ГИДРАЗИД МАЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

АКАДЕМИЯ НАУК УССР
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ
ТРОЯН В. М.
ГИДРАЗИД МАЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИНГИБИТОР ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ И АЗОТИСТЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Автореферат
диссертации, представленной на соискание
ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель — доктор биологических наук,
профессор КАЛИНИН Ф. Л.
КИЕВ— 1966
6)•nil
i. 9, m.i,-jj
<<л/и lyyf'-
)ММ*
С
•
/7
//
'(/ f/
,
АКАДЕМИЯ НАУК УССР
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ
ТРОЯН В. М„
Гидразид малеиновой кислоты —
ингибитор обмена йуклеиновых
кислот и азотистых соединений
Автореферат
диссертации, представленной на соискание
ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель — доктор биологических наук,
. •
профессор КАЛИНИН Ф. Л. ,
-/
Цепрадыи Научяая Баблмте*» f
МОСКОВСКОЙ «рд. Левина Сели та..
Академия «и. К,л A, Jn.jngsjtB*
№
КИЕВ — 1966
Диссертационная работа выполнялась в лаборатории физио­
логии роста и развития растений на протяжении 1962—1965 гг.
Диссертация' изложена на 233 страницах машинописи и со­
стоит из введения, обзора литературы, пяти глав эксперимен­
тального материала, обсуждения результатов и выводов. В
работе приведено 52 таблицы и 62 рисунка.
Список использованной литературы включает 288наимено :
ваний, в том числе 213 на иностранных языках.
,.\
,;. . .
• ; » i
i ' ,
. •
;.'
. .
.? ~'\
.'•.....,•
•-
•
•
" •''
,"..
.
:
.
t
-' .защита диссертации состоится в Институте физиологии рас> •
тений АН УССР
'.
•'
1966 г.
Отзывы на автореферат просим направлять по адресу:
Киев-22, Васнльковская, 49, секретарю Ученого Совета.
<*
В решениях декабрьского Пленума • ЦК КПСС (1963 г.)
указывается, что ускоренное развитие химической промыш­
ленности является одним из главных'условий повышения про­
дуктивности сельскохозяйственного производства.
^Важное место в химизации сельского хозяйства на совре­
менном этапе должны занять биологически активные, веще­
ства, применяемые как средства управления рортом, развити­
ем и другими жизненными процессами растений с целью по­
вышения их продуктивности, уменьшения потерь при выращи­
вании, уборке и хранении урожая. Среди них большое прак• тическое значение имеет применение химических соединений,
способных, затормозить или прекратить рост растений. По
мнению многих исследователей (Webber, 1955; Ракитин, 1961;
Крафтс, 1963 и др.) одним из самых эффективных ингибиторов
ростовых процессов является гидразид'малешювой кислоты,
сокращенно обозначаемый ГМК. -.
/
•'•'..
Результаты исследований, посвященных изучению физио­
логии действия и возможностей практического применения
этого соединения, сведены в ряде обзоров (White, 1952; Zukel,
1954; Radwany, 1955; Weller at al., 1957; Баскаков, 1958; Коз­
лова', 1962; Крафтс, 1963; Калинин, Мережинский,. 1965)Л
'«• Однако остается дискуссионным, вопрос о механизме ростингибирующего влияния этого вещества. Соответственно мно. госторшнему воздействию ГМК на процессы метаболизма в
растении, существует и несколько точек зрения на способ его
•действия. Основные из них следующие:
ГМК является антиауксином (Leopold, Klein, 1951; Andreae,
1952, 1954; Ракитин, Сваринская, 1957).
ГМК угнетает рост через'торможение митозов (Greulach
Atchison, 1950; Darlington, Mc Leish, 1951; Carlson,J954; Gif
^ ford, 1956).
•
ГМК — дыхательный ингибитор (Naylor, Davis, 1951; Isenberg at al., 1951, 1954).
•
ГМК нарушает нормальную дифференциацию флоэмы и
приводит к некрозу сосудистой системы (Mc Ilrath, 1950; Cur­
rier at al., 1951; Крафтс, 1963).
3
ГМК подавляет активность дегидраз и других соединений,
реагируя с сульфгидрильными группами (Mnir, Hansh, 1953;
Dugnani, 1954). '
•
'
ч
ГМК, являясь структурным аналогом урацила, >фгибирует
рост растений, вмешиваясь в синтез нуклеиновых кислот
; (Kihlman, 1952; Greulach, 1955; Баскаков, 1958; Бутенко,
Баскаков, 1960; Поволоцкая с сотр., 1960). •
На наш взгляд особого внимания заслуживает последнее
предположение о заместительном антагонистическом взаимо­
действии гидразида малеиновой кислоты и урацила при син­
тезе нуклеиновых кислот, которое предполагает связь между
ростингибирующим влиянием ГМК и образованием нуклеино- t
вых кислот, ответственных.за ростовые и формообразователь­
ные процессы. Учитывая опыты Грейлаха (Greulach; 1955) о
снятии ростингибирующего влияния ГМК не только урацилом,
но и тимином', мы предположили далее, что ГМК. может вы­
ступать антиметаболитом и тимина, молекула которого отли=
чается от структуры молекулы урацила лишь наличием метилыюй группы у 5-го углеродного атома.
В связи с вышеизложенным, задачей наших исследований
было изучение влияния раздельной и совместной обработки
растений растворами гидразида малеиновой кислоты.и пиримидиновых оснований урацила и тимина на-содержание и
.*• состав нуклеиновых кислот, а также на азотистый и амино­
кислотный обмены растений сахарной свеклы с целью выясне­
ния механизма действия ГМК.. Кроме этого, в виду возмож- .
