К - 210, К - 03, К - 032, К - 10, К - 8. Колонии
второго типа - круглые, прозрачные с ровными краями в диаметре до 2,5 мм с отсутствием
зоны неполного лизиса. Колонии второго типа образовывали фаги К - 41, К - 42, К - 11, К - 101,
К - 14, К - 201, К - 281, К - 44, К - 81.
Изученные фаги обладали литическойактивностью от 10-5 до 10-8 (по методу Аппельмана) и от 4 х 107 до 8 х 109фаговых корпускул в 1 мл (по методу Грациа). Результаты исследований представлены в таблице 1.
81
Биология фагов
№
пп
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Таблица 1 - Литическая активность фагов бактерий рода Klebsiella
Активность фагов
Название
Индикаторная
Метод
бактериофага
культура
Метод Аппельмана
Грациа
К - 281
10-5
1 х 108
K. pneumoniae№ 8172
К - 210
10-6
1,5 х 108
K. pneumoniae№ 1071
-6
К - 41
10
7 х 109
K. pneumoniae№ 4463
К - 42
10-6
5 х 108
K. pneumoniae№ 4463
-6
К-4
10
1 х 109
K. pneumoniae№ 4463
К - 14
10-5
1,1 х 109
K. pneumoniae№ 4463
-5
К - 24
10
1 х 109
K. pneumoniae№ 4463
К - 101
10-5
7 х 109
K. pneumoniae№ 01
-5
К - 201
10
2 х 109
K. pneumoniae№ 01
К-2
10-5
4 х 107
K. pneumoniae№ 265
-5
К - 12
10
1 х 109
K. pneumoniae№ 265
К - 10
10-6
2 х 109
K. pneumoniae№ 1017
-5
К - 60
10
2,5 х 109
K. pneumoniae№ 60
К - 11
10-8
2,5 х 109
K. pneumoniae№ 1
-5
К - 0х1
10
8 х 109
K. oxytoca№ 1/1
К - 33
10-8
5 х 109
K. oxytoca№ 5
-6
К - 44
10
2 х 109
K. pneumoniae№ 4463
К - 03
10-7
1 х 109
K. pneumoniae№ 03
-7
К - 032
10
1 х 109
K. pneumoniae№ 03
К - 81
10-6
4 х 109
K. pneumoniae№ 8172
-7
К-8
10
1 х 109
K. pneumoniae№ 423
В результате проведенных исследований нами установлено, что бактериофаги обладали разным диапазоном литической активности к 28 испытанным штаммам клебсиелл, который
колеблется от 14 % до 75 %(табл. 2).
Таблица 2 - Спектр литической активности бактериофагов бактерий рода Klebsiella
№
пп
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
82
Фаги
К - 281 УГСХА
К - 210 УГСХА
К - 41 УГСХА
К - 42 УГСХА
К - 14 УГСХА
К - 101 УГСХА
К - 201 УГСХА
К - 2 УГСХА
К - 4 УГСХА
К - 24 УГСХА
K - 12 УГСХА
К - 10 УГСХА
K - 60 УГСХА
Количество
чувствительных
штаммов бактерий рода
Klebsiella
% лизируемых
штаммов клебсиелл
4
5
4
4
4
4
5
5
13
16
13
21
18
14,3
17,8
14,3
14,3
14,3
14,3
17,8
17,8
46,4
57,1
46,4
71,4
64,3
Биология фагов
14
15
16
17
18
19
20
21
K - 11 УГСХА
K - 33 УГСХА
K - 01 УГСХА
K - 44 УГСХА
K - 03 УГСХА
K - 032 УГСХА
K - 81 УГСХА
К - 8 УГСХА
15
5
4
13
18
12
22
6
53,5
17,8
14,3
46,4
64,3
42,8
75
21,4
Два отобранных бактериофага исследовали дополнительно на 10 штаммах клебсиелл
изколлекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ). В результате было установлено что,фаг К - 10
УГСХАлизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА – 73 %, а в сумме фаги
проявили литическое действие в отношении 97 % всех исследованных культур (табл. 3).
Таблица 3 - Спектр литической активности фагов бактерий рода Klebsiella
Общее
Кол-во
Кол-во
%
кол-во
исследованных
лизируемых лизируемых
лизируемых
Фаги
штаммов
штаммов
штаммов
штаммов
культур
культур
культур
культур
К - 10 УГСХА
29
76
К - 81 УГСХА
28
73
38
37
Общий % лизируемых
97
штаммов культур
По результатам изученияспецифичности бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА
в отношениигетерологичных бактерий, всего происследовано123 штамма, установлено, что селекционированные фаги неактивны по отношению к представителям бактерий других родов
и семейств.
Заключение. В результате изученных основных биологических свойств бактериофагов
бактерий рода Klebsiella были отобраны два бактериофага с высокой литической активностью
и широким диапазоном литического действия, строго специфичные бактериофаги К- 10 и К - 81
для практического использования в диагностики клебсиеллезной инфекции.
Библиографический список
1. Адамс М. Бактериофаги - М.: изд-во иностр. Лит-ра, 1961.
2. Алешкин А.В. Бактериофаги как пробиотики и средства деконтаминации пищевых
продуктов / А.В. Алешкин, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, и др. // Астраханский медицинский
журнал. – 2012. Т.7 - №3. – С.31-39.
3. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов E. coli
0124:В17 // Проблемы бактериофагии и биология кишечных бактерий: сб. кафедры микробиологии I Лен.мед. ин-та им. акад. И.П. Павлова Л., 1973. – 53 с.
4. �����������������������������������������������������������������������������
Габрилович И�����������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������
.М. �������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������
бщая характеристика бактериофагов
����������������������������������������
//������������������������
В кн.: О���������������
����������������
сновы ���������
бакте����
риофагии. – Минск, 1973. –С. 5 – 24.
5. Ганюшкин
����������������������������������������������������������������������������
В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии.��������
–������
�������
Улья�����
новск, 1988. – 45 с.
83
Биология фагов
6. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. – М.: Медгиз, 1961. – 299 с.
7. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. – М.: Наука, 1968 – 170 с.
8. Ackermann H.-W., DuBow M.S., Gershman M. Taxonomic changes in tailed of enterobacteria // Archies of virology. – 1997. – № 142. – P. 1381 – 1390.
BASIC BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE ISOLATED BACTERIA
BACTERIOPHAGES KIND KLEBSIELLA
Liashenko E.A., Vasilyev D.A., Zolotukhin S.N.
Keywords: biological properties, bacteriophages, bacteria of the genus Klebsiella
Learn the basic biological properties of bacteriophages, bacteria of the genus Klebsiella.
The results of the study were selected from two high bacteriophage lytic activity and a wide range of
lytic activity, strictly specific bacteriophages K-10 and K-81 for practical use.
УДК 579.842.23:578.1:616-092:57:612.015.2
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФАГОВ ПАТОГЕННЫХ
ИЕРСИНИЙ:YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS И YERSINIA
ENTEROCOLITICA
Македонова Л.Д., кандидат медицинских наук, тел. 8(863)240-27-03,
e-mail:plague@aaanet.ru
Кудрякова Т.А. , доктор медицинских наук, Тел. 8 (863)240-27-03,
e-mail:plague@aaanet.ru
Качкина Г.В., Тел. 8(863)240-27-03, e-mail:plague@aaanet.ru
Гаевская Н.Е. , Тел. 8(863)240-27-03, e-mail:gaevskaya.nata@mail.ru
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора
Ключевые слова: бактериофаги Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica, обнаружение,
свойства
Подобраны 4 индикаторных псевдотуберкулезных и 5 кишечноиерсиниозных штаммов, при применении которых выделены 12 псевдотуберкулезных и 9 кишечноиерсиниозных
фагов. При идентификации бактериофагов установлена специфичность антигенного строения, различия в морфологии негативных колоний и фаговых частиц, по диапазону литической
активности. Чувствительность к фагам может быть использована в лабораторной диагностике штаммов Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica.
Введение. Заболевания, вызываемые патогенными иерсиниями, в последние годы занимают важное место среди других острых кишечных инфекций. Ежегодно в России регистрируются в основном в организованных детских коллективах вспышки псевдотуберкулеза. Существенно возросло значение Y.enterocolitica в возникновении гастроинтестинальной
инфекции [1, 2]. Сложность идентификации и дифференциации инфекций, вызванных этими
микроорганизмами, связана с фенотипической и генотипической близостью возбудителей. По-
84
Биология фагов
этому лабораторная диагностика иерсиниозов с использованием специфических бактериофагов в последние годы привлекает все большее внимание микробиологов [3, 4]. Накопление
данных о новых псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных фагах, изучение их биологических свойств не теряет своей актуальности.
Целью настоящей работы явилось выделение и идентификация новых псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных бактериофагов из штаммов различных О-сероваров.
Материалы и методы исследований. В экспериментах использовали 161 штамм
псевдотуберкулезного микроба О1-О5 сероваров и 227 штаммов Y.enterocolitica сероваров
1-38, выделенных в различные годы и полученных из музея института. Специфичность свежевыделенных фагов оценивали на 44 штаммах различных представителей семейства Enterobacteriaceae. Исследовали также пробы сточных вод г. Ростова – на – Дону на наличие кишечноиерсиниозных бактериофагов, которые выявляли в надосадочных жидкостях суточных бульонных культур Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica и пробах сточных вод, инактивированных
хлороформом, двухслойным методом по Грациа. В качестве индикаторов испытывали каждый
из исследуемых штаммов Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica. Биологические свойства изучали по общепринятым методам [5]. Литическую активность исследовали постановкой прямой пробы с фагами [5]. Специфические антифаговые сыворотки получали путем внутривенной иммунизации кроликов препаратами свежевыделенных фагов с различной морфологией
корпускул в возрастающих дозах. В качестве питательных сред использовали 0,7% и 1,5%
агар, бульон Хоттингера и 1,5% эритрит агар (для обнаружения псевдотуберкулезных фагов),
рН всех сред 7,2.
Результаты исследований и их обсуждение. В результате проделанной работы установлено, что эффективными индикаторными свойствами для выделения 12-ти псевдотуберкулезных фагов из гомологичных культур О1, О3, О4, О5 сероваров обладали следующие штаммы: 1362 (О1 серовара), 310, 5344 (О3 серовара), 10368 (О4 серовара, культура депонирована
в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под № КМ 207). Из штаммов
Y.enterocolitica в качестве индикаторных отобраны следующие: Y.enterocolitica 2012 (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под № КМ 206) и 5507
(О3 серовара), 10152 (О5 серовара), 5517 (О10 серовара) и 5528 (О18 серовара), использование которых позволило изолировать 7 фагов из штаммов наиболее часто встречающихся
О-сероваров Y.enterocolitica (О1, О3, О5, О12). Из проб сточных вод выделено 2 фага.
Свежевыделенные псевдотуберкулезные фаги имели сходное строение фаговых корпускул и относились к �������������������������������������������������������������������
III����������������������������������������������������������������
морфологической группе по классификации А.С.Тихоненко [6]. Диаметр негативных колоний составлял 4-6 мм. Фаги полностью нейтрализовались антифаговой
сывороткой к псевдотуберкулезным фагам I серотипа и не давали перекрестных реакций с
антифаговыми сыворотками к псевдотуберкулезным фагам II-III серотипов и чумным фагам
I-IV серотипов. Псевдотуберкулезные бактериофаги обладали широким спектром литической
активности, лизируя 50-100% штаммов Y.pseudotuberculosis, а также взятые в опыт штаммы
E.coli, Sh.dysenteriae, S.paratyphi и 2,6-20,5% штаммов Y.enterocolitica. Изучение диапазона
действия выделенных псевдотуберкулезных фагов на штаммах Y.pseudotuberculosis разных
О-сероваров показало, что они отличаются друг от друга (табл.1). Однако избирательной активности фагов в отношении псевдотуберкулезных штаммов определенных О - серогрупп не
отмечено.
Изученные фаги Y.enterocolitica характеризовались разнообразием биологических
свойств по строению вирионов, антигенной структуре, спектру литической активности. Морфологическая структура исследованных фагов Y.enterocolitica была представлена III, IV, V
группами по классификации А.С.Тихоненко. Кишечноиерсиниозные фаги имели 3 типа не-
85
Биология фагов
гативных колоний: 1) точечные, мутные и полупрозрачные; 2) мутные, диаметром около 1мм;
3) крупные мутные с ореолом, диаметром 3-4мм. Выявлено 3 серологических типа фагов
Y.enterocolitica, не дающие перекрестных реакций. Не отмечено антигенного родства между
псевдотуберкулезными и кишечноиерсиниозными бактериофагами.
Результаты, полученные при изучении спектра литической активности 9-ти фагов
Y.enterocolitica, выявили специфичность 7 из них. Они не лизировали представителей других
видов семейства Enterobacteriaceae. Два фага проявляли активность в отношении некоторых
штаммов Shigella, Salmonella и E.coli. Диапазон литической активности кишечноиерсиниозных фагов в отношении гомологичных штаммов колебался от 3,08 до 31,7%. Исключение составляли фаг 19 (из сточных вод), который лизировал 66,07% гомологичных штаммов и фаг
5423, активный в отношении 0,88% исследованных штаммов Y.enterocolitica.
С/ры изучен.
штаммов
Y.pseudotuberculosis
Кол-во изуч.
штам-мов
Таблица 1 - Лизабельность штаммов Y.pseudotuberculosis разных сероваров псевдотуберкулезными фагами
Лизировано бактериофагами
Из шт. I с/вара
2344
Л
%
2391
Л
%
Из шт.
III с/
вара
12310
Л
%
Из шт.
Vсеровара
Из штаммов IV серовара
1996
Л
%
274
Л
%
10364
Л
%
I с/в 33 33 100 33 100 21 63,6 32 96,9 32 96,9 33 100
II с/в 8 8 100 8 100 8 100 7 87,5 8 100 7 87,5
III
c/в 13 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100
IV с/в 20 20 100 20 100 19 95 19 95 19 95 19 95
V с/в 2 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100 2 100
Примечание: Л – лизабельность штаммов, с/в - серовар
10369
10358
Л
Л
%
%
1984
Л
%
32 96,9 32 96,9 19 57,5
7 87,5 7 87,5 6 75,0
13 100 13 100 13 100
19 95 19 95 19 95
2 100 2 100 2 100
Заключение. Таким образом, с помощью специально подобранных четырех индикаторных штаммов Y. pseudotuberculosis и пяти Y.enterocolitica удалось обнаружить 12 новых
псевдотуберкулезных и 9 кишечноиерсиниозных бактериофагов. Коллекция бактериофагов и
тест-штаммов патогенных для человека иерсиний представлена в базе данных (свидетельство
о государственной регистрации № 2012620588 от 19 июня 2012 года). Выделенные псевдотуберкулезные фаги не отличались друг от друга по морфологии негативных колоний на газонах
соответствующих индикаторных культур и имели одинаковое строение корпускул. Фаги относились к 1 серологической группе псевдотуберкулезных фагов. Отмечена способность фагов Y. pseudotuberculosis одновременно лизировать чумные и псевдотуберкулезные культуры, а
также отдельных представителей семейства Enterobacteriaceae.
Фаги Y.enterocolitica формировали на газонах чувствительных культур 3 типа негативных колоний, отличающихся степенью прозрачности и диаметром. По структуре вирионов
они относились к трем морфогруппам и по антигенным свойствам составили 3 серогруппы.
Отмечены индивидуальные особенности псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных фагов в диапазоне литической активности, которые могут быть использованы в лабораторной
диагностике.
86
Биология фагов
206с.
Библиографический список
1. Ющук Н.Д. Иерсиниозы /Н.Д.Ющук, Г.Я.Ценева, К.Н.Кареткина и др. –М., 2003,
2. Профилактика инфекционных болезней. Кишечные инфекции. Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза /Ю.В.Демина,
Г.Я.Ценева, Е.А.Воскресенская и др. //Методические указания. – М., 2009, 66с.
3. Проценко С.Л. Биологические свойства возбудителя кишечного иерсиниоза из очагов чумы Кавказа и Закавказья //Автореф. дисс…канд. мед. наук. – Саратов, 1990.
4. Дарсавелидзе М.А., Капанадзе Ж.С., Чанишвили Т.Г. Биологические свойства бактериофагов, активных в отношении Yersinia enterocolitica//Журн. микробиол., эпидемиол. и
иммунобиол., 2004, №6, с.10-13.
5. Адамс М. Бактериофаги: Пер. с англ. – М., 1961, 527с.
6. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. – М., 1968, 89с.
BIOLOGICAL PROPERTIES OF PHAGES PATHOGENIC IYERSINY:
YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS AND YERSINIA ENTEROCOLITICA
Makedonskaya L.D, Kudryakova T.A., Kachkina G.V., Gaevskaya N.E.
Key words: bacteriophages Y.pseudotuberculosis, Y.enterocolitica, detection, properties
4 indicator pseudo-tubercular and 5 kishechnoiyersiniozny strains are selected at application of which 12 pseudo-tubercular and 9 kishechnoiyersiniozny phages are allocated. At identification of bacteriophages specificity of an anti-gene structure, distinction in morphology of negative
colonies and fagovy particles, on the range of lytic activity is established. Sensitivity to phages can
be used in laboratory diagnostics of strains Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica.
УДК 619:579
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАГОВ ESCHERICHIA COLI
О157 ДЛЯ СОЗДАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
Молофеева Н.И., кандидат биологических наук, доцент
8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор
8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор
тел. 8(8422) 55-95-47, fvm.zol@yandex.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
Ключевые слова: Бактерии, бактериофаги, энтеробактерии, литическая активность, специфичность.
Работа посвящена выделению и изучению основных биологических свойств бактериофагов бактерий Escherichia coli О157. При проведении исследований авторами выделено 3
штамма фага и изучены их биологические свойства.
87
Биология фагов
Введение. В последние годы установлено, что штаммы Е. соli серо­логического варианта 0157 способны вызывать у людей тя­жело протекающие вспышки гастроэнтерита [7, 8, 9,
13, 14], а и у молодняка животных диареи с признаками геморрагиче­ского гастроэнтеритах[11].
Эффективность лечебных мероприятий во многом зависит от своевременности диагностики болезни, поэтому совершенст­вованию методов лабораторной диагностики указанной
инфек­ции уделяется большое внимание. Для бактериологической диагностики разработа­ны питательные среды для выделения указанного серовара эшерихий [10]. Но метод их выделения и
идентификации с использованием предлагаемых сред сравнительно трудоемок, не достаточно
чувстви­телен и требует много времени (4-5 суток). Современные методы иммунодиагностики
(ПЦР и ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов,
для постановки этих реакций, делает их пока недоступными для большинства лабораторий. Поэтому перед нами была поставлена цель - изыскание более простого и доступного для любых
лабораторий метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.
В микробиологической практике для ускоренного обнаружения не­которых микроорганизмов в патологическом материале и объек­тах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги [3, 5, 6] Метод индикации и идентификации патогенных микроорганизмов с помощью
бактериофагов спе­цифичен, не требует больших затрат времени, материалов и об­щедоступен.
В связи с отсутствием сообщений в научной литературе об использовании бактериофагов Е. соli О157 возникла необ­ходимость изыскания индикаторных эшерихиозных бактерио­
фагов для ускоренного обнаружения серологического варианта 0157 в объектах внешней среды, патологическом материале, пищевых продуктах и кормах, а также для ускоренного типирования полевых штаммов возбудителя болезни.
Материалы и методы исследований. Материалом для исследований служили сточные воды, взятых из животноводческих ферм и общественных туалетов разных населенных
пунктов Ульяновской и Самарской областей. Использовались бактериологические, вирусологические методы исследования. Методы выделения бактериофагов и работы с ними [1, 2, 4].
Методы селекции бактериофагов.
Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе работы целью наших
исследований была разработка оптимальной схемы выделения фагов Е.соli 0157.
В основу метода для поиска фагов положена схема, предло­женная Грациа, адаптированная к изучаемым видам бактерий. 1,5% МПА с генцианвиолетом накануне опыта разлили
по чашкам в количестве 25-30 мл. Чашки, прикрытые стерильной бумагой, высушивали под
бактерицидной лампой в течение нескольких часов, затем закрывали крышками и в перевернутом виде оставляли на ночь при комнатной температуре для полного высушивания агара
в чашках, так как малейшее увлажнение искажает результаты. Предварительно разлитый в
пробирку 0,7% агар в количестве 2,5 мл доводили до 46-47°С и 1 мл исследуемого фильтрата
вносили в 2,5 мл 0,7% агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры Е.соli, вращая
пробирку для быстрого перемешивания все быстро перемешивали и выливали на по­верхность
агара. В качестве индикаторной культуры использо­вали штаммы Е.соli 0157.
Смесь осторожными движениями распределяли по поверх­ности 1,5% агара, для затвердения оставляли на столе в течение 30 минут, а затем выдерживали в термостате при 37°С
в течение 20-24 часов. При наличии фага на чашках обнаружива­ли негативные колонии или
зоны лизиса.
По указанной схеме нами было исследовано 56 проб сточ­ных вод, взятых из животноводческих ферм и общественных туалетов разных населенных пунктов Ульяновской и Самарской областей. Из трех проб было выделено 3 штамма фага, которые дифференцировали по
88
Биология фагов
морфологии негативных колоний (таблица 1).
Таблица 1 - Морфология негативных колоний фагов
№ штамма фага
Морфология негативных колоний
№1
D=1 мм, с ровными краями, прозрачные
№2
D=1-1,5мм, с ровными краями, прозрачные
№3
D=1-2 мм, с ровными краями, прозрачные
Для селекции клонов фагов от­вивали одну негативную колонию и помещали в пробирку с МПБ и индикаторной культурой эшерихий. Пробирки инкуби­ровали в термостате при
37°С в течение 5-6 часов, прогревали при 60°С и полученный фаголизат вновь исследовали
методом агаровых слоев. Каждый штамм пассировали 7-10 раз до получения рассы колифага с
однородными негативными колониями.
Селекционированные бактериофаги имели прозрачные не­гативные колонии с ровными краями диаметром 1,0-2,0 мм.
Биологические свойства этих фагов были изучены по ряду показателей, в том числе
активности и специфичности.
Литическую активность селекционированных фагов мы оп­ределяли на плотных и
жидких питательных средах на индикаторных культурах E.coli по следующей методике: в ряд
пробирок из нейтраль­ного стекла одинакового диаметра наливали по 4,5 мл МПБ. В первую
вносили 0,5 мл испытуемого фага. Затем делали после­довательные разведения 1:10. Обычно
использовали 10 пробирок. За­тем во все пробирки вносили по 0,2 мл 18-часовой индикаторной
бульонной культуры Е.соli 0157, причем 11-я и 12-я пробирки являются контроль­ными, в первой из них находится МПБ и культура (без фага), во второй - один МПБ (контроль на стерильность). Все пробирки помещали в термостат при 37°С на 18 часов. Титр фага устанав­ливали
по конечному разведению.
При использовании метода агаровых слоев определены качественные показатели фагов. Для опыта брали по 1 мл фага в разведениях 106 до 1010 (без культуры) и вносили в пробирки с 2,5 мл 0,7% агара, расплавленного и остуженного до 46-47°С, туда же вносили 0,2 мл
культуры Е.соli, содержимое пробирки перемешивали и вы­ливали на поверхность 1,5% агара.
Чашки оставляли на столе для затвердения агара, затем их выдерживали в термостате при 37°С
в течение 20 часов. Активность определяли по количеству негативных колоний на газоне роста
индикаторных культур.
Таблица 2 - Результаты изучения литической активности эшерихиозных фагов
Литическая
ФАГИ
№1
№2
№3
активность
-6
-7
-6
-7
По Аппельману
10 -10
10 -10
10-6-10-7
9
9
По Грациа
8х10
3,2х10
8х109
Для изучения специфичности фагов нами были использова­ны 6 штаммов бактерий
Е.соli гетерологичных серологических групп, в том числе 3 штамма, относящиеся к серогруппе О157, Citrobacter - 2 штамма, М.morganii - 2 штамма, Klebsiella - 1 штамм.
89
Биология фагов
Таблица 3 - Специфичность фагов
Штаммы бактерий
Фаг №1
Фаг №2
Фаг №3
Е.соli О157№1
+
+
++
Е.соli О157№2
+
+
++
Е.соli О157№3
+
+
++
Е.соli О26
-
-
--
Е.соli 0111
-
-
--
Е.соli 0126
-
-
--
М.morganii
-
-
--
Сitrobacter
-
-
--
-
--
Klebsiella
«+» полный лизис; «-» отсутствие лизиса.
Заключение. Анализируя результаты проведенных исследований по изу­чению литической активности и специфичности, селекционированные нами фа­ги обладают высоким
спектром литической активности по Аппельману - 10-6-10-7; по Грациа – от 3,2х109 до 8х109, и
являются специфичными по отношению к бактериям Escherichia coli О157. Селекционированные бактериофаги являются новыми объектами, дальнейшее изучение которых представляет
определенный интерес.
Библиографический список
1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с англ.)//М., 1961.-521 С.
2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии// Учебное пособие , Ульяновск. -1988. -45 С.
3. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство саль­монелл и фагопрофилактика.// Вопросы ветеринарной мик­робиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной
экспертизы. Ульяновск.-1990. с. 20-28.
4. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// М.: Медгиз., 1961. -297С.
5.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Бактерии рода Citrobacter и их
бактериофаги // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сборник научных трудов. Ульяновск. – 2000, с..53-58.
6.Кольпикова Т.Н., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листерий. /Ветеринария. N6, 1990, с. 31-32.
7. Кольпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Перспективы практического применения листериозных бактериофагов.//Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии
и эпи­зоотологии./ Материалы научной конференции ВНИИВиМ. Покров. Часть 11, 1992, с.
211-212.
8. Потапова Т.А. и др. О выделении Е. coli О157:Н7 -возбудителя ОКИ с гемолитикоуремическим синдромом в Тульской области // ЖМЭИ, №5, 2000, с. 115-116.
9. Ратинер Ю.А., Бондаренко В.М.// Микробиология. №2, 1998, с.87-56.
10. Султанова З.С. и др. //ЖМЭИ , №1, 2000, с. 48-50.
11. Малов В.А., Пак С.Г.// ЖМЭИ, №2, 1996, с. 50-53.
12. Характеистика биологических свойств бактериофагов вида Bacillus subtilis / Д.А.
90
Биология фагов
Васильев [и др.] // Вестник УГСХА. – 2011. - №1(13) – С. 79-84
13. Воусе Т.G., Swerdlov D.L., Griffin P.M..// New Епgl. J. Меd., V. 333, 1995, р. 364-368.
14. http://www.ecdc.europa.eu.
BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PHAGES ESCHERICHIA COLI
О157 TO CREATE DIAGNOSTIC PREPARATION
Моlofeeva N.I., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.
Кey words: Bacteria, bacteriophages, enterobacteria, lytic activity and specificity.
The work is devoted to the allocation and study of the basic biological properties of bacteriophages of bacteria Escherichia coli О157. During the research the authors allocated 3 strain of
phage and studied their biological properties.
УДК 578.81
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГА AP22, СПЕЦИФИЧЕСКИ
ИНФИЦИРУЮЩЕГО ШИРОКИЙ СПЕКТР ШТАММОВ
ACINETOBACTER BAUMANNII
Попова А.В., кандидат биологических наук, popova_nastya86@mail.ru
Мякинина В.П.,
Богун А.Г., кандидат биологических наук, bogun62@mail.ru
Воложанцев Н.В., кандидат биологических наук, nikvol@obolensk.org
ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора
Ключевые слова: бактериофаг, Acinetobacter baumannii, геномный анализ.
Данная работа посвящена микробиологической и молекулярно-генетической характеристике вирулентного бактериофага, специфически инфицирующего и лизирующего широкий
спектр клинических штаммов A. baumannii.
Введение. Одним из наиболее значимых возбудителей внутрибольничных инфекций
во всем мире является представитель группы неферментирующих грамотрицательных аэробных бактерий – Acinetobacter baumannii, который характеризуется резистентностью к большинству доступных на сегодняшний день антибиотиков, дезинфектантов, устойчивостью к
УФ-облучению и высушиванию, способностью к образованию биопленок на различных биотических и абиотических поверхностях. Инфекции, вызываемые A. baumannii, представляют серьёзную терапевтическую проблему, особенно у иммунокомпрометированных больных
ожоговых отделений, отделений реанимации и интенсивной терапии, где A. baumannii часто
становится причиной развития госпитальных пневмоний, раневых инфекций, постхирургических осложнений, бактериемий, септицемий, сепсиса (Peleg et al., 2008; Towner, 2009).
В связи с этим существует острая проблема поиска и разработки новых антибактери-
91
Биология фагов
альных средств, активных в отношение A. baumannii. Применение литических бактериофагов
– один из возможных путей решения данной проблемы. Однако в настоящее время, как в нашей стране, так и за рубежом, не существует препаратов бактериофагов для контроля внутрибольничных A. baumannii-инфекций. Это связано, в первую очередь, с отсутствием коллекций
перспективных фагов, которые могли бы быть использованы для разработки лечебных препаратов, а также с узким спектром антибактериальной активности известных литических фагов,
инфицирующих A. baumannii.
Материалы и методы исследований.
В работе использовали 130 штаммов A. baumannii, выделенных из клинического материала от госпитализированных больных в стационарах различного профиля городов Челябинска (n = 89), Нижнего Новгорода (n = 20), Москвы (n = 12), Санкт-Петербурга (n = 9) в 20052010 гг., а также бактерии других геномовидов Acinetobacter (n = 18) и бактерии других родов
и семейств: Pseudomonas aeruginosa (n = 5), Escherichia coli (n = 3), Yersinia pseudotuberсulosis
(n = 3), Yersinia enterocolitica (n = 3), Klebsiella pneumoniae (n = 3), Klebsiella oxytoca (n = 3),
Enterobacter cloacae (n = 3), Pasteurella multocida (n = 3) и Salmonella Enteritidis (n����������
���������
=��������
�������
3), полученные из коллекции НИИ антимикробной химиотерапии СГМА г. Смоленска и «ГКПМОболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.
Выделение бактериофагов, лизирующих бактерии рода Acinetobacter, из образцов
клинического материала и проб из окружающей среды, а также наработку, очистку и концентрирование фаголизата проводили, как описано ранее (Popova et al., 2012).
Для изучения спектра литической активности и биологических свойств бактериофага
использовали методы, предложенные М. Adams (1959), с нашими модификациями (Попова и
др., 2012, Dubrovin et al., 2012, Popova et al., 2012).
ДНК бактериофагов выделяли методом депротеинизации очищенных в градиенте хлористого цезия фаговых частиц с использованием лизирующей смеси, содержащей 0,5 % SDS,
Рис. 1 – Зоны лизиса бактериального «газона» штамма �����������������������
A����������������������
.���������������������
baumannii�����������
1053, формируемые фагом AP22 на плотной питательной среде: A. Морфология негативных колоний
фага с ореолами; Б. Пятно лизиса бактериофага, окружённое ореолом (наверху: через 18 ч
инкубации при температуре 37 ºС, внизу – через 30 ч последующего хранения при температуре 4 ºС)
92
Биология фагов
20 мМ ЭДТА и 50 мкг/мл протеиназы К. ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ (1:1)
и переосаждали этиловым спиртом с ацетатом натрия.
Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера на приборах ABI PRISM 310
(Applied BioSystem, США) и MegaBace (Amersham Biosciences, США) с программным обеспечением Cimarron 3.12.
Результаты исследований и их обсуждение.
В ходе анализа образцов клинического материала и проб из окружающей среды, был
выделен бактериофаг, получивший авторское название AP22, обладающий широким спектром
антибактериального действия по отношению к клиническим штаммам A. baumannii.
На культуре чувствительных бактериальных штаммов A. baumannii бактериофаг AP22
формирует круглые прозрачные негативные колонии с ровными краями, окружённые непрозрачными ореолами, которые увеличиваются в размере с течением времени (рис.1). В соответствии с морфологическими параметрами, согласно Международной классификации и таксономии вирусов, бактериофаг AP22 отнесен к семейству Myoviridae, морфотипу А1 (Popova
et al., 2012).
Бактериофаг AP����������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������
22 лизирует в общей сложности 68��������������������������������
�������������������������������
% (89 из 130) клинических штаммов A. baumannii и не обладает литической активностью по отношению к представителям других геномовидов Acinetobacter, а также бактериям других родов и семейств (Попова и др.,
2012).
В экспериментах по определению времени адсорбции и одиночного цикла размножения бактериофага AP22 показано, что более 99 % фаговых частиц адсорбируются в течение
5 мин, длительность латентного периода составляет 40 мин, средний выход фаговых частиц
в расчёте на одну инфицированную бактериальную клетку составляет 240 частиц, что свидетельствует о высокой урожайности исследуемого фага (Popova et al., 2012).
При изучении динамики инфекционного процесса фага AP22, установлено, что при
значениях множественности инфицирования (MOI), составляющих 50 и пять фаговых частиц
на одну бактериальную клетку, бактериофаг полностью лизирует жидкую культуру штаммахозяина через 60 мин после начала фаговой инфекции, в то время как при ������������������
MOI���������������
=0,5 лизис происходит через 2 ч.
На сегодняшний день многие вопросы, связанные с практическим использованием
бактериофагов, могут быть решены на стадии изучения фагового генома: это и тип развития
фага, и наличие генов, кодирующих потенциально опасные продукты, устойчивость к антибиотикам и т.д. Поэтому одна из задач наших исследований предусматривала определение
полной нуклеотидной последовательности бактериофага AP22. Секвенирование нуклеотидных последовательностей ДНК проводили с использованием метода Сэнгера. Геном бактериофага содержит 46387 п.н. с Г-Ц составом 37,74 % .
С помощью биоинформационных программ GeneMark.hmm и Soft-Berry FGENE в геноме фага AP22 было выявлено 89 открытых рамок считывания (ОРС), кодирующих предполагаемые пептиды размером не менее 35 а.о., из которых 77 ОРС располагаются на прямой,
12 – на обратной цепях ДНК.
При сравнении аминокислотных последовательностей потенциальных белков фага
AP22 с известными протеинами с помощью BLASTP, определены возможные функции 25 %
(22 из 89) из них; 60����������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������
% (54 из 89) ОРС кодируют гипотетические белки с неизвестными функциями, представленные в базах данных; предполагаемые продукты 15 % ОРС (13 из 89) не имеют
сходства с какими-либо фаговыми или бактериальными протеинами. Показано, что 18 % (16
из 89) ОРС AP22 кодируют полипептиды, обладающие гомологией с протеинами Acinetobacter
spp. с неизвестной функцией, 57 % (51 из 89) ОРС гомологичны фаговым протеинам.
93
Биология фагов
Сравнительный геномный анализ выявил существенную гомологию между бактериофагом AP22 и фагом AB1 (Yang et al., 2010) также инфицирующим A. baumannii: гомология
определена для 53 из 89 предполагаемых генов. Кроме того, по одному из предсказанных протеинов AP22 обладают гомологией с белками бактериофагов Staphylococcus 52A (ORF032),
Salmonella E1 и Burkholderia BcepC6B (gp36).
Геном бактериофага AP22 имеет модульную организацию и включает гены, кодирующие структурные протеины (белок капсида, белки хвостового отростка, базальной пластинки,
хвостовых фибрилл и выростов), ферменты, ответственные за лизис бактериальной клетки-хозяина (фаговый лизоцим – эндолизин и потенциальный холин) и компоненты системы репликации ДНК и нуклеотидного обмена (рис.2).
Следует подчеркнуть, что в геноме фага AP22 не идентифицировано ни одного гена,
кодирующего токсины или какие-либо известные факторы вирулентности. Кроме того, не выявлены гены, определяющие умеренный (лизогенный) путь развития бактериофага.
Рис. 2 – Геномная карта бактериофага AP22 с указанием функций предсказанных
белковых продуктов в геноме фага
Таким образом, на основании данных микробиологического, геномного и биоинформационного анализов бактериофаг �������������������������������������������������������
AP�����������������������������������������������������
22 можно рассматривать в качестве потенциального компонента препарата для лечения инфекций, вызванных A. baumannii, и использовать для иден-
94
Биология фагов
тификации бактерий данного вида при бактериологическом анализе клинического материала.
Библиографический список
1. Попова, А. В. Молекулярно-генетическая характеристика антибиотико-устойчивых
штаммов Acinetobacter baumannii и оценка их чувствительности к бактериофагу AP22 / А. В.
Попова, В. П. Мякинина, М. Е. Платонов, Н. В. Воложанцев // Мол. генетика, микpобиол.,
виpусол. – 2012. – № 4. – С. 18-22.
2. Dubrovin, E. V. Atomic force microscopy analysis of the Acinetobacter bau-mannii bacteriophage AP22 lytic cycle / E. V. Dubrovin, A. V. Popova, S. V. Kraevskiy, S. G. Ignatov, T. E.
Ignatyuk, I. V. Yaminsky, N. V. Volozhantsev // PLoS ONE. – 2012. – Vol. 7. – N 10. – e47348.
3. Peleg, A. Y. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen / A. Y. Peleg,
H. Seifert, D. L. Paterson // Clin. Microbiol. Rev. – 2008. – Vol. 21. – N 3. – P. 538-582.
4. Popova, A. V. Isolation and characterization of wide host range lytic bacteri-ophage AP22
infecting Acinetobacter baumannii / A. V. Popova, E. L. Zhilenkov, V. P. Myakinina, V. M. Krasilnikova, N. V. Volozhantsev // FEMS Microbiol. Lett. – 2012. – Vol. 332. – N 1. – P. 40-46.
5. Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy / K. J. Towner // J. Hosp.
Infect. – 2009. – Vol. 73. – N 4. – P. 355-363.
6. Yang, H. Isolation and characterization of a virulent bacteriophage AB1 of Acinetobacter
baumannii / H. Yang, L. Liang, S. Lin, S. Jia // BMC Microbiology. – 2010. – Vol. 10. – P. 131.
MICROBIOLOGICAL AND MOLECULAR GENETIC ANALYSES
OF PHAGE AP22 SPECIFICALLY INFECTING A WIDE RANGE OF
ACINETOBACTER BAUMANNII STRAINS
Popova A.V., Myakinina V.P., Bogun A.G., Volozhantsev N.V.
