РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ На правах рукописи
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ На правах рукописи ЛЕПЕХИНА Елена Владимировна РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС-СИСТЕМ ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР И АНТИБИОТИКОВ У ESCHERICHIA COLI 03.02.03 Микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук Г.В. Смирнова Пермь – 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ СОДЕРЖАНИЕ ...................................................................................................................................... 2 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................ 4 ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 5 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .................................................................................................................. 11 ГЛАВА 1. ТИОЛОВЫЕ РЕДОКС-СИСТЕМЫ У E. COLI ............................................................. 11 1.1. Редокс-система глутатиона ................................................................................................. 11 1.1.1 Глутатион .......................................................................................................................... 11 1.1.2 Глутатионредуктаза ......................................................................................................... 13 1.1.3 Глутаредоксины................................................................................................................ 14 1.2. Редокс-система тиоредоксина ............................................................................................. 16 1.2.1 Тиоредоксины ................................................................................................................... 16 1.2.2 Тиоредоксинредуктаза ..................................................................................................... 16 1.3. Функциональная связь между редокс-системами глутатиона и тиоредоксина ............. 17 ГЛАВА 2. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС У БАКТЕРИЙ ................................................................ 19 Источники АФК и повреждения, вызываемые окислительным стрессом ..................... 19 2.1. 2.2. Механизмы защиты от окислительного стресса ............................................................... 22 Адаптивный ответ на окислительный стресс .................................................................... 24 2.3. 2.4. Роль тиоловых редокс-систем при окислительном стрессе ............................................. 26 ГЛАВА 3. ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ НА БАКТЕРИИ .......................................................... 27 3.1. Молекулярные механизмы действия антибиотиков ......................................................... 27 3.1.1 Ингибиторы процессов образования клеточной стенки бактерий .............................. 28 3.1.2 Ингибиторы процессов биосинтеза белка ..................................................................... 28 3.1.3 Ингибиторы репликации и транскрипции ДНК и РНК ................................................ 29 Гипотеза об окислительном стрессе как универсальном механизме бактерицидного 3.2. действия антибиотиков..................................................................................................................... 30 ГЛАВА 4. ТЕМПЕРАТУРНЫЕ СТРЕССЫ У БАКТЕРИЙ ............................................................. 33 4.1. Тепловой стресс .................................................................................................................... 33 4.1.1. Характерные изменения в клетке при повышении температуры ................................ 33 4.1.2. Адаптивный ответ на тепловой стресс ........................................................................... 34 4.1.2.1. Белки теплового шока ................................................................................................... 34 4.1.2.2 Регуляция ответа на тепловой шок ............................................................................... 36 4.1.3. Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при тепловом стрессе……………………………………………………………………………………………..38 Холодовой стресс ................................................................................................................. 39 4.2. 4.2.1. Характерные изменения в клетке при резком понижении температуры.................... 39 4.2.2. Белки холодового шока ................................................................................................... 41 4.2.3. Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при холодовом стрессе …………………………………………………………………………………………….42 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .................................................................................................... 45 ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .................................................................. 45 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. Бактериальные штаммы....................................................................................................... 45 Питательная среда и условия культивирования................................................................ 46 Определение устойчивости бактерий к стрессовым воздействиям ................................ 47 Определение способности к образованию биопленок. .................................................... 48 Определение подвижности бактерий ................................................................................. 49 Измерение внутри- и внеклеточной концентрации глутатиона ...................................... 49 3 5.7. Определение уровня дисульфидов в белках ...................................................................... 50 5.8. Определение концентрации перекиси водорода ............................................................... 51 5.9. Определение активности гидропероксидаз HPI и HPII .................................................... 51 5.10. Определение экспрессии антиоксидантных генов (по активности β-галактозидазы) .. 52 5.11. Статистическая обработка полученных результатов ....................................................... 53 5.12. Материалы ............................................................................................................................ 53 ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, МУТАНТНЫХ ПО ТИОЛОВЫМ РЕДОКС-СИСТЕМАМ ............................................................................................... 54 6.1. Рост и выживаемость бактерий........................................................................................... 54 6.2. Способность к образованию биопленок ............................................................................ 55 6.3. Подвижность бактерий ........................................................................................................ 56 6.4. Концентрация внутри- и внеклеточного глутатиона ........................................................ 57 6.5. Уровень тиолов и дисульфидов в белках ........................................................................... 58 6.6. Концентрация пероксида водорода в культуральной среде ............................................ 59 6.7. Активность гидропероксидаз HPI и HPII .......................................................................... 60 6.8. Экспрессия генов katG и sodA ............................................................................................. 62 6.9. Устойчивость бактерий к пероксидному стрессу ............................................................. 63 ГЛАВА 7. РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС СИСТЕМ В ОТВЕТЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НА ТЕМПЕРАТУРНЫЕ СТРЕССЫ .................................................................................................. 65 7.1. Рост и выживаемость бактерий при температурных стрессах ........................................ 65 7.2. Влияние температуры культивирования на способность к образованию биопленок ... 67 Продукция пероксида водорода при температурных стрессах ....................................... 73 7.3. 7.4. Экспрессия антиокисдантных генов при температурных стрессах ................................ 75 ГЛАВА 8. РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС СИСТЕМ В ОТВЕТЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НА ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ .................................................................................................. 81 8.1. Минимальные ингибирующие концентрации антибиотиков .......................................... 81 8.2. Рост и выживаемость бактерий при действии антибиотиков .......................................... 82 8.3. Влияние искусственных изменений уровня глутатиона внутри и снаружи клеток на устойчивость E. coli к различным антибиотикам ......................................................................... 87 8.4. Комбинированное действие антибиотиков и температурных стрессов ......................... 92 8.5. Способность к образованию биопленок в присутствии антибиотиков .......................... 98 8.6. Влияние экзогенных антиоксидантов на способность к образованию биопленок ...... 100 ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................................................................. 103 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 115 ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................ 117 ЛИТЕРАТУРА .................................................................................................................................... 119 4 СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ АДФ . . . . . аденозин-5'-дифосфат АТФ . . . . . аденозин-5'-трифосфат АФК . . . . . активные формы кислорода КОЕ. . . . . . колониеобразующая единица м.в. . . . . . . молекулярный вес НАДН . . . . никотинамидадениндинуклеотид восстановленный НАД+ . . . . .никотинамидадениндинуклеотид окисленный НАДФН . . никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный НАДФ+ . . . никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный ОD 600 . . . оптическая плотность (optical density) при длине волны 600 нанометров ФАД . . . . . флавинадениндинуклеотид ЭДТА . . . . этилендиаминтетрауксусная кислота DTNB . . . . 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic)) кислота GOR . . . . . .глутатионоксидоредуктаза (glutathione oxidoreductase) GSH . . . . . .глутатион восстановленный GSSG . . . . .глутатион окисленный HPI . . . . . . каталаза гидропероксидаза I (hydroperoxidase I) НРII . . . . . гидропероксидаза II (hydroperoxidase II) NEM . . . . . N-этилмалеимид (N-ethylmaleimide) OxyR . . . . .транскрипционный фактор, активируемый пероксидом водорода SOD . . . . . супероксиддисмутаза SoxRS . . . .сенсорный и регуляторный белки ответа на супероксидный стресс 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. Широкое распространение штаммов патогенных микроорганизмов, устойчивых к лечебным препаратам, привело к резкому снижению эффективности терапии инфекционных болезней. Поиск новых антибиотиков требует более глубоких исследований адаптационных реакций клетки на вызванный антибактериальными препаратами стресс с целью обнаружения новых внутриклеточных мишеней. Наряду с этим все большее внимание уделяется исследованию условий, модифицирующих действие антибиотиков. В последнее время в научной литературе разгорелась дискуссия, касающаяся механизмов бактерицидного действия антибиотиков. M.A. Kohanski и ряд других исследователей представили доказательства в пользу того, что наряду с влиянием на специфические молекулярные мишени бактерицидные антибиотики стимулируют образование активных форм кислорода (АФК) и развитие окислительного стресса, который является общим механизмом убивания бактерий [Kohanski et al., 2007, Kohanski et al., 2008, Yeom et al., 2010, Foti et al., 2012]. Это открытие вызвало широкий резонанс, поскольку могло дать толчок к поиску новых путей повышения эффективности антибактериальных препаратов. Однако позже появились публикации, опровергающие эту гипотезу и указывающие на то, что активные формы кислорода не участвуют в гибели клеток, вызванной антибиотиками [Liu and Imlay, 2013, Keren et al., 2013]. В недавней работе J.J. Collins с соавторами [Dwyer et al., 2014] вновь выступили в поддержку своей гипотезы о вкладе редокс-стресса в механизм убивания бактерий при действии антибиотиков. В качестве аргументов приводятся результаты экспериментов, указывающие на повышение внутриклеточной концентрации пероксида водорода и экспрессии антиоксидантных генов при воздействии антибиотиками. Было также показано, что сверхэкспрессия каталазы или фермента репарации ДНК (MutS) и предобработка антиоксидантами 6 (глутатион, аскорбат) снижают летальность, свидетельствуя о вкладе АФК в убивание бактерий антибиотиками. Ранее было обнаружено, что у бактерий резкие изменения температуры культивирования сопровождаются окислительным стрессом, и в поддержании нормальной жизнедеятельности бактерий в этих условиях существенную роль играют тиоловые редокс-системы [Lee et al., 1983, Benov and Fridovich, 1995, Смирнова с соавт., 2001, Smirnova et al., 2007]. Внутриклеточные тиоловые редокс-системы у бактерий Escherichia coli включают системы глутатиона (GSH, глутатионредуктаза и глутаредоксины) и тиоредоксина (тиоредоксины и тиоредоксинредуктаза). Эти редокс-системы обеспечивают поддержание восстановленного состояния SH-групп в различных белках, многие из которых являются важными ферментами, сенсорными или регуляторными факторами, и прямо или косвенно участвуют в ответе на окислительный стресс [Октябрьский, Смирнова, 2007]. Следовательно, если окислительный стресс действительно включен в механизм индуцированной антибиотиками клеточной смерти, дефекты тиоловых редокс-систем, связанные с мутациями, также как изменения редокс-статуса клеток при температурных стрессах, должны существенным образом влиять на чувствительность бактерий к антибиотикам в этих условиях. Исследование действия антибиотиков на бактерии с мутациями по тиоловым редокс-системам при экстремальных температурах, то есть в условиях, когда продукция активных форм кислорода повышена, а антиоксидантная защита повреждена, является перспективным направлением в изучении молекулярных механизмов летальности антибиотиков. Цель настоящего исследования - изучение роли тиоловых редокс-систем при действии экстремальных температур и антибиотиков у Escherichia coli. Основные задачи исследования: 1. Изучить влияние мутаций по основным компонентам тиоловых редокссистем на рост, способность к биопленкообразованию, редокс-статус клетки, активность антиоксидантных ферментов и экспрессию 7 антиоксидантных генов при оптимальной температуре роста бактерий и при температурных стрессах. 2. Исследовать влияние компоненты тиоловых мутаций по генам, редокс-систем, на кодирующим устойчивость основные E. coli к антибиотикам различной природы при оптимальной температуре роста и в комбинации с действием экстремальных температур. 3. Изучить влияние искусственных изменений уровней тиолов в культуральной среде и в клетках (за счет внесения в среду глутатиона, его предшественников и SH-реагентов) на адаптацию бактерий к антибиотикам. Научная новизна. Впервые для исследования влияния редокс-статуса E. coli на их антибиотикорезистентность использован изогенный ряд мутантов по тиоловым редокс-системам с широким спектром антиоксидантных свойств. В ходе выполнения работы впервые установлено, что зависимость чувствительности бактерий к антибиотикам от температуры в диапазоне от 20°С до 46°С имеет вид V-образной кривой с максимумом чувствительности при 44°С для ципрофлоксацина и 40°С для ампициллина и стрептомицина. В культурах родительского штамма вид кривой не зависел от природы антибиотика и был тесно связан с изменением скорости роста бактерий при разных температурах культивирования. Максимум чувствительности бактерий к антибиотикам приходился на область температур, соответствующих наиболее высоким скоростям роста. Впервые показано, что мутации по компонентам тиоловых редокс-систем существенным образом влияют на чувствительность бактерий к антибиотикам. Характер влияния зависел от природы мутации, вида антибиотика и температуры культивирования и в значительной мере определялся скоростью роста бактерий. Впервые установлено, что мутации по компонентам тиоловых редокссистем модифицируют способность бактерий к образованию биопленок, изменяя 8 интенсивность биопленкообразования, его зависимость от температуры и устойчивость к антибиотикам. Теоретическая и практическая значимость работы. С использованием мутантов по компонентам тиоловых редокс-систем и экзогенных добавок, модулирующих редокс-статус клетки, получены новые данные о роли изменений редокс-статуса в устойчивости E. coli к антибиотикам. Эти данные вносят вклад в понимание механизмов убивания бактерий антибиотиками и могут быть использованы для повышения эффективности антибактериальных препаратов. Исследование комбинированного действия антибиотиков и различных ростовых температур позволило определить температурную зону максимальной чувствительности бактерий к антибиотикам с различными внутриклеточными мишенями. Большой теоретический и практический интерес представляет обнаружение влияния тиоловых редокс-систем на формирование биопленок, чрезвычайная устойчивость которых к повреждающим факторам внешней среды и антибиотикам составляет существенную медицинскую и техническую проблему. Методология и методы исследования При выполнении исследований использовалась библиотека делеционных мутантов Escherichia coli (Keio collection). На ее основе методами трансформации плазмид и трансдукции с фагом РI в Лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов были сконструированы двойные мутанты и штаммы, содержащие одновременно соответствующие мутации и слияния промоторов генов katG и sodA со структурным геном lacZ, кодирующем β-галактозидазу. Для анализа продукции H2O2 применяли чувствительный флуоресцентный метод. Восстановленный и окисленный глутатион определяли высоко специфическим методом с глутатионредуктазой. Уровень дисульфидных связей в белках и активность каталаз измеряли спектрофотометрическими методами. Экспрессию генов изучали, определяя активность β-галактозидазы в штаммах, несущих слияния с геном lacZ. Рост и выживаемость бактерий контролировали 9 традиционными методами измерения OD600 и высева на твердые среды. Способность бактерий к образованию биопленок исследовали в 96-луночных полистирольных планшетах с использованием микропланшетного спектрофотометра xMark Bio-Rad (США). Применяемые методы адекватны поставленным задачам и соответствуют мировому уровню. Положения, выносимые на защиту: 1. Используемые в работе мутанты E. coli по компонентам тиоловых редокс-систем имеют резко выраженные различия в содержании глутатиона, уровне индукции антиоксидантных генов и ферментов и устойчивости к пероксидному стрессу. 2. Модуляция редокс-статуса клеток вследствие мутаций по компонентам тиоловых редокс систем или путем искусственных добавок тиолов и SH-реагентов приводит к изменениям антибиотикорезистентности, характер которых в значительной мере определяется изменениями скорости роста бактерий. 3. Комбинированное антибиотиков способствует действие повышению экстремальных температур антибиотикорезистентности и всех изученных штаммов E. coli, что, по-видимому, связано со снижением скорости роста в условиях температурного стресса. 4. Мутации по компонентам тиоловых редокс-систем модифицируют способность бактерий к образованию биопленок, изменяя интенсивность биопленкообразования, его зависимость от температуры и устойчивость к антибиотикам. Степень достоверности и апробация результатов: Материалы диссертации были представлены на Региональной научно- практической конференции студентов и молодых ученых, «Химия, экология, биотехнология» (Пермь, 2013), VII Всероссийском Конгрессе молодых биологов «Симбиоз-Россия-2014» (Екатеринбург, 2014). 10 По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ, и 1 статья в иностранном рецензируемом журнале. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах печатного текста, иллюстрирована 36 рисунками и 13 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, трех глав собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 216 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к факторам среды» (номер госрегистрации 01201353249). Исследования поддержаны грантом Программы МКБ Президиума РАН №12-П-4-1013 «Роль изменений редокс-статуса среды и периплазмы во внутри- и межклеточной сигнализации при стрессах у бактерий», грантом РФФИУрал №13-04-96039 «Роль тиоловых редокс-систем при комбинированном действии экстремальных температур и антибиотиков у бактерий Escherichia coli». Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. 11 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА 1. ТИОЛОВЫЕ РЕДОКС-СИСТЕМЫ У E. COLI Одним из условий нормальной жизнедеятельности клеток является поддержание определенного редокс-состояния в цитоплазме, в связи с тем, что большое число реакций, протекающих в клетках, сопряжено с переносом окислительно-восстановительных эквивалентов. Сдвиги внутриклеточного редокс-статуса, индуцированные наружными или внутриклеточными стимулами, модулируются буферной редокс-ситемой глутатиона, которая включает сам глутатион (GSH), глутаредоксины (Grx) и глутатионоксидоредуктазу (GOR). Наряду с редокс-системой глутатиона важную роль в поддержании тиолдисульфидного статуса белков играет редокс-система тиоредоксина, включающая тиоредоксины 1 и 2 (Trx) и тиоредоксинредуктазу (TR). Редокс-системы глутатиона и тиоредоксина функционируют в клетках одновременно, дополняя и дублируя друг друга. 1.1. Редокс-система глутатиона 1.1.1 Глутатион Глутатион представляет собой трипептид (L-γ-глутамил-L- цистеинилглицин) с молекулярной массой 307 Да. При физиологических значениях pH имеет две отрицательно заряженные карбоксильные группы и положительно заряженную аминогруппу. Уникальной особенностью GSH является наличие γ-глутамильной связи, которая защищает трипептид от деградации внутриклеточными пептидазами, и свободной сульфгидрильной (SH-) группы, служащей донором электронов. Одноэлектронная реакция GSH со свободными радикалами приводит к образованию тиильного радикала GS˙, 12 который при димеризации с другим GS˙ радикалом дает дисульфид глутатиона GSSG [Mannervik et al., 1989]. Вторым типом окислительно-восстановительных реакций с участием глутатиона являются реакции тиол-дисульфидного обмена, играющие центральную роль при образовании смешанных дисульфидов с белками (GSSR) [Kosower and Kosower, 1978]. В реакциях третьего типа происходит двухэлектронное окисление с образованием интермедиата, который затем реагирует со второй молекулой, идентичной или отличной от первой. При этом в первом случае образуется дисульфид глутатиона (GSSG), а во втором – смешанный дисульфид. Например, восстановление перекиси водорода, происходящее с участием глутатионпероксидазы [Cohen and Hochstein, 1963]: 2GSH + H2O2 → GSSG + H2O Глутатион является главным редокс-буфером, поскольку в клетке он присутствует, в основном, в восстановленной форме в высоких концентрациях до 10 мМ [Fahey et al., 1978, Romero and Canada, 1991]. Количество окисленной формы глутатиона на 1-2 порядка ниже, вследствие этого, отношение GSH/GSSG остается довольно высоким [Meister and Anderson, 1983, Смирнова с соавт., 2000]. Восстановление дисульфидных связей в белках глутатионом чаще всего является энзиматическим процессом Образующийся при этом и происходит дисульфид при участии глутатиона глутаредоксинов. восстанавливается глутатионредуктазой. Поэтому редокс-система глутатиона, кроме него самого, включает глутаредоксины и глутатионредуктазу. 13 1.1.2 Глутатионредуктаза GOR принадлежит дисульфидоксидоредуктаз к семейству флавоферментов пиридиннуклеотид- и катализирует реакцию переноса восстановительных эквивалентов от НАДФН на GSSG [Schirmer et al., 1989]. NADPH + GSSG + H+ → 2GSH + NADP Бактериальная глутатионредуктаза является димером, состоящим из двух одинаковых субъединиц с молекулярным весом 55000 и имеет высокую гомологию с ферментом из клеток человека [Greer and Perham, 1986]. Глутатионредуктазу клеток E. coli кодирует ген gor. У мутантов, имеющих делеции по этому гену, сохраняется способность к росту на богатых и бедных средах в жидкой культуре и на чашках с агаром [Davis et al., 1982]. Поскольку мутанты по gor поддерживают высокий пул восстановленного глутатиона, вероятно наличие альтернативного пути для восстановления GSSG, независимого от GOR, например глутаредоксиновая или тиоредоксиновая системы [Tuggle and Fuchs, 1985; Russel and Holmgren, 1988]. В клетках E. coli GОR относят к антиоксидантным ферментам, поскольку ее активность регулируется транскрипционным фактором OxyR [Michan et al., 1999]. Кроме того, показано, что в клетках E. coli глутатионредуктаза находится под OxyRнезависимым контролем альтернативной субъединицы РНК-полимеразы σs (RpoS) [Becker-Hapak and Eisenstark, 1995]. Под контролем RpoS находится более 70 генов, обеспечивающих устойчивость к окислительному стрессу, тепловому шоку, повышенной осмолярности, низкому pH и другим воздействиям [Hengge-Aronis, 2002]. Таким образом, GOR в клетках E. coli включена в глобальную регуляторную сеть, обеспечивающую адаптацию бактерий к различным стрессовым условиям. 14 1.1.3 Глутаредоксины Одной из главных функций глутаредоксинов является восстановление дисульфидных связей в системе, сопряженной с GSH, НАДФН и глутатионредуктазой [Holmgren and Aslund, 1995]. В этом процессе используется два каталитических механизма. В дитиоловом механизме участвуют соседние цистеиновые остатки активного центра глутаредоксина [Bushweller et al., 1992]. R-S2 + Grx-(SH)2 → R-(SH)2 + Grx-S2 Grx-S2 + 2 GSH → Grx-(SH)2 + GSSG По альтернативному монотиоловому механизму могут восстанавливаться только смешанные дисульфиды [Bushweller et al., 1992]: R-S-SG + Grx-(SH)2 → R-SH + Grx-S-SG Grx-S-SG + GSH → Grx-(SH)2 + GSSG, где R-S-SG – смешанный дисульфид с глутатионом [Holmgren et al., 2005]. Глутатионредуктаза при помощи восстановительных эквивалентов от НАДФН в дальнейшем восстанавливает глутатион, выступающий в этих реакциях в качестве донора. Глутаредоксин (Grx) впервые обнаружили в штаммах E. coli, мутантных по тиоредоксину, в качестве рибонуклеотидредуктазы глутатион-зависимого [Holmgren, 1976]. донора Бактерии E. водорода coli для содержат глутаредоксины Grx1, Grx2 и Grx3, кодируемые соответственно генами grxA, grxB и grxC [Aslund et al., 1994]. Активные центры глутаредоксинов содержат сходную аминокислотную последовательность –Cys-Pro-Tyr-Cys- [Lillig et al., 2008]. Глутаредоксин 1 состоит из 85 аминокислотных остатков [Hoog et al., 1983]. Третичные структуры Grx1 и тиоредоксинов сходны, однако существенно отличаются по аминокислотному составу [Xia et al., 1992]. Согласно 15 иммунохимическому анализу, глутаредоксин занимает периферию клетки [Nygren et al., 1981]. Экспрессия grxA находится под контролем транскрипционного фактора OxyR [Zheng et al., 2001]. Глутаредоксин 1 является эффективным донором водорода для рибонуклеотидредуктазы и PAPS-редуктазы [Holmgren, 1979] Глутаредоксин 2 и глутаредоксин 3 были выделены из двойных мутантов по grxA и trxA [Aslund et al., 1994]. Глутаредоксин 2 состоит из 215 аминокислот, его структура напоминает структуру глутатион-S-трансфераз [Vlamis-Gardikas et al., 1997]. Внутриклеточный пул Grx2 составляет 1% от общего содержания белка [Shi et al., 2000]. Концентрация глутаредоксина 2 в три раза выше в стационарной фазе, чем в растущей культуре, а уровень экспрессии grxB регулируется σsсубъединицей РНК-полимеразы (RpoS) и гуанозин-3`,5`-тетрафосфатом (ppGpp) [Potamitou et al., 2002b]. Активность Grx2 в качестве донора восстановительных эквивалентов в 100 раз выше, чем у остальных глутаредоксинов [Shi et al., 1999]. Grx3 имеет сходную третичную структуру с Grx1 и 33% идентичных аминокислот. Grx3 передает восстановительные эквиваленты на рибонуклеотидредуктазу in vitro [Aslund et al., 1996]. Клетки E. coli, имеющие мутации по каждому из глутаредоксинов в отдельности и по всем трем глутаредоксинам вместе, сохраняют способность к росту на богатых и минимальных средах [Russel and Holmgren, 1988; Prinz et al., 1997]. Показано, что глутаредоксины играют определенную роль в защите клеток E. coli от окислительного стресса. В клетках E. coli Grx1 участвует в восстановлении транскрипционного фактора OxyR [Zheng et al., 1998; Aslund et al., 1999]. Отсутствие Grx2 и Grx3 приводит к повышению степени карбонилирования белков после обработки клеток перекисью водорода [VlamisGardikas et al., 2002]. Об антиоксидантных свойствах свидетельствует возрастание уровней всех трех глутаредоксинов в штамме, дефицитном по каталазной активности (KatE, KatG). 