ности практического применения ГМК в растениеводстве для
подавления израстания корней в зимний период, изучалось
влияние гидразида
малеиновой кислоты и пиримидинбв на
накопление-и превращение Сахаров (интенсивность дыхания,
активность окислительно-восстановительных ферментов) ••, в
корнеплодах при уборке и. через пять месяцев хранения. На- ,
конец, была предусмотрена проверка некоторых, полученных
in vivo закономерностей, на культуре ткани in vitro.
Исследования проводились в 1962—1965 гг. В качестве
объекта были взяты растения сахарной свеклы сорта Рамонский-06. Выращивание материала в полевых условиях произ­
водилось на опытном участке Института физиологии растений
АН УССР, а экспериментальная «асть и культивирование тка­
ней сахарной свеклы in vitro — в лаборатории физиологии
роста и развития растений.
Мы использовали ГМК в.виде триэтаноламинбвой-соли
30%-й концентрации в расчете на действующее начало. Обра­
ботка проводилась путем опрыскивания ботвы при помощи
4
,х
ручного пульверизатора водными растворамиТМК в двух кон­
центрациях — 0,3%.и 1% из расчета 1000 л/га. Урацил и тимин
применялись в чистом виде в количестве 10 мг/л (0,001%).
Часть растений, обработанных 0,3%-ным раствором ГАЖ, че­
рез два дня опрыскивались растворами пиримидинов.
Чтобы охватить различные фазы развития растений, опрыст
кивание проводилось в два qpoKa: за 90 дней (обработка
17.VII) и за 45 дней (обработка 3.IX) до уборки. За контроль
принимались растения, опрысканные.водой.
Содержание РНК определяли по методу Шмидта и Тангаузена (Ванюшин, 1964), ДНК—по реакции с дифениламином
(Burton, 1956); нуклеотидный состав'нуклеиновых кислот по
методу Спирина и Белозерского в описании Ванюшина (1964)
с заменой электрофореза нисходящей хроматографией на бу­
маге для разделения нуклеотидов РНК. Растворимый.азот и
его формы определялись по методике Ястрембовича и Калипина (1962), белковый — по Калинину и Ястрембовичу-(1963),
аминокислоты — по схеме Зайцевой и Тюленевой (1958). Ды­
хание корнеплодов изучали методом Толмачева (1950),
са­
хара — по прописи Починка (1958), активность перочксидазы
и полифенолоксидазы по методике Keilin и Mann (1938).
Влияние ГМК, урацила и тимина на содержание
и нуклеотидный состав нуклеиновых кислот
Изменения в обмене нуклеиновых кислот при введении
этих веществ исследовались в точках роста корнеплодов са­
харной свеклы. Полученные данные показывают (табл. 1), что
нанесение гидразида малеиновой кислоты вызывает снижение
содержания рибонуклеиновой кислоты,, причём степень сни­
жения пропорциональна концентрации препарата. Это свиде­
тельствует об угнетении гидразидом реакций образования
РНК. Пиримидиновые основания оказывают противоположный
эффект: под .влиянием урацила и тимина содержание РНК
увеличивается по сравнению с контрольным вариантом. "
Последовательная обработка растений ГМК (0,3%) и урацилом'или ГМК и тимином приводит к частичному снятию пиримидинами ингибирующего влияния ГМК на, синтез РНК. Со
временем содержание РНК в вариантах ГМК — 0,3%'+урацил
и ГМК—0,3% -Ьтимин повышается по сравнению с вариантом",
где обработка проводилась только 0,3%-ным раствором ГМК,
и в образцах, отобранных 4.VIII, даже выше контроля.
Аналогичные зависимости обнаружены при изучении содер­
жания дезоксирибонуклеиновой кислоты в точках роста обра. '
5
ботанных растений (таблица 2). Как видно из приведенных
данных, в присутствии ГМК содержание ДНК в точках роста
снижается. Особенно сильно угнетает синтез ДНК 1%-ная
концентрация гидразида: в образцах последнего срока-отбора
(9.VIII) в этом варианте содержится всего 1,81 /чг ДНК на
грамм сухого вещества, а в контроле — 3,84.
Таблица I
Рибонуклеиновая кислота в точках роста сахарной свеклы
(в мг на 1' г сухого вещества, обработка 17.VII)
Варианты
0>
М
н л
• 51
Д5 •
Ч ч
оК оО.
22.VH
25. VII
30. VII
4.VIII
9.VIII
20,26
21,01
21,16
20,19
20,78
1
5«[
U o
^ 5£
19,22
19,85
18,37
16,04
17,12
£
1+
N3
SfO
у
:*£
l-fS™.
U O
T
19,85
21,72
22,60
22,10
21,35
18,00
18,90
19,26
20,87
20,43
20,09
21,80
21,26
21,82
21,47
t-o"
18,15
19,98
20,09
21,12
19,40
1
Ъ£
su *u
15,01
13,25
13,70
12,00
11,42
У—урацил, Т — тимин.
Таблица 2
Дезоксирибонуклеиновая кислота в точках роста сахарной свеклы
(мг на 1 г сухого вещества, обработка 17.V1I)
Варианты
о
. с к
о а
• 2 «»
га (ц
Ч ч
22.VII
25.VII
30.VH
4.V1II
1
оо
и о.
UO '
3,82
3,67
3,57
3,39
3,06
aviii
У - у рацнл, Т — тимин.