Key words: bacteriophage, Acinetobacter baumannii, genomic analysis.
The research is devoted to the microbiological and molecular genetic analyses of lytic phage
AP22 specifically infecting and lysing a wide spectrum of Acinetobacter baumannii clinical strains.
УДК 619
МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФАГА VB_EVOP_G7C
И РОДСТВЕННЫХ ЕМУ КОЛИФАГОВ С КЛЕТКАМИ ESCHERICHIA
COLI НА РАННИХ СТАДИЯХ ИНФЕКЦИИ
Прохоров Н.С., Куликов Е.Е., Голомидова А.К., Летаров А.В.
ФГБУН «Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН»
тел. +7 (499) 135 72 64; prokhoroff@gmail.com
Ключевые слова: N4-подобные бактериофаги, колифаги, взаимодействие вирусов с
клеткой, механизмы адсорбции бактериофагов, vB_EcoP_G7C
Работа посвящена анализу механизмов взаимодействия индигенных N4-подобных колифагов, прежде всего vB_EcoP_G7C, выделенных из симбиотического сообщества лошадей,
95
Биология фагов
с клетками E. coli на ранних стадиях инфекции. Было показано, что в этой группе реализуется нетипичный для Podoviridae механизм узнавания бактериальных клеток, при котором
короткие хвостовые фибриллы фага, представленные продуктами двух разных генов, играют
роль детерминант не только первичного, но и вторичного необратимого взаимодействия с
бактериальными клетками.
Введение
Бактериофаги – самые распространенные органические самовоспроизводящиеся объекты на Земле. Оценки их численности в биосфере колеблются от 1030 до 1032 вирусных
частиц, составляющих по крайней мере 108 отдельных видов. Легкость их изоляции и культивации в лабораторных условиях, сравнительно небольшие размеры геномов сделали их излюбленными объектами исследований генетиков и молекулярных биологов еще в первой половине XX века. Однако к настоящему времени фокус исследований бактериофагов сместился
от регуляции выражения генов и механизмов репликации вирусных геномов к поиску закономерностей взаимодействия вирусов с бактериальными клетками. Можно назвать две большие причины этой тенденции. С самого момента открытия бактериофаги рассматривались как
многообещающие кандидаты для терапии бактериальных инфекции. Последующее открытие
антибиотиков и развитие соответствующей индустрии, казалось, сняло этот вопрос с повестки
дня. Однако темпы возникновения штаммов патогенных микроорганизмов с множественной
лекарственной устойчивостью заставляют вновь всерьез рассматривать возможность терапевтического применения бактериофагов. С другой стороны, бактериофаги представляют заметную угрозу для любого биотехнологического процесса, оперирующего большой биомассой
прокариотических клеток, вызывая тотальный лизис бактерий в биотехнологических производствах. Обе проблемы самым непосредственным образом связаны с феноменом видовой и
штаммовой специфичности бактериофагов, определяющей спектр инфицируемых микроорганизмов, и феноменом возникновения резистентных к инфекции форм бактерий.
Результаты и обсуждения
В нашей лаборатории наряду с прочими микроорганизмами был изолирован ряд фагов,
отнесенный к немногочисленному роду N4-подобных вирусов на основании наличия геномных последовательностей, гомологичных ряду последовательностей генома фага N4, в частности, уникальному среди бактериофагов гену вирионной ДНК-зависимой РНК-полимеразы
[1]. Принадлежность изолятов к семейству Podoviridae дополнительно была показана с помощью электронной микроскопии. Один из этих фагов G7C был подвергнут полному геномному секвенированию (GenBank: HQ259105.1), геномы остальных фагов были секвенированы
частично. Анализ полученных последовательностей подтвердил близкое родство выделенных
фагов и N4 [2]. Так геном G7C воспроизводит характерные для рода консервативные аппараты
репликации и транскрипции. В то же время модуль, по всей вероятности ответственный за
взаимодействие вируса с бактериальными клетками, имеет довольно необычное для представителей Podoviridae устройство – две находящиеся в единой транскрипционной единице ОРС,
аннотированные как ОРС66 и ОРС63.1, кодируют последовательности частично гомологичные мономерам белков хвостовых фибрилл бактериофагов Det7, Vi01 и phiSboM-AG3 из семейства Myoviridae. Область гомологии ограничена N-концевыми доменами белков. Это весьма необычно, так как принято считать, что N-концевые домены хвостовых фибрилл отвечают
за прикрепление этих структур к вирусной частице, и должны быть консервативны в рамках
семейства ввиду принципиальных отличий в структуре хвостов представителей Podoviridae и
фагов с длинными хвостами. С-концевые и центральные домены предполагаемых белковых
продуктов не имеют гомологов в белковых базах данных. Однако продукты обеих ОРС содер-
96
Биология фагов
жат предсказанные разные по структуре и специфичности гидролитические домены.
Масс-спектрометрический анализ очищенных фаговых частиц подтвердил присутствие обоих белков в структуре вириона. Рекомбинантные белки gp66 и gp63.1, экспрессированные в E. coli, образуют растворимые гомотримеры, устойчивые к действию денатурирующих агентов. Это свидетельствует в пользу предположения, что они представляют собой
мономеры хвостовых фибрилл. Очищенный рекомбинантный белок gp63.1 специфически связывается с клетками штамма, чувствительного к G7C, но не связывается с клетками близких
штаммов E. coli, устойчивых к инфекции этим фагом. Избыток экзогенного рекомбинантного
gp63.1 в жидкой культуре чувствительного штамма полностью блокирует адсорбцию бактериофага на бактериальных клетках. В совокупности полученные данные позволяют предполагать, что продукт гена OPC63.1 связывается с клеточным рецептором, инициируя адсорбцию
вирусной частицы.
Получить рекомбинантный gp66, пригодный для металлоафинной хроматографии per
se, нам не удалось. Добавление олигогистидиновых последовательностей на N- и С-конец полипептида приводило к потери способности gp66 к тримеризации, что однозначно свидетельствовало о потере белком нативной конформации. Однако, эксперимент по проверке способности белков gp63.1 и gp66 к взаимодействию друг с другом увенчался успехом. При последовательном нанесении на металлоафинную колонку лизатов, содержащих gp63.1 с олигогистидиновой модификацией и интактный gp66, в элюате мы получили очищенный комплекс хвостовых фибрилл. Оценка молекуляной массы полученного комплекса методом гель-фильтрации
показала, что в состав комплекса входит по одному тримеру gp63.1 и gp66.
Эксперимент по инкубации очищенного комплекса фибрилл gp63.1 и gp66 с бактериальными клетками разных штаммов показал специфический характер связывания комплекса. Комплекс связывался только со штаммом, чувствительным к инфекции фагом G7C. Кроме
того, комплекс фибрилл gp63.1 и gp66, в отличие от очищенного рекомбинантного gp63.1, связывался с клетками необратимо. Следует отметить, что gp66 в отсутствии gp63.1 с клетками чувствительного штамма не взаимодействовал. Все это позволяет заключить, что gp63.1
представляет собой детерминанту первичного обратимого связывания бактериальных клеток,
а gp66 отвечает за необратимую фазу взаимодействия. Кроме того, судя по тому, что комплекс
успешно проходит первичные фазы взаимодействия и закрепляется на поверхности клетки,
можно уверенно предполагать, что адсорбционный аппарат G7C и родственных ему фагов целиком представлен продуктами генов ОРС66 и ОРС63.1.
Интересно, что фаг G7C отличается не только примечательно узким спектром хозяев.
но и высокой частотой возникновения устойчивых к нему клонов. Приблизительно 0.01% потомства любого случайного клона выращенного в жидкой культуре в отсутствие G7C выживает на агаре с высокой концентрацией бактериофага. Характер резистентности проверенных
нами клонов был адсорбционный. Фаг G7C оказывался не способен даже обратимо взаимодействовать с такими клетками. Анализ клеточных стенок канонического чувствительного штамма и резистентных субклонов показал существенные отличия структуры липополисахаридов
внешней мембраны. Примечательно, что один из выделенных нами N4-подобных бактериофагов Alt63, наиболее существенное отличие которого от G7C по результатам частичного секвенирования состоит в отсутствии гена ОРС63.1 и нахождение в этом локусе фагового генома
принципиально иной рамки считывания, оказывается способным преодолеть адаптации клонов, устойчивых к G7C. Так как фаги были изолированы из одной пробы, приведенные факты подтверждают предположение о наличие в природных популяциях с высокой плотностью
микроорганизмов динамичных и сложных взаимодействий между коэволюционирующими
штаммами бактерий и инфицирующими их бактериофагами.
97
Биология фагов
В нашей работе мы планируем провести дальнейшее исследование структуры и механизмов функционирования адсорбционного аппарата этих необычных вирусов, что, весьма
вероятно, приблизит нас к пониманию закономерностей взаимодействий бактериофагов и бактерий и механизмов возникновения форм бактерий, устойчивых к фаговой инфекции.
Библиографический список
1. Golomidova A, Kulikov E, Isaeva A, Manykin A, Letarov A. The diversity of coliphages
and coliforms in horse feces reveals a complex pattern of ecological interactions // Appl Environ
Microbiol. 2007. T. 73. №19. – C. 5975-81.
2. Kulikov E, Kropinski AM, Golomidova A, Lingohr E, Govorun V, Serebryakova M,
Prokhorov N, Letarova M, Manykin A, Strotskaya A, Letarov A. Isolation and characterization of a
novel indigenous intestinal N4-related coliphage vB_EcoP_G7C // Virology. 2012. T. 426. №2. – C.
93-9.
MECHANISMS OF INTERACTIONS OF VB_ECOP_G7C
BACTERIOPHAGE AND ITS RELATIVES WITH ESCHERICHIA COLI
AT EARLY STAGES OF INFECTION
Prokhorov N.S., Kulikov E.E., Golomidova A.K., Letarov A.V.
Key words: N4-related, coliphages, virus-host interactions, mechanisms of phage
adsorption, vB_EcoP_G7C
This paper is devoted to analysis of mechanisms of interactions between indigenous
intestinal N4-related bacteriophages, vB_EcoP_G7C mostly, and E. coli cells at early stages of
phage infection. It was elucidated that phages of that group utilize very unusual among podoviruses
mechanism of host recognition in which two types of short tail fibers serve sequentially as prime and
second receptor recognition proteins ensuring irreversible binding of a virus particle to bacterial cell
outer membrane.
УДК 619:578
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙТВА БАКТЕРИОФАГОВ CITROBACTER
Пульчеровская Л.П., кандидат биологических наук, доцент,
pulcherovskaya.lidia@yandex.ru
Ефрейторова Е.О.,аспирант
Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор,
Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпиа»
432017, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Ключевые слова: бактериофаги, негативные колонии, литическая активность,
специфичность бактериофагов, бактерии рода Citrobacter .
Изученные фаги бактерий рода Citrobacter��������������������������������������
�������������������������������������������������
имели колонии четырех типов, характеризовались различным спектром литической активности и явились специфичными по отно-
98
Биология фагов
шению к бактериям рода Citrobacter и не активны к представителям бактерий других родов
и семейств.
Особое место в этиологии массовых заболеваний новорожденных животных занимает
условно-патогенная микрофлора, которая в отличие от возбудителей «классических» инфекций (н-р: листериоза, лептоспироза и др.) ежедневно поступает с экскрементами клинически
здорового маточного поголовья (животных-бактерионосителей). К данной группе и относятся
бактерии рода Citrobacter.
Согласно литературным данным бактерии рода Citrobacter выделяются из фекалий
больных диареей сельскохозяйственных животных [5,6], являются причиной гибели диких животных[7],
Основой идентификации цитробактеров является изучение ферментативных свойств
и антигенной структуры. Бактериальная диагностика длительна и трудоемка. В связи с этим
возникла необходимость в поиске альтернативных методов лабораторной диагностики менее
трудоемких, более быстрых и доступных. Одним из таких методов является фагодиагностика
[1,2,3,4,9]. Для индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов необходимо иметь набор фагов с определенными биологическими свойствами.
Мы выделили бактериофаги из объектов окружающей среды Ульяновской и Самарской областей. Перед нами стояла задача – изучить основные свойства выделенных бактериофагов.
Материалы и методы. Материалом для исследований послужили 13 штаммов бактерий рода Citrobacter и 23 бактериофага бактерий рода Citrobacter. Чистые линии фагов получали по методике описанной И.М. Габриловичем (1992), С.Н.Золотухиным (1999).
При изучении свойств выделенных бактериофагов были использованы методы: определение морфологии, спектра литической активности и специфичности выделенных фагов
описанными М.Адамс (1961); В.Я.Ганюшкин (1988), С.Н.Золотухиным (1999).
Результаты проведенных исследований. В результате проведенных исследований
была изучена морфология 23 термостабильных расс фагов, обладающих способностью на индикаторных культурах цитробактера образовывать негативные колонии различных типов. Результаты представлены в таблице 1.
Из таблицы видно, что образовавшиеся колонии можно разделить на четыре типа: 1-й
– мелкие полупрозрачные с ровными краями до1 мм в диаметре; 2-й – прозрачные негативные
колонии до 2-3мм; 3-й – прозрачные негативные колонии 2-3 мм с зоной неполного лизиса
по периферии и 4-й – стерильные пятна 5,0-10,0 мм с зоной неполного лизиса по периферии,
ширина зоны 0,5-1 мм.
99
Биология фагов
Фаг
1.
Таблица 1 - Морфология негативных колоний выделенных бактериофагов
Бактериальная
культура Citrobacter
C.amalonaticus №2
Наличие негативных колоний или зон лизиса
Прозрачные негативные колонии, округлые с ровными
краями, 1,5-2,0
2.
C.amalonaticus №2
Прозрачные негативные колонии, с ровными краями, 5,0-8,0
3.
C.freundii № 9
Полупрозрачные негативные колонии с ровными краями,
0,5-1,0
4.
C.amalonaticus №11
Полупрозрачные негативные колонии с ровными краями,
5.
C.amalonaticus №11
0,5-10
6.
C.freundii №1
Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 2,0-2,2
7.
C.freundii №1
8.
C.diversus №4
9.
C.freundii №16
10.
C.amalonaticus
№ 11
Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 0,51,0
Полупрозрачные негативные колонии с ровными краями
1,0-1,3
Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 1,01,5
Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 0,51,0
Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 2,0-3,0 и
зоной неполного лизиса по периферии
Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 1,0-1,5
11.
C.amalonaticus №11
12.
C.freundii №1
13.
C.freundii №1
14.
C.diversus №4
15.
C.freundii №16
16.
С.amalonaticus №11
17.
C.freundii №1
18.
C.freundii №1
Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 1,01,2
19.
C.amalonaticus №2
Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 1,01,5
20.
C.freundii №9
21.
C.diversus №4
C.amalonaticus №11
22.
23.
C.freundii №16
Полупрозрачные негативные колонии с ровными краями,
0,5-1,0
Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 0,2-0,7
Прозрачные негативные колонии с ровными краями,1,0-1,5
Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 0,5
Прозрачные негативные колонии с ровными краями 1,0-1,5
Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 1,0
Прозрачные негативные колонии размером 3, 0- 10,0 и зоной
неполного лизиса 0,5-1,0.
Прозрачные негативные колонии с ровными краями,
2,5-4,0Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 2,0-2,5
Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 1,5-2,3
Для получения чистой линии фага проводили от 5 до 7 пассажей из изолированных
негативных колоний.
Выделенные бактерифаги обладали разной литической активностью. Литическая
активность бактериофагов оценивается по способности фага вызывать лизис бактериальной
культуры в жидких или плотных питательных средах и выражается это тем максимальным
100
Биология фагов
разведением, в котором исследуемый бактериофаг проявлял свое литическое действие. Результаты представлены в таблице 2.
Ульяновская
обл.
Ульяновская
обл.
Самарская обл.
Самарская
обл.
Таблица 2 -Литическая активность и место выделения фагов бактерий рода
Citrobacter
Место
Литическая активность
фаг
По Грациа
По Аппельману
выделения
1
3х109
10-3х10-4
2
3,2х109
10-3х10-4
9
3
1х10
10-5
4
1,5х109
10-4
6
5
2х10
10-3-10-4
6
2х108
10-6-10-7
8
7
1,6х10
10-5
8
2х108
10-8-10-9
8
9
3х10
10-7-10-8
10
2х108
10-4-10-5
9
11
2х10
10-6-10-7
12
2х109
10-5
8
13
1х10
10-7
14
1х108
10-6
8
15
6х10
10-6
16
1,3х109
10-7
9
17
2,3х10
10-7
18
4х108
10-5
7
19
1х10
10-3
20
2х108
10-3
7
21
2х10
10-3
22
5х108
10-6
8
23
4х10
10-6
Спектр литической активности является также характерной особенностью штаммов
фага и его используют для их идентификации [8].
Для изучения спектра литической активности 23 штаммов выделенных и селекционированных бактериофагов использовали 13 штаммов бактерий рода Citrobacter. Исследования
проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры. Опыты показали, что
изученные фаги характеризуются различным спектром литической активности. Результаты
представлены в таблице 3.
Видовая специфичность фагов используется широко в практике для дифференциации
бактерий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, сродством их к рецепторам лизируемых бактерий.
Определение видовой специфичности бактериофагов проводили на агаровых средах
путем нанесения фага на газон культуры.
Изучение специфичности цитробактерных бактериофагов проводили по отношению
к представителям других семейств и родов с использованием штаммов: E.coli - 46 штаммов,
Proteus spp.- 6 штаммов, Morganella spp.-6 штаммов, Klebsiella spp.- 4 штамма, Salmonella spp.6 штаммов, Enterobacter spp.- 4 штамма, Y.enterocolitica - 12 штаммов, Staphylococcus spp.-3
штамма, Streptococcus spp.-2 штамма, Pseudomonas aureginisa - 4 штамма, Bacillus cereus - 3
штамма.
101
Биология фагов
Таблица 3 - Спектр литической активности цитробактерных фагов по отношению к штаммам бактерий Citrobacter
Количество
Из них
№ лизируемых
% лизируемых
№ фага
испытанных чувствительных
штаммов
штаммов
штаммов
к фагу
1
13
3
2,11,10
23,1%
2
13
2
2,11
15,4%
3
13
1
9
7,7%
4
13
2
11,16
15,4%
5
13
3
16, 11,10
23,1%
6
13
5
1, 9, 4, 16,6
41,5%
7
13
5
1,4, 16,6,10
41,5%
8
13
5
1,4,16, 6,12
41,5%
1,4,16,6,
9
13
7
53,8%
101/57,11,12
10
13
6
2,9,16,7,12, 13
46,1%
11
13
3
1,7,11
23,1%
12
13
4
1,4,16,11
30,8%
13
13
4
1,4,16,6
30,8%
14
13
5
1,9,4, 16,6
41,5%
15
13
4
3,4,16,6
30,8%
16
13
2
11,10
15,7%
17
13
5
1,4,16,11,10
41,5%
18
13
5
1,4,16,7,10
41,5%
19
13
3
2,9,16
23,1%
16,1,
20
13
7
53,8%
11,8,101/57,12,7
21
13
5
1,4,16,6,7
41,5%
22
13
1
11
7,7
23
13
5
1,4,16,6,13
41,5%
В результате изучения специфичности цитробактерных бактериофагов по отношению
к представителям других семейств и родов установлено, что данные фаги не лизировали ни
одну из испытуемых культур. На основании полученных результатов можно сделать вывод, о
том, что выделенные фаги являются специфичными по отношению к бактериям рода Citrobacter и не активны к представителям бактерий других родов и семейств.
Библиографический список
1. Адамс М. Бактериофаги. – Москва, 1961. – с. 15-44.
2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. // -М.: Медгиз. –1961. –297С.
3.Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. Учебное
пособие. – Ульяновск, 1988. – с. 45-49.
4. Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Бактерии рода Citrobacter и их
бактериофаги // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сборник научных трудов, Ульяновск, - 2000. - С. 53-58.
5. Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение и селекция бактериофагов рода Citrobacter. //Вестник ветеринарии., Выпуск V., Оренбург, - 2002. - С. 85-88.
6. Воронин Е.С., Дервишов Д.А. и др. Этиология и профилактика желудочно-кишеч-
102
Биология фагов
ных заболеваний телят // Вестник сельскохозяйственной науки. – 1989. - №9. – С.105-110.
7.Мищенко В.А. и др. Некоторые аспекты патогенеза диареи новорожденных телят //
Ветеринария. - 1999. - №9. – С. 20-23.
8. Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Кирьянова Н.А., Васильев Д.А. Выделение
фагов бактерий рода Citrobacter из объектов внешней среды и патологического материала
//«Вестник УГСХА», Сборник научных трудов, Ульяновск, - 2002. - С. 29-32.
9. Золотухин С.Н. Бактериофаги M.morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят // Автореферат дис. канд. вет. наук. - Ульяновск, 1994.
10. Изучение основных биологических свойств бактериофагов ������������������������
Bordetella��������������
�������������
bronchiseptica, выделенных методом индукции / Д.А. Васильев [и др.] // Вестник УГСХА. – 2011. - №1(13)
– С. 59-63
BIOLOGICAL PROPERTIES OF BACTERIOPHAGES CITROBACTER
Pulcherovskaya L.P., Еfreytorova Е.О., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.
Кey words: bacteriophages, negative colony, lytic activity, specificity of bacteriophages,
bacteria of the genus Citrobacter .
Studied phages of bacteria of the genus Citrobacter had colonies of four types, characterized by a diverse range of lytic activity and specific in regard to bacteria of the genus Citrobacter and
non-active to the representatives of bacteria of other genus and families.
УДК 619:579
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ
БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER
Пульчеровская Л.П., кандидат биологических наук, доцент,
pulcherovskaya.lidia@yandex.ru
Ефрейторова Е.О.,аспирант
Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор,
Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпиа»
432017, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.
Ключевые слова: Бактериофаги, электронная микроскопия, вирион, бактерии рода
Citrobacter, морфология фагов.
В соответствии с морфологическими параметрами изучаемые нами фаги бактерий
рода Citrobacter����������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������������������
№1, №2 и №3 согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride , а по классификации А.С. Тихоненко - к V морфологической группе: “Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению”
Бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную, широко распростра-
103
Биология фагов
ненную в биосфере и, предположительно, наиболее эволюционно древнюю группу вирусов. В
природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии.
[6]
Предположение, что бактериофаги имеют корпуску­лярную природу, было высказано
еще д’Эреллем на осно­вании их способности образовывать на бактериальных газонах собственные негативные колонии ограниченных разме­ров. Позже это предпо­ложение было подтверждено при иссле­довании очищенных фагофильтратов в темном поле микроскопа, при их
ультрацентрифугировании и ультрафильтрации через специаль­но градуированные коллодийные фильтры. Но только изобретение электронного микроскопа позволило увидеть фаги. Так,
уже в на­чале 40-х годов X. Руска (Н. Ruska�������������������������������������������������
������������������������������������������������������
) показал, что в фаголизатах дизентерийных бактерий, кишечной палочки, протея, стафилококков и стрептококков содержатся осо­бые тельца,
состоящие из головки и более или менее длинного хвоста. [4,7]
Дальнейшее усовершенствование электронного микро­скопа с постоянным повышением его разрешающей спо­собности дало возможность многим исследователям более точно
уяснить общую морфологию различных фагов, изу­чить отдельные детали их структуры и процессы размно­жение в бактериальной клетке. Особенно ценным в этом отношении явилось
применение методов так называемого негативного контрастирования препаратов с помощью
растворов фосфорно-вольфрамовой кислоты, урацил-ацетата и некоторых других веществ, а
также получение ультратонких срезов зараженных фагами бактериальных клеток. Очень полезным для изучения фагов в процессе их взаимодействия с бактериями явилось применение
сканирующего электронного микроскопа, дающего осо­бо рельефные изображения.
С помощью электронного микроскопа установлено, что фаг состоит из головки и отростка (хвоста). Размеры фагов колеблются от 20 до 200 им. Отросток состоит из внутреннего
стержня и наружного сокращающегося футляра. На дистальном конце отростка расположена
базальная пластинка с зубцами, от которых отходят длинные нити. Базальная пластинка и нити
осуществляют процесс адсорбции частицы фага на бактериальной клетке. [4]
Материалом для электронно-микроскопических исследований использовали лизаты
бульонных культур C. freundii № 9, C. freundii № 16 и C. amalonaticus № 11 с бактериофагами
№1, №2, №3 в титре от 3 х 109 до 4 х 109 фаговых корпускул в 1 мл (по Грациа), выделенные
нами бактериофаги бактерий рода Citrobacter из сточных вод Ульяновской и Самарской областей.
Подготовку препаратов для электронной микроскопии проводили осаждением вирусных частиц в режиме низкоскоростного центрифугирования. В процессе центрифугирования
вируссодержащей суспензии происходит образование новой фазы - осадка из белковых макромолекул. Захват осадком вирусных частиц, которые сами по себе в данных условиях осадков
не образуют, характеризуется как метод концентрирования за счет соосаждения.
С этой целью суспензии фага в объёме 1 мл предварительно осветляли на центрифуге
при 500 g в течение 10 мин. Затем надосадочную водную фазу повторно центрифугировали
при 2000 g в течение 30 мин. Из пробирки полностью сливали жидкость, а образовавшийся
осадок ресуспендировали в 30-50 мкл буферного раствора рН 7,3-7,5. Вирусные частицы, соосаждаясь с белковыми макромолекулами, в данном режиме центрифугирования образуют концентрированную суспензию в 10-20 раз. Данная методика отработана для работы с вирусами
животных и успешно применяется при подготовке препаратов для электронной микроскопии
(Пономарев, Андреева, Артамонова, 2002).
Вирусные препараты наносили на поддерживающие угольно-парлодионовые пленкиподложки для электронно-микроскопических исследований. Контрастирование вирионов проводили с использованием 4% раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты рН 6,8. Исследова-
104
Биология фагов
ния проводили на электронном микроскопе JЕМ-100В (Япония). Размеры вирионов определяли на измерительном микроскопе МИР-12т непосредственно с негативных фотопластинок. В
результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фага имеют структуры,
состоящие из головки в форме растянутого многогранника с отростком. У основной массы вирионов чехол находится в растянутом состоянии, что характерно для интактных частиц. Чехол
отростка на всем протяжении прямой и имеет цилиндрическую форму.
Единичные вирионы имеют отросток в сокращенном состоянии, то есть чехол отростка укорачивается и расширяется. При этом просматривается внутренний стержень отростка.
Вирусные частицы фагов №2 и №3 имеют следующие размеры: диаметр головки: 100 нм и
длина отростка – 135 нм. Отношение высоты головки к её диаметру у фагов равно 1,28, что
позволяет заключить о растянутости многогранника частиц данных фагов. Корпускулы фага
№1 имеют более симметричную головку, её длина равна 74 нм, диаметр 68 нм. Отношение
высоты головки к её диаметру равно 1,08. Длина отростка 115 нм и длина сокращённого чехла
отростка 60 нм.
Вирусные частицы выделенных нами бактериофагов имеют форму аналогичную фагам, изученным Т.А. Хакешевой с соавт. (1985).
Таким образом, в соответствии с морфологическими параметрами изучаемые нами
фаги №1, №2 и №3 согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride [8], а по классификации А.С. Тихоненко - к V морфологической
группе: “Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению” [5]. К
названной группе относятся ДНК-содержащие фа­ги булавовидной формы, но имеющие мощный отросток сложного строения. Он состоит из наружного сокращающегося чехла, внутреннего жесткого полого стержня и хорошо выраженной базальной пластинки. Последняя в свою
очередь имеет ряд элементов типа выростов с ши­пами или зубьями на концах и почти у всех
фагов снабжена длинными нитями. При сокращении чехол отростка расширяется и укорачивается, обнажая дистальный ко­нец внутреннего стержня, который может проникать че­рез клеточную стенку бактерий. У некоторых фагов пя­той группы, кроме перечисленных элементов,
обнаруже­ны дополнительные структуры в виде воротничка или муфты в месте прикрепления
отростка к головке и т. п. [1,2,3,6]
Морфология исследуемых фагов представлена на рисунках 1, 2 и 3.
Рис. 1 - Электронная микрофотография. Морфология бактериофага С-52 УГСХА
х 167 000
105
Биология фагов
Рис. 2 - Электронная микрофотография. Морфология бактериофага С-61 УГСХА
х 167 000
Рис. 3 - Электронная микрофотография. Морфология бактериофага С-66 УГСХА
х 167 000
Библиографический список
1. Ляшенко Е. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов
Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата // Автореферат дис. канд. вет. наук. Саратов, 2006.
2. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Escherichia coli О157 и их применение в диагностике // Автореферат дис. канд. биол.
наук. - Саратов, 2004.
3. Пульчеровская Л.П.. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике // Автореферат дис. канд. вет. наук. Саратов, 2004.
4. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике // – Киев:
Урожай, - 1978. – С. 88.
106
Биология фагов
5. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий //М.: Наука, 1968. – С. 89 .
6. Феоктистова Н.А. Выделение и изучение биологических свойств фагов бактерий
рода ������������������������������������������������������������������������������������
Proteus�����������������������������������������������������������������������������
, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров его практического применения // Автореферат дис. канд. вет. наук. - Саратов, 2006.
7. Хакешева Т.А. Фаги цитробактера // Автореферат канд. дис. – М. – 1985.
8. Murphy F.A. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses // Spingerverlad Wien New York. – 1995. – P. 586.
ELECTRON MICROSCOPY OF ALLOCATED BACTERIOPHAGES OF
BACTERIA OF THE GENUS CITROBACTER
Pulcherovskaya L.P., Еfreytorova Е.О., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.
Кey words: bacteriophages, electronic microscopy, virion, bacteria of the genus Citrobacter, morphology of phages.
In accordance with the morphological parameters the studied phages of bacteria of the genus Citrobacter №1, №2 and №3 according to the International classification and nomenclature of
viruses belong to the family Myoviride , and on the classification of A.S. Tikhonenko - to V morphological group: “Phages with the outgrowth of complex structure, whose pouch is able to contract ”
УДК 578: 615.03
ВЫДЕЛЕНИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
И ЛЕЧЕБНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ БАКТЕРИОФАГА ЕСD4
ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
ESCHERICHIA COLI О104:H4-ИНФЕКЦИИ.
Светоч Э.А.*, доктор ветеринарных наук, профессор,
тел. (4967)-36-00-79; svetoch@obolensk.org
Веревкин В.В.*, кандидат медицинских наук,
Воложанцев Н.В.*, кандидат биологических наук,
тел. (4967)-36-01-47; nikvol@obolensk.org
Борзилов А.И.*, кандидат медицинских наук,
тел. (4967) 36 01 47, borzilov@obolensk.org
Борзенков В.Н.*, кандидат медицинских наук,
Коробова О.В.*, кандидат медицинских наук,
Комбарова Т.И.*,
Красильникова В.М.*, кандидат биологических наук, Мякинина В.П.*,
Баннов В.А.*,
Денисенко Е.А.*,
Теймуразов М.Г.*, кандидат биологических наук,
Коровкин С.А.**, доктор медицинских наук, профессор,
тел.(495) 917-41-49, korovkin09@mail.ru
107
Биология фагов
Дятлов И.А.*, чл.-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор,
тел. (4967) 36 00 03, dyatlov@obolensk.org
*ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии»
Роспотребнадзора
**НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН
Ключевые слова: Escherichia�����������������������������������������������������
coli, шига-токсин, бактериофаг, мыши ���������������
Balb�����������
/����������
c���������
, литическая активность фагов.
Изучены свойства бактериофага ЕСD4, активного против эпидемического шигатоксин продуцирующего штамма E��������������������������������������������������
���������������������������������������������������
.со�����������������������������������������������
li���������������������������������������������
серотипа O104:������������������������������
H�����������������������������
4, некоторых ЕНЕС-штаммов серотипа О157:Н7 и других клинически значимых эшерихий и шигелл. Установлено, что бактериофаг персистирует определенное время в организме интактных мышей линии Balb/c и
в 6-8 раз снижает концентрацию E. соli O104:H4 в кишечнике инфицированных мышей. Обсуждаются пути повышения лечебной эффективности фагов при экспериментальной E.соli
O104:H4-инфекции.
Введение
Шига-токсин продуцирующие Escherichia coli (����������������������������������
STEC������������������������������
) вызывают у человека потенциально летальные заболевания с широким спектром клинических проявлений: от банальной
легкой формы диареи до тяжелого геморрагического колита (ГК), осложненного гемолитикоуремическим синдромом (ГУС) и тромботической тромбоцитопенической пурпурой [1 - 3].
Основными возбудителями STEC-инфекций является группа энтерогеморрагических
E.coli (ЕНЕС), принадлежащих к серотипу О157:Н7 (ведущий патоген) и к серогруппам 026,
055, 091, 0103, 0111, 0113, 0121, 0145, реже другим. 21 мая 2011 года в Германии появились сообщения об эпидемической вспышке заболевания, вызванного шига-токсин продуцирующим
штаммом E.соli серотипа O104:����������������������������������������������������������
H���������������������������������������������������������
4 [4]. В течение последующих двух месяцев в странах Европейского Союза (преимущественно в Германии), а также в США, Канаде и Швейцарии было
зарегистрировано более 4000 случаев заболевания, связанного с этим возбудителем, причем
в 773 случаях болезнь сопровождалась симптомами гемолитико-уремического синдрома. За
время STEC-эпидемии погибло 54 человека [5].
Причиной описанной STEC-вспышки во всех странах явился новый уникальный
штамм E.соli O104:H4, сочетающий в себе факторы вирулентности энтероаггрегативных
(EAggEC) и энтерогеморрагических (ЕНЕС) эшерихий. Кроме того, эпидемический штамм
E.соli O104:H4 был устойчив к большой группе антибиотиков: ампициллину, амоксициллину/
клавуланату, пиперациллину/сульбактаму, пиперациллину/тазобактаму, цефураксиму, цефураксим-аксетилу, цефокситину, цефотаксиму, цефразидиму, цефподоксиму, стрептомицину, налидиксовой кислоте, татрациклину, триметоприму/сульфаметаксозолу. Штамм E.соli O104:H4
является носителем плазмидных генов bla CTX-M-15 и bla TEM-1.
Высокий процент случаев ГУС, отмеченный при вспышке E.coli О104:H4-инфекции
в Германии (22 %), а также высокая смертность среди больных с ГУС (свыше 4 %) свидетельствуют о серьезных проблемах в лечении этой инфекции, связанных с низкой эффективностью
антибиотикотерапии. Более того, применение антибиотиков может усугублять течение болезни [6].
В данной ситуации остро встает вопрос о поисках альтернативных методов профилактики и антимикробной терапии E.coli О104:H4-инфекции. Вполне оправдано, что одним из
таких подходов может стать использование специфических бактериофагов [5, 7].
Цель работы – поиск и характеристика литических бактериофагов, активных против
108
Биология фагов
эпидемического штамма E.coli О104:H4, изучение их профилактической и лечебной эффективности на экспериментальной мышиной модели E.coli О104:H4-инфекции.
Материалы и методы исследования
Для выделения бактериофагов и характеристики их литической активности использовали индикаторные штаммы эшерихий различных серогрупп, а также штаммы Escherichia
coli К12 С600, E. coli М17, Shigella sonnei, Shigella flexneri и Shigella dysenteriae. Штамм
Escherichia coli О104:H12 SS513 (далее E.coli О104:H12), не продуцирующий шига-токсинов,
получен из института им. Л.И. Тарасевича (г. Москва). Штамм E.coli О104:H4 №112027 Stx
(далее E.coli О104:H4) выделен от больного ГК при пищевой вспышке в 2011 г. в Германии и
любезно предоставлен д-ром Альфредо Каприоли (Европейская референс-лаборатория E.coli,
Институт санитарии, г. Рим, Италия). Штамм продуцирует шига-токсин типа 2 и устойчив к
бета-лактамным антибиотикам, стрептомицину, налидиксовой кислоте, тетрациклину, триметоприму/сульфаметоксазолу.
Бактериальные культуры выращивали при 37°С в течение 18-24 ч на плотной и жидкой питательных средах ГРМ (ФБУН ГНЦ ПМБ).
Вирулентные фаги, активные против E.coli О104:H4, выделяли из образцов подстилки
и фекалий бройлерной птицы на птицефабриках Московской и Калужской областей. Бактериофаги идентифицировали с помощью спот-теста и последующего титрования на чувствительных штаммах E.coli К12 С600, E. coli О104:H12 и E.coli О104:H4. «Чистые» линии фагов
получали из изолированной негативной колонии после трех последовательных пересевов на
газоне чувствительного штамма. Специфичность и спектр антибактериального действия фагов
определяли методом спот-тестирования и стандартным двухслойным методом с использованием индикаторных штаммов.
Фаговую ДНК выделяли из обработанного протеиназой К фаголизата на колонках
фирмы QIAGEN (QIA-amp DNA Midi Kit).
Фармакокинетику – продолжительность персистирования бактериофага ЕС���������
D��������
4 изучали на мышах линии Balb/c массой 17-20 г. В эксперимент было взято 4 группы животных (по
6 особей каждая). Мышам первых двух групп натощак внутрижелудочно вводили фаг по 0,5
мл с концентрацией 1×107 и 1×109 БОЕ/мл, соответственно, мыши третьей группы получали бактериофаг с питьевой водой. Через 1,5; 3, 6, 9, 12, 24, 36 и 48 ч после введения фага от
каждой мыши отбирали фекалии (по 0,1 г), помещали их в пробирку с 1 мл SM буфера и 20
мкл хлороформа. Компоненты интенсивно встряхивали 20 мин, взвесь центрифугировали при
16000 g в течение 10 мин и из полученного центрифугата готовили десятикратные разведения.
Количество фаговых частиц в образцах определяли нанесением 10 мкл каждого разведения на
газоны E.coli К12 С600 с последующим подсчетом негативных колоний фага ЕСD4.
Четвертую группу мышей через 1, 3, 9 и 12 часов (по три мыши на каждый срок) после внутригастрального введения фага ЕСD4 (~ 2×109 БОЕ) умерщвляли с помощью СО2, и в
крови, селезенке и печени каждой особи определяли наличие фаговых частиц.
