Лабораторная диагностика инфекционного мононуклеоза
advertisement
Лабораторная диагностика инфекционного мононуклеоза Инфекционный мононуклеоз (синонимы: болезнь Филатова, железистая лихорадка, моноцитарная ангина, болезнь Пфейфера и др.) – общее системное лимфопролиферативное заболевание, которое чаще всего вызывается вирусом Эпштейна–Барр Toxoplasma gondii и цитомегаловирус, вирус иммунодефицита человека, вирус герпеса человека 6 типа, являющийся причиной детской розеолы, могут вызывать клинически подобные заболевания История Впервые заболевание было описано Н. Ф. Филатовым в 1885 г. под названием «идиопатическое воспаление шейных желез» В 1889 г. немецкий ученый Pfeiffer описал это заболевание под названием — железистая лихорадка В 1907 г. Turk, а в 1909 г. Burns выявили характерные изменения в крови при этом заболевании В 1920 г. Спринт и Эванс описали «новое» заболевание под названием «инфекционный мононуклеоз», характерными для которого являются гематологические изменения в виде лейкоцитоза с выраженным моноцитозом и лимфоцитозом Спустя год эти авторы сообщили, что инфекционный мононуклеоз и железистая лихорадка являются одним и тем же заболеванием Schneider с соавторами (1964) установили, что возбудителем заболевания является вирус Эпштейна–Барр Вирион состоит из капсида диаметром 120—150 нм, окруженного оболочкой, содержащей липиды Вирус Эпштейна–Барр - ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Herpesviridae, подсемейству Gamma Herpesviridae, роду Lymphocryptovirus - является вирусом герпеса человека 4 типа Инфекционный мононуклеоз Заболевание, встречающееся во всех странах мира Чаще всего подвержены заболеванию группы детей и молодых людей, живущих вместе, например в школах-интернатах, студенческих общежитиях, военных лагерях До 60% заболевших лица в возрасте 2–20 лет В последние годы во всем мире наметился рост заболеваемости этой инфекцией Заражение происходит при передаче вируса воздушно-капельным путем Патогенез Входными воротами при инфекционном мононуклеозе является слизистая оболочка ротоглотки и верхних дыхательных путей. Проникая в организм через слизистую оболочку ротоглотки и верхних дыхательных путей, вирус вызывает характерные изменения: поражение миндалин, слизистой оболочки носоглотки, что клинически проявляется затрудненным носовым дыханием, отечностью зева При этом создаются благоприятные условия для присоединения вторичной микробной флоры и возникновения более тяжелой ангины с наложениями Вирус строго лимфотропен. На поверхности В-лимфоцитов и эпителиальных клеток имеются рецепторы к вирусу Эпштейна-Барр - CR2, которые одновременно служат рецепторами фрагмента компонента комплемента C3d Рецептор CR2 представлен на поверхности таких клеток, как B-клетки, дендритные клетки, эпителий шейки матки и носоглотки Присоединяясь к CR2-рецептору клеточной мембраны В-лимфоцитов, вирус вызывает пролиферацию поликлональных Влимфоцитов с соответствующим увеличением миндалин, системной лимфопатией и спленомегалией В-лимфоциты трасформируются (приобретают способность к бесконечному делению) и при отсутствии адекватного клеточного иммунного ответа этот процесс может эволюоцинировать в явно злокачественный (например, Х-связанный лимфопролиферативный синдром) Если факторы клеточного иммунитета контролируют репликацию вируса Эпштейна–Барр в организме, то клинические симптомы инфекционного мононуклеоза постепенно исчезают, а лимфоаденопатия и спленомегалия уменьшаются Подобно другим герпесвирусам, вирус Эпштейна– Барр может сохраняться в виде латентной инфекции (его ДНК содержится в ядре небольшого количества В-лимфоцитов) Эпизодическая асимптоматическая реактивация инфекции является обычным явлением, и около 20 % здоровых молодых людей выделяют вирус Эпштейна–Барр со слюной У лиц с поврежденным клеточным иммунитетом (СПИД, реципиенты трансплантатов, атаксическая телеангиэктазия) может развиться явная реактивная инфекция с волосистой лейкоплакией, интерстициальным пневмонитом и в виде моноклональной В-клеточной лимфомы С вирусом Эпштейна–Барр связывают этиологию назофарингеальной карциномы и лимфомы Беркитта Иммунный ответ на инфицирование Пролиферация