4,36
i 4,99,
. 4,72
4,77
3,84
! H
i >=
1+
5 «я
У
uo
3,80
4,10
3,75
3,60
3,09
4,33
4,81
4,76
4,97 ,
4,45
1+
5" со
U o
4,43
4,56
4,06
3,97
3,89
1
. т
u,—.
4,84
5,21
4,46
4,80
4,77
3,39
2,70
2,30
2,70
1,81
Под" влиянием урацила содержание ДНК остается почти
на уровне контроля и только под конец несколько увеличива­
ется; тимин же вызывает более заметное усиление синтеза
ДНК. Совместная обработка свеклы ГМК (0,3%) и пиримидинами, как и в случае РНК, отчасти снимает угнетающее
6
действие ГМК. Тимин в этом, отношении оказался более эф­
фективным, чем урацил.
,
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что
под влиянием гидразида малеиновой кислоты происходит глу­
бокое торможение биосинтеза как рибонуклеиновой, так и
дезоксирибонуклеиновой кислот в точках роста сахарной свек­
лы. Это согласуется с результатами опытов по воздействию
ГМК ла ростки,картофеля (Поволоцкая, 1961) и клетки хло­
реллы (Kim, Greulach, 1963). Кроме этого, данные анализов
указывают также на наличие антиметаболитических взаимо-.
отношений между ГМК и пиримидино!ВЫми\пролзводными —
урацилом и тимином, что проявляется в частичном снятии по­
следними ингибирующего влияния ГМК на образование ну­
клеиновых кислот..
>
\
Исходя из предположения о заместительном антагрнистическом взаимодействии гидразида малеиновой кислоты, с од­
ной стороны, урацила и тимина — с другой, представлял .инте­
рес вопрос о влиянии ГМК на содержание пиримидиннуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот.
Результаты определения нуклеотидного состава РНК пока­
зали (табл. 3), что в присутствии ГМК происходит снижение
содержания уридинмонофосфата в молекуле РНК:
•
Таблица 3
Нуклеотидный соста^ РНК в точках роста сахарной свеклы
(обработка 17.V1I, определение 9.VIII)
Варианты
молярные проценты
отклонение от среднего±0,6
Г
:
у
Ц
•'•
. А
.А+Г
У+Ц
Г+Ц
А+У
1,18
0,93
0,96
0,92
0,88
1,22
1,38
1,27.
1,32
1,55
/
Контроль
ГМК—0,3%
ГМК—0,3+У
ГМК—0,3+Т
ГТ—1%.
30,3
24,8
25,2
26,5
23,0
20,9
18,8
20,0
21,6
15,6
4
25,9
32,6
31,9
30,6
37,3
25,1
22,8
24,8
21,7
23,3
.•
Г — гуаниловая кислота (ГМФ), У — уридиловая кислота (УМФ),
Ц — цитидиловая кислота (ЦМФ), А — адениловая кислота (АЛ1Ф).
Однако, кроме этого, уменьшается количество и гуанилового нуклеотида, причем даже в большей степени, чем УМФ:,
от 30,3 молярных процентов в контроле до 23 при обработке
1%-ной концентрацией ингибитора. Заметно падает также и
содержание другого пуриннуклеотида — аденозинмонофосфор-
ной кислоты. В результате уменьшается соотношение пурины/
пиримидины от 1,18 в контроле до 0.88 в варианте ГМК — 1 % .
Величина коэффициента специфичности '(ГЦ), наоборот, по­
вышается за счет увеличения количества цитидиннуклеотида.
При обработке растений ГМК (0,3%) и урацилом наблю­
дается обратная картина: немного повышается количество
ГМФ, АМФ и УМФ и снижается содержание цитидилового
нуклеотида. • Это приводит к повышению соотношения
А + Г/У+Ц. В варианте ГМК+тимин также увеличивается
содержание ГМФ и УМФ по сравнению с вариантом —
ГМК—0.3%, однако количество АМФ еще больше падает, в
результате чего отношение пурины/пирнмидины ниже, чем при
нанесении только 0,3%-го раствора ГМК.
Под влиянием гидразида малеиновой кислоты- происходят
изменения и в нуклеотидном составе ДНК,, выделенной из то­
чек роста обработанных растений сахарной свеклы (табл. 4):
,
•
'
Таблица 4 '
Нуклеотидкый состав ДНК точек роста сахарной свеклы
(обработка 17.VII, анализ 9.VIII)
\
молярные проценты .
отклонение от среднего ±042—0,3
Варианты
Г
А
•>
Т
А4-Г
А+Т
мц1 т-ьш-мц г+ц+мц
Ц
-
1,39
27,77 20,00 26,86 13,83 5,46
1.03
Контроль
1,08
25,80 19,30 25,20 20.58 7,50
0,85
ГМК—0,3% '
22,23
1,31
30,30 14,33 6,50
0,95
ГМК—0,3%+У 26.26
23,00
1,27
29,43 13,94 5,84
•0,98
ГМК—0,3%+ Т 25,10
0,93
'24,00 17,70 20,68. 22,00 .8,50
0,81
ГМК—1%
А—аденин; Г—гуанин; Т—тимин; Ц—цитозин; МЦ—метилцитозин.
уменьшается содержание аденина, тимина и гуанина н по-1
вышается количество цитозина и метнлцитозина. Это приводит
к понижению соотношения пурины/пиримидины от 1,03 в* контроле до 0,81 при концентрации ГМК—1%. Снижается также и
величина коэффициента специфичности. Совместное нанесение
ГМК с урацилом увеличивает^ количество пуриновых основа­
ний и тимина, а содержание цитозина и 5-метилцитозина, на­
оборот, уменьшается по сравнению с вариантом ГМК—0,3%.