Профилактическую и лечебную эффективность фага ЕС���������������������������
D��������������������������
4 оценивали на экспериментальной мышиной модели (мыши линии Balb/c) E.coli О104:H4-инфекции, которая обеспечивала стабильную колонизацию кишечника животных в концентрации не менее чем 1×108 КОЕ
патогена на 1 г содержимого. В эксперименте использовали 24 мыши, которые были разделены
на 3 группы: опытную и две контрольные. Животные всех трех групп, начиная с первого дня и
на протяжении всего эксперимента, получали с питьевой водой стрептомицин (5 г/л) для подавления других, кроме E.coli О104:H4, представителей рода Escherichia. Начиная со второго дня
и в течение всего срока эксперимента (7 дней) мыши опытной группы получали бактериофаг
ЕСD4 с питьевой водой (~ 2×108 БОЕ/мл). Мыши первой контрольной группы бактериофаг не
109
Биология фагов
получали (контроль колонизации кишечника штаммом E.coli О104:H4). На третий день эксперимента животные опытной и первой контрольной групп интрагастрально заражали штаммом
E.coli О104:H4 в дозе 1×109 КОЕ/особь. Третья контрольная группа мышей оставалась не зараженной, но получала бактериофаг по той же схеме, что и опытная группа. На 1, 2, 3, 6 и 7
сутки после заражения у мышей всех экспериментальных групп, опытной и двух контрольных,
отбирали образцы фекалий и определяли в них концентрацию бактериофага ЕСD4 и клеток
E.coli О104:H4. В последнем случае высев фекалий и подсчет колоний патогена проводили на
питательном агаре и среде Эндо со стрептомицином (50 мкг/мл). Принадлежность выросших
культур бактерий к серотипу E.coli О104:H4 подтверждали в реакции латекс-агглютинации и
методом ПЦР в соответствии с Методическими указаниями [8].
Результаты и их обсуждение
В результате проведенного поиска из образцов фекалий и подстилки бройлерной птицы удалось выделить семь «чистых» линий бактериофагов, обладающих литической активностью против шига-токсин продуцирующего эпидемического штамма E.coli О104:H4 и штамма
E.coli О104:H12. Свойства одного из фагов – фага ЕСD4, как наиболее перспективного, были
изучены более подробно.
Батериофаг ЕСD4 способен подавлять рост бактерий штамма E.coli О104:H4 до восьмого десятикратного разведения при титровании по Аппельману. Кроме того, фаг обладает
литической активностью по отношению к некоторым шига-токсин продуцирующим штаммам E.coli О157:H7, клинически значимым эшерихиям других серогрупп, а также бактериям S.sonnei и S.flexneri – возбудителям дизентерии человека. Вместе с тем, фаг не подавляет
рост бактерий непатогенного для человека штамма E.coli М17, используемого для приготовления пробиотического препарата «Колибактерин», но может быть размножен на непатогенном
штамме E.coli К12 С600, что значительно упрощает крупномасштабную наработку данного
бактериофага.
На чувствительном бактериальном штамме бактериофаг ЕС�����������������������
D����������������������
4 формирует мутные негативные колонии диаметром около 1 мм; вторичный рост клеток-хозяина в зоне лизиса отсутствует. Геном фага представлен двухнитевой ДНК размером около 60 тыс. пар оснований.
ДНК не гидролизуется ферментами SalG1, PstI, EcoRI, BamH1, HindIII, ApaI, KpnI, Eco1471,
Eco521, Eco1301, MvaI. Эндонуклеаза SmiI расщепляет ДНК фага ЕСD4 на три фрагмента,
два из которых имеют размер 700 и 3000 пар оснований, ����������������������������������
BcuI������������������������������
расщепляет ДНК на шесть фрагментов, EcoRV - на 15, XmiI - на 18, VspI - на 20 фрагментов. В фаговом геноме не выявлено
генов синтеза шига-подобных токсинов и других факторов вирулентности, характерных для
бактерии-хозяина.
Как показали наши исследования, фаг ЕС���������������������������������������
D��������������������������������������
4 способен определенное время циркулировать в организме мышей, свободном от клеток-хозяина. Продолжительность персистирования этого фага в кишечнике интактных животных после внутригастрального введения вируса
в дозе ~ 1×107 БОЕ/особь составляла не менее 24 часов. При введении мышам фага в большей
дозе (1×109 БОЕ) вирусные частицы у отдельных особей выделяли через 36 час. Через 48 часов
фаг из фекалий изолировать не удавалось.
При доставке фага ЕСD4 мышам с питьевой водой (2×108 БОЕ/мл) вирус обнаруживали в фекалиях через 24 ч. после его введения, в более поздние сроки фаг не выявляли.
При внутригастральном введении мышам фага ЕСD4в дозе ~ 1×109 БОЕ/особь вирусные частицы проникали из желудочно-кишечного тракта в кровь и паренхиматозные органы
животных и определенное время персистировали в них. В крови и селезенке фаговые частицы
у отдельных особей обнаруживали через 12 час, в печени – лишь через час после его введения.
Таким образом, фаг ЕС�������������������������������������������������������
D������������������������������������������������������
4 обладает важным свойством лечебного фага – способно-
110
Биология фагов
стью персистировать определенное время в организме животного, длительность которого зависит от дозы фага и способа его доставки в организм.
Результаты эксперимента по изучению профилактической эффективности бактериофага ЕСD4 показали, что предварительное, еще до заражения, выпаивание фага животным
в течение суток не предотвращало колонизацию кишечника мышей линии Balb/c штаммом
E.coli О104:H4 (мышей заражали интрагастрально на 3-ий день после начала эксперимента в
дозе ~ 1×109 КОЕ/особь). Тем не менее, концентрация возбудителя в кишечном содержимом
мышей опытной группы, получавших с водой фаг ЕСD4, была в разы ниже, чем у животных
контрольной группы, которая бактериофаг не получала: на 1, 2, 3, 6 и 7 сутки после заражения
количество E.coli О104:H4 в расчете на 1 г фекалий было ниже у опытных по сравнению с контрольными животными соответственно в 5,9; 6,5; 6,7; 8,4 и 7,8 раз. В те же сроки бактериофаг
ЕС��������������������������������������������������������������������������������
D�������������������������������������������������������������������������������
4 обнаруживали в фекалиях опытной (леченой) группы мышей в значительных концентрациях: от ~ 1×107 до 1×108 БОЕ/г, т.е. фаг активно репродуцировался в кишечнике зараженных животных. Напротив, у мышей контрольной группы, которая получала фаг с питьевой
водой в течение 7 дней, но не заражалась E.coli О104:H4, концентрация фага была значительно
ниже, чем в опытной группе.
Низкая профилактическая лечебная эффективность фага ЕСD4, полученная нами на
экспериментальной мышиной модели E.coli О104:H4-инфекции, на фоне активного размножения его в кишечнике зараженного животного, скорее всего, объясняется образованием клетками штамма E.coli О104:H4 биопленки, которая, как известно, может существенно влиять на
взаимоотношения фага с клеткой-хозяином.
Решение задачи повышения лечебной эффективности фаговых препаратов против
E.coli О104:H4-инфекции, по-видимому, лежит в области поиска специфических фагов, способных разрушать биопленки в кишечнике макроорганизма, либо применение коктейля фагов
с такими свойствами.
Изучение фага ЕС����������������������������������������������������������
D���������������������������������������������������������
4, способного лизировать шига-токсин продуцирующие эшерихии, другие патогенные E.coli и шигеллы будет продолжено. Особое внимание будет уделено
вопросам использования его для деконтаминации продуктов питания и объектов внешней среды от опасного для человека патогена E.coli О104:H4, поскольку именно этот путь представляется на сегодня, когда еще не ясен природный резервуар и источник возбудителя, наиболее
реальным и безопасным.
Библиографический список
1. Caprioli, A. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and
modes of transmission / A. Caprioli, S. Morabito, H. Brugère, E. Oswald // Vet. Res. - 2005. – Vol.
36. – P. 289-311.
2. Karmali, M.A. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli / M.A. Karmali //
Clin. Microbiol. Rev. - 1989. – Vol. 2. – P. 15–38.
3. Karmali, M.A Association of genomic O island 122 of Escherichia coli EDL 933 with
verocytotoxinproducingEscherichia coliseropathotypes that are linked to epidemic and/or serious
disease / M.A. Karmali, M. Mascarenhas, S. Shen, K. Ziebell, S. Johnson, R. Reid-Smith, J. IsaacRenton, C. Clark, K. Rahn, J.B. Kaper // J. Clin. Microbiol. - 2003. – Vol. 41. – P. 4930-4940.
4. Soon, J.M. Escherichia coli O104:H4 outbreak from sprouted seeds / J.M. Soon, P. Seaman, R.N. Baines // Int J Hyg Environ Health – 2012 - Aug 13. [Epub ahead of print]
5. Merabishvili,������������������������������������������������������������������������������
M����������������������������������������������������������������������������
, De Vos, D., Verbeken, G, et al. ������������������������������������������
Selection and characterization of a candidate therapeutic bacteriophage that lyses the Escherichia coli O104:H4 strain from the 2011 outbreak
in Germany // PLOS ONE.-2012.-Vol.7.- Iss.12. –P.e52709
111
Биология фагов
6. Michael M, Elliott EJ, Ridley GF, Hodson EM, Craig JC. Interventions for haemolytic
uraemic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura. Cochrane Database Syst Rev. -2009.CD003595.
7. Damien Maura, Eric Morello, Laurence du Merle, Perrine Bomme, Chantal Le Bouguénec, Laurent Debarbieux. Intestinal colonization by enteroaggregative Escherichia coli supports longterm bacteriophage replication in mice/ // Environment. Microbiol. -2011.– Vol.14.-P.1844-1854
8. Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых
Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (����������������������������������������
STEC������������������������������������
-культуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах// МУК 4.2.2963-11// Москва, 2011
BACTERIOPHAGE ECD4: ISOLATION, CHARACTERIZATION
AND ESTIMATION OF THE TREATMENT EFFECT AT EXPERIMENTAL
ESCHERICHIA COLI O104:H4‑INFECTION
Svetoch E.A., Verevkin V.V., Volozhantsev N.V., Borzilov A.I., Borzenkov V.N.,
Korobova O.V., Kombarova T.I., Krasilnikova V.M., Myakinina V.P., Bannov V.A.,
Denisenko E.A., Teimurazov M.G., Korovkin S.A., Dyatlov I.A.
Key words: Escherichia coli, Shiga-toxin, bacteriophage, Balb/c mice, lytic activity
Characteristics of bacteriophage ECD4 lytic for Shiga-toxin producing Escherichia coli
O104:H4, some EHEC O157:H7 strains and other clinical E. coli strains; and some Shigella strains
were determined. It was shown that the phage persists for some time into the body of non-infected
mice Balb/c and decreases on 6-8 times the level of the pathogen into infected mice intestinal. The way
for the increasing of the bacteriophages treatment effect at experimental E. coliO104:H4 infection is
discussed.
УДК 578.81
ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИИ ФАГОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ
БАКТЕРИЙ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В АГРОЦЕНОЗАХ УКРАИНЫ
Семчук Л. И., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник,
Lidia_Semchuk@univ.kiev.ua
Постоенко Е.М., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Ромашев С. А., старший инженер,
ОНЦ «Институт биологии» Киевский
национальный университет имени Тараса Шевченко, тел. +38-044- 521-35-02.
Ключевые слова: Бактериофаги, экология, фитопатогенные бактерии, нуклеиновые кислоты, рекомбинанты
Изучали экологию фагов фитопатогенных бактерий четырнадцати штаммов родов
Xanthomonas, Erwinia и Pseudomonas . Фаги, в отдельном биоценозе, удавалось обнаружить
ко всем тестовым штаммам, при проведении ряда последовательных отборов проб. В то же
112
Биология фагов
время, в биологических образцах, отобранных на Украинской антарктической станции, обнаружены инфекционные фаги на тестовых бактериях. При этом, пробы, смытые с жабр рыб
Черного моря, имели только литическую активность, без репродукции.
Показано, что резистентные к штаммам X. axonopodis pv. beticola IMV 7325, P.
syringae pv. atrofaciens IMV 1025, P. syringae pv. tabaci IMV 223, E����������������������������
�����������������������������
. ��������������������������
carotovora����������������
���������������
IMV������������
216 (������
Pectobacterium� ���������������������������������������������������������������������������
carotovorum����������������������������������������������������������������
) фаги образовывали рекомбинанты, способные лизировать новых хозяев. Сравнение геномов моноспецифичных фагов P. atrofaciens IMV 1025, из полевой коллекции, с лабораторными рекомбинантами, показало, что профили разделения фрагментов ДНК
HindIII всех образцов идентичны.
Указанные свойства фагов важно учитывать при их практическом применении, в
частности, искусственном внесении в экосистему.
При построении экологических пирамид, у их основания размещают микроорганизмы
и вирусы. Среди них вирусы бактерий, являются самыми многочисленными биологическими
объектами на Земле [1], изучению роли которых не уделяется должного внимания. Данная
работа представляет собой обобщение исследований, проведенных на протяжении продолжительного периода времени в лаборатории кафедры вирусологии Киевского национального
университета имени Тараса Шевченко. Исследования были направлены на изучение особенностей экологии фагов активных против фитопатогенных бактерий, циркулирующих в агроценозах Украины.
В литературе нет данных об изменении числа бактерий на поверхности растений в
биоценозах под влиянием фагов. Подобные данные приводятся для водных систем, где под
влиянием фагов за сутки погибает до 20% бактерий, присутствующих в экосистеме [2]. Можно предположить, что в растительных биоценозах они также играют важную редуцирующую
роль. Об этом свидетельствует широкое разнообразие фагов, выявляемых нами на поверхности растений. В исследованиях были использованы штаммы бактерий Xanthomonas, Erwinia и
Pseudomonas : P. syringae pv. aptata IMV 185, P. savastanoi pv. phaseolicola IMV 4013, P. syringae
pv. aptata IMV 8545, P. syringae pv. tabaci IMV 8646, P. viridiflava IMV 8867, P. savastanoi pv.
phaseolicola IMV 4228, P. syringae pv. tabaci IMV 223, X. axonopodis pv. beticola IMV 7325, P.
syringae pv. lachrymans IMV 7591, P. syringae pv. atrofaciens IMV 1025, P. clororophis IMV 8612,
P. alliicola IMV 8494, P. syringae pv. syringae IMV 8653, E. carotovora IMV 216(Pectobacterium
carotovorum). Все тестовые культуры получены из музея фитопатогенных бактерий института
микробиологии и вирусологии НАН Украины им Д. К. Заболотного. Обсуждаемые в данной
работе фаги представляют собой полевые изоляты, полученные в нашей лаборатории.
Выделение полевых фагов из растительных биоценозов проводили, используя пробы,
обладающие литической активностью к тестовым бактериям. Нам не удавалось выявить одновременно фаги, активные против всего списка используемых штаммов, при однократном заборе проб. Их обнаруживали ко всем используемым штаммам, при анализе проб, отбираемых
с исследуемого участка, в динамике. Фаги смывали в 7 мл 0, 1 М Трис- НСl буфера (высечка ≈
7 см2) с поверхности листовой пластинки. В одном миллилитре их содержание варьировало от
единиц до 107 БОЕ/мл [3]. Последнее указанное значение оценивали, как максимально возможную концентрацию фагов фитопатогенных бактерий на поверхности растений в природных
ценозах. Это количество способно вызвать полный лизис бактериальной культуры на газоне
чашки Петри (площадь ≈ 70 см2). Более высокие титры фагов получают в лабораторных условиях, при их репродукции на хозяине, растущем на концентрированных питательных средах.
Для фагов, присутствующих на поверхности почвы в растительных экосистемах, ареал отдельной популяции занимает площадь около 2 см2 [4]. Его размер на поверхности расте-
113
Биология фагов
ний исследователями не определялся. Косвенные данные, полученные в нашей лаборатории,
свидетельствуют о том, что, очевидно, ареал фагов фитопатогенных бактерий имеет подобные
значения. Об этом свидетельствуют те данные, что в отдельных пробах, отбираемых на общем
участке, количество фагов распределялось не равномерно, а дискретно, локальными популяциями. Они были представлены либо максимально возможными концентрациями (при лизисе
доминирующего штамма на поверхности растения), либо минимальными (отдельные сохранившиеся инфекционные частицы или спонтанная продукция лизогенных бактерий).
Одним из этапов нашей работы была задача поиска уникальных генотипов фагов, имеющих широкий спектр литической активности против фитопатогенных бактерий. Такие фаги
могли иметь практическую и коммерческую ценность. Необходимы были фаги, с уникальными свойствами, являющимися потенциально перспективными для защиты от бактериозов растений, произрастающих на Украине.
Мы предполагали, что большинство фагов, выделенных из определенной растительной экосистемы и внесенные в неё же, могли просто «растворяться», не оказывая желаемого
эффекта. Обнаружение фагов с искомыми характеристиками могло быть связано с другими
экосистемами. География распространения фагов фитопатогенных бактерий не освещена, в
связи с чем, мы обратились к анализу наличия вирусов бактерий на одной из наиболее удаленных от Украины точек - Украинской антарктической станции (Аргентинские острова, климат
субантарктический, морской, средняя температура летом около нуля) [5]. Исследования носили поисковый характер. Информации о присутствии фагов фитопатогенных бактерий на Аргентинских островах мы не имели. Острова имеют бедную растительность. Предполагалось,
что концентрация фитопатогенных бактерий не может быть высока и, соответственно, вероятность выявления искомых фагов крайне мала. Даже в случае их обнаружения, фаги должны
были бы присутствовать в крайне низкой концентрации и иметь ярко выраженные психрофильные свойства. Как указывалось выше, в зоне умеренного климата, наибольшая вероятность выявления высоких концентраций фагов существует при оптимальных для размножения
фитопатогенных бактерий условиях, +25°С. Такая зависимость не соблюдалась при анализе
образцов растений и почвы, отобранных в экосистеме Антарктиды [6]. В результате, в водных
экстрактах мхов и почвы, на газонах четырнадцати тестовых украинских штаммов, выявляли
широкий спектр фагов. Их наличие констатировали в ≈ 30% проб. Среди всего пула обнаруженных фагов, в ≈ 10% случаев титры достигали значений 106 БОЕ/мл [6]. Около 40% фагов
«Антарктиды» удавалось вывести в стабильные линии, сохраняющие инфекционность при
температуре +25°С. Такие значения сравнимы с данными, полученными для полевых фагов
Украины [7].
Пул полученных фагов тестировали на наличие среди них генотипов с широким диапазоном хозяев. С этой целью, проводили их выращивание методом двухслойного агара, в чашке Петри, на газоне, представляющего собой смесь двух тестовых культур. На фоне мутных
колоний искали прозрачные бляшки фагов, способные лизировать обоих хозяев. В результате,
были выявлены прозрачные негативные колонии. Их последующее последовательное перенесение еще на два штамма позволило изолировать генотип, способный лизировать одновременно четыре штамма бактерий (X. axonopodis pv. beticola IMV 7325, P. syringae pv. atrofaciens IMV
1025, E. carotovora IMV 216(Pectobacterium carotovorum), P. syringae pv. tabaci IMV 223). Таким
образом, было установлено, что, поиск уникальных генотипов фагов в Антарктиде имеет свою
перспективу.
До сих пор практически не изучался вопрос, о существовании границ распространения популяций фагов фитопатогенных бактерий. В частности, распространяется ли их география на прилегающие к наземным растительным биоценозам, морские акватории. В них фаги
114
Биология фагов
могли быть смыты дождевыми потоками и в результате эволюции, адаптироваться.
Для поиска ответа проводили анализ присутствия фагов фитопатогенных бактерий в
соприкасающейся с растительными биоценозами Украины, акватории Черного моря. Как известно, максимальные концентрации вирусов у морских животных выявляют на фильтрующей
поверхности, жабрах. Смывы из них использовали для анализа наличия фагов фитопатогенных бактерий. Было установлено, что около 40% образцов вызывали лизис тестовых бактерий.
Однако, все попытки вывести, путем пассажей такие фаги в стабильные инфекционные линии, не увенчались успехом. Фаги полностью инактивировались [8]. Очевидно, они являлись
морскими фагами, способными вызывать лизис, за счет активности литических ферментов
вирусов. Не исключено, что они могут выполнять важную роль, защищая жабры рыб от бактериальной инфекции. Полученные данные свидетельствуют в пользу того предположения, что
в исследуемой акватории отсутствуют истинные фаги фитопатогенных бактерий.
В природе репродукция вирулентных фагов сопровождается полным лизисом хозяина. Образовавшаяся популяция фагов, при отсутствии чувствительного штамма постепенно
уменьшается, а когда ее численность падает ниже критической, она инактивируется. В наших
исследованиях (на моделях шести фагов фитопатогенных бактерий), было показано, что срок
сохранения их биологической активности в биоценозе составляет около 14 дней [9]. Спектр
литической активности у большинства полевых фагов узкий и способен инфицировать лишь
несколько штаммов. Численность популяций может уменьшиться до критических значений и
возникает угроза элиминации их из экосистемы. Однако, на практике, фаги широко распространены и стабильно присутствуют в биоценозах [10]. С поиском ответа на вопрос, каким
образом обеспечивается постоянное присутствие узкоспецифических фагов в природе, мы
столкнулись, при выделении фагов к штаммам : P. alliicola IMV 8494, P. syringae. pv. tabaci IMV
8646, P. savastanoi pv. phaseolicola IMV 4013, P. syringae pv. aptata IMV 8545.
Из полевых образцов нам не удавалось изолировать генетически стабильные линии
искомых фагов. После пассажей они теряли инфекционность. Однако, мы исключали возможность того, что в природе какой-либо штамм не имеет своего природного ограничителя численности, коими являются фаги. Если мы не обнаруживали искомые фаги напрямую, то было
решено получить их, как продукт рекомбинации. Для инфицирования использовали фаги, активные против других штаммов бактерий. На газонах, резистентных к используемым фагам,
штаммов P. alliicola IMV 8494, P. syringae. pv. tabaci IMV 8646, P. savastanoi pv. phaseolicola IMV
4013, P. syringae pv. aptata IMV 8545. Их инфицировали 24 вариантами пар вирусов. В результате были обнаружены рекомбинанты [11]. Это свидетельствовало о том, что подобные события,
вероятно, происходят и в природе. Одновременно, возникал вопрос, можно ли в таком случае,
рассматривать генотипы рекомбинантных фагов, как биологический объект с устойчивыми
характеристиками.
Для ответа на поставленный вопрос проводили сравнение полевых и рекомбинантных
фагов, активных против штамма P. atrofaciens IMV 1025. Использование этого штамма было
обусловлено тем, что все, выделенные в нашей лаборатории, к нему фаги были моновалентны. У нас поддерживается большая коллекция изолятов фагов. Они выделены в разные годы
и в разных географических точках Украины. Фаги P. syringae pv. аtrofaciens IMV 1025 одного
морфотипа, имели близкий белковый состав, а их геномы при рестрикционном анализе, при
использовании фермента HindIII идентичны. У фагов других бактерий такой строгой закономерности не наблюдали.
Для образования рекомбинантных фагов к P. atrofaciens IMV 1025 отбирали полевые
образцы, содержащие фаги, способные образовывать на тестовом штамме пятна лизиса, но не
дающих инфекционное потомство. Пары таких изолятов, при смешанной инфекции, в трех
115
Биология фагов
случаях из 48, образовывали стабильные рекомбинанты, 1025R1, 1025R2 и 1025R3. Сравнение
геномов полевых штаммов и рекомбинантов проводили с помощью рестрикционного анализа,
с применением эндонуклеазы рестрикции HindIII. Было установлено, что профили разделения
фрагментов ДНК всех сравниваемых фагов, как хранящихся в коллекции, так и полученных
после рекомбинации, идентичны. Их ДНК содержала значительное количество сайтов узнавания HindIII, что позволяет говорить о подобии их ДНК. Полученные результаты указывают на
важную роль хозяев в процессе естественной эволюции фагов, нуждающуюся в дальнейшем
изучении.
Таким образом, учет многофакторных взаимоотношений фагов и их хозяев, исследование экологии, разработка принципов селекции фагов, которые не сформулированы и устанавливаются в каждой лаборатории индивидуально, является необходимым условием для
создания научно обоснованных подходов к решению важной задачи разработки экологически
безопасных препаратов защиты растений, на основе вирусов бактерий.
Библиографический список
1. Wommack K.E & Colwell R.R. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiol
//Mol. Biol. - 2000. - 64, № 1, - P. 69-114
2. Suttle A. The significance of viruses to mortality in aquatic microbial communities //
Microbial. Ecology . - 1994, № 2, - P. 237-243
3. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І. Екологічні аспекти циркуляції фагів фітопатогенних бактерій у біоценозах //Екологічний вісник. 2003. - Київ, - С. 498 – 504
4. Vos M. , Birkett P., Birch E., Griffiths R., Buckling. A. Local Adaptation of Bacteriophages to Their Bacterial Hosts in Soil // Science. - 2009. - 325. - P. 833
5. Попов Ю.И., Скрыпник В.В., Тимофеев В.Е., Украинский В.В. Гидрофизические
аномалии и их связь с метеорологическим режимом в районе Антарктической станции Академик Вернадский в течении летних сезонов 2000-2001 гг. //Украинский антарктический журнал.
- 2003, №1, - С. 79-84
6. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Войціцький В.М., Андрійчук О.М. Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І., Ващенко В.М., Делімат А. Виявлення фагів фітопатогенних бактерій в
Антарктиді //Агроекологічний журнал. - 2003, №4, - С.12-15
7. Андрійчук О.М., Семчук Л.І., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І., Бойко
А.Л. Динаміка виділення фагів фітопатогенних бактерій із листя та коренів цукрових буряків.
// Вісник КНУ. - Сер. Біол. - 2004. №42, - С. 49-51
8. Семчук Л.І., Степанова О.А., Бойко А.Л., Андрійчук О.М. Виявлення фагів фітопатогенних бактерій у зябрах риб Чорного моря //Вісник КНУ. Сер. Біол. - 2003. №41, - С.156-158
9. Ромашев С.А., Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ігнатенко Т.О., Яцковська Л.І., Колонюк І.О. Дослідження фагів фітопатогенних бактерій та їхнього впливу при внесенні на експериментальні ділянки з посівами цукрового буряку//Вісник КНУ. Сер. Біол. - 2005. №44, - С.
33-34
10. Weinbauer M. Ecology of procaryotyc viruses. // FEMS Microbiology Revies. -2004. 28, P.127-181
11. Семчук Л.І., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.О. Аналіз частоти рекомбінацій фагів фітопатогенних бактерій та їхня роль у природі. // Вісник КНУ Сер. Біол. - 2006. №47, - C.36-38
PARTICULAR QUALITIES ECOLOGY PHAGES OF PHYTOPATHOGENIC
116
Биология фагов
BACTERIA, CIRCULATING IN AGROCENOSES OF UKRAINE
Semchuk L.I., Postoenko E.M., Romashev S.A.
nant.
Keywords: Bacteriophages, ecology, phytopathogenic bacteria, nucleic acids, Recombi��������
Studied ecology of phages, to fourteen strains phytopathogenic bacteria Xanthomonas, Erwinia and Pseudomonas. Phages in a separate ecological community, could be detected for all test
strains during several consecutive sampling. At the same time, in biological samples taken at the
Ukrainian Antarctic station, has been detected phages infections on test bacteria.�����������������
In
����������������
analysis samples, washed from the gills fishes Black Sea, was observed only lytic activity, no reproduction.
It shown, that resistance, to strains of X. axonopodis pv. beticola IMV 7325, P. syringae pv.
atrofaciens IMV 1025, P. syringae pv. tabaci IMV 223, E. carotovora IMV 216 (Pectobacterium carotovorum) phages, formed recombinants, which are capable to lysing new hosts.
A comparison genomes of monospecific phage P. atrofaciens IMV 1025, from collection,
with laboratory recombinants, showed that the profiles DNA HindIII -fragments all samples are identical. Studying the properties of phages is important to consider at their practical implementation, in
particular, the artificial bring in ecosystem.
УДК 579.262
ОСОБЕННОСТИ ВОЗРАСТНОЙ ДИНАМИКИ БАКТЕРИОФАГОВ
E.COLI КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА СВИНЕЙ
Скобликов Н.Э., кандидат медицинских наук
ГНУ Северо-Кавказский научно-исследовательский институт
животноводства Россельхозакадемии (СКНИИЖ)
тел. 8(918)4989891, skoblikow@yandex.ru
Зимин А.А., кандидат биологических наук
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина
РАН (ИБФМ РАН)
8(4967)730479, zimin@ibpm.pushchino.ru
Ключевые слова: бактериофаги, E.coli, свиньи, возрастная динамика
Работа посвящена определению титра и разнообразия бактериофагов ���������������
E��������������
.�������������
coli���������
в кишечнике поросят первых месяцев жизни. Установлено: пик количества и разнообразия коли-фагов
приходится на 27 день; динамика имеет тенденцию к снижению с титра 4,73 – 5,46 lg БОЕ/г
до неопределяемых значений к 66 дню; большую часть (89,7%) коли-фагов составляют фаги
Т4-типа семейства Myoviridae.
Введение
В настоящее время исследованиям микробной экологии растущих животных посвящено уже значительное количество работ [1], однако в абсолютном большинстве они касаются рассмотрения бактериальной составляющей, в то время как рассмотрение бактериофагов,
составляющих единую микроэкологическую систему с изучаемыми бактериями-хозяевами,
117
Биология фагов
остаётся практически без внимания исследователей. Такая ситуация особенно парадоксальна
в отношении фагов E.coli (коли-фагов), которых можно назвать самыми изученными (в т.ч. –
и по причине их применения в качестве основы профилактических и терапевтических антибактериальных препаратов). Работы, посвящённые описанию фаговых профилей микробиоценозов животных [2; 3], крайне немногочисленны. Данное исследование позволит восполнить
пробел в представлениях о детальной (с интервалом в несколько дней) возрастной динамике
поросят первых месяцев жизни.
Материалы и методы исследований
Для наблюдения было отобраны трое поросят, родившихся в один день потомков одной свиноматки породы СМ-1 и содержавшихся в одинаковых условиях на одинаковом рационе. Отъём поросят от свиноматок во всех группах проводился на 35-й день жизни.
У всех животных отбирались образцы содержимого толстой кишки в различном возрасте: на 17-й, 21-й, 24-й, 27-й, 31-й, 35-й, 39-й, 42-й, 46-й, 53-й, 59-й, 66-й день жизни (всего
12 раз, т.е., 36 образцов). Фекалии животных г) отбирались в одно и то же время суток (сразу
после утреннего кормления около 800 – 900) в стерильные 20 мл контейнеры. Для определения
титра коли-фагов образцы фекалий, отобранных в стерильный контейнер, взвешивали, после
чего ресуспендировали в 10 мл буферного (50мМ трис; 10мМ ЭДТА) раствора (рН 8,0). После
приготовления взвесь центрифугировали при 3000�����������������������������������������
����������������������������������������
об/мин в течение 20 мин, отбирали супернатант, переносили в другую пробирку, добавляли 0,3 мл хлороформа и перемешивали. Центрифугировали ещё раз при 3000 об/мин в течение 20 мин, отбирали супернатант, переносили
его в третью пробирку и добавляли 0,1 мл хлороформа. Из полученной суспензии делали серию 100-кратных разведений в этом же растворе, из которых производили высев на культуры
лабораторного штамма E. coli B методом агаровых слоёв с использованием твёрдой и мягкой
агаризованных сред LB [4]. После инкубирования при 37º��������������������������������
C�������������������������������
в течение 18������������������
�����������������
ч производили отбор образовавшихся бляшек для дальнейшего исследования, учитывая их морфологические
особенности и количество бляшко-образующих единиц (БОЕ) данных бактериофагов. Количественная оценка (титр) содержания бактериофагов E.coli в исследуемом биоматериале осуществлялась путём подсчёта бляшек после первичного посева, выражая её в lg БОЕ/г.
Для качественной оценки спектра коли-фагов из чашек с посевом штамма E. coli B и
образовавшимися на них бляшками производили отбор чётких изолированных бляшек, отличавшихся наибольшим морфологическим разнообразием. Вырезанные бляшки вносили в пробирки с культурой соответствующего штамма, культивировали на жидкой среде LB при 37°С
в течение 6,5 часов, после чего рост бактерий останавливали добавлением 0,1 мл хлороформа.
Полученную взвесь фагов и лизированных бактерий освобождали от клеточного детрита центрифугированием при 14500 об/мин в течение 5 мин.
Молекулярно-генетическую характеризацию бактериофагов осуществляли с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специальными праймерами, позволяющими выявить наличие характеристических для фагов Т4-типа семейства Myoviridae генетических маркеров. К таким маркерам относятся ген 23, кодирующий основной белок головки
фага (праймеры MZia1 и Cap8), ген 32 (праймеры FR60 и FR61) и ген hoc (праймеры hoc1fR и
hocCrH), кодирующие иммуноглобулиноподобные белки поверхности фага.
Результаты исследований и их обсуждение
В результате исследования оставшихся собранных 36 образцов биоматериала, подлежащего качественной и количественной оценке фагов E.coli, было установлено, что в 7 образцах отсутствуют фаги, определяемые на культуре E.coli B. В остальных 29 образцах было
выделено 58 коли-фагов (от 1 до 3 фагов от одного образца), отличающихся друг от друга
морфологическими особенностями бляшек. Характерно, что наибольшим разнообразием ти-
118
Биология фагов
пов коли-фагов отличался период 27 дней, демонстрируя с 42 дня тенденцию к снижению разнообразия.
Количество коли-фагов, выделенных от одного животного в течение всех 12 возрастных периодов колебалось от 18 (животное III�������������������������������������������������
����������������������������������������������������
) до 20 (животные I������������������������������
�������������������������������
и II�������������������������
���������������������������
). Что касается суммарного титра коли-фагов в каждом образце, то его динамика имела определённое сходство между
животными. У всех животных график динамики титра коли-фагов имел следующие общие
элементы: исходный (в 17 день) титр в пределах 4,73 – 5,46 lg БОЕ/г; снижение (в 24 день) до
3,00-4,28 lg БОЕ/г с последующим выравниванием; постепенное снижение (в 59 – 66 дней) до
неопределяемых значений (рис. 1).
Динамика титра коли-фагов у поросят 3-9 недель жизни
7,00
I-1
I-2
Титр коли-фагов , lgКОЕ/мл
6,00
I-3
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
17
21
24
27
31
35
39
42
46
53
59
66
Возраст животны х, дней
Рис.1 - Динамика титра коли-фагов у поросят 3-9 недель жизни
По результатам ПЦР-анализа на наличие генетических маркеров, характерных для
фагов Т4-типа семейства Myoviridae, выяснилось, что бактериофаги различались наборами
определяемых генов. Было установлено, что большая часть выделенных коли-фагов имела генетические маркеры принадлежности к фагам Т4-типа семейства Myoviridae. Так, из всех 58
фагов 44 фага (75,9%) были положительны по обоим генам (ген 23 и ген 32), 8 фагов (13,8%)
– по гену 23; отрицательными по обоим генам было 6 фагов (10,3%). Примечательно, что ни
один из 58 выделенных фагов не характеризовался генотипом «g23– g32+». Также интересно,
что фаги не-������������������������������������������������������������������������������
T�����������������������������������������������������������������������������
4-типа, обнаруживаясь до отъёма у всех трёх животных, после отъёма не обнаруживались. Примечательно, что ни один из 58 выделенных фагов не характеризовался генотипом «g23– g32+». Также интересно, что фаги не-T4-типа, обнаруживаясь до отъёма у всех трёх
животных, после отъёма не обнаруживались (таблица 1).
119
Биология фагов
Таблица 1 -Доля и популяционный состав коли-фагов Т4-типа семейства Myoviridae в кишечном микробиоценозе поросят 3-9 недель жизни
Доля типа коли-фагов в группе, %
Генотипы фагов T4-типа
Животное
Фаги не T4-типа
(g23–/g32–)
g23+/g32+
g23+/g32–
g23– g32+
всего
I
75,0
15,0
0,0
90,0
10,0
II
65,0
20,0
0,0
85,0
15,0
III
88,9
5,6
0,0
94,4
5,6
Всего
75,9
13,8
0,0
89,7
10,3
Дополнительное типирование по наличию hoc-гена помогло более детально дифференцировать фаги Т4-типа на субпопуляции. Так, всего было выявлено 10 hoc-отрицательных
фагов из 52 всех фагов Т4-типа (т.е., 19,2 % Т4-фагов). Однако, анализ конкретных фагов в
группах животных лишь по трём генам не позволил решить вопрос об идентичности фагов с
одинаковыми генотипами, определяемых в одном и том же образце. Также в целом неясным
остался вопрос об идентичности фагов с одинаковыми генотипами, выделяющимися у одного
и того же животного в разные временные периоды.
Однако, в данном случае, молекулярно-генетическая характеризация коли-фагов по
трём различным генам позволила ответить на существенный вопрос динамики содержания
бактериофагов E.coli у отдельных животных, а именно: вызваны ли описанные выше периодические подъёмы титра коли-фагов одними и теми же или разными фагами? Из анализа данных
видно, что подъёмы титра коли-фагов на 17-й, 31-й и 46-й дни могут быть обусловлены одним
и тем же фагом у животного I, но у других животных вызваны разными фагами.
Заключение
Проведённые исследования позволяют сделать следующие выводы:
1. В период с 17 до 31 день жизни в кишечном микробиоценозе поросят выделяется
2-3 коли фага (пик разнообразия приходится на 27 день), с 35 по 53 день – 1-2 фага, в возрасте
66 дней коли-фаги не выделяются в определяемых количествах.
2. Титра коли-фагов кишечного микробиоценоза поросят в возрасте 17-66 дней имеет
характерную динамику, в общем имеющую тенденцию к снижению с титра 4,73 – 5,46 lg БОЕ/г
до неопределяемых значений.
3. Большую часть (89,7%) выделяемых в кишечном микробиоценозе поросят колифагов составляют фаги Т4-типа семейства Myoviridae; большинство из них положительны по
генам 23, 32 и hoc-гену.