16 1.2. Редокс-система тиоредоксина 1.2.1 Тиоредоксины Тиоредоксин представляет собой небольшой белок, имеющий длину от 105 до 110 аминокислот [Eklund et al., 1991]. Все тиоредоксины имеют одинаковую трехмерную структуру, которая состоит из трех α-спиралей и четырех складчатых β-структур. Активный центр Cys-Gly-Pro-Cys локализован на петле, соединяющей первую β-структуру с первой α-спиралью [Dyson et al., 1989; Martin, 1995]. Тиоредоксин 1 кодируется геном trxA. Он служит донором электронов для рибонуклеотидредуктазы, 3΄-фосфоаденилсульфатредуктазы (PAPS) и метионинсульфоксидредуктазы [Gleason and Holmgren, 1988]. Тиоредоксин локализован на бактериальной мембране и в области нуклеоида, большая его часть сосредоточена в сайтах адгезии между внутренней и наружной мембранами E. coli [Nygren et al., 1981, Bayer et al., 1987]. Тиоредоксин кодируется 2 геном trxC, восстанавливает рибонуклеотидредуктазу и PAPS-редуктазу in vitro [Lillig et al., 1999]. Содержание в клетке тиоредоксина 1 в десять раз выше, чем тиоредоксина 2. Аминокислотная последовательность двух тиоредоксинов совпадает на 38%. У тиоредоксина 2 обнаружена N-концевая последовательность из 30 аминокислот, которая включает в себя мотив C-X-X-C-X16-C-X-X-C. Предполагают, что эта последовательность обеспечивает термостабильность или участвует в активации шаперона теплового шока Hsp33 [Burlacu-Miron et al., 1998, Jakob et al., 2000]. 1.2.2 Тиоредоксинредуктаза В восстановлении тиоредоксинредуктаза окисленного [Williams, 1995]. тиоредоксина Тиоредоксинредуктаза участвует является ферментом с молекулярным весом 70000, состоящая из двух идентичных субъединиц, каждая из которых связывает молекулу ФАД. В отличие от 17 остальных флавопротеидов, тиоредоксинредуктаза содержит в активном центре только два аминокислотных остатка между цистеинами вместо четырех и проявляет слабую консервативность последовательности аминокислот в области активного центра фермента [Russel and Model, 1988]. При структурном анализе тиоредоксинредуктазы из E. coli выявлены значительные конформационные изменения, связанные с переносом восстановительных эквивалентов с домена, связывающего НАДФН, на домен, содержащий дисульфид [Lennon et al., 2000]. Несмотря на важную роль тиоредоксина в метаболизме E. coli, при делеции гена, кодирующего тиоредоксин 1 (trxA), не происходит существенного изменения фенотипа [Russel and Model, 1985]. 1.3. Функциональная связь между редокс-системами глутатиона и тиоредоксина Системы глутатиона и тиоредоксина считаются параллельными редоксситемами клетки, не обменивающимися восстановительными эквивалентами [Das and White, 2002]. Однако при наличии дефектов в той или иной системе, они по функциям могут дублировать друг друга. В связи с этим делеция компонентов одной из систем часто никак не проявляется фенотипически, и только множественные мутации, затрагивающие обе системы, ведут к существенным нарушениям метаболизма. Глутаредоксин или тиоредоксин необходимы для восстановления сульфата в сульфит с помощью PAPS-редуктазы, поэтому двойные мутанты grxAtrxA теряют способность ассимилировать сульфат. В связи с этим в данном штамме происходит резкое снижение уровня глутатиона со сдвигом редокс-статуса в сторону окисленной формы [Miranda-Vizuete et al., 1996]. У двойных мутантов gshAtrxA повышена также индукция рибонуклеотидредуктазы и Grx1 (в 55 раз выше, чем в клетках дикого типа). Показана обратная корреляция между уровнями глутаредоксина и тиоредоксина при относительно стабильном содержании других редоксинов. Вероятнее всего глутаредоксин 1 и тиоредоксин 1 имеют перекрывающиеся 18 специфические функции, связанные с восстановлением рибонуклеотидредуктазы [Potamitou et al., 2002a]. Наряду с глутатионом тиоредоксины и глутаредоксины участвуют в создании общих восстановительных условий в цитоплазме, что было подтверждено в экспериментах с лишенной сигнальной последовательности щелочной фосфатазой [Derman et al., 1993]. Экспрессия глутаредоксинов и тиоредоксинов индуцируется в условиях окислительного стресса при нарушении редокс-равновесия в клетке [Prieto-Alamo et al., 2000, Potamitou et al., 2002a]. При этом была показана устойчивость штаммов, лишенных всех тиоредоксинов, к окислительному стрессу. Вероятно, в отсутствии тиоредоксинов происходит образование дисульфидных связей в белке OxyR, что приводит к активации других антиоксидантных систем клетки, таких как AhpC и каталаза, имеющих более высокую способность удалять пероксид водорода [Ritz et al., 2000]. Таким образом, система тиоредоксина не является необходимой для защиты от окислительного стресса в клетках E. coli, однако критична для сохранения клеточного белкового дисульфид/дитиолового редокс контроля [Lu and Holmgren, 2014]. 19 ГЛАВА 2. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС У БАКТЕРИЙ 2.1. Источники АФК и повреждения, вызываемые окислительным стрессом Продукция активных форм кислорода (АФК) является неизбежным следствием аэробного существования живых систем. Около 90% таких АФК как супероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал продуцируются в качестве побочных продуктов электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) в процессе окислительного фосфолирирования [González-Flecha and Demple, 1995]; кроме того, возникновение АФК в клетках является следствием воздействия конкурирующих микроорганизмов и внешних окислительно- восстановительных реакций [Imlay, 2008]. На верхней части схемы отображено четырех-электронное восстановление молекулы кислорода в ЭТЦ (Рис. 1). На нижней части схемы показано последовательное присоединение по одному электрону к молекуле кислорода с образованием промежуточных продуктов – АФК - супероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал. В конце концов, частично восстановленные формы кислорода могут принимать четвертый электрон и совместно с двумя протонами образовывать молекулу воды. Рис. 1. [Lushchak, 2011]. Различные пути восстановления кислорода в биологических системах. АФК воздействуют на все биологические макромолекулы: ДНК, РНК, белки и липиды. В результате разрывов цепи ДНК и модификации азотистых оснований и углеводных остатков нарушается и полностью блокируется репликация [Sies, 20 1993]. Известно более 20 продуктов распада окисленной ДНК, таких как 7,8дигидро-8-оксогуанин (8-oxo-G), 1,2-дигидро-2-оксоаденин (2-oxo-A), гидроксиметилмочевина, мочевина, тиминовые гликоли, тимин и другие [Farr, 1991, Shigenaga, 1991, Dizdaroglu, 1992]. В основе повреждающего действия пероксида водорода лежит реакция прямого окисления несвязанных внутриклеточных ионов восстановленного железа, частично ассоциированных с молекулой ДНК, приводящая к образованию высокореактивного OH· (реакция Фентона) [Imlay and Linn, 1988, Henle et al., 1999]. H2O2 + Fe2+ + H+ → ˙OH + H2O + Fe3+ Образующийся в ходе реакции гидроксильный радикал является короткоживущим и чрезвычайно активным, вследствие чего реагирует возле сайта своего образования [Park et al., 2005, Lushchak, 2011]. Для продолжения реакции необходимо восстановление окисленного железа. Предполагается, что донорами электронов служат тиолы, НАД(Ф)Н, свободные восстановленные флавины [Rowley and Halliwell, 1982, Woodmansee and Imlay, 2002]. Суперокидный радикал способен напрямую восстанавливать трехвалентное железо [Henle and Linn, 1997]. O2·¯ + Fe 3+ → Fe 2+ + O2 Однако внутриклеточная концентрация O2·¯ слишком мала, чтобы играть существенную роль в этом процессе. В данном случае более эффективным восстановителем железа считают цистеин [Park and Imlay, 2003]. Повреждающее действие супероксидного радикала связывают со способностью высвобождать железо из железо-серных центров дегидратаз [Liochev and Fridovich, 1994, Keyer and Imlay, 1996], что способствует накоплению свободного железа в цитоплазме и потенцирует реакцию Фентона. При высвобождении железа из мононуклеарных кластеров происходит захват ионов цинка, что приводит к нарушению системы метаболизма клетки [Imlay, 2013]. 21 Свободные радикалы напрямую атакуют полиненасыщенные жирные кислоты мембран, вызывая перекисное окисление липидов. С этим явлением связано повышение текучести мембран и возрастание образования по типу цепной реакции повреждающих липиды продуктов их полураспада, таких как альдегиды [Cabiscol, 2000]. Приведенные выше изменения ведут к потере целостности мембран, и в конечном итоге к гибели клеток [Imlay, 2003]. Содержание в составе мембран бактерий насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот делает их более устойчивыми к перекисному окислению, чем в клетках млекопитающих, где мембраны богаты ненасыщенными жирными кислотами. АФК вызывают окислительное повреждение белков, что приводит к модификации аминокислот, а именно, к окислению сульфгидрильных групп цистеина и метионина, имидазольных групп гистидина, циклических колец тирозина, фенилаланина, гистидина, триптофана и др. [Smith et al., 1993]. Внутриклеточные белки под действием окислительного стресса могут образовывать нежелательные дисульфидные связи. Это явление получило название «дисульфидный стресс» [Aslund et al., 1999]. Появление смешанных дисульфидов с низкомолекулярными тиолами, такими как GSH, приводит, с одной стороны, к утрате их ферментативной активности, с другой стороны, к индукции регуляторного ответа, одним из проявлений которого является активация шаперона Hsp33 [Levine et al., 1981, Paget and Buttner, 2003]. Этот шаперон играет важную роль в защите от окислительного стресса, сохраняя окисленные белки в растворенной форме, делая их доступными для регенерации или деградации клеточными протеазами [Jakob et al., 1999]. Некоторые аминокислотные остатки, включая лизин, аргинин, пролин и треонин, окисляются до карбонильных производных, образование которых считается маркером окислительного стресса [Berlett and Stadtman, 1997, Dukan and Nystrom, 1999]. В связи с этим разработаны методы определения окислительного повреждения белков, основанные на анализе содержания карбонильных групп [Levine et al., 1994, Berlett and Stadtman, 1997]. 22 В ходе окисления супероксид радикалом происходит инактивация железосерных кластеров некоторых ферментов и высвобождение иона Fe 2+ [Jang and Imlay, 2007]. [4Fe-4S] 2+ + O2·¯ + 2H+ → [3Fe-4S]+ + H2O2 + Fe 2+ Это приводит к нарушению ферментативной активности и повышает концентрацию несвязанного железа, что опасно в условиях окислительного стресса. 2.2. Механизмы защиты от окислительного стресса Для борьбы с АФК в клетке существуют специальные механизмы, направленные на их деградацию. Благодаря этому в цитоплазме поддерживается очень низкая (< 10-8 М) стационарная концентрация АФК [Halliwell and Gutteridge, 1989]. Однако в определенных условиях возрастает скорость продукции АФК или снижаются защитные способности клеток, вследствие чего возникает окислительный стресс (ОС). В ходе эволюции живые организмы выработали механизмы поддержания свободных радикалов на допустимом уровне, а также способы репарации окислительных повреждений. Важными компонентами защиты от действия АФК являются низкомолекулярные антиоксиданты, такие как глутатион, витамин Е, аскорбиновая и мочевая кислоты. Глутатион реагирует со всеми видами АФК, включая пероксид водорода, супероксидный радикал, гидроксильный радикал и синглетный кислород [Sies, 1997]. Реакции низкомолекулярных антиоксидантов с АФК протекают как неферментативно, так и с участием ферментов. Например, конъюгацию восстановленного глутатиона с клеточными компонентами, поврежденными АФК катализирует глутатион-S-трансфераза [Лущак, 2001]. В условиях окислительного стресса протекторное действие оказывают также алкилоксибензолы (АОБ) микробного происхождения. С одной стороны, 23 АОБ, обладая антиоксидантными свойствами, снижают уровень АФК. С другой стороны, эти биологически активные вещества обладают способностью модифицировать структуру биополимеров, что в отношении ферментных белков приводит к повышению их активности, функциональной и операционной стабильности в широком диапазоне неоптимальных для катализа условий [Николаев с соавт., 2010]. Основными антиоксидантными ферментами в клетке являются супероксиддисмутазы и пероксидазы. У бактерий дисмутацию O2˙¯ молекулярного кислорода цитоплазматических и пероксида супероксиддисмутазы: водорода Fe-СОД, катализируют экспрессия до две которой модулируется внутриклеточным уровнем железа [Niederhoffer et al., 1990] и MnСОД, которая быстро синтезируется при подаче кислорода, и имеет 6 глобальных эффекторов транскрипции кодирующего ее гена sodA [Compan and Touati, 1993]. Еще одна супероксиддисмутаза (CuZn-SOD) локализована в периплазматическом пространстве [Benov and Fridovich, 1994] и активируется при переходе в стационарную фазу роста [Korshunov and Imlay, 2006]. Пероксид водорода у бактерий E. coli разлагается двумя каталазами: HPI (hydroperoxidase I), которая особо важна при аэробном росте бактерий и кодируется геном katG под контролем регуляторного белка OxyR [Loewen et al., 1985] и HPII (hydroperoxidase II), которая индуцируется в стационарной фазе роста и кодируется геном katE под контролем σs (RpoS) субъединицы РНК-полимеразы [Loewen et al., 1998]. Система репарации окислительных повреждений ДНК включает в себя эндонуклеазу IV, индуцируемую окислительным стрессом, и экзонуклеазу III, индуцируемую в стационарной фазе роста и в голодающих клетках. Оба фермента действуют на двойную цепь ДНК, гидролизуя связи на 3'-концах [Demple and Harrison, 1994]. Окисленные метионин и цистеин могут быть репарированы под действием метионинсульфоредуктаз и дисульфидредуктаз (тиоредоксин и глутаредоксин) [Moskovitz et al., 1995, Cabiscol et al., 2000]. 24 2.3. Адаптивный ответ на окислительный стресс Адаптивный ответ бактериальных антиоксидантных систем на окислительный стресс координируется глобальными транскрипционными регуляторами SoxRS и OxyR, контролирующими экспрессию многих антиоксидантных генов. контролем SoxRS находится индукция экспрессии Под генов, отвечающих на супероксидный стресс. К их числу относятся гены sodA (кодирует Mn-SOD), nfo (кодирует эндонуклеазу IV), marAB (оперон множественной антибиотикоустойчивости), tolC (кодирует белок внешней мембраны), micF (кодирует антисмысловую РНК, репрессор трансляции OmpF), fpr (кодирует НАДФН-ферредоксин оксидоредуктазу), zwf (кодирует глюкозо-6- фосфатдегидрогеназу), acnA (кодирует аконитазу), fumC (кодирует фумаразу С), acrAB (кодирует помпу «drug efflux pump»), fur (железосвязывающий регуляторный белок) и другие [Pomposiello et al., 2001, Imlay, 2008]. К числу OxyR-регулируемых генов, отвечающих на повышение концентрации Н2О2, относятся katG (кодирует каталазу-гидропероксидазу I), ahpFC (кодирует НАДН-зависимую алкилгидропероксидредуктазу), grxA (кодирует глутаредоксин А), gor (кодирует глутатионредуктазу), dps (кодирует ДНК-защищающий белок), oxyS (кодирует регуляторную РНК) [Zheng et al., 2001]. Оба регулона могут взаимодействовать друг с другом, например, SoxRS регулон может быть активирован пероксидом водорода [Semchyshyn, 2009]. Механизм активации SoxRS регулона является двухступенчатым. Белок SoxR связывается с молекулой ДНК в специфическом сайте и активирует экспрессию гена soxS, в результате чего повышается уровень белка SoxS. SoxS, являясь вторичным транскрипционным фактором, повышает экспрессию генов SoxRS регулона [Hidalgo et al., 1997]. Активация белка SoxR происходит при его окислении супероксидом, а также NO· радикалом с образованием динитрозил-железо/дитиоловых производных [Ding and Demple, 2000]. Одноэлектронное окисление/восстановление [2Fe-2S] кластера регулирует транскрипционную активность SoxR. Только окисленный белок SoxR стимулирует экспрессию гена soxS в 30 раз. Предполагают, что в клетке 25 содержатся специфические редуктазы, поддерживающие [2Fe-2S] кластеры в восстановленном состоянии. Белок OxyR является хорошо изученным членом семейства LysR белковактиваторов транскрипции. Аналогично SoxR, OxyR может существовать в окисленной и восстановленной формах, причем восстановленная форма связывается с промотором oxyR, обеспечивая механизм ауторегуляции, а окисленная форма способна связываться со всеми промоторами генов, подконтрольных OxyR. Окисленный OxyR активирует транскрипцию при связывании N-терминального домена с карбокси-терминальным доменом α-субъединицы РНК-полимеразы [Storz and Imlay, 1999, Lushchak, 2011]. Активация OxyR под действием перекиси водорода происходит в результате окисления остатка Cys199 до сульфеновой кислоты (C199SOH). Несмотря на активную научную дискуссию [Zheng et al., 1998, Kim et al., 2002], большинство данных указывают на конденсацию остатка Cys208 с сульфеновой кислотой и образование дисульфидной связи, что приводит к выраженным конформационным изменениям в регуляторном домене OxyR [Choi et al., 2001]. Окисление белка OxyR происходит уже при концентрации пероксида водорода 100нМ с периодом полураспада дисульфидной связи 30 секунд. Такая сверхчувствительность белка необходима для предотвращения повреждений ДНК и ферментов при субмикромолярных концентрациях внутриклеточной перекиси [Park et al., 2005, Jang and Imlay, 2007]. Инактивация окисленного белка происходит в результате его восстановления с участием глутаредоксина 1 в присутствии глутатиона [Aslund et al., 1999]. SoxRS и OxyR регулоны также вовлечены в ответ на нитрозольный стресс [Poole, 2005]. В антиоксидантную защиту клеток вовлечен еще один регулятор – альтернативный транскрипционный фактор sigma S (RpoS, σs), регулирующий адаптационный ответ в стационарной фазе. Он кодируется геном rpoS и регулирует активность большого числа генов, в том числе антиоксидантных генов katG, dps и gor [Hengge-Aronis, 2002]. 26 2.4. Роль тиоловых редокс-систем при окислительном стрессе В адаптации бактерий к окислительному стрессу участвуют тиоловые редокссистемы клетки. Глутатион является важнейшим внутриклеточным редокс-буфером. Перекись водорода и генератор супероксида менадион вызывают существенное повышение внутриклеточного GSSG и снижение соотношения GSH/GSSG [Smirnova et al., 2000]. Однако глутатион не играет критической роли в адаптации к пероксидному стрессу [Greenberg and Demple, 1986]. Мутанты по синтезу глутатиона не проявляют повышенной чувствительности к Н2О2, куменгидропероксиду и параквату в логарифмической фазе роста, но становятся в 2 раза чувствительнее, чем родитель, в стационарной фазе [Chesney et al., 1996]. Мутанты по тиоредоксинредуктазе (trxB), напротив, демонстрируют повышенную устойчивость к перекиси водорода [Takemoto et al., 1998, Октябрьский и соавт., 2007]. Участие тиоловых редокс-систем в антиоксидантном ответе бактерий может быть связано с регуляцией активности OxyR регулона. У мутантов по генам gor и grxA снижена скорость восстановления OxyR. Регулон частично активируется у бактерий, мутантных по gshAtrxA и gortrxA, что свидетельствует о его чувствительности к изменению тиол-дисульфидного статуса [Zheng et al., 1998, Aslund et al., 1999]. У мутантов E. coli по глутатиону и тиоредоксину повышены уровень транскрипции тиоредоксина 2 и тиоредоксинредуктазы и базовый уровень экспрессии OxyR-регулируемых генов, в том числе katG, что в свою очередь, приводит к возрастанию активности каталаз и усилению устойчивости к пероксидному стрессу [Prieto-Alamo et al., 2000]. Предполагают, что регуляция редокс-чувствительного регулона SoxRS также зависит от активности тиоловых редокс-систем. В экспериментах in vitro глутатион способствовал разрушению железосерных кластеров SoxR, а экспрессия soxS in vivo снижалась у мутанта gortrxA при обработке паракватом [Ding and Demple, 1996]. При окислительном стрессе происходит значительное перекрывание функций различных компонентов антиоксидантных систем. Тиоловые редокс-системы составляют интегральную часть ответа на окислительный стресс. 27 ГЛАВА 3. ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ НА БАКТЕРИИ 3.1. Молекулярные механизмы действия антибиотиков В современной антибактериальной терапии выделяют две основные категории: бактерицидные антибиотики, которые убивают бактерии с эффективностью более чем 99,9% и бактериостатические препараты, которые подавляют рост бактерий, не убивая их [Pankey and Sabath, 2004]. Общие принципы действия различных антибиотиков представлены на рисунке 2. Рис. 2. Основные механизмы воздействия антибиотиков на клетку [Сидоренко, 2004]. 28 Ниже приводится более подробное описание молекулярных механизмов действия ряда основных групп антибиотиков, используемых в данной работе. 3.1.1 Ингибиторы процессов образования клеточной стенки бактерий Характерными свойствами данных антибиотиков являются воздействие только на делящиеся клетки, а также устойчивость к ним бактерий без клеточной стенки. Выделяют ингибиторы образования компонентов клеточной стенкb (фосфомицин), ингибиторы реакций переноса структурных блоков клеточной стенки из цитоплазмы наружу (бацитрацин А), ингибиторы образования связей (сшивок) между элементами пептидогликана (гликопептидные и β-лактамные) [Алехин, 2000]. К β-лактамным антибиотикам относят пенициллины и цефалоспорины. Опорный каркас клеточной стенки бактерий — пептидогликан - представляет собой упорядоченную структуру ячеистого строения, построенную из Nацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных β-1,4- гликозидными связями [Сидоренко, 1997]. Присоединение олигопептидов к молекуле N-ацетилмурамовой кислоты производится ферментом транспептидазой. Трансгликозилазы реагируют с гликановыми нитями, расширяя сахарные цепи путем включения новых пептидогликановых субъединиц. Бифункциональные ферменты, содержащие оба домена транспептидаз и трансгликозилаз, являются мишенью для β-лактамных антибиотиков, которые реагируют как псевдосубстраты и ацилируют активные сайты транспептидаз, предотвращая нормальную сшивку пептидных цепей в пептидогликановом слое [Bush et al., 1995, Walsh, 2000]. 3.1.2 Ингибиторы процессов биосинтеза белка Существует несколько механизмов процесса подавления синтеза белка. Условно их делят на: 29 1. Ингибирование активации аминокислот и реакций переноса (этионин, пуромицин). 2. Ингибирование функций малых субъединиц (30S) рибосомы (50S) рибосомы (аминогликозиды). 3. Ингибирование функций больших субъединиц (макролидные антибиотики). 4. Ингибирование внерибосомных функций [Желдакова, 2004]. Антибиотики данной группы в основном обладают бактериостатическим действием, за исключением случаев необратимого связывания с каким-либо компонентом системы синтеза. Аминогликозидные антибиотики, к которым относится стрептомицин, нарушают синтез белка путем связывания с рибосомами. Прохождение высокополярных молекул антибиотика через наружную мембрану грамотрицательных бактерий представляет собой самопроизвольный процесс, вызывающий разрывы Mg2+-мостиков Последующее между смежными проникновение липополисахаридными молекулами. аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану энергетически зависимо от транспорта электронов. В цитозоле аминогликозиды связываются с 30S субъединицей рибосом. Хотя это связывание не предотвращает инициацию синтеза пептида, происходит нарушение элонгации зарождающейся цепи в результате ошибок считывания. Неправильные белки затем могут встраиваться в клеточную мембрану, что ведет к изменению ее проницаемости и дальнейшей стимуляции транспорта аминогликозидов [MingeotLeclercq et al., 1999]. 3.1.3 Ингибиторы репликации и транскрипции ДНК и РНК Антибиотики, относящиеся к данной группе: 1) ингибиторы синтеза предшественников нуклеиновых кислот; 2) ингибиторы реакций полимеризации [Желдакова, 2004]. 30 Хинолоны и фторхинолоны, к которым относится ципрофлоксацин, являются ингибиторами активности ферментов, участвующих в репликации и транскрипции ДНК. Мишенью действия этих антибиотиков являются бактериальные топоизомеразы – топоизомераза IV и ДНК-гираза. Гены обоих ферментов локализованы на бактериальной хромосоме. Топоизомераза IV осуществляет разрезание на отдельные хромосомы формирующуюся в ходе репликации линейную молекулу ДНК. Функцией ДНК-гиразы является снятие напряжения, возникающего впереди репликационной вилки в результате расплетания двойной спирали ДНК в ходе репликации. Хинолоны обладают высоким сродством с комплексом ДНК-фермент. Участок их связывания называется «хинолоновым карманом». При попадании хинолона в карман останавливается продвижение ДНК-гиразы вдоль молекулы, после чего останавливается продвижение репликационной вилки. Блокирование процесса репликации ДНК вызывает SOS-ответ, что приводит к клеточной филаментации, однако сверхспирализация изолированных нуклеоидов при этом сохраняется. При повышении концентрации хинолонов до уровня, приводящего к быстрой гибели клеток, сверхспирализация нуклеоидов исчезает, что, вероятнее всего, объясняется фрагментацией хромосом. [Drlica et al., 2008, Сидоренко, 2004]. 3.2. Гипотеза об окислительном стрессе как универсальном механизме бактерицидного действия антибиотиков При использовании бактерицидных антибиотиков, быстро убивающих патогенные микроорганизмы, снижается риск возникновения антибиотикоустойчивости. В связи с этим особое внимание уделяется изучению механизмов летального действия антибиотиков. В последнее десятилетие была предложена гипотеза, что антибиотики, имеющие различные мишени в бактериальной клетке, оказывают бактерицидное действие по общему механизму, в основе которого лежит повышение продукции АФК [Kohanski et al., 2007]. Гипотеза опиралась на данные разных авторов, регистрировавших повышение 31 продукции АФК при действии таких бактерицидных антибиотиков, как хинолоны [Albesa et al., 2004, Goswami et al., 2006, Dwyer et al., 2007], аминогликозиды [Kohanski et al., 2008], ампициллин [Kohanski et al., 2008], и рифампицин [Kolodkin-Gal et al., 2008]. Бактерицидный эффект снижался в присутствии тиомочевины, ингибирующей гидроксильные радикалы, и дипиридила, хелатирующего свободное внутриклеточное железо, а также у мутантов по циклу Кребса и, наоборот, усиливался в мутантах, лишенных деструкторов перекиси водорода. В случае бактериостатических антибиотиков стимуляция продукции гидроксильных радикалов не была обнаружена. На рисунке 3 схематически представлен гипотетический путь, по которому бактерицидные антибиотики вызывают летальные повреждения в клетке. Хинолоны, β-лактамы и аминогликозиды стимулируют окисление НАДН в электрон-транспортной цепи, зависимой от цикла трикарбоновых кислот. Гиперактивация электрон-транспортной цепи стимулирует образование супероксида, который под действием супероксиддисмутаз конвертируется в пероксид водорода. высвобождая Кроме двухвалентное того, супероксид железо. поражает Повышение Fe-S концентрации кластеры, Н2О2 и свободного железа стимулирует продукцию гидроксильных радикалов в результате реакции Фентона [Kohanski et al., 2007, Dwyer et al., 2009]. Гидроксильные радикалы повреждают ДНК и другие макромолекулы, вызывая гибель клеток. На этом фоне каталазы и алкилгидропероксидредуктаза, разлагающие перекись водорода, хелатор железа дипиридил и ингибитор гидроксильных радикалов тиомочевина должны защищать клетки от гибели. Рис. 3. Летальные повреждения при бактерицидном стрессе [Wang and Zhao, 2009]. 