При обработке растении тимином после нанесения ГМК—0,3%
молярное количество аденина еще снижается, но содержание
цитозина и 5-метилцитозина приближается к контролю, а гуа8-
.
,
!
'
,
•
.
•
нина и тимина—даже больше контроля. И в результате близка
к контролю величина отношения пуриновых оснований- к пнримидиновым.
* . • •
+
Из полученных данных следует, что гидразид малеиновой
кислоты, по-видимому, угнетает включение в молекулы нукле­
иновых кислот не только уридин- и тимидиннуклеотидов, но и
пуриннуклеотидов; включение же цитидиннуклеотида, наобо­
рот, заметно увеличивается, вследствие чего повышается со­
держание его и в РНК и в ДНК. При совместной, обработке
растений растворами ГМК (0,3%) и пиримидинов нуклеотидный состав нуклеиновых кислот изменяется в основном в сто­
рону приближения к контролю.
• '
Эти результаты до некоторой степени согласуются с рабо­
той Kim и Greulach (1963), где изучалось влияние раздель­
ного и совместного нанесения ГМК, пуринов и пиримидинов
на число клеток хлореллы. Было обнаружено четкое снятие
тормозящего влияния ГМК на увеличение количества клеток
• при добавлении гуанина, а также тимина. Потом шли аденин,
урацил и тицозин. Это заставляет предположить, что введе­
ние в ткани растения гидразида малеиновой кислоты затраги­
вает метаболизм' не только пиримидинов, но и пуринов, что.
подтверждается и в, наших опытах.
.
АЗОТИСТЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В ТОЧКАХ РОСТА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ,
ОБРАБОТАННОЙ ГМК, УРАЦИЛОМ И ТИМИНОМ
Изменения, происходящие в нуклеиновом обмене при воз­
действии гидразида малеиновой кислоты, заметно сказываются
также на метаболизме азотистых соединений: Эксперименталь­
ные результаты показали, что в присутствии ГМК-происходит
закономерное увеличение содержания как общего растворимо­
го азота, так и его форм — аммиачного, амидного и аминного
азота.
ч
При этом эффект, оказываемый ГМК, пропорционален кон­
центрации препарата: при обработке свеклы 1%-ным раство­
ром гидразида содержание растворимого азота выше, чем при
применении 0,3%-ной концентрации, и в образцах последнего
срока отбора больше, чем в полтора раза превышает-конт-,
рольную величину. Нанесение ГМК приводит также к накоп­
лению в тканях растений значительных количеств аммиака.
Наряду.с этим, происходит активизация процессов, направ­
ленных на быстрое связывание и обезвреживание этого соеди­
нения, о чем свидетельствует повышение амидного и аминного
азота; Сходные данные были получены другими авторами,при
9
обработке гидразидом табака (Petersen, Naylor,- 1953):и земляппки (Vatsu, Boynton, 1959).
При воздействии пиримидиновых оснований получены ре­
зультаты, аналогичные влиянию ГМК:.в присутствии урацила
и тимипа повышается содержание растворимых азотистых со­
единений в точках роста сахарной свеклы, однако в основном
в меньшей степени, чем при введении гидразида. В итоге, в
вариантах совместного внесения ГМК и пиримидинов содер­
жание' растворимого азота и его форм тоже оказывается за­
метно повышенным по •сравнению с контролем.
Однако иные зависимости получены при изучении дина­
мики белкового азота в, точках роста, сахарной свеклы под
влиянием испытуемых веществ (табл'. 5).
'
.
'
•
Таблица 5
Белковый азот в точках роста сахарной свеклы
(в мг на 1 г сухого вещества, обработка 17.VII)
анализа
22.VII
30.VII.
9.VIII
конт­
роль
Дата
.10,14
9,06
11,10
1
У
1+
(-.©
8,39
8,00
9,17
Г
.•
т
1_0"
9,89
' 9,57
U.57
9,28
9,10
10,05
.
• S s
11,34
9,48
9,77 ""'•• 9,30
11,92,
10,20
7,40
5,30 4,05
•
. У — урацил, Т — тимин.
Как свидетельствуют цифры, гидразид малеиновой кисло­
ты вызывает, снижение содержания белкового азота, причем
1 %-ная концентрация препарата оказывает более сильное вли­
яние в'этом направлении по сравнению с действием 0,3%-го
раствора. Аналогичные данные были получены другими иссле­
дователями. (Haskins, Ghapman, 1956, Fults,. Payne, 1956).
Содержание белкового азота в точках роста сахарной свек-.
лы при введении пиримидинов выше контроля,.то есть эти ве­
щества, очевидно, стимулируют процесс образования белка.
Повышение количества белкового азота, при обработке урацилом наблюдал Kessler (1956) в опытах, на винограде и
оливках*
Совместная обработка 0.3%-ным раствором ГМК с урацилом или тимином повышает содержание белкового азота по
сравнению с вариантом, где наносилась только 0,3%-ная доза.
малеингидразида. Повидимому.'в этом случае пиримидиновые
ю
основания . лрепятствуют полному проявлению угнетающего
влияния ГМК на биосинтез белковых соединений.
Одной из .причин снижения белкового синтеза при воздей­
ствии ГМК может быть
недостаточная обеспеченность ткани
аминокислотами или1-заметное снижение количества некото­
рых,'.наиболее важных аминокислот, например, моноаминодикарбоновых, занимающих центральное место в реакциях переаминирования.
;
.