поликлональных Влимфоцитов при инфицировании вирусом Эпштейна–Барр, генерирует большое количество разнообразных аутоантител в организме больного, таких как IgM-анти-i (холодовой агглютинин), ревматоидный фактор, антинуклеарные антитела Большинство необычных иммуноглобулинов, которые появляются при инфекционном мононуклеозе получили название гетерофильных антител Пауля– Буннеля Эти антитела относятся к классу IgM, имеют сродство к бараньим и лошадиным эритроцитам, и не направлены к каким-либо антигенам вируса Гетерофильные антитела являются случайными продуктами Влимфоидной пролиферации (наведенной вирусом ЭпштейнаБарр), которые появляются в первую неделю заболевания, снижаются при выздоровлении, и их обычно не обнаруживают через 3–6 мес Вскоре после инфицирования Влимфоцитов обнаруживается ранний антиген (early antigen – EA) Он не является структурным вирусным компонентом, а белком, необходимым для репликации вируса Эпштейна–Барр К раннему антигену в организме больного синтезируется антитела классов IgМ и IgG По мере распространения инфекции, во всех клетках в больших количествах появляются геномы вируса Эпштейна–Барр (уникальные антигены): Антиген вирусного капсида (VCA) Мембранный антиген (MА) Ядерный антиген (EBNA) - ответственен за его дупликацию и выживание По мере стихания инфекционного процесса небольшой процент инфицированных вирусом Эпштейна–Барр В-лимфоцитов избегают иммунной деструкции и сохраняют вирусный геном в латентной форме В ответ на вирусные антигены синтезируются специфические антитела, которые являются ценными маркерами стадии заболевания Диагностика Изменения в клиническом анализе крови: лейкоцитоз до 10–20•109/л с лимфомоноцитозом (до 90–95%), наличием широкоплазменных и базофильных лимфоцитов специфическим проявлением инфекционного мононуклеоза является наличие атипичных лимфоцитов (до 10 % и более от общего количества лимфоцитов) атипичные лимфоциты обнаруживают в крови с начала периода клинических проявлений инфекции их уровень в крови достигает пика к концу 2-й началу 3-й нед и может держаться до 1,5–2 мес полное исчезновение обычно происходит к началу 4-го месяца от начала заболевания атипичные лимфоциты относительно нечувствительный признак инфекции, но имеет общую специфичность около 95 % при исследовании обычных мазков крови атипичные мононуклеары выявляются в 20-86 % случаев, лейкоконцентрация позволяет обнаружить их у всех больных так как в небольшом количестве атипичные мононуклеары могут наблюдаться при различных инфекциях (цитомегаловирусной, герпетической 6 типа, острых респираторных вирусных инфекциях, ветряной оспе, кори, инфекционных гепатитах, токсоплазмозе и др.), диагностическим для инфекционного мононуклеоза считается содержание их 10 % и более в периферической крови Серологические методы диагностики Неспецифические антитела В 1932 г. Паулем и Буннелем (Paul, Bunnell) была предложена реакция, основанная на обнаружении в сыворотке крови больного инфекционным мононуклеозом противобараньих агглютининов Тест позволяет выявлять гетерофильные антитела в сыворотке крови больного Титр гетерофильных антител 1:224 и выше является диагностическим и подтверждает диагноз инфекционного мононуклеоза Тест бывает положительным у 60 % молодых лиц через 2 нед и у 90 % – через 4 нед от начала клинических проявлений заболевания Поэтому для диагностики инфекционного мононуклеоза необходимо проводить несколько исследований – на 1-й нед заболевания (реакция может быть отрицательной) и через 1–2 нед (реакция может стать положительной) Уровень гетерофильных антител снижается по окончании острого периода инфекционного процесса, однако их титр можно определить в течение 9 мес после появления клинических симптомов Реакция Пауля–Буннеля может превратиться из положительной в отрицательную даже когда имеются остаточные гематологические и клинические симптомы у пациента Чувствительность метода у взрослых составляет 98 %, специфичность 99 % У детей в возрасте до 2-х лет гетерофильные антитела выявляются только у 30 % больных, в возрасте 2–4 года – у 75 %, старше 4 лет – более чем у 90 %. Чувствительность метода у детей составляет менее 70 %, специфичность – 20 % Снижение, а затем повторное повышение титра геторофильных антител может иметь место в ответ на другую инфекцию (наиболее часто при вирусных инфекциях верхних дыхательных путей) Реакция Пауля–Буннеля не специфична для вируса Эпштейна–Барр Титр гетерофильных антител не дает перекрестной реакции и не коррелирует со специфическими антителами к вирусу Эпштейна–Барр Нет корреляции с тяжестью течения заболевания Тест бесполезен для диагностики реактивации инфекционного мононуклеоза (положителен только у около 10 % пациентов) Титры 1:56 и менее могут быть обнаружены у здоровых людей и у пациентов с другими заболеваниями (ревматоидный артрит, краснуха) Антитела к раннему антигену (early antigen – EA) Антитела к раннему антигену вируса Эпштейна–Барр IgG, представляют собой антитела к D-компонету белка необходимого для репликации вируса (анти-ЕА-D IgG) Они появляются еще в острый период первичной инфекции и быстро исчезают с выздоровлением Определение антител анти-ЕА-D IgG - это тест для ранней диагностики острой первичной инфекции длительное выявление высоких титров анти-ЕА-D IgG свидетельствует о сохраняющейся активности процесса и переходе в хроническую форму иногда анти-ЕА-D IgG обнаруживаются у вирусоносителей и увеличение их титров является индикатором реактивации инфекции Оценка результатов исследований методом ИФА Антитела к раннему антигену вируса Эпштейна–Барр класса IgG: результат может быть отрицательным или положительным Титр антител не указывается Обнаружение антител IgG к раннему антигену Эпштейна–Барр свидетельствует об острой инфекции Оценка результатов исследования методом иммунохемилюминисцентного анализа Антитела анти-ЕА-D IgG к вирусу Эпштейна– Барр: менее 10 Е/мл - результат отрицательный 10-40 Е/мл - результат сомнительный («серая» зона) более 40 Е/мл - результат положительный. Сомнительные результаты должны быть повторены через 5-7 дней и в случае получения аналогичных данных расцениваются как отрицательные Вирусспецифические антитела Антитела к капсидному антигену вируса Эпштейна–Барр IgМ (анти-VCA IgМ): появляются в крови очень рано, обычно до клинических симптомов и обнаруживаются в начале заболевания в 100 % случаев высокие значения бывают на 1–6 нед от начала инфекции, начинают снижаться с 3-й нед и обычно исчезают чере 1–6 мес анти-VCA IgМ почти всегда присутствуют в сыворотке при активной инфекции, поэтому очень чувствительны и специфичны для острого эпизода инфекционного мононуклеоза наличие анти-VCA IgМ в крови больного в высоких титрах более 3 мес свидетельствует о затяжном течении инфекционного мононуклеоза и иммунодефицитном состоянии Оценка результатов исследований методом ИФА Антитела к капсидному антигену вируса Эпштейна–Барр класса IgМ: результат может быть отрицательным или положительным Титр антител не указывается Обнаружение антител IgМ к капсидному антигену вируса Эпштейна–Барр свидетельствует об острой инфекции Оценка результатов исследования методом иммунохемилюминисцентного анализа Антитела анти-VCA IgМ к вирусу Эпштейна– Барр: менее 20 Е/мл - результат отрицательный; 20-40 Е/мл - результат сомнительный («серая» зона) более 40 Е/мл - результат положительный Сомнительные результаты должны быть повторены через 5-7 дней и в случае получения аналогичных данных расцениваются как отрицательные Антитела к капсидному антигену вируса Эпштейна–Барр класса IgG (анти-VCA IgG): могут появиться рано (1–4 нед), достигают пика ко 2-му месяцу заболевания в начале заболевания обнаруживаются в 100 % случаев только у 20 % пациентов выявляют 4кратное увеличение титра при исследовании парных сывороток методом ИФА титр снижается при выздоровлении, но обнаруживается в течение нескольких лет после перенесенной инфекции, поэтому бесполезен для диагностики инфекционного мононуклеоза Наличие анти-VCA IgG свидетельствует о состоянии после инфекции и иммунитете высокий титр (более 1:320) или 4кратный подъем титра анти-VCA IgG в течение болезни свидетельствует в пользу острой первичной инфекции постоянное присутствие антител к раннему антигену (анти-ЕА-D IgG) и анти-VCA IgG в высоких титрах указывают на хроническую фазу инфекции высокий уровень