522p.
Библиографический список
1. Holzapfel W. H., Naughton P. J. Microbial ecology in growing animals / Elsevier. 2005.
2. Callaway,T., Edrington,T., Varey,P., Raya,R., Brabban,A., Kutter,E., Jung,Y., Genovese,K.,
Elder,R., Nisbet,D.J. (2003). Isolation of naturally occurring bacteriophage from sheep that reduce
populations of Escherichia coli O157:H7 In Vitro And In Vivo. 5th International Symposium on
‘Shiga Toxin(Verocytotoxin) - Producing Escherichia coli Infections’ , O-16.
3. Golomidova, A., Kulikov, E., Isaeva, A., Manykin, A., Letarov, A. (2007) The Diversity
of Coliphages and Coliforms in Horse Feces Reveals a Complex Pattern of Ecological Interactions.
Appl.Environ.Microbiol. 73(19) 5975–5981.
4. Sambrook J., Frith E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual / Cold Spring
Harbor Lab. Press. 1989. 480 p.
120
Биология фагов
FEATURES OF AGE DYNAMICS OF E.COLI PHAGES OF INTESTINAL
MICROBIOCENOSIS OF PIGS
Skoblikow N.E., Zimin A.A.
Key words: bacteriophages, E.coli, pigs, age dynamics
The study investigates the titer and biodiversity of E.coli phages in intestinal microflora of
pigs in first months of life. Established: the quantity and diversity peaks of coli-phages detected at 27th
day; age dynamics has trend for decreasing from 4,73 – 5,46 lg PFU/g till undetected values at 66th
day; most part (89,7%) of coli-phages consists of Т4-type phages of Myoviridae family.
УДК 602.3:579.8
ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТ
БАКТЕРИОФАГОВ BACILLUS MYCOIDES
Феоктистова Н. А.*, кандидат биологических наук, доцент
тел. 8(8422) 55-95-47, feokna@yandex.ru
Макеев В. А.*, аспирант
тел. 8(8422) 55-95-47, usxa@yandex.ru
Васильев Д.А.*, доктор биологических наук, профессор
8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Алешкин А.В.**, доктор биологических наук
8-495-452-18-16, ava@gabri.ru
*ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
**Московский НИИЭиМ им. Г.Н. Габричевского»
Ключевые слова: Бактериофаги, ����������������������������������������������
Bacillus��������������������������������������
�������������������������������������
mycoides�����������������������������
, биопрепарат, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, изменение литической
активности при хранении.
В статье дана характеристика некоторых биологических свойств бактериофагов
Bacillus mycoides (литическая активность, спектр литического действия, специфичность
действия, изменение литической активности при хранении). На основании изученных свойств
были выбраны фаги для конструирования биопрепарата для фагоиндикации и фагоидентификации бактерий Bacillus mycoides в пищевом сырье и продуктах питания.
Введение. Создание биопрепарата для фагоиндикации и фагоидентикации бактерий
Bacillus mycoides в пищевом сырье на основе бактериофагов подразумевает изучение таких
биологических свойств, как литическая активность, спектр литического действия, специфичность в пределах вида и изменение литической активности при хранении [3,5].
Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражает это тем
максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое
действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Однако, этот показатель от-
121
Биология фагов
носительный, так как активность фага зависит от различных условий, основными из которых
являются биологические особенности бактериальной клетки, которые в свою очередь зависят
от физических свойств среды, ее химического состава, окружающей температуры и так далее.
Поэтому активность фага всегда определяется в конкретных, стандартных условиях [4]. Видовая специфичность фагов используется в практике для дифференциации бактерий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, родством их к рецепторам лизируемых бактерий
[2]. Так как для разработки технологических параметров изготовления биопрепарата на основе
фагов необходимо изучить изменение литической активности при хранении, так как срок годности биопрепарата начинает исчисляться с момента наработки фага и его укупоривания в
герметично закрытые флаконы [7].
Целью наших исследований было изучение основных биологических свойств бактериофагов Bacillus mycoides (литическая активность, спектр литической активности, специфичность действия, изменение литической активности при хранении).
Материалы и методы исследований
В работе было использовано 12 штаммов бактерии Bacillus mycoides, 1 из них референс – штамм (Bacillus mycoides 537). Использовали также 78 штаммов бактерий Bacillus
cereus, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО
«Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Изучались биологические свойства 5 изолятов бактериофагов Bacillus mycoides, выделенных из объектов санитарного надзора Ульяновской и
Самарской областей, Краснодарского края.
Изучение биологических свойств бактериофагов проводили методами, предложенными Д.М. Гольдфарбом [2], И.П. Ревенко [6], В.Я. Ганюшкиным [1], С.Н. Золотухиным [3].
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Изучения литической активности селекционированных фагов Bacillus mycoides проводили методом агаровых слоев (Gracia, 1936) [6]. Накануне опыта по чашкам Петри разливали
1,5% мясопептонный агар в ламинарном боксе. Перед использованием чашки дополнительно
подсушивали в термостате при 37 0С 15-20 минут. Индикаторные культуры Bacillus mycoides
выращивались в условиях термостата в течение 18-20 часов при 37 0С на мясо-пептонном бульоне. Стерильный 0,7% мясопептонный агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли на
водяной бане и остужали до 46-48 0С. Исследуемый на присутствие бактериофага субстрат в
количестве 1,0 мл помещали в 2,5 мл 0,7% мясопептонного агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры. Все быстро и тщательно перемешивали вращением пробирки в ладонях
и выливали на поверхность 1,5% мясопептонного агара. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности мясопептонного агара, чашки Петри оставляли на горизонтальной
поверхности стола до полного застывания мясопептонного агара, затем инкубировали посевы
в термостате при 37 0С в течение 18 часов. Экспериментальным путем установлено, что литическая активность фагов колеблется в диапазоне от 106 до 10 12 БОЕ/мл.
Результаты исследований представлены в таблице 1.
Важной характеристикой фагов Bacillus mycoides является диапазон их действия на
штаммы бактерий в пределах вида. Для изучения спектра литического действия селекционированных фагов использовали 10 штаммов бактерий Bacillus mycoides, выделенных нами их
проб пищевого сырья и продуктов питания и 1 штамм, полученный из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.
Столыпина». Исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры методом «стекающая капля». Экспериментальным путем установлено, что изучаемые
специфичные бактериофаги имеют различный диапазон действия по отношению к 12 изучае-
122
Биология фагов
мым штаммам Bacillus mycoides (рис. 1). Опыты демонстрируют, что наиболее широким спектром литического действия по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов
B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, совокупный процент лизиса которых составил 91,7 %. Вышеназванные фаги обладают перекрестным лизисом, в данном случае они лизируют следующие штаммы Bacillus mycoides, выделенные нами из пищевого сырья: Bacillus mycoides 1
(пряности – мускатный орех), Bacillus mycoides 2 (картофель), Bacillus mycoides 5 (лук репчатый), Bacillus mycoides 6 (рыба прудовая), Bacillus mycoides Н (пряности – корица) и референсштамм Bacillus mycoides 537.
Рис. 1 – Спектр литического действия фагов Bacillus mycoides
Важнейшей характеристикой фага, входящего в состав биопрепарата для индикации и
идентификации бактерий, является его специфичность в пределах вида. Изучение специфичности
5 выделенных изолятов бактериофагов Bacillus mycoides мы проводили на культурах гомологичного рода: Bacillus subtilis – 25 штаммов, Bacillus mesentericus – 20 штаммов, Bacillus megaterium – 4
штаммов, Bacillus cereus – 25 штаммов, Bacillus thuringiensis – 4 штамма. Эксперимент ставили,
используя методику, описанную С.Н. Золотухиным (2007).
Таблица 1 - Результаты исследований спектра литического действия и литической активности фагов бактерий Bacillus mycoides
Количество
Процент
лизированных
Количество корпускул в 1 мл
№
Фаги
лизируемых
культур Bacillus
фага (по Грациа), БОЕ
культур, %
mycoides, шт
1 B myc–1 УГСХА
2
16,7
1,5х109 ± 0,4 х109
2 B myc–2 УГСХА
5
41,7
2,3х106 ± 0,7 х106
3 B myc–3 УГСХА
8
66,7
6,2х1012 ± 0,8 х1012
4 B myc–4 УГСХА
6
50,0
7,8х108 ± 0,2 х108
5 B myc–5 УГСХА
9
75,0
1,6х1010 ± 0,6 х1010
Совокупный процент лизиса
91,7
На чашки Петри с разлитым в нее 1,5% накануне мясопептонным агаром наносили
газон культуры вышеназванных видов бактерий рода Bacillus. Бактериальный газон подсушивали в условиях термостата в течение 20-30 минут при 37 0С. Затем чашку Петри с подготовленным газоном делили на три сектора: две «опытных» дорожки и контроль на механическое
повреждение газона. На «опытные» дорожки наносили по 1-2 капли исследуемого бактерио-
123
Биология фагов
фага Bacillus mycoides, на «контрольную» дорожку – стерильный мясопептонный бульон в том
же количестве, что и бактериофаги. Посевы помещали в термостат на 18 часов инкубации при
37 0С.
На чашках Петри, засеянных культурами Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, зон лизиса, при нанесении селекционированных нами фагов Bacillus mycoides B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА на газон культур,
обнаружено при визуальном осмотре не было. Полученные результаты свидетельствуют, что
выделенные и селекционированные нами бактериофаги, строго специфичны в пределах вида
Bacillus mycoides и могут быть компонентами биопрепарата для индикации и идентификации
бактерий Bacillus mycoides.
Для конструирования биопрепарата нами было отобрано два фага B.myc–3 и B.myc–5
серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической активности и максимально широким совокупным спектром литического действия (рис. 2).
Последующие эксперименты были направлены на изучение изменения литической
активности укупоренных во флаконы бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, хранящихся в условиях холодильника в течение 12 месяцев. Показатели литической активности
фагов при хранении определяется по классической методике определения активности методом
агаровых слоев (�����������������������������������������������������������������������
Gracia�����������������������������������������������������������������
, 1936). Для получения достоверных данных каждый эксперимент проводили троекратно и результаты исследований подвергали статистической обработке. Эталонные культуры бактерий Bacillus mycoides выращивали на мясо-пептонном бульоне в течение 18
часов в термостате при 37 °С. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Рис. 2 – Диапазон лизиса фагов В.myc-3 и В.myc-5 серии УГСХА
Опытным путем установлено, что в течение 3 месяцев показатели литической активности
исследуемых бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА оставались без изменений, 6,2х1012
± 0,8 х1012 и 1,6х1010 ± 0,6 х1010 БОЕ/мл фаголизата, соответственно.
Через 6 месяцев литическая активность снижалась и составила у фага B.myc–3
8
4,7х10 ±1,5х108 БОЕ/мл и у B.myc–5 УГСХА - 2,5х108±1,7х108 БОЕ/мл, через 9 месяцев 0,9х107±0,2х107 и 1,1х108±0,4х108 БОЕ/мл, 12 месяцев - 0,4х107±0,1х107 и 1,3х107±0,5х107 БОЕ/мл,
соответственно.
Экспериментально установлено, что пассирование бактериофагов на исходном штамме
бактерий Bacillus mycoides в течение 7 пассажей методом агаровых слоев (���������������������
Gracia���������������
, 1936) восстанавливает литическую активность бактериофагов на 1 порядок.
124
Биология фагов
Таблица 2 – Изменение литической активности фагов В.myc-3 и В.myc-5 серии
УГСХА при хранении
Литическая активность, количество
Бактериальная культура
Временной интервал
корпускул в 1 мл фага, БОЕ
/ название фага
момент укупоривания
6,2х1012 ± 0,8 х1012
3 месяца
6,2х1012 ± 0,8 х1012
Bacillus mycoides 537/
6 месяцев
4,7х108±1,5х108
В.myc-3 УГСХА
9 месяцев
0,9х107±0,2х107
12 месяцев
0,4х107±0,1х107
момент укупоривания
1,6х1010 ± 0,6 х1010
3 месяца
1,6х1010 ± 0,6 х1010
Bacillus mycoides Н /
6 месяцев
2,5х108±1,7х108
В.myc-5 УГСХА
9 месяцев
1,1х108±0,4х108
12 месяцев
1,3х107±0,5х107
Заключение. Проведенные исследования по изучению биологических свойств фагов
Bacillus mycoides показали, что изучаемые бактериофаги именют различные показатели литической активности, определяемые в стандартных условиях. Литическая активность фагов B.myc–1
- B.myc–5 серии УГСХА колеблется в диапазоне от 106 до 10 12 БОЕ/мл. Опыты демонстрируют, что
наиболее широким спектром литического действия по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, совокупный процент лизиса исследованных
штаммов Bacillus mycoides которых составил 90,9 %. Установлено, что выделенные и селекционированные нами бактериофаги, строго специфичны в пределах вида Bacillus mycoides и могут
быть компонентами биопрепарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus mycoides.
Для конструирования биопрепарата для фагоиндикации и фагоидентификации Bacillus mycoides
нами было отобрано два фага B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической активности и максимально широким совокупным спектром литического
действия. Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение изменения литической активности укупоренных во флаконы бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, хранящихся в
условиях холодильника в течение 12 месяцев. Определено, что бактериофаги в течение 12 месяцев
снижали показатели литической активности с 1012 до 107 БОЕ/мл. Согласно данным С.Н. Золотухина (2007), изменение литической активности фагов в диапазоне 107-109 не является критическим при конструировании биопрепарата и не отразится на его способности лизировать
культуры в пищевом сырье и продуктах питания при проведении исследований по их индикации
и идентификации [3].
Библиографический список
1. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии / В.Я. Ганюшкин. – Ульяновск: УГСХА, 1988. − С.42–45.
2. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия // Д.М. Гольдфарб. – М.: Медгиз,1961. − С. 169–187.
3. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: автореф. дис. …
докт. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23 / Золотухин Сергей Николаевич. − Ульяновск, 2007. − С.32.
4. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. − М.: Научный мир, 2012. − С. 365-369.
5. Раутенштейн, Я.И. Изменчивость Bacillus mycoides. Морфология вариантов/ Я.И. Раутенштейн // Микробиология. − 1977. − №1 (16). − С.33–41.
6. Ревенко, И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике / И.П. Ревенко. – Киев: Урожай, 1978. − С. 41–88.
125
Биология фагов
7. Юдина, М.А. Диагностика картофельной болезни хлеба, вызываемой бактериями
видов Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus / М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев,
Е.О. Бахаровская [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2011. – №1 (13). – C. 61–67.
CHARACTERISTICS OF SOME BIOLOGICAL PROPERTIES
BACTERIOPHAGES BACILLUS MYCOIDES
Feoktistova N.A., Makeev V.A.,Vasilyev D.A ., Aleshkin A.V.
Keywords: bacteriophages, Bacillus mycoides, biological product, the lytic activity, spectrum
of lytic activity, specificity, modification of lytic activity during storage.
The article provides a description of some of the biological properties of bacteriophages,
Bacillus mycoides (lytic activity spectrum of lytic action, specificity, modification of lytic activity
in storage). By studying the properties of phages were selected for the construction of a biological
product for fagoindikatsii and fagoidentifikatsii bacteria Bacillus mycoides in food raw materials and
food products.
УДК 602.3:579.8
ФАГОИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS CEREUS
Феоктистова Н. А.*, кандидат биологических наук, доцент
тел. 8(8422) 55-95-47, feokna@yandex.ru
Калдыркаев А. И.*, ассистент
тел. 8(8422) 55-95-47, usxa@yandex.ru
Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор
8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Алешкин А.В.**, доктор биологических наук
8-495-452-18-16, ava@gabri.ru
*ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
**Московский НИИЭиМ им. Г.Н. Габричевского»
Ключевые слова: бактериофаги, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, лизис, корма,
пищевые продукты, фагоидентификация
Описана схема исследования проб пищевых продуктов и продовольственного
сырья с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий �����������������������
Bacillus���������������
��������������
subtilis������
и ���
Bacillus cereus с использованием выделенных и селекционированных строго специфичных
бактериофагов Bacillus subtilis и Bacillus cereus в сравнении с классической схемой выделения
и идентификации бактерий рода Bacillus по Gordon (1973).
Введение. Роль бактериофага как средства терапии и профилактики некоторых
инфекционных заболеваний в настоящее время невелика, а значение для лабораторной
диагностики ряда инфекции этот биологический объект не только не утратил, а, наоборот, начал привлекать к себе все более пристальное внимание исследователей [1,3,5].
С каждым годом повышается значимость бактериофагов как высоко специфического
126
Биология фагов
диагностического средства, позволяющего надежно дифференцировать возбудителей
бактериальных видов, а порой проводить более детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри данного вида [2,7]. Возможность фагоидентификации
вытекает из специфичности действия фагов, которая может быть настолько выражена,
что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида [4]. Поэтому все большее число исследователей предпочитают обращаться к фаговым тестам, как единственному средству,
способному дифференцировать близкородственные штаммы [2,8,9].
Материалы и методы. В исследованиях использовали фаги Bacillus subtilis
Bs-13, Bs-16, фаги Bacillus cereus Вс-4, Вс-8 серии УГСХА; водопроводную воду, комбикорм, мясо, пряности, которые контаминировали штаммами бактерий Bacillus subtilis
(Bacillus subtilis 6633, Bacillus subtilis 2) и Bacillus cereus (Bacillus cereus 2527, Bacillus cereus
8035) в концентрации 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1 м.к./мл., полученными из музея кафедры
микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА
им. П.А.Столыпина».
Используя строгую родовую и видовую специфичность селекционированных
бактериофагов, нами была разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus. Подготовку и посев проб кормов
и пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии ГОСТ
Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб» [10] и ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов» [11].
Результаты исследований и их обсуждение. Для искусственной контаминации
пробы воды (мяса, комбикорма и пряностей) объемом (весом) 10 мл (г) вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из расчета 10 мл бульона
на 1 мл (г) исследуемой пробы. В колбы вносили индикаторные культуры в концентрации 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1 м.к./мл (г). Полученные смеси встряхивали в шуттельаппарате в течение 15 минут и ставили в термостат на 24 часа при 37°С. Затем надосадочную жидкость исследовали в соответствии со схемой, представленной на рис.2.
Первоначально производили посев по МПА по методу Дригальского для выделения
чистой культуры Bacillus subtilis и Bacillus cereus, а затем производили посевы на среду
Гаузе № 2 и среду Громыко. Инкубировали посевы в условиях термостата в течение 24
часов в условиях термостата при 37°С. Затем выросшие колонии пересевали на МПБ
и инкубировали в условиях термостата в течение 18 часов в условиях термостата при
37°С. Следующим этапом наших исследований было изучение биологических свойств
выделенных культур по тестам, отраженным на рис.1. Результаты исследований представлены в таблицах 1 и 2.
В основу приведенной ниже схемы оценки диагностических признаков выделенных бацилл положены принципы, изложенные в работах R������������������������
�������������������������
. Gordon����������������
����������������������
[13] автора систематики рода Bacillus в последних изданиях определителя бактерий Bergey [12].
Бульонные культуры, полученные после пересева колоний с вышеперечисленных сред на МПБ, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамположительных палочек с закругленными концами, располагающихся одиночно и попарно,
подвергали фагоидентификации.
На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3-4
капли бульонной 18-часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую
культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут.
Чашку делили бактериологическим карандашом на три сектора. На поверхность засеянной среды, в зоне первого сектора, пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили фаг Bs-13 УГСХА, на второй сектор аналогично наносили
127
Биология фагов
фаг Bs-16 УГСХА, на третий сектор в качестве контроля наносили стерильный МПБ.
Наклоняли чашку, чтобы капли стекли в виде дорожки. Чашки оставляли для подсушивания в боксе на 15-20 минут и помещали в термостат на 18 часов при 37°С. По аналогичной методике изучали работу цереусных бактериофагов Вс -4 и Вс-8 серии УГСХА.
Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным считали результат - отсутствие лизиса на газоне
роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствие лизиса в контроле. При
положительном результате культуру относили к виду Bacillus subtilis или Bacillus cereus.
Результаты опытов представлены в таблице 3.
Рис.1 - Схема выделения и дифференциации бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus
Таблица 1 - Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus на среде Гаузе № 2
Количество микробных Количество микробных Количество микробклеток в 1 гр (мл), проба клеток в 1 гр (мл), проба
ных клеток в 1 гр
Объекты
№1
№2
(мл), проба №3
101 102
103
104
101
102
103 104 101 102 103 104
1
вода
+
+
+
2 пряности
+
+
+
мясо
+
+
+
3
комби
4
+
+
+
корм
Примечание:
«+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат.
128
Биология фагов
Таблица 2 - Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий Bacillus subtilis и Bacillus cereus на среде Громыко
Количество микробных Количество микробных Количество микробных
Объекты
клеток в 1 гр (мл), проба клеток в 1 гр (мл), проба клеток в 1 гр (мл), проба
№1
№2
№3
1
2
3
4
1
2
3
4
10 10
10
10
10
10
10
10 101
102 103
104
1 вода
+
+
+
2 пряности
+
+
+
+
+
+
3 мясо
4 комбикорм +
+
+
Примечание:
«+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат.
Таблица 3 - Фагоидентификация бактерий Bacillus subtilis бактериофагами
Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА и бактерий Bacillus cereus бактериофагами Вс-4 и Вс-8
серии УГСХА
Результат воздействия фагов Bs- Результат воздействия фагов Вс-4
Объекты
13 и Bs-16 серии УГСХА
и Вс-8 серии УГСХА
Проба 1
Проба 2
Проба 3 Проба 1
Проба 2 Проба 3
1 вода
+
+
+
+
+
+
2 мясо
+
+
+
+
+
+
3 пряности
+
+
+
+
+
+
4 комбикорм
+
+
+
+
+
+
Примечание:
«+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат.
Заключение. Фагоидентификация бактерий Bacillus subtilis бактериофагами Bs13 и Bs-16 серии УГСХА и бактерий Bacillus cereus бактериофагами Вс-4 и Вс-8 серии
УГСХА дала положительные результаты: из всех исскуственно контаминированных
бактериями Bacillus subtilis и Bacillus cereus проб пряностей, комбикорма, водопроводной воды и мяса были выделены культуры, которые при взаимодействии с вышеуказанными фагами были лизированы ими. При получении отрицательных результатов
фагоидентификации необходимо проведение детального изучения ферментативных,
серологических и патогенных свойств выделенных микроорганизмов. На рисунке 2
изображена схема фагоидентификации бактерий вида Bacillus subtilis и Bacillus cereus.
Она представлена в сравнении с традиционной схемой выделения и дифференциации
бацилл первой морфологической группы [13], изложенной в «Определителе бактерий
Берджи» [12]. Доказано, что время исследований в соответствии с разработанной нами
схемой короче на 71 час с меньшими затратами посуды и реактивов
129
Биология фагов
Рис. 2 - Схема ускоренной идентификации бактерий вида Bacillus subtilis и
Bacillus cereus с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической
группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи».
Библиографический список
1. Адамс, М. Бактериофаги / М. Адамс. – М., Медгиз, 1961. – С. 26-121.
2. Адельсон, Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам / Л.И. Адельсон // Вопросы микробиологической диагностики и бактериофагии.
– М., 1962. – С. 184-194.
3. Габрилович, И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск, 1973. – С.5 – 24.
4. Габрилович, И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences / И.М.
Габрилович // ЖМЭИ. – 1992. – №6. – С.10-12.
5. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии/ В.Я.
Ганюшкин //. – Ульяновск. – 1988. – С.45
6. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб. – М.: Медгиз,1961. – С. 6-18.
7. Егоров В.В. Практикум по микробиологии / В.В. Егоров. – М.: Изд-во МГУ, 1986. С. 35-42.
130
Биология фагов
8. Клевакин, В. М. Санитарная микробиология пищевых продуктов / В.М. Клевакин,
В.В. Карцев. – Л.: Медицина, 1986. – С. 164.
9. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. - Киев: Hayкова
Думка, 1982. - С. 117-120.
10. ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб».
11. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».
12. Bergey’s manual of determinative bacteriology, Williams and Wilkins Co, Baltimore,
Md., 8th ed., 1974. - 1246 p. 191.
13. Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // In: Handb. Microbiol. Cleveland
(Ohio). - 1973. - V.l. - P .71-88.
FAGOIDENTIFIKATSII BACILLUS SUBTILIS BACTERIA
AND BACILLUS CEREUS
Feoktistova N.A., Kaldirkaev A.I., Vasilyev D.A. Aleshkin A.V.
Key words: bacteriophages, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, lysis, feed, food,
fagoidentifikatsiya
The scheme of study samples of food products and food raw materials for the isolation and
rapid identification of bacteria Bacillus subtilis and Bacillus cereus with dedicated and select for
a strictly specific bacteriophages of Bacillus subtilis and Bacillus cereus in comparison with the
classical scheme of isolation and identification of bacteria of the genus Bacillus by Gordon (1973) .
131
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Бактериофаги в медицине
и ветеринарии
УДК 615.375(06):616.981.49-053.2
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИММУННОГО ЛАКТОГЛОБУЛИНА
НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К БАКТЕРИОФАГАМ САЛЬМОНЕЛЛ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ, В ОПЫТАХ IN VITRO
Алексанина Н.В., кандидат биологических наук,
ФБУН Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии
Тел.8(863)234-29-33, nataly10_09@mail.ru
Ключевые слова: Бактериофаги, сальмонеллы, иммунный лактоглобулин.
Исследована чувствительность к бактериофагу клинических штаммов рода
Salmonella, выделенных от детей первых лет жизни, больных сальмонеллезом. Получено 46
штаммов: 26 штаммов – S.typhimurium и 20 штаммов S.enteritidis. Все культуры обладали
высокой антибиотикорезистентностью и разной степенью чувствительности к сальмонеллезному бактериофагу. Показано, что воздействие иммунного лактоглобулина приводит к
восстановлению чувствительности сальмонелл к бактериофагу, в опытах in vitro.
Введение. Острые кишечные инфекции ( ОКИ ),вызванные антибиотикорезистентными штаммами сальмонелл, занимают ведущее место в патологии детей первых лет жизни.
Сальмонеллезы относятся к разряду внутригоспитальных и протекают в виде ограниченных
вспышек или разрозненных спорадических заболеваний. Наиболее часто возбудителями сальмонеллезов у детей являются S.typhimurium и S.enteritidis. Летальность при этих инфекциях
достигает 30-60%. Вместе с тем, лечение данного заболевания затруднено высокой частотой (
60-95% ) антибиотикорезистентности, проявлением токсических и многочисленных аллергических реакций, а также осложнениями в виде явлений дисбактериоза( 1,2).
В современной детской гастроэнтерологии используется широкий арсенал препаратов для коррекции нарушенного микробиоценоза кишечника. В связи с широким распространением лекарственноустойчивых форм возбудителей в последнее время возрос интерес к
бактериофагам, которые используют для антибактериальной терапии, альтернативно приему
антибиотиков. В отличие от химиотерапевтических лекарственных средств бактериофаги оказывают специфическое направленное действие строго в отношении соответствующих микроорганизмов , не причиняя вреда нормальной микрофлоре, сочетаются с любыми лекарственными средствами(3,4).
Разработанный в Ростовском НИИ микробиологии и паразитологии совместно с ВНИИВС им.Мечникова и Нижегородским НИИЭМ им.И.Н.Блохиной пероральный препарат “
Лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл” представляет собой стерильную лиофилизированную иммуноглобулиновую фракцию молозива коров (Ig G, Ig A, Ig
M до 96 % состава препарата) и предназначен для лечения детей с дисбактериозами и острыми
кишечными инфекциями, вызванными сальмонеллами, клебсиеллами, протеем, псевдомонадами и их ассоциациями. Препарат обладает антибактериальным, антитоксическим, антиадгезивным, иммуномодулирующим действием,содержит бифидогенный фактор, не токсичен.
132
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Совместим с антибиотиками и бактериофагами, препаратами нормофлоры (5,6).
В данной работе исследована чувствительность к фагам бактерий рода ���������������
Salmonella�����
, выделенных от детей с ОКИ, изучено влияние иммунного лактоглобулина на фагочувствительность этих микроорганизмов, в опытах in vitro.
Материалы и методы исследований. Материалом для исследований явились 46
штаммов сальмонелл (26 штаммов S.typhimurium и 20 штаммов S.enteritidis); бактериофаг
сальмонеллезный групп А,В,С,Д,Е жидкий (раствор для приема внутрь и местного применения); лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл, выпускаемый в РНИИМП с 1994 года.
Чувствительность микроорганизмов к бактериофагу проводили путем нанесения капли препарата (0,01 мл) на газон –test штамм (‘’ Spot- test’’). Учет степени лизиса бактерий регистрировали по четырех крестовой схеме.
Результаты исследований и их обсуждение. В ходе исследования было получено
46 штаммов рода Salmonella ( 26 шт.- S.typhimurium и 20шт.-���������������������������������
S��������������������������������
.�������������������������������
enteritidis��������������������
), выделенных от детей больных сальмонеллезом. Все выделенные культуры обладали высокой антибиотикорезистентностью и были чувствительны к сальмонеллезному бактериофагу. Однако, из 46 исследованных штаммов сальмонелл к 32 культурам (70%) активность сальмонеллезного бактериофага была высокой и оценена нами на 4 креста (через 18-20 часов наблюдали полный
лизис бактерий ), к 11 культурам (30%) – 8 штаммов S.enteritidis и 6 штаммов S.typhimurium
активность сальмонеллезного бактериофага была низкой и оценена нами 1и 2 креста.
Обязательным условием эффективности фагирования является чувствительность возбудителя к бактериофагу и степень его литической активности.
Для изучения влияния иммунного лактоглобулина на фагочувствительность сальмонелл отобрали клинические изоляты бактерий рода Salmonella ( 11 штаммов) :8 штаммов
S.������������������������������������������������������������������������������������������
enteritidis�������������������������������������������������������������������������������
и 6 штаммов ������������������������������������������������������������������
S�����������������������������������������������������������������
.����������������������������������������������������������������
typhimurium�����������������������������������������������������
активность фага к которым была низкой. Культуры пассировали в 5% растворе лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл в
течение 15 дней, что соответствовало схеме терапевтического применения препарата для лечения больных ОКИ. Параллельно в качестве контроля проведены пассажи тех же штаммов в
мясопептонном бульоне (МПБ). У полученных в процессе пассирования культур ( 5,10,15 пассажи) и их исходных вариантов изучали чувствительность к сальмонеллезному бактерифагу.
Результаты проведенных исследований показали, что при пассажах сальмонелл в
иммунном лактоглобулине чувствительность культур к сальмонеллезному бактериофагу восстанавливалась и оценена нами на 4 креста ( наблюдали полный лизис бактерий через 18-20
часов) уже после 5-го пассажа сальмонелл в лактоглобулине. Активность фага в отношении
культур, пассированных в МПБ, оставалась прежней..
Заключение. Проведенные исследования показали, что сальмонеллы, выделенные от
детей раннего возраста, характеризовались разной степенью чувствительности к бактериофагу. Сальмонеллезный бактериофаг проявлял высокую активность в отношении 70% антибиотикорезистентных штаммов сальмонелл, к 30% культур активность фага была низкой.
В опытах in vitro установлено, что при воздействии лактоглобулина на сальмонеллы
с низкой фагочувствительностью происходит восстановление чувствительности у культур к
сальмонеллезному бактериофагу уже после 5-го пассажа их в препарате.
Библиографический список
1.ВоротынцеваН.В.,МазанковаЛ,Н.Острые кишечные инфекции у детей // М. ‘’ Медицина’’, 2001,с.477.
2. Ворошилова Н.Н., Боговазова Г.Г., Казакова Т.Б., Перепанова Т.С., Дарбеева О.С. //
133
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Актуальные вопросы разработки и применения иммунобиологических и фармацевтических
препаратов: Материалы всероссийской конф. – Уфа.2000.-с.87-94.
3. Приворотский В.Ф., Лупова Н.Е., Шильникова О.В.// Логика построения коррегирующих медикаментозных программ нарушенного микробиоценоза кишечника у детей.
РМЖ.2007.№1.с.6-9.
4. Суворова М.А., Рябчук Ф.Н. Чувствительность микробиоты кишечника к бактериофагам и пробиотикам у детей с заболеваниями органов пищеварения // Педиатрия. № 6.2011.
5. Соболева С.В. Лактоглобулины – препараты нового поколения для лечения и профилактики острых кишечных инфекций и дисбактериозов у детей.// Актуальные вопросы инфекционной патологии. Материалы юбилейной н/п конференции, посвященной 100-летию
РНИИМП, 23-24 сентября 2009г. Ростов-на-Дону. С.251-255.
6. Алексанина Н.В., Соболева С.В. Микробиоценоз толстого кишечника детей с диарейными заболеваниями в процессе лечения лактоглобулином против условно-патогенных
бактерий и сальмонелл.// Там же. С.302-305.
THE STUDY OF INFLUENCE OF THE IMMUNE LACTOGLOBULIN
ON THE SUSCEPTIBILITY TO BACTERIOPHAGES OF SALMONELLA
ISOLATED FROM CHILDREN IN EXPERIMENTS IN VITRO
Alexsanina N.V.
Key words: bacteriophages, Salmonella, immune lactoglobulin
The susceptibility of the clinical strains of Salmonella, isolated from children with
Salmonellosis in the first years of their, to bacteriophages, was investigated. There were neceived
46 strains of S.typhimurium and 20 strains S.enteritidis. All the cultures possessed high antibiotic
resistance and different degrees of sensitivity to Salmonella bacteriophage. It has been shown that
the influence of the immune lactoglobulin leads to the restoration of sensitivity of Salmonella to
bacteriophage, in the experiments in vitro.
УДК 616.932:576.858.9
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ ХОЛЕРНЫХ
БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ
ВИБРИОНОВ
Аленкина Т.В., кандидат медицинских наук,
Коровкина Г.И., кандидат медицинских наук,
Никифоров А.К., кандидат медицинских наук, доцент
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт
«Микроб», Роспотребнадзора, г. Саратов тел. 8(8452) 51-69-65, microbe@san.ru
Ключевые слова: бактериофаги, фаготипирование, лиофилизация, холера, энтеропатогенные вибрионы
134
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Работа посвящена разработке режимов лиофилизации, выбору стабилизирующей
среды для получения сухих препаратов бактериофагов диагностических холерных ТЭПВ-17. Определены физико-химические свойства лиофилизированных бактериофагов, оценена их
диагностическая значимость, установлен минимальный срок годности.
Опыт эпидемиологических расследований выявил существенную роль в этиологии
кишечных заболеваний человека штаммов Vibrio cholerae не О1/не О139 серогрупп, близких
по многим таксономическим признакам к возбудителю холеры [3, 6]. Клинические заболевания, вызываемые холерными вибрионами не О1/не О139 серогрупп, так называемыми энтеропатогенными, протекают по типу острых гастроэнтеритов, энтероколитов, токсикоинфекций
в ряде случаев по клинике и тяжести проявления подобных холере. Заболевания чаще носят
спорадический характер, однако регистрируются и крупные вспышки с алгидными формами.
В большинстве своем энтеропатогенные вибрионы способны продуцировать термолабильный
токсин, сходный с холерным энтеротоксином, цитолизин, гемолизин, термостабильные токсины, ответственные за развитие диареи. Описаны отдельные штаммы V. cholerae не О1/не О139,
продуцирующие холерный токсин и содержащие в геноме ctx-ген, например штаммы относящиеся к О9, О13, О28, О37, О41 серогруппам [3, 5]. Все это свидетельствует об актуальности
эпидмониторинга и правильной диагностики заболеваний вызванных энтеропатогенными вибрионами.
Большую роль в решении указанных задач играют препараты бактериофагов, строгая
специфичность которых позволяет проводить индикацию, дифференциацию и фаготипирование бактериальных культур, выделенных из объектов внешней среды. Фаготипирование позволяет не только определить видовую принадлежность изучаемой культуры, но и ее фаготип
(фаговар). Этот метод широко применяется в микробиологической практике для идентификации выделенных культур, а также имеет большое значение для эпидемиологического анализа
инфекционных заболеваний: установление источника инфекции и путей ее передачи.
Наиболее распространенный подход фаготипирования базируется на выявлении спектра чувствительности выделенной культуры к набору стандартных типовых фагов. Так в РосНИПЧИ «Микроб» выпускается набор «Бактериофаги диагностические холерные ТЭПВ-1,
ТЭПВ-2, ТЭПВ-3, ТЭПВ-4, ТЭПВ-5, ТЭПВ-6, ТЭПВ-7, раствор для диагностических целей»
(далее ТЭПВ-1–7), предназначенный для фаготипирования и фагодиагностики вибрионов неагглютинирующихся холерной О1 сывороткой, выделяемых от людей и из объектов внешней
среды. Бактериофаги в жидком виде имеют ограниченный срок годности (1–2 года), быстро реагируют на изменения температурного режима при транспортировании и хранении, как в сторону повышения, так и понижения (замораживание). Стабильными свойствами и длительным
сроком годности характеризуются лиофилизированные бактериофаги [1, 2]. Исходя из этого,
целью наших исследований была разработка технологии лиофилизации бактериофагов ТЭПВ1–7 и определение физико-химических и биологических характеристик сухих препаратов.
Материалы и методы исследований. Бактериофаги ТЭПВ-1–7 выращивали на соответствующих штаммах-продуцентах в бульоне Мартена рН 7,6±0,1 при температуре (37±1) ºС.
Лиофилизации подвергались бактериофаги ТЭПВ-1–7, содержащие от 2х108 до 6х109 БОЕ/мл.
Поскольку выживаемость фагов в процессе лиофилизации зависит от состава среды
высушивания, которая должна обеспечивать равномерное обезвоживание материала при сублимации [1, 2, 7], в качестве стабилизаторов выбраны 8 вариантов сред: 1 – пептон 10 %, желатин 1,5 %, натрия глутамат 5 %; 2 – пептон 10 %, желатин 2 %; 3 – натрия глутамат 10 %; 4 –
лактоза 20 %; 5 – сахароза 25 %, крахмал 2 %; 6 – раствор бессолевого пептона 5 %; 7 – пептон
5 %, желатин 0,7 %; 8 – сахароза 10 %, желатин 1,5 %. Защитные среды перед лиофилизацией
135
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
соединяли с бактериофагами в соотношении 1:1.
