Характеристика сои Roundup ReadyR , кукурузы MON810 и
advertisement
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 Характеристика сои Roundup ReadyR , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 М.Кверчи, М.Маццара WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 2 Содержание Сессия 7 Характеристика сои Roundup ReadyR , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 Характеристика сои Roundup Ready 3 Характеристика кукурузы MON810 8 Характеристика кукурузы Bt-176 13 Литература 19 Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 Характеристика сои Roundup ReadyR 3 1 Краткое определение Обозначение GTS 40-3-2 Заявитель Monsanto Canada Inc. Вид растения Glycine max L. (соя) Новый признак Новый признак глифосату, толерантности активному к ингредиенту гербицида RoundupR Метод введения нового признака Баллистический метод Предполагаемое применение Выращивание сои для получения кормов (преимущественно в виде обезжиренной обжаренной муки грубого помола и хлопьев), а также пищевых продуктов, (преимущественно соевого масла, белковых фракций и пищевых волокон) Основные сведения Трансгенная соя линии GTS 40-3-2 разработана фирмой Monsanto Canada Inc. для того, чтобы можно было использовать глифосат в качестве альтернативной системы борьбы с сорняками при промышленном выращивании сои. Создание линии GTS 40-3-2 основано на технологии рекомбинантных ДНК, и осуществлено путем введения гена толерантной к глифосату формы фермента 5энолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSPS), выделенного из штамма СР4 Agrobacterium tumefaciens, в коммерческий сорт сои “A5403” (Asgrow Seed Company). 1 Выписка из Решений Агентства продовольственной инспекции Канады (DD95-05) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 4 Описание нового признака Толерантность к глифосату Глифосат, активный ингредиент RoundupR, является системным гербицидом, используемым после появления всходов, и распространенным во всем мире в качестве неселективного средства борьбы с сорняками. Глифосат действует как конкурентный ингибитор 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSPS), жизненно важного фермента биохимического пути шикимата, участвующего в биосинтезе ароматических аминокислот фенилаланина, тирозина и триптофана (Рисунок 1). Ингибирование фермента EPSPS приводит к подавлению роста и гибели растения. Введенный ген толерантности кодирует бактериальный (из СР4 штамма Agrobacterium tumefaciens), вариант этого необходимого фермента, повсеместно распространенного, обнаруживаемого в растениях, грибах и микроорганизмах, который является в значительной степени нечувствительным к глифосату. Таким образом, он может играть важную роль в осуществлении необходимого для растений метаболизма ароматических аминокислот. Ген EPSPS находится под контролем сильного конститутивного промотора из вируса мозаики цветной капусты (Cauliflower Mosaic Virus – P-CaMV E35S) и терминатора нопалин синтазы (nopaline synthase terminator – T-nos), из Agrobacterium tumefaciens (Рисунок 2). Растительная ДНК-последовательность, кодирующая пептид, обеспечивающий доставку белка в хлоропласты, (сигнальный пептид СТР4 из Petunia hibrida), была клонирована на 5’- конце гена толерантности к глифосату. Сигнальный пептид, слитый с геном EPSPS, облегчает доставку ново-синтезированного фермента в хлоропласты, где осуществляется метаболический путь шикимата, и где расположены участки, на которые воздействует глифосат. После того, как произошла доставка фермента, сигнальный пептид удаляется и быстро разрушается с помощью специфической протеазы. EPSP синтаза повсеместно распространена в природе, и не предполагается, что она может быть токсичной или аллергенной. При проведении сравнительного анализа с базами данных последовательностей токсичных или аллергенных полипептидов, аминокислотная последовательность фермента не показала значительной гомологии с какими-либо известными токсинами или аллергенами. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 5 Рисунок 1 EPSPS катализирует реакцию шикимат-3-фосфата и фосфоэнолпирувата (РЕР) с образованием 5энолпирувилшикимат-3фосфата (EPSP) и фосфата. шикимат-3-фосфат EPSP является промежуточным продуктом в синтезе ароматических аминокислот. В результате ингибирования этого фосфоэнолпируват биохимического пути, разрушается процесс синтеза белков, что приводит к гибели глифосат (Roundup) растений. EPSPS является N-(фосфонометил)глицин единственной физиологической мишенью глифосата в растениях, и никакие иные ферменты, 5-энолпирувил-шикимат-3-фосфат использующие фосфоэнолпируват (РЕР) не ингибируются глифосатом. фосфоэнолпируват + фенилаланин P-E35S CTP4 эритрозо-4-фосфат тирозин триптофан CP4 EPSPS T-nos Рисунок 2. Схематическое изображение кассеты гена из сои Roundup ReadyR (модифицировано из Padgette et al, 1995) Метод разработки Коммерческий сорт сои А5403 (Asgrow Seed Co.) был трансформирован с помощью бомбардировки частицами золота с PV-GMGTO4 плазмидным вектором из Escherichia coli (Рисунок 3). Плазмида PV-GMGTO4 содержит СР4 ген EPSPS, обуславливающий Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 6 толерантность к глифосату, gus ген, необходимый для биосинтеза β-глюкуронидазы как селективного маркера, и ген nptII устойчивости к антибиотику (канамицину). Отобранные первичные трансформанты демонстрировали два сайта интеграции, один с селективным маркерным геном gus, а другой – с геном, обеспечивающим толерантность к глифосату. Эти два сайта затем распределяются независимо в следующих поколениях; а линия GTS 40-3-2, как показал анализ, содержит только один сайт инсерции, в который интегрирован ген, обуславливающий толерантность к глифосату. Протяженность вставки при трансформационном событии 40-3-2 Рисунок 3. Карта плазмиды, включающая генетические элементы вектора PVGMGTO4, использованного для трансформации RR сои, трансформационное событие 40-3-2 (взято из материалов Монсанто, 2000) Стабильная интеграция в геном растения Исходные данные (Padgette et al., 1995, 1996) указывали на то, что линия GTS 40-3-2 содержит единственную функционирующую кассету гена СР4 EPSPS, содержащую Е35S промотор вируса мозаики цветной капусты (Cauliflower Mosaic Virus – CaMV), хлоропластный сигнальный пептид, кодирующую последовательность СР4 EPSPS и сигнал полиаденилирования nos гена. Не было обнаружено включения какой-либо кодирующей области вне слитого гена исходного плазмидного вектора. Последующие поколения растений не демонстрировали дальнейшего разделения слитого гена, описанного выше; что Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 7 показывает, что линия GTS 40-3-2 являлась гомозиготной по слитому гену. Анализ ДНК в течение шести поколений показал, что вставка была стабильной. Недавние исследования показали, что в процессе интеграции ДНК-вставки, происходит некоторая реорганизация, и в дополнение к основной функциональной вставке, соя Roundup ReadyR , трансформационное событие 40-3-2, содержит два небольших нефункциональных фрагмента введенной ДНК, размером 250 и 72 н.п. соответственно (Monsanto, 2000; Windels et al., 2001). Решения контролирующих органов. Соя Roundup ReadyR (RR) в настоящее время является единственной трансгенной линией сои, разрешенной к продаже в ЕС. После получения в 1994 г. разрешения в США, было также получено и согласие на импорт в страны Европейского Союза, в соответствии с Решением Комиссии 96/281/EC от 3 апреля 1996 г. (Решение Комиссии 96/281/EC). Данное решение позволяло импортировать семена в страны ЕС для промышленной переработки, в результате которой получаются продукты, исключающие их прорастание, а именно – корма для животных, пищевые продукты и любые другие продукты, содержащие отдельные фракции сои. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 Характеристика кукурузы MON810 8 2 Краткое определение Кукуруза, Обозначение трансформационное MON810 (торговое событие наименование YieldGard®) Заявитель Monsanto Canada Inc. Вид растения Zea mays L. (кукуруза) Новый признак Устойчивость к кукурузному мотыльку (Ostrinia nubilalis) Метод введения нового признака Баллистический метод Предполагаемое применение Выращивание кукурузы употребления в Z. mays пищу для человеком (переработка свежей или высушенной, или в виде кукурузного масла из семян), а также на корм скоту, в виде муки грубого помола и силоса Основные сведения Трансгенная кукуруза, трансформационное событие MON810 (YieldGard®) разработана фирмой Monsanto Canada Inc. с тем, чтобы она обладала специфической устойчивостью к кукурузному мотыльку (European Corn Borer, ECB, Ostrinia nubilalis), и чтобы получить метод борьбы с потерями урожая вследствие ущерба от повреждения растений кукурузы, которой питаются личинки мотылька, в отсутствие традиционных пестицидов. Кукуруза MON810 была создана с использованием технологии рекомбинантных ДНК, с помощью микроинъекций в клетки растений баллистическим методом, с целью введения гена, кодирующего продукцию природного инсектицидного белка (из штамма Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki). Данный белок активен по отношению к определенным видам чешуекрылых - Lepidoptera, отряду насекомых, к которому принадлежат бабочки и мотыльки, включая и кукурузного мотылька (ECB). 