анти-VCA IgG выявляют у больных с лимфомой Беркитта и назофарингеальной карциномой Оценка результатов исследования методом иммунохемилюминисцентного анализа Антитела класса IgG к капсидному антигену вируса Эпштейна–Барр: менее 20 Е/мл - результат отрицательный более 20 Е/мл - результат положительный Антитела к ядерному антигену класса IgG EBNA (анти-EBNA IgG ): появляются позже всех, редко выявляются в острой фазе заболевания их уровень возрастает в период выздоровления (3–12 мес) могут сохраняться в крови в течение многих лет после болезни отсутствие анти-EBNA IgG при наличии анти-VCA IgМ и анти-ЕА IgG свидетельствует о текущей инфекции обнаружение анти-EBNA IgG после ранее негативной реакции свидетельствует о существующей инфекции отсутствие анти-EBNA IgG свидетельствует о наличии иммунодефицита (дефекте Тклеточного звена иммунитета) при использовании метода ИФА можно одновременно определить анти-EBNA классов IgM и IgG. Если анти-EBNA IgM больше анти-EBNA IgG – острая инфекция, при обратном соотношении – ранее перенесенная Оценка результатов исследования методом иммунохемилюминисцентного анализа Антитела класса IgG к ядерному антигену вируса Эпштейна–Барр (анти-EBNA IgG): менее 5 Е/мл - результат отрицательный; 5-20 Е/мл - результат сомнительный («серая» зона); более 20 Е/мл - результат положительный. Сомнительные результаты должны быть повторены через 5-7 дней и в случае получения аналогичных данных расцениваются как отрицательные Алгоритм обследования пациентов с подозрением на инфекционный мононуклеоз Клинические признаки инфекционного мононуклеоза Определение гетерофильных антител в сыворотке Гетерофильные антитела обнаружены? Да Инфекционный мононуклеоз, обусловленный вирусом Эпштейна–Барр (около 70 %) Инфекционный мононуклеоз, обусловленный вирусом Эпштейна–Барр (около 10 %) Нет Определение анти-VCA IgМ в сыворотке Да Анти-VCA IgМ обнаружены? Нет Инфекционный мононуклеоз, обусловленный: цитомегаловирусом (5–10 %) Toxoplasma gondii (около 2 %) вирусом герпеса человека 6 типа (около 2 %) вирусом иммунодефицита (ВИЧ) (менее 1%) этиологический агент не установлен (5–10 %) Обнаружение вируса ЭпштейнаБарр методом ПЦР ПЦР позволяет качественно определять ДНК вируса Эпштейна-Барр в соскобах слизистых оболочек (уретра, цервикальный канал, стенки влагалища, секрет предстательной железы, осадок мочи) и в крови Определяемым фрагментом служит область последовательности гена рецепторного белка вируса Эпштейна-Барр Аналитическая чувствительность метода ПЦР составляет не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл, прошедшей выделение ДНК пробы, специфичность - 98 % В слюне вирус обнаруживается в конце инкубационного периода болезни, в период ее разгара и иногда спустя 6 месяцев и более после выздоровления Выделение вируса отмечается у 10— 20% лиц, в прошлом перенесших инфекционный мононуклеоз Вирусы Эпштейна-Барр в латентной форме могут сохраняться в Влимфоцитах и в эпителии слизистой оболочки ротоглотки Оценка результатов метода ПЦР Обнаружение ДНК вируса Эпштейна-Барр в исследуемом материале указывает на этиологическую роль вируса в развитии заболевания при наличии соответствующей клинической картины Однако из-за того, что вирус ЭпштейнаБарр может длительно персистировать в организме пациента и, соответственно, обнаруживаться в исследуемого материале, оценить его роль в развитии заболевания не всегда возможно Критерии хронического инфекционного мононуклеоза: I. Перенесенное не более чем за 6 мес тяжелое заболевание, диагностированное как первичное заболевание инфекционным мононуклеозом или ассоциированное с необычно высокими титрами антител к вирусу Эпштейна-Барр (антитела класса IgM) к капсидному антигену вируса в титре 1:5120 и выше или к раннему вирусному антигену в титре 1:650 и выше. 2. Гистологически подтвержденное вовлечение в процесс ряда органов: 1) интерстициальная пневмония 2) гипоплазия элементов костного мозга; 3) увеит 4) лимфаденопатия 5) персистирующий гепатит 6) спленомегалия 3. Нарастание количества вируса ЭпштейнаБарр в пораженных тканях (доказанное методом гистохимической иммунофлуоресценции с ядерным антигеном вируса Эпштейна—Барр или ПЦР)