Результаты предварительных экспериментов по отработке режимов лиофилизации позволили установить в качестве оптимального 24-часовой режим, при этом продолжительность
периода сублимации составляла (5±1) ч, десорбции – (19±1) ч.
Специфическую активность (концентрацию фаговых частиц и спектр литической активности) до и после лиофилизации препаратов определяли методом агаровых слоев соответственно с индикаторными и контрольными штаммами V. cholerae не О1 фаготипов I-VII, а
также V. parahaemolyticus, Aeromonas, Pseudomonas, Commamonas, E. coli. На агаровые слои с
контрольными штаммами бактериофаги наносили репликатором.
Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе исследования показали,
что максимальное количество выживших фаговых частиц наблюдалось при использовании
сред высушивания 1, 2, 3 и, в зависимости от фага, находилось в пределах 1,0х107 – 2,8х109
БОЕ/мл. При лиофилизации со стабилизаторами 4–8 количество жизнеспособных частиц составляло от 1,0х104 до 1,0х107 БОЕ/мл, что в среднем в 620 раз ниже исходных значений. Поскольку низкая концентрация фаговых частиц может привести к изменению спектра литической активности бактериофага, то есть к потере диагностической ценности препарата, среды
4–8 были исключены из дальнейших исследований.
На втором этапе нашей работы была проведена сравнительная оценка эффективности
отобранных стабилизаторов в повторных экспериментах. Установлено, что все бактериофаги
ТЭПВ, высушенные на средах 1, 2, 3, представляли собой аморфную массу светло-коричневого цвета, полностью растворялись в течение 1-2 минут независимо от защитной среды. Одним
из важных показателей сухих препаратов является потеря в массе при высушивании, от которой зависит растворимость и стабильность свойств при хранении. Потеря в массе при высушивании у бактериофагов ТЭПВ-1–7, лиофилизированных со средой 1, составляла в среднем от
1,37 до 2,01 %, со средой 2 – от 1,08 до 1,48 %, со средой 3 – от 5,04 до 6,49 %. Оптимальные
значения показателя потери в массе при высушивании для бактериофагов находятся в пределах 1–3 %. В наших экспериментах такие показатели характерны для образцов бактериофагов
ТЭПВ-1–7, высушенных со средами 1 и 2.
Установлено, что при применении трехкомпонентной среды (среда 1) количество жизнеспособных частиц бактериофагов ТЭПВ составило в среднем от 2,9х109 до 4,0х107 БОЕ/
мл, то есть уменьшилось в среднем в 2,1 раза по сравнению с жидкой формой (от 6,0х109 до
2,0х108 БОЕ/мл). При лиофилизации на двухкомпонентной (среда 2) и однокомпонентной (среда 3) средах количество выживших фаговых частиц находилось в пределах 1,0х109–2,0х106 и
1,4х108–1,0х107 БОЕ/мл соответственно, в среднем отмечалось снижение концентрации фаговых частиц в 6,2 и 41,3 раза. Полученные данные свидетельствовали о преимуществе защитной среды 1, обеспечивающей лучшую выживаемость бактериофагов ТЭПВ-1–7 в процессе
лиофилизации (Рис. 1).
136
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
а
б
Рис. 1 - Изучение выживаемости бактериофагов ТЭПВ-5 (а) и ТЭПВ-6 (б) после
лиофилизации со стабилизаторами 1, 2, 3.
Дальнейшие исследования были направлены на изучение стабильности бактериофагов ТЭПВ-1–7 в процессе хранения в условиях, предусмотренных нормативной документацией [4]. Изучение физико-химических (внешний вид, растворимость, рН, потеря в массе при
высушивании) и биологических (специфическая активность) свойств лиофилизированных
препаратов, хранившихся при температуре (6±2) °С, проводили через 1, 2, 3 и 3,5 года, что необходимо для установления их срока годности.
Результаты показали, что наибольшее снижение количества частиц у отдельных бактериофагов ТЭПВ-1–7 происходило в течение первого года. При этом у бактериофагов лиофилизированных со средой 1 количество фаговых частиц снизилось в 3 раза, со средой 2 – в 11
раз, со средой 3 – в 23 раза. В дальнейшем при хранении препаратов снижение концентрации
фаговых частиц составило не более 3-5 %. Физико-химические характеристики сухих бактериофагов ТЭПВ-1–7 в процессе хранения практически не изменялись.
Анализ полученных данных показал преимущества трехкомпонентной защитной среды (среда 1), которая применялась впоследствии для изготовления 4 экспериментально-производственных серий бактериофагов диагностических холерных ТЭПВ-1–7, лиофилизатов для
диагностических целей, представленных на расширенные межлабораторные испытания.
В результате проведенных испытаний установлено, что:
1. Лиофилизаты представляют собой аморфную массу светло-коричневого цвета. После растворения – прозрачная жидкость светло-желтого цвета. Содержимое ампулы полностью растворяется в 1 мл воды очищенной при встряхивании в течение 1 мин, что соответствует предварительно установленному в проекте ТУ пределу растворимости – 2 мин.
2. �������������������������������������������������������������������������������
H��������������������������������������������������������������������������������
препаратов находится в пределах от 6,8 до 7,06, что соответствует предварительно установленному в проекте ТУ пределу рН от 6,5 до 7,6.
3. Потеря в массе при высушивании находится в пределах 0,7–1,9 %, что соответствует
предварительно установленному в проекте ТУ пределу данного показателя – не более 3 %.
4. Специфическая активность, определяемая по количеству фаговых частиц в 1 мл, у
лиофилизированных бактериофагов ТЭПВ-1–7 находилась в пределах 9х106– 9х108. Количество фаговых частиц в 1 мл у жидких (коммерческих) препаратов – в пределах 5х107 – 2,8х109.
В процессе лиофилизации, как известно, происходит снижение количества фаговых
частиц в 1 мл на 1-2 порядка. В соответствии с ТУ 8637-019-01898109-2008 для обеспечения
137
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
специфической активности жидкие бактериофаги ТЭПВ-1,2,4,5,6,7 должны содержать не менее 1х107, а ТЭПВ-3 – не менее 1х106 фаговых частиц в 1 мл. Таким образом, для лиофилизированных препаратов количество фаговых частиц, обеспечивающих специфическую активность
бактериофагов ТЭПВ-1,2,4,5,6,7 должно составлять не менее 1х106, а ТЭПВ-3 – не менее 1х105.
5. Спектр литической активности лиофилизированных препаратов бактериофагов
ТЭПВ-1–7 экспериментально-производственных соответствовал аналогичным показателям
коммерческого (жидкого) препарата. Каждый бактериофаг ТЭПВ проявлял литическую активность только в отношении штамма гомологичного фаготипа и не лизировал культуры V.
parahaemolyticus, Aeromonas, Pseudomonas, Commamonas и E. Coli.
6. На основании данных изучения стабильности лиофилизированных бактериофагов
ТЭПВ-1–7 в процессе хранения был установлен срок годности – 3 года (срок наблюдения).
Срок годности жидкого препарата – 2 года.
По результатам испытаний было рекомендовано продолжить изучение стабильности
свойств лиофилизированных серий бактериофагов ТЭПВ-1–7 с целью увеличения срока годности до 4 лет, а также направить препарат на государственные испытания для дальнейшего
его внедрения в практику здравоохранения.
Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана лиофилизированная форма бактериофагов диагностических холерных ТЭПВ-1–7, определены их физико-химические и биологические характеристики, установлен срок годности.
Библиографический список
1. Булыгина Е.М., Беликова В.А., Образцова Н.В. Изучение условий лиофилизации
фагов. // Матер. Международн. науч. конф. «Микробиология и биотехнология XXI столетия”,
Минск, 22-24 мая 2002 г. Минск, 2002, С. 15-16.
2. Македонова Л.Д., Кудрякова Т.А., Кадетов В.В., Наталич Л.А. Лиофилизация фагов
холерных вибрионов О1 и не О1 групп//Проблемы криобиологии, № 2, 1991, с. 34-39.
3. Онищенко Г.Г., Ганин В.С., Голубинский Е.П. Вибрионы не О1 серологической
группы и их значение в патологии человека – М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ. 2001, 384 с.
4. Санитарные правила СП 3.3.2.1248-3 “Условия транспортирования и хранения медицинских иммунобиологических препаратов”. М. 2003 г.
5. Хотько Н.И., Дмитриев А.П. Водный фактор в передаче инфекции. Изд-во: Пенза:
ПГУ. 2002, 232 с.
6. Хотько Н. И. Организационные и методические аспекты противоэпидемического
обслуживания населения. Изд-во: М.: Военный институт ВВ МВД России, Пенза: Медицинский институт ПГУ. 2005, 379 с.
7. Фурик Н.Н., Кононович Е.М., Картель А.Н. Влияние состава защитных сред на выживаемость бактериофагов молочнокислых бактерий при лиофилизации//Пищевая промышленность: наука и технология, № 3(5), 2009, с. 36-39.
DEVELOPMENT OF THE LYOPHILIZED CHOLERA BACTERIOPHAGE
PREPARATIONS FOR TYPING ENTEROPATHOGENIC VIBRIOS
Alenkina T.V., Korovkina G.I., Nikiforov A.K.
Key words: bacteriophages, liophilzation, cholera, enteropathoginic vibrios.
The article contains information on the liophilisation modes - selection of stabilizing
138
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
(cell maintenance) media for the obtainment of diagnostic cholera TEPV-1-7 bacteriophage dry
preparations. Determined are physical-chemical properties of lyophilized bacteriophages, estimated
is their diagnostic value, established is the shelf life limit.
УДК 578.81
БАКТЕРИОФАГИ В РОССИИ: ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ
Алешкин В.А., доктор биологических наук, профессор, (495)452-18-16,
info@gabrich.com
Алешкин А.В., доктор биологических наук, (495)452-18-16, ava@gabri.ru
С.С. Афанасьев, доктор медицинских наук, профессор, (495)452-18-16,
info@gabrich.com
ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора
Ключевые слова: бактериофаги, фаготерапия, фагопрофилактика.
Все большее распространение получают штаммы патогенных бактерий, характеризующиеся высокой термостабильностью, устойчивостью ко многим современным антибиотикам и дезинфицирующим средствам, способные вызывать спорадические случаи и вспышки
госпитальной инфекции с высоким уровнем смертности среди пациентов. В этой ситуации,
пользуясь накопленным в России многолетним опытом, логично предложить открытый для
всего мира заново класс антибактериальных средств на основе бактериофагов. С 1930-х годов на всей территории бывшего Советского Союза врачи начали применять бактериофаги
для профилактики и лечения инфекционных заболеваний у людей. Позже, в сороковые годы
двадцатого столетия на базе четырех институтов вакцин и сывороток (в Уфе, Тбилиси,
Нижнем Новгороде и Перми) было организовано производство свыше десятка наименований
лекарственных средств как на основе отдельных видов бактериофагов, так и их комбинаций
для лечения и профилактики острых кишечных инфекций, а также против возбудителей ряда
гнойно-воспалительных инфекций. В настоящее время в Российской Федерации бактериофаги
используются не только в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур, но и в составе
санитарно-гигиенических мероприятий в пищевой промышленности, сфере общественного
питания, в детских и воинских коллективах, а также лечебно-профилактических учреждениях. Ученые во всем мире могли бы использовать накопленный в России опыт при планировании
будущих исследований по бактериофагам.
Во время Первой мировой войны среди ученых-микробиологов распространилась
сенсационная новость, что Феликс д’Эрелль открыл вирусы, «пожирающие бактерии», и что
ему удалось разработать фаговые препараты для лечения солдат, заразившихся дизентерией
[1]. Врачи во всем мире были воодушевлены этим известием, особенно потому, что сообщения, опубликованные в медицинских журналах, указывали, что вирусы-бактериофаги безвредны для людей и животных и могут успешно использоваться как терапевтические средства [2].
В действительности история бактериофагов началась задолго до этого сообщения. В
1896 английский бактериолог Эрнест Хэнбери Хэнкин попытался подсчитать число бактерий
Vibrio cholera в 1 мл воды, взятой из реки Ганг. Забор образцов производился в 2-х местах: где
река входила в город Агра и где выходила из него. К своему удивлению Хэнкин обнаружил, что
139
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
в 1 мл воды на входе в город содержится 100 000 бактерий, в то время как на выходе из города
их число уменьшалось до 90. Странное самоочищение воды в Ганге в то время не нашло своего объяснения и получило название «феномен Хэнкина» [3].
В конце девятнадцатого века Н.Ф. Гамалея опубликовал статью, в которой описал внезапное разрушение Bacillus�����������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������
antracis��������������������������������������������������������
в дистиллированной воде, после чего эта жидкость приобретала способность лизировать свежие культуры сибиреязвенной бациллы. Он предположил,
что бактерии при распаде образуют бактериолизин, который специфически действует на такие
же бактерии, вызывая их лизис [4].
В 1915 году известный британский журнал The Lancet опубликовал статью Ф.Творта
о передающемся лизисе бактерий, в которой он описал свои наблюдения о «съеденных краях
колоний Staphylococcus». Однако Творт не смог объяснить наблюдаемое явление, а дал лишь
его описание [5].
В 1917 году молодой грузинский ученый Г.Элиава наблюдал таинственное исчезновение клеток V. cholera [6].
Величайшая заслуга Ф. д’Эрелля состояла в том, что он выдвинул идею использования
бактериофагов для лечения болезней, причиной которых у людей и животных являются бактерии. За эту идею он заслужил Нобелевскую премию, на которую его выдвигали восемь раз,
каждый год, начиная с 1925 года, хотя она так никогда и не была ему присуждена [1]. Д’Эрелль
первый применил бактериофаги для лечения дизентерии в детской больнице в Париже в 1919
году под руководством профессора Виктора-Анри Ютинеля. Фаговый препарат предварительно был перорально введен д’Эреллю, Ютинелю и нескольким интернам этой больницы для
того, чтобы подтвердить его безопасность перед применением у 12-летнего мальчика с острой
дизентерией. Симптомы у пациента прекратились после однократного введения противодизентерийного бактериофага и он полностью выздоровел через несколько дней [7].
Р. Брюноже и Д. Мэйсин в 1921 году впервые использовали бактериофаги для лечения
стафилококковых инфекций кожи. Авторы сообщали, что бактериофаги, введенные непосредственно в открытые хирургические раны, инициировали процесс выздоровление через 24-48
часов [8].
Первые попытки использования холерных бактериофагов для лечения и профилактики
этой инфекции были сделаны Ф. д’Эреллем и Г.Элиавой в 1931 году в СССР. После чего Тбилисский НИИ вакцин и сывороток начал производить первый в России коммерческий фаговый
препарат против холеры, который, как сообщалось, успешно использовался для борьбы с эпидемиями, угрожавшими юго-восточным территориям СССР [8]. В то же время создаются два
промышленных центра в Индии для производства противохолерных бактериофагов, применение которых в этой стране позволило сократить смертность от данной инфекции до 10% [9]. В
этом же источнике упоминается о создании в 1931 году и коммерческой лаборатории д’Эрелля
в Париже, которая изготавливала, пять наименований фаговых препаратов против различных
бактериальных инфекций: Bacte´-coli-phage, Bacte´-rhino-phage, Bacte´-intesti-phage, Bacte´pyo�������������������������������������������������������������������������������������
-������������������������������������������������������������������������������������
phage�������������������������������������������������������������������������������
, �����������������������������������������������������������������������������
and��������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������
Bacte��������������������������������������������������������������������
´-������������������������������������������������������������������
staphy������������������������������������������������������������
-�����������������������������������������������������������
phage������������������������������������������������������
. Эти препараты поставлялись на рынок французской компанией Лореаль. Институт Освальдо Крус в Рио-де-Жанейро, Бразилия начал производство
противодизентерийных бактериофагов в 1924 году для того, чтобы использовать их в борьбе
с дизентерией в странах Латинской Америки [9]. В 1940-ые годы семь лечебных бактериофаговых препаратов против стафилококков, стрептококков, эшерихий коли и других патогенных
бактерий также производились в США компанией Эли Лилли [2].
Клинические данные по эффективности бактериофаговых препаратов, производимых этими предприятиями, были противоречивыми [7]. Это могло быть вызвано как низкой
концентрацией или полным отсутствием фаговых частиц в готовых препаратах, так и узким
140
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
спектром их литической активности. В результате, с появлением антибиотиков коммерческое
производство лечебных фагов прекратилось в большинстве западных стран, несмотря на предварительные многообещающие результаты фаготерапии. В Советском Союзе этого не произошло. Наоборот зародившееся в Институте бактериологии (позднее НИИ вакцин и сывороток),
организованном д’Эрелл������������������������������������������������������������������
tv����������������������������������������������������������������
и Г.Элиавой в Тбилиси, массовое производство бактериофагов, получило свое развитие на других научно-исследовательских базах СССР. В Москве в 1930-ые
годы крупномасштабный выпуск бактериофагов был организован на базе НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова, из московских штаммов в Ленинградском НИИ вакцин и сывороток также было налажено производство противодизентерийного и ряда других препаратов, позднее
серийный выпуск бактериофагов активных против стафилококка, стрептококка, синегнойной
палочки, протея и ряда других энтеропатогенных бактерий появился в Уфе, Нижнем Новгороде, Хабаровске и Перми, где были задействованы сотни специалистов, выпускавшие по несколько тон жидких фаговых препаратов в день.
Широкомасштабные испытания, связанные с фаговой терапией, активно проводились
в 1930-1940-ые годы в Грузии, России, Украине, Белоруссии, Азербайджане и других республиках, входивших в то время в Советский Союз. Экспериментальные серии фаговых препаратов, против бактерий, относящихся к видам Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia coli и
Proteus��������������������������������������������������������������������������������
прошли испытания в конце 1930-х годов в хирургических и гинекологических клиниках Москвы. Исследования, проведенные в Остроумовской больнице Кокиным и его коллегами, доложенные на конференциях, проходивших в 1940 году, привели к разработке инструкций
по внутримышечному и внутривенному применению фагов, что было необходимо в случаях
терапии системной инфекции, развивавшейся как последствие хирургических вмешательств и
боевых ранений [10]. Эти методы были одобрены Главным санитарным управлением Красной
Армии и применялись для лечения солдат в ходе советско-финской кампании 1939-1940 годов
и Великой Отечественной Войне. Крестникова в 1947 году обобщила данные, полученные независимыми бригадами военных врачей – профилактическая обработка ран фаговыми смесями против анаэробных бактерий снижала в среднем на 30% число случаев газовой гангрены
у раненых солдат [10]. В 1938 году видный советский хирург Бурденко также рекомендовал
использовать бактериофаги против гнойных инфекций [11].
Война и потребность в антибактериальных препаратах заставила советских врачей
проводить все новые испытания с фагами и разрабатывать современные методы их применения. Так, в 1941 году Александр Цулукидзе, обобщая результаты полученные во время финской кампании по использованию у раненных солдат смеси фагов активных против стрептококка, стафилококка и ������������������������������������������������������������������
C�����������������������������������������������������������������
. perfringens����������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������
, предложил стратегию борьбы с анаэробными инфекциями заключавшуюся в совместном применении фаготерапии и противогангреннозной сыворотки [12]. Он предположил, что фаги лизируют бактерии, вызывающие инфекцию, а сыворотка
нейтрализует их токсины.
Каплан в 1941 году, а позднее Карпов и Яворская (1949) разрабатывали стратегию
фаготерапии и фагопрофилактики при пероральном приеме препаратов. Они продемонстрировали выживаемость бактерифагов в организме человека и животных в течение максимум 10
дней от момента их введения с постепенным снижением их титра после полной элиминации
бактерии-хозяина, кроме того, на модели лабораторных мышей ими был подтвержден высокий
профилактический эффект перорального приема сальмонеллезных бактериофагов [13, 14].
Одно из наиболее масштабных клинических испытаний лечебного эффекта дизентерийных фагов было проведено Сапиром [15]. Всего автором описано 1064 случая лечения дизентерии бактериофагами в двух больницах Москвы. Группа пациентов включала 767 мужчин
и 297 женщин в возрасте от новорожденных до 79 лет. В каждой возрастной группе применя-
141
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
лась стандартная фаготерапия с использованием дизентерийного бактериофагового препарата,
разработанного Московским Институтом вакцин и сывороток им. Мечникова. Автор отмечал,
что после первого дня лечения фагами количество пациентов с кровавым стулом уменьшилось
со 100 до 74 человек; на 5 день фаготерапии только 4 пациента продолжали страдать этим синдромом, а через неделю – 95% пациентов не обнаруживали патологических симптомов и могли
быть выписаны из больницы.
С появлением антибиотиков учение о бактериофагах подверглось значительной эволюции и начало превращаться из проблемы медицинской и ветеринарной в общебиологическую
дисциплину – фаги считались наиболее удобными объектами вирусологических и генетических исследований. В 1960-80-е годы тема исследования бактериофагов продолжала активно
развиваться в СССР, несмотря на достаточно скептическое отношение к ней многих западных ученых. По данному направлению работали такие известные исследователи как Тимаков,
Жуков-Вережников, Гольдфарб, Раутенштейн, Тихоненко, Ревенко, Крылов и другие [16-20].
В нашей стране не прекращалось практическое применение бактериофаговых препаратов, в
частности они широко использовались с профилактической целью в регионах эндемичных по
инфекционным заболеваниям, а также в организованных коллективах, таких как ясли. детские
сады, школы и армейские казармы где могли происходить быстрые вспышки инфекций [21-25].
Развитие новых представлений в конце ХХ начале ХХI века как о молекулярной биологии, так
и об экологических взаимоотношениях бактериофагов и их хозяев, а также все более широкое
распространение в биосфере антибиотикорезистентных микроорганизмов, актуализировали
своего рода второе рождение вирусов бактерий. Существенно возросшее количество персистирующих антибиотикорезистентных патогенных и условно-патогенных штаммов бактерий,
утяжеляющих клиническое течение патологических состояний и существенно ухудшающих
показатели инфекционной заболеваемости во многих странах мира, связано как с бесконтрольным использованием антибиотиков при самолечении и профилактики нозокомиальных инфекций, так и с массовым применением консервантов и бактерицидных препаратов в пищевой
промышленности и сельском хозяйстве. Улучшение качества медицинской помощи инфекционным больным, а также переход на потребление экологически чистых не обработанных антибактериальными средствами продуктов питания подразумевает поиск новых и возрождение
известных ранее форм и методов лечения инфекционных заболеваний, способов деконтаминации инструментария и помещений ЛПУ, а также консервации пищевой продукции.
В июне 2011 Ученым Советом Роспотребнадзора по инициативе 2-х ведущих научно-исследовательских институтов ГНЦ ПМБ (п. Оболенск) и МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского было принято решение о разработке новых средств профилактики пищевых инфекций
на основе бактериофагов, успешно завершившееся созданием специализированного продукта
диетического (профилактического) питания для применения декретированными группами населения в период повышения риска заболеваемости острыми кишечными инфекциями и в соответствии с рекомендациями по организации противоэпидемических мероприятий. В рамках
принятых Роспотребнадзором решений этими научными центрами продолжается конструирование деконтаминационных фагосодержащих средств для обработки мясных и рыбных полуфабрикатов перед вакуумной упаковкой и длительным хранением, а также в сотрудничестве
с клиницистами разрабатывается комплекс мероприятий по фагопрофилактике госпитальных
инфекций, вызванных антибиотикорезистентными штаммами клебсиеллы, ацинетобактера и
синегнойной палочки.
142
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Библиографический список
1. Hausler, T. Viruses vs. Superbugs//MacMillan, New York, 2008.
2. Sulakvelidze, A., Alavidze, Z., and Morris, J. G., Jr. Bacteriophage Therapy// Antimicrob.
Agents Chemother, 2001, Vol. 45, pp. 649-659.
3. Adhya, S., and Merril, C. The road to phage therapy// Nature, 2006, Vol. 443, pp. 754-755.
4. Гамалея Н.Ф. Бактериолизины – ферменты, разрушающие бактерии// Русский архив
патологии, 1898, т.6 (№6), С. 607-613.
5. Twort, F. An investigation on the nature of ultramicroscopic viruses// Lancet 1915, Vol.11,
p.1241.
6. Георгадзе И.А., Макашвили Е.Г. Георгий Элиава// Грузинская советская энциклопедиа, 1979, т. 4, С. 125.
7. Summers, W. C. Felix d’Herelle and the Origins of Molecular Biology// Yale UniversityPress, New Haven, CT, 1999.
8. Кажал Н., Ифтимович Р. Из истории борьбы против микробов и вирусов//Научное
из-во, Бухарест, 1968, 404 с.
9. Д’Эрелль Ф. Бактериофаг и феномен выздоровления// Тифлисс. гос. Ун-т, Тифлис,
1935, 262 с.
10. Крестовникова В.А. Фаготерапия и фагопрофилактика и их обоснование в работах
советских исследователей// ЖМЭИ, 1947, №11, С. 56-65.
11. Шкроб О.С. Академик Николай Нилович Бурденко (к 125-летию со дня рождения)// Хирургия, 2001, №5, С. 61-63.
12. Цулукидзе А.П. К методике применения бактериофага в хирургической практике//
Вестн. хир., 1941, №6, С. 679-685.
13. Каплан А.С. Распределение и сохранение дизентерийного поливалентного бактериофага в организме белых мышей после однократного кормления// ЖМЭИ, 1941, №5-6, С.
162.
14. Карпов С.П., Яворская Б.М. Динамика выделения бактериофага из организма фагированных людей// ЖМЭИ, 1949, №7, С. 40-42.
15. Сапир И.Б. Наблюдения и замечания по поводу лечения дизентерии бактериофагом// Труды Московского областного института инфекционных болезней, М., 1939, С.135-151.
16. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия/Под ред. Тимакова В.Д.// М.:Медгиз, 1961, 299 с.
17. Раутенштейн Я.И. Бактериофагия// М.: Из-во АН СССР, 1955.
18. Жуков-Вережников Н. Н. Перемитина Л.Д., Берило Э.А. и др. Изучение терапевтического эффекта препаратов бактериофага в комплексном лечении гнойных хирургических
заболеваний// Советская медицина, 1978, № 12, С. 64-66.
19. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике// Киев:
Урожай, 1978, 88 с.
20. Крылов В.Н. Фаготерапия с точки зрения генетики бактериофага// Генетика, 2001,
Т. 37, №7, С. 869–887.
21. Бабалова Г.Г., Кацитадзе К.Т., Сакварелидзе Л.А. и др. О профилактическом значении дизентерийного сухого бактериофага// ЖМЭИ, 1968, №2, С. 143-145.
22. Погорельская С.А. Опыт широкого применения бактериофагов с целью профилактики острых кишечных заболеваний// ЖМЭИ, 1968, №4, С.34-37.
23. Солодовников Ю.П., Павлова Л.И., Емельянов П.И. и др. Профилактическое
применение сухого поливалентного бактериофага с пектином в дошкольных учреждениях//
ЖМЭИ, 1970, №5, С. 131-137.
24. Агафонов В.И., Хохлов Д.Т., Золочевский М.А. Эпидемиология тифо-паратифоз-
143
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
ных инфекций и их профилактика в войсках// Военно-медицинский журнал, 1984, №6, С. 3639.
25. Анпилов Л.И., Прокудин А.А. Профилактическая эффективность сухого поливалентного дизентерийного бактериофага в организованных коллективах// Военно-медицинский
журнал, 1984, №5, С. 39-40.
BACTERIOPHAGES IN RUSSIA: PAST, PRESENT AND FUTURE
Aleshkin V.A., Aleshkin A.V., Afanas’ev S.S.
Key words: bacteriophages, phage therapy, phage prophylaxis.
The more prevalent bacterial strains increasing in numbers are those with high
thermostability, resistant to many present-day antibiotics and disinfectants, those which are capable
to cause hospital infective episodes with high mortality incidence among patients. In this situation
using the accumulated Russian experience it is logical to propose the development in a world of a
renewed class of antibacterial agents based on bacteriophages. Since 1930s in different part of the
Soviet Union a lot of doctors began to use phages in human prophylaxis and therapy. Later In the
1940s four Institutes for Vaccines and Sera (in Ufa, Tbilisi, Nizhnii Novgorod, and Perm’) began to
produce a dozen medicinal compounds based on several individual species of bacteriophages or their
combinations which are used to treat and prevent acute intestinal infections and to control causative
agents of certain pyoinflammatory infections. In recent years in the Russian Federation phages are
used not only as natural antimicrobial agents to fight against bacterial infections in humans, animals
and agricultural plants, but also they are used in conjunction with sanitary and hygienic activities in
food industry, public catering, children’s collectives, military units and hospitals. Therefore, world
scientists should not neglect these clinical results when designing any future studies.
УДК. 576.858.9+616.936.49:598.2/9
ВЫДЕЛЕНИЕ НОВЫХ БАКТЕРИОФАГОВ, ПРИГОДНЫХ
ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ АКТУАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ
ИНФЕКЦИЙ НА ПТИЦЕФАБРИКАХ
Андреева И.С., к.б.н., ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»,
тел. 8(383) 363-47-79, andreeva_IS@vector.nsc.ru;
Афонюшкин В.Н., к.б.н., ИХБФМ СО РАН,
тел. 8 923 117 64 61, lisocim@mail.ru;
Соловьянова Н.А., Cеливанова М.А., ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»,
тел. 8(383) 363-47-79;
Зайцев Б.Н., к.ф.-м.н., ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», тел. (383) 336-71-53;
Закабунин А.И., ИХБФМ СО РАН, тел. 89231723193;
Емельянова Е.К., к.б.н., ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», ГБОУ ВПО НГМУ
Минздравсоцразвития, тел. 89139048741
Ключевые слова: Бактериофаги, кишечные инфекции птиц, сальмонеллез, резистентность к антибиотикам
144
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Работа посвящена выделению новых бактериофагов, проявляющих активность против патогенных энтеробактерий, выделяемых из проб патологического материала, продукции животноводства и птицеводства, образцов кишечного содержимого птиц. Показано,
что обнаруженные бактериофаги проявляют специфическую активность по отношению к
штаммам рода ���������������������������������������������������������������������
Salmonella�����������������������������������������������������������
из разных источников выделения, что дает возможность рекомендовать их для разработки комплексного поливалентного салмонеллезного фагового препарата.
Введение. Сальмонеллезы — одна из наиболее распространенных и опасных токсикоинфекций человека, сельскохозяйственных, домашних и диких животных. Основной путь заражения при сальмонеллезе обусловлен употреблением в пищу продуктов, контаминированных
сальмонеллами. В последние годы отмечается значительный рост заболеваемости сальмонеллезом, связанный с распространением возбудителя через мясо птицы и яйца. При попадании
возбудителя в крупные птицеводческие хозяйства он быстро поражает бoльшую часть поголовья. Возбудителями сальмонеллезов является группа бактерий семейства Enterobacteriaceae,
рода Salmonella, насчитывающая в настоящее время более 2500 серотипов. Все серовары сальмонелл относятся к двум видам: S. bongori и S. enterica. Последний делят на 5 подвидов, обозначаемых собственными именами и цифрами: enterica (I), salamae (II), arizonae (�������������
IIIa���������
), diari������
zonae (IIIb), houtenae (IV) и indica (V). Для человека патогенны первые два подвида, причем
подвид enterica (I) включает в себя большую часть известных в настоящее время сероваров
сальмонелл (1400 из 2500). В этиологии внекишечного сальмонеллеза основную роль играют
S. typhimurium (34%) и S. enteritidis (21%) [1, 2]. Смертность при внекишечных формах сальмонеллеза у человека варьирует от 7% для инфекций костно-суставной системы, до 60-80%
для инфекций дыхательной системы и ЦНС [3]. В последние десятилетия во многих странах
получили широкое распространение разновидности ряда сероваров (S.wien, S.typhimurium,
S.haifa, S.enteritidis и др.), отличающиеся повышенной термоустойчивостью и устойчивостью
к дезинфицирующим средствам, а также множественной устойчивостью к действию антибиотиков [4]. В сложившейся ситуации достойную альтернативу антибиотикам в терапии множества болезней бактериального происхождения способны составить бактериофаги [5]. Важно,
что фаговые препараты высокоактивны в отношении патогенных бактерий, включая антибиотикорезистентные, не вызывают побочных токсических и аллергических реакций и не имеют
противопоказаний. Лечебно-профилактическая эффективность бактериофага зависит от того,
в какой мере его структура соответствует этиологической структуре заболеваний конкретной
территории, на которой он применяется. Создание высокоэффективных препаратов бактериофагов достигается за счет систематического подбора штаммов фагов с широкой валентностью
и высокой силой литического действия от больных и бактерионосителей, а также при постоянном обновлении производственных бактериальных культур за счет вновь выделенных. В настоящей работе приводятся данные по выделению из естественных источников штаммов сальмонелл и бактериофагов, обладающих по отношению к ним литической активностью. Особое
внимание уделялось отбору образцов для исследования во время вспышек сальмонеллезов на
птицефабриках.
Материалы и методы исследований. В качестве субстратов для выделения бактериофагов и штаммов сальмонелл были использованы образцы патологического материала, продукции животноводства и птицеводства, пробы кишечного содержимого птиц. Для изоляции
микроорганизмов использовали селективные и элективные среды (среду Эндо, селенитовый
бульон, висмут-сульфитагар). Идентификацию выделенных бактериальных штаммов проводили в соответствии с [6,7]. В процессе биохимической идентификации первоначально от-
145
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
бирали колонии уреазонегативных бактерий, образующих сероводород и ферментирующих
глюкозу, но не сахарозу. Бактериальные изоляты пересевали на среду Гисса с маннитом и 1%-ю
пептонную воду для выявления способности к образованию индола. Культуры, обладающие
характерными для сальмонелл признаками, дополнительно типировали на питательной среде
«Уриселект 4» (BioRad) для исключения бактерий родов Enterobacter, Klebsiella, Proteus, также
растущих на висмут-сульфитагаре. Чувствительность к антибиотикам изучали методом определения антибиотикорезистентности в микропланшетном формате [8, 9] и с помощью дисков
производства НИЦФ (Санкт-Петербург, Россия). Количество антибиотиков в 1 диске составляло: для рифампицина – 5 мкг, бензилпенициллина, оксациллина, ампициллина, импенема
и гентамицина – 10 мкг, эритромицина, линкомицина – 15 мкг, канамицина, тетрациклина,
левомицетина, ванкомицина – 30 мкг, карбенициллина – 100 мкг. Выделение бактериофагов,
приготовление фаголизатов, титрование фаговых суспензий, определение чувствительности к
выделенным фагам штаммов сальмонелл выполняли в соответствии с [6-8, 10]. Морфологию
бактериофагов изучали с помощью электронной микроскопии методом негативного контраста.
Исследование нуклеиновой кислоты фагов проводили согласно [11].
Результаты исследований и их обсуждение. Недостатком традиционной схемы изоляции сальмонелл является тот факт, что и селенитовый бульон и висмут-сульфитагар селективны в отношении грам-отрицательных микроорганизмов, активно продуцирующих сероводород. Более эффективна была первичная изоляция бактерий на среде Эндо, при этом посевная
доза сальмонелл может варьировать до единичных клеток, что не влияет на выживаемость
сальмонелл в данной среде. Однако при исследовании желудочно-кишечного тракта птиц данный метод оставался недостаточно эффективным ввиду возможности ползущего роста Pro����
teus�����������������������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������������
vulgaris��������������������������������������������������������������������������
на среде Эндо, поскольку данный микроорганизм всегда встречается в кишечном содержимом птиц. Использование среды XLT4 позволило исключить негативное влияние
микроорганизмов рода ����������������������������������������������������������������
Proteus���������������������������������������������������������
на рост сальмонелл при их первичной изоляции. Схема изоляции была следующей; посев образцов на среду Эндо, инкубирование в течение 16 ч, рассев
выросших бледно-розовых колоний на среду XLT4, инкубация 24-48 ч, одновременно посев
изолятов штрихом на среды висмут-сульфитагар и уриселект-4 для подтверждения продукции
сероводорода и исключения триптофандезаминазной активности, соответственно. В дальнейшем изоляты, обладающие культуральными и тинкториальными характеристиками сальмонелл, типировали иммунохимически, биохимически или с помощью ПЦР. Первоначально, при
высеве образцов на селективные среды, для дальнейшего исследования было отобрано около
200 бактериальных колоний, и только 62 изолята были идентифицированы, как относящиеся к
роду Salmonella. Выделенные штаммы были проверены на устойчивость к антибиотикам. Выяснено, что все они являются полирезистентными штаммами, проявляющими устойчивость к
6-13 антибиотикам из 14-ти, примененных в настоящей работе. Гены устойчивости к антибиотикам у сальмонелл могут быть расположены как в хромосоме, так и в плазмидах и, как правило, образуют кассеты, локализующиеся внутри транспозонов, которые могут переноситься
из хромосомы в плазмиду и обратно. Благодаря коньюгативности большинства таких плазмид,
этот механизм обеспечивает широкое распространение генов антибиотикорезистентности среди сальмонелл [12]. В настоящей работе показано, что множественная устойчивость к антибиотикам была наиболее выражена у штаммов, выявленных в образцах птицефабрик, где для
борьбы с сальмонеллезами особенно активно используют антибиотики. Штаммы, выделенные
из этих образцов, были резистентны к таким антибиотикам, как эритромицин, ванкомицин,
линкомицин, пенициллин, карбенициллин и рифампицин, в то же время, за исключением единичных штаммов, изоляты сальмонелл были высокочувствительны к имипенему. Следует отметить, что этот препарат является препаратом резерва и имеет некоторые ограничения в ис-
146
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
пользовании. При его применении могут развиваться аллергические реакции, дисбактериоз,
гиповитаминоз и другие нежелательные реакции. Следующими по эффективности действия
на выделенные сальмонеллы были оксациллин, левомицетин, канамицин и амикацин, более
50% штаммов были к ним чувствительны. К таким антибиотикам, как тетрациклин, ампициллин, гентамицин резистентность проявили около 70% исследуемых штаммов. В исследуемых
образцах было обнаружено три морфологических типа бактериофагов (рис.1) ���������������
c��������������
бинальным типом симметрии. Штаммы полученной коллекции полирезистентных к антибиотикам изолятов
сальмонелл были проверены на устойчивость к литическому действию бактериофагов.