.• ' •
Однако количественное изучение содержания 16-ти свобод­
ных аминокислот в точках роста'сахарной свеклы.показало,
что. при воздействии гидразида малеиновой кислоты повыша­
ется количество почти всех аминокислот (табл. 6): глицина,
лейцина, серина, моноаминодикарбоновых кислот и их ами­
дов, диаминомонокарбоновых и циклических аминокислот,
Таблица
.-'.
t
3 §
^ о..
• >>
1
§3?
5со
(-о
У
0.87
.0,80
Глицин '
0,90
Алании
0,63
0,55 ,
0,60
Лейцин
0,54
0,61
0,78
Серии
0,38
0,38
0,35*
Цистин
0,94
1,44
1,27
Метионин +
+валин
0,39
0,42 " 0,45
Асларагиновая
кислота
0,22
0,30
0,55
Глютаминовая
кислота
0,85 " 0,89
1.1?
Аспарагин .
1,34
1,43
1,51
Глютамин,
0,31
0,39
0,48
Аргинин..
0,41
0,41
0,48
Лизни
0,46
0,63
0,72
Фенилаланин
0,33
0,53
0,50
Тирозин
0,52
0,62
1,12
Гистидин
0,42
0,51
0,68
•j-аминомасляная
кислЬта
0,48
0,60
0,68
Сумма амино­
кислот .
9,09
10,61
12,14
1+
\
1
.t"°".
t-—
0,84
0,52.
'0,81
0,50
1,21 ,
0,98
0,67
0,65
0,56
1,59
т
t-o*
1,16
0,59
0,62
0,40
1,35
6
+Т
Свободные аминокислоты в точках роста сахарной свеклы
(мг на г сухого вещества, обработка • 17.VII, анализ 9.VIII)
1,06
0,50
0,68
0,48
1,16
.
0,43
0,46
0,57 &. 0,46
0,56
0,66
1,25
2,30
0,63
0,45
0,63
0,42
0,62
0,53
1.01
1,37
0,34
0,44
0,48
0,59
0,88
0,40
0,76*
2,20
0,36
0,52
0,65
0,65
•0,71
0,55
0,47
' 0,36*
0,98 •
1,54
0,30
0,30
0,50
0,40
0,92
0,38
...
1,30
13,34
i
'
.
.
• 0,88
. 0 , 5 3 .,
. 10,90
10,91
*
/
1,20
13,17
* Некоторое снижение содержания этих аминокислот отмечено только
под конец опыта. В пробах, отобранлых 22.VII я 30.VII, содержание их
выше контрольной величины.
-•
•
, ...
ГМК увеличивает также количество сёросодёржащйхЛаминокислот, особенно цистина: при обработке 1%-ным раствором
в образцах последнего срока определения (9.VIII) содержится
1,59 мг этой аминокислоты на г сухого вещества, в то время
как в контроле всего 0.94 мг. Заметно повышается в присут­
ствии ГМК также и количество -у— аминомасляной кислоты.
Исключение'составляет аминокислота аланин, количество
которой снижается при нанесении 0,3%-го раствора инги­
битора в июле месяце. При сентябрьской обработке растений
гидразидом содержание аланина выше, чем'в контроле: ' '
' Действие азотистых оснований в основном сходно с влия­
нием ГМК: введение их в ткани вызывает увеличение коли­
чества почти всех аминокислот, Исключение из этой законо­
мерности составляет уменьшение содержания глицина при
опрыскивании урацилом, и гистидина и аргинина при нанесе­
нии тимина. Кроме этого, пиримидины, как и ГМК, снижают
количество аланина при обработке в июле. • • • • • ' • • •
На основании полученных данных можно предположить
следующее объяснение рос*тингибирующего действия гйдразида малеиповой кислоты: попадая в растение, ГМК угнетает
включение пуринов, а также уридин- и тимидиннуклеотидовв
молекулы нуклеиновых кислот, вследствие чего содержание их"
значительно уменьшается. В результате нехватки "молекул
РНК замедляются реакции включения аминокислот в поли­
пептидную цепь, что приводит к уменьшению содержания.
белка и накоплению свободных аминокислот: Угнетение гид­
разидом малеиновой кислоты синтеза важнейших соединений
живого организма — белков и 'нуклеиновых кислот вызывает
подавление процессов^деления и новообразования протоплаз-.
мы, а в итоге — торможение роста растений.
•..>..
Пиримидиновые основания урацил и тимин, повышая со­
держание аминокислот, что указывает, по-видимому,, на - сти­
мулирующее влияние их на реакции образования данных со­
единений, усиливают и процессы их использования, о чем мо­
жет свидетельствовать увеличение содержания белка при вве­
дении этих веществ.
"'•/
ДЕЙСТВИЕ ГМК И ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИИ
НА
ИНТЕНСИВНОСТЬ МЕТАБОЛИЗАЦИИ VCAXAPOB
v
И ПРОЦЕССЫ ОКИСЛЕНИЯ В КОРНЕПЛОДАХ
САХАРНОЙ СВЕКЛЫ ПРИ ХРАНЕНИИ
,
Эти вопросы изучались в корнеплодах.сахарной свеклы,'
опрысканной растворами ГМК и ГМК + пиримидины 17-го
июля и 3-го сентября. Свеклу убирали во второй половине ок12
I
тября и хранили в ящиках с песком при температуре 3—4°СМ
Анализы проводили при закладке корнеплодов на хранение —
конец сентября и через пять
месяцев хранения, то есть в конце
ч
марта месяца.
.