32 Однако недавно появились работы, опровергающие эту гипотезу и позволяющие заключить, что активные формы кислорода не участвуют в гибели клеток, вызванной антибиотиками [Liu and Imlay, 2013, Keren et al., 2013]. В этих работах показано, что канамицин, ампициллин и норфлоксацин не меняют своей летальной активности в анаэробных условиях. В мутанте E. coli, лишенном каталазной и пероксидазной активности и, следовательно, способности разлагать пероксид водорода, не обнаружено повышения продукции Н2О2 при действии антибиотиков. Измерения потребления кислорода на электроде Кларка не зафиксировали существенного усиления дыхания при добавлении норфлоксацина и канамицина. Анализ ПЦР в реальном времени, проводимый в присутствии ампициллина и норфлоксацина, не выявил индукцию генов, подконтрольных OxyR. Хелаторы железа и тиомочевина одинаково подавляли чувствительность к антибиотикам в аэробных и анаэробных условиях. Одним из аргументов участия АФК в бактерицидном действии антибиотиков является защитный эффект экзогенных антиоксидантов, в частности глутатиона и аскорбиновой кислоты. Goswami и соавторы подтвердили участие АФК в антибактериальном действии ципрофлоксацина и опровергли в случае стрептомицина и ампициллина [Goswami et al., 2006, 2007]. Авторы показали также, что для бактерий E. coli глутатион и аскорбиновая кислота повышают устойчивость клеток к ципрофлоксацину и стрептомицину, однако механизмы их защиты различны. В случае β-лактамных антибиотиков наблюдали усиление антибактериальной активности в присутствии глутатиона. Dhamdhere и соавторы показали, что только экзогенный глутатион обладает защитным эффектом, однако при аккумуляции в высоких концентрациях в периплазме он становится токсичным [Dhamdhere et al., 2010]. 33 ГЛАВА 4. ТЕМПЕРАТУРНЫЕ СТРЕССЫ У БАКТЕРИЙ E. coli относится к числу типичных мезофильных микроорганизмов. Ее температурный диапазон роста от 10ºС до 49ºС. Максимальная скорость роста в аэробных условиях на богатой среде наблюдается при 35-36ºС, а температурная ниша, в которой скорость роста не ниже 75% от максимальной, находится в области от 28,5ºС до 41ºС [Bronikowski et al., 2001]. Изменения температуры выше или ниже оптимального значения вызывают, соответственно, тепловой или холодовой стресс (шок) и индуцируют стрессовый ответ. 4.1. Тепловой стресс 4.1.1. Характерные изменения в клетке при повышении температуры Как правило, повышение температуры вызывает в клетках следующие эффекты: - Повышение текучести липидного бислоя мембраны, что приводит к утечке ионов и понижении эффективности ионного гомеостаза. Для поддержания относительно постоянной вязкости мембраны при повышении температуры у большинства бактерий происходит изменение состава липидов клеточной мембраны, в нее включаются боле насыщенные длинноцепочные жирные кислоты [Ленгелер, 2005, Терешина с соавт. 2010]. - Возрастание активности ферментных систем (в два раза при повышении температуры на 10°С). Верхний предел этого эффекта определяется естественной стабильностью каждого фермента. В конечном итоге подъем температуры приводит к денатурации белка и потере ферментной активности [Ленгелер, 2005]. - Увеличение количества активных форм кислорода (АФК), что приводит к возникновению окислительного стресса [Benov and Fridovich, 1995, Davidson et al., 1996]. 34 - Резкое повышение уровня экспрессии отдельных белков, названных белками теплового шока, к которым, прежде всего, относятся молекулярные шапероны, выполняющие фолдинг белков, и АТФ-зависимые протеазы, обеспечивающие их деградацию [Bukau, 1993, Gottesman, 1996]. 4.1.2. Адаптивный ответ на тепловой стресс 4.1.2.1. Белки теплового шока Белки теплового шока участвуют в стабилизации нативной конформации жизненно необходимых белков клетки в стрессовых условиях [Van der Vies and Georgopoulos, 1996], кроме того, они блокируют агрегацию олигомеров, а также обеспечивают транспорт вновь синтезируемых клеточных белков через мембрану [Баснакьян, 2003]. Идентифицировано два основных семейства белков теплового шока Hsp70 и Hsp60 (аббревиатура из слов heat shock protein + молекулярная масса). Основным белком семейства Hsp70 у E. coli является DnaK, который формирует DnaKшаперонный механизм совместно с кошаперонами GrpE и DnaJ [McCarty et al., 1995]. Они предотвращают агрегацию новосинтезированных белковых молекул, неправильно свернутых под действием стресса. В результате гидролиза АТФ образуется комплекс АДФ-DnaK, обладающий высоким сродством к несвернутой белковой цепи. Мишенью служат выступающие на поверхности белка-субстрата гидрофобные участки из 4-5 оснований, одним из которых является лейцин; подобные участки обычно встречаются через каждые 36 аминокислот. GrpE индуцирует АДФ/АТФ обмен, в результате чего вновь образуется комплекс АТФDnaK с низким сродством к несвернутому белку, в следствие чего, белок освобождается [Siegenthaler et al., 2004]. Дальнейшее превращение белка может пойти по нескольким путям: неправильное свертывание, еще одна регенерация с участием DnaK-шаперонного механизма либо правильное свертывание с помощью белков, представителей 35 семейства Hsp60, GroEL и GroES. Суть функции белка GroEL состоит в изменении кинетического баланса между правильным фолдингом, ошибочным сворачиванием и агрегацией [Ткаченко, 2012]. Четырнадцать субъединиц белка GroEL формируют структуру, имеющую центральную полость. Белок, который должен быть свернут, временно размещается в этом отверстии, где с помощью белка GroES приобретает правильную простанственную укладку зрелого белка [Hartl et al., 2011]. У прокариот за распознавание субстрата отвечают сами протеазы, поэтому обычно их в клетке несколько. Сигналом для связывания и гидролитической активности протеаз служат аминокислотные остатки, расположенные на N-конце белковой молекулы [Varshavsky, 1997]. У E. coli известны четыре типа АТФзависимых протеаз. - ClpAP и ClpXP представляют собой крупные олигомерные комплексы, состоящие из шаперонных (ClpA и ClpX) и протеазных (СlpP) субъединиц [Clarke, 1996]. ClpA и ClpX способствуют развертыванию белка-субстрата и переносят его к протеазному компоненту СlpP, находящемуся во внутренней камере олигомера. Структура ClpP представляет собой образованную двумя гептамерными кольцами полость, располагающую в себе 14 протеолитических активных сайтов [Wang et al., 1998]. - ClpYQ/HsIUV является многокомпонентной протеазой, в состав которой входит Clp-АТФаза, связанная с протеолитическим компонентом, родственным протеасоме эукариот [Ткаченко, 2012]. - HflB (FtsH) – Zn и АТФ-зависимая протеаза, находящаяся в опероне с RpoH-зависимым промотором. Она участвует в деградации цитоплазматических и мембранных белков [Tomoyasu et al., 1995]. Является единственной АТФзависимой протеазой, существенной для жизни E. coli. - Lon – гомотетрамер, который транскрибируется с промотора теплового шока. Белок имеет два домена: протеазный с карбоксильного конца и АТФазный. В основном Lon протеаза взаимодействует с множеством аминокислот, обогащенных ароматическими остатками, которые становятся доступными в 36 денатурированном белке. Эта протеаза деградирует большинство аномальных белков E. coli [Botos et al., 2004, Meyer and Baker, 2011]. 4.1.2.2 Регуляция ответа на тепловой шок Мягкий тепловой шок у E. coli (перепад температур от 30°С до 42°С) вызывает мгновенную индукцию белков теплового шока, которая достигает максимума приблизительно через 5 минут с дальнейшим понижением до достижения нового стационарного уровня через 20-30 минут [Straus et al., 1987]. Индукция происходит на транскрипционном уровне и находится под контролем альтернативной σ32-субъединицы РНК-полимеразы, кодируемой rpoH геном [Connolly et al., 1999, Arsene et al., 2000]. Транскрипция rpoH может инициироваться с четырех промоторов, три из которых распознаются σ70- субъединицей РНК-полимеразы, основным σ-фактором E. coli. Четвертый промотор зависит от σE, регулируется белком DnaA и комплексом cAMP-CRP и активируется при сильном тепловом шоке (выше 45°С) [Erickson et al., 1987, Hengge-Aronis, 2002]. В этих условиях синтез практически всех белков в клетке прекращается и σE становится единственной σ-субъединицей, которая участвует в транскрипции σ32. При росте в нестрессорных условиях в клетке поддерживается низкий уровень σ32, что обеспечивает синтез небольшого количества белков теплового шока в клетке. Причиной этого является ограниченная трансляция rpoH мРНК и нестабильность σ32. При повышении температуры количество rpoH мРНК увеличивается незначительно, а содержание активной субъединицы σ32 возрастает в 15-20 раз. Механизмы, являющиеся причиной этому, действуют на следующих уровнях: посттранскрипционный уровень, на котором увеличивается трансляция rpoH мРНК и посттрансляционный уровень, на котором стабильность белка сохраняется приблизительно в течение 5 минут [Yura, Nakahigashi, 1999]. Регуляция активности σ32 происходит в течение фазы адаптации после повышения температуры, когда экспрессия белков теплового шока ниже 37 ожидаемой от количества присутствующей в клетке σ32 [Straus et al., 1987]. Для объяснения механизма контроля активности была предложена модель титрования несвернутых белков [Guisbert et al., 2008]. Согласно этой модели, σ32 дает способность шаперонам определить количество несвернутых белков в клетке. Если количество шаперонов велико относительно несвернутых белков, шапероны по типу обратной связи будут ингибировать σ32, таким образом, отрицательно регулируя дальнейшее образование шаперонов. Сверхэкспрессия DnaK/J и GroEL/S шаперонных механизмов инактивирует σ32, и наоборот, повышенное образование неправильно сложенных белков приводит к уменьшению количества шаперонов и аккумуляции σ32 [Guisbert et al., 2004, Tomoyasu et al., 1998]. Это свидетельствует о том, что σ32 реагирует не на общий уровень шаперонов в клетке, а на отношение их содержания к числу несвернутых белков. Количество шаперона DnaK-DnaJ в клетке невелико, поэтому он является весьма чувствительным средством мониторинга стрессов. Согласно этой модели шапероны не участвуют в стабильных взаимодействиях с субстратами, а привлечены в циклы связывания и освобождения субстратов, приводимых в действие АТФазной активностью шаперонов. Контроль деградации σ32 является сложным процессом. Время полужизни этого белка в условии устойчивого состояния при 30°С составляет около 1 минуты и снижается до 20 секунд при мягком тепловом шоке (42°С) [Kanemori et al., 1999, Morita et al., 2000]. Однако при переходе в сторону более высоких температур этот в норме неустойчивый белок немедленно стабилизируется на 510 минут [Straus et al., 1987]. Главной протеазой, деградирующей σ32,является АТФ-зависимая протеаза FtsH, локализованная во внутренней мембране [Herman et al., 1995, Tomoyasu et al., 1995]. В деградацию σ32 вовлечены также шапероны DnaK, DnaJ и шаперонины GroEL/S [Guisbert et al., 2004]. Молекулярный механизм шаперонной инактивации σ32 полностью не установлен. Считается, что шапероны предотвращают связывание σ32 с РНК-полимеразой, что позволяет протеазам ее деградировать [Guisbert et al., 2008] . 38 4.1.3. Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при тепловом стрессе Существует гипотеза, согласно которой активно растущие клетки, подверженные какому-либо стрессовому воздействию, продуцируют избыток свободных радикалов [Aldsworth et al., 1999]. Было показано, что в условиях теплового шока в клетках E. coli происходят изменения, характерные для окислительного стресса [Lee et al., 1983, Benov and Fridovich, 1995, Smirnova et al., 2007]. Повышение температуры культивирования до 42°С сопровождается возрастанием скорости дыхания, продукции супероксида и увеличением внутриклеточной концентрации перекиси водорода. В этих условиях стимулируется синтез GSH, его окисление и выход из клеток [Smirnova et al., 2007]. Кроме того, при мягком тепловом шоке была выявлена индукция, по крайней мере, 26 генов регулона окислительного стресса [Gunasekera et al., 2008]. Таким образом, в условиях мягкого теплового шока повышение активности антиоксидантных систем стремится компенсировать возрастание продукции АФК. С этой точки зрения, увеличение концентрации восстановленного глутатиона внутри и снаружи клеток и возрастание активности антиоксидантных ферментов HPI, GOR и GrxB являются частью адаптивного ответа на мягкий тепловой стресс (42°С). В этих условиях бактерии сохраняют высокий внутриклеточный редокс-статус (GSHin:GSSGin=195), что связано с ускорением синтеза глутатиона и повышением активности GOR [Smirnova et al., 2007]. Если тепловой шок сопровождается возрастанием продукции АФК, то искусственное повышение АФК, в свою очередь, приводит к сверхэкспрессии генов теплового шока. В частности, у E. coli все главные системы шаперонов, включая DnaK, GroEL, HtpG, и Clp протеазы демонстрировали сверхиндукцию при пероксидном стрессе [Zheng et al., 2001]. Мутационные дефекты некоторых компонентов клеточных редокс-систем также могут приводить к индукции белков теплового шока. Повышенная экспрессия белков теплового шока, подконтрольных σ32, и некоторых белков окислительного стресса наблюдалась у 39 мутантов, дефектных по обеим дисульфид-восстанавливающим системам, а именно тиоредоксинредуктазе и глутатионоксидоредуктазе (gortrxB). Это явление связывают с дисульфидным стрессом. Предполагаетя, что при дисульфидном стрессе стабилизация σ32 происходит через ингибирование FtsH-зависимой деградации [Muller et al., 2013]. Сравнительный анализ штаммов, мутантных по rpoH, не выявил сверхрегуляции генов, индуцируемых при тепловом или дисульфидном стрессе, показывая, что σ32 является необходимым и достаточным фактором индукции ответа на тепловой шок при дисульфидном стрессе. 4.2. Холодовой стресс 4.2.1. Характерные изменения в клетке при резком понижении температуры Как было показано выше, ответ бактерий на тепловой шок изучен сравнительно детально, значительно меньше известно о механизмах, лежащих в основе ответа бактерий на холодовой шок. Для мезофильных микроорганизмов, к которым относится и E. coli, принято определять холодовой шок как переход от роста при оптимальной температуре (37 ºС) в сторону более низких. Чаще всего, при изучении ответа кишечной палочки на холодовой шок используют сдвиг температур с 37 ºС до 10 ºС. В отличие от высоких температур, холодовой шок бактерии переносят легче. В зависимости от перепада температур при холодовом стрессе наблюдается снижение скорости роста или даже остановка роста. В определенных условиях после остановки роста и периода акклиматизации может наблюдаться возобновление роста, но уже с новой, пониженной скоростью, характерной для данной температуры [Jones et al., 1987]. Установлено, что многие виды микроорганизмов могут сохранять жизнеспособность в течение тысячелетий, находясь в условиях вечной мерзлоты [Zvyagintsev, 1995]. На молекулярном уровне холодовой стресс приводит к следующим структурно-функциональным изменениям: снижению текучести мембран, что затрагивает такие функции как активный транспорт и секреция белков [Murata and 40 Wada, 1995]; стабилизации вторичной структуры ДНК и РНК, приводящей к снижению эффективности трансляции мРНК и транскрипции; медленному или неэффективному фолдингу некоторых белков; необходимости адаптации рибосом к функционированию при низких температурах [Phadrate, 2004, VanBogelen and Neidhardt, 1990]. Одним из важных механизмов адаптации к воздействию пониженных температур является увеличение доли короткоцепочных и ненасыщенных жирных кислот. В фосфолипидах мембран бактерий E. сoli наблюдается увеличение количества цис-вакценовой кислоты и снижение количества пальмитиновой кислоты [Marr and Ingraham, 1962]. Этот тип ответа был назван гомеовискозной адаптацией. Ключевую роль в изменении состава жирных кислот играет кодируемая fabF β-кетоацил-АЦФ-синтаза II, которая является ответственной за элонгацию пальмитолеиновой кислоты в цис-вакценовую. Таким образом, под действием холодового шока происходит увеличение биненасыщенных фосфолипидов по сравнению с насыщенными фосфолипидами [Sinensky, 1974]. Однако не всегда холодовой стресс сопровождается изменением насыщенности и изомерии жирных кислот. В частности показано, что в соответствующим образом оптимизированной среде бактерии E. сoli могут расти при 10°С, не меняя состав жирных кислот [Головлев, 2003]. Важную роль в адаптации к низким температурам, по-видимому, играет трегалоза. В условиях холодового стресса индуцируется экспрессия генов otsA (трегалозо-6-фосфат синтаза) и otsB (трегалозо-6-фосфат фосфотаза) [Phadtare and Inouye, 2004]. Предполагают, что трегалоза может участвовать в стабилизации клеточных мембран и предотвращать денатурацию и агрегацию специфичных белков при низких температурах. Еще одной функцией трегалозы in vivo может быть связывание свободных радикалов [Kandror et al., 2002]. В результате геномного анализа ответа на холодовой стресс была показана также экспрессия генов, отвечающих за транспорт и метаболизм таких сахаров как фруктоза, глюкоза, мальтоза, рибоза, манноза и ксилоза. Однако, непосредственный защитный эффект вышеперечисленных сахаров не выявлен, в 41 связи с чем предполагают их участие в перестройке клеточного метаболизма к низким температурам [Phadtare and Inouye, 2004]. Неправильная укладка белков не рассматривалась ранее как основная проблема при холодовом шоке. Однако, геномный анализ клеток дикого типа E. coli при 15°С показал резкое повышение индукции генов, кодирующих белки теплового шока и молекулярные шапероны, такие как htpG, mopA, mopB и ppiA, кодирующие HtpG, GroEL, GroES и пептидил-пролил-цис-трансизомеразу соответственно [Phadtare and Inouye, 2004]. Протеомный анализ физиологического ответа энтерогеморрагической кишечной палочки на снижение температуры (до 14°С и 25°С) и активности воды (до aw 0,985 и 0,967) выявил значительное повышение экспрессии генов, кодирующих ферменты пентозо-фосфатного пути. Наибольшую индукцию показали гены трансальдолазы A и транскетолазы B, находящиеся под позитивным контролем RpoS [Moen et al., 2009, Kocharunchitt et al., 2012]. Кроме того, была обнаружена активация генов биосинтеза таких аминокислот как гистидин, валин, изолейцин и триптофан [Kocharunchitt et al., 2012]. При идентификации генов, чья экспрессия повышалась при переходе от 37ºС к 23ºС у бактерии E. coli, была обнаружена целая группа генов, отвечающая за образование биопленок [White-Ziegler et al., 2008]. 4.2.2. Белки холодового шока Важным следствием холодового шока является практически полная остановка синтеза большинства клеточных белков и активация синтеза некоторых белков, получивших название белков холодового шока (cold shock proteins, Csp). В зависимости от степени индукции Csps E. coli можно разделить на два класса. К первому классу относятся белки, концентрация которых при снижении температуры возрастает в 10 и более раз, ко второму – белки, индуцируемые в меньшей степени [Thieringer et al., 1998]. 42 В первый класс входят главные белки холодового шока CspA, CspB, CspG и CspI, которые действуют как шапероны для РНК и ДНК, а также CsdA (хеликаза), RbfA (рибосомсвязывающий фактор), NusA (белок, участвующий в терминации и антитерминации транскрипции) и PNP (рибонуклеаза) [Goldstein et al., 1990, Nakashima et al., 1996, Wang et al., 1999]. Ко второму классу относятся рекомбиназа RecA, фактор инициации трансляции IF-2, ДНК-связывающий белок нуклеоида H-NS, субъединица ДНК гиразы GyrA, молекулярные шапероны Hsc66 и HscB, пируватдегидрогеназа и дигидролипоамид-ацетил-трансфераза. Среди главных белков холодового шока наиболее активно синтезируется CspA. В связи с обнаружением сродства этого белка к одноцепочечным ДНК и РНК предполагают, что CspA выполняет функции РНК-шаперона и отвечает за стабилизацию структуры этих молекул при пониженных температурах. CspA присутствует в клетках и при оптимальной ростовой температуре. В этих условиях его содержание зависит от фазы роста культуры: уровень максимален на ранней фазе экспоненциального роста и падает почти до нуля в поздней фазе роста. Функции при оптимальной температуре неизвестны [Скабкин, 2004]. Повышенная экспрессия главных Csps при низких температурах является необходимым условием адаптации бактерий к росту и размножению при холодовом стрессе, однако ни один из этих белков сам по себе не является критичным для выживания клеток при низких температурах. Важно, что к индукции белков холодового шока приводит также добавление определенных ингибиторов синтеза белка, таких как хлорамфеникол, тетрациклин, эритромицин [VanBogelen and Neidhardt, 1990, Jiang et al., 1993]. 4.2.3. Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при холодовом стрессе При изучении ответа растущих аэробных клеток E. coli на относительно «мягкий» холодовой шок (от 37ºС до 20ºС и 15ºС) было выявлено развитие реакций, характерных для окислительного стресса. В пользу этого 43 свидетельствует повышение уровня экспрессии гена sodA, кодирующего супероксиддисмутазу Mn-СОД в ответ на снижение температуры до 20ºС [Cмирнова с соавт., 2001]. Методом двумерного гель-электрофореза была показана экспрессия SodB и AhpF у E. coli K12 при 15°С [Brennan et al., 2012]. Транскриптомный анализ выявил индукцию экспрессии гена katG в течение пяти часов инкубации при температуре 15°С [Phadtare and Inouye, 2004]. В культурах, подвергнутых холодовому шоку 20°С, было показано повышение уровня внеклеточного восстановленного глутатиона и снижение его уровня внутри клеток [Cмирнова с соавт., 2001]. Транскриптомным анализом было выявлено повышение экспрессии глутаредоксина 2 в течение первого часа после перехода температуры от 37°С к 15°С [Phadtare and Inouye, 2004]. Изменение уровня внеклеточных и внутриклеточных низкомолекулярных тиолов является, по-видимому, распространенной, и, возможно, универсальной реакцией бактерий E. coli на различные стрессы [Cмирнова с соавт., 2001]. Вопрос о роли различных тиоловых и антиокидантных систем в ситуации холодового стресса остается открытым. В завершение литературного обзора, суммируя известные к настоящему времени данные, можно сделать следующее заключение. 1. Подробно изучены биохимические и молекулярно-генетические аспекты внутриклеточных редокс-систем глутатиона и тиоредоксина. Установлена их роль в поддержании тиол-дисульфидного баланса в цитоплазме и в регуляции SH-SS переходов в ферментах и регуляторных белках. 2. Показана прямая (как антиоксидантов) и косвенная (как регуляторов состояния существенных SH-групп в сенсорных и регуляторных белках) роль тиоловых редокс-систем в ответе на окислительный стресс. 3. Получены свидетельства, что тепловой и холодовой стрессы сопровождаются изменениями редокс-статуса глутатиона и индукцией антиоксидантных регулонов. В свою очередь, окислительный и 44 дисульфидный стрессы приводят к повышению уровня белков теплового шока. Однако роль этих изменений в адаптации к соответствующим стрессам и возможное участие редокс-регуляции в ответе на температурные стрессы изучены недостаточно. 4. Дискуссионным остается вопрос о вкладе активных форм кислорода в механизм индуцированной антибиотиками гибели бактериальных клеток и об участии антиоксидантных систем клетки в ответе на вызванный антибиотиками стресс. 5. Данные о роли тиоловых редокс-систем в ответе клеток на стрессы, индуцированные антибиотиками, немногочисленны и противоречивы. Мало известно о роли этих систем при комбинированном действии температурных стрессов и антибиотиков. 45 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 5.1. Бактериальные штаммы Объектом исследования служили изогенный ряд одиночных нокаут мутантов Escherichia coli, полученных из Keio Knockout Collection. На ее основе методами трансформации плазмид и трансдукции с фагом РI в Лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов (ЛФГМ) были сконструированы двойные мутанты и штаммы, содержащие одновременно соответствующие мутации и слияния промоторов генов katG и sodA со структурным геном lacZ, кодирующем β-галактозидазу (Таблица 1). Таблица 1. Штаммы E. coli, используемые в исследовании. Штамм BW25113 Генотип JW2663 как BW25113, но ∆gshA769::kan Источник Baba, et al., 2006. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single – gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2: 1-11. The Keio collection JW3467 как BW25113, но ∆gor-756::kan The Keio collection JW5856 как BW25113, но ∆trxA732::kan The Keio collection JW0871 как BW25113, но ∆trxB786::kan The Keio collection JW0833 как BW25113, но ∆grxA750::kan The Keio collection JW1051 как BW25113, но ∆grxB734::kan The Keio collection NM3655 как BW25113, но ∆trxAgshA769::kan Сконструировано в ЛФГМ NM3761 как BW25113, но ∆trxBgor756::kan Сконструировано в ЛФГМ ∆(araD-araB)567, ∆lacZ4787(::rrnB3), λ-, rph-1, ∆(rhaD-rhaB)568, hsdR514 46 Продолжение табл. 1. Штамм NM3001 Генотип как BW25113, но sodA::lacZ NM3104 как JW2663, но sodA::lacZ (∆gshA) Сконструировано в ЛФГМ NM3204 как JW3467, но sodA::lacZ (∆gor) Сконструировано в ЛФГМ NM3401 как JW0833, но sodA::lacZ (∆grxA) Сконструировано в ЛФГМ NM3503 как JW1051, но sodA::lacZ (∆grxB) Сконструировано в ЛФГМ NM3703 как JW0871, но sodA::lacZ (∆trxB) Сконструировано в ЛФГМ NM4604 NM3021 как NM3655, но sodA::lacZ (trxAgshA) как NM3761, но sodA::lacZ (trxBgor) как BW25113, но katG::lacZ NM3122 как JW2663, но katG::lacZ (∆gshA) Сконструировано в ЛФГМ NM3221 как JW3467, но katG::lacZ (∆gor) Сконструировано в ЛФГМ NM3422 как JW0833, но katG::lacZ (∆grxA) Сконструировано в ЛФГМ NM3521 как JW1051, но katG::lacZ (∆grxB) Сконструировано в ЛФГМ NM3624 как JW5856, но katG::lacZ (∆trxA) Сконструировано в ЛФГМ NM3725 как JW0871, но katG::lacZ (∆trxB) Сконструировано в ЛФГМ NM4621 как NM3655, но katG::lacZ (trxAgshA) как NM3761, но katG::lacZ (trxBgor) NM4706 NM4721 Источник (wt) Сконструировано в ЛФГМ Сконструировано в ЛФГМ Сконструировано в ЛФГМ (wt) Сконструировано в ЛФГМ Сконструировано в ЛФГМ Сконструировано в ЛФГМ 5.2. Питательная среда и условия культивирования Бактерии E. coli выращивали на минимальной среде М9 (Na2HPO4 12 H2O – 15,13 г/л; KH2PO4 - 3 г/л; NH4Cl – 1 г/л; NaCl – 0,5 г/л; MgSO4 · 7 H2O – 0,246 г/л; CaCl2 – 0,011 г/л) [Miller, 1972] с добавлением 0,15% глюкозы и антибиотиков, к которым был устойчив исследуемый штамм (канамицин или ампициллин). После центрифугирования клетки из ночной культуры ресуспендировали в 100 мл свежей среды до значения оптической плотности при 600 нм 0,1 и далее 47 выращивали при 37ºС в колбах объемом 250 мл в термостатируемом орбитальном шейкере (Россия) при частоте вращения 150 об/мин. В середине логарифмической фазы (OD600 = 0,5) бактерии обрабатывали сублетальными концентрациями исследуемых антибиотиков (ципрофлоксацин, ампициллин, стрептомицин) и в течение двух часов следили за ростом по изменению OD600. В экспериментах с комбинированным действием экстремальных температур и антибиотиков температурный стресс производили за 1 час до добавления антибиотика. 