А.С.Чунаев – кандидат биологических наук, доцент кафедры

Отзыв
на диссертацию Тютеревой Елены Владимировны на тему «Реакция
фотосинтетического аппарата chlorina 3613 (Hordeum vulgare L.), лишённого хлорофилла
b, на изменение уровня инсоляции» на соискание ученой степени кандидата
биологических наук по специальности 03.01.05 – физиология и биохимия растений.
Современные представления о физиологии и биохимии растений в значительной
степени основываются на изучении мутантов. Невозможность получения широкого
спектра ауксотрофных мутантов растений, по примеру гетеротрофных организмов,
свидетельствует о множественности альтернативных путей синтеза аминокислот у
растений. Многочисленные рецессивные хлорофильные мутанты растений летальны, так
что соответствующие аллели поддерживаются в генетических коллекциях в
гетерозиготных растениях, а исследования мутантных растений проводятся с
проростками. В этой связи понятен интерес биологов к жизнеспособным мутантам гороха,
наследование фенотипа которых описал основатель генетики Грегор Мендель.
Нормальное запасание продуктов фотосинтеза в форме разветвленных молекул крахмала
оказалось нарушенным у растений, семена которых выглядят морщинистыми после
высыхания. Желтую окраску зрелых семян гороха удалось объяснить адаптивной
деградацией хлорофилла при увядании растений.
Из немногочисленных жизнеспособных мутантов растений, мутанты, лишённые
хлорофилла b, одни из самых изученных. Потенциал этих мутантов в качестве объектов
для изучения вопросов физиологии и биохимии растений раскрыт далеко не полностью.
Изучению подвергаются, как правило, проростки растений на стадии первого листа, в
разных частях которого, от базальной до апикальной исследуется экспрессия
хлоропластных и ядерных генов, контролирующих биогенез хлоропласта. Уместно
вспомнить, что в моей работе 1983 года с мутантом ячменя chlorina f2 3613, любезно
предоставленным Т.Г.Масловой, было показано наличие двух максимумов
фотосинтетического включения 13CO2 по длине первого листа – один на апикальном конце
листа, где ранее была продемонстрирована активная экспрессия хлоропластного гена
Рубиско, а другой – в базальной половине листа, где активно экспрессируются ядерные
гены апопротеина светособирающего хлорофилл a/b-белкового комплекса (Чунаев и др,
1983). Максимум в базальной половине листа у мутанта без хлорофилла b был менее
выражен, чем у нормальных растений.
Изучение мутантных растений chlorina 3613 (Hordeum vulgare L.) на стадии
трубкования, предпринятое Е.В.Тютеревой призвано ликвидировать существующий
пробел в исследованиях мутантных растений на разных стадиях онтогенеза и ответить на
вопросы о роли хлорофилла b и компонентов хлорофилл a/b-белковых комплексов в
обеспечении адаптивной способности растения как целого посредством участия в
различных адаптационных механизмах. Работа, представленная к защите, несомненна
актуальна и заслуживает пристального внимания и тщательного рассмотрения.
Перед нами тщательно спланированное и довросовестно выполненное
разностороннее исследование фенотипов, образуемых мутантными растениями ячменя
chlorina f2 3613, в различных условиях выращивания. В работе использованы
современные методы изучения ультраструктуры хлоропластов(ТЭМ), анализа
апопротеинов хлорофилл-белковых комплексов(гель-электрофорез и вестерн-блоттинг),
анализа содержания пигментов (высокоэффективной жидкостной хроматографии в
обратной фазе), интенсивности фотосинтеза (инфракрасным газоанализатором).
Результаты, полученные в течение нескольких полевых сезонов, подвергнуты
статистической обработке. Обсуждение собственных экспериментальных данных
проведено в русле существующих представлений о механизмах акклимации
фотосинтетического аппарата растений к повышенной освещённости. Экспрессия
мутантной аллели прослежена на разных уровнях организации растения (на
молекулярном, на ультраструктурном, на уровне листа и на уровне целого растения).
В результате ознакомления с диссертацией создаётся целостное представление о
плейотропных эффектах мутантной аллели clo3613, которое можно использовать в качестве
классического примера при чтении лекций по генетике фотосинтеза. Я читаю лекции по
генетике хлоропластов в рамках бакалаврского курса «Генетика органелл» на кафедре
генетики биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского университета. Я считаю
достойным, использовать результаты диссертационного исследования Е.В.Тютеревой в
своём цикле лекций.
Текст диссертации построен по традиционному плану. Обзор литературы,
изложенный на 33 страницах диссертации (с 10 по 43 страницы) посвящён литературным
данным, имеющим отношение к экспериментальной работе диссертанта. Обзор логично
выстроен и разбит на разделы. К сожалению, при изложении и при обобщении
литературных данных диссертант не избежал досадных ошибок, неточностей и
преувеличений. Так, на странице 17 диссертации Е.В.Тютерева пишет:
«Все ферменты пути биосинтеза хлорофилла кодируются ядерной ДНК,…», не
ссылаясь на какой-либо обзор, или на экспериментальные исследования других учёных.
На самом многие растения (голосеменные, у зелёные водоросли) способны к синтезу
хлорофилла в темноте. В состав фермента, отвественного за темновой синтез хлорофилла,
входят три субъединицы, гены которых локализованы в хлоропластной ДНК.
Но что ещё более важно, и это справедливо отмечено на рисунке 1.5 обзора
литературы, биосинтез хлорофилла у всех растений начинается с присоединения
молекулы глутаминовой кислоты к молекуле транспортной РНК. Ускользнуло от
внимания Е.В.Тютеревой только то, что ген глутамиловой транспортной РНК, trnE,
находится в хлоропластном геноме.
Значение хлоропластного гена trnE для биогенеза фотосинтетического аппарата
трудно переоценить. От этого гена не только зависит баланс между синтезом хлорофилла
и синтезом белков-апопротеинов хлорофилл-белковых комплексов, но, как оказалось,
именно ген глутамиловой транспортной РНК переводит биогенез хлоропласта с
использования кодируемой в ядре РНК-полимеразы на использование кодируемой в
хлоропласте РНК-полимеразы бактериального типа, которая преимущественно
транскрибирует гены хлоропластной ДНК для синтеза белков фотосинтетического
аппарата.
На странице 16 диссертации со ссылкой на обзорную работу Хубера утверждается,
что «У зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii импорт белков происходит, но
стабильных ССК не образуется, и наблюдается быстрая деградация апопротеинов (Hoober
et al., 2007).» Внимательное прочтение этого обзора показывает, что утверждение
Е.В.Тютеревой с некоторой натяжкой можно отнести к мутантному штамму cbn1-113, но
не к дикому типу зелёной водоросли, выделенному из природы: «Accumulation of LHCPs
in vivo into the plastid of the alga Chlamydomonas reinhardtii was markedly reduced in the Chl
b-less strain, cbn1-113 (Park and Hoober, 1997). Mature-sized proteins were detected in the
cytosol, which indicated that import was aborted (White et al. 1996; Park and Hoober 1997).»
Хламидомонаде в обзоре литературы не повезло ещё раз. При перечислении
мутантов растений и водорослей, лишённых хлорофилла b, упоминается без ссылки один
из многочисленных мутантов Chlamydomonas reinhardtii, лишенных хлорофилла b.
Впрочем, не повезло и другим растениям, так как процитированы только работы по
описанию мутантов донника, но и эти работы почему-то отсутствуют в списке
литературы:
«Мутанты с заблокированным биосинтезом Хлb. Мутантные растения,
вегетирующие и воспроизводящиеся в отсутствие Хлb, относительно немногочисленны.
На сегодняшний день такие мутанты получены из растений нескольких видов: ячменя
(chlorina f2), кукурузы, гороха,риса (chlorina 1-10), сои, донника (sweet-clover U 395
ch5/ch5), пшеницы (wheat Driscoll mutant), Arabidopsis thaliana и Chlamydomonas
reinhardtii (cbs3) (Yang et al., 1990; Bevins et al.,1992).»
Считаю своим долгом изложить историю получения и генетических исследований
мутантов Chlamydomonas reinhardtii, поскольку я имею к ним непосредственное
отношение.
Первый мутант Chlamydomonas reinhardtii, N-48 был получен А.В.Столбовой в ходе
диссертационного исследования. Методом бумажной хроматографии у этого мутанта
было показано отсутствие хлорофилла b и неоксантина. После серии митотических
делений при пересевах культуры N-48 перестал проявлять мутантные признаки и более не
отличался от штамма дикого типа по содержанию пигментов. В 1981 году я вовлёк в
скрещивания мутант С-48, незадолго до этого полученный в Пущино-на-Оке под
действием γ-лучей, и показал в совместной работе с Г.А.Корнюшенко, что за отсутствие
хлорофилла b у этого мутанта ответственна рецессивная мутантная аллель гена cbn1,
которая в качестве плейотропного эффекта определяет сниженное содержание
каротиноидов и в наибольшей степени – неоксантина (отсюда название гена - cbn1, что
означает chlorophyll b and neoxanthin deficiency). Сниженное содержание неоксантина
характерно и для мутанта chlorina f2 Hordeum vulgare. Окраска (цветность) культур
сегрегантов из скрещиваний штаммов хламидомонады, лишённых хлорофилла b,
варьировала от светло-зелёной до тёмно-зелёной и перекрывалась с нормой рефкции
сегрегантов дикого типа. Мною была разработана методика качественной оценки
признака «отсутствие хлорофилла b» культур хламидомонады. С использованием этого
метода Ольга Николаевна Болдина довела число независимо полученных мутантных
аллелей в гене cbn-1 до 54 (Чунаев и др., 1984). Впоследствии в отдельных исследованиях
с моим участием было показано, что мутант pg-113, полученный в Швейцариии и мутанты
серии cbs по гену САO, полученные в Японии, аллельны cbn1-мутантам (Chunaev et al.
1992, Mijit et al., 2006). Вместо аббревиатуры pg-113 стали применять обозначение cbn1113, а названия генов CAO и CBN1 как синонимичные, так как они относятся к одному и
тому же гену. Ген CBN1 картирован в I-й группе сцепления Chlamydomonas reinhardtii