2 Выписка из Решений Агентства продовольственной инспекции Канады (документ 97-19) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 9 Точнее можно сказать, что белок, экспрессирующийся в кукурузе MON810, является усеченной формой природного инсектицидного белка, CRYIA(B) δ-эндотоксина, и защищает растения кукурузы от повреждения листьев и стеблей, причиняемого личинками кукурузного мотылька. Описание нового признака Устойчивость к кукурузному мотыльку (European Corn Borer – ECB). Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki – это спорообразующая, Грам-положительная, почвенная бактерия. В спорогенной стадии, помимо эндоспор, она продуцирует несколько кристаллических инсектицидных белков, включая δ-эндотоксин CRYIA(B) – белок, обладающий инсектицидным действием по отношению к определенным чешуекрылым насекомым, таким как кукурузный мотылек (European Corn Borer - ECB), листовертка-почкоед еловый (Spruce Budworm), коконопряд лесной (Tent Caterpillar), непарный шелкопряд (Gypsy Moth), капустная моль (Diamondback Moth), капустная совка (Cabbage Looper), табачная совка (Tobacco Budworm) и мермитиды (Cabbage Worm). Многократно продемонстрировано, что данный белок нетоксичен для человека, других позвоночных и полезных насекомых (Lee et al., 1995). Кукуруза MON810 трансформирована с помощью одной копии cryIA(b) гена под контролем сильного конститутивного усиленного CaMV 35S промотора, а также лидерной последовательности HSP70 интрона кукурузы (Рисунок 4). Кодирующая последовательность cryIA(b) гена из Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki HD1 была модифицирована для того, чтобы оптимизировать и максимально увеличить экспрессию белка δ-эндотоксина CRYIA(b) в растениях. Белок становится токсичным для личинок чешуекрылых после расщепления до био-активного, устойчивого к трипсину основного компонента. Инсектицидная активность, как полагают, зависит от связывания активного фрагмента со специфическими рецепторами, находящимися на поверхности эпителиальных клеток кишечника насекомых, чувствительных к токсину, и от последующего образования пор, нарушающих осмотический баланс и приводящих со временем к лизису клеток. Специфическими вредителями кукурузы из отряда чешуекрылых, чувствительными к токсину, являются кукурузный мотылек (ECB) и совка (corn earworm). Показано, что аминокислотная последовательность токсина, экспрессирующегося в модифицированных растениях кукурузы, идентична последовательности природного токсина, и эквивалентна белку, который производят и широко используют в качестве Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 10 биопестицида, при «естественном» (без применения химикатов) выращивании растений для пищевой промышленности. P-E35S cryIA(b) hsp70 T-nos Рисунок 4.Схематическое изображение конструкции гена cryIA (b) из плазмиды PVZMBK07, используемой при трансформации MON810, включая CaMV 35S промотор, HSP70 интрон 1 кукурузы и синтетический ген δ-эндотоксина cryIA(b), за которым следует nos терминатор (модифицированный из BATS, 2003). Метод разработки. Кукуруза MON810 получена из кукурузы с генотипом Hi-II методом баллистической трансформации смесью плазмидных ДНК, PV-ZMBK07 и PV-ZMGT10. Плазмида PVZMBK07 содержит cryIA (b) ген (Рисунок 5), а плазмида PV-ZMGT10 содержит СР4 EPSPS и gox гены. Обе плазмиды также содержат ген npfII (для бактериальной селекции) под контролем бактериального промотора, и участок начала репликации из pUC плазмиды (ori-pUC), требующийся для репликации плазмид в E.coli. Эти два вектора были введены с помощью микроинъекций в культивируемые клетки растений баллистическим методом. Трансформированные клетки, толерантные к глифосату, отбирались и затем культивировались в среде для культур тканей с целью регенерации растений (Armstrong et al., 1991). Молекулярный анализ, проведенный авторами, показывает, что только элементы из конструкции PV-ZMBK07 были интегрированы в геном линии кукурузы MON810 единой вставкой, состоящей из усиленного CaMV 35S (Е35S) промотора, лидерной последовательности HSP70 интрона и усеченного cryIA(b) гена. Nos 3’- терминирующий сигнал, присутствующий в плазмиде PV-ZMBK07, теряется при отсечении 3’-конца кассеты гена, и, таким образом, не интегрируется в геном клеткихозяина (BATS, 2003). Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 11 Рисунок 5. Схематическое изображение плазмиды PV-ZMBK07, используемой при конструировании MON810 (взято из базы данных Agbios по необходимой биобезопасности) Стабильность вставки вводимых признаков Данные, предоставленные авторами, показывают что сегрегация и стабильность соответствовали единственному сайту инсерции cryIA(b) гена в геном кукурузы MON810. Стабильность вставки продемонстрирована на протяжении множества поколений скрещивания. Данная линия кукурузы скрещивалась с несколькими различными генотипами кукурузы в течение 4 поколений, причем защита против ECB сохранялась. Линия MON810 получена из третьего поколения обратного скрещивания. Стабильная интеграция единственной вставки продемонстрирована в течение трех поколений методом гибридизации по Саузерну. Решения контролирующих органов. Выращивание кукурузы линии MON810 разрешено в США с июля 1996 г. Агентством по защите окружающей среды (Environmental Protection Agency). Коммерциализация данной линии кукурузы в ЕС была разрешена в соответствии с Решением Комиссии 98/294/ЕС от 22 апреля 1998 г. (Решение Комиссии 98/294/EC). Агентство продовольственной инспекции Канады издало Документ 97-19, в котором опубликовано разрешение на ее использование, как в пищевых продуктах, так и в Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 12 кормах. Линия кукурузы MON810 разрешена также в Аргентине, Австралии, Японии, Южной Африке и Швейцарии. Данная линия кукурузы предназначена для употребления в пищу человеком (переработка свежей или высушенной, и в виде кукурузного масла из семян); а также на корм скоту, в виде муки грубого помола и силоса. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 13 Характеристика кукурузы Bt-176 3 Краткое определение Кукуруза, трансформационное событие Обозначение 176 Bt Ciba Seeds of Ciba-Geigy и Mycogen Заявитель Corporation Вид растения Zea mays L. (кукуруза) Новый признак Устойчивость к кукурузному мотыльку (Ostrinia nubilalis); толерантность к гербициду глюфосинату аммония Метод введения нового признака Баллистический метод на незрелых эмбрионах Выращивание гибридной кукурузы на Предполагаемое применение зерно Основные сведения Ciba Seeds и Mycogen Corporation разработали линию кукурузы, устойчивую к кукурузному мотыльку (ECB). Данная линия кукурузы, обозначаемая как трансформационное событие Bt-176, была трансформирована с помощью технологии рекомбинантной ДНК и микроинъекций в эмбрионы баллистическим методом для продуцирования инсектицидного белка из Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, активного против определенных видов чешуекрылых - Lepidoptera, отряда насекомых, к которому принадлежат бабочки и мотыльки, включая и кукурузного мотылька (ECB). Точнее можно сказать, что данный белок является усеченной формой CRYIA(b) δэндотоксина, и защищает растения кукурузы от повреждения листьев и стеблей, причиняемого личинками кукурузного мотылька. В дополнение, данная линия кукурузы была ко-трансформирована геном, обуславливающим толерантность к гербициду глюфосинату аммония, который используют для селекции трансформированных растений на самых ранних стадиях развития. 3 Выписка из Решений Агентства продовольственной инспекции Канады (документ 96-09) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 14 Описание нового признака Устойчивость к кукурузному мотыльку (European Corn Borer – ECB). Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki – это образующая эндоспоры, Грам-положительная, почвенная бактерия. В спорогенной стадии, помимо эндоспор, она продуцирует несколько кристаллических инсектицидных белков, включая δ-эндотоксин CRYIA(b) – белок, обладающий инсектицидным действием по отношению к определенным чешуекрылым насекомым, таким как кукурузный мотылек (ECB), листовертка-почкоед еловый (Spruce Budworm), коконопряд лесной (Tent Caterpillar), непарный шелкопряд (Gypsy Moth), капустная моль (Diamondback Moth), капустная совка (Cabbage Looper), табачная совка (Tobacco Budworm) и мермитиды (Cabbage Worm). Многократно продемонстрировано, что данный белок нетоксичен для человека, других позвоночных и полезных насекомых (Lee et al., 1995). Был сконструирован синтетический ген cryIA(b) из Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, штамм HD-1, кодирующий модифицированный для усеченную увеличения его форму CRYIA(b) экспрессии в δ-эндотоксина, растениях и кукурузы. Синтетический ген имел около 65% гомологии на уровне нуклеотидов с природным геном (Koziel et al., 1993). Усеченный CRYIA(b) белок содержит инсектицидный участок природного CRYIA(b) белка. Полагают, что инсектицидная активность зависит от связывания активного фрагмента со специфическими рецепторами, находящимися на поверхности эпителиальных клеток кишечника насекомых, чувствительных к токсину, и от последующего образования пор, нарушающих осмотический баланс и приводящих к лизису клеток, к прекращению поедания личинками листьев и, со временем, – к смерти личинок насекомых. Трансформационное событие Bt-176 было получено путем трансформации двумя синтетическими конструкциями cryIA (b) гена. Одна из конструкций находится под транскрипционным контролем промотора гена фосфоэнолпируват-карбоксилазы (PPEPC) кукурузы и экспрессируется в зеленых тканях. Вторая конструкция находится под контролем промотора гена кальций-зависимой протеинкиназы (P-CDPK) кукурузы и специфически экспрессируется в пыльце. Обе конструкции терминируются терминатором вируса мозаики цветной капусты (T-CaMV 35S) и включают в себя также интрон 9 из гена фосфоэнолпируват-карбоксилазы кукурузы (см. Рисунок 6 и Рисунок 7). Экспрессия CRYIA(b) белка в зеленых тканях направлена на повышение устойчивости растений к первому поколению личинок ECB, питающихся листьями. Экспрессия в пыльце нацелена на второе поколение личинок ECB, которые, как известно, питаются Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 15 пыльцой. Белок CRYIA(b) из листьев растений трансформационного события Bt-176 подвергли исследованиям in vitro, имитирующим пищеварительную систему млекопитающих, и как было показано, он разрушался также как и обычные пищевые белки. T-35S cryIA(b) P-CDPK PEPC Intr # 9 Рисунок 6. Схематическое изображение синтетического cryIA (b) гена под контролем CDPK промотора (из Matsuoka et al., 2000) PEPC Intr # 9 cryIA(b) T-35S P-PEPC Рисунок 7. Схематическое изображение синтетического cryIA (b) гена под контролем PEPC промотора (из Matsuoka et al., 2000) Толерантность к гербициду глюфосинату аммония Ген толерантности к глюфосинату аммония (bar ген) из обычной почвенной бактерии Streptomyces hydroscopicus кодирует фосфинотрицин-ацетилтрансферазу (PAT) под транскрипционным контролем конститутивного промотора CaMV 35S, активного во всех тканях растения, за исключением пыльцы. Фосфинотрицин, ингибитор глютаминсинтетазы, является активной составляющей глюфосината аммония. Гербицидное действие фосфинотрицина характеризуется ингибированием глютамин-синтетазы, что приводит к катализирует накоплению летального ацетилирование количества фосфинотрицина, аммония и таким в растениях. образом РАТ исключает гербицидную активность. L-изомер фосфинотрицина (L-PPT) широко используется как средство борьбы с сорняками широкого спектра действия. L-PPT является активным ингредиентом гербицида, разработанного фирмой Hoechst и имеющего название BASTA. Данный Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 16 изомер является структурным аналогом глютамата, субстрата глютамин-синтетазы (см. сравнение структур L-PPT и глютамата на Рисунке 8). O H H CH3 — P — CH2 — CH2 — C — COOH OH HOOC — CH2— CH2 — C— COOH NH2 NH2 Рисунок 8. L-изомер фосфинотрицина (слева) в сравнении с глютаматом (справа). Первоначально L-PPT был выделен из бактерий Streptomyces viridochromogenes, которые синтезируют только L-изомер фосфинотрицина. Синтетический глюфосинат аммония является эквимолярной, рацемической смесью D- и L – изомеров РРТ (Dизомер не обладает гербицидной активностью). Показано, что РАТ специфически воздействует на фосфинотрицин, так как его активность не проявляется по отношению к другим обычным субстратам ацетилтрансферазы, включая пируват, холин или серин. Изучение переваривания