5.3. Определение устойчивости бактерий к стрессовым воздействиям Удельная скорость роста Удельную скорость роста культуры (µ) определяли по формуле: µ= ln ODt 2 − ln ODt1 t 2 − t1 где ODt2 и ODt1 – плотности культуры в моменты времени t2 и t1, соответственно, измеренные при длине волны 600 нм. Колониеобразующая способность Аликвоты культуры, отобранные через определенные временные промежутки (0, 30, 60 и 120 мин после добавления антибиотика или температурного стресса), испытывали на способность к формированию колоний (выживаемость на твердых средах). Из каждой отобранной пробы готовили ряд разведений в 0,85 % растворе NaCl. По 1 мл полученных разведений добавляли в пробирку с расплавленным при 42°С жидким LB-агаром (0,8%), встряхивали и быстро выливали на чашку с твердым агаром (1,5%). После застывания верхнего агара чашку ставили в термостат при 37°С и через 24 часа подсчитывали количество выросших колоний. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотиков МИК определяли методом разведения на среде LB и в минимальной среде М9 с добавлением 0,15% глюкозы. Для этого в лунки планшета вносили среду с последовательными двукратными разведениями испытуемого антибиотика и по 48 50 мкл суспензиии клеток с OD600 = 0,003 и измеряли оптическую плотность на микропланшетном спектрофотометре xMarkTM Bio-Rad (США) при длине волны 600 нм. Планшеты помещали в термостат при 37°С и через 22 часа снова измеряли оптическую плотность. МИК соответствует самой низкой концентрации антибиотика, которая полностью подавляет рост бактерий. 5.4. Определение способности к образованию биопленок Для приготовления клеточной суспензии бактерии из ночной культуры центрифугировали и ресуспендировали в 5 мл среды М9 (0,4% глюкозы) с добавлением 0,2% казаминовых кислот и тиамина (10 мкг/мл) до значения оптической плотности OD600 = 0,1. Способность бактерий к биопленкообразованию определяли по методу, описанному Naves et al (2008) с некоторыми модификациями. В лунки 96луночного полистирольного планшета стерильно вносили по 100 мкл суспензии бактериальных клеток или среды М9 (контроль), культивировали 110 минут при 37°С в термостатируемом шейкере ST-32 ELMI (Латвия), при необходимости вносили по 5 мкл антибиотика на лунку до конечной концентрации 3 мкг/мл ципрофлоксацина, 10 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл стрептомицина и помещали в термостат при разных температурах в диапазоне 20°С-46°С. Через 21 час измеряли OD600, выливали содержимое лунок, отмывали стерильным физраствором два раза по 250 мкл и сушили на открытом воздухе 30 минут. Затем вносили в лунки по 150 мкл 0,1% раствора генциан-виолета и оставляли на 30 минут, после чего выливали краситель, промывали 5 раз по 200 мкл водой и подсушивали в течение 40 минут. Для количественного определения биопленкообразования в лунки вносили по 200 мкл 96% этанола, пипетировали, переносили по 125 мкл в новый планшет и измеряли оптическую плотность связанных с красителем клеток и контрольных лунок на микропланшетном спектрофотометре xMarkTM Bio-Rad (США) при длине волны 540 нм. Расчеты проводили, согласно формулам: 49 BF = AB – CW, где BF – валовое биопленкообразование, AB - OD540 окрашенных бактериальных клеток, CW - OD540 окрашенных контрольных лунок. SBF = (AB - CW)/∆OD600, где SBF – удельное биопленкообразование, ∆OD600 – разность между OD600 планктонной культуры и OD600 среды без бактерий. 5.5. Определение подвижности бактерий Каплю (5 мкл) ночной культуры бактерий помещали в центр чашки с полужидким жидким LB-агаром (0,3%) и инкубировали в течение суток при 30°С, после чего измеряли диаметр пятна [Pittman et al., 2002]. 5.6. Измерение внутри- и внеклеточной концентрации глутатиона Для определения экстраклеточного глутатиона 2,5 мл пробы из культуры, находящейся в середине логарифмической фазы роста, пропускали через мембранный фильтр VLADiSART (Россия) с диаметром пор 0,45 мкм. Часть фильтрата использовали для определения общего глутатиона, к другой части для определения окисленного глутатиона добавляли 2мМ N-этилмалеимида (NEM). После инкубирования в течение часа избыток NEM удаляли семикратной экстракцией эфиром. Для определения внутриклеточного глутатиона 10 мл культуры центрифугировали в течение 5 минут при 8000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 5 мл 0,02 M ЭДТА и разрушали ультразвуком 6 раз по 30 секунд на льду. Для осаждения белка к полученному гомогенату добавляли перхлорную кислоту (в конечной концентрации 0,5 мМ) и через 30 минут центрифугировали. Избыток хлорной кислоты нейтрализовали 5 М КОН, доводя рН до 7,5. Для удаления перхлората калия пробы охлаждали и центрифугировали. Глутатион определяли высокочувствительным циклическим методом с глутатионредуктазой [Tietze, 1969]. 200 мкл пробы добавляли к смеси, 50 содержащей 100 мМ Na-фосфатного/5 мМ ЭДТА буфера (pH 7,5), 0,6 мМ DTNB и глутатионредуктазу. Поглощение пробы измеряли до и через 6 мин после добавления 0,2 мМ НАДФН при 412 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1650 (Япония). Контрольная кювета содержала смесь аналогичного состава за исключением того, что вместо пробы добавляли равный объем буфера. Концентрацию общего глутатиона или GSSG рассчитывали по калибровочным графикам, используя в качестве стандарта растворы GSH или GSSG с известной концентрацией. Калибровочные растворы обрабатывали так же, как опытные пробы. Концентрацию глутатиона выражали в мкM/OD600. 5.7. Определение уровня дисульфидов в белках Для определения тиолов и дисульфидов в белках клетки E. coli выращивали на среде М9 с добавлением 0,15% глюкозы до OD600 = 0,6. Для приготовления суспензии 20 мл культуры центрифугировали (5 минут, 13000×g, 4°С), отмывали в 10 мл 100мМ Na-фосфатного/5мМ ЭДТА буфера (pH 7,5) и ресуспендировали в 4 мл ледяной сульфосалициловой кислоты (3% w/w). Полученную смесь обрабатывали ультразвуком 6 раз по 30 секунд на льду. Разрушенные клетки центрифугировали при 13000×g в течение 2 минут. Осадок отмывали три раза сульфосалициловой кислотой и ресуспендировали в 1 мл сульфосалициловой кислоты (3% w/w). Эту суспензию использовали для определения тиолов и дисульфидов в белке как описано Chen et al (2008). Для определения тиолов 100 мкл суспензии встряхивали с раствором, содержащим Na-фосфатный буфер (0,15М, pH 7,5, 1120 мкл) и DTNB (19,8 мг/мл, 70 мкл), инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре и измеряли абсорбцию на спектрофотометре Shimadzu UV-1650 PC (Япония) при длине волны 412 нм. Контрольная кювета содержала Na-фосфатный буфер (1190 мкл) и 100 мкл клеточной суспензии. Для определения дисульфидов в белках 100 мкл суспензии встряхивали с раствором, содержащим Na-фосфатный буфер (0,5М, pH 7,5, 200 мкл) и NaBH4 51 (283,7 мг/мл). Смесь инкубировали при 60°С в течение 30 минут вслед за медленным добавлением соляной кислоты (18,3%, 160 мкл) на льду до достижения pH 1. Затем смесь нейтрализовывали Na-фосфатным буфером (0,5М, pH 10, 590 мкл) и добавляли DTNB (19,8 мг/мл, 70 мкл). После 20 минут инкубации при комнатной температуре измеряли абсорбцию при длине волны 412 нм. Для построения калибровочного графика использовали растворы с известной концентрацией GSH и GSSG, обработанных таким же способом, как и пробы с экспериментальной суспензией. Количество дисульфидов в белках определяли по формуле: Дисульфиды в белках (выраженные в эквивалентах GSSG) = (тиолы после восстановления с NaBH4 – тиолы до восстановления с NaBH4)/2 5.8. Определение концентрации перекиси водорода Клетки выращивали на среде М9 с добавлением 0,15 % глюкозы при 37°С до OD600 = 0,5. Пробы из необработанных или подвергнутых температурным стрессам культур отбирали в течение часа с интервалом в 20 минут и пропускали через мембранный фильтр VLADiSART (Россия) с диаметром пор 0,45 мкм. Затем 1,35 мл полученного фильтрата инкубировали с 0,75 мл флуохромного реагента Amplex Red (200 мкМ) и 0,75 мл Horseradish peroxidase (0,02 мг/мл) в течение 5 мин. Содержание H2О2 в образцах измеряли на спектрофлуориметре Shimadzu RF1501 (Япония) при длине волны облучения 563 нм и длине волны испускания 587 нм [Seaver and Imlay, 2001]. Концентрацию Н2О2 рассчитывали по калибровочным графикам, построенным с использованием стандартных растворов H2O2. 5.9. Определение активности гидропероксидаз HPI и HPII Каталазную активность измеряли спектрофотометрическим методом [Visick and Clark, 1997]. Для приготовления экстрактов 20 мл культуры центрифугировали 5 минут (13000×g, 4°C). Осадок отмывали и ресуспендировали 52 в 4 мл 5 мМ К+-фосфатного буфера (рН 7), содержащего 5 мM ЭДТА, 10 % глицерина и 25 мкМ фенилметилсульфонил флуорида. Клетки разрушали ультразвуком пульсами по 5 секунд 4 цикла. Растворимую клеточную фракцию отделяли центрифугированием (10 мин, 12000×g) при 4°C. Супернатант делили на две порции, в одной из которых определяли общую каталазную активность. Во второй порции термостабильную HPII активность измеряли после нагревания на водяной бане в течение 15 минут при 55°С. Активность каталазы HPI определяли по разности между общей каталазной активностью и активностью HPII. Каталазную активность определяли по убыли известной концентрации Н2О2 за 1 минуту при 240 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1650PC (Япония). Расчет активности проводили по формуле: (1000 × ∆А240 /мин) / (43,6 × мг белка/мл реакционной смеси) Единица каталазной активности (U) соответствует деструкции 1 мкМ Н2О2 в минуту на 1 мг белка. Концентрацию белка в супернатанте определяли методом Лоури [Lowry et al., 1951]. 5.10. Определение экспрессии антиоксидантных генов (по активности βгалактозидазы) Активность β-галактозидазы в клетках E. coli, несущих слияния гена lacZ с промоторами исследуемых генов, измеряли по методу Миллера (Miller, 1972). Для этого отобранные до и после теплового стресса суспензии клеток (0,5 мл) вносили в 1,5 мл восстановительного буфера, содержащего 0,1 М Na-фосфатный буфер (рН 7), 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO4, 0,1 мМ MnSO4·5H2O, 50 мМ меркаптоэтанола и 50 мкг/мл хлорамфеникола. В реакционную смесь добавляли 10мкл толуола и 10 мкл дезоксихолата, встряхивали и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Затем добавляли 0,5 мл 13,3 мМ раствора о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ОНФГ), и через 3 минуты останавливали реакцию добавлением 0,5 мл 1N K2CO3. Поглощение измеряли при длине волны 420 нм (на фотометре КФК-3 с толщиной кюветы 5 мм), что соответствует суммарному поглощению окрашенного продукта 53 реакции о-нитрофенола и рассеянию света обломками клеток, и при 550 нм, когда происходит только рассеяние света обломками клеток. Используя коэффициент рассеяния света, равный 1,75·OD550, вычисляли истинное поглощение онитрофенола. Активность β-галактозидазы выражали в относительных единицах Миллера и рассчитывали по формуле: активность = 3 × 1000 × OD420 − 1.75 × OD550 , t × V × OD600 где OD420 и OD550 – измеренные значения для реакционной смеси; OD600 – плотность клеточной суспензии перед определением; t – время реакции в минутах, V – объем отбираемой клеточной суспензии в мл. 5.11. Статистическая обработка полученных результатов Обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excel (Microsoft Office 2003) и Statistica 6.0, вычисляя среднее значение, стандартную ошибку и доверительный интервал. Каждый результат показан как среднее значение не менее чем из трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий между средними величинами оценивали согласно критерию Стьюдента, различия считались значимыми при р < 0,05. 5.12. Материалы В работе использовались реагенты, полученные от «Sigma» (США): казаминовые кислоты, тиамин, фермент глутатионоксидоредуктаза, DTNB, ЭДТА, НАДФН, GSH, NEM, GSSG, ОНФГ, LB, Amplex Red, horseradish peroxidase, агар, меркаптоэтанол, приготовления дезоксихолат. растворов классифицируемые как х.ч. и Остальные сред, были реагенты, использованные отечественного для производства, 54 ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, МУТАНТНЫХ ПО ТИОЛОВЫМ РЕДОКС-СИСТЕМАМ В работе использовали бактерии родительского штамма и делеционные мутанты Escherichia coli, полученные из Keio collection, по генам gshA (первый фермент синтеза глутатиона), gor (глутатионредуктаза), trxA (тиоредоксин I), trxB (тиоредоксинредуктаза), grxA и grxB (глутаредоксины А и В). Кроме того в Лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов методом трансдукции с помощью фага P1 были сконструированы двойные мутанты gshAtrxA и gortrxB. Тестирование параметрам: производилось скорость роста, по следующим число физиолого-биохимическим колониеобразующих единиц (КОЕ), содержание белковых и небелковых тиолов и дисульфидов, уровень глутатиона (GSH) в цитоплазме и в среде, активность гидропероксидаз HPI и HPII, уровень Н2О2, экспрессия антиоксидантных генов, устойчивость к пероксидному стрессу, подвижность бактерий и способность к биопленкообразованию. Все параметры определялись в растущих аэробно культурах при температуре 37°С. 6.1. Рост и выживаемость бактерий Мутации по генам, кодирующим компоненты тиоловых редокс-систем, вызывали небольшие, но статистически значимые изменения скорости роста бактерий в оптимальных условиях (Таблица 2). Мутанты по генам gor, trxA, gortrxB росли с более низкой скоростью (соответственно, на 11, 13 и 15% ниже), а мутант gshA – с более высокой скоростью (на 15% выше), чем клетки родительского штамма. Выживаемость большинства мутантов, которая определялась по числу колониеобразующих единиц на твердой среде, была близка к выживаемости клеток родительского штамма (Таблица 2). Максимальное снижение выживаемости (на 34%) наблюдали у двойного мутанта gshAtrxA. Мутанты по 55 генам gortrxB и gshA показывали снижение выживаемости по сравнению с родительским штаммом на 15% и 17%, соответственно. Таблица 2. Удельная скорость роста и выживаемость мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам на среде М9. Штаммы µ, ч-1 Выживаемость, % BW 25113 (wt) 0,61±0,01 (1) 100±2,5 JW2663 (gshA) 0,7±0,01* (1,15) 83±2* JW3467 (gor) 0,54±0,01* (0,89) 96±4 JW0833 (grxA) 0,57±0,01* (0,93) 91±6 JW1051 (grxB) 0,58±0,01 (0,95) 109±7 JW5856 (trxA) 0,53±0,01* (0,87) 105±3 JW0871 (trxB) 0,56±0,01* (0,92) 107±4 NM3655 (gshAtrxA) 0,63±0,01 (1,03) 66±2* NM3761 (gortrxB) 0,52±0,01* (0,85) 85±2* В скобках указано отношение значений у мутантных штаммов к значениям у родительского штамма. 100% выживаемости соответствует числу КОЕ в штамме дикого типа при OD600=0,5. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (P<0,05). 6.2. Способность к образованию биопленок Наличие мутаций по синтезу глутатиона (gshA) и тиоредоксинредуктазы (trxB) не приводило к изменению удельного биопленкообразования при 37°С, в то время как мутации по остальным генам при этой температуре повышали способность к формированию биопленок в 1,5-2,2 раза (Таблица 3). Валовое 56 биопленкообразование мутанта по гену trxB также не отличалось от родительского штамма, в то время как у gshA мутанта этот параметр снижался на 20%. У остальных штаммов валовая продукция биопленок была в 1,28-1,8 раз выше, чем у родительского. Таблица 3. Валовое (BF) и удельное (SBF) биопленкообразование у мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам. Штаммы BF 0,029±0,002 SBF 0,046±0,003 0,023±0,001* (0,80) 0,041±0,003* (1,43) 0,037±0,001* (1,28) 0,052±0,001* (1,80) 0,042±0,004* (1,47) 0,027±0,003 (0,95) 0,048±0,001* (1,65) 0,041±0,002* (1,43) 0,046±0,003 (1,00) 0,070±0,004* (1,52) 0,075±0,003* (1,63) 0,100±0,002* (2,17) 0,081±0,004* (1,76) 0,052±0,004 (1,13) 0,083±0,004* (1,80) 0,070±0,001* (1,52) BW 25113 (wt) JW2663 (gshA) JW3467 (gor) JW0833 (grxA) JW1051 (grxB) JW5856 (trxA) JW0871 (trxB) NM3655 (gshAtrxA) NM3761 (gortrxB) В скобках указано отношение значений у мутантных штаммов к значениям у родительского штамма. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (P<0,05). 6.3. Подвижность бактерий Во всех изучаемых штаммах, кроме мутанта по глутатиону, наблюдали снижение подвижности бактерий (Таблица 4). Наиболее низкой подвижностью обладали мутанты по генам gor и gshAtrxA (в 6 раз ниже, чем у клеток родительского штамма). Статистическая обработка выявила обратную 57 корреляцию между подвижностью мутантов и их валовым биопленкообразованием (r = - 0,76, P<0,05). Таблица 4. Подвижность мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам. Штаммы Диаметр, мм BW 25113 (wt) 76,3±1,9 JW2663 (gshA) JW3467 (gor) JW0833 (grxA) JW1051 (grxB) JW5856 (trxA) JW0871 (trxB) NM3655 (gshAtrxA) NM3761 (gortrxB) 82,3±4,1 (0,93) 12,3±0,9* (6,19) 64,3±2,9* (1,19) 39,3±0,9* (1,94) 37,7±2,2* (2,02) 50,0±3,1* (1,53) 12,3±0,9* (6,19) 34,0±2,0* (2,25) В скобках указано отношение значений родительского штамма к таковым у мутантов. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (P<0,05). 6.4. Концентрация внутри- и внеклеточного глутатиона Небольшие, но статистически значимые, изменения уровня внутриклеточного глутатион (GSHin) по сравнению с клетками родительского штамма были обнаружены только у штамма, дефицитного по тиоредоксину I (trxA), (на 26% меньше), и у двойного мутанта gortrxB (на 40% больше) (Таблица 5). Более значительно изменялся уровень внеклеточного глутатиона (GSHout). Двойной мутант gortrxB показывал повышение экстраклеточного GSH в 3,4 раза. Значения GSHout у мутантов по генам gor, grxA, trxB были выше в 1,9, 1,6 и 1,4 раза, соответственно. 58 Статистический анализ выявил прямую корреляцию между уровнями внутри- и внеклеточного глутатиона (r = 0,87, P<0,01) и обратные зависимости между уровнями внутри- и внеклеточного GSH и удельной скоростью роста (r = - 0,8 и - 0,78, соответственно, P<0,05). Таблица 5. Концентрация внутри- и внеклеточного глутатиона у мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам. Штаммы BW25113 (wt) JW2663 (gshA) JW3467 (gor) JW0833 (grxA) JW1051 (grxB) JW5856 (trxA) JW0871 (trxB) NM3655 (gshAtrxA) NM3761 (gortrxB) GSHout, мкM/OD600 1,43 ± 0,13 (1,0) GSHin, мкM/OD600 6,49 ± 0,43 (1,0) 0 0 2,78 ± 0,35* (1,94) 2,23 ± 0,25* (1,56) 1,71 ± 0,08 (1,2) 1,27 ± 0,05 (0,89) 1,98 ± 0,15* (1,38) 7,07 ± 0,37 (1,09) 7,36 ± 0,63 (1,13) 7,14 ± 0,43 (1,1) 4,78 ± 0,18* (0,74) 6,47 ± 0,42 (1,0) 0 0 4,83 ± 0,14* (3,38) 9,12 ± 0,43* (1,41) В скобках указано отношение значений у мутантных штаммов к значениям у родительского штамма. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (P<0,05). 6.5. Уровень тиолов и дисульфидов в белках Значительные изменения были обнаружены при определении уровня дисульфидов в белках (Таблица 6). Мутанты по генам gor, grxB, trxA, trxB, gshAtrxA и gortrxB имели повышенный уровень дисульфидов в белках (в 6,4 и более раза по сравнению с диким типом). 59 Была выявлена статистически значимая обратная зависимость между содержанием дисульфидов в белках и подвижностью бактерий (r = - 0,89, P<0,01). Таблица 6. Содержание тиолов и дисульфидов в белках у мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам. Штаммы BW25113 (wt) JW2663 (gshA) JW3467 (gor) JW0833 (grxA) JW1051 (grxB) JW5856 (trxA) JW0871 (trxB) NM3655 (gshAtrxA) NM3761 (gortrxB) SHprot, мкM/OD600 S-Sprot, мкM/OD600 11,4±1,2 0,71±0,09 11,0±1,7 (0,96) 12,7±1,0 (1,11) 17,6±2,4* (1,54) 12,9±1,2 (1,13) 9,9±1,7 (0,87) 10,3±0,2 (0,9) 12,4±1,1 (1,09) 9,5±0,9 (0,83) 0,75±0,11 (1,06) 5,4±0,55* (7,6) 1,45±0,23* (2,04) 4,55±0,58* (6,4) 5,6±0,4* (7,9) 6,05±0,6* (8,5) 9,0±1,0* (12,7) 6,2±0,62* (8,7) В скобках указано отношение значений у мутантных штаммов к значениям у родительского штамма. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (P<0,05). 6.6. Концентрация пероксида водорода в культуральной среде Наибольшую продукцию пероксида водорода показывал мутант по глутатионоксидоредуктазе (в 1,76 раз выше, чем клетки дикого типа), в то время как двойной мутант gshAtrxA снижал способность продуцировать перекись в 4,7 раза (Таблица 7). Мутации по генам gshA и gortrxB не сопровождались статистически значимым изменением концентрации Н2О2 в среде, в то время как в остальных мутантах эта концентрация возрастала примерно на треть. 60 Статистический анализ выявил обратную корреляцию между концентрацией пероксида водорода и удельной скоростью роста (r = - 0,7, P < 0,05). Кроме того были обнаружены прямые зависимости между содержанием пероксида водорода в среде и выживаемостью бактерий и уровнем GSHin (r = 0,79 и 0,71, соответственно, P<0,05). Таблица 7. Концентрация пероксида водорода у мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам. Штаммы BW 25113 (wt) JW2663 (gshA) JW3467 (gor) JW0833 (grxA) JW1051 (grxB) JW5856 (trxA) JW0871 (trxB) NM3655 (gshAtrxA) NM3761 (gortrxB) H2O2, мкМ 0,32±0,02 (1,0) 0,24±0,03 (0,73) 0,58±0,03* (1,76) 0,42±0,03* (1,27) 0,46±0,03* (1,39) 0,51±0,04* (1,55) 0,42±0,03* (1,27) 0,07±0,01* (0,24) 0,36±0,06 (1,09) В скобках указано отношение значений у мутантных штаммов к значениям у родительского штамма. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (P<0,05). 6.7. Активность гидропероксидаз HPI и HPII В экспоненциально растущей культуре родительского штамма базовые уровни активности гидропероксидаз HPI и HPII практически не отличались друг от друга (Таблица 8). Все мутанты, за исключением gshA, проявляли увеличенную активность HPI. Примечательно, что у двойных мутантов gshAtrxA и gortrxB 61 активность HPI была в 20 и 16 раз выше, чем у родительского штамма, соответственно. В то же время активность HPII у этих мутантов повышалась 2,4 и 1,7 раза, соответственно. Обнаружены прямые корреляции между активностями HPI и HPII, с одной стороны, и уровнем дисульфидов в белках, с другой стороны (r = 0,68 и 0,88, соответственно, P<0,05). Для каталазы-гидропероксидазы HPI были выявлены обратные корреляции с выживаемостью и концентрацией пероксида водорода в среде (r = - 0,8 и - 0,68, P<0,05, соответственно), а для гидропероксидазы HPII обратная зависимость с подвижностью бактерий (r = - 0,69, P<0,05). Таблица 8. Активность гидропероксидаз HPI и HPII у мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам. Штаммы Активность HPI Активность HPII мкМ/мин×мг белка мкМ/мин×мг белка BW25113 (wt) 10,2 ± 1,4 (1,0) 11,1 ± 0,8 (1,0) JW2663 (gshA) 11,3 ± 2,1 (1,1) 17,6 ± 1,9* (1,7) 17,5 ± 0,1* (1,7) 14,4 ± 1,4* (1,4) 15 ± 2,0* (1,5) 14,2 ± 1,4* (1,4) 256 ± 22* (25,1) 167 ± 17* (16,4) 9,1 ± 2,4 (0,8) 12,1 ± 1,9 (1,1) 9,9 ± 1,0 (0,9) 13,2 ± 2,0 (1,2) 17,9 ± 3,0* (1,6) 15,2 ± 1,8* (1,4) 27,0 ± 3,7* (2,4) 18,9 ± 2,3 (1,7) JW3467 (gor) JW0833 (grxA) JW1051 (grxB) JW5856 (trxA) JW0871 (trxB) NM3655 (gshAtrxA) NM3761 (gortrxB) В скобках указано отношение значений у мутантных штаммов к значениям у родительского штамма. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (P<0,05). 62 6.8. Экспрессия генов katG и sodA Наличие мутации по глутатиону не приводило к изменению уровня экспрессии katG, у остальных одиночных мутантов экспрессия повышалась в 1,32 раза, а у двойных мутантов экспрессия гена katG была в 5 раз выше, чем у родительского штамма (Таблица 9). У штаммов, несущих слияния с геном sodA, наличие мутаций по grxA, grxB, trxA, gshAtrxA, gortrxB приводило к снижению активности β-галактозидазы на 20%-40% (Таблица 9) . Таблица 9. Активность β-галактозидазы (ед. Миллера) у мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам, несущих слияния katG::lacZ и sodA::lacZ. Штаммы katG::lacZ sodA::lacZ BW25113 (wt) 326 ± 20 (1,0) 1275±52 (1,0) JW2663 (gshA) 365 ± 20 (1,1) 638 ± 39* (2,0) 544 ± 17* (1,7) 525 ± 26* (1,6) 427 ± 14* (1,3) 564 ± 20* (1,7) 1660 ± 58* (5,1) 1669 ± 17* (5,1) 1226±80 (0,96) JW3467 (gor) JW0833 (grxA) JW1051 (grxB) JW5856 (trxA) JW0871 (trxB) NM3655 (gshAtrxA) NM3761 (gortrxB) 1192±90 (0,96) 768±61* (0,60) 774±73* (0,61) 1017±44* (0,80) 1120±89 (0,88) 978±51* (0,77) 971±46* (0,76) В скобках указано отношение значений у мутантных штаммов к значениям у родительского штамма. * статистически достоверная разница по сравнению с культурой дикого типа (P<0,05). Как и ожидалось, была обнаружена прямая корреляция между экспрессией гена katG, кодирующего каталазу HPI, и активностью каталазы HPI (r = 0,95, 63 P<0,01). Кроме того выявлена прямая зависимость между экспрессией гена katG и уровнем дисульфидов в белках (r = 0,71, P<0,05) и обратная корреляция с выживаемостью бактерий (r = - 0,7, P<0,05). Экспрессия гена sodA находилась в обратной зависимости с удельным биопленкообразованием (r = - 0,81, P<0,05). 6.9. Устойчивость бактерий к пероксидному стрессу Устойчивость мутантов по компонентам тиоловых редокс-систем к пероксидному стрессу оценивали по изменению удельной скорости роста штаммов после добавления 2 мМ H2O2 (Рис. 4). В течение первых 30 минут пероксидного стресса наблюдали резкое падение скорости роста у всех штаммов. Однако, у двойных мутантов gortrxB и, особенно, gshAtrxA, скорость роста снижалась в меньшей степени и быстрее возвращалась к исходному уровню, чем у клеток родительского штамма. Чувствительность к пероксидному стрессу остальных мутантов была близка к родительскому штамму. Обнаружены тесные корреляции между устойчивостью исследуемых штаммов к пероксидному стрессу и активностью каталаз HPI и HPII и базовым уровнем экспрессии katG::lacZ (r = 0,94, 0,93 и 0,85, соответственно, P<0,01). Кроме того, выявлена прямая зависимость между устойчивостью к H2O2 и содержанием дисульфидов в белках (r = 0,74, P<0,05). 64 0,8 удельная скорость роста, 1/ч 0,7 wt 0,6 gshA gor 0,5 grxA 0,4 grxB trxA 0,3 trxB gshAtrxA 0,2 gortrxB 0,1 0,0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 время, мин Рис.4. Удельная скорость роста мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам при добавлении пероксида водорода (2 мМ). Суммируя представленные в этом разделе данные, следует отметить, что штаммы, несущие мутации по компонентам тиоловых редокс-систем, существенно различаются по физиолого-биохимическим свойствам как от родительского штамма, так и между собой. Особенно важным являются различия в параметрах, характеризующих антиоксидантную активность, что делает эти штаммы удобной моделью для изучения роли антиоксидантных систем при действии антибиотиков. 65 ГЛАВА 7. РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС СИСТЕМ В ОТВЕТЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НА ТЕМПЕРАТУРНЫЕ СТРЕССЫ 7.1. Рост и выживаемость бактерий при температурных стрессах При изучении влияния температуры на скорость роста бактерий родительского штамма была выявлена характерная кривая с максимумом при 40°С (Рис. 5). Выживаемость бактерий в интервале температур от 20°С до 46°С существенно не изменялась (Рис.5). Небольшое статистически достоверное повышение и понижение выживаемости бактерий наблюдали при 20°С и 44°С, 4500 0,800 4000 0,700 3500 0,600 КОЕ, *10000 3000 0,500 2500 0,400 2000 0,300 1500 0,200 1000 удельная скорость роста, 1/ч соответственно. 0,100 500 0 0,000 20 24 30 37 40 42 44 46 температура, °С Рис. 5. Выживаемость и удельная скорость роста родительского штамма E. coli (BW25113) через час экспозиции к различным температурам. При температурах, близких к оптимальным (37 и 40°С), бóльшая часть мутантов росла с меньшей скоростью, чем клетки родительского штамма (Рис. 6). Наиболее выраженное снижение удельной скорости роста (µ) наблюдалось у штаммов, мутантных по gor, trxA и gortrxB. При снижении температуры 66 культивирования до 20°С и повышении до 46°С скорость роста значительно ингибировалась у всех изученных штаммов. В последнем случае наибольший эффект наблюдался у двойных мутантов gshAtrxA и gortrxB, где рост останавливался почти полностью. При 46°С более высокую скорость роста, чем клетки родительского штамма, показывал мутант trxB, а при 20°С – мутант gshAtrxA. 0,8 удельная скорость роста, 1/ч 0,7 0,6 wt gshA 0,5 gor grxA 0,4 grxB trxA 0,3 trxB gshAtrxA 0,2 gortrxB 0,1 0,0 20°С 37°С 40°С 46°С температура Рис. 6. Удельная скорость роста мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам через час после воздействия различными температурами. При изменении температуры культивирования для большинства изученных штаммов наблюдалась тенденция к увеличению выживаемости при снижении температуры до 20°С и к ее уменьшению при 46°С (Рис. 7). Примечательно, что наличие мутаций gshAtrxA и gortrxB приводило к снижению выживаемости по сравнению с родительским штаммом при всех ростовых температурах. Клетки, дефицитные по глутатиону (gshA), демонстрировали пониженную выживаемость только при 37°С и 40°С. Мутант trxA был более устойчив, чем родитель, при повышенных температурах. 