Рис. 1 - Морфологические типы выделенных бактериофагов.
Фаги Ph1 и Ph2 состояли из икосаэдрической головки 40-50 нм в диаметре, фаг Ph3
имел иную форму и болеекрупные размеры (40-50×100-110 нм). Структура и длина хвостовых участков фагов была различна, нуклеиновая кислота фагов была представлена ДНК, что
было продемонстрировано по ее чувствительности к панкреатической ДНКазе. Исследование
полученных бактериофагов на способность к лизису изолятов сальмонелл и ряда коллекционных бактерий рода Escherichia и Shigella показало, что из 45 изученных штаммов Salmonella
sp. 17 штаммов, представленные в основном S. entericа, были резистентны по отношению ко
всем трем тестируемым бактериофагам, остальные штаммы были избирательно чувствительны к фагам в разных сочетаниях, что позволило их разделить на следующие группы: штаммы
сальмонелл, чувствительные ко всем трем бактериофагам; штаммы, чувствительные только к
одному из них: фагу Ph1, Ph2 или к фагу Ph3; штаммы, чувствительные к фагам Ph2 и Ph3 и
штаммы, чувствительные к фагам Ph1 и Ph2. Показано также, что бактериофаги не проявили
литическую активность относительно патогенного тест-штамма Shigella sonnei 32, а коллекционный тест-штамм Salmonella typhimurium 2606 лизировался только фагом Ph1. По отношению
к штаммам E.coli В и E.coli �������������������������������������������������������������
CR�����������������������������������������������������������
63 был активен только фаг ���������������������������������
Ph�������������������������������
3, что дает возможность нарабатывать его на колийных, более безопасных штаммах. Дополнительно, на чувствительность к
фагам Ph1, Ph2 и Ph3 были проверены 5 бактериальных изолятов также идентифицированных
как S. enterica, выделенных из очагов сальмонеллезных вспышек на птицефабриках. Выяснено, что фаг Ph3 способен лизировать четыре из пяти штаммов и что все пять тестируемых
штаммов S. enterica были резистентны к фагам Ph1 и Ph2. Важно подчеркнуть, что выделенные
в данной работе изоляты сальмонелл, проявили полирезистентность к антибиотикам, широко
используемым в практике ветеринарии и медицины, что затрудняет процесс лечения, вызванных ими заболеваний, с применением антибиотических препаратов.
Заключение. В результате проведенных исследований показано, что обнаруженные
бактериофаги �������������������������������������������������������������������������
Ph�����������������������������������������������������������������������
1, Ph������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������
2 и Ph������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������
3 проявляют специфическую активность по отношению к патогенным штаммам рода Salmonella из разных источников выделения, что дает возможность рекомендовать их для разработки комплексного поливалентного фагового препарата, направленного для лечения сальмонеллезов, вызванных возбудителями, обладающими множественной
устойчивостью к антибиотикам.
147
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Библиографический список
1. Ф.Н. Шубин, Н.И. Ковальчук, Н.А. Кузнецов, Г.В. Ревина, А.В. Раков, Д.В. Маслов, Е.М. Нечухаева, Л.К. Гребенькова, Н.Г. Кошелева и Ю.Н. Хорошевская, Г.П. Горшунова,
Н.А. Белоголовкина. «Кишечные инфекции. Предэпидемическая диагностика и профилактика
госпитального сальмонеллеза. М.У. № 3.1.1.016-2000», Издание официальное. Центр госсанэпиднадзора в Приморском крае Владивосток, 2001, С.24.
2. А.В. Раков, Ф.Н. Шубин, В.А. Иванис. Кишечные инфекции. Внекишечные проявления сальмонеллезной инфекции. М.У. № 3.1.1.0-28-04. Издание официальное. Центр Госсанэпиднадзора в Приморском крае. Владивосток, 2004, С.23.
3. �����������������������������������������������������������������������������������
Aguado�����������������������������������������������������������������������������
J���������������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������
.��������������������������������������������������������������������������
M�������������������������������������������������������������������������
., Ramos�����������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������
J���������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������
.��������������������������������������������������������������
M�������������������������������������������������������������
., Garciacorbeira��������������������������������������������
����������������������������������������������������������
�������������������������������������������
P������������������������������������������
., ���������������������������������������
Ales�����������������������������������
J���������������������������������
����������������������������������
.��������������������������������
M�������������������������������
., Fernandez�������������������
����������������������������
-������������������
Guerrero����������
M��������
���������
.�������
L������
., ���
Soriano F. Clinical spectrum of focal infection by Salmonella no-typhi. // Medicina Clinica, 1994, Vol.
103, P. 293-298.
4. Милютина Л.Н., Гурьева О.В., Рожнова С.Ш., Головинова М.А. К вопросу об эволюции лекарственной резистентности сальмонелл enteritidis����������������������������������
���������������������������������������������
, выделенных от детей // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2008, № 2, C. 44–47.
5. Красильников И.В., Лыско К.А., Отрашевская Е.В., Лобастова А.К. Препараты бактериофагов: краткий обзор современного состояния и перспектив развития. // Сибирский медицинский журнал. 2011, Т. 26, № 2, Выпуск 2, С. 33-37.
6. Руководство по медицинской микробиологии, кн. 1 / Под ред. А.С. Лабинской, Е.Г.
Волиной // М., «Бином», 2008, 1077 с.
7. Руководство по медицинской микробиологии, кн. 2. /Под ред. А.С. Лабинской, Н.Н.
Костюковой, С.М. Ивановой // М., «Бином», 2010, 1150 с.
8. Афонюшкин В.Н. Антибиотикорезистентность сальмонелл в Сибири./ Афонюшкин
В.Н., Дударева Е.В., Малахеева Л.И., Филипенко М.Л. // Ветеринария. 2008, № 1, С. 7-9.
9. Hall and Collis, 1995 R.M. Hall and C.M. Collis, Mobile gene cassettes and integrons:
capture and spread of genes by site-specific recombination, Mol. Microbiol. 15 (1995), pp. 593–600.
10. Основы бактериофагии / Под ред. И.М.Габриловича // Изд. «Вышэйшая школа».
Минск, 1973, 221 с.
11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984, 480 с.
12. Tosini et al., F. Tosini, P. Visca, I. Luzzi, A.M. Dionisi, C. Pezzella, A. Petrucca and A.
Carattoli��
, ��������������������������������������������������������������
Class���������������������������������������������������������
1 integron����������������������������������������������
������������������������������������������������������
-���������������������������������������������
borne����������������������������������������
���������������������������������������
multiple�������������������������������
-������������������������������
antibiotic��������������������
�������������������
resistance���������
��������
carried� ���������
by�������
������
IncFI� ����������������
and�������������
������������
IncL��������
/�������
M������
�����
plasmids in Salmonella enterica serotype typhimurium, Antimicrob. Agents Chemother. 42 (1998), pp.
3053–3058.
ISOLATION OF NEW BACTERIOPHAGES SUITABLE FOR PREVENTION
AND TREATMENT OF INTESTINAL INFECTIONS OF CURRENT
INTEREST AT POULTRY FARMS
Andreeva I.S., Afonyushkin V.N., Solovyanova N.A., Selivanova M.A.,
Zaitsev B.N., Zakabunin A.I., Emelyanova E.K.,
Keywords: Bacteriophages, intestinal infections of birds, salmonellosis, antibiotic resistance
The work is devoted to isolation of new bacteriophages active against pathogenic
enterobacteria from samples of pathological material, meat and poultry, samples of intestinal contents
of birds. It is shown that the detected bacteriophages exhibit specific activity against Salmonella
148
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
strains isolated from various sources, which allows us to recommend them for the development of a
complex polyvalent phage preparation against salmonellosis.
УДК 579.871.9:615.281.9:616-07:616-08
ПОЛУЧЕНИЕ ТОНКОДИСПЕРСНОЙ СУСПЕНЗИИ КУЛЬТУРЫ
КЛЕТОК – ПУТЬ К ПРОМЫШЛЕННОМУ ПРОИЗВОДСТВУ
МИКОБАКТЕРИОФАГОВ КАК ЛЕЧЕБНЫХ СРЕДСТВ ПРОТИВ
ТУБЕРКУЛЁЗА
Болдырев А.Н., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник,
boldyrev@vector.nsc.ru
Туманов Ю.В., доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник
тел. 8 (383) 363-47-51, tumanov@vector.nsc.ru
ФБУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Ключевые слова: бактериофаги, микобактериофаг D29, Mycobacterium smegmatis,
Mycobacterium tuberculosis, МЛУ-туберкулёз, ШЛУ-туберкулёз, детергенты
Статья посвящена разработке метода получения тонкодисперсной культуры клеток Mycobacterium smegmatis, не патогенной для человека и животных. Используя культуру
клеток ������������������������������������������������������������������������������
M�����������������������������������������������������������������������������
. ���������������������������������������������������������������������������
smegmatis������������������������������������������������������������������
в таком виде, удалось осуществить культивирование литического микобактериофага ���������������������������������������������������������������������
D��������������������������������������������������������������������
29, одновременно вирулентного и для патогенной микобактерии Mycobac��������
terium���������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������������������
tuberculosis��������������������������������������������������������������������
, без потерь культуры. В статье сообщается подобранный состав ростовой питательной среды для культивирования M. smegmatis, компоненты для приготовления
которой имеются в любой бактериологической и молекулярно-биологической лаборатории.
Разработанная схема получения фаголизата литического микобактериофага D29 является
прототипом для промышленного получения других литических микобактериофагов, поскольку условия для культивирования клеток микобактерий и микобактериофагов соответствуют
национальным требованиям обеспечения биологической безопасности персонала при работе
с этими объектами. Таким образом, микобактериофаги могут быть наработаны в необходимых количествах и в виде фаголизата, и в виде суспензии фага и использованы для лечения.
Введение. Исследования по получению тонкодисперсной суспензии культуры клеток
(КК) M. smegmatis были выполнены в 2005–2007 гг. в ГНЦ ВБ «Вектор» и направлены на
разработку технологического регламента для промышленного производства литических микобактериофагов. Иммунобиологические препараты, включающие микобактериофаг(и), должны
быть доступны государственным учреждениям различного профиля: медицинским, ветеринарным, научно-исследовательским для осуществления исследований, нацеленных на борьбу
с туберкулёзом.
Около трети населения планеты инфицировано преимущественно микобактериями
вида M. tuberculosis. В 2011 г. из 8,7 млн чел., заболевших туберкулёзом во всём мире, 1 млн
131 тыс. выявлены как ВИЧ-инфицированные; смертность в 2011 г. составила 1,4 млн чел.,
включая 990 тыс. ВИЧ-отрицательных и 430 тыс. ВИЧ-положительных.
В России инфицированность превышает 80�������������������������������������
������������������������������������
%. Она входит в число 22 неблагоприятных по туберкулёзу стран и находится на 18-м месте (заболеваемость в 2011 г. составила
73 случая на 100000 населения против 645 в Южной Африке, занимающей 1-е место) [1]. По
149
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
данным ВОЗ, число больных туберкулёзом на конец года в 2007 г. (именно в это время были
проведены наши исследования!) составило 164�������������������������������������������������
������������������������������������������������
тыс.��������������������������������������������
�������������������������������������������
чел., а в 2011�����������������������������
����������������������������
г. – 159479 чел. и болезненность составила (159479/1428,36000) 112 чел.
ВИЧ-инфекция в России становится отягощающим фактором для активизации туберкулёзной инфекции. Несмотря на снижение доли ВИЧ-инфицированных больных туберкулёзом до 5,8 % (9300/159479) к концу 2011 г. [1], смертность ВИЧ-позитивных пациентов в
~ 70 % случаев связана именно с заболеванием туберкулёзом.
С появлением лекарственно устойчивых (ЛУ) штаммов M. tuberculosis усложнились
подходы к лечению заболевания: традиционные режимы проведения противотуберкулёзной
терапии (ПТТ) оказались уже непригодными, поскольку препараты, к которым была выявлена
у пациента устойчивость, должны были исключаться. В 2011 г. число обращений по поводу
лечения МЛУ-туберкулёза (устойчивость одновременно как минимум к изониазиду и рифампицину – двум ключевым препаратам в ПТТ) составило 18902 случая. В случаях заболевания
туберкулёзом с широкой лекарственной устойчивостью, т. н. ШЛУ-туберкулёзом (устойчивость практически ко всем известным ПТП второй линии), антибиотико- и химиотерапия оказываются бессильными. Причина стремительного распространения ЛУ-штаммов обусловлена
отсутствием контроля за применением антибиотиков и химиопрепаратов в ходе лечения туберкулёза и других заболеваний. Лечение таких пациентов требует введения в практику новых
препаратов. К ним можно отнести и микобактериофаги.
Бактериофаги успешно применяются при лечении кишечных заболеваний (дизентерийный, протейный, сальмонеллёзный, клебсиелловый, бактериофаг коли), раневых инфекций (протейный, интести-бактериофаг, пиобактериофаг, бактериофаг коли). Микобактериофаги – вирусы, повреждающие микобактерии рода Mycobacterium.
Используя микобактериофаги можно проводить лечение туберкулёза как отдельно микобактериофагами, так и комбинированно в сочетании с антибиотиками и химиопрепаратами,
которые в настоящее время используются в фтизиатрии, и теми новыми препаратами, которые
оказывают бактерицидное действие на M. tuberculosis и M. bovis проходят доклинические испытания. Поэтому актуальны проекты, связанные с поиском новых бактериофагов вообще и
микобактериофагов в частности, и внедрением последних в практику лечения туберкулёза.
Материалы и методы исследований. Для исследований использовали литический
микобактериофаг D29 (США) и культуру клеток вида M. smegmatis (НИИ туберкулёза, г. Новосибирск).
Агар, дрожжевой экстракт, лауроилсаркозинат натрия (SLS), 30 % р-р, Sigma (США);
твин 80 (T80), Applichem и триптон, ICN (Германия). Ампициллин (A) (50 мкг/мл) и амфотерицин B (Ap) (5 мкг/мл); глюкоза (Glc), 40 % р-р; кальция хлорид (CaCl2), 10 % р-р для инъекций,
– фармакопейные (Россия); натрия хлорид (NaCl), калия гидрофосфат (K2HPO4) (Россия). Приготовление среды 2 × YTMyc (2 ×) в (г/л): дрожжевой экстракт – 10, триптон – 30, NaCl – 10,
K2HPO4 – 5. Автоклавируют. Приготовление питательной среды YTMyc41: для 40 мл среды
YTMyc41 смешивают 4 мл Glc, 0,4 мл 0,1 М CaCl2, 20���������������������������������������
��������������������������������������
мл 2����������������������������������
���������������������������������
×и 15,6��������������������������
�������������������������
мл стерильной дистиллированной воды. Вносили антибиотики (A и Ap) и детергенты (Т80, SLS). В этом случае среду обозначали, например как YTMyc41/A/Ap и YTMyc41/A/Ap//0,25T80/0,01SLS – добавление A, Ap,
Т80, SLS (конечные концентрации указаны в названии среды цифрой в объёмных процентах
с сокращённым названием детергента). Приготовление среды YTMyc/НА и YTMyc/ВА: на 1 л
среды брали навески, вполовину меньшие, для приготовления среды 2 ×, и 15 г агара (нижний
агар, НА) или 8 г агара (верхний агар, ВА), дистиллированной воды до 1 л. Автоклавируют.
Газон бактерий в НА. На чашку вносят 0,5 мл Glc, 0,1 мл 0,1 M CaCl2, по 50 мкл A и
Ap (5 мкг/мл), чашку прогревают при 37 °C 10 мин, вносят 1 мл нагретой до 37 °C суспензии
150
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
клеток микобактерий, и добавляют 8,3 мл охлаждённой до 50 °C среды YTMyc/НА, используя
мерную пробирку на 10 мл, тщательно перемешивают. Газон бактерий в ВА. На чашку вносят
0,5 мл Glc и по 50 мкл A и Ap, чашку прогревают при 37�����������������������������������
����������������������������������
°���������������������������������
C��������������������������������
10�����������������������������
����������������������������
мин, добавляют 9,4 мл охлаждённой до 50 °C среды YTMyc/НА. После отверждения чашку с НА помещают в термостат на
37 °C на 10 мин.
0,3 мл суспензии клеток, 30 мкл 0,1 M CaCl2 вносят в пробирку, инкубируют при 37 °C
5 мин, добавляют охлаждённую до 50 °C среду YTMyc/ВА до 3 мл, перемешивают на вортексе
и выливают на поверхность чашки с НА.
Засев M. smegmatis из единичной колонии (или со скошенного агара) с 0,5 % Т80. В
пробирку на 20 мл вносят 0,5 мл Glc, 50 мкл 0,1 M CaCl2, 25 мкл A (50 мкг/мл), 2,5 мл среды
2 ×, 1,8 мл стерильной дистиллированной воды и 0,125 мл 20 % водного р-ра Т80, затем небольшое количество клеток M. smegmatis на микробиологической петле с чашки, содержащей
единичные колонии, или из пенфлакона с КК M. smegmatis на скошенном агаре. Инкубируют
при 37 ºC при скорости вращения 200 об./мин в течение 2–4 сут.
Культивирование M. smegmatis с 0,25 % Т80 и 0,01–0,05 % SLS. Пробирку для засева
готовят так же, как приведено выше, с добавлением 62,5 мкл 20 % р-ра Т80 и 10–50 мкл 5 %
р-ра SLS. Инкубируют 5–6 сут.
Культивирование M. smegmatis в присутствии 0,01 % SLS и без детергентов. Пересев
культуры, выращенной в присутствии 0,25–0,5 % Т80 и 0,01 % SLS, в свежую питательную
среду YTMyc41/A/(Ap) или YTMyc41/A/(Ap)/0,01SLS проводят 1:50, через 2-е суток культивирования пересев повторяют.
Титрование КК M. smegmatis до отдельных колоний. Разведения готовят на среде
YTMyc41//0,03SLS. На каждую чашку (Ø 90 мм) наносят 0,5 мл Glc, по 50 мкл A и Ap, прогревают при 37 °C 5 мин, добавляют 9,4 мл охлажденной 50 °C среды YTMyc/НА, перемешивают.
Высевают по 100 мкл каждого разведения культуры на каждую чашку, растирая шпателем.
Использование КК M. smegmatis для титрования микобактериофага. На дно пробирки
на 10����������������������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������������������
мл вносят 0,3��������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������
мл охлаждённой до 0������������������������������������������������
�����������������������������������������������
°����������������������������������������������
C���������������������������������������������
суспензии КК, выращенных в отсутствие детергентов (1-й или 2-й пересев) в течение 2����������������������������������������������������
���������������������������������������������������
сут, добавляют 0,1���������������������������������
��������������������������������
мл разведения суспензии микобактериофага, инкубируют при 37 °C 60 мин, переносят пробирки с инфицированной культурой
в стерильное место, добавляют 30 мкл 0,1 M CaCl2 и до 3,0 мл охлаждённой до 50 °C среды
YTMyc���������������������������������������������������������������������������������
/ВА, быстро перемешивают на вортексе 2–3�����������������������������������������
����������������������������������������
раза с остановками и выливают на поверхность с твёрдой агаризованной средой YTMyc/НА в чашке Петри, предварительно изъятой из
термостата (37��������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������
°������������������������������������������������������������������������
C�����������������������������������������������������������������������
). Чашки с ВА ставят на ровную поверхность, выставленную по уровню. После затвердевания чашки переносят в термостат на 37 °C, перевернув вверх дном.
Результаты исследований и их обсуждение. Патогенные микобактерии вызывают
социально опасные заболевания – туберкулёз, лепру; условно патогенные – микобактериозы,
у животных – туберкулёз (возбудитель Mycobacterium bovis). Культивирование микобактерий в
жидкой среде осложняется тем, что поверхностный слой клеточной стенки содержит миколовые кислоты (C78–95), которые имеют гидрофобный характер (рис. 1) [3]. Две углеводородные
цепи располагаются параллельно (см. рис. 1). Гидрофильность мембраны определяется незначительным количеством гликолипидов и свободных белков наружного слоя. Отсюда высокая
адгезия микобактерий к стеклянным и металлическим поверхностям. Вторая причина – способность к ветвлению. Результат – агрегация клеток. Поэтому промышленное культивирование микобактерий в жидкой среде до сих пор отсутствует.
151
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Рис.�����������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������
1 -�������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������
Общее строение клеточной стенки грамположительных бактерий, содержащих в поверхностном слое миколовые кислоты
Рис. 2 - Культивирование на среде YTMyc21/0,5T80/0,04SLS микобактерий
M. smegmatis 45 ч и высев 100 мкл 4-го разведения (10-кратные) (фото со стороны дна
чашки Петри)
Первый этап исследования – анализ работ предшественников [4–6] и выбор среды.
При культивировании M. smegmatis увеличена концентрация Т80 до 1 %. Результат – образование тонкодисперсной КК микобактерий в диапазоне 0,25–1 %. Добавление SLS (0,01–0,03 %)
обеспечивает рост КК M. smegmatis в виде эмульсии с высокой седиментационной и агрегативной устойчивостью и получению при рассеве единичных колоний (см. рис. 2). Полученная КК
нечувствительна к микобактериофагу при прямом инфицировании. Последующее культивирование без детергентов (1–2 пересева) ведёт к восстановлению чувствительности к микобактериофагу. При внесении ����������������������������������������������������������������
SLS�������������������������������������������������������������
в концентрации свыше 0,03�����������������������������������
����������������������������������
% до 0,05�������������������������
������������������������
% наблюдается значительное снижение скорости роста культуры.
Заключение. Проведённые культуральные исследования показали, что промышлен-
152
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
ное культивирование микобактериофагов возможно в жидкой среде (не только на твёрдой) и
является наиболее эффективным и безопасным способом для их накопления.
Библиографический список
1. Global tuberculosis report 2012, www.who.int/tb/publications/global_report/en/,
http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/75938/1/9789241564502_eng.pdf
2. Jacobs-Sera D. et al. On the nature of mycobacteriophage diversity and host preference //
Virology, v. 434, 2012, p. 187–201.
3. Takayama K. et al. Pathway to Synthesis and Processing of Mycolic Acids in Mycobacterium
tuberculosis // Clin. Microbiol. Rev., v. 18, 2005, p. 81–101.
4. Dubos R.J., Davis B.D. Factors affecting the growth of tubercle bacilli in liquid media //
J. Exp. Med., v. 83, 1946, p. 409–423.
5. Sarkis G.J., Hatfull G.F. // Meth. Mol. Biol., v. 101, 1998, p. 145–173. – Totowa: Hum.
Press
6. McNerney R. // Meth. Mol. Medicine, v. 54, 2001, p. 145–154. – Totowa: Hum. Press.
AN OBTAINING FINE-DISPERSED SUSPENSION OF CELL CULTURE –
A WAY TO INDUSTRIAL PRODUCTION OF MYCOBACTERIOPHAGES
AS THERAPEUTIC AGENTS AGAINST TUBERCULOSIS
Boldyrev A.N., Tumanov Yu.V.
Key words: bacteriophages, mycobacteriophage D29, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, MDR tuberculosis, XDR tuberculosis, detergents
The article is devoted to the development of the method of obtaining fine-dispersed Mycobacterium smegmatis cells culture. This mycobacterial species is not pathogenic for humans and animals. Using M. smegmatis cell culture in such form, the cultivation of lytic mycobacteriophage D29
which is virulent simultaneously for Mycobacterium tuberculosis along with M. smegmatis became
possible. The selected composition of nutrient medium for cultivation of M. smegmatis is also reported in this article. Components for its preparation are available in any bacteriological and molecularbiological laboratory. The developed scheme of obtaining lytic mycobacteriophage D29 phage lysate
is the prototype for the industrial production of other lytic mycobacteriophages since the conditions
for culturing mycobacteria and mycobacteriophages comply with national requirements for biological safety of personnel when working with these objects. Thus, mycobacteriophages may be amassed
in necessary quantities both in the form of phage lysate and in the form of the purified phage suspension then be used for phage therapy.
153
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
УДК 577.27
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ IN VIVO
ДЛЯ ПОИСКА ПЕПТИДОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ
С АДЕНОКАРЦИНОМОЙ ЛЁГКИХ
Боргоякова М.Б., ***Каледин В.И., ***Николин В.П.,
**,***
Попова Н.А., *,**Ильичев А.А.
*
630559, НСО, п. Кольцово, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
**
630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2, Новосибирский государственный
университет,
***
630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10, ИЦиГ СО РАН
*,**
Фаговые пептидные библиотеки (ФПБ) часто используются в качестве источников
пептидов, связывающихся с опухолями. Мишенью для отбора пептидов могут выступать очищенные опухолевые антигены, культуры клеток или перевиваемые опухоли [3]. В настоящее
время идентифицировано большое количество пептидов, имеющих повышенную тропность к
раковым клеткам [1, 2, 3, 13, 17, 19, 21, 23, 24]. Было показано, что фаги, несущие такие пептиды в составе минорного белка pIII, при внутривенном введении скапливаются в опухоли.
Исследования были проведены как на чисто мышиных моделях [4, 6], так и на моделях перевиваемых опухолей человека [1, 11] и даже на онкологических больных [8].
Практическое применение опухоль-адресованных пептидов, отобранных из комбинаторных фаговых библиотек, довольно разнообразно. Некоторые из них сами по себе проявляют противоопухолевое действие, например, пептид LyP-1, который оказался специфичен
к опухолевой лимфатической системе и при введении мышам с опухолью молочной железы
приводил к ингибированию её роста и сокращению числа лимфатических сосудов [10]. В ряде
работ показано, что конъюгирование с пептидами химиотерапевтических агентов, таких как
доксорубицин, повышает их эффективность и снижает токсичность [1, 18]. При этом конъюгация может быть осуществлена непосредственно с агентом, или пептид может быть введен в состав наружной мембраны липосом и других наночастиц, транспортирующих терапевтическое
средство к мишени [5, 9, 12, 14], а также в состав оболочки вирусного вектора, используемого
для генной терапии [15]. Кроме того в целях диагностики можно конъюгировать опухоль-адресованные пептиды контрастирующими или флуоресцентными агентами, что позволяет локализовать опухоли и метастазы [16, 22, 24].
Таким образом, пептиды, отобранные из фаговых пептидных библиотек, связывающиеся с опухолями, являются перспективными кандидатами в адресные молекулы, способные повысить специфичность химиотерапевтических препаратов и диагностических агентов
к опухоли. Цель данной работы заключалась в in vivo селекции пептидов, связывающихся с
аденокарциномой лёгкого (или её стромой), а также в проверке способности специфичности
отобранных пептидов адресно связываться с опухолью.
Материалы и методы.
Животные, опухоли. В работе использовали мышей линии A/Sn разведения Института
цитологии и генетики СО РАН, а также опухоли аденокарциному лёгкого (AL) и гепатому (HA)
[7]. Асцитные опухолевые клетки перевивали подкожно концентрацией ̴106 клеток/мл, работа
проводилась на животных, когда опухолевые узлы достигали 5-8 мм в диаметре.
Фаговая пептидная библиотека. В работе использовали штамм Escherichia coli
ER2738 и фаговые пептидные библиотеки Ph.D.-12TM и Ph.D.-7TM фирмы New England Biolabs,
154
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Inc. на основе нитчатых бактериофагов. Библиотеки содержали пептидные встройки длиной
12 и 7 аминокислотных остатков в составе минорного белка pIII. В качестве контрольного фага
использовался фаг mp9 [25].
Аффинная селекция пептидов, специфически взаимодействующих с опухолью, проводилась с использованием метода селекции in vivo, описанного ранее [1] с модификациями.
Фаговую пептидную библиотеку разводили до концентрации 1011 БОЕ/мл в физиологическом
растворе и вводили мышам с солидными узлами AL в хвостовую вену в объёме 0,5 мл, после
чего вводили животным наркоз. Через 5 минут вскрывали грудную клетку и перфузировали
через сердце 10 мл охлажденного раствора Рингера. Опухоли извлекали, взвешивали и гомогенизировали в 1 мл физраствора, содержащего 1 мМ ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфлюорида, трижды отмывали физраствором, содержащим 1 % бычьего сывороточного
альбумина (БСА). Инкубировали 20 минут с 1 мл компетентной культуры ER2738 при температуре 37ºC на термошейкере. Затем центрифугировали 5 минут при 10000 об/мин, супернатант
добавляли в 20 мл компетентной культуры и инкубировали 4,5 часа при температуре 37ºC на
термошейкере. Полученную смесь фагов очищали и использовали для следующего раунда селекции. После третьего и четвертого раунда фаги не амплифицировали. Их высевали на чашки
Петри, после чего выделяли индивидуальные фаговые клоны, ДНК которых была подготовлена к секвенированию, как описано в инструкции к набору фаговых пептидных библиотек.
Секвенирование проводили на автоматическом капиллярном секвенаторе в ЦКП СО
РАН «Геномика». Обработка результатов секвенирования проводилась в программах ClustalW
и EMBOSS Transeq.
Анализ распределения отобранных фагов по органам проводился после введения животным 0,5 мл фагового раствора концентрацией 109 БОЕ/мл и 24-часовой инкубации. Мышей забивали, извлекали опухоли и лёгкие, взвешивали, гомогенизировали, отмывали в БСА,
инкубировали 5 минут с глициновым буфером (pH 2.2) для элюирования связавшихся фагов,
нейтрализовали кислую среду 1М раствором триса (pH 9.1). После центрифугирования супернатант отбирали и определяли в нем концентрацию фагов методом агаровых слоев. Распределение каждого фагового клона было оценено после опыта на 3 мышах.
Анализ связывания отобранных фагов с асцитными клетками AL проводился в тех
же условиях, что и анализ связывания с тканями. Количество опухолевых клеток при анализе
было 106. Инкубацию с 109 БОЕ проводили в течение 5 минут, а затем обрабатывали, как указано выше.
Результаты и обсуждение.
После трёх раундов аффинной селекции 12-мерной ФПБ из неамплифицированного
элюата последнего раунда для секвенирования был отобран 31 фаговый клон, из числа которых два были выбраны для дальнейшего исследования: со встройками TAAPVPKGPVSP и
MQAAYTPPLGSL (для простоты обозначим их 12-1 и 12-2, соответственно). После третьего
и четвертого раундов аффинной селекции 7-мерной ФПБ были определены последовательности 90 фагов, из которых 5 были выбраны для дальнейшей работы: со встройками TPWPRLN,
GNTPSRA, HAIYPRH, STASYTR, STPQTPR (7-1, 7-2, 7-3, 7-8, 7-9). Основным критерием выбора была частота встречаемости встройки среди фагов третьего и четвертого раундов, а также
предварительный анализ распределения фагов по организму (данные не приведены).
Анализ распределения выбранных фагов в мышах-носителях AL показал спустя 24
часа после их введения, что разница в накоплении изучаемых фагов в опухоли и лёгких, взятых
в качестве контрольного органа, составляет от нескольких десятков до нескольких сотен раз
(рис. 1). Контрольный фаг без встройки показал разницу лишь в 4 раза.
155
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Рис. 1 - График, отражающий распределение фаговых клонов по тканям
и органам спустя 24 часа после введения их в организм мыши-носителя AL.
Считается, что 5-минутная экспозиция фаговых библиотек в организме приводит к отбору фагов, связывающихся с растущими сосудами опухоли, которые значительно отличаются
по морфологическим и антигенным характеристикам от сформированных сосудов взрослого
человека [20]. Мы исследовали также способность некоторых фагов связываться с другой солидной опухолью – гепатомой. В данном эксперименте мышам перевивали сразу две опухоли
(��������������������������������������������������������������������������������������������
AL������������������������������������������������������������������������������������������
и ���������������������������������������������������������������������������������������
HA�������������������������������������������������������������������������������������
) – под кожу правого и левого бёдер. Результат представлен на рис. 2. Из графика видно, что в опухолях происходит гораздо большее скапливание исследуемых фагов по сравнению
с контрольным (соотношение такое же, как и при введении фагов мышам с одной перевитой
опухолью).
Рис. 2 - График, отражающий связывание фагов 12-2, 7-3 и контрольного фага с
разными солидными опухолями: AL и HA.
156
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Анализ взаимодействия отобранных фаговых клонов с асцитными клетками ������
AL����
показал, что связывание клонов не специфическое и не зависит от наличия встройки (рис. 3).
Для удобства сравнения приведены десятичные логарифмы данных. На графике видно, что ни
один фаг не связывается с клетками больше, чем в 6 раз, по сравнению с контрольным фагом.
ми AL.
Рис. 3 - График, отражающий связывание фаговых клонов с асцитными клетка-
Таким образом, из 12-мерной и 7-мерной фаговых пептидных библиотек с помощью
in vivo селекции были отобраны фаговые клоны, которые при внутривенном введении мышамопухоленосителям накапливались в опухоли в несколько десятков и сотен раз больше, чем в
контрольных органах. Отсутствие специфического связывания фагов с клетками опухоли in
vitro, а также наличие связывания с разными опухолями in vivo позволяют предположить, что
исследуемые фаги отобраны, скорее всего, на новообразующиеся кровеносные сосуды.
Библиографический список
1. Arap W., Pasqualini R., Ruoslahti E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor
Vasculature in a Mouse Model // Science. – 1998. – Vol. 279, N 5349. – P. 377-80.
2. Beck S., Jin X., Yin J., et al. Identification of peptide that interacts with Nestin protein
expressed in brain cancer stem cells // Biomaterials. – 2011. – Vol. 32, N 33. – P. 8518-28.
3. Brown K.C. Peptidic tumor targeting agents: the road from phage display peptide selections
to clinical applications // Curr Pharm Des. – 2010. – Vol. 16, N 9. – P. 1040-54.
4. Eriksson F., Culp W., Massey R., et al. Tumor specific phage particles promote tumor regression in a mouse melanoma model // Cancer Immunol Immunother. – 2007. – Vol. 56, N 5. – P. 677-87.
5. Holig P., Bach M., Volkel T., et al. Novel RGD lipopeptides for the targeting of liposomes
to integrin-expressing endothelial and melanoma cells // Protein Eng Des Sel. – 2004. – Vol. 17, N
5. – P. 433-41.
6. Joyce J., Laakkonen P., Bernasconi M., et al. Stage-specific vascular markers revealed by
phage display in a mouse model of pancreatic islet tumorigenesis // Cancer Cell. – 2003. – Vol. 4, N
5. – P.393-403.
7. Kaledin V.I., Matienko N.A., Nikolin V.P., et al. Intralymphatic administration of liposomeencapsulated drugs to mice: possibility for suppression of the growth of tumor metastases in the
lymph nodes // J Natl Cancer Inst. – 1981. – Vol. 66, N 5. – P. 881-7.
157
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
8. Krag D.N., Shukla G.S., Shen G.P., et al. Selection of tumor-binding ligands in cancer patients with phage display libraries // Cancer Res. – 2006. – Vol. 66, N 15. – P. 7724-33.
9. Krumpe L.R., Mori T. The use of Phage-Displayed Peptide Libraries to Develop TumorTargeting Drugs // Int J Pept Res Ther. – 2006. – Vol. 12, N 1. – P. 79-91.
10. Laakkonen P., Akerman M.E., Biliran H., et al. Antitumor activity of a homing peptide that
targets tumor lymphatics and tumor cells // Proc Natl Acad Sci USA. – 2004. – Vol. 101, N 25. – P.
9381-6.
11. Lee T.Y., Lin C.T., Kuo S.Y., et al. Peptide-mediated targeting to tumor blood vessels of lung
cancer for drug delivery // Cancer Res. – 2007. – Vol. 67, N 22. – P. 10958-65.
12. Lee T.Y., Wu H.C., Tseng Y.L., Lin C.T. A Novel Peptide Specifically Binding to Nasopharyngeal Carcinoma For Targeted Drug Delivery // Cancer Res. – 2004. – Vol. 64, N 21. – P. 8002-8.
13. Liu J., Chen H.C., Rao Z.Z., et al. Identification of heptapeptides interacting with IFN-αsensitive CML cells // Expert Opin Investig Drugs. – 2011. – Vol. 20, N 12. – P. 1583-9.
14. Loi M., Marchio S., Becherini P., et al. Combined targeting of perivascular and endothelial
tumor cells enhances anti-tumor efficacy of liposomal chemotherapy in nueroblastoma // J Control
Release. – 2010. – Vol. 145, N 1. – P. 66-73.
15. Michelfelder S., Trepel M. Adeno-associated viral vectors and their redirection to cell-type
specific receptors // Adv Genet. – 2009. – Vol. 67. – P. 29-60.
16. Miller S.J., Joshi B.P., Feng Y., et al. In vivo fluorescence-based endoscopic detection of colon dysplasia in the mouse using a novel peptide probe // PLoS One. – 2011. – Vol. 6, N 3, e17384.
17. Pasqualini R., Ruoslahti E. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries //
Nature. – 1996. – Vol. 380, N 6572. – P. 364-6.
18. Passarella R.J., Spratt D.E., van der Ende A.E., et al. Targeted nanoparticles that deliver a
sustained, specific release of Paclitaxel to irradiated tumors // Cancer Res. – 2010. – Vol. 70, N 11. –
P. 4550-9.
19. Rivinoja A., Laakkonen P. Identification of homing peptides using the in vivo phage display
technology // Methods Mol Biol. – 2011. – Vol. 683. – P. 401-15.
20. Ruoslahti E. Specialization of tumor vasculature // Nat Rev Cancer. – Vol. 2, N 2. – P. 83-90.
21. Tu X., Zhuang J., Wang W., et al. Screening and identification of a renal carcinoma specific
peptide from a phage display peptide library // J Exp Clin Cancer Res. – 2011. – Vol. 30. – P. 105-10.
22. Wu C.C., Lin E.H., Lee Y.C., et al. Identification of a new peptide for fibrosarcoma tumor
targeting and imaging in vivo // J Biomed Biotechnol. – 2010. – Vol. 2010. Id 167045.