Опыты показали, что рлияние ГМК на содержание сахдра1
в корнеплодах свеклы при уборке зависит от времени обра­
ботки и концентрации препарата. Нанесение 0,3%-го рас­
твора ГМК в июле . уменьшает количество сахара в корнях,
однако обработка этой же концентрацией ГМК в сентябре вы­
зывает некоторое повышение сахаристости в сравнении с конт­
ролем. Под действием 1%-ной концентрации содержание са­
хара заметно снижается и при ранней, и при поздней обработ­
ке, что обусловлено, по-видимому, токсическим влиянием вы­
сокой дозы ГМК на ткани растения. Кроме этого, известно,
что высокие концентрации ГМК снижают количество хлоро­
филла и интенсивность .фотосинтеза (Гончарик, Маршакова,
1962), а это приводит к снижению содержания углеводов.
Совместное применение для опрыскивания-свеклы 0,3Го­
лого раствора ГМК и урацила вызывает повышение сахарис­
тости корнеплодов, что особенно выражено при осенней обра­
ботке. Возможно, это связано с участием урацила в образо­
вании уридиндифосфатглюкозы, с помощью которой проис­
ходит синтез Сахаров в растении. Опрыскивание свеклы ГМК
и тимином в июле несколько увеличивает содержание сахара
по сравнению с обработкой одним ГМК, но при сентябрьском
опрыскивании наблюдается обратная зависимость.
Изучение сахаристости корней после пяти месяцев хране­
ния свидетельствует, 'что за этот период контрольные корне­
плоды потеряли значительное количество сахара — 20,8% от
начального содержания. Потери сахара в корнях свеклы, об­
работанной 0,3%-ным раствором ГМК в июле, составляли все­
го 8,7%, а при осеннем нанесении ингибитора — 7,6%.
Таким .образом, обработка сахарной свеклы'в начале сен­
тября 0,3%-ной концентрацией малеингидразида приводит и
к повышению сахаристости корней при уборке, и к уменьше­
нию потерь сахара при хранении. Эти данные подтверждают
результаты работ других авторов (Mikkelsen at al., 1952; Ракитин и сотр., 1958; Калинин, 1964).
Обратная зависимость получена при совместном введении
ГМК и пиримидинов: потери сахара в этих вариантах после
пяти месяцев хранения даже превышают контрольную величи­
ну в корнеплодах первой обработки. Во втором опыте также
наблюдается большая потеря сахара в вариантах ГМК+ура'
•
ч
J3
цил и ГМК+тимин по сравнению с вариантом ГМК—0,3%.
Повидимому, под влиянием пиримидинов к.этому времени
происходит снятие тормозящего действия ГМК на-период по­
коя корнеплодов, израстание их усиливается, на что расходу­
ется значительное количество сахара.
Одним из показателей интенсивности протекания физиоло­
гических процессов является дыхание. Установлено, что корнп свеклы, обработанной гидразидом малеиновой кислоты, от­
личаются слабой интенсивностью дыхания и при уборке, и че­
рез пять месяцев хранения по сравнению с контрольными ва­
риантами (табл 7). Особенно заметно подавляет дыхание вы­
сокая 1%-ная доза препарата. Кроме того, действие ГМК за­
висит также от времени обработки: нанесение ГМК в сен­
тябре "приводит к более сильному ингибированию дыхания,
чем при опрыскивании в июле.
,
Таблица 7
Дыхание корнеплодов сахарной свеклы
(в мл СО на 1 кг сухого вещества за 1 час)
Варианты
Дата обра• ботки
*
Контроль
-
ГМК —
0,3%
ГМК —
0,3%+У •
ГМК —
0,3%+Т
при закладке на хранение:
18,5
20,5
22,8
17,7
18,7
22,8
ч
Г7. VII
3. IX
20,7
18,1
i
через пять месяцев хранения: '
I7.VII
3. IX
.
28,1
28,1
25,5
23,4
27,8
25,6
гмк—1 %
18,0
14,8
'
28,6
• • 25,9
25,1
21,0
Вероятно, за этот промежуток времени,, который прошел
от первой-обработки растений растворами ГМК, дыхание кор­
неплодов восстановились в большей степени по сравнению с
вариантами осеннего опыта.
. Под влиянием пиримидинов происходит частичное снятие
ингибирующего действия ГМК на процесс дыхания, вследст­
вие чего интенсивность его в этих вариантах выше, чем при
нанесении только .0,3%-го раствора маленнгидразида. Это
особенно заметно при определении энергии дыхания; корней
14
после пяти месяцев хранения. Так, интенсивность дыхания
корнеплодов июльской обработки 0,3%-ной концентрацией
ГМК и урацилом в это время,близка к контролю, а в вариан­
тах ГМК + тимин даже превышает контрольную величину.
Опрыскивание этими соединениями во второй срок также сти­
мулирует дыхание, но в меньшей мере. Следовательно, и в
этом случае пиримидиновые.основания урацил и тимин усили­
вают процессы, направленные на снятие ингибирующего влия­
ния гидразида малеиновой кислоты.
Заметное действие оказывает ГМК также на распределе­
ние активности окислительно-восстановительных ферментов
пероксидазы и полифенолоксидазы, участвующих в конечной
фазе процессов дыхания у растений.
Установлено, что эти ферментные системы находятся в из­
вестной мере в отношении взаимного замещения. При воздей­
ствии ГМК окислительные процессы вначале в большей сте­
пени осуществляются с помощью фермента пероксидазы, ак­
тивность которого повышается (определение при /уборке).