67 5000 4500 wt gshA КОЕ*100000 4000 gor grxA 3500 grxB trxA trxB 3000 gshAtrxA gortrxB 2500 2000 20°С 37°С 40°С 46°С те мпература Рис. 7. Выживаемость мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам через час после воздействия различными температурами. 7.2. Влияние температуры культивирования на способность к образованию биопленок В культурах бактерий родительского штамма изменение температуры от 37°С до 42°С тепловой (мягкий биопленкообразованию (Рис. 8). шок) не При влияло 44°С на способность величина к удельного биопленкообразования (SBF) возрастала в 1,7 раза по сравнению с 37°С. При смещении температуры культивирования в сторону пониженных значений наблюдали усиление способности к биопленкообразованию с максимумом при температуре 24°С (в 1,6 раза). Отсутствие глутатиона в gshA мутантах существенно снижало биопленкообразование при всех тестированных температурах, кроме 46°С (Рис 8). При этом полностью отсутствовали характерные для родительского штамма максимумы при 24°С и 44°С. 68 wt 0,09 gshA удельное биопленкообразование 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 температура, °С Рис. 8. Удельное биопленкообразование клетками родительского штамма E. coli и мутанта по глутатиону в диапазоне температур 20°С-46°С. Мутанты по генам gor, trxA, grxA, grxB, gshAtrxA и gortrxB проявляли повышенную способность к биопленкообразованию в диапазоне температур 30°С-40°С, но утрачивали характерные для родителя максимумы при 24°С и 44°С, за исключением gortrxB мутанта, который сохранял наибольшее значение величины SBF при 24°С (Рис. 9, 11). При этой температуре мутант, делеционный по тиоредоксинредуктазе, также показывал наивысшую способность к биопленкообразованию (Рис. 10). Примечательно, что кривая зависимости удельного биопленкообразования от температуры для двойного мутанта gshAtrxA была полностью противоположна родительского штамма (Рис. 9). аналогичному графику для бактерий 69 wt 0,14 gshAtrxA gortrxB удельное биопленкообразование 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 температура, °С Рис. 9. Удельное биопленкообразование клетками родительского штамма E. coli и двойных мутантов gshAtrxA и gortrxB в диапазоне температур 20°С-46°С. wt 0,10 trxB удельное биопленкообразование 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 температура, °С Рис. 10. Удельное биопленкообразование клетками родительского штамма E. coli и мутанта по тиоредоксинредуктазе в диапазоне температур 20°С-46°С. 70 wt 0,16 gorgrxA удельное биопленкообразование 0,14 grxB trxA 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 температура, °С Рис. 11. Удельное биопленкообразование родительского штамма E. coli и мутантов по генам gor, grxA, grxB и trxA в диапазоне температур 20°С-46°С. При повышении температуры до 44°С все мутанты показывали значительное снижение накопления биопленок, по сравнению с родителем при данной температуре. При критической для роста E. coli температуре 46°С все изученные мутанты сохраняли более высокую способность к формированию биопленок, чем клетки родительского штамма. Во всем диапазоне пониженных температур (20°С - 30°С) наблюдали повышение величины удельного биопленкообразования у grxB и gortrxB мутантов по сравнению с родительским штаммом. Для всех штаммов было определено также валовое биопленкообразование (Таблица 10). Интересно отметить, что для температур 22°С, 24°С и 42°С не были обнаружены статистически значимые корреляции между валовым и удельным биопленкообразованием. Статистический анализ показал обратные зависимости между базовым уровнем экспрессии sodA и валовым биопленкообразованием при 20°С и при 40°С 71 (r = - 0,79 и - 0,84, соответственно, P<0,05). Также обнаружены прямые корреляции между активностями каталаз и валовым биопленкообразованием при тепловом стрессе, а именно, зависимость между валовым биопленкообразованием при 40°С и активностью каталазы HPI (r = 0,7, P<0,05), валовым биопленкообразованием при 46°С и активностями гидропероксидаз HPI и HPII (r = 0,67 и 0,7, соответственно). 72 Таблица 10. Валовое биопленкообразование (BF) мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам при температурных стрессах. BW25113 wt JW2663 JW3467 JW0833 JW1051 JW5856 JW0871 gshA gor grxA grxB trxA trxB NM3655 gshAtrxA NM3761 gortrxB 0 20 C 0,025±0,002 0,023±0,000 0,010±0,001 0,036±0,003 0,041±0,001 0,022±0,002 0,021±0,002 0,032±0,001 0,025±0,002 220C 0,026±0,001 0,025±0,002 0,020±0,001 0,018±0,001 0,032±0,002 0,027±0,001 0,020±0,000 0,020±0,001 0,016±0,001 240C 0,033±0,000 0,020±0,000 0,022±0,002 0,021±0,001 0,037±0,002 0,032±0,002 0,026±0,001 0,026±0,001 0,024±0,001 300C 0,027±0,002 0,021±0,001 0,043±0,002 0,035±0,003 0,055±0,003 0,045±0,001 0,026±0,002 0,038±0,003 0,037±0,003 370C 0,029±0,002 0,023±0,000 0,041±0,003 0,037±0,001 0,052±0,001 0,042±0,004 0,027±0,002 0,048±0,001 0,041±0,002 400C 0,026±0,003 0,017±0,001 0,017±0,002 0,030±0,001 0,034±0,002 0,024±0,002 0,016±0,001 0,038±0,001 0,036±0,001 420C 0,028±0,002 0,017±0,001 0,016±0,002 0,020±0,001 0,021±0,000 0,024±0,002 0,015±0,002 0,022±0,001 0,027±0,001 440C 0,033±0,001 0,013±0,002 0,019±0,001 0,015±0,001 0,017±0,001 0,021±0,001 0,018±0,001 0,017±0,001 0,020±0,001 460C 0,011±0,001 0,016±0,001 0,013±0,001 0,015±0,001 0,017±0,001 0,019±0,001 0,013±0,001 0,020±0,002 0,020±0,002 73 7.3. Продукция пероксида водорода при температурных стрессах Продукцию пероксида водорода замеряли каждые 20 минут в течение одного часа температурного воздействия. Только у двойных мутантов переход от 37°С к 20°С сопровождался обратимым повышением продукции Н2О2. Наиболее резко это повышение было выражено в штамме gortrxB, где концентрация пероксида водорода через 20 мин холодового стресса возрастала в 2 раза. При 20°С с течением времени продукция Н2О2 постепенно снижалась во всех штаммах, причем у двойного мутанта gshAtrxA - до нуля (Рис. 12). В этих же условиях выявлена обратная связь между удельной скоростью роста и продукцией пероксида водорода (r = - 0,94, P<0,01). Прямая зависимость была обнаружена между уровнем внутри- и внеклеточного глутатиона в момент начала температурного воздействия с одной стороны и продукцией пероксида водорода при холодовом шоке с другой (r = 0,76 и 0,91, соответственно, P<0,01). концентрация перекиси, мкМ 1,20 1,00 0,80 0 мин 20 мин 0,60 40 мин 60 мин 0,40 0,20 xB go rt r rx A gs hA t trx B trx A xB gr xA gr go r gs hA w t 0,00 мутации Рис. 12. Продукция пероксида водорода у мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам при ростовой температуре 20°С. 74 В течение роста при 46°С штаммы gor, grxA и grxB продуцировали в 1,75 – 2,75 раза больше Н2О2, чем клетки дикого типа. В противоположность этому, оба двойных мутанта показывали значительное снижение накопления оксиданта в среде (Рис. 13). В этих условиях обнаруживается прямая зависимость между продукцией пероксида водорода и выживаемостью бактерий (r = 0,72, P<0,05). Выявлена также обратная корреляции между активностями каталаз HPI и HPII в момент начала температурного воздействия с одной стороны и продукцией пероксида водорода через час после начала повышения температуры с другой стороны (r = - 0,71, P<0,05, в обоих случаях). концентрация перекиси, мкМ 1,20 1,00 0,80 0 мин 20 мин 0,60 40 мин 60 мин 0,40 0,20 xB go rt r rx A hA t gs trx B trx A gr xB gr xA go r hA gs w t 0,00 мутации Рис. 13. Продукция пероксида водорода у мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам при ростовой температуре 46°С. 75 7.4. Экспрессия антиокисдантных генов при температурных стрессах Экспрессия гена katG В главе 6 было показано, что при 37°С все тиоловые мутанты (кроме gshA и trxA) показывали более высокую активность каталазы HPI и повышенный уровень экспрессии кодирующего этот фермент гена katG (Таблицы 8,9). Особенно в этом отношении выделялись двойные мутанты, у которых эти активности были значительно выше, чем у клеток родительского типа. Для двойных мутантов этот эффект сохранялся и при экстремальных температурах (Рис. 14). Мутации по генам gor, grxA, grxB, trxA не оказывали влияния на активность β-галактозидазы при тепловом стрессе, однако при холодовом шоке приводили к снижению данного параметра на 25%-40%, по сравнению с родительским штаммом. Наличие мутации по глутатиону не влияло на экспрессию katG при 20°С и 37°С. Для бактерий родительского штамма и мутантов по генам gshA, gshAtrxA и gortrxB было показано повышение экспрессии katG при холодовом шоке, по сравнению с 37°С. Корреляционный анализ выявил обратную связь между экспрессией гена katG и выживаемостью для культур, растущих при 20°C (r = - 0,82, P<0,05). Такая же связь обнаружена при тепловом воздействии между экспрессией гена katG и удельной скоростью роста, выживаемостью и продукцией пероксида водорода (r = - 0,74, - 0,84 и - 0,67, соответственно, P<0,05). Важно отметить наличие прямых корреляций между устойчивостью бактерий к пероксидному стрессу и экспрессией гена katG при 20°С и 46°С (r = 0,79 и 0,75, соответственно, P<0,05). 76 wt активность β-галактозидазы, ед. Миллера 3500 gshA gor 3000 grxA grxB 2500 trxA trxB gshAtrxA 2000 gortrxB 1500 1000 500 0 20°С 37°С 46°С температура Рис. 14. Экспрессия гена katG у мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам через час экспозиции к экстремальным температурам. Экспрессия гена sodA Для всех изученных штаммов наблюдали общую тенденцию повышения экспрессии sodA при холодовом стрессе, за исключением обоих двойных мутантов. В течение первых 45 минут стрессового воздействия (20°С) степень повышения экспрессии гена sodA была выше в штаммах, мутантных по генам gor и trxB (Рис. 15). При 37°С экспрессия гена sodA постепенно снижалась в течение роста у всех штаммов (Рис. 16). У мутантов по генам grxB, gshAtrxA, gortrxB это снижение проявлялось в большей, а у мутантов по gshA, trxA и gor - в меньшей степени, чем у клеток родительского штамма. При тепловом шоке (46°С) экспрессия sodA ингибировалась у всех изученных штаммов (Рис. 17). 77 2 1,8 1,6 wt β-галактозидаза 1,4 gshgor- 1,2 grxA 1 grxB trxA 0,8 trxB gshAtrxA 0,6 gor-trxB 0,4 0,2 0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 время, мин Рис. 15. Экспрессия гена sodA у мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам в течение двух часов инкубации при 20°C. Здесь и в двух последующих рисунках значения активности β-галактозидазы представлены как отношение к начальному значению для каждого штамма (OD600 = 0,5, 37°С) 1,6 1,4 wt 1,2 β-галактозидаза gshgor- 1 grxA grxB 0,8 trxA 0,6 trxB gshAtrxA 0,4 gor-trxB 0,2 0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 время, мин Рис. 16. Экспрессия гена sodA у мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам в течение двух часов инкубации при 37°C. 78 1,2 1 β-галактозидаза wt gsh- 0,8 gorgrxA 0,6 grxB trxA trxB 0,4 gshAtrxA gor-trxB 0,2 0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 время, мин Рис. 17. Экспрессия гена sodA у мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам в течение двух часов инкубации при 46°C. Для всех изученных штаммов абсолютные значения β-галактозидазной активности были выше при холодовом стрессе и ниже при тепловом стрессе, чем при 37°C (Рис. 18). При температуре 37°C двойные мутанты и мутанты по обоим глутаредоксинам имели пониженный уровень экспрессии sodA по сравнению с клетками родительского штамма. При холодовом стрессе в дополнение к этим штаммам снижалась экспрессия sodA у мутантов по trxA, а при тепловом шоке - у мутантов по trxA и trxB. При 46°C наибольшее падение экспрессии sodA наблюдалось у мутантов по глутаредоксинам (до 3,5 раз). Мутант, дефицитный по глутатиону, показывал аналогичную с родителем активность β-галактозидазы при всех изученных температурах. 79 wt 1800 активность β-галактозидазы, ед. Миллера gshA gor 1600 grxA 1400 grxB trxA 1200 trxB gshAtrxA 1000 gortrxB 800 600 400 200 0 20°С 37°С 46°С температура Рис. 18. Экспрессия гена sodA у мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам через час экспозиции к экстремальным температурам. Для культур, растущих при 20°C, выявлена обратная корреляция между экспрессией гена sodA с одной стороны и способностью бактерий к биопленкообразованию (r = - 0,73, P<0,05) и уровнем дисульфидов в белках (r = - 0,7, P<0,05) с другой стороны, а также прямая связь с подвижностью бактерий (r = 0,73, P<0,05). Таким образом, изменение температуры культивирования в обе стороны от оптимальных значений приводило к снижению скорости роста для всех изученных штаммов. Наблюдалась тенденция к повышению выживаемости при низких температурах и к ее снижению при высоких температурах по сравнению с выживаемостью при 37°C. Наличие мутаций по компонентам тиоловых редокссистем, особенно у двойных мутантов gshAtrxA, gortrxB в той или иной степени модифицировало изменение удельной скорости роста и выживаемости при температурных стрессах. В культуре родительского штамма наблюдалось два 80 максимума биопленкообразования при температурах 24°C и 44°C, то есть способность к образованию биопленок возрастала при приближении к границам зоны, в которой возможен рост E. coli. Наличие мутаций по компонентам тиоловых редокс-систем биопленкообразования от существенно температуры, модифицировало вплоть до зависимость изменения характера зависимости на противоположную родительскому штамму (у двойного мутанта gshAtrxA). Мутации по компонентам тиоловых редокс-систем влияли на продукцию перекиси водорода при температурных стрессах и изменяли степень экспрессии генов katG и sodA. 81 ГЛАВА 8. РОЛЬ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС СИСТЕМ В ОТВЕТЕ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НА ДЕЙСТВИЕ АНТИБИОТИКОВ 8.1. Минимальные ингибирующие концентрации антибиотиков Определяли минимальные ингибирующие концентрации (МИК) трех антибиотиков с различным механизмом действия (ципрофлоксацина, ампициллина, стрептомицина) для всех изучаемых штаммов, растущих на среде М9 с добавлением 0,15% глюкозы или на среде LB (Таблица 11). На среде LB мутантные штаммы показывали повышение устойчивости к стрептомицину в 2-3 раза, по сравнению с родительским штаммом. При действии ампициллина наблюдали снижение МИК в два раза у обоих двойных мутантов. Мутации по генам gshA и gor повышали МИК ципрофлоксацина в два раза, а по глутаредоксину B, наоборот, снижали в два раза. На среде М9 также наблюдали повышение МИК стрептомицина у всех мутантных штаммов, особенно у grxB мутанта (в 8 раз). В случае ампициллина МИК была выше в два раза у gor, trxA, trxB мутантов. Повышение МИК ципрофлоксацина в два раза вызвали мутации по обоим глутаредоксинам и тиоредоксинам. Таблица 11. Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков. М9 LB Штаммы ЦФ Амп Стрепт ЦФ Амп Стрепт BW 25113 (wt) 0,016 4 8 0,008 1 1 JW2663 (gshA) 0,032 4 16 0,008 1 4 JW3467 (gor) 0,032 4 24 0,008 2 4 JW0833 (grxA) 0,016 4 24 0,016 1 4 (мкг/мл) 82 Продолжение табл. 11. М9 LB Штаммы ЦФ Амп Стрепт ЦФ Амп Стрепт JW1051 (grxB) 0,008 4 24 0,016 1 8 JW5856 (trxA) 0,016 4 16 0,016 2 4 JW0871 (trxB) NM3655 (gshAtrxA) NM3761 (gortrxB) 0,016 4 16 0,016 2 4 0,016 2 16 0,008 1 2 0,016 2 16 0,008 1 2 8.2. Рост и выживаемость бактерий при действии антибиотиков Определение выживаемости бактерий по числу колоний на твердой среде показало, что при температуре 37°C одиночные мутанты gor, trxA, grxA, grxB и gortrxB были более устойчивы к ципрофлоксацину, чем клетки родительского штамма (Рис. 19). Мутант, дефицитный по глутатиону, был более чувствителен к этому антибиотику, чем родитель. Статистический анализ выявил обратную корреляцию между выживаемостью бактерий через 2 часа после воздействия ципрофлоксацином и удельной скоростью роста в момент его добавления (r = - 0,93, P<0,01). Были обнаружены также прямые корреляции между выживаемостью бактерий через 1 час после добавления антибиотика и уровнем внутри- и внеклеточного глутатиона (r = 0,92 и 0,82, соответственно, P<0,01), а также прямая зависимость между выживаемостью и концентрацией пероксида водорода в среде (r = 0,69, P<0,05). Удельная скорость роста в присутствии ципрофлоксацина находилась в тесной корреляции с экспрессией гена katG (r = 0,8, P<0,05), а также с удельными скоростями роста исследуемых штаммов при действии пероксида (r = 0,88, P<0,01). 83 wt 0 gshA gor -0,5 выживаемость, ∆logКОЕ grxA grxB -1 trxA trxB -1,5 gshAtrxA gortrxB -2 -2,5 -3 -3,5 -4 0 15 30 45 60 75 90 105 120 время, мин Рис. 19. Выживаемость мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам при действии ципрофлоксацина (3 мкг/мл) при 37°C. Антибиотик добавлен во время t=0. В случае ампициллина отсутствие тиоредоксина I практически полностью предотвращало гибель клеток в течение двух часов экспозиции (Рис. 20). Мутанты по генам gortrxB, gor, trxB и grxB были более устойчивы к ампициллину, а gshA, grxA и gshAtrxA мутанты менее устойчивы, чем клетки родительского штамма. Как и в случае с ципрофлоксацином, были выявлены обратная корреляция между выживаемостью через час после добавления ампициллина и удельной скоростью роста в момент добавления антибиотика (r = - 0,8, P<0,05), а также прямая корреляция между выживаемостью и концентрацией H2O2 (r = 0,78, P<0,05). 84 0,5 выживаем ость, ∆logКОЕ /м л 0 -0,5 wt gshA -1 gor grxA grxB -1,5 trxA trxB -2 gshAtrxA gortrxB -2,5 0 15 30 45 60 75 90 105 120 время, мин Рис. 20. Выживаемость мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам при действии ампициллина (10 мкг/мл) при 37°С. Антибиотик добавлен во время t=0. Штаммы, несущие мутации по генам trxA и trxB, продолжали расти (сохраняли удельную скорость роста выше нуля) на протяжения двух часов после добавления ампициллина (Рис. 21). У остальных штаммов через 50-80 минут после добавления антибиотика наступал лизис (удельная скорость роста становилась отрицательной), причем у мутантов grxB, gor, gortrxB лизис начинался, соответственно, на 15, 20 и 30 минут позже, чем у клеток родительского штамма. Выявлен высокий коэффициент корреляции между временем от начала добавления антибиотика до наступления лизиса и выживаемостью при действии ампициллина (r = 0,84, P<0,01). 85 0,95 0,75 удельная скорость роста, 1/ч 0,55 wt 0,35 gshA 0,15 -0,05 gor grxA 0 15 30 45 60 75 90 105 120 grxB -0,25 trxA -0,45 trxB gshAtrxA -0,65 gortrxB -0,85 -1,05 -1,25 время, мин Рис. 21. Удельная скорость роста мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам при действии ампициллина (10 мкг/мл) при 37°С. Антибиотик добавлен во время t=0. Через 1 час экспозиции к стрептомицину все мутанты, за исключением trxA, демонстрировали повышенную устойчивость к этому антибиотику (Рис. 22). Через 2 часа экспозиции мутанты по генам gshAtrxA, gortrxB и trxA имели одинаковую чувствительность с клетками родительского штамма. Остальные мутанты, особенно по глутатионокидоредуктазе и обоим глутаредоксинам, оставались более устойчивыми к стрептомицину, чем родительский штамм. Рост культуры родительского штамма полностью прекращался через 70 минут после добавления стрептомицина, в то время как gshAtrxA и grxB мутанты останавливали рост на 10 минут и 30 минут позже, соответственно, а остальные штаммы на 20 минут позже, чем родительские клетки (Рис. 23). Обнаружена статистически значимая корреляция между выживаемостью и концентрацией пероксида водорода в среде (r = 0,7, P<0,05). 86 0,5 выживаемость, ∆logКОЕ/мл 0 -0,5 -1 wt -1,5 gshA gor -2 grxA -2,5 grxB trxA -3 trxB gshAtrxA -3,5 gortrxB -4 0 15 30 45 60 75 90 105 120 время, мин Рис. 22. Выживаемость мутантов E. coli по тиоловым редокс-системам при действии стрептомицина (30 мкг/мл) при 37°С. Антибиотик добавлен во время t=0. 0,80 удельная скорость роста, 1/ч 0,70 0,60 wt 0,50 gshA gor 0,40 grxA 0,30 grxB trxA 0,20 trxB gshAtrxA 0,10 gortrxB 0,00 0 15 30 45 60 75 90 105 120 -0,10 -0,20 время, мин Рис. 23. Удельная скорость роста мутантов E. coli по тиоловым редокссистемам при действии стрептомицина (30 мкг/мл) при 37°С. Антибиотик добавлен во время t=0. 87 Для ампициллина и стрептомицина выявлены прямые корреляции между удельной скоростью роста в присутствии антибиотиков и выживаемостью в этих условиях (r = 0,83 и 0,94, соответственно, P<0,01). Не выявлено статистически значимых корреляций между выживаемостью при действии этих антибиотиков и устойчивостью бактерий к пероксидному стрессу. 8.3. Влияние искусственных изменений уровня глутатиона внутри и снаружи клеток на устойчивость E. coli к различным антибиотикам Как было показано выше, gshA мутант, растущий на среде М9 с глюкозой более чувствителен к ципрофлоксацину и ампициллину, чем родительский штамм. Кроме того наблюдалась высокая степень корреляции между выживаемостью бактерий в присутствии ципрофлоксацина и уровнем внутри- и внеклеточного глутатиона (Раздел 8.2). В связи с этим было исследовано влияние экзогенных факторов, изменяющих уровень глутатиона, на устойчивость бактерий E. coli к антибиотикам, а именно цистеина, цистина, валина и Nэтилмалеимида (NEM). Первые две аминокислоты являются предшественниками в биосинтезе GSH. Добавление валина в среду М9 ингибирует синтез белка у E. coli, что увеличивает пул свободного цистеина в цитоплазме и, в конечном счете, приводит к повышению уровня GSH. NEM вызывает обратный эффект, связывая SH-группы в глутатионе. В случае ципрофлоксацина предобработка бактерий родительского штамма (BW25113), растущих на среде М9, глутатионом не оказывала влияния на устойчивость к ципрофлоксацину, тогда как цистеин и цистин вызывали двукратное увеличение КОЕ, а валин увеличивал число КОЕ в 17 раз по сравнению с необработанными клетками. Примечательно, что предобработка Nэтилмалеимидом способствовала защите бактерий от ципрофлоксацина (увеличение КОЕ в 39 раз). Добавление LB (25 мг/мл) в культуру E. coli BW25113, растущую на среде М9, повышало чувствительность бактерий к ципрофлоксацину в 8 раз (Таблица 12). 88 В этих же условиях предобработка бактерий родительского штамма, растущего на среде M9, цистином, цистеином, валином и NEM значительно повышала устойчивость к бактерицидному действию ампициллина. В то же время, предобработка глутатионом и добавление в среду М9 порции LB снижали устойчивость BW25113 в 18 и 14 раз, соответственно (Таблица 12). При действии стрептомицина предварительная обработка пятью тестируемыми соединениями повышала устойчивость клеток BW25113, растущих на среде М9, в 5-13 раз. При добавлении LB в среду культивирования число КОЕ увеличивалось в 15 раз (Таблица 12). В следующей серии опытов мы проверили действие предобработок на чувствительность к испытуемым антибиотикам E. coli BW25113, растущих на среде LB. В отсутствии предобработки чувствительность бактерии ко всем трем антибиотикам была на 2-3 порядка выше, чем на среде М9. Добавление GSH и в меньшей степени GSSG на среде LB защищало бактерии от действия ципрофлоксацина и ампициллина. Обе формы глутатиона полностью предотвращали бактерицидное действие стрептомицина в этих условиях. В отличие от среды М9, валин не оказывал никакого влияния на устойчивость бактерий E. coli BW25113 ко всем антибиотикам на среде LB (Таблица 12). 89 Таблица 12. Влияние предобработки бактерий E. coli BW25113 (wt) на рост и устойчивость к антибиотикам. М91 Среда добавки Контроль GSH Цистеин Цистин LB2 NEM Валин LB Контроль GSH GSSG Валин Число колониеобразующих единиц через 60 минут добавления антибиотика к предобработанным клеткам (КОЕ,•105/мл) ЦФ 22,5±2,1 22,5±1,7 45,2±0,5 Амп 1730±130 311±33 3210±160 3400±220 2200±340 3880±540 Стрепт 422±7 43,6±1,9 873±33 2720±130 5370±340 5480±220 2090±380 384±54 5540±80 2,9±0,5 0,4±0,2 39,6±9,6 243±25 6,9±0,9 391±116 39,7±11,4 10,7±4,3 6550±150 0,2±0,02 3190±30 3990±220 3,5±0,5 0,3 ± 0 0,2±0,1 Удельная скорость роста в отсутствии добавления антибиотика (µ, ч-1) 0,5±0,02 1 0,5±0,02 0,3±0,01 0,3±0,01 -0,1±0,03 0,15±0,01 1,0±0,01 1,3±0,03 0,4±0,01 0,75±0,04 1,2±0,07 - В культуру, растущую на среде М9, добавляли 10мМ GSH, 2мМ цистеина, 1мМ цистина, 0,1мМ NEM, 0,5 мг/мл валина или 25 мг/мл LB за 15 минут до обработки антибиотиком. 2 - В культуру, растущую на среде LB, добавляли 10мМ GSH, 5мМ GSSG или 0,5 мг/мл валина за 15 минут до обработки антибиотиком. 3 мкг/ мл ципрофлоксацина (ЦФ), 10 мкг/мл ампициллина (Амп), 30 мкг/мл стрептомицина (Стрепт) добавляли при ОD600 = 0,5. 90 Качественно, эффект предобработок на антибиотикорезистентность бактерий E. coli сохранялся в штамме JW2663, лишенном глутатиона (Таблица 13). Примечательно, что экзогенный глутатион не оказывал влияния на устойчивость JW2663 к ципрофлоксацину и усиливал токсичность при действии ампициллина (Таблица 13). В совокупности, полученные данные указывают на то, что нет прямой связи между уровнем глутатиона и его редокс-статусом и чувствительностью E. coli к антибиотикам. При анализе данных, представленных в Таблицах 12 и 13, мы обратили внимание на то, что в ряде случаев используемые для предобработки вещества существенно влияли на скорость роста и этот эффект зависел от состава среды. GSH не изменял удельную скорость роста бактерий на среде М9, однако существенно снижал данный параметр на среде LB. Обратный эффект наблюдали в случае валина: ингибирование роста на М9 и отсутствие изменений на LB. Цистеин, цистин и NEM снижали удельную скорость роста в обоих штаммах, в то время как LB существенно ее увеличивал. Таким образом, антибиотики в момент их добавления действовали на культуры, растущие с разной скоростью. Статистический анализ данных выявил тесную обратную корреляцию между удельной скоростью роста перед добавлением антибиотика и выживаемостью предобработанных клеток в присутствии ципрофлоксацина (r = - 0,985, P<0,01, рис. 32). Обратная корреляция между этими параметрами была обнаружена также при действии ампициллина (r = - 0,89, P<0,05). Аналогичные корреляционные зависимости были выявлены для gshA мутантов при действии ципрофлоксацина и ампициллина (r = - 0,94 и - 0,87, соответственно). 91 Таблица 13. Влияние предобработки бактерий E. coli JW2663 (gshA) на рост и устойчивость к антибиотикам. М91 Среда добавки Контроль GSH Цистеин Цистин LB2 NEM Валин LB Контроль Число колониеобразующих единиц через 60 минут добавления антибиотика к предобработанным клеткам (КОЕ,•105/мл) ЦФ 15,3±2,1 15,2±1,4 65,4±0,8 17,7±0,7 647±87 303±23 6,3±0,2 0,29±0,05 Амп 1046±4 212±20 3610±160 3370±170 2770±6 2950±60 391±59 51±6 Стрепт 920±10 1610±165 4640±160 2280±150 3710±280 4570±100 5420±290 1,0±0,02 0,97±0,02 1,16±0,03 Удельная скорость роста в отсутствии добавления антибиотика (µ, ч-1) 0,55±0,02 1 0,53±0,02 0,12±0,02 0,36±0,01 0,01±0,02 0,11±0,01 - В культуру, растущую на среде М9, добавляли 10мМ GSH, 2мМ цистеина, 1мМ цистина, 0,02 мМ NEM, 0,5 мг/мл валина или 25 мг/мл LB за 15 минут до обработки антибиотиком. Концентрация NEM была в пять раз ниже, чем у родительского штамма, поскольку высокое содержание NEM убивало клетки gshA мутанта. 2 - Культуру выращивали на среде LB до ОD600 = 0,5, затем обрабатывали антибиотиками. 3 мкг/ мл ципрофлоксацина (ЦФ), 10 мкг/мл ампициллина (Амп), 30 мкг/мл стрептомицина (Стрепт) добавляли при ОD600 = 0,5. 92 Рис. 32. Корреляция между удельной скоростью роста в момент добавления антибиотика и выживаемостью предобработанных клеток через час после воздействия ципрофлоксацином. Данные взяты из таблицы 12. 8.4. Комбинированное действие антибиотиков и температурных стрессов Для всех трех антибиотиков у бактерий родительского штамма выявлена характерная V-образная кривая зависимости выживаемости от ростовой температуры, с максимумом чувствительности при 44°С для ципрофлоксацина и 40°С для ампициллина и стрептомицина, т.