23. Zhang W.J., Sui Y.X., Budha A., et al. Affinity peptide developed by phage display selection
for targeting gastric cancer // World J Gastroenterol. – 2012. – Vol. 18, N 17. – P. 2053-60.
24. Zitzmann S., Mier W., Schad A., et al. A New Prostate Carcinoma Binding Peptide (DUP-1)
for Tumor Imaging and Therapy // Clin Cancer Res. – 2005. – Vol. 11, N 1. – P. 139-46.
25. ��������������������������������������������������������������������������������
Петренко В.А., Семенова Л.Н., Киприянов С.М. и др. Производные ДНК фага М13, содержащие фрагмент гена β-галактозидазы, - удобная мутационная система для исследования
направленного олигонуклеотидами мутагенеза // Биоорганическая химия. – 1986. – Т. 12, №
12. – Стр. 1612-24.
158
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
УДК 619:579
ИНДИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS FLUORESCENS МЕТОДОМ
РЕАКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА
Викторов Д.А., к.б.н., старший научный сотрудник, т. 8-908-477-55-73,
e-mail: viktorov_da@mail.ru
Васильев Д.А., д.б.н., профессор, тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Артамонов А.М., соискатель
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
Ключевые слова: псевдомонозы рыб, Pseudomonas������������������������������
�����������������������������������������
, бактериофаги, реакция нарастания титра фага, фагодиагностика.
Применяемые в настоящее время методы диагностики, лечения и профилактики
псевдомонозов рыб имеют существенные недостатки. Авторами предложены усовершенствованные методы.
Актуальность.
Pseudomonas fluorescens выделяют главным образом из недоброкачественных пищевых продуктов (яйца, мясо, рыба, молоко), что указывает на роль данных бактерий в порче
пищевых продовольственных товаров и сырья. Могут быть выделены из клинического материала [5]��������������������������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������������������
. Наряду с другими видами бактерий неферментирующей группы, способны к биодеградации различных углеводородов, что придаёт Pseudomonas fluorescens важное практическое
значение при очистке почвы, воды и сточных вод промышленных предприятий от загрязнений
нефтепродуктами. Особенно актуально применение психрофильной бактерии Pseudomonas
fluorescens с этой целью в северных регионах страны при температуре 3-15 ºС [5]. Широко населяет ризосферу и способствует значительному улучшению роста и развития растений, являясь потенциальным объектом агробиотехнологии для разработки на их основе биологических
средств защиты растений от фитопатогенов, а так же биопрепаратов, стимулирующих рост и
повышающих продуктивность растений [5].
Pseudomonas fluorescens является возбудители псевдомоноза – заболевания карповых
рыб, распространенного в хозяйствах, применяющих индустриальные методы рыбоводства
[2].
Последствия энзоотий наносят ощутимый экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам [2].
В целях ликвидации псевдомонозов проводят ряд сложных и затратных мероприятий [1, 2, 5]. Хозяйство объявляют неблагополучным и вводят ограничения на перевозки рыб
[2]. Для лечения применяют дорогостоящие, малоэффективные в экономическом отношении
курсы антибиотиков: дибиомицина, экмолина, сульгина, левомицетина [2], которые накапливаются в тканях рыбы, попадая в дальнейшем в пищевое сырьё и продукцию. Использование
антибиотиков вызывает гибель полезной сапрофитной микрофлоры прудов, микрофлоры кишечника рыб, а бессистемное применение антибиотиков приводит к появлению антибиотикорезистентных бактерий.
Меры профилактики, применяемые в настоящее время, также обуславливают значительные затраты, связанные с дезинфекцией бассейнов и инвентаря, созданием оптимальных
зоогигиенических, гидрологических и гидрохимических условий, применением особой технологии посадки молоди рыб в бассейны, поддержанием оптимального температурного режима
[2].
159
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Применяемые на сегодня методы диагностики псевдомонозов далеко не совершенны.
Диагноз ставят на основании результатов бактериологического исследования с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков и патологоанатомических изменений [3]. При
типировании возбудителей заболевания до рода Pseudomonas применяется узкий ряд тестов
(оксидазная активность, тест окисления-ферментации, определение подвижности, реакция на
среде Клиглера), что обуславливает большую долю недостоверности исследования, которое,
кроме того, затрачивает от 84 до 126 часов [3]. Для определения видовой принадлежности
возбудителей, проводимой крайне редко, используются методы высевов на среды Гисса с маннитом, сахарозой, мальтозой, лактозой. По данным ряда исследователей, видовая дифференциация псевдомонад посредством определения сахаролитической активности не может давать
достоверных результатов [3].
Перечисленные причины обуславливают необходимость использования новых методов диагностики, обладающих следующими критериями: простота в применении, кратчайшие
сроки исследования, высокая чувствительность и специфичность.
Цель исследования: разработка биопрепарата на основе выделенного и изученного
бактериофага Pseudomonas fluorescens и параметры его применения в схеме реакции нарастания титра фага (РНФ) для индикации указанных бактерий.
Материалы и методы исследования.
Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам Д.М.
Гольдфарба (1961), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловича (1973), С.Н. Золотухина (2007).
Материалом исследования при выделении бактериофагов являлись 76 образцов прудовой воды и патологического материала. В качестве индикаторных культур использовали
штамм P. fluorescens ATCC 13525. Посевы инкубировали при температуре 28 оС в течение 24
часов.
Для получения негативных колоний бактериофагов использовали метод агаровых слоев по Грациа (Гольдфарб, 1961). Повышение литической активности проводили пассированием на индикаторных культурах. Литическую активность определяли по Аппельману и Грациа
(Гольдфарб, 1961). Для определения спектра литической активности использовали референсштамм P. fluorescens ATCC 13525 и выделенные нами ранее 28 полевых штаммов. Для определения специфичности использовали 2 референс-штамма бактерии P. putida №901 IV-89; ATCC
12633 IV-87, полученные из музея ГИСК им. Л.А. Тарасевича, 33 «полевых» штамма P. ���
putida, выделенные из объектов окружающей среды, 3 референс-штамма бактерии P. aeruginosa
№128, №381, №1677, 14 штаммов бактерий других родов: Aeromonas hydrophila, Proteus������
mira�����
bilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, E. coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia��������
pseudo�������
tuberculosis, Yersinia enterocolitica, Stenotrophomonas maltophila, полученные из музея кафедры
микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ при ФГБОУ ВПО Ульяновской ГСХА.
Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами.
Реакцию нарастания титра фага проводили по методам В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962), а также В.Я. Ганюшкина (1984).
Результаты исследований.
Препарат бактериофага �����������������������������������������������������
Pf���������������������������������������������������
01�������������������������������������������������
F������������������������������������������������
1-УГСХА обладает всеми необходимыми для проведения РНФ свойствами: титр бактериофага 0,7х108, спектр литической активности 86,2 %, строгая специфичность по отношению к бактерии P. fluorescens.
В результате серии исследований была разработана схема постановки РНФ с использованием биопрепарата бактериофага Pf01F1-УГСХА, представленная на рисунке 1.
160
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Рис. 1 - Схема реакции нарастания титра фага для индикации P. fluorescens.
Исследуемый материал весом 5 г растирается в фарфоровой ступке и вносится в колбы, содержащие по 50 мл питательного бульона (МПБ). Содержимое колб культивируется в
течение 5 часов при 28 оС для предварительного подращивания бактерий. На каждую исследуемую пробу отводится три пробирки: №1 предназначена для опытной пробы, №2 является контролем на свободный фаг, №3 – контроль титра индикаторного фага. Исследуемый материал
разливается по 9 мл в пробирки №1 и №2, пробирки №3 содержат 9 мл МПБ. В пробирки №1
и №3 добавляется по 1 мл препарата бактериофага Pf01F1-УГСХА в рабочем разведении (титр
бактериофага 104), а пробирки №2 – 1 мл МПБ. Все пробы инкубируются в термостате при
температуре 28 оС 7 часов. Параллельно ставится контроль стерильности сред. После инкубации из пробирок берутся пробы по 0,25 мл, вносятся в пробирки с 4,5 мл МПБ и обрабатываются фильтрованием через бактериальные фильтры. Далее содержимое пробирок исследуется
методом агаровых слоев по Грациа. Чашки инкубируются 12 часов при 28 оС.
Реакция считается положительной при нарастании титра бактериофага Pf01F1-УГСХА
в 5 и более раз.
Выводы: разработанная нами схема РНФ с использованием биопрепарата бактериофага Pf01F1-УГСХА позволяет проводить индикацию P. fluorescens в различных объектах
количестве от 103 м.к./мл в течение 24 часов. Преимущества метода РНФ: время на исследование сокращается до 24 часов, реакция обладает высокой чувствительностью – метод позволяет проводить индикацию возбудителя при содержании его в исследуемых образцах от
103 м.к./мл., высокой специфичностью, не требуется выделение чистой культуры возбудителя,
методика проста, не требует использования дорогостоящего оборудования и материалов, высококвалифицированных специалистов [4]. Перечисленные достоинства позволяют судить о
161
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
высокой экономической эффективности метода РНФ в сравнении с существующими методами
диагностики псевдомоноза рыб [4].
Библиографический список
1. Вялова Г.П. Методы борьбы и профилактики псевдомоноза молоди горбуши / Г.П.
Вялова, А.В. Полтева, З.К. Шкурина // Информ. листок СахЦНТИ. – 1995. – № 38-95. – С. 4.
2. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации псевдомоноза рыб,
Минсельхозпрод России, Департамент ветеринарии, 1998.
3. Методические указания по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб, Минсельхозпрод России, Департамент ветеринарии, 1998.
4. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. К., «Урожай», 1978.
5. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев. Наукова думка,
1990, с. 176-187.
INDICATION OF BACTERIA OF THE PSEUDOMONAS FLUORESCENS
BY METHOD OF REACTION OF RISE OF TITRE OF THE PHAGE
Viktorov D.А., Vasilev D.А., Аrtamonov А.М.
Keywords: pseudomonosis fish, Pseudomonas, bacteriophages, phage titer rise reaction,
fagodiagnostika.
The authors proposed a new method of indicating Pseudomonas fluorescens (diagnostics
pseudomonosis of fish) with the use of the reaction of rise of titre of the phage. The appropriate
bacteriophages were allocated, their properties were studied and diagnostic biopreparation was
developed.
УДК 619:579
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ
ПСЕВДОМОНОЗОВ РЫБ
Викторов Д.А. , кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник, тел. 9084775573, viktorov_da@mail.ru
Гринева Т.А., соискатель, тел. 9033201410, e-mail: tag78@mail.ru
Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор,
тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru
Артамонов А. М., соискатель
Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор,
тел. 9272703480, fvm.zol@yandex.ru
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»
Ключевые слова: псевдомонозы рыб, Pseudomonas������������������������������
�����������������������������������������
, бактериофаги, реакция нарастания титра фага, фагодиагностика.
162
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Применяемые в настоящее время методы диагностики, лечения и профилактики
псевдомонозов рыб имеют существенные недостатки. Авторами предложены усовершенствованные методы.
Псевдомонозы – заболевания карповых рыб, вызываемые патогенными штаммами
флюоресцирующих бактерий рода Pseudomonas. [3, 4]. Подвержены карпы, караси, пестрые
и белые толстолобики, белые и черные амуры, буффало и другие карповые рыбы. Источником возбудителей заболевания являются больные рыбы, их трупы, дикие рыбы, обитающие в
водоисточниках. [4] Передаются прямым контактом и опосредованно через воду, инвентарь, с
эктопаразитами [2, 3, 5].
Псевдомонозы довольно распространены в хозяйствах, применяющих индустриальные методы рыбоводства [4]. Поскольку они вызывают массовую гибель рыбы, а переболевшая рыба теряет вес и товарные качества, последствия энзоотий наносят ощутимый экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам.
Для ликвидации псевдомонозов проводят ряд сложных и затратных мероприятий [2,
4, 9]. Хозяйство объявляют неблагополучным и вводят ограничения на перевозки рыб. При лечении применяют дорогостоящие, малоэффективные в экономическом отношении курсы антибиотиков: дибиомицина, экмолина, сульгина, левомицетина [4], которые накапливаются в тканях рыбы, попадая в дальнейшем в пищевое сырьё, продукцию, а в конечном итоге в организм
человека. Использование антибиотиков вызывает гибель полезной сапрофитной микрофлоры
прудов, микрофлоры кишечника рыб, а бессистемное применение антибиотиков приводит к
появлению мутантных антибиотикорезистентных форм псевдомонад.
Применяемые в настоящее время меры профилактики также обуславливают значительные затраты, связанные с дезинфекцией бассейнов и инвентаря, созданием оптимальных
зоогигиенических, гидрологических и гидрохимических условий, применением особой технологии посадки молоди рыб в бассейны, поддержанием оптимального температурного режима
[4].
Далеко не совершенны применяемые на сегодня методы диагностики псевдомонозов.
Диагноз ставят на основании результатов бактериологического исследования с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков и патологоанатомических изменений [6]. При
типировании возбудителей заболевания до рода Pseudomonas применяется узкий ряд тестов
(оксидазная активность, тест окисления-ферментации, определение подвижности, реакция на
среде Клиглера), что обуславливает большую долю недостоверности исследования, которое,
кроме того, требует от 84 до 126 часов. Такое длительное время, потраченное на диагностику,
оказывается фатальным для хозяйств. Для определения видовой принадлежности возбудителей, проводимой крайне редко, используются методы высевов на среды Гисса с маннитом,
сахарозой, мальтозой, лактозой [6]. По данным ряда исследователей, видовая дифференциация
псевдомонад посредством определение сахаролитической активности не может давать достоверных результатов [8].
Авторами разработаны более совершенные, по ряду критериев, методы идентификации и дифференциации бактерий рода Pseudomonas [1]. В частности, разработана бактериологическая схема, позволяющая проводить выделение, идентификацию и дифференциацию
псевдомонад до вида за 96 часов, основанная на применении оригинальных специфических
питательных сред – среды накопления ������������������������������������������������
Psp���������������������������������������������
-��������������������������������������������
A�������������������������������������������
-УГСХА с сукцинатом натрия и плотной селективной среды �����������������������������������������������������������������������
Psp��������������������������������������������������������������������
-�������������������������������������������������������������������
S������������������������������������������������������������������
-УГСХА с глюкозой, бромтимоловым синим и фурадонином, а так же системы бактериологических тестов, включающих тест на оксидазу, каталазу, желатиназу, окисление глюкозы в аэробных условиях, чувствительность к хлориду бария, окраска по Граму,
163
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
подвижность клеток, утилизация ацетамида, продукция леванасахаразы, наличие характерной
пигментации, реакция «стекающая капля» с бактериофагами, специфичными в отношении патогенных для рыб псевдомонад: P. putida, P. fluorescens, P. chlororaphis [1].
Также разработаны биопрепараты на основе выделенных и изученных нами бактериофагов названных видов бактерий, оптимизированы параметры их применения в схеме реакции
нарастания титра фага (РНФ) для экспресс-диагностики псевдомонозов рыб [1]. Данный метод
имеет ряд существенных преимуществ: время на исследование сокращается до 24 часов, реакция обладает высокой чувствительностью – метод позволяет проводить индикацию возбудителя при содержании его в исследуемых образцах от 103 м.к./мл., высокой специфичностью, не
требуется выделение чистой культуры возбудителя, методика проста, не требует использования дорогостоящего оборудования и материалов, высококвалифицированных специалистов [1,
7]. Перечисленные достоинства позволяют судить о высокой экономической эффективности
метода РНФ в сравнении с существующими методами диагностики псевдомоноза рыб [7].
Библиографический список
1. Викторов Д.А. Выделение бактериофагов бактерий Pseudomonas putida и их селекция в целях создания биопрепарата для диагностики псевдомоноза рыб / Д.А. Васильев, Д.А.
Викторов, И.И. Богданов // Естественные и технические науки. – 2011. – №2(52). – С. 79-82.
2. Вялова Г.П. Методы борьбы и профилактики псевдомоноза молоди горбуши / Г.П.
Вялова, А.В. Полтева, З.К. Шкурина // Информ. листок СахЦНТИ. – 1995. – № 38-95. – С. 4.
3. Грищенко Л.И. Болезни рыб и основы рыбоводства. Учебник. / Грищенко Л.И., Акбаев М.Ш., Васильков Г.В. - М.: Колос, 1999. - С. 10-69; 139-263; 420-448.
4. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации псевдомоноза рыб,
Минсельхозпрод России, Департамент ветеринарии, 1998.
5. Лобунцов К.А. Септический псевдомоноз карпов и толстолобиков / Лобунцов К.А.
[и др.] // Ветеринария.-1971.- С. 58 -59.
6. Методические указания по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб, Минсельхозпрод России, Департамент ветеринарии, 1998.
7. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. К., «Урожай», 1978.
8. Смирнов В.В. Бактерии рода Pseudomonas / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова // Киев:
Наук. Думка. - 1990. – с. 65-69.
9. Altinok I. Pseudomonas putida infection in rainbow trout / Altinok I., Kayis S., Capkin E.
// Aquaculture. December 2006. Volume 261. p.850-855.
IMPROVEMENT OF METHODS OF DIAGNOSTICS
OF PSEUDOMONOSIS OF FISH
Viktorov D.А., Grineva Т.А., Vasilev D.А.,
Аrtamonov А.М., Zolotukhin S.N.
Keywords: pseudomonosis fish, Pseudomonas, bacteriophages, phage titer rise reaction,
fagodiagnostika.
The currently applied methods of diagnostics, treatment and prevention of pseudomonosis of
fish have significant disadvantages. The authors proposed improved methods.
164
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ
ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО – ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И ЭНТЕРАЛЬНЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ УСЛОВНО – ПАТОГЕННЫМИ
БАКТЕРИЯМИ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ
Ворошилова Н.Н. доктор медицинских наук, профессор
Боговазова Г.Г. кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник
Казакова Т.Б. кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник
Алферова Э.В. кандидат биологических наук
Филиал ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» г. Уфа
Тел. (347) 229-92-54, reza08@mail.ru
Ключевые слова: бактерии, бактериофаги, способы приготовления препаратов
бактериофагов, гнойно – воспалительные заболевания, лечение.
Разработаны эффективные технологии приготовления новых препаратов бактериофагов, в том числе: пиобактериофага поливалентного очищенного, бактериофага клебсиелл
поливалентного очищенного, бактериофага клебсиелл пневмонии очищенного, бактериофага
энтеробактер поливалентного очищенного. Препараты бактериофагов не вызывают токсических и аллергических реакций, обладают широким спектром антибактериальной активности и высокой степенью клинической эффективности, что дает возможность расценивать их как эффективные и альтернативные антибиотикам средства антибактериальной
терапии. Препараты бактериофагов эффективны при лечении гнойно - воспалительных заболеваний мочеполовой сферы (цистит, кольпит, пиелонефрит, гломерулонефрит, сальпингоофорит, простатит), хирургических инфекций (абсцесс, флегмона, перитонит, плеврит,
мастит, нагноения ран, ожогов), воспалительных заболеваний глаз (коньюнктивит, кератит, язва роговицы иридоциклит), стоматитов, заболеваний уха, горла и носа (гайморит,
фронтит, отит, ангина, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония), а также инфекционных
заболеваний новорожденных (перитонит, менингит, пневмония, отит, омфалит, везикулопустулез, остеомиелит, сепсис).
Антибиотикотерапия гнойно – воспалительных и энтеральных заболеваний, вызванных условно - патогенными бактериями Кlebsiella, Escherichiae, Proteus, Pseudomonas,
Staphylococcus, Streptococcus, Enterobacter чрезвычайно затруднена естественной резистентностью возбудителей к антибиотикам, а также неуклонным ростом антибиотикорезистентных
форм бактерий и ростом числа побочных токсических, аллергических и дисбиотических осложнений от применения антибиотиков. В числе этих заболеваний - хирургические инфекции,
заболевания уха, горла, носа, легких и плевры, озена, склерома, урогенитальная патология,
гастроэнтероколиты, дисбактериоз кишечника, инфекционные заболевания детей первого года
жизни. В связи с изложенным, разработка новых препаратов бактериофагов, как альтернативы
антибиотикам, является весьма актуальной задачей.
Нами разработаны новые препараты бактериофагов, технологии их приготовления и
способы применения, которые защищены патентами Российской Федерации и не имеют мировых аналогов, в том числе это - пиобактериофаг поливалентный очищенный, бактериофаг
клебсиелл поливалентный очищенный, бактериофаг клебсиелл пневмонии очищеный, бактериофаг энтеробактер поливалентный очищенный [1-8].
В таблице 1 приведены характеристики спектра антибиактериальной активности новых препаратов.
165
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Таблица 1 - Спектр антибактериальной активности препаратов бактериофагов
Препараты
Спектр антибактериальной активности
бактериофагов
Пиобактериофаг
поливалентный очищенный
Бактериофаг клебсиелл
поливалентный очищенный
Бактериофаг клебсиелл
препаратов бактериофагов
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus
vulgaris, Кlebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Sreptococcus рneumoniae,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactia,
Echerichiae сoli (serotypes O1, 012, 025, 010, 023, О13,
055, 018, 013, 0133, 0124, 06, 026, 03, О9, 0О11,012,
0114, 044, 0127, 0111, 0О125, 0142, 0112, 020, 033, 151)
Кlebsiella rhinoscleromatis,
Кlebsiella ozaenae
Кlebsiella pneumoniae
пневмонии очищенный
Бактериофаг
энтеробактер Еnterobacter
cloace,
поливалентный очищенный
Enterobacter аеrogenes
Кlebsiella
Еnterobacter
pneumoniae,
agglomerans,
Технологии приготовления вышеперечисленных препаратов бактериофагов предусматривают постоянное обновление состава бактериофагов в препаратах под контролем спектра
их антибактериальной активности, а также оптимизированные способы периодического динамического гомогенного глубинного культивирования бактерий и бактериофагов, способы
очистки фаголизатов бактерий от бактериальных клеток, бактериальных токсинов и метаболитов с использованием методом мембранного разделения. Степень очистки составляет 98-99%,
что позволяет исключить токсические и аллергические реакции на применение препаратов.
Способы применения препаратов бактериофагов следующие - прием внутрь, орошение ран,
введение в дренированные полости - брюшную, плевральную, полости пазух носа, среднего
уха, абсцессов, ран, матки, мочевого пузыря.
Нами установлено, что препараты бактериофагов по широте спектра антибактериальной активности не уступают и даже превосходят большинство из изученных нами антибиотиков (33 вида). Пиобактериофаг поливалентный очищенный был активен в отношении 89,0%
E.coli; 85,0% - Staphylococcus; 88,0 % - Streptococcus; 72,0% - Proteus; 81% - Ps.аeruginoza; 89%
- K. pneumoniae. Активность большинства антибиотиков была значительно ниже (таблица 2).
Бактериофаг клебсиелл пневмонии очищенный и бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный превосходили по антибактериальной активности в отношении бактерий
����������������������������������������������������������������������������������������������
lebsiella�������������������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������������������
rhinoscleromatis��������������������������������������������������������������������
, �����������������������������������������������������������������
lebsiella��������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������
pneumoniae���������������������������������������������
, ������������������������������������������
lebsiella���������������������������������
��������������������������������
ozaenae�������������������������
все изученные нами антибиотики.
Аналогичные данные были получены при изучении активности бактериофага энтеробактер поливалентного очищенного в отношении бактерий Еnterobacter cloace, Еnterobacter
agglomerans���������������������������������������������������������������������������������
, Enterobacter�������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������
ае����������������������������������������������������������������
rogenes���������������������������������������������������������
(активность 83,2-88,1%). Установлено, что препараты бактериофагов в отличие от антибиотиков безвредны, нереактогенны, не агрессивны в отношении
пробиотиков –лактобактерина, бифидумбактерина и бактисубтила.
Нами установлено, что препараты бактериофагов эффективны при лечении заболеваний, вызванных антибиотикорезистентными штаммами бактерий, в частности - паратонзиллярных абсцессов, воспалений пазух носа, а также гнойно - септических заболеваний больных
реанимации, хирургических инфекций, плевритов, бронхитов, пиелонефритов, холециститов,
гастроэнтероколитов, циститов, парапроктитов, гастроэнтероколитов, дисбактериоза кишеч-
166
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
ника, воспалительных заболеваний и сепсиса новорожденных. Применение пиобактериофага
поливалентного очищенного и бактериофага энтеробактер поливалентного очищенного при
лечении хронического цистита, пиелонефрита, простатита, уретрита, нагноений ран позволило в 84% случаев получить положительный бактериологический эффект и в 92% случаев - положительный клинический эффект, который был сопоставим с активностью только фторхинолов и превосходил по эффективности другие используемые в урологии антибактериальные
препараты. При этом установлено, что причиной указанных заболеваний являются бактерии
родов Кlebsiella, Escherichiae, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Enterobacter,
из которых 80% составляли представители семейства Enterobactericeae.
Доля полирезистентных к антибиоитикам бактерий (резистентность более чем к 50%
препаратов) составляла 29-95%. Чувствительность выделенных бактерий к пиобактериофагу
и бактериофагу энтеробактер поливалентному, соответственно составляла 72-94%, препараты
были активны и в отношении антибиотикорезистентных штаммов бактерий. Кроме того, нами
установлено, что в 64,75% случаев у таких больных выявлен дисбактериоз кишечника и контаминация его условно - патогенной микрофлорой, в том числе - Escherichia coli���������������
�������������������
(23,7%), �����
Pseudomonas aer. (16,7%), Proteus (12,4%), Klebsiella (6,1%), Enterobacter (12,6%), Staphуlococcus
(5,1%), �������������������������������������������������������������������������������
Streptococcus������������������������������������������������������������������
(13,1%). Дополнительное пероральное введение препаратов бактериофагов, помимо их местного применения (в полости мочевого пузыря, почечной лоханки при
наличии дренажей) в очаге воспаления, позволило воздействовать как на экзогенный, так и
эндогенный факторы инфицирования и получить положительный бактериологический (элиминация возбудителя из очага воспаления) и положительный клинический эффект соответственно у 88,4±0,9% и 92,2±0,7% больных. В контрольной группе больных, получавших традиционную антибактериальную терапию, эти данные составляли соответственно 39,1±9,2%
и 58,5±5,5%. При сравнении с контрольной группой больных установлено, что применение
препаратов бактериофагов приводило к стимуляции иммунитета, о чем свидетельствовали показатели фагоцитоза, метаболическая активность нейтрофилов, абсолютное количество лимфоцитов, относительное количество Т - лимфоцитов, нормализация уровня нейтрофилов, увеличение в сравнении с контролем доли фагоцитирующих нейтрофилов.
167
168
Пенициллин
0
Левомицетин
10,0
Карбенициллин
5,9
Цефалоидин
2,3
Тетрациклин
39,2
Стрептомицин
9,8
Фузидин
0
Линкомицин
23,3
Бензилпенициллин
40,0
Н и т р о к с о л и н 96,6
О л е а н д о м и ц и н 13,3
Эритромицин
60,0
Рифампицин
30,0
Ванкомицин
0
Цефазолин
90,0
Ампициллин
73,3
Цефалексин
70,0
Гентамицин
93,3
Оксациллин
33,0
Доксациллин
0
0
4,5
3,5
0
1,3
2,2
0
0
13,3
96,6
3,0
0
33,3
6,6
83,3
46,6
70,0
96,6
6,6
0
0
36,15,9
29,6
55,6
2,8
96,6
90
50,4
96,6
73,3
70,0
96,6
96,6
86,6
30,0
83,3
86,6
86,6
0
0
7,5
18,8
3,8
17,5
3,8
0
0
0
0
0
1,9
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1,0
3,0
3,0
4.0
3,0
0
0
0
0
0
3,2
0
0
0
0
0
41,8
0
0
0
18,5
0
0
8,3
5,6
0
0
0
0
1,6
4,8
1,6
0
0
0
0
91,7
0
0
0
56,5
0
0
30,7
29,0
0
0
2
0
0
11,4
25,7
0
0
0
0
84,3
0
0
0
41,9
1,6
0
19
27,4
0
0
0
4
0
17,2
17,2
0
0
0
0
87,7
0
0
0
41,9
1,6
0
19,4
27,4
0
0
0
1,6
1,6
4,8
1,6
0
0
0
0
67,7
1
3,2
0
18,5
0
0
8,3
5,6
0
0
0
0
0
1,9
0
0
0
0
0
21,3
8,6
1,9
0
56,5
0
0
37,0
29,0
0
0
0
0
0
3,2
0
0
0
0
0
25,8
4,6
2,6
Таблица 2. Спектр антибактериальной активности антибиотиков и препаратов бактериофагов в отношении клинических штаммов бактерий
Entero- E n t e r o - E n t e r o K.rhinProPs.aerubacter
ba c t e r bacter
Антибактериаль- E. coli
Staph. S t r e p t
K.pneumoniae K.ozaenae o s c l e r o teus
ginoza
a g g l o - aerogecloace
ные препараты
102шт.
108шт 80шт
150шт
120шт
matis
230шт
100шт
merans nes.
209 шт
150шт
104 шт 180 шт
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Пиобактериофаг
поливалентный
очищенный
Бактериофаг клебсиелл
пневмонии
очищенный
Бактериофаг
к л е б с и е л л
поливалетный
очищенный
Бактериофаг
Энтеробактер
поливалентный
очищенный
Колистин
Цефотоксим
Хлорамфеникол
Тримоксазол
Сульфизоксазол
Ципрофлоксацин
Ристомицин
Тобрамицин
А з л о ц и л л и н
Амикацин
Клиндамицин
1
72,0
-
-
-
-
-
-
13,3
93,1
73,3
46,6
6,6
100
12,0
100
60,0
100
13,3
3
89,0
42,8
96,6
86,6
48,2
0
96,0
51,0
96,6
79,3
96,6
10,0
2
-
-
-
85,0
6,6
86,6
93,3
13,3
0
80,0
68,0
89,6
63,3
86,6
86,6
4
-
-
-
88,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5
-
-
-
81,0
0
14,8
0
0
0
7,7
0
0
27,3
14,3
0
6
-
88,0
88,0
89,0
12,1
8,6
14,1
0
0
17,0
0
0
0
12,2
0
7
-
93,0
-
-
0
0
0
15,3
0
12,4
0
0
11,7
0
0
8
-
88,0
-
-
9,1
0
7,3
0
0
10,3
0
0
0
0
0
9
85,1
-
-
-
0
0
6,8
7,4
0
0
7,3
0
0
13,3
0
10
83,2
3,2
7,2
0
0
0
5,3
0
9.7
0
0
0
11
88,1
-
-
-
0
3,2
17,6
0
0
0
0
23,5
0
0
0
12
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
169
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
При изучении эффективности препарата в офтальмологии показано, что пиобактериофаг поливалентный очищенный является высокоэффективным препаратом при лечении
гнойных посттравматических поражений глаз – коньюнктивитов, кератитов, язв роговицы,
иридоциклитов.
При лечении стоматологической патологии установлено, что причиной возникновения
пародонтита являются бактерии Staphуlococcus (26%), Streptococcus (63%), а также - Proteus,
Klebsiella�������������������������������������������������������������������������������
, Enterobacter�����������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������������
. Препарат пиобактериофага обладает широким спектром антибактериальной активности в отношении клинических штаммов бактерий - 78-98% (из 1036 штаммов),
в том числе - в отношении штаммов, резистентных к антибиотикам и эффективен при лечении
пародонтита у больных с общесоматической патологией (инфекционные поражения желудочно - кишечного тракта, дыхательных путей).
Использование пиобактериофага поливалентного очищенного в терапии паратонзиллитов предупреждает возможность тонзилогенных осложнений и рецидивов, способствует активации Т - клеточного и фагоцитарного звеньев иммунитета на общем и региональном уровне.
При лечении 136 больных хроническим гнойным риносинуситом нами установлено, что этиологически значимыми в возникновении этого заболевания являются бактерии
Staphylococcus, Ps. aeruginosa, E.col, K. pneumoniae, Ent. aerogenes, Ent. сloace. Также установлено, что пиобактериофаг поливалентный очищенный обладает широким спектром антибактериальной активности (88,2% - 100%) в отношении патогенных бактерий Staphylococcus,
Streptococcus, E. coli, Kl.pneumoniae и Ps. аeruginosa, позволяет эффективно элиминировать
патогенные бактерии из очага воспаления, в отличие от антибиотиков, стимулирует местный
клеточный иммунитет, что в совокупности определяет высокую (100%) клиническую эффективность данного препарата и позволяет удлинить в сравнении с антибиотикотерапией в 2,4
раза сроки ремиссии заболевания и предотвратить вторичное инфицированием слизистых
оболочек патогенными грибами. При изучении эффективности препарата бактериофага клебсиелл пневмонии установлено, что препарат эффективен в 92-100% случаев клебсиеллезных
инфекционных заболеваний - при лечении гнойно - воспалительных заболеваний мочеполовой
сферы (цистит, кольпит, пиелонефрит, гломерулонефрит, сальпингоофорит, простатит), хирургических инфекций (абсцесс, флегмона, перитонит, плеврит, мастит, нагноения ран, ожогов),
а также инфекционных заболеваний новорожденных (перитонит, менингит, пневмония, отит,
омфалит, везикулопустулез, остеомиелит, сепсис).
При изучение терапевтической активности препарата бактериофага клебсиелл поливалентного установлено, что применение препарата было эффективным в 92% случаев при
лечении атрофических форм озены и позволило получить выраженный клинический эффект в
виде снижения явлений атрофии, нормализации состояния слизистых оболочек верхних дыхательных путей и носового дыхания. Применение препарата для лечения острых форм склеромы было эффективным в 80% случаев. У 63% больных отмечено улучшение клинического состояния уже на 10-15 день лечения. Препарат был эффективным в 100% случаев при лечении
гайморитов, отитов, абсцессов носовой перегородки, фронтита, эпитимпанита, пиелонефрита,
орхоэпидидимита, цистита и паранефральной флегмоны.
Изучение клинической эффективности бактериофага энтеробактер поливалентного
очищенного (проведено на 216 больных) показало, что препарат был эффективен при лечении
хронических гастроэнтероколитов и дисбактериоза кишечника - клиническая эффективность в
91,4% случаев, в контрольной группе эффективность составляла 55,3%. Препарат был эффективен при лечении урологических инфекций - клиническая эффективность 86,6±13,5%, хирургических инфекций - нагноений ожогов, гнойных ран, остеомиелита, медиастинита, абсцессов
170
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
и флегмон - эффективность 86,3±12,1%., а также при лечении инфекционных заболеваний новорожденных и детей первого года жизни - пневмонии, диареи, омфалита, цистита, нефроза.
Бактериологическая эффективность при фаготерапии новорожденных составляла 68,6±11,3%,
клиническая эффективность - 90,9±4,6%. В контроле эти показатели составляли соответственно 36,6±11,3% и 65,4±4,2%..
Выводы: 1. Разработаны эффективные технологии приготовления и способы применения новых препаратов бактериофагов, в том числе: пиобактериофага поливалентного очищенного, бактериофага клебсиелл поливалентного очищенного, бактериофага клебсиелл пневмонии очищеного, бактериофага энтеробактер поливалентного очищенного.
2. Разработанные препараты бактериофагов не вызывают токсических и аллергических реакций, не влияют на препараты пробиотиков, обладают широким спектром антибактериальной активности и высокой степенью клинической эффективности.
3. Препараты бактериофагов эффективны при лечении гнойно - воспалительных заболеваний мочеполовой сферы (цистит, кольпит, пиелонефрит, гломерулонефрит, сальпингоофорит, простатит), хирургических инфекций (абсцесс, флегмона, перитонит, плеврит, мастит,
нагноения ран, ожогов), воспалительных заболеваний глаз (коньюнктивит, кератит, язва роговицы иридоциклит), стоматитов, пародонтитов, заболеваний уха, горла, и носа (гайморит,
фронтит, отит, ангина, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония), а также инфекционных заболеваний новорожденных (перитонит, менингит, пневмония, отит, омфалит, везикулопустулез,
остеомиелит, сепсис).
Библиографический список
1. Ворошилова Н.Н., Баснакьян И.А., Казакова Т.Б., Михайлов А.И., Каримов Р.М.
Способ культивирования бактериофагов энтеробактерий. Патент РФ № 1058283. 1983.
2. Ворошилова Н.Н., Горбаткова Г.А., Казакова Т.Б., Байгузина Ф.А., Боговазова Г.Г.,
Перепечкин Л.П., Борщов А.П., Афанасьева О.Н.,Федотова Е.Е. Способ выделения бактериофагов. 1988. Патент РФ № 412302. 1988.
3. Ворошилова Н.Н., Казакова Т.Б., Горбаткова Г.А., Боговазова Г.Г., Афанасьева Э.В.,
Бондаренко В.М. Способ получения пиобактериофага. Патент РФ №2036232. 1992.
4. Н.Н.Ворошилова, Г.Г.Боговазова, В.М.Бондаренко, Т.Б.Казакова, Г.А. Горбаткова.
Препарат бактериофага клебсиелл пневмонии. Патент РФ №1697422. 1990.
5. Н.Ворошилова, Г.Г.Боговазова, В.М.Бондаренко, Т.Б.Казакова, Г.А.Горбаткова. Препарат бактериофага клебсиелл поливалентный. Патент РФ №1697421. 1990.
6. Фаттахов Б.Т., Сережин И.Н., Ворошилова Н.Н., Даутова З.А. Средство для лечения
травматических инфекций глазных болезней. Заявка на патент 96119718\ 14 (26159), положительное решение от 28.06.99. № 145703.
7. Ворошилова Н.Н., Казакова Т.Б., Боговазова Г.Г., Алферова Э.В., Усманова С.С.,
Горбаткова Г.А. Способ получения пиобактериофага поливалентного Патент РФ № 2153534.
1999.
8. Арефьева Н.А., Ворошилова Н.Н., Азнабаева Л.Ф., Султанов Н.М. Способ лечения
хронических гнойных риносинуситов. Патент РФ №2345784. 2009.
DEVELOPMENT OF NEW PREPARATIONS OF BACTERIOPHAGES
FOR TREATMENT IT IS PURULENT – THE INFLAMMATORY AND
ENTERALNY DISEASES CAUSED CONDITIONALLY – PATHOGENIC
BACTERIA AND STUDYING OF THEIR CLINICAL EFFICIENCY
171
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Voroshilova N. N. Bogovazova G.G. Kazakova T.B. Alfyorova E.V.