Активность полифенолоксидазы в корнеплодах в присутствии
ГМК в это время, наоборот, ниже контрольной величины. Но
со временем происходят обратные изменения: после пяти ме­
сяцев хранения в процессах окисления в корнеплодах свеклы,
обработанной ГМК, большее участие, повидимому, принимает
фермент полифенолоксндаза. Активность его в это время зна­
чительно повышается по сравнению с первоначальной вели­
чиной, а пероксидазная активность падает.
В контрольных корнеплодах, а также в корнях вариантов,
где обработка производилась 0,3%-ным раствором ГМК и пиримидиновыми основаниями — урацилом или тимином, актив­
ность этих ферментов изменяется в противоположную сторону.
Таким образом, экспериментальные данные свидетель­
ствуют об угнетающем действии гидразида малеиновой кис­
лоты на процесс гликсуштического распада сахарозы в корне­
плодах сахарной свеклы при хранении, а также на интенсив­
ность окислительных реакций, происходящих в их тканях при
дыхании. Использование ГМК для обработки сахарной свек­
лы с целью уменьшения потерь с/ахара при хранении корне­
плодов может, иметь практическое значение.
Введение в ткани растения вместе с ГМК пиримидиновых
производных приводит к увеличению потерь сахара по срав­
нению с действием одного гидразида. Из этого следует, что
в отношении изучаемого процесса урацил и тимин выступают
как антагонисты ГМК.
,
15
ИНТЕНСИВНОСТЬ РОСТА,' НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И САХАРА
В ТКАНЯХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ IN VITRO .
Ткани сахарной свеклы 1Йыращивались на среде Уайта в
модификации Hildebrandt (1962). При добавлении в питатель­
ную среду гидразида малеиновой кислоты наблюдается замет­
ное угнетение роста эксплантатов. Кроме этого, ГМК умень­
шает оводненность тканей сахарной свеклы, вследствии чего
возрастает содержание сухого( вещества. Введение в среду
пиримидиновых оснований сопровождается противоположной
картиной: рост эксплантатов стимулируется, активно образует­
ся каллус, повышается оводненность тканей, а содержание су­
хого вещества падает.
Исходя изнпредположения об антагонистическом взаимо­
действии ГМК н пиримидииов нами были поставлены опыты
по изучению влияния совместного внесения в среду этих сое­
динений на интенсивность роста ткани. Пиримидины исполь­
зовались в концентрации 10 мг/л, так как при добавлении
такого количества их эксплантаты растут особенно интенсивно.
Опытами установлено, что во всех вариантах, где кусочки
тканей свеклы были посажены на среду ГМК +" пиримидины
интенсивность их роста больше, чем на среде, содержащей
только гидразид, и превышает интенс!гвность роста каллусов'
на'контрольной среде. Только при-увеличении концентрации
ГМК до 10 мг/л средний вес каллуса немного меньше коптрольной величины. Таким образом, можно констатировать,
что урацил и тимин способны полностью или частично сни­
мать подавляющее влияние ГМК на рост тканей сахарной
^свеклы in vitro.
'
. .
В результате экспериментального исследования содержа­
ния нуклеиновых кислот в трасплантатах сахарной бвеклы
было обнаружено, что при росте тканей заметно повышается
количество луклеиновых кислот по сравнению с содержанием
их в .тканях исходных корнеплодов: за двадцать дней роста
эксплантата на питательной среде содержание нуклеиновых
кислот увеличивается более, чем в 3,5 раза. Однако, добавле­
ние в среду ГМК угнетает процесс биосинтеза этих соедине­
ний. Степень угнетения пропорциональна' концентрации инги­
битора. Введение в среду азотистых оснований сопровождает­
ся обратными изменениями: с увеличением концентрации урацила и тимина до 10 мг/л стимулируется и.синтез нуклеиновых
кислот..
•
Одновременное введение в среду ГМК и пиримидииов так­
же приводит к снятию угнетающего действия ГМК на синтез
16
:.
'
нуклеиновых кислот (табл. 8). Особенно отчетливо это высту­
пает при. добавлении в среду ГМК в концентрации 5 мг/л и
вдвое большем количестве урацила (10 мг/л). Синтез нуклеи­
новых кислот, заметно угнетенный этой концентрацией ГМКне только восстанавливается урацилом, но даже немного пре­
вышает контроль. Это согласуется с результатами исследова­
ний -Бутенко и Баскакова (1960), которые наблюдали полное
восстановление роста ткани моркови при таких же соотноше­
ниях ГМК и урацила в среде. \
#
:
,
-
.'
Таблица 8
•
-
,
i
.
Нуклеиновые кислоты в эксплантатах сахарной свеклы
при воздействии ГМК и урацила
ГМК
.нг/л, •
0'
. 0,10
. 0.1
.
1
•
' Урацил
мг/л ,
л
'• •
0
.0
10
10
0
мг НК на
на 100 мг
обезжи­
ренного
остатка
0,47
0,45
0,89 .
0,69
0,40
ГМК
Урацил
мг/л
мг/л
t
. 1
Ъ -.
5
10
10
:
10
О
10
0
10
мг НК
на 100 мг
. обезжи­
ренного
остатка
0,46
0,36
0,50
0,21
0,46
•
. Таким образом, при изучении влияния различных концен­
траций гидразида малеиновой кислоты и пиримидинов на син­
тез нуклеиновых кислот в изолированных тканях сахарной
свеклы, получены закономерности, сходные с воздействием
этих веществ'на интенсивность роста эксплантатов. .