е. в области, соответствующей наиболее высоким скоростям роста (Рис. 24). Обнаруживается обратная связь между log КОЕ и удельной скоростью роста с высокими коэффициентами корреляции: - 0,96 для ципрофлоксацина, - 0,94 для ампициллина и - 0,90 для стрептомицина (Рис. 25-27). 93 3мкг/мл ЦФ 10 10мкг/мл Амп 30мкг/мл Стрепт выживаемость, lgКОЕ 9 8 7 6 5 4 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 температура, °С Рис. 24. Влияние ростовой температуры на выживаемость E. coli BW25113 к ципрофлоксацину (3 мкг/мл), ампициллину (10 мкг/мл) и стрептомицину (30 мкг/мл). Показана выживаемость через 60 мин после добавления антибиотиков. Рис. 25. Корреляция между выживаемостью бактерий E. coli BW25113 при действии ципрофлоксацина и удельной скоростью роста в момент добавления антибиотика. Данные взяты из рисунков 5 и 24. 94 Рис. 26. Корреляция между выживаемостью бактерий E. coli BW25113 при действии ампициллина и удельной скоростью роста в момент добавления антибиотика. Данные взяты из рисунков 5 и 24. Рис. 27. Корреляция между выживаемостью бактерий E. coli BW25113 при действии стрептомицина и удельной скоростью роста в момент добавления антибиотика. Данные взяты из рисунков 5 и 24. 95 Общий V-образный вид зависимости чувствительности бактерий к антибиотикам от температуры сохранялся у мутантов по компонентам тиоловых редокс-систем, однако наблюдались изменения, связанные с видом мутации и типом антибиотика (Рис. 28-30). При 20°С и 46°С все мутанты проявляли более высокую устойчивость к трем антибиотикам, чем при 37°С и 40°С. Исключение составили мутант grxA, чуствительность которого к стрептомицину при 46°С была близкой к наблюдаемой при 37°С, а также мутант trxA, который полностью утрачивал чувствительность к ампициллину при всех изученных температурах. При каждой их испытанных температур мутанты отличались между собой по чувствительности, примечательно, что эти различия в наибольшей степени былы выражены при оптимальных для роста температурах (37°С и 40°С) и в наименьшей степени – при экстремальных температурах (20°С и 46°С). При 40°С отмечена повышенная устойчивость к ципрофлоксацину мутанта gortrxB. При 37°С и 40°С более устойчивы к ампициллину были мутанты trxB и gortrxB. Примечательна низкая устойчивость двойного мутанта gshAtrxA в этих же условиях. При действии стрептомицина наибольшую устойчивость при 37°С показали мутанты grxA и grxB, при 40°С - grxA, grxB и trxB. Следует отметить, что при оптимальных температурах (37°С-40°С) gor мутант был более устойчив, чем родительский штамм, при действии всех антибиотиков (Рис. 28-30). Статистический анализ данных выявил прямую зависимость между выживаемостью бактерий при холодовом стрессе в присутствии ципрофлоксацина и продукцией пероксида водорода при 20°С (r = 0,8, P<0,05). Примечательно, что выживаемость мутантов при тепловом шоке 46°С в присутствии всех антибиотиков коррелировала с базовым уровнем продукции пероксида водорода (r = 0,76, 0,82, 0,79, P<0,05, для ципрофлоксацина, ампициллина и стрептомицина, соответственно). Обнаружена обратная корреляция между выживаемостью бактерий при комбинированном действии ципрофлоксацина и холодового шока и удельной скоростью роста добавления антибиотика (r = - 0,94, P<0,01, рис. 31). в момент 96 0 -0,5 -1 ∆logКОЕ/мл -1,5 wt -2 gshA -2,5 gor -3 grxA -3,5 grxB -4 trxA trxB -4,5 gshAtrxA -5 20°С 37°С 40°С 46°С gortrxB температура Рис. 28. Выживаемость бактерий E. coli при различных ростовых темературах в присутствии ципрофлоксацина (3 мкг/мл). 0,5 0 ∆logКОЕ/мл -0,5 wt gshA -1 gor grxA -1,5 grxB -2 trxA trxB -2,5 gshAtrxA -3 gortrxB 20°С 37°С 40°С 46°С температура Рис. 29. Выживаемость бактерий E. coli при различных ростовых темературах в присутствии ампициллина (10 мкг/мл). 97 1 ∆logКОЕ/мл 0 wt -1 gshA -2 gor grxA -3 grxB trxA -4 trxB gshAtrxA -5 20°С 37°С 40°С 46°С gortrxB температура Рис. 30. Выживаемость бактерий E. coli при различных ростовых темературах в присутствии стрептомицина (30 мкг/мл). Рис. 31. Корреляция между выживаемостью бактерий E. coli при холодовом стрессе в присутствии ципрофлоксацина (3 мкг/мл) и удельной скоростью роста бактерий в момент добавления антибиотика. Данные взяты из рисунков 5 и 28. 98 8.5. Способность к образованию биопленок в присутствии антибиотиков При оптимальной температуре культивирования (37°С) обработка бактерий родительского штамма тремя антибиотиками значительно снижала величину валового биопленкообразования. В наших исследованиях наибольший интерес представляет величина удельного биопленкообразования (SBF), определяемая как отношение биомассы биопленок к планктону. При 37°С способность к биопленкообразованию существенно не изменялась в случае ципрофлоксацина и стрептомицина, но практически полностью подавлялась ампициллином (Рис. 33). Изменение температуры культивирования за пределы оптимума значительно модифицировало влияние антибиотиков на образование биопленок (Рис. 33). Холодовой стресс повышал удельное биопленкообразование в присутствии любого из трех изученных антибиотиков по сравнению с действием антибиотика при 37ºС. При этом при температурах 20ºС и 22ºС величина удельного биопленкообразования в присутствии ципрофлоксацина или стрептомицина была выше, чем при той же температуре без антибиотика. При действии ампициллина, напротив, удельное биопленкообразование было ниже, чем без антибиотика, при температурах 20ºС, 22ºС и 24ºС. Комбинированное действие мягкого теплового стресса (40ºС и 42ºС) и антибиотиков ципрофлоксацина и стрептомицина не влияло на способность к биопленкообразованию. Ампициллин стимулировал биопленкообразование в 4,5 раза при 40ºС, в 2,4 раза при 42ºС и не оказывал влияния при 46ºС. В условиях сильного теплового стресса (при изменении температуры культивирования от 37ºС до 46ºС) присутствие ципрофлоксацина повышало, а стрептомицина снижало величину удельного биопленкообразования в 2,5 и 5 раз, соответственно. 99 без антибиотика +3мкг/мл ципрофлоксацина 0,2 0,18 +10мкг/мл ампициллина 0,16 +30мкг/мл стрептомицина SBF 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 20 22 24 30 37 40 42 44 46 температура, °C Рис. 33. Влияние ростовой температуры биопленкообразованию у родительского штамма на способность E. coli к в присутствии антибиотиков. Для штаммов, несущих мутации по генам gor, grxB, gshAtrxA и gortrxB определяли удельное биопленкообразование в присутствии антибиотиков при 37ºС (Рис. 34). Как было описано выше (Раздел 7.2), указанные штаммы стимулировали биопленкообразование в оптимальных для роста условиях. В отличие от родительского штамма, обработка этих мутантов при 37ºС ампициллином значительно повышала способность к биопленкообразованию. В случае стрептомицина, наоборот, величина удельного биопленкообразования снижалась. Присутствие ципрофлоксацина не оказывало влияния на способность к образованию биопленок у мутантов по генам gor и gshAtrxA, стимулировало у gortrxB мутанта и ингибировало у grxB мутанта. Представляют интерес выявленные корреляции между удельным биопленкообразованием в присутствии ампициллина и уровнем дисульфидов в белках (r = 1,0, P<0,01) и удельным биопленкообразованием в присутствии стрептомицина и базовым уровнем экспрессии katG (r = - 0,97, P<0,01). 100 без антибиотика 0,35 3 мкг/мл ципрофлоксацина 0,30 10 мкг/мл ампициллина SBF 0,25 30 мкг/мл стрептомицина 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 wt gor grxB gshAtrxA gortrxB мутации Рис. 34. Способность к биопленкообразованию бактерий родительского штамма E. coli и мутантов по генам gor, grxB, gshAtrxA, gortrxB при 37°С в присутствии антибиотиков. 8.6. Влияние экзогенных антиоксидантов на способность к образованию биопленок Как было показано выше, наличие мутаций по компонентам тиоловых редокс-систем существенно влияет на способность E. coli к формированию биопленок. В связи с этим представляло интерес изучить влияние экзогенных редокс-активных соединений, а также хелаторов внутриклеточного железа, на биопленкообразование. Для этой цели в качестве редокс-активных соединений использовали глутатион и полифенолы кверцетин и танин, а в качестве хелаторов - дипиридил и дефероксамин. Кверцетин и танин являются компонентами растительной пищи и входят в состав большого числа биологически активных добавок. В своей естественной экологической нише (кишечник млекопитающих) бактерии E. coli постоянно взаимодействуют с этими соединениями. В зависимости от условий эти полифенолы проявляют как антиоксидантную, так и прооксидантную активность. 101 Статистически значимое увеличение SBF вызывали кверцетин (в диапазоне концентраций от 1 до 50 мкМ) и таннин (в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкМ) (Рис. 35). Кверцетин не влиял на биопленкообразование в концентрации 100 мкМ, а при более высоких концентрациях приводил к снижению величины SBF. Дефероксамин оказывал слабое влияние на биопленкообразование, в то время как дипиридил в концентрации 100 мкМ повышал величину SBF в 1,6 раза (Рис. 36). Экзогенный глутатион в большинстве испытанных концентраций снижал уровень удельного биопленкообразования по сравнению с контролем (Рис. 36). кв ерцетин 0,30 таннин 0,25 SBF 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 конт роль 1 µM 5 µM 10 µM 50 µM 100 µM концентрация Рис. 35. Влияние кверцетина и танина на способность родительского штамма E. coli к биопленкообразованию. глутатион 0,16 дипиридил 0,14 дефероксамин 0,12 SBF 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 контроль 0,5 µM 1 µM 5 µM 10 µM 100 µM концентрация Рис. 36. Влияние глутатиона, дипиридила и дефероксамина на способность родительского штамма E. coli к биопленкообразованию. 102 Суммируя данные, представленные в этой главе, можно сделать следующие выводы. Мутации по компонентам тиоловых редокс-систем изменяют чувствительность бактерий к антибиотикам во всех использованных тестах (скорость роста, МИК, способность к образованию колоний и биопленок). Степень и направление этих изменений зависят от вида антибиотика и типа мутации. Выявлены прямые корреляции между устойчивостью к антибиотикам, с одной стороны, и продукцией Н2О2 и содержанием глутатиона в среде и клетках, с другой стороны, а также обратные корреляции между устойчивостью к антибиотикам и скоростью роста бактерий в момент добавления антибиотика. Не обнаружено связи между устойчивостью к пероксидному стрессу и выживаемостью бактерий в присутствии антибиотиков. Модуляция уровня глутатиона в среде и в клетках за счет экзогенных добавок изменяла выживаемость бактерий родительского штамма при действии антибиотиков в соответствии со степенью их влияния на скорость роста бактерий. У всех изученных штаммов максимальная чувствительность к антибиотикам наблюдалась при 40ºС. Повышение устойчивости бактерий к антибиотикам при экстремальных температурах коррелировало со снижением их скорости роста. ОБСУЖДЕНИЕ Наши исследования показали, что наличие мутаций по компонентам тиоловых редокс-систем сопровождается существенными изменениями редоксстатуса клеток и активности антиоксидантных генов и ферментов. За исключением gshA мутанта, все исследуемые штаммы, особенно двойные мутанты gshAtrxA и gortrxB, показали бóльшую активность гидропероксидаз HPI и HPII, высокий уровень экспрессии katG::lacZ, а также повышенное содержание дисульфидов в белках, по сравнению с клетками родительского штамма. Мутанты по компонентам тиоловых редокс-систем также значительно различались по содержанию внутри- и внеклеточного глутатиона и накоплению перекиси водорода в среде. Благодаря взаимозаменяемости компонентов тиоловых редокссистем и их взаимодействию с антиоксидантным регулоном OxyR делеции отдельных генов или даже двух генов, принадлежащих редокс-системам глутатиона и тиоредоксина, не предотвращали возможность роста бактерий на минимальной среде с глюкозой. У большинства мутантов наблюдались лишь небольшие, но статистически значимые отличия в скорости роста от клеток родительского штамма. Выживаемость существенно снижалась только у gshA и обоих двойных мутантов. Наличие мутаций по компонентам тиоловых редокс-систем приводило к ингибированию подвижности бактерий и сильно модифицировало их способность к формированию биопленок. По сравнению с планктонными свободно плавающими одиночными бактериями, биопленки представляют собой микробные сообщества экстраклеточный прикрепленных матрикс клеток. к Этот субстрату жизненный и погруженных стиль в бактерий характеризуется высокой устойчивостью ко всем стрессам, включая действие антибиотиков и дезинфектантов [Mah et al., 2003, Николаев и Плакунов, 2007]. Роль тиоловых редокс-систем в образовании биопленок отмечена впервые и представляет большой интерес для понимания механизмов этого процесса и его регуляции при ответе на различные стрессы. 104 Результаты наших исследований хорошо согласуются с данными, имеющимися в литературе, и существенно их расширяют. Ранее было показано, что ряд мутантов по компонентам обеих тиоловых систем, производных от E. coli DHB4, содержат повышенный уровень протеиновых дисульфидов даже в отсутствие экзогенной перекиси водорода [Prinz et al., 1997; Aslund et al., 1999]. Было также показано, что, даже в отсутствие экзогенного оксиданта, в мутантах, дефектных по тиоловым редокс-системам, транскрипционный фактор OxyR конститутивно активирован вследствие сдвига тиол-дисульфидного редоксстатуса [Aslund et al., 1999]. Поскольку OxyR активирует экспрессию таких антиоксидантных генов как katG, ahpFC, gor, grxA и других, предполагалось, что мутанты по компонентам тиоловых систем должны проявлять более высокую устойчивость к пероксидному стрессу [Aslund et al., 1999]. Действительно, были опубликованы данные, что штамм E. coli A237, дефицитный по гену trxB (derivate of E. coli K12), растущий на среде LB, был более устойчив к пероксидному стрессу, чем родительский штамм, и это сопровождалось более высоким уровнем экспрессии katG::lacZ [Takemoto et al., 1998]. Повышенная устойчивость к пероксиду обнаружена у мутантов, потерявших тиоредоксины 1 и 2 [Ritz et al., 2000]. Высокие уровни протеиновых дисульфидов и повышенная активность каталазы HPI отмечены также в ряде одиночных и двойных тиоловых мутантов, дериватов E. coli DHB4 [Vlamis-Gardicas et al., 2002]. Хотя накопилось достаточно много данных, указывающих на участие тиоловых редокс-систем в антиоксидантной защите бактерий, точный механизм этого процесса далек от полного понимания. Одна из проблем, осложняющих интерпретацию имеющихся данных, связана с указанным выше взаимодействием и перекрыванием функций не только между компонентами тиоловых систем, но и между тиоловыми системами и OxyR регулоном. Важно отметить также, что многие из тиоловых мутантов, используемых в предшествующих работах, были производными от разных родителей (background) и культивировались на средах разного состава, что приводило к получению противоречивых данных и создавало трудности при сравнении результатов, полученных разными авторами. 105 Учитывая это, ведущие специалисты в данной области науки рекомендовали обязательное использование изогенных мутантных штаммов для исследований роли тиолов в антиоксидантной защите бактерий [Carmel-Harel and Storz, 2000]. Недавно было обнаружено также, что многие используемые штаммы кроме мутаций в генах, кодирующих синтез тиолов, несли другие мутации, которые могли влиять на поведение мутантов. Сказанное еще раз подчеркивает актуальность настоящей работы. В наших исследованиях учтены указанные выше рекомендации, все исследования проведены на изогенных штаммах E. coli из Keio collection, созданных на основе современных методов генной инженерии. Попутно следует отметить, что в ходе исследований показано наличие противоположных эффектов при росте одного и того же мутанта, растущего на средах разного состава (M9 или LB). В целом наши результаты подтверждают и дополняют данные других авторов о наличии связи между активностью тиоловых редокс-систем, с одной стороны, и активностью компонентов OxyR регулона, с другой. Ранее было показано, что температурные стрессы у бактерий E. coli, сопровождаются явлениями, характерными для окислительного стресса, и антиоксидантные системы, которыми обладают эти бактерии, вносят вклад в устойчивость клеток к температурным воздействиям. Было отмечено, что резистентность к тепловому и холодовому шоку определяется разными компонентами антиоксидантной защиты [Aldsworth et al., 1999, Cмирнова и соавт., 2001, Phadtare and Inouye, 2004, Smirnova et al., 2007, Gunasekera et al., 2008]. В наших экспериментах с мутантами по компонентам тиоловых редокс систем в условиях холодового шока была выявлена обратная корреляция между удельной скоростью роста и продукцией Н2О2, а также между экспрессией гена katG и выживаемостью бактерий. Кроме того, для всех изученных штаммов наблюдали общую тенденцию повышения экспрессии sodA при холодовом стрессе, за исключением обоих двойных мутантов. В случае теплового стресса были показаны обратные корреляции между экспрессией гена katG и удельной скоростью роста, выживаемостью и продукцией перекиси водорода. Однако 106 мутанты по разным компонентам тиоловых редокс-систем проявляли различную устойчивость к температурным стрессам, что указывает на специфические функции отдельных компонентов в ответе на стресс. В данной работе мы показали, что мутанты по компонентам тиоловых редокс-систем по-разному влияют на направление и степень изменений чувствительности бактерий E. coli к антибиотикам. Характер влияния зависел от типа мутации и антибиотика. Большинство мутантов были более устойчивы ко всем тестируемым антибиотикам, чем клетки родительского штамма. Штаммы, несущие мутации по генам gor, grxB и trxB демонстрировали повышенную устойчивость ко всем антибиотикам. В противоположность этому, двойной мутант gshAtrxA был более чувствителен во всех случаях. Штамм, дефектный по тиоредоксину 1 был полностью устойчив к ампициллину, но не к другим антибиотикам. Интересно отметить, что устойчивость к действию антибиотиков у grxA мутанта была повышена в случае стрептомицина и понижена в случае ампициллина. В наших условиях штамм E. coli JW2663 (gshA) был более чувствителен к ципрофлоксацину и ампициллину, но более устойчив к стрептомицину, чем клетки родительского штамма. Предыдущие исследования показали, что другой мутант E. coli JW2914-1 (gshB), также дефектный по синтезу глутатиона, был менее чувствителен к ампициллину, проявлял одинаковую чувствительность к хинолону норфлоксацину и был более устойчив к аминогликозиду канамицину, чем родительский штамм. Влияние антибиотиков в цитируемой работе оценивалось по изменению минимальных ингибирующих концентраций на среде LB [Dhamdhere et al., 2010]. В недавних исследованиях M.A. Kohanski и ряд других авторов представили доказательства в пользу того, что наряду с действием на специфические молекулярные мишени, бактерицидные антибиотики, включая хинолоны, β- лактамы и аминогликозиды, стимулируют образование активных форм кислорода (АФК), которые вносят вклад в убивание бактерий. Предполагается рассматривать этот процесс как общий механизм индуцированной антибиотиками клеточной смерти [Albesa and Becerra, 2004, Kohanski et al., 2007, Wang and Zhao, 107 2009]. Эта гипотеза привлекла внимание ученых, работающих в разных областях биологии и медицины, поскольку открывала новые пути для повышения эффективности антибактериальных препаратов. Однако позже появились работы, опровергающие эту гипотезу и указывающие на то, что активные формы кислорода (АФК) не являются причиной гибели клеток, вызванной антибиотиками [Keren et al., 2013; Liu and Imlay, 2013]. Было отмечено, что только дальнейшее накопление данных в этой области исследований может прояснить роль окислительного стресса при действии бактерицидных антибиотиков. Если окислительный стресс включен в механизм индуцированной антибиотиками смерти, дефекты тиоловых редокс-систем должны существенным образом влиять на чувствительность бактерий к антибиотикам. Устойчивость мутантов к антибиотикам должна, в той или иной мере, коррелировать с их антиоксидантой активностью. Данные, полученные ранее другими исследователями и представленные в этой работе, указывают на широкую вариабельность активности антиоксидантных систем в тиоловых мутантах, что делает их полезной моделью для изучения роли окислительного стресса при действии антибиотиков. В наших исследованиях статистический анализ не выявил значимой корреляции между чувствительностью мутантов ко всем трем антибиотикам и их устойчивостью к пероксидному стрессу. Среди всех тестируемых мутантов, двойной мутант gortrxB проявлял повышенную выживаемость при действии ципрофлоксацина и ампициллина и, одновременно, демонстрировал повышенную устойчивость к H2O2, связанную с высокой активностью каталаз и возросшим уровнем экстра- и внутриклеточного глутатиона. В то же время, двойной мутант gshAtrxA, который показывал даже большую устойчивость к действию перекиси, имел такую же чувствительность к ципрофлоксацину, как и родитель, и повышенную чувствительность к ампициллину. В совокупности, эти данные указывают на то, что, кроме антиоксидантной активности, есть другие факторы, влияющие на устойчивость E. coli к ципрофлоксацину и ампициллину. 108 Среди этих факторов важное значение может иметь скорость роста. В пользу этого свидетельствует высокая обратная корреляция между устойчивостью к ципрофлоксацину и ампициллину и удельной скоростью роста бактерий в момент добавления антибиотика. Эти результаты согласуются с ранними наблюдениями других исследователей, что действие некоторых антибиотиков снижается в медленно растущих и голодающих культурах. Зависимость чувствительности бактерий к антибиотикам от скорости роста частично объяснялась возрастанием доли клеток, проходящих через чувствительный к антибиотику период клеточного цикла в быстро растущей популяции [Toumanen et al., 1986, Gilbert et al., 1990, Eng et al., 1991]. Эксперименты с использованием тестов на определение КОЕ и МИКов показали, что добавление экзогенного глутатиона защищает бактерии E. coli MG1655, растущие на среде LB, от действия хинолонов и аминогликозидов, но не от β-лактамов. Аналогичный эффект наблюдали после добавления N- ацетилцистеина, предшественника в биосинтезе глутатиона. Авторы заключили, что только в случае фторхинолонов GSH защищает клетки по антиоксидантному механизму. Не было обнаружено связи между восстановительными и другими свойствами глутатиона и его влиянием на чувствительность бактерий E. coli к другим антибиотикам [Goswami et al., 2006, 2007, 2010, Dhamdhere et al., 2010]. В наших исследованиях добавление GSH на среде М9 не оказывало влияния на бактерицидное действие ципрофлоксацина, значительно защищало от действия стрептомицина и усиливало эффект ампициллина. Вещества, оказывающие прямое или косвенное воздействие на внутри- и внеклеточный глутатион, изменяли чувствительность бактерий E. coli BW25113 (wt) к тестируемым антибиотикам, но их эффект не был связан с окислительно-восстановительными свойствами или способностью изменять уровень глутатиона, поскольку аналогичный эффект наблюдали у gshA мутанта. Как окисленный (GSSG), так и восстановленный (GSH) глутатион защищали бактерии E. coli BW25113 от действия всех изучаемых антибиотиков на среде LB, также подтверждая, действие глутатиона не связано с его редокс-свойствами. Более того, предобработка клеток 109 E. coli цистеином (редуктант) и цистином (оксидант), которые оба усиливают гибель клеток при пероксидном стрессе по механизму Фентона [Park and Imlay, 2003, Смирнова с соавт., 2005], способствовала снижению чувствительности ко всем антибиотикам на среде М9. В данных экспериментах, как и в опытах без добавок, были выявлены тесные обратные корреляции между чувствительностью к ципрофлоксацину и ампициллину, с одной стороны, и скоростью роста перед добавлением антибиотика, с другой. Отсутствие такой корреляции при действии стрептомицина позволяет предположить, что в данном случае, наряду со скоростью роста, определенную роль в устойчивости к антибиотику может играть глутатион. Вероятные механизмы защитного действия глутатиона от аминогликозидов обсуждались ранее, но точный механизм до конца не установлен [Goswami et al., 2007]. Исследования влияния температуры на чувствительность бактерий к антимикробным препаратам начались еще в 1946 году, когда Johnson and Lewin показали, что действие хинина на E. coli постепенно усиливается с возрастанием температуры в диапазоне 18°С-40,9°С [Johnson and Lewin, 1946]. Mackowiak и соавторы наблюдали четырех-шестнадцатикратное снижение МИК антибиотиков разных классов при переходе от 35°С к 41,5°С для разных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. При этом авторы считали маловероятной связь повышения чувствительности бактерий к антибиотикам со снижением скорости роста, вызванным температурными сдвигами [Mackowiak et al., 1982]. В чувствительность более поздних различных исследованиях патогенных было бактерий к установлено, антибиотикам что и дезинфектантам возрастала при сублетальных стрессах, вызванных понижением и повышением температуры культивирования [Reisinger et al., 1996, Al-Nabulsi et al., 2011, Lin et al., 2013]. Следует отметить, что изменение чувствительности бактерий авторы оценивали по тесту МИК и колониеобразующей способности без параллельного контроля скорости роста. В проведенных нами исследованиях выявлено, что в диапазоне 20°С-46°С зависимость устойчивости бактерий родительского штамма BW25113 (wt) к 110 антибиотикам от температуры имеет вид V-образной кривой с максимумом чувствительности при 40°С, то есть при температуре, соответствующей максимальной скорости роста. В культурах родительского штамма тип кривой не зависел от природы антибиотика, и, соответственно, его внутриклеточной мишени, а был тесно связан с изменением удельной скорости роста бактерий при разных температурах культивирования. Изучение влияния мутаций по компонентам тиоловых редокс систем на чувствительность бактерий к антибиотикам при температурных стрессах может дать дополнительные аргументы в дискуссии о роли окислительного стресса при бактерицидном действии антибиотиков. При сохранении общего V-образного характера зависимости чувствительности мутантов по компонентам тиоловых редокс систем к антибиотикам от температуры наблюдали изменения, связанные с видом мутации и типом антибиотика. В случае ампициллина и тепловой и холодовой стресс почти полностью предотвращали гибель бактерий, связанную с действием антибиотика. Такой же эффект наблюдался при обработке клеток стрептомицином в условиях холодового стресса. При тепловом стрессе, наряду с общим повышением выживаемости относительно той, которая наблюдалась при 37°С, менялся профиль зависимости устойчивости к стрептомицину от вида мутации, в частности, возрастала чувствительность мутантов, лишенных глутатиона и глутаредоксина 1 (grxA). При воздействии ципрофлоксацина в условиях холодового стресса сохранялась характерная для 37°С обратная зависимость между удельной скоростью роста бактерий в момент добавления антибиотика и выживаемостью штаммов. При этом профиль зависимости чувствительности к ципрофлоксацину от вида мутации в целом сохранялся, хотя все штаммы становились менее устойчивыми относительно родительского. При тепловом стрессе сильнее всего возрастала чувствительность к ципрофлоксацину у мутанта, лишенного тиоредоксинредуктазы. Представляется, что в условиях теплового стресса возрастает роль редокс-системы глутатиона в защите клеток от стрептомицина, в то время как для защиты от ципрофлоксацина важна тиоредоксинредуктаза. 