in vitro, в условиях, имитирующих условия желудочнокишечного тракта млекопитающих, проведенное с белком РАТ, экспрессированым в клетках E.coli, показало, что данный белок переваривается также, как обычные пищевые белки. Ген толерантности к глюфосинату аммония вводился одновременно в качестве селективного маркера, позволяющего идентифицировать трансформированные эмбрионы на селективной среде, и позволяющего также отслеживать введенные гены в процессе выращивания растений. Как докладывалось (FSANZ, 2000), молекулярнобиологический анализ показал, что линия Bt-176 содержит одну копию гена bar, под транскрипционным контролем 35S промотора и 35S терминатора вируса мозаики цветной капусты (P-CaMV 35S и T-CaMV 35S, соответственно) (см. Рисунок 9). P-35S bar T-35S Рисунок 9. Схематическое изображение гена bar (из Matsuoka et al., 2000) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 17 Метод разработки Трансформационное событие Bt-176 получено методом баллистической трансформации инбредной линии кукурузы CG00526 (Zea mays L.) с участием двух плазмид. Две синтетические конструкции гена cryA(b), были клонированы совместно в одном плазмидном векторе (pCIB4431). Второй плазмидный вектор (pCIB3064) содержал ген толерантности к гербициду (bar), выделенный из почвенной бактерии Streptomyces hygroscopicus. Оба вектора были введены в линию кукурузы CG00526 путем микроинъекции, баллистическим методом в незрелые эмбрионы. Молекулярнобиологический анализ трансформированных растений показал, что две или более копий каждой плазмидной конструкции интегрированы в геном данной линии кукурузы. Тесты и Нозерн-блот анализ показали, что ген устойчивости к ампицилину (bla ген), контролируемый бактериальным промотором (используемым для селекции векторов бактериального происхождения), не экспрессировался ни в тканях листьев, ни в пыльце растений. Два независимых трансгенных события кукурузы были выбраны для дальнейшего скрещивания и характеристики: Событие 171 и Событие 176 (Koziel et al., 1993). Дополнительные исследования подтвердили присутствие в кукурузе Bt-176 гена cry1A(b) (Koziel et al., 1993), генов bar и bla (Privalle, 1994). Как докладывалось Организацией, контролирующей стандарты пищевых продуктов в Австралии и Новой Зеландии (Food Standards Australia New Zeland - FSANZ, 2000), полученные данные указывали, что в геноме данной трансформированной линии кукурузы Bt-176 может присутствовать до шести копий генов cry1A(b) и bla, и, по крайней мере, две копии гена bar (вместе с 35S промотором), что было определено методом гибридизации по Саузерну c ДНК кукурузы Bt-176 (Privalle, 1994). Стабильность вставки вводимых признаков Согласно докладу (FSANZ, 2000), продукция белков CRIA(b) и РАТ в листьях и пыльце растений, выращиваемых в теплице, как было показано, оставалась стабильной в течение четырех последовательных поколений обратного скрещивания. Сегрегационный анализ показал, что признаки устойчивости к кукурузному мотыльку (ECB) и толерантности к гербициду ко-сегрегировались по Менделю, как связанные признаки. При изучении 3240 растений, были выявлены только пять растений (0,15%), которые обладали толерантностью к глюфосинату аммония, но не обладали устойчивостью к кукурузному мотыльку и повреждались его личинками. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 18 Решения контролирующих органов. В августе 1995 года Агентство по защите окружающей среды (Environmental Protection Agency) США разрешило коммерциализацию выращиваемой на полях кукурузы, происходящей от трансформационного события 176, вплоть до 2000 г. Коммерциализация данной линии кукурузы была санкционирована EC в соответствии с решением Комиссии 97/98/EC от 23 января 1997 года. Данная линия кукурузы предназначена для выращивания с целью производства семян; с целью силосования и получения зерна на корм скоту; а также с целью получения зерна для промышленной переработки (Решение Комиссии 97/98/EC). Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 19 Литература Agbios database on Essential Biosafety. Molecular Characterization of MON810 inserted DNA. http://www.essentialbiosafety.info/dbase.php Armstrong, C. L., Green, C. E., and Phillips, R. L. 1991. Development and availability of germplasm with high type II culture formation response. Maize Genetics Cooperation NewsLetter 65, 92-93. BATS (2003). Genetically Modified (GM) Crops: molecular and regulatory details. http://www.gmo-watch.org Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate, Plant Biosafety Office. Decision Document DD96-09: Determination of Environmental Safety of Event 176 Bt Corn (Zea mays L.) Developed by Ciba Seeds and Mycogen Corporation. http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/pbo/dd/dd9609e.shtml Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate, Plant Biosafety Office. Decision Document DD95-05: Determination of Environmental Safety of Monsanto Canada Inc.'s Glyphosate Tolerant Soybean (Glycine max L.) Line GTS 40-3-2. http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/pbo/dd/dd9505e.shtml Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate, Plant Biosafety Office. Decision Document 97-19: Determination of the Safety of Monsanto Canada Inc.'s YieldgardTM Insect Resistant Corn (Zea mays L.) Line MON810. (http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/pbo/dd/dd9719e.shtml) Commission Decision 97/98/EC of 23 January 1997 concerning the placing on the market of genetically modified maize (Zea mays L.) with the combined modification for insecticidal properties conferred by the Bt-endotoxin gene and increased tolerance to the herbicide glufosinate ammonium, pursuant to Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 31, 1.2.1997, p. 69). Commission Decision 96/281/EC of 3 April 1996 concerning the placing on the market of genetically modified soya beans (Glycine max L.) with increased tolerance to the herbicide glyphosate, pursuant to Council Directive 90/220/EEC. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 20 (OJ L 107, 30.4.1996, p. 10). Commission Decision 98/294/EC of 22 April 1998 concerning the placing on the market of genetically modified maize (Zea mays L. line MON810), pursuant to Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 131, 5.5.1998, p. 33) Food Standards Australia New Zealand – FSANZ (formerly Australia New Zealand Food Authority - ANZFA) (2000). Draft risk analysis report. Food produced from insect-protected Bt-176 corn. Application 385. http://www.foodstandards.gov.au/_srcfiles/A385%20FA.pdf Koziel, M.G. et al. (1993). Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. BIO/Technology 11, 194–200. Lee, T.C., Zeng, J., Bailey, M., Sims, S.R., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1995). Assessment of equivalence of insect protected corn- and E. coli-produced B.t.k. HD-1 protein. Plant Physiol. Suppl. 108, 151. Matsuoka, T., Kawashima, Y., Akiyama, H., Miura, H., Goda, Y., Kusakabe, Y., Isshiki, K., Toyota, M., and Hino, A. (2000). A method of detecting Recombinant DNAs from four lines of genetically modified maize. Journal of Food Hygienic Society of Japan 41, 137-143. Monsanto Company (2000). Updated Molecular Characterization and Safety Assessment of Roundup Ready Soybean Event 40-3-2. Monsanto Report, Product Safety Centre. Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Delannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N., Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eichholtz, D.A., Peschke, V.M., Nida, D.L., Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification, and characterization of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science 35, 1451– 1461. Padgette, S.R., Re, D.B., Barry, G.F., Eicholtz, D.E., Delannay, X., Fuchs, R.L., Kishore, G.M., and Fraley, R.T. (1996). New weed control opportunities: Development of soybeans with a Roundup Ready gene. In Duke, S.O. (ed.) Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7 R Характеристика сои Roundup Ready , кукурузы MON810 и кукурузы Bt-176 21 Herbicide-Resistant Crops. Agricultural, Economic, Regulatory and Technical Aspects. CRC Lewis Publishers., pp 53-84. Privalle, L. 1994. Quantification of Cry1A(b) and PAT proteins in Bt corn (corn) tissues, whole plants and silage. Performing laboratory: Ciba Seeds Agricultural Biotechnology Research Unit, Ciba-Geigy Corporation, Research Triangle Park, NC, USA. Study No CAB-009-94 Windels, P., Taverniers, I., Depicker, A., Van Bockstaele, E. and De Loose, M. (2001). Characterisation of the Roundup Ready soybean insert. European Food Research Technology 213, 107-112. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов Сессия 7