Конечно, зависимости, обнаруженные на тканях, культиви­
руемых in vitro, нельзя полностью относить к целым организ'мам, функционирование которых связано с воздействием мно­
гих внешних и внутренних факторов. Однако изучение росто­
вой реакции и изменения содержания нуклеиновых кислот
свидетельствует, что ткани сахарной свеклы в опытах, прове­
денных и in vivo, и in vitro в основном сходно реагируют на
влияние гидразида, Урацила и тимина.
Изучение содержания форм Сахаров в изолированных
тканях сахарной свеклы показало, что при введении ГМК по­
давляется процесс образования моносахаров и снижается
расход сахарозы. При совместном добавлении в среду ГМК
•и пиримидинов наблюдается обратная картина: количество
моносахаров возрастает по сравнению с содержанием их. о ва- - - ^ ^ Б ^ З ?
17
.щзл
№оск'
UWJL****
риантах с ГМК, а сахарозы — понижается. Таким образом,
результаты показывают, что гидразид малеиновой кислоты
ингибирует процесс гликолитического распада Сахаров в тка­
нях сахарной свеклы in vitro. Это заключение согласуется с
данными, полученными при исследовании сахаристости корне­
плодов при хранении.
ВЫВОДЫ
•
1. Гидразид малеиновой кислоты угнетает биосинтез нукле­
иновых кислот в точках роста сахарной свеклы, а также в тка­
нях свеклы, культивируемых in vitro. Пиримидиновые основа­
ния — урацил и тимин стимулируют этот процесс. При сов­
местном нанесении ГМК и пиримидинов наблюдается частич­
ное снятие последними ингибирующего влияния ГМК «а
синтез .нуклеиновых'кислот.
2. При введении ГМК происходят качественные изменения
РНК и ДНК точек роста сахарной свеклы: снижается содер­
жание уридин- и тимидиЕгауклеотидов, а также пури'ннуклеотидов. Повидимому, в присутствии ГМК подавляется'включе­
ние этих нуклеотидов в молекулы нуклеиновых кислот. Коли­
чество цитиднниуклеотида, наоборрт, повышается. Урацил и
тимин уменьшают влияние ГМК на нуклеотидный состав ну­
клеиновых кислот.
3. Под воздействием гидразида малеиновой кислоты отме­
чено повышение содержания растворимых азотистых соедине­
ний в точках роста свеклы и заметное снижение содержания
белкового азота. Накопление растворимых азотистых соеди­
нений, в частности свободных аминокислот, происходит, ве­
роятно, вследствие угнетения использования аминокислот 'в
синтезе белка, что может быть связано с нехваткой молекул
РНК, синтез которой ингибируется гидразидом.
4. Пиримидиновые основания урацил и тимин. повышая
уровень свободных аминокислот, способствуют и их исполь­
зованию, о чем свидетельствует увеличение •белкового азота' в
этих вариантах. При совместной обработке растений ГМК и
пирнмидинамн наблюдается снижение ингибирующего дейст­
вия ГМК на биосинтез белка, что объясняется противополож­
ным влиянием ГМК и пиримидинов на образование нуклеино­
вых кислот, ответственных за синтез полипептидной цепи.
5. Обработка растений сахарной свеклы растворами ГМК
оказывает влияние на сахаристость корнеплодов при уборке.
/При этом действие ГМК зависит от времени обработки и кон­
центрации препарата; предуборочное опрыскивание посево'в
18
', * : '.''
•".•'..'";• v<
'к
0,3%-ным раствором способствует увеличению сахаристости
корней, тогда как более ранняя обработка'.—-в июле месяце,
а также нанесение 1%-го раствора оказывают отрицательное
действие.
6. Гидразид малеиновои кислоты снижает интенсивность
дыхания корнеплодов сахарной свеклы,, что обуславливает
уменьшение потерь сахара в них при пятимесячном храпении..
Пиримидины. частично снимают подавляющее влияние ГМК
на1 процесс гликолитического распада Сахаров. Это подтверж­
дается исследованием содержания Сахаров в эксплантатах
свеклы.
'
^
7. ГМК вызывает изменение направленности окислнтельнб. восстановительных ферментов по сравнению с контролем.
Осенью окислительные процессы, в корнеплодах опытных ва­
риантов осуществляются в большей мере при участии пероксидазы, а через пять месяцев хранения — полифенолокси\ дазы. В вариантах ГМК + пиримидины активность ферментов
изменяется в сторону приближения к контролю, что также
свидетельствует о наличии антиметаболитических отношений
между ГМК и данными пиримидиновыми основаниями.
• ..->•
-
список
работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Гидразид малеиновои кислоты — антиметаболнт обмена угеловодно.фосфорных соединений и нуклеиновых кислот.
I Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы докладов, в. 111,
Ленинград, 1964.
2. О механизме действия гидразида малеиновои кислоты .на растение.
IX Менделеевский съезд, Рефераты докладов, № 2, Москва,
Наука, 1965.
3. Бюсинтез i нуклеотидннн склад ДНК i РНК в точках росту цукрового
буряка при введена! пдразиду малеТново! кнслоти.
I УкраТнський бшх1м'1чний зЧзд, Тези доповщей, Чершвщ, 1965.
4. Изучение процессов роста и. дифференциации в контролированных
условиях.
'
В сб. «Рост и устойчивость растений», К.; Наукова думка, 1965.
5. К выяснению, механизма действия гидразида малеиновои кислоты нах
растения.
.
Там ^ке.
.
БФ 06232. Подписано к печати 12:Ш 1966 г. 1,25 п. л. Зак. 1043. Тираж 150.
Киев, тип. № 3, цех 2, ул. Франко, 44.