111 В случае ципрофлоксацина и ампициллина изменения в чувствительности тиоловых мутантов к антибиотикам при разных температурах, по-видимому, связаны как с различием их редокс-активных свойств, так и с косвенным влиянием мутаций на скорость роста в испытуемых условиях. В целом, полученные данные дают дополнительные доказательства важной роли физиологического состояния в устойчивости бактерий к действию стрессов. В настоящее молекулярных время большое механизмов, внимание ответственных за уделяется исследованию высокую устойчивость микроорганизмов в составе биопленок. Одна из точек зрения на причину формирования биопленок исходит из того предположения, что эти структурированные сообщества являются способом защиты микроорганизмов от стрессовых условий, таких как лимитирование субстрата, изменения pH, окисление активными формами кислорода, действие антибиотиков и различных биоцидов [Jefferson, 2004]. В нашей работе показано, что при 24°С и 44°С, то есть вблизи границ температурного диапазона роста E. coli, у клеток родительского штамма резко возрастает способность к биопленкообразованию. Мутации по компонентам тиоловых редокс-систем биопленкообразования от значительно температуры, влияли вплоть до на зависимость изменения характера зависимости на противоположную родительскому штамму, как у двойного мутанта gshAtrxA. Отсутствие глутатиона в gshA мутантах существенно снижало биопленкообразование при всех тестированных температурах. При этом полностью отсутствовали характерные для родительского штамма максимумы при 24°С и 44°С. Мутанты по генам gor, trxA, gshAtrxA, gortrxB, grxA и grxB проявляли повышенную способность к биопленкообразованию в диапазоне температур 30°С-40°С, но также утрачивали максимумы, характерные для родителя. Изменение характера зависимости биопленкообразования от температуры указывает на важную роль тиоловых редокс-систем в регуляции процессов, связанных с формированием биопленок. Хотя при некоторых температурах были отмечены корреляции между продукцией биопленок и 112 уровнем индукции антиоксидантных генов и ферментов, роль окислительного стресса в биопленкообразовании при разных температурах остается неопределенной. Обработка бактерий экзогенными полифенолами кверцетином и таннином приводила к стимуляции биопленкообразования в диапазоне концентраций от 1 до 50 мкМ, более высокие концентрации кверцетина ингибировали этот процесс. Экзогенный GSH снижал способность к формированию биопленок. Стимуляция биопленкообразования в присутствии полифенолов может быть связана с окислительным стрессом, возникающим в результате накопления АФК при их аутоокислении, и индукцией антиоксидантных генов, особенно тех, которые принадлежат к OxyR регулону. Ранее было показано, что полифенолы кверцетин и таннин и богатые полифенолами растительные экстракты повышают экспрессию OxyR-контролируемого гена katG, кодирующего каталазу HPI [Smirnova et al., 2009, Samoilova et al., 2014]. Малая регуляторная РНК OxyS также индуцируется при пероксидном стрессе под контролем OxyR [Altuvia et al., 1997]. Недавно было показано, что OxyS снижает экспрессию генов flhDC, ингибируя тем самым продукцию флагелл и подвижность бактерий [De Lay and Gottesman 2012]. Кроме этих эффектов OxyS оказывает непрямое ингибирующее влияние на экспрессию RpoS [Zhang et al., 1998]. Более того, Ag43, большой протеин наружной мембраны, который необходим для формирования биопленок на различных поверхностях, также регулируется OxyR [van der Woude and Henderson, 2008]. Если кверцетин и таннин стимулируют образование биопленок за счет своего прооксидантного действия, то GSH может ингибировать этот процесс благодаря антиоксидантным свойствам. Рассмотренный механизм может действовать и в случае с мутантами. Все мутанты, у которых наблюдалась стимуляция образования биопленок при температуре 37°С (gor, trxA, gshAtrxA, gortrxB, grxA и grxB), имели высокий уровень дисульфидов в белках, повышенную экспрессию гена katG и активность каталазы HPI. Они также проявляли пониженную по сравнению с родительским штаммом подвижность в полужидком агаре. Таким образом, дисульфидный 113 стресс и экспрессия OxyR-регулона у мутантов по компонентам тиоловых редокссистем могут вносить вклад в стимуляцию биопленкообразования и у мутантов. Накапливаются данные о том, что сублетальные концентрации антибиотиков могут индуцировать [Hoffman et al., 2005, Linares et al., 2006, Boehm et al., 2009] или ингибировать [Boehm et al., 2009, Kuczynska-Wisnik et al., 2010] образование биопленок бактериями. Предполагают, что антибиотики могут играть роль внутриклеточных сигнальных молекул, и их присутствие в низких концентрациях может вызывать адаптивный ответ [Yim et al., 2007, Fajardo and Martinez, 2008]. Для бактерий E. coli было показано, что индуцированный сублетальными концентрациями β-лактамных антибиотиков синтез колановой кислоты может усиливать образование и устойчивость биопленок [Sailer et al., 2003]. Boehm с соавторами показали, что обработка бактерий E. coli, растущих на среде LB, сублетальными концентрациями антибиотиков, подавляющих синтез белка, ведет к резкому повышению биопленкообразования, что было связано с участием алармона ppGpp и вторичного мессенджера цикло-диГМФ [Boehm et al., 2009]. В наших экспериментах ампициллин (10 мг/мл) практически полностью подавлял способность к биопленкообразованию у бактерий дикого типа при температуре 37°С, что вероятно связано со спецификой его влияния на метаболизм бактерий, поскольку данный антибиотик ингибирует синтез компонентов клеточной стенки, которые необходимы для созревания биопленки. Однако, обработка мутантов по генам gor, grxB, gshAtrxA, gortrxB ампициллином, в отличие от родительского штамма, значительно повышала их способность к биопленкообразованию, причем представляет интерес прямая связь между удельным биопленкообразованием в присутствии ампициллина и уровнем дисульфидов в белках. В отличие от ампициллина, мутации по компонентам тиоловых редокс-систем не оказывали эффекта на биопленкообразование в присутствии ципрофлоксацина и ингибировали при обработке стрептомицином. Интересно, что если биопленкообразование при по низких сравнению температурах с ампициллин необработанными подавлял антибиотиком 114 клетками, то при высоких температурах (40-44°С), наблюдалась стимуляция этого процесса. Ципрофлоксацин усиливал биопленкообразование при низких температурах и при 46°С, а стрептомицин – в области низких температур и при 44°С. Таким образом изменение редокс-ситуации в клетке, вызванное мутациями и температурой, по-разному влияло на биопленкообразование в присутствии антибиотиков с разными внутриклеточными мишенями. Это указывает на то, что каждый из антибиотиков может иметь специфический механизм стимуляции или ингибирования этого процесса. 115 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наши исследования показали, что наличие мутаций по компонентам тиоловых редокс-систем сопровождается существенными изменениями редоксстатуса клеток и активности антиоксидантных генов и ферментов, что коррелирует с устойчивостью мутантов к окислительному стрессу, индуцированному перекисью водорода. Мутации по компонентам тиоловых редокс-систем по-разному влияли на направление и степень изменений чувствительности бактерий E. coli к антибиотикам с разными внутриклеточными мишенями (ципрофлоксацин – синтез ДНК, ампициллин – синтез клеточной стенки и стрептомицин – синтез белка). Характер влияния зависел от вида мутации и типа антибиотика. Статистический анализ не выявил значимой корреляции между чувствительностью мутантов ко всем трем антибиотикам и их устойчивостью к пероксидному стрессу. В целом, полученные данные больше согласуются с гипотезой о влиянии конкретных компонентов клеточных редокс-систем на уровне специфических мишеней для каждого антибиотика, чем с их участием в защите от индуцированного антибиотиками окислительного стресса. В случае ципрофлоксацина и ампициллина изменения в чувствительности тиоловых мутантов к антибиотикам при разных температурах, по-видимому, были связаны как с различием их редокс-активных свойств, так и с косвенным влиянием мутаций на скорость роста бактерий в испытуемых условиях. Тепловой и холодовой стресс приводили к изменению продукции оксидантов и активности антиоксидантных генов. При общей тенденции к повышению экспрессии генов sodA и katG при холодовом стрессе и ее снижению при тепловом стрессе, мутации по тиоловым редокс-системам значительно модулировали степень экспрессии этих генов. Мутанты по разным компонентам тиоловых редокс-систем проявляли различную устойчивость к температурным стрессам, что указывает на специфические функции отдельных компонентов в ответе на стресс. При комбинированном действии температурных стрессов и 116 антибиотиков наблюдалось повышение устойчивости родительских и мутантных бактерий ко всем изученным атибиотикам, что было связано, в основном, со снижением скорости роста. Искусственное изменение редокс-статуса среды и клеток за счет экзогенных добавок также модифицировало чувствительность бактерий к антибиотикам, главным образом, за счет влияния этих добавок на скорость роста бактерий. Мутации по компонентам тиоловых редокс-систем значительно влияли на интенсивность биопленкообразования и его зависимость от температуры. В основе модулирующего действия изменений редокс-статуса на биопленкообразование может лежать дисульфидный стресс и активация OxyRрегулона у мутантов по компонентам тиоловых редокс-систем. Изменение редоксситуации в клетке, вызванное мутациями и температурой, по-разному влияло на биопленкообразование в присутствии антибиотиков с разными внутриклеточными мишенями. Это указывает на то, что каждый из антибиотиков может иметь специфический механизм стимуляции или ингибирования этого процесса. Результаты настоящей работы вносят существенный вклад в понимание роли тиоловых редокс-систем в устойчивости бактерий к действию антибиотиков. Полученные данные могут быть использованы при поиске новых приемов, усиливающих эффективность антибиотикотерапии, и путей контроля биопленкообразования посредством изменения редокс-статуса бактериальных культур. 117 ВЫВОДЫ 1. Показано, что используемые в работе одиночные и двойные мутанты E. coli по компонентам тиоловых редокс-систем демонстрируют широкий спектр антиоксидантной активности (экспрессия антиоксидантных генов, активность каталаз, уровень глутатиона) и различную устойчивость к пероксидному стрессу. Это делает их удобной моделью для изучения влияния указанных параметров при ответе бактерий на действие антибиотиков и температурные стрессы. 2. Установлено, что мутации по тиоловым редокс-системам значительно модулируют продукцию перекиси водорода и активность антиоксидантных генов katG и sodA при тепловом и холодовом стрессах и существенно изменяют устойчивость E. coli к этим стрессам. 3. Показано, что мутации по компонентам тиоловых редокс-систем по- разному влияют на направление и степень изменений чувствительности бактерий E. coli к антибиотикам с разными внутриклеточными мишенями. Характер влияния зависит от вида антибиотика и, в значительной мере, определяется скоростью роста бактерий перед его добавлением. Не выявлена связь между чувствительностью E. coli к антибиотикам и устойчивостью бактерий к пероксидному стрессу. 4. Установлено, что предобработка родительских бактерий и мутанта, дефицитного по синтезу глутатиона, тиолами и SH-реагентами, значительно изменяет чувствительность к антибиотикам. Выживаемость бактерий в этих условиях не зависит от изменений редокс-статуса и коррелирует с изменением скорости роста бактерий, индуцированным экзогенными добавками. 5. При комбинированном действии температурных стрессов и антибиотиков для E. coli родительского штамма и большинства мутантов выявлена характерная V-образная кривая зависимости выживаемости от ростовой температуры с максимумом чувствительности при 44°С для ципрофлоксацина и 40°С для ампициллина и стрептомицина, т.е. соответствующих наиболее высоким скоростям роста. в области температур, 118 6. Установлено, что мутации по компонентам тиоловых редокс-систем значительно изменяют интенсивность биопленкообразования и его зависимость от температуры. У всех мутантов, за исключением gshA и trxB, биопленкообразование повышается в области оптимальных ростовых температур. При комбинированном действии антибиотиков и температурных стрессов интенсивность биопленкообразования зависит от типа антибиотика. 119 ЛИТЕРАТУРА 1. Алехин Е.К. Как действуют антибиотики / Е.К. Алехин // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. - № 4. – С. 19-23. 2. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. – М. – 2003. – 136с. 3. Головлев Е.Л. Реакция бактериальных клеток на холодовой шок на уровне динамики хромосомы, транскрипции и трансляции / Е.Л. Головлев // Микробиология. – 2003. – Т. 72. - № 1. – С. 5-13. 4. Желдакова Р.А. Механизмы биосинтеза антибиотиков и их действие на клетки микроорганизмов. – Мн.: БГУ. – 2004. – 111c. 5. Ленгелер Й. Современная микробиология: Прокариоты: В 2х томах: Т.2. – М.:Мир. – 2005. – 493с. 6. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В.И. Лущак // Биохимия. – 2001. – Т. 66. – С. 592-609. 7. Николаев Ю.А. Биопленка – «Город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология. – 2007. – Т.76. – С. 149-163. 8. Николаев Ю.А. Роль алкилоксибензолов в адаптации бактерий к неблагоприятным условиям роста / Ю.А. Николаев, И.А. Борзенков, А.Л. Тарасов, Н.Г. Лойко, А.Н. Козлова, В.Ф. Гальченко, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. – 2010. – Т.79. – С.760-766. 9. Октябрьский О.Н. Роль тиоловых редокс-систем в отклике бактерий Escherichia coli на пероксидный стресс / О.Н. Октябрьский, Н.Г. Музыка, В.Ю. Ушаков, Г.В. Смирнова // Микробиология. – 2007. – Т. 76. – С. 1-7. 10. Сидоренко С.В. Бета-лактамные антибиотики [Электронный ресурс] / С.В. Сидоренко, С.В. Яковлев // Русский медицинский журнал. – 1997. – Т. 5. - № 21. – Режим доступа: http://www.rmj.ru/articles_2892.htm 11. Смирнова Г.В. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на тепловой шок / Г.В. Смирнова, О.Н. Закирова, О.Н. Октябрьский // Микробиология. – 2001. – Т. 70. – С. 595-601. 120 12. Смирнова Г.В. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на холодовой стресс / Г.В. Смирнова, О.Н. Закирова, О.Н. Октябрьский // Микробиология. – 2001. - Т. 70. – С. 55-60. 13. Терешина В.М. Состав мембранных липидов и углеводов цитозоля в условиях теплового шока у Aspergillus niger/ В.М. Терешина, А.С. Меморская, Е.Р. Котлова, Е.П. Феофилова // Микробиология. – 2010. – Т. 79. - № 1. – С. 45-51. 14. Ткаченко А.Г. Молекулярные механизмы стрессорных ответов у микроорганизмов. Екатеринбург: УрО РАН, 2012. – 268с. 15. Albesa I. Oxidative stress involved in the antibacterial action of different antibiotics // I. Albesa, M.C. Becerra, P.C. Battan, P.L. Paez // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2004. – V. 317. – P. 605-609. 16. Aldsworth T.G. Bacterial suicide through stress / T.G. Aldsworth, R.I. Sharman, C.E. Dodd // Cell. Mol. Life Sci. – 1999. – V. 56. – P. 378-383. 17. Al-Nabulsi A.A. Impact of environmental stress desiccation, acidity, alkalinity, heat or cold on antibiotic susceptibility of Cronobacter sakazakii // Anas A. Al-Nabulsi, T. M. Osaili, N.A. Elabedeen, Z.W. Jaradat, R.R. Shaker, K.A. Kheirallah, Y.H. Tarazi, R.A. Holley // Int. J. Food Microbiol. – 2011. – V. 146. – P.137-143. 18. Arsene F. The heat shock response of Escherichia coli / F. Arsene, T. Tomoyasu, B. Bukau // Int. J. Food Microbiol. – 2000. – V. 55. – P. 3–9. 19. Aslund F. Glutaredoxin-3 from Escherichia coli. Amino acid sequence, 1H and 15N NMR assignments, and structural analysis / F. Aslund, K. Nordstrand, K.D. Berndt, M. Nikkola, T. Bergman // J. Biol. Chem. – 1996. – V. 271. – P. 6736-6745. 20. Aslund F. Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol-disulfide status / F. Aslund, M. Zheng, J. Beckwith, G. Storz // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – V. 96. – P. 6161-6165. 21. Aslund F. Two additional glutaredoxins exist in Escherichia coli: Glutaredoxin 3 is a hydrogen donor for ribonucleotide reductase in a thioredoxin/glutaredoxin 1 double mutant / F. Aslund, B. Ehn, A. Miranda-Vizuete, C. Pueyo, A. Holmgren // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. – V. 91. – P. 9813-9817. 121 22. Baba T. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection // T. Baba, T. Ara, M. Hasegawa, Y. Takai, Y. Okumura, M. Baba, K.A. Datsenko, M. Tomita, B.L. Wanner, H. Mori // Mol. Syst. Biol. – 2006. – V. 2. – P. 1-11. 23. Becker-Hapak M. Role of rpoS in the regulation of glutathione oxidoreductase (gor) in Escherichia coli / M. Becker-Hapak, A. Eisenstark // FEMS Microbiol. Lett. – 1995. – V. 134. – P. 39-44. 24. Benov L. Escherichia coli expresses a copper- and zinc-containing superoxide dismutase / L.T. Benov, I.Fridovich // J. Biol. Chem. – 1994. - V. 269. – P. 2531025314. 25. Benov L. Superoxide dismutase protects against aerobic heat shock in Escherichia coli / L. Benov, I. Fridovich // J. Bacteriol. – 1995. – V. 177. – P. 33443346. 26. Berlett B.S. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress / B.S. Berlett, E.R. Stadtman // J. Biol. Chem. 1997. – V. 272. – P. 20313-20316. 27. Boehm A. Second messenger signaling governs Escherichia coli biofilm induction upon ribosomal stress / A. Boehm, S. Steiner, F. Zaehringer, A. Casanova, F. Hamburger, D. Ritz, W. Keck, M. Ackermann, T. Schirmer, U. Jenal // Mol. Microbiol. - 2009. - V. 72. - P.1500-1516. 28. Botos I. The catalytic domain of Escherichia coli Lon protease has a unique fold and a Ser-Lys dyad in the active site / I. Botos, E.E. Melnikov, S. Cherry, J.E. Tropea, A.G. Khalatova, F. Rasulova, Z. Dauter, M.R. Maurizi, T.V. Rotanova, A. Wlodawer, A. Gustchina // J. Biol. Chem. - 2004. - V. 279. - No. 9. – P. 8140–8148. 29. Braig K. The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A˚/ K. Braig, Z. Otwinowski, R. Hegde, D.C. Boisvert, A. Joachimiak, A.L. Horwich, P.B. Sigler // Nature. – 1994. – V. 371. – P. 578–586. 30. Brennan F.P. Insights into the low-temperature adaptation and nutritional flexibility of a soil-persistent Escherichia coli / F.P. Brennan, J. Grant, C.H. Botting, V. O’Flaherty, K.G. Richards // FEMS Microbiol. Ecol. – 2013. – V. 84. – P. 75-85. 122 31. Bukau B. Regulation of the Escherichia coli heat shock response / B. Bukau // Mol. Microbiol. – 1993. – V. 9. – P. 671-680. 32. Burlacu-Miron S. Structural and energetic factors of the increased thermal stability in a genetically engineered Escherichia coli adenylate kinase / S. BurlacuMiron, V. Perrier, A.M. Gilles, E. Pistotnik, C.T. Craescu // J. Biol. Chem. – 1998. – V. 273. – P. 19102-19107. 33. Bush K. A functional classification scheme for β-lactamases and its corrrelation with molecular structure / K. Bush, G.A. Jacoby, A.A. Medeiros // Antimicrob. Agents Chemother. - 1995. – V. 39. – P. 1211-1233. 34. Bushweller J.H. Structural and functional characterization of the mutant Escherichia coli glutaredoxin (C14-S) and its mixed disulfide with glutathione / J.H. Bushweller, F. Aslund, K. Wuthrich, A. Holmgren // Biochemistry. – 1992. – V. 31. – P. 9288-9293. 35. Cabiscol E. Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species / E. Cabiscol, J. Tamarit, J. Ros // Internatl. Microbiol. – 2000. – V. 3. – P. 3-8. 36. Carmel-Harel O. Roles of the glutathione- and thioredoxin-dependent reduction systems in the Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae responses to oxidative stresses / O. Carmel-Harel, G. Storz // Annu. Rev. Microbiol. - 2000. – V. 54. - P. 439461. 37. Chen W. Determination of thiols and disulfides via HPLC quantification of 5- thio-2-nitrobenzoic acid / W. Chen, Y. Zhao, T. Seefeldt, G. Xiangming // J. Pharm. Biomed. Anal. – 2008. – V. 48. – P. 1375-1380. 38. Choi H.J. Structural basis of the redox switch in the OxyR transcription factor / H.J. Choi, S.J. Kim, P. Mukhopadhyay, S. Cho, J.R. Woo, G. Storz, S.E. Ryu // Cell. – 2001. – V. 105. – P. 103-113. 39. Cohen G. Glutathione peroxidase: the primary agent for the elimination of hydrogen peroxide in erythrocytes / G. Cohen, P. Hochstein // Biochem. – 1963. – V. 2. – P. 1420-1426. 123 40. Compan I. Interaction of six global transcription regulators in expression of manganese superoxide dismutase in Escherichia coli K-12 / I. Compan, D. Touati // J. Bacteriol. – 1993. – V. 175. – P. 1687-1696. 41. Connolly L. Autoregulation of the heat shock response in procaryotes. In Molecular chaperones and folding catalysts. Regulation, cellular function and mechanism / L. Connolly, T. Yura, C.A. Gross (ed. B. Bukau) // Harwood Academic Publishers, Amsterdam. - 1999. - P. 13–33. 42. Das K.S. Redox systems of the cell: possible links and implications / K.S. Das, C. W. White // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2002. – V. 99. – P. 9617-9618. 43. Davidson J. Oxydative stress is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae / J. Davidson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1996. - V. 93. – P. 5116-5121. 44. De Lay N. A complex network of small non-coding RNAs regulates motility in Escherichia coli / N. De Lay, S. Gottesman // Mol. Microbiol. – 2012. V. 84. - P. 36-50. 45. Demple B. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology / B. Demple, L. Harrison // Annu. Rev. Biol. – 1994. – V. – 63. – P. 915-948. 46. Derman A.F. Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli / A.F. Derman, W.A. Prinz, D. Belin, J. Beckwith // Science. – 1993. – V. 262. - P. 1744-1747. 47. Dhamdhere G. Interplay between drug efflux and antioxidants in Escherichia coli resistance to antibiotics // G. Dhamdhere, G. Krishnamoorthy, H.I. Zgurskaya // Antimicrob. Agents Chemother. – 2010. – V.54. – P. 5366-5368. 48. Ding H. Direct nitric oxide signal transduction via nitrosylation of iron-sulfur centers in the SoxR transcription activator / H. Ding, B. Demple // J. Biol. Chem. – 2000. – V. 97. – P. 33173-33175. 49. Ding H. Glutathione-mediated destabilization in vitro of [2Fe-2S] centers in the SoxR regulatory protein / H. Ding, B. Demple // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – V. 93. – P. 9449-9453. 50. Dizdaroglu M. Measurement of radiation-induced damage to DNA at the molecular level / M. Dizdaroglu // Int. J. Radiat. Biol. – 1992. – V. 61. – P. 175-183. 124 51. Drlica K. Quinolone-mediated bacterial death / K. Drlica, M. Malik, R.J. Kerns, X. Zhao // Antimicrob. Agents Chemother. - 2008. - V. 52. - P. 385-392. 52. Dukan S. Bacterial senescence: stasis results in increased and differential oxidation of cytoplasmic proteins leading to developmental induction of the heat shock regulon / S. Dukan, T. Nyström // Genes Dev. - 1998. – V. 12. – P. 3431–3441. 53. Dwyer D.J. Gyrase inhibitors induce an oxidative damage cellular death pathway in Escherichia coli / D.J. Dwyer, M.A. Kohanski, B. Hayete, J.J. Collins // Mol. Syst. Biol. – 2007. – V. 3. – P. 91. 54. Dwyer D.J. Antibiotics induced redox-related physiological alterations as part of their lethality / D.J. Dwyer, P.A. Belenky, J.H. Yang, I.C. MacDonald, J.D. Martell, N. Takahashi, C.T. Chan, M.A. Lobritz, D. Braff, E.G. Schwarz, J.D. Ye, M. Pati, M. Vercruysse, P.S. Ralifo, K.R. Allison, A.S. Khalil, A.Y. Ting, G.C. Walker, J.J. Collins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2014. – V. 111(20). – P. 2100-2109. 55. Dwyer D.J. Role of reactive oxygen species in antibiotic action and resistance / D.J. Dwyer, M.A. Kohanski, J.J. Collins // Curr. Opin. Microbiol. – 2009. – V. 12. – P. 482-489. 56. Dyson H.J. Assignment of the proton NMR spectrum of reduced and oxidized thioredoxin: sequence-specific assignments, secondary structure, and global fold / H.J. Dyson, A. Holmgren // Biochemistry. – 1989. – V. 28. – P. 7074-7087. 57. Eklund H. Structural and functional relations among thioredoxins of different species / H. Eklund, F. Gleason, A. Holmgren // Proteins. – 1991. – V. 11. – P. 13-28. 58. Eng R.H.K. Bactericidal effects of antibiotics on slowly growing and nongrowing bacteria / R.H.K. Eng, F.T. Padberg, S.M. Smith, E.N. Tan, C.E. Cherubin // Antimicrob. Agents Chemother. - 1991. - V. 35. - P. 1824-1828. 59. Erickson J.W. Transcription of rpoH (htpR) gene in Escherichia coli. Identification of the promoters and evidence that the amount of rpoH mRNA increases after heat shock by a post-transcriptional mechanism / J.W. Erickson, V. Vaughn, W. Walter, F.C. Neidhard, C.A. Gross // Genes Dev. - 1987. - V. 1. - P. 419-432. 60. Fahey R.C. Occurrence of glutathione in bacteria / R.C. Fahey, W.C. Brown, W.B. Adams, M.B. Worsham // J. Bacteriol. – 1978. – V. 133. – P. 1126-1129. 125 61. Fajardo A. Antibiotics as signals that trigger specific bacterial responses // A. Fajardo, J.L. Martinez // Curr. Opin. Microbiol. - 2008. - V. 11. - P. 161-167. 62. Farr S.B. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium / S.B. Farr, T. Kogoma // Microbiol. Rev. - 1991. - V. 55. - P. 561-585. 63. Foti J. Oxidation of the guanine nucleotide pool underlies cell death by bactericidal antibiotics / J.J. Foti, B. Devadoss, J.A. Winkler, J.J. Collins, G.C. Walker, F. Abramet // Science. - 2012. – V. 336. – P. 315-319. 64. Gilbert P. Influence of growth rate on susceptibility to antimicrobial agents: biofilms, cell cycle, dormancy, and stringent response / P. Gilbert, P. J. Collier, M. R. Brown // Antimicrob. Agents Chemother. - 1990. - V. 34. - P.1865-1868. 65. Goldstein J. Major cold shock protein of Escherihia coli / J. Goldstein, N.S. Pollitt, M. Inouye // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 1990. – V. 87. – P. 283-287. 66. González-Flecha B. Metabolic sources of hydrogen peroxide in aerobically growing Escherichia coli / B. González-Flecha, B. Demple // J. Biol. Chem. – 1995. – V. 270. – P. 13681-13687. 67. Goswami M. Effects of glutathione and ascorbic acid on streptomycin sensitivity of Escherichia coli / M. Goswami, S.H. Mangoli, N. Jawali // Antimicrob. Agents Chemother. - 2007. - V.51. - P. 1119–1122. 68. Goswami M. Glutathione-mediated augmentation of β-lactam antibacterial activity against Escherichia coli / M. Goswami, N. Jawali // J. Antimicrob. Chemother. - 2007. - V. 60. - P. 184-185. 69. Goswami M. Involvement of reactive oxygen species in the action of ciprofloxacin against Escherichia coli / M. Goswami, S.H. Mangoli, N. Jawali // Antimicrob. Agents Chemother. – 2006. – V.50. – P. 949-954. 70. Goswami M. N-acetylcysteine-mediated modulation of bacterial antibiotic susceptibility / M. Goswami, N. Jawali // Antimicrob. Agents Chemother. - 2010. - V. 54. - P.3529-3530. 71. Gottesman S. Proteases and their targets in Escherichia coli / S. Gottesman // Annu. Rev. Genet. – 1996. - V. 30. – P. 465-506. 126 72. Graumann P. A family of cold shock proteins in Bacillus subtilis is essential for cellular growth and for efficient protein synthesis at optimal and low temperatures / P. Graumann, T. Wendrich, M. Weber, K. Schroder, M. Marahiel // Mol. Microbiol. – 1997. – V. 25. – P. 741-756. 73. Greenberg J.T. A global response induced in Escherichia coli by redox-cycling agents overlaps with that induced by peroxide stress / J.T. Greenberg, B. Demple // J. Bacteriol. – 1989. – V. 171. – P. 3933-3939. 74. Greer S. Glutathione reductase from Escherichia coli: cloning and sequence analysis of the gene and relationship to other flavoprotein disulfide oxidoreductases / S. Greer, R.N. Perham // Biochemistry. – 1986. – V. 25. – P. 2736-2742. 75. Gualerzi C.O. Transcriptional and post-transcriptional control of cold-shock genes / C.O. Gualerzi, A.M. Giuliodori, C.L. Pon // J. Mol. Biol. – 2003. – V. 331. - P. 527-539. 76. Guisbert E. A chaperone network controls the heat shock response in Escherichia coli / E. Guisbert, C. Herman, C. Zen Lu, A. Carol // Genes Dev. – 2004. – V. 18. – P. 2812–2821. 77. Gunasekera T.S. Genome-wide transcriptional responses of Escherichia coli K-12 to continuous osmotic and heat stresses / T.S. Gunasekera, L.N. Csonka, O. Paliy // J. Bacteriol. – 2008. – V. 190. – P. 3712-3720. 