Key words: bacteria, bacteriophages, ways of preparation of preparations of bacteriophages,
it is purulent – inflammatory diseases, treatment
Effective technologies of preparation of bacteriophages new preparations are developed,
including: pyobacteriphage polyvalent cleared, bacteriophage klebsiellae polyvalent cleared,
bacteriophage klebsiellae pneumoniae cleared, bacteriophage an enterobakter polyvalent cleared.
Preparations of bacteriophages don’t cause toxic and allergic reactions, possess a wide range of
antibacterial activity and high degree of clinical efficiency that gives the chance to regard them as
means of antibacterial therapy effective and alternative to antibiotics. Preparations of bacteriophages
are effective at treatment is purulent - inflammatory diseases of the urinogenital sphere (cystitis,
a colpitis, pyelonephritis, glomerulonephrinis, salpingooforitis, prostatitis), surgical infections
(abscess, phlegmon, peritonitis, pleurisy, mastitis, suppurations of wounds, burns), inflammatory
diseases of eyes (conjunctivitis, keratitis, a cornea ulcer, iridociklitis), stomatitises, diseases of an
ear, a throat, and a nose (antritis, plays the dandy, otitis, quinsy, laryngitis, tracheitis, bronchitis,
pneumonia), and also infectious diseases of newborns (peritonitis, meningitis, pneumonia, otitis,
omphalitis, vesiculopustulesis, osteomyelitis, sepsis).
УДК 579.843:578.1
БАКТЕРИОФАГИ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ:
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ
Гаевская Н.Е., gaevskaya.nata@mail.ru
Кудрякова Т.А., доктор медицинских наук,
Македонова Л.Д., кандидат медицинских наук,
Качкина Г.В.,
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт»
Роспотребнадзора, тел. 8(863) 240-91-08
Ключевые слова: Vibrio parahaemolyticus, бактериофаги, биологические свойства,
фаготипирование.
Для первичной характеристики и дифференциации свежевыделенных фагов парагемолитических вибрионов предложены 2 индикаторных штамма. Проведено сравнительное
изучение биологических свойств 20 бактериофагов парагемолитических вибрионов, выделенных в разных регионах нашей страны. Осуществлено фаготипирование штаммов парагемолитических вибрионов по новой схеме, которая включает в себя 11 фаготипов.
Введение. При обследовании больных острыми желудочно-кишечными заболеваниями ���������������������������������������������������������������������������������
(��������������������������������������������������������������������������������
ОЖКЗ����������������������������������������������������������������������������
)���������������������������������������������������������������������������
, особенно в приморских районах, а также морской воды и её обитателей выделяются галофильные вибрионы, играющие определенную роль в патологии человека [1, 2].
Впервые парагемолитические вибрионы были выделены в Японии в 1950 г., где они были признаны причиной 70% пищевых отравлений [3]. У нас в стране парагемолитические вибрионы
обнаружены в морях, соленых озёрах и продуктах моря.
Бактериологическая диагностика гастроэнтеритов, вызываемых парагемолитически-
172
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
ми вибрионами, относится к одной из актуальных проблем. [4, 5, 6]. Во Владивостоке спорадические кишечные заболевания, вызванные парагемолитическими и алгинолитическими
вибрионами, отмечались с 1977 г. и продолжаются до настоящего времени, а в июле-августе
1997 г. зарегистрирована вспышка этой инфекции [4, 7]. Штаммы Vibrio����������������������
����������������������������
parahaemolyticus�����
���������������������
, обусловившие вспышку пищевой токсикоинфекции в 1997 г. и спорадические заболевания в последующие годы в г. Владивостоке относились к серогруппе О3:К6 и не были охарактеризованы по продукции умеренных фагов.
Приоритет в открытии фагов парагемолитических вибрионов принадлежит японским
исследователям [8]. В нашей стране первые расы фагов были выделены и изучены в 1980 году
из крабов и мидий. В 1990 году из Крымской, Одесской и Новороссийской ПЧС были доставлены в Ростовский-на-Дону противочумный институт 27 фагов, выделенных из морской воды,
крабов и мидий, и 14 фагочувствительных штаммов для каждого из фагов [9, 10]. Кроме того,
в Ростовском-на-Дону противочумном институте был подобран индикаторный штамм Vibrio
parahaemolyticus O���������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������
4:К12, выявляющий фаги в штаммах этого серотипа [11]. Большое количество индикаторных штаммов затрудняло выделение и размножение новых бактериофагов, что
требовало отбора универсального индикаторного штамма.
Целью работы явилось изучение лизогении у поступивших из г. Владивостока и г.
Новороссийска штаммов парагемолитических вибрионов, сравнение биологических свойств
выделенных бактериофагов и применение их для фаготипирования.
Материалы и методы исследований. В работе было использовано 248 штаммов
Vibrio parahaemolyticus, из них 64 штамма серогруппы О3:К6, полученных из Музея живых
культур ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора. В качестве
индикаторных штаммов использовали культуры V. parahaemolyticus КМ-97 (tdh-trh-) и КМ-184
(tdh-trh-). Концентрацию фаговых частиц определяли методом агаровых слоёв по Грациа. Титр
фагов составлял 107-1010 БОЕ/мл. Изучение биологических свойств проводили по общепринятым методам [12]. Морфологию частиц фага исследовали в электронном микроскопе JEM100���������������������������������������������������������������������������������
B��������������������������������������������������������������������������������
. Кроличьи антифаговые сыворотки получали внутривенной иммунизацией кроликов фагами в возрастающих дозах [13].
Специфичность бактериофагов испытывали на 133 штаммах бактерий близкородственных родов и семейств (Vibrionaceae, Pseudomonadoceae, Enterobacteriaceae).
Работу проводили на 0,7%, 1,5% агаре и бульоне Мартена с добавление 1,5% или 3%
NaCl, рН 7,6-7,8.
Результаты исследований и их обсуждение. Исследования 248 штаммов парагемолитических вибрионов на лизогению позволили выявить 33 лизогенных штамма, из которых 13,
получены из г Владивостока и относились к серогруппе О3:К6.
Из лизогенных штаммов парагемолитических вибрионов, изолированных в г. Новороссийске были выделены фаги �����������������������������������������������������������
I����������������������������������������������������������
, ��������������������������������������������������������
III�����������������������������������������������������
, ���������������������������������������������������
IV�������������������������������������������������
, �����������������������������������������������
V����������������������������������������������
морфогрупп и отнесены по серологическим свойствам к I, III, IV, V, VI, VIII и XI серогруппам; из штаммов, поступивших из г. Владивостока
– IV морфогруппы, новой XII серогруппы.
Негативные колонии фагов парагемолитических вибрионов Черноморского побережья были округлой формы, мутные с плотным центром, диаметром 0,5-0,7 мм или полупрозрачные с ровными краями и имели диаметр 0,5-2 мм. Ко второму типу негативных колоний
относились бактериофаги, выделенные из штаммов парагемолитических вибрионов Дальневосточного региона (г. Владивосток).
Фаги парагемолитических вибрионов были специфичными, они не лизировали представителей микроорганизмов семейств Vibrionaceae, Pseudomonadoceae, Enterobacteriaceae.
Диапазон литической активности фагов парагемолитических вибрионов варьировал и у раз-
173
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
личных фагов составлял 0,8-82,6%. Бактериофаги парагемолитических вибрионов III�������
����������
-������
V�����
морфогрупп чувствительны к повышенной температуре, при температуре 70°С отмечается полная
инактивация при экспозиции в 30 мин, в то время как фаги I морфогруппы инактивируются
при температуре 80°С. К действию хлороформа фаги III���������������������������������
������������������������������������
-��������������������������������
V�������������������������������
морфогрупп устойчивы, а I�����
������
морфогруппы инактивируются под его действием. Умеренные фаги проявили чувствительность к
3% раствору цитрата натрия, при этом выживаемость сохранялась в пределах 27,2-98,9% при
экспозиции 18-20 часов. Пребывание фагов в растворе 30% мочевины приводило к снижению
активности фагов, выживаемость которых сохранялась в пределах 0,01-2,6% (табл.1).
Для первичной характеристики и дифференциации свежевыделенных фагов парагемолитических вибрионов предложены индикаторные штаммы. Испытание литической активности 33 фагов галофильных вибрионов показало, что только 2 штамма V. parahaemolyticus KM97 (13) и КМ-184 (3), с характеристикой по генотипу tdh-rth-Kp-Ure-, проявляют чувствительность ко всем испытанным фагам. Эти 2 штамма были отобраны из 60 не серотипированных и
124 серотипированных штаммов после проверки чувствительности к ним всех имевшихся фагов. В результате исследований был подтвержден факт, что штамм V. parahaemolyticus КМ-184
лизируется фагами четырёх морфогрупп в отличие от штамма V�����������������������������
������������������������������
. parahaemolyticus�����������
���������������������������
КМ-97, который проявляет чувствительность к фагам трёх морфогрупп, исключая фаги I морфогруппы.
Впервые разработан способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов
III, IV, V морфогрупп от бактериофагов I морфогруппы, на который выдан патент № 2290445.
Анализ данных фаготипирования 121 штаммов парагемолитических вибрионов различных серогрупп, имеющихся в коллекции лаборатории, показал, что около 60% культур лизировались в той или иной мере типирующими фагами в сочетаниях, которые не были предусмотрены предложенной ранее схемой фаготипирования [14]. Это дало возможность выделить
новые фаготипы и усовершенствовать схему фаготипирования парагемолитических вибрионов. Расширение её с четырёх до одиннадцати фаготипов повысило типируемость вибрионов
с 48,4 % до 92,6 %. Анализ встречаемости фаготипов среди парагемолитических вибрионов
различных серогрупп не выявил корреляции. Новая схема фаготипирования нашла применение при изучении 184 штаммов парагемолитических вибрионов Черноморского побережья.
Установлено, что 170 штаммов (92,3%) типировались фагами и были представлены всеми фаготипами. При изучении 33 штаммов, полученных из г. Владивостока в 1997 г. было показано,
что типировалось 14 штаммов (42,4%). При этом типирующиеся штаммы представлены 1, 4, 5,
7, 10 фаготипами. Фаготипирование 31 штамма парагемолитических вибрионов, полученных
из г. Владивостока в 2012 г., выявило 11 фаготип у 29 штаммов (93,5%)
Наши исследования показали, что лизогенные штаммы являются источником фагов,
которые могут быть использованы в лабораторной диагностике возбудителей.
Заключение. Бактериофаги, выделенные из лизогенных штаммов парагемолитических вибрионов разных регионов России, охарактеризованы по основным таксономическим
признакам. Разработанная тест-система индикаторных штаммов позволяет проводить морфологическую идентификацию специфических бактериофагов. Усовершенствована схема фаготипирования парагемолитических вибрионов, при использовании которой установлено 11
фаготипов у 92,6% штаммов.
174
67
240
588
735
1553
616
1154
109
3256
17733
17748
19151
7
23
101
3600
824
227
507
536
№ фагов
Морфология�������
корпу������
скул фага
СероЛитиЦитрату налоги- Специ- темпеческая
ХлороМочевине
трия
ческий фичактивформу
30%
ратуре.
3%
ность
тип
ность
Полная
По А.С. По Acker%
инактива- Количество активных корпускул фага
фага
Тихоненmann,
ция ºC
(%)
ко, 1968
1987
I
FI
I
+
75-80
0
0,21
27,2
0,8
I
FI
I
+
70-75
0
0,11
57,7
0,8
I
FI
I
+
75-80
0
0,35
76,3
0,8
I
FI
I
+
75-80
0
0,06
68,9
0,8
I
FI
I
+
70-75
0
0,15
78,5
0,8
III
C
III
+
65-70
100
0,81
64,7
23,5
III
C
III
+
65-70
98,7
2,6
97,1
81,7
IV
BI
IV
+
65-70
99,4
0,87
76,8
69,4
IV
BI
IV
+
60-65
100
0,37
98,9
80,3
IV
BI
+
65-70
97,6
1,6
96,5
21,6
IV
BI
+
60-65
96,6
0,56
95,8
29,5
IV
BI
+
60-65
100
0,12
98,7
32,6
V
A
V
+
65-70
100
0,04
44,3
48,8
V
A
V
+
65-70
100
0,01
57,7
35,7
V
A
V
+
65-70
99,3
1,3
77,4
48,3
V
A
VI
+
60-65
97,7
0,07
98,3
28,6
V
A
VI
+
65-70
98,5
0,67
88,6
31,7
V
A
VIII
+
65-70
100
0,45
94,2
20
III
C
XI
+
65-70
100
0,08
56,7
38,8
III
C
XI
+
60-65
100
0,31
98,8
82,6
Примечание: + наличие признака;
– бактериофаги I морфогруппы;
– бактериофаги, выделенные в г.Владивосток.
Устойчивость к
Таблица 1 – Характеристика биологических свойств фагов парагемолитических вибрионов
70-75
70-75
70-75
70-75
70-75
68-70
68-70
65-70
68-70
62-67
65-67
60-65
65-70
67-70
68-70
65-67
60-65
65-67
65-70
65-70
Продолжительность
латентного
периода
(в мин)
1,98±1,16
1,77±2,06
2,08±2,16
1,65±0,88
1,55±0,78
2,23±0,49
2,33±0,57
1,86±0,59
1,68±0,48
2,15±0,69
1,35±0,47
2,61±0,60
2,04±1,58
2,14±0,59
2,34±0,47
2,51±0,68
1,98±2,26
2,53±0,58
2,35±0,69
2,55±0,59
cредний
урожай
на одну
микробную
клетку
Некоторые данные одиночного цикла развития фагов
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
175
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
Библиографический список
1. Данилкина Е.Б. Совершенствование методов выделения и идентификации патогенных для человека вибрионов: Автореф. дис… канд. мед. наук. – Ростов-на-Дону, 1995. – 16 с.
2. Soumare M., Seydi M., Gbabangai E. et al. Acute Vibrio parahaemolyticus gastroenteritis
in Dakar // Med. Mal. Infect. – 2007. – Vol. 37, № 10. – P.673-677.
3. Fujino T., Okumo Y., Nakada D. et al. On the bacteriological examination of shirasu food
poisoning // J. Jap. Ass. Infect. Dis. – 1951. – Vol. 35. – P. 11-17.
4. Маслов Д.В. Вспышка галофилеза среди населения г. Владивостока Приморского
края // Здоровье населения и среда обитания. – 1997. –№12. – С.17-21.
5. Смоликова Л.М., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н. и др. Галофильные вибрионы, обусловившие вспышку пищевой токсикоинфекции во Владивостоке // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2001. – №6. – С.3-7.
6. Barbieri E., Falzano L., Fiorentini C. et al. Occurrence, diversity and pathogenicity of
halophilic Vibrio spp. and non-O1 Vibrio cholerae from estuarine waters along the italian Adriatic
coast // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – Vol.65, №6. – P.2748-2753.
7. Тарасенко Т.Т., Грушина Г.А., Воронок В.М., Хоменко Т.В. Пищевые токсикоинфекции, вызываемые галофильными вибрионами в г. Владивостоке: эпидемиологическая характеристика // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 1999. – № 2 – С. 36-39.
8. Nakanishi H., Iida Y., Maeshima K., Teramoto T. Isolation and properties of bacteriophages of Vibrio parahaemolyticus // Biken J. – 1966 – Vol.9, №3. – P.149-157.
9. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Дудкина О.С. и др. Фаги галофильных вибрионов
и их применение // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 1992. – №9-10. – С.5-8.
10. Либинзон А.Е., Ус З.И., Гальцева Г.В. и др. Фаги галофильных вибрионов // Журн.
микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 1995. – №1. – С.15-18.
11. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Дудкина О.С. и др. Лизогения парагемолитических вибрионов О4:К12 // Микробиол. журнал. – 1992. – Т.54, №6. – С.45-49.
12. Адамс М. Бактериофаги – М., 1961 – 522 с.
13. Марьина Ю.Н. Получение антифаговой сыворотки и изучение антигенной структуры фага //Тр. Ростовского. противочум. ин-та. – 1941. – Т.2. – С.3-7.
14. Хайтович А.Б., Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д. и др. Фаговары галофильных вибрионов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 1997. – № 2. – С. 7-10.
BACTERIOPHAGES OF PARAHAEMO LYTIC VIBRIOES: BIOLOGICAL
PROPERTIES AND APPLICATION
Gaevskaya N.E., Kudryakova T.A., Makedonskaya L.D, Kachkina G.V.
Key words: Vibrio parahaemolyticus, bacteriophages, biological properties, lysotypy.
For the primary characteristic and differentiation of the just allocated phages of parahaemolytic vibrioes two indicator strains are suggested. The comparative studying of biological properties of 20 bacteriophages of the parahaemolytic vibrioes allocated in different regions of our country
is made. The lysotypy of strains of parahaemolytic vibrioes according to the new scheme which includes 11 types of phages is performed.
176
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
УДК 578.323
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФАГОВОЙ ИНФЕКЦИИ
Дубровин Е.В., кандидат физико-математических наук
ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова»
тел. 8(495) 926-37-43, dubrovin@physics.msu.ru
Попова А.В., кандидат биологических наук
ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
8(4967) 36-01-47, popova_nastya86@mail.ru
Краевский С.В., кандидат физико-математических наук
ГНЦ Институт теоретической и экспериментальной физики
имени А.И. Алиханова
Игнатов С.Г., доктор биологических наук
ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора,
ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова»
Яминский И.В., доктор физико-математических наук
ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова»
Воложанцев Н.В., кандидат биологических наук
ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора
8(4967) 36-01-47, nikvol@obolensk.org
Ключевые слова: Атомно-силовая микроскопия, бактериофаги, Acinetobacter
baumannii.
Работа посвящена развитию атомно-силовой микроскопии для исследования бактериофагов на примере фага AP22, специфически инфицирующего A. baumannii.
Введение. В связи с возрастающим интересом к использованию бактериофагов в медицине, в частности, для фаговой терапии, большое значение приобретают прямые и быстрые
методы исследования взаимодействия бактериофагов с бактериальными клетками. Одним из
таких наиболее перспективных методов является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Если
по латеральному пространственному разрешению АСМ сопоставима со сканирующей электронной микроскопией (СЭМ), традиционно применяющейся для анализа бактериофагов (см.,
например, [1-2]), то по ряду признаков значительно превосходит или дополняет её. Среди таких признаков можно назвать следующие: высокое (не менее десятых долей нанометра) разрешение по высоте, относительно быстрая и простая пробоподготовка (не требуется контрастирование атомами тяжёлых металлов, замораживание-скалывание), возможность проводить
исследования на воздухе и в жидкости, а также изучать динамику процессов. Кроме того,
АСМ позволяет напрямую изучать механические, адсорбционные, адгезивные, электрические
и прочие свойства микробиологических поверхностей [3]. Перечисленные достоинства АСМ
позволяют использовать её для исследования особенностей взаимодействия бактериофагов с
бактериальными клетками с высоким пространственным разрешением, в частности, фаговой
адсорбции, детального изучения различных стадий инфекционного процесса, морфологии поверхности клетки и фагов, изменения механической жёсткости заражённой клетки. Данная
177
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
работа посвящена развитию метода АСМ для исследования бактериофагов и их литического
цикла. В качестве объекта в данной работе использовали литический бактериофаг AP�������
���������
22, инфицирующий A. baumannii.
Материалы и методы исследований. В работе использовали недавно описанный литический бактериофаг AP22, специфически инфицирующий A. baumannii [4]. .Для получения
фаголизата культуру штамма-хозяина А. baumannii 1053 (“ГКПМ-Оболенск” №�����������
B���������
7129) выращивали при температуре 37 ºС с аэрацией до значения оптической плотности OD600=0,3-0,4,
заражали бактериофагом таким образом, чтобы множественность инфицирования составляла
один бактериофаг на 10 бактериальных клеток (MOI=0,1), и инкубировали до заметного лизиса жидкой культуры.
Для АСМ-экспериментов использовали фаговый препарат с титром 109 БОЕ/мл. Суточную бактериальную культуру штамма A. baumannii 1053, выращенную в LB-бульоне при
температуре 37°C в стационарных условиях, разбавляли свежим LB-бульоном и выращивали в
течение 1,5-2 ч в тех же условиях. Затем бактериальную культуру разделяли на две части: экспериментальную и контрольную. К экспериментальной части добавляли бактериофаг, таким
образом, чтобы множественность инфицирования составляла 50. Экспериментальный и контрольные (содержащий только бактериальные клетки или только фаги) образцы инкубировали
при 37 °C. Через разные промежутки времени (от 1 до 60 мин) отбирали аликвоты образцов
бактерий A. baumannii, фагов и бактериальных клеток, инкубированных с фагом, и анализировали с помощью АСМ.
В качестве подложек использовали пластины из слюды и высокоориентированного
графита (ВОПГ) квадратной формы (приблизительно 7×7 мм). Клетки A. baumannii или их
смесь с фагом (образец) разбавляли в 11 раз, смешивая на свежесколотой поверхности подложки 1 мкл образца с каплей деионизованной воды объёмом 10 мкл. После этого образец
оставляли на 1 минуту для адсорбции, аккуратно промывали из микропипетки 20 микролитрами деионизованной воды и высушивали в ламинарном шкафу. Для АСМ-исследований использовали мультимодовый атомно-силовой микроскоп 3а (Digital Instruments, США), оснащённый
сканером 150 мкм. Сканирование проводили под углом 90º, со скоростью 2 Гц, в контактном
режиме на воздухе с использованием коммерческих кантилеверов ������������������������
CSC���������������������
11 из кремния (МикроМаш) с константой упругости 0,35 Н/м. Для анализа и обработки изображений использовали
программу Фемтоскан (Центр перспективных технологий, Россия).
Результаты исследований и их обсуждение. Прежде всего, нами были изучены
особенности адсорбции бактериофага AP22 на различные поверхности – слюду и ВОПГ. На
АСМ-изображениях частиц бактериофага, адсорбированных на слюду (рис. 1а), чётко различаются головка и хвостовой отросток бактериофага, при этом встречаются две разных высоты головки, средние значения которых составляют 42 и 62 нм. Высота в 62 нм согласуется с
экспериментами по электронной микроскопии [4] и соответствует интактному бактериофагу,
тогда как заниженное значение высоты головки (42 нм) соответствует бактериофагу, частично
либо полностью лишённому своей ДНК. Это подтверждается также наличием в ряде случаев
небольшого отверстия на головке бактериофага, свидетельствующего о возникновении в ней
полости. Бактериофаги, адсорбированные на поверхность ВОПГ (рис. 1б) также имеют бимодальное распределение высот, однако, в отличие от слюды, сами высоты ещё ниже и их средние значения составляют 18 и 38 нм. Вероятно, это связано с частичным разрушением капсида
бактериофага из-за гидрофобного взаимодействия с поверхностью ВОПГ. Влияние поверхности графита на целостность адсорбированных на неё вирусных частиц также было описано
на примере вируса табачной мозаики [5]. При адсорбции бактериофагов как на слюду, так и на
графит часть из них утрачивает свою целостность, что можно наблюдать по наличию отдельно
178
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
лежащих на поверхности головок и хвостовых отростков фага. Данный эффект особенно ярко
выражен для ВОПГ. Таким образом, можно сделать вывод, что подложка, с которой контактирует бактериофаг, может сильно влиять не только на процесс его адсорбции, но также и на
целостность фаговой частицы. Большую роль при этом играет гидрофобное взаимодействие
белковой оболочки капсида с поверхностью.
Для изучения различных стадий литического цикла бактериофага AP22 отбирали пробы бактериальных клеток A baumannii, инкубированных с фагом AP22 при температуре 37 ºC,
через разные промежутки времени (от 1 до 60 мин) от начала фаговой инфекции.
Адсорбция фагов на клетки наблюдалась уже с первой минуты (рис. 2а), причём количество адсорбированных фагов значительно увеличивалась в последующие несколько минут взаимодействия (рис. 2б-2г). На рисунке 3 приведены увеличенные фрагменты АСМизображений поверхностей инфицированной и неинфицированной клетки. В отличие от
фагов, адсорбированных на подложку, у связавшихся с поверхностью клетки бактериофагов
почти все головки имеют отверстия, свидетельствующие о вышедшей из них ДНК (рис. 3б).
Наблюдение за морфологией инфицированных клеток показало, что их целостность начинает
значительно нарушаться после 30 минут взаимодействия с бактериофагами. Это выражается в
значительном уменьшении высоты адсорбированной клетки с 300-400 нм до 200 нм и менее,
увеличении шероховатости поверхности, а также в изменении начальной формы клетки (рис.
2д-2е). Полный лизис клетки наблюдается на временах инкубации порядка 60 минут. При этом
АСМ-изображения лизированных клеток сопровождаются наличием большого количества новых фагов, высвободившихся из неё (рис. 2д-2е).
Интересно, что данные, полученные с помощью АСМ, позволяют также предположить наличие у фага AP22 деполимеразной активности в отношении к экзополисахаридам,
секретируемым бактериальными клетками A. baumannii. Действительно, уже с первой минуты
совместной инкубации A. baumannii с бактериофагами практически все бактериальные клетки
адсорбируются на поверхность подложки поодиночке, по сравнению с контрольным образцом
клеток A. baumannii, где они располагаются в виде агрегатов, окруженных слоем внеклеточного матрикса.
Заключение. Применение АСМ к изучению бактериофагов и их взаимодействия с бактериальными клетками позволяет не только получить качественную информацию о специфичности данного фага, но и количественно охарактеризовать такое взаимодействие, например,
измерить морфологические параметры фага и клетки, поверхностную плотность адсорбции
бактериофага, оценить продолжительность разных стадий литического цикла. Высокое пространственное разрешение АСМ наряду с возможностью проведения относительно быстрого
анализа бактериофага делает её перспективной для широкого применения в исследованиях
бактериофагов.
Работа поддержана программой грантов Президента РФ для молодых учёных
(МК-312.2013.2).
Библиографический список
1. Bes, M. Morphology of Staphylococcus saprophyticus bacteriophages / M. Bes, H.-W.
Ackermann, Y. Brun, J. Fleurette. // Research in Virology. – 1990. – V. 141. – P. 625–635.
2. Yele, A.B. Novel lytic bacteriophage AB7-IBB1 of Acinetobacter baumannii: isolation,
characterization and its effect on biofilm / A.B. Yele, N.D. Thawal, P.K. Sahu, B.A. Chopade. // Archives of Virology. – 2012. – V. 157. – P. 1441–1450.
3. Dorobantu, L.S. Atomic force microscopy: A nanoscopic view of microbial cell surfaces /
179
Бактериофаги в медицине и ветеринарии
L.S. Dorobantu, G.G. Goss, R.E. Burrell // Micron. – 2012. – V. 43. – P. 1312–1322.
4. Popova, A.V. Isolation and characterization of wide host range lytic bacteriophage AP22
infecting Acinetobacter baumannii / A.V. Popova, E.L. Zhilenkov, V.P. Myakinina, V.M. Krasilnikova, N.V. Volozhantsev // FEMS Microbiology Letters. – 2012. – V. 332, – P.40–46.
5. Дубpовин, Е.В. Изучение особенностей адгезии вируса табачной мозаики методом
атомно-силовой микроскопии / Е.В. Дубpовин, М.Н. Кирикова, В.К. Новиков, Ю.Ф. Дрыгин,
И.В. Яминский // Коллоидный журнал. – 2004. – Т.66. – С. 750-755.
6. Wendt, C. Survival of Acinetobacter baumannii on dry surfaces / C. Wendt, B. Dietz, E.
Dietz, H. Ruden // Journal of Clinical Microbiology. – 1997. – V. 35. – P. 1394–1397.
UTILIZATION OF ATOMIC FORCE MICROSCOPY
FOR PHAGE INFECTION STUDY
Dubrovin E.V., Popova A.V., Kraevskiy S.V., Ignatov S.V., Yaminsky I.V.,
Volozhantsev N.V.
Key words: Atomic force microscopy, bacteriophages, Acinetobacter baumannii
The study is devoted to the development of atomic force microscopy for application in bacteriophages research on the example of bacteriophage AP22 to A. baumannii.
180
содержание:
Абаев И.В., Скрябин Ю.П., Печерских Э.И., Шишкова Н.А., Светоч Э.А.
СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ФАГОВЫХ И
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕПТИДОГЛИКАНГИДРОЛАЗ, НОВОГО КЛАССА АН3
ТИСТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНЗИБИОТИКОВ
Ильичев А. А. , Чикаев А. Н. , Щербаков Д. Н., Федина Н. В., Бакулина А. Ю.,
Карпенко Л. И.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВЫХ ПЕПТИДНЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭПИТОПОВ, УЗНАВАЕМЫХ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ ВИЧ-1 АНТИ7
ТЕЛАМИ ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ Z13E1, VRC03 И VRC01
Андрийчук Е.Н.
ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ФАГОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕ14
РИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ОБРАЗЦОВ КАРТОФЕЛЯ
Баннов В.А., ФурсоваН.К. , Воложанцев Н.В., Коровкин С.А., Светоч Э.А.
ДЕТЕКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУЛЕНТНОСТИ В ГЕ19
НОМАХ БАКТЕРИОФАГОВ
Барт Н. Г., Золотухин С. Н., Васильев Д. А.
ПОИСК И СЕЛЕКЦИЯ БАКТЕРИОФАГОВ PROVIDENCIA
23
БартН. Г. , Золотухин С. Н., Васильев Д. А.
ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ РОДА PROVIDENCIA
25
Васильева Ю.Б., Васильев Д.А., Семанина Е.Н.
РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И СЕЛЕКЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ
28
BORDETELLA BRONCHISEPTICA
Викторов Д.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Гринева Т.А., Горшков И.Г.,
Куклина Н.Г., Насибуллин И.Р., Парамонова Н.А., Артамонов А.М.,
Воротников А.П., АнтошкинП.А.
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ УМЕРЕННЫХ И ВИ32
РУЛЕНТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ
ВикторовД.А. , ГриневаТ.А. , ВасильевД.А. , Артамонов А.М., Воротников А.П.,
АнтошкинП.А. , Золотухин С.Н.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ФАГОРЕЗИСТЕНТНЫХ МУТАН38
ТОВ НА ПРИМЕРЕ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS
Воложанцев Н.В., Баннов В.А., Веревкин В.В., Красильникова В.М.,
Мякинина В.П. , Левчук В.П., Светоч Э.А., Дятлов И.А.
БАКТЕРИОФАГИ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS: ВЫДЕЛЕНИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАК44
ТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
181
Гулий О.И., Караваева О.А., Макарихина С.С., Павлий С.А., Игнатов О.В.
ДЕТЕКЦИЯ БАКТЕРИИ РОДА AZOSPIRILLUM С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИОФАГОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ AZOSPIRILLUM BRASILENSE ШТАММОВ SP7
49
И SR75
Куликов Е. Е., Тарасян К. К., Голомидова А. К., Прохоров Н. С., Исаева А. С,
Строцкая А. В., Татарский Е. В., Летарова М. А., Кутузова Н. М., Клунова С. М.,
Летаров А. В.
ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА НОВОГО КОЛИФАГА PHIKT,
54
БЛИЗКОРОДСТВЕННОГО ФАГУ CAULOBACTER CRESCENTUS CD1
Зимин А.А.
ТРАНСДУКЦИЯ ПЛАЗМИД БАКТЕРИОФАГАМИ Т4-ТИПА (ОБЗОР)
59
Золотухин Д. С., Васильев Д. А., Золотухин С. Н., Семенов А. М., Летаров А.В.
О СПЕЦИФИЧНОСТИ БАКТЕРИОФАГОВ HAFNIA ALVEI
63
Игнатов С.Г., Денисенко Е.А., Веревкин В.В., Волошин А.Г.
ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЙ МЕТОД АНАЛИЗА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФАГ66
БАКТЕРИЯ
Исаева А.С., Летаров А. В., Ильина Е.Н., Муравьёва В.В., Анкирская А.С.
ПОИСК ЛИЗОГЕННЫХ ШТАММОВ ВАГИНАЛЬНЫХ ЛАКТОБАЦИЛЛ
69
Карамышева Н. Н., Васильев Д. А., Золотухин С. Н.
ПОДБОР И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
73
DESULFOVIBRIO DESULFURICANS
Лахтин В.М., Алешкин А.В., Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.
ЛЕКТИН-ГЛИКОКОНЪЮГАТНЫЕ ОТНОШЕНИЯ В СИСТЕМАХ «БАКТЕ73
РИОФАГИ - БАКТЕРИИ»
Ляшенко Е.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н.
ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВАВЫДЕЛЕННЫХ БАКТЕРИО80
ФАГОВ БАКТЕРИЙ РОДА KLEBSIELLA
Македонова Л.Д., Т.А. Кудрякова, Г.В. Качкина, Н.Е. Гаевская
БИОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА
ФАГОВ
ПАТОГЕННЫХ
ИЕРСИНИЙ:YERSINIA
PSEUDOTUBERCULOSIS
И
YERSINIA
84
ENTEROCOLITICA
Молофеева Н.И., Васильев Д.А., Золотухин С.Н.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАГОВ ESCHERICHIA COLI О157
87
ДЛЯ СОЗДАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
Попова А.В., Мякинина В.П., Богун А.Г., Воложанцев Н.В.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГА AP22, СПЕЦИФИЧЕСКИ ИНФИЦИРУЮ91
ЩЕГО ШИРОКИЙ СПЕКТР ШТАММОВ ACINETOBACTER BAUMANNII
Прохоров Н.С., Куликов Е.Е., Голомидова А.К., Летаров А.В.
МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФАГА VB_EVOP_G7C И РОДСТВЕННЫХ ЕМУ КОЛИФАГОВ С КЛЕТКАМИ ESCHERICHIA COLI НА РАННИХ
95
СТАДИЯХ ИНФЕКЦИИ
Пульчеровская Л.П., Ефрейторова Е.О., Золотухин С. Н., Васильев Д. А.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙТВА БАКТЕРИОФАГОВ CITROBACTER
182
98
Пульчеровская Л.П., Ефрейторова Е.О., Золотухин С. Н., Васильев Д. А.
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ
103
БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER
Светоч Э.А., Веревкин В.В., Воложанцев Н.В., Борзилов А.И.,
Борзенков В.Н., Коробова О.В., Комбарова Т.И., Красильникова В.М., Мякинина В.П.,
Баннов В.А., Денисенко Е.А., Теймуразов М.Г., Коровкин С.А., Дятлов И.А.
ВЫДЕЛЕНИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЛЕЧЕБНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ БАКТЕРИОФАГА ЕСD4 ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
107
ESCHERICHIA COLI О104:H4-ИНФЕКЦИИ
Семчук Л. И., Постоенко Е.М., Ромашев С. А.
ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИИ ФАГОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ,
112
ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В АГРОЦЕНОЗАХ УКРАИНЫ
Скобликов Н.Э., Зимин А.А.
ОСОБЕННОСТИ ВОЗРАСТНОЙ ДИНАМИКИ БАКТЕРИОФАГОВ E.COLI
117
КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА СВИНЕЙ
Феоктистова Н. А., Макеев В. А., Васильев Д.А., Алешкин А.В.
ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТ БАКТЕ121
РИОФАГОВ BACILLUS MYCOIDES
Феоктистова Н. А., Калдыркаев А. И., Васильев Д.А., Алешкин А.В.
ФАГОИДЕНТИФИКАЦИИ Б АКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS
126
CEREUS
Алексанина Н.В.
ИЗУЧЕНИЕ
ВЛИЯНИЯ
ИММУННОГО
ЛАКТОГЛОБУЛИНА
НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К БАКТЕРИОФАГАМ САЛЬМОНЕЛЛ, ВЫДЕ132
ЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ, В ОПЫТАХ IN VITRO
Аленкина Т.В., Коровкина Г.И., Никифоров А.К.
РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ ХОЛЕРНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ВИБРИО134
НОВ
Алешкин В.А., Алешкин А.В., С.С. Афанасьев
БАКТЕРИОФАГИ В РОССИИ: ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ
139
Андреева И.С., Афонюшкин В.Н., Соловьянова Н.А., Cеливанова М.А.,
Зайцев Б.Н., Закабунин А.И., Емельянова Е.К.
ВЫДЕЛЕНИЕ НОВЫХ БАКТЕРИОФАГОВ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ АКТУАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА
144
ПТИЦЕФАБРИКАХ
Болдырев А.Н., Туманов Ю.В.
ПОЛУЧЕНИЕ ТОНКОДИСПЕРСНОЙ СУСПЕНЗИИ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК –
ПУТЬ К ПРОМЫШЛЕННОМУ ПРОИЗВОДСТВУ МИКОБАКТЕРИОФАГОВ
149
КАК ЛЕЧЕБНЫХ СРЕДСТВ ПРОТИВ ТУБЕРКУЛЁЗА
Боргоякова М.Б., Каледин В.И., Николин В.П., Попова Н.А., Ильичев А.А.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ IN VIVO ДЛЯ
ПОИСКА ПЕПТИДОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С АДЕНОКАРЦИНОМОЙ
154
ЛЁГКИХ
183
Викторов Д.А., Васильев Д.А., Артамонов А.М.
ИНДИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS FLUORESCENS МЕТОДОМ РЕ159
АКЦИИ НАРАСТАНИЯ ТИТРА ФАГА
Викторов Д.А., Гринева Т.А., Васильев Д.А., АртамоновА. М. , Золотухин С.Н.
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОМОНО162
ЗОВ РЫБ
Ворошилова Н.Н., Боговазова Г.Г., Казакова Т.Б., Алферова Э.В.
РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
ГНОЙНО – ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И ЭНТЕРАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ УСЛОВНО – ПАТОГЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ И ИЗУЧЕНИЕ
165
ИХ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ
Гаевская Н.Е., Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Качкина Г.В.
БАКТЕРИОФАГИ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ: БИОЛОГИ172
ЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ
Дубровин Е.В., Попова А.В., Краевский С.В., Игнатов С.Г., Яминский И.В., Воложанцев Н.В.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ИССЛЕ177
ДОВАНИЯ ФАГОВОЙ ИНФЕКЦИИ
184