78. Halliwell B, Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. 2nd ed. Oxford : Clarendon Press. 1989. 79. Hancock R. Peptide antibiotics / R. Hancock, D.S. Chapple // Antimicrob. Agents Chemother. – 1999. – V.43. – No. 6. – P. 1317–1323. 80. Hartl F. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis / F. Hartl, A. Bracher, M. Hayer-Hartl // Nature. – 2011. – V. 475. – P. 324-332. 81. Hayer-Hartl M.K. Asymmetrical interaction of GroEL and GroES in the ATPase cycle of assisted protein folding / M.K. Hayer-Hartl, J. Martin, F.-U. Hartl // Science. 1995. – V. 269. – No. 5225. - P. 836–841. 127 82. Hengge-Aronis R. Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase / R. Hengge-Aronis // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2002. – V. 66. – No. 3. – P. 373-395. 83. Henle E.S. Formation, prevention, and repair of DNA damage by iron/hydrogen peroxide / E.S. Henle, S. Linn // J. Biol.Chem. – 1997. - V. 272. – P. 19095–19098. 84. Henle E.S. Sequence-specific DNA cleavage by Fe2+-mediated Fenton reactions has possible biological implications / E.S. Henle, Z. Han, N. Nang, P. Rai, Y. Luo // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 962-971. 85. Hidalgo E. Spacing of promoter elements regulates the basal expression of the soxS gene and converts SoxR from a transcriptional activator into a repressor / E. Hidalgo, B. Demple // EMBO J. – 1997. – V. 16. – P. 1056-1065. 86. Hillier B. Coupling protein stability and protein function in Escherichia coli CspA / B. Hillier, H. Rodriguez, L. Gregoret // Fold Des. – 1998. – V. 3. – P. 87–93. 87. Hoffman L.R. Aminoglycoside antibiotics induce bacterial biofilm formation / L.R. Hoffman, D.A. DʹArgenio, M.J. MacCoss, Z. Zhang, R.A. Jones, S.I. Miller // Nature. - 2005. - V.436. - P. 1171-1175. 88. Holmgren A. Glutaredoxin / A. Holmgren, F. Aslund // Methods Enzymol. – 1995. – V. 252. – P. 283-292. 89. Holmgren A. Glutathione-dependent synthesis of deoxyribonucleotides. Characterization of the enzymatic mechanism of Escherichia coli glutaredoxin / A. Holmgren // J. Biol. Chem. – 1979. – V. 254. – P. 3672-3678. 90. Holmgren A. Hydrogen donor system for Escherichia coli ribonucleosidediphosphate reductase dependent upon glutathione / A. Holmgren // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1976. – V. 73. – P. 2275-2279. 91. Holmgren A. Thiol redox control via thioredoxin and glutaredoxin systems / A. Holmgren, C. Johansson, C. Berndt, M.E. Lonn, C. Hudemann, C.H. Lillid // Biochem. Soc. Trans. – 2005. – V. 33. – P. 1375 – 1377. 92. Hoog J. O. The primary structure of Escherichia coli glutaredoxin / J.O. Hoog, H. Jornvall, A. Holmgren, M. Carlquist, M. Persson // Eur. J. Biochem. – 1983. – V. 136. – P. 223-232. 128 93. Hunt J. F. The crystal structure of the GroES cochaperonin at 2.8 A˚ resolution / J.F. Hunt // Nature. – 1996. – V. 379. – P. 37-35. 94. Imlay J.A. Cellular defenses against superoxide and hydrogen peroxide / J.A. Imlay // Annu. Rev. Biochem. – 2008. – V. 77. – P. 755-776. 95. Imlay J.A. DNA damage and oxygen radical toxicity / J.A. Imlay, S. Linn // Science. – 1988. – V. 240. – P. 1302-1309. 96. Imlay J.A. Pathways of oxidative damage / J.A. Imlay // Annu. Rev. Microbiol. – 2003. – V. 57. – P. 395-418. 97. Imlay J.A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: lessons from a model bacterium / J.A. Imlay // Nat. Rev. Microbiol. 2013. – V.11. - P. 443-454. 98. Imlay J.A. Toxic DNA damage by hydrogen peroxide through the Fenton reaction in vivo and in vitro / J.A. Imlay, S.M. Chin, S. Linn // Science. – 1988. – V. 240. – P. 640-642. 99. Jacob U. Hsp33`s redox switch has a novel zinc-binding motif / U. Jacob, M. Eser, J.C. Bardwell // J. Biol. Chem. – 2000. – V. 275. – P. 38302-38310. 100. Jang S. Micromolar intracellular hydrogen peroxide disrupts metabolism by damaging iron-sulfur enzymes / S. Jang, J.A. Imlay // J. Biol. Chem. – 2007. – V. 282. – P. 929-937. 101. Jefferson K. What drives bacteria to produce biofilm? / K. Jefferson // FEMS. Microbiol. Lett. - 2004. - V. - 236. - P. 163-173. 102. Jiang W. Chloramphenicol induces the transcription of the major cold shock gene of Escherichia coli, cspA / W. Jiang, P. Jones, M. Inouye // J. Bacteriol. - 1993- V. 175P. 5824 – 5828. 103. Johnson F.H. The growth rate of E. coli in relation to temperature, quinine and coenzyme / F.H. Johnson, I. Lewin // J. Cell. Comp. Physiol. – 1946. – V. 28. – P. 4775. 104. Jones P.G. Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli / P.G. Jones, R.A. VanBogelen, F.C. Neidhardt // J. Bacteriol. - 1987. - V. 169. - P. 2092-2095. 129 105. Kandror O. Tregalose synthesis is induced upon exposure of Escherichia coli to cold and is essential for viability at low temperatures / O. Kandror, A. DeLeon, A. Goldberg // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2002. – V. 94. – P. 9727-9732. 106. Kanemori M. Marked instability of the sigma 32 heat shock transcription factor at high temperature – Implications for heat shock regulation / M. Kanemori, H. Yanagi, T. Yura // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 271. – No. 31. – P. 22002-22007. 107. Keren I. Killing by bactericidal antibiotics does not depend on reactive oxygen species // I. Keren, Y. Wu, J. Inocencio, L. Mulcahy, K. Lewis // Science. – 2013. – V. 339. – P. 1213-1216. 108. Keyer K. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free-iron levels / K. Keyer, J.A. Imlay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – V. 93. – P. 13635-13640. 109. Kocharunchitt C. Integrated transcriptomic and proteomic analysis of the physiological response of Escherichia coli O157:H7 Sakai to steady-state conditions of cold and water activity stress / C. Kocharunchitt, T. King, K. Gobius, J.P. Bowman, T. Ross // Mol. Cell. Proteomics. – 2012. – V. 11.1. – P. 1-16. 110. Kohanski M.A. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics / M.A. Kohanski, D.J. Dwyer, B. Hayete, C.A. Lawrence, J.J. Collins // Cell. – 2007. – V. 130. – P. 797-810. 111. Kohanski M.A. Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger aminoglycoside-mediated oxidative stress and cell death / M.A. Kohanski, D. J. Dwyer, J. Wierzbowski, G. Cottarel, J.J. Collins // Cell. – 2008. – V. 135. – P. 679-690. 112. Kolodkin-Gal I. The communication factor EDF and toxin-antitoxin module mazEF determine the mode of action of antibiotics / I. Kolodkin-Gal, B. Sat, A. Keshet, H. Endelberg-Kulka // PLoS Biol. – 2008. – V. 6. – e319. 113. Korshunov S. Detection and quantification of superoxide formed within the periplasm of Escherichia coli / S. Korshunov, J.A. Imlay // J. Bacteriol. – 2006. – V. 188. – P. 6326-6334. 114. Kosower N.S. The glutathione status of cells / N.S. Kosower, E.M. Kosower // Internat. Rev. Cytol. – 1978. – V. 54. – P. 109-160. 130 115. Kuczynska-Wisnik D. Antibiotics promoting oxidative stress inhibit formation of Escherichia coli biofilm via indole signaling / D. Kuczynska-Wisnik, E. Matuszevska, B. Furmanek-Blaszk, D. Leszczynska, A. Grudowska, P. Szczepaniak, E. Laskowska // Res. Microbiol. - 2010. - V. 161. - P. 847-853. 116. Langer T. Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding / T. Langer, C. Lu, H. Echols, J. Flanagan, M.K. Hayer, F.-U. Hartl // Nature. – 1992. – V. 356. – P. 683-689. 117. Langer Т. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder which accommodates the substrate within its central cavity / Т. Langer, G. Pfeifer, J. Martin, W. Baumeister, F.U. Hartl // EMBO J. - 1992. - V. 11. - P.455457. 118. Lee P. C. AppppA, heat shock stress and cell oxidation / P.C. Lee, B.R. Bochner, B.N. Ames // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1983. - V. 80. - P. 7596-7600. 119. Levine R.L. Turnover of bacterial glutamine synthetase: oxidative modification precedes proteolysis / R.L. Levine, C.N. Oliver, R.M. Fulks, E.R. Stadtman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1981. – V. 78. – P. 2120-2124. 120. Lillig C. H. New thioredoxins and glutaredoxins as electron donors of 3`phosphoadenylylsulfate reductase / C.H. Lillig, A. Prior, J.D. Schwenn, F. Aslund, D. Ritz // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 7695-7698. 121. Lillig C.H. Glutaredoxin systems / C.H. Lillig, C. Berndt, A. Holmgren // Biochim. Biophys. Acta. – 2008. – V. 1780. – P. 1304-1317. 122. Lin Z. GroEL-Mediated protein folding: Making the impossible, possible / Z. Lin, H.S. Rye // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. – 2006. – V. 41. – P. 211-239. 123. Lin M.H. Susceptibility of Vibrio parahaemolyticsus to disinfectants after prior exposure to sublethal stress / M.H. Lin, T.Y. Tsai, S.C. Hsieh, R.C. Yu, C.C. Chou // Food Microbiol. – 2013. – V. 34. – P. 202-206. 124. Linares J.F. Antibiotics as intermicrobial signaling agents instead of weapons / J.F. Linares, I. Gustaffson, F. Baquero, J.I. Martinez // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V. 103. - P. 19484-19489. 131 125. Liochev S.I. The role of superoxide in the production of hydroxyl radical: in vitro and in vivo / S.I. Liochev, I. Fridovich // Free Radic. Biol. Med. – 1994. – V. 16. – P. 29-33. 126. Liu Y. Cell death from antibiotics without the involvement of reactive oxygen species / Y. Liu, J.A. Imlay // Science. – 2013. – V. 339. – P. 1210-1213. 127. Llorea O. The formation of symmetrical GroEL-GroES complexes in the presence of ATP / O. Llorea, S. Marco, J. Carracosa, J.M. Valpuesta // FEBS Lett. 1994. - V. 345. - P.181-186. 128. Loewen P.C. Catalases HPI and HPII in Escherichia coli are induced independently / P.C. Loewen, J. Switala, B.L. Triggs-Raine // Arch. Biochem. Biophys. – 1985. – V. 243. – P. 144-149. 129. Loewen P.C. Regulation in the rpoS regulon of Escherichia coli / P.C. Loewen, B. Hu, J. Strutinsky, R. Sparling // Can. J. Microbiol. – 1998. – V. 44. – P. 707-717. 130. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randoll // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 193. – P. 265275. 131. Lu J. The thioredoxin antioxidant system / J. Lu, A. Holmgren // Free Rad. Biol. Med. – 2014. – V. 66. – P. 75-87. 132. Mah T.F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance // T.F. Mah, B. Pitts, B. Pelloc, G.C. Walker, P.S. Stewart, G.A. OʹToole // Nature. - 2003. - V. 426. - P. 306-310. 133. Mackowiak P.A. Effects of temperature on antimicrobial susceptibility of bacteria // P. A. Mackowiak, M. Marling-Cason, R.L. Cohen // J. Infect. Dis. – 1982. – V. 145. – P. 550-554. 134. Mannervik B. Glutathione: general review of mechanism of action / B. Mannervik, I. Carlberg, K. Larson // Glutathione: chemical, biochemical and medical aspects. Parts A, B / N.Y. - 1989. – P. 476-516. 135. Martin J.L. Thioredoxin - a fold for all reasons / J.L. Martin // Structure. – 1995. – V. 3. - 245-250. 132 136. Mayer M. P. Hsp70 chaperones: Cellular functions and molecular mechanism / M. P. Mayer, B. Bukau // Cell. Mol. Life Sci. – 2005. – V. 62. – P. 670–684. 137. McCarty J.S. The role of ATP in the functional cycle of the DnaK chaperone system / J.S. McCarty A. Buchberger, J. Reinstein, B. Bukau // J. Mol. Biol. – 1995. V. 249. - P. 126-137. 138. Meister A. Glutathione / A. Meister, M.E. Anderson // Ann. Rev. Biochem. – 1983. – V. 52. – P. 711-760. 139. Meyer A.S. Proteolysis in the Escherichia coli heat shock response: a player at many levels / A.S. Meyer, T.A. Baker // Curr. Opin. Microbiol. – 2011. – V. 14. – P. 194-199. 140. Michan C. In vivo transcription of the Escherichia coli oxyR regulon as a function of growth phase and in response to oxidative stress / C. Michan, M. Manchado, G. Dorado, C. Pueyo // J. Bacteriol. – 1999. – V. 181. – P. 2759-2764. 141. Mingeot-Leclercq M. P. Aminoglycosides: activity and resistance / M.P. Mingeot-Leclercq, Y. Glupczynski, P.M. Tulkens // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - V. 43. - P. 727-737. 142. Miranda-Vizuete A. Cloning, expression, and characterization of a novel Escherichia coli thioredoxin / A. Miranda-Vizuete, A.E. Damdimopoulos, J.A. Gustafsson, G. Spyrou // J. Biol. Chem. – 1997. – V. 272. – P. 30841-30847. 143. Moen B. Global responses of Escherichia coli to adverse conditions determined by microarrays and FT-IT spectroscopy / B. Moen, A.O. Janbu, S. Langsrud, O. Langsrud, J.L. Hobman, C.Constantinidou, A. Kohler, K. Rudi // Can. J. Microbiol. 2009. – V. 55. – P. 714–728 144. Morita M. Dynamic interplay between antagonistic pathways controlling the sigma 32 level in Escherichia coli / M. Morita, M. Kanemori, H. Yanagi, T. Yura // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – V. 97. – No. 11. – P. 5860-5865. 145. Muller A. Nonnative disulfide bond formation activates the σs- dependent heat shock response in Escherichia coli / A. Muller, J.H. Hoffmann, H.E. Meyer, F. Narberhaus, U. Jakob, L.I. Leichert // J. Bacteriol. - 2013. - V. 195. - P. 2807-2815. 133 146. Murata N. Acyl-lipid desaturases and their importance in the tolerance and acclimatization to cold of cyanobacteria / N. Murata, H. Wada // Biochem. J. - 1995. V. 308. - P. 1-8. 147. Nakashima K. A novel member of the cspA family of genes that is induced by cold shock in Escherichia coli / K. Nakashima, K. Kanamaru, T. Mizuno, K. Horikoshi // J. Bacteriol. – 1996. – V. 178. – P. 2994–2997. 148. Newkirk K. Solution NMR structure of the major cold shock protein (CspA) from Escherichia coli: Identification of a binding epitope for DNA / K. Newkirk, W. Feng, W. Jiangi, R. Tejero, S. Emerson, M. Inouye, G. Montelione // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. - V. 91. - P. 5114-5118. 149. Niederhoffer E. Control of Escherichia coli superoxide dismutase (sodA and sodB) genes by the ferric uptake regulation (fur) locus / E. Niederhoffer, C. Naranjo, K. Bradley // J. Bacteriol. – 1990. – V. – 172. – P. 1930-1938. 150. Nygren H. Immunoelectron microscopic localization of glutaredoxin and thioredoxin in Escherichia coli cells / H. Nygren, B. Rozell, A. Holmgren, H.A. Hansson // FEBS Lett. – 1981. – V. 133. – P. 145-150. 151. Palleros, D.R. ATP-induced protein-Hsp70 complex dissociation requires K+ but not ATP hydrolysis / D.R. Palleros, K.L. Reid, L. Shi, W.J. Welch, A.L. Fink // Nature. – 1993. V. 65. - P. 664-666. 152. Pankey G.A. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections / G.A. Pankey, L.D. Sabath // Clin. Infect. Dis. – 2004. – V. 38- P. 864-870. 153. Park S. Substantial DNA damage from submicromolar intracellular hydrogen peroxide detected in Hpx- mutants in Escherichia coli / S. Park, X. You, J.A. Imlay // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2005. – V. 102. – P. 9317-9322. 154. Park, S. High levels of intracellular cysteine promote oxidative DNA damage by driving the Fenton reaction / S. Park, J.A. Imlay // J. Bacteriol. - 2003. – V.185. – P. 1942-1950 155. Phadtare S. Recent developments in bacterial cold-shock response / S. Phadtare // Curr. Issues Mol. Biol. – 2004. – V. 6. – P. 125-136. 134 156. Phadtare S. Genome-wide transcriptional analysis of the cold-shock response in wild-type and cold sensitive quadruple-csp-deletion strains of Escherichia coli / S. Phadtare, M. Inouye // J. Bacteriol. - 2004. – V. 186. – P. 7007-7014. 157. Pittman M.S. Cysteine is exported from the Escherichia coli cytoplasm by CydDC, an ATP-binding cassette-type transporter required for cytochrome assembly / M.S. Pittman, H. Corker, G. Wu, M.B. Binet, A.J. Moir, R.K. Poole // J. Biol. Chem. – 2002. – V. 277. – V. 51. – P. 49841-49849. 158. Pomposiello P.J. Genome-wide transcriptional profiling of the Escherichia coli responses to superoxide stress and sodium salicylate / P.J. Pomposiello, M.H. Bennik, B. Demple // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183. – P. 3890-3902. 159. Pomposiello P.J. Redox-operated genetic switches: the SoxR and OxyR transcriptional factors / P.J. Pomposiello, B. Demple // Trends Biotechnol. – 2001. – V. 19. – P. 109-114. 160. Poole R.K. Nitric oxide and nitrosative stress tolerance in bacteria / R.K. Poole // Biochem. Soc. Trans. – 2005. – V. 33. – P. 176-180. 161. Potamitou A. Protein levels of Escherichia coli thioredoxins and glutaredoxins and their relation to null mutants, growth phase, and function / A. Potamitou, A. Holmgren, A. Vlamis-Gardikas // J. Biol. Chem. – 2002a. – V. 277. – P. 18561-18567. 162. Potamitou A. Expression of Escherichia coli glutaredoxin 2 is mainly regulated by ppGpp and σs / A. Potamitou, P. Neubauer, A. Holmgren, A. Vlamis-Gardikas // J. Biol. Chem. – 2002b. – V. 277. – P. 17775-17780. 163. Prieto-Alamo M.J. Transcriptional regulation of glutaredoxin and thioredoxin pathways and related enzymes in response to oxidative stress / M.J. Prieto-Alamo, J. Jurado, R. Gallardo-Madueno, F. Monje-Casas, A. Holmgren, C. Pueyo // J. Biol. Chem. – 2000. – V. 275. – P. 13398-13405. 164. Prinz W.A. The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in Escherichia coli cytoplasm / W.A. Prinz, F. Aslund, A. Holmgren, J. Beckwith // J. Biol. Chem. – 1997. – V. 272. – P. 15661-15667. 135 165. Reisinger E. Antibiotics and increased temperature against Borrelia burgdorferi in vitro // E. Reisinger, I. wendelin, R. Gasser, G. Halwachs, M. Wilders-Trusching, G. Krejs // Scand. J. Infet. Dis. – 1996. – V. – 28. – P.155-157. 166. Reynolds P.E. Structure, biochemistry and mechanism of action of glycopeptide antibiotics / P.E. Reynolds // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 1989. – V. 8. - P. 943-950. 167. Ritz, D. Thioredoxin 2 is involved in the oxidative stress response in Escherichia coli / D. Ritz, H. Patel, B. Doan, M. Zheng, F. Aslund, G. Storz, J. Beckwith // J. Biol. Chem. – 2000. – V. 275. - P. 2505–2512. 168. Rodriguez H. Role of a solvent-exposed aromatic cluster in the folding of Escherichia coli CspA / H. Rodriguez, D. Vu, L. Gregoret // Protein Science. – 2000. – V. 9. – P. 1993–2000. 169. Romero M.Jo.M. The evaluation of Escherichia coli as a model for oxidant stress in mammalian hepatocytes: role of glutathione / M.Jo.M. Romero, A.T. Canada // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1991. – V. 111. – P. 485-495. 170. Rowley D.A. Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals from NADH and NADPH in the presence of iron salts / D.A. Rowley, B. Halliwell // FEBS Lett. – 1982. – V.142. – P. 39–41. 171. Russel M. Construction and characterization of glutaredoxin-negative mutants of Escherichia coli / M. Russel, A. Holmgren // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1988. – V. 85. – P. 990-994. 172. Russel M. Thioredoxin is required for filamentous phage assembly / M. Russel, P. Model // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1985. – V. 82. – P. 29-33. 173. Sailer F. C. Beta-lactam induction of colonic acid gene expression in Escherichia coli // F.C. Sailer, B.M. Meberg, K.D. Young // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - V. 226. - P. 245-249. 174. Samoilova Z. Medicinal plant extracts variously modulate susceptibility of Escherichia coli to different antibiotics / G. Smirnova, N. Muzyka, O. Oktyabrsky // Microbiol. Res. – 2014. - V. 169. - P. 307-313. 136 175. Schindelin H. Crystal structure of CspA, the major cold shock protein of Escherihia coli / H. Shindelin, W. Jiang, M. Inouye, U. Heinemann // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1994. – V. 91. – P. 5119-5123. 176. Schirmer R.H. Glutathione reductase / R.H. Schirmer, R.L. Krauth-Siegel, G.E. Schultz // Coenzymes and Cofactors. - 1989. – P. 553-596. 177. Seaver L.C. Alkyl hydroperoxide reductase is the primary scavenger of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli / L.C. Seaver, J.A. Imlay // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183, P. 7173-7181. 178. Semchyshyn H. Hydrogen peroxide-induced response in E. coli and S. cerevisiae: different stages of the flow of the genetic information / H. Semchyshyn // Centr. Eur. J. Biol. – 2009. – V. 4. – P. 142-153. 179. Shi J. Reactivity of glutaredoxins 1, 2, and 3 from Escherichia coli shows that glutaredoxin 2 is the primary hydrogen donor to ArsC-catalyzed arsenate reduction / J. Shi, A. Vlamis-Gardikas, F. Aslund, A. Holmgren, B.P. Rosen // J. Biol. Chem. – 1999. – V. 274. – P. 36039-36042. 180. Shi Z. Glutathione synthesis is essential for mouse development but not for cell growth in culture / Z. Shi, J. Osei-Frimpong, G. Kala, S.V. Kala, R.J. Barrios, G.M. Habib, D.J. Lukin, C.M. Danney, M.M. Matzuk, M.W. Leiberman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – V. 97. – P. 5101-5106. 181. Shigenaga M.K. Assays for 8-hydroxy-2-deoxyguanosine: a bio-marker of in vivo oxidative DNA damage / M.K. Shigenaga, B.N. Ames // Free Rad. Biol. Med. 1991. - V.10. - P.211-216. 182. Siegenthaler R. Immediate response of DnaK molecular chaperone system to heat shock / R. Siegenthaler, J. Grimshaw, P. Christen // FEBS. Lett. – 2004. – V. 562. – P. 105-110. 183. Sies H. Damage to plasmid DNA by singlet oxygen and its protection / H. Sies // Mutat. Res. – 1993. – V. 299. – P. 183-191. 184. Sies H. Oxidative stress: Oxidants and antioxidants / H. Sies // Exp. Physiol. – 1997. – V. 82. – P. 291-295. 137 185. Sinensky M. Homeoviscous adaptation – a homeostatic process that regulates the viscousity of membrane lipids in Escherichia coli / M.Sinensky // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1974. – V. 71. – P. 522-525. 186. Smirnova G.V. Effects of cystine and hydrogen peroxide on glutathione status and expression of antioxidant genes in Escherichia coli / G.V. Smirnova, N.G. Muzyka, O.N. Oktyabrsky // Biochemistry (Moscow). - 2005. - V. 70. - P. 926-936. 187. Smirnova G.V. Enhanced resistance to peroxide stress in Escherichia coli grown outside their niche temperatures / G.V. Smirnova, N.G. Muzyka, O.N. Oktyabrsky // J. Therm. Biol. – 2007. – V. 32. – 321-327. 188. Smirnova G.V. Influence of polyphenols on Escherichia coli resistance to oxidative stress // G.V. Smirnova, Z.Y. Samoylova, N.G. Muzyka, O.N. Oktyabrsky // 2009. - Free Radic. Biol. Med. – V. 46. – P. 759–768. 189. Smirnova G.V. The role of antioxidant enzymes in response of Escherichia coli to osmotic upshift / G.V. Smirnova, N.G. Muzyka, O.N. Oktyabrsky // FEMS Microbiol. Letters. – 2000. – V. 186. – P. 209-213. 190. Straus D.B. The heat shock response of Escherichia coli is regulated by changes in the concentration of sigma 32 / D.B. Straus, W.A. Walter, C.A. Gross // Nature. – 1987. – V. 329. – No. 6137. – P. 348-351. 191. Takemoto T. Different mechanisms of thioredoxin in its reduced and oxidized forms in defense against hydrogen peroxide in Escherichia coli / T. Takemoto, Q.M. Zhang, S. Yonei // Free Radic. Biol. Med. – 1998. – V. 24. – P. 556-562. 192. Thieringer H. Cold shock and adaptation / H. Thieringer, P. Jones, M. Inouye // BioEssays. – 1998. – V. 20. – P. 49-57. 193. Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione. Application to mammalian blood and other tissues / F. Tietze // Anal. Biochem. - 1969. - V. 27. - P. 502-522. 194. Tomoyasu T. Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease which degrades the heat-shock transcription factor sigma 32 / T.Tomoyasu // EMBO J. – 1995. – V. 14. – P. 2551-2560. 138 195. Tomoyasu T. Levels of DnaK and DnaJ provide tight control of heat shock gene expression and protein repair in Escherichia coli / T. Tomoyasu, T. Ogura, T. Tatsuta, B. Bukau // Mol. Microbiol. – 1998. – V. 30. – No. 3. – P. 567-581. 196. Toumanen E. The rate of killing of Escherichia coli by β-lactam antibiotics is strictly proportional to the rate of bacterial growth / E. Toumanen, R. Cozens, W. Tosch, O. Zak, A. Tomasz // J. Gen. Microbiol. - 1986. - V. 132. - P. 1297-1304. 197. Tuggle C.K. Glutathione reductase is not required for maintenance of reduced glutathione in Escherichia coli K-12 / C.K. Tuggle, J.A. Fuchs // J. Bacteriol. – 1985. – V. 162. – P. 448-450. 198. Van der Vies S. Regulation of chaperonin gene expression / S. Van der Vies, C. Georgopoulos // Chaperonins (Series: Cell Biology, A Series of Monographs). - 1996. – P. 137-166. 199. van der Woude M. Regulation and functionof Ag43 (Flu) / M. van der Woude, I.R. Henderson // Annu. Rev. Microbiol. - 2008. – V. 62. – P. 153-169. 200. VanBogelen R.A. Ribosomes as sensors of heat and cold shock in Escherichia coli / R.A. VanBogelen, F.C. Neidhardt // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - V. 87. P. 5589-5593. 201. Varshavsky A. The N-end rule pathway of protein degradation / A. Varshavsky // Genes Cells. – 1997. – V. 2. – P. 13–28. 202. Visick J. RpoS- and OxyR-independent induction of HPI catalase at stationary phase in Escherichia coli and identification of rpoS mutation in common laboratory strains / J. Visick, S. Clark // J. Bacteriol. – 1997. – V. 179. – P. 4158-4163. 203. Vlamis-Gardikas A. Characterization of Esherichia coli null mutants for glutaredoxin 2 / A. Vlamis-Gardikas, A. Potamitou, R. Zarivach, A. Hochman, A. Holmgren // J. Biol. Chem. - 2002. - V. 277. - P. 10861-10868. 204. Vlamis-Gardikas A. Cloning, overexpression, and characterization of glutaredoxin 2, an atypical glutaredoxin from Escherichia coli / A. Vlamis-Gardikas, F. Aslund, G. Spyrou, T. Bergman, A. Holmgren // J. Biol. Chem. – 1997. – V. 272. – P. 11236-11243. 139 205. Wang J.M. Crystal structure determination of Escherichia coli ClpP starting from an EM-derived mask / J.M. Wang, J.A. Hartling, J.M. Flanagan // J. Struct. Biol. – 1998. – V. 124. – P. 151-163. 206. Wang N. CspI, the ninth member of the CspA family of Escherihia coli, is induced upon cold shock / N. Wang, K. Yamanaka, M. Inouye // J. Bacteriol. – 1999. – V. 181. – P. 1603-1609. 207. Wang X. Contribution of oxidative damage to antimicrobial lethality / X. Wang, X. Zhao // Antimicrob. Agents Chemother. – 2009. – V.53. – P. 1395–1402. 208. White-Ziegler C. Low temperature (23 ºС) increases expression of biofilm-, coldshock,- and RpoS-dependent genes in Escherichia coli K-12 / C. White-Ziegler, S. Um, N. Perez, A. Berns, A. Malhowski, S. Young // Microbiology. – 2008. - V. 154. – P. 148-166. 209. Woodmansee A. N. Reduced flavins promote oxidative DNA damage in nonrespiring Escherichia coli by delivering electrons to intracellular free iron / A.N. Woodmansee, J.A. Imlay // J. Biol. Chem. – 2002. – V. 277. – P. 34055-34066. 210. Xia, B. The role of RbfA in 16S rRNA processing and cell growth at low temperature in Escherichia coli / B. Xia, H. Ke, U. Shinde, M. Inouye // J. Mol. Biol. – 2003. V. 332. – P.575-584. 211. Yamanaka K. The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation / K. Yamanaka, L. Fang, M. Inouye // Mol. Microbiol. – 1998. – V. 27. – P. 247-255. 212. Yeom J. Iron homeostasis affects antibiotic-mediated cell death in Pseudomonas species / J. Yeom, J.A. Imlay, W. Park // J. Biol. Chem. – 2010. – V. 285. – P. 2268922695. 213. Yura T. Regulation of the heat-shock response / T. Yura, K. Nakahigashi // Curr. Opin. Microbiol. – 1999. – V. 2. – No. 2. – P. 153-158. 214. Zhang A. The OxyS regulatory RNA represses rpoS translation and binds the Hfq (HF-I) protein / A. Zhang, S. Altuvia, A. Tiwari, L. Argaman, R. Hengge-Aronis, G. Storz // EMBO J. – 1998. – V. 17. – P. 6061–6068. 140 215. Zheng M. DNA microarray-mediated transcriptional profiling of the Escherichia coli response to hydrogen peroxide / M. Zheng, X. Wang, L.J. Templeton, D.R. Smulski, R.A. LaRossa, G. Storz // J. Bacteriol. – 2001. – V. 183. – P. 4562-4570. 216. Zhu X. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK / X. Zhu, X. Zhao, W.F. Burkholder, A. Gragerov, C.M. Ogata, M.E. Gottesman, W.A. Hendrickson // Science. – 1996. – V. -272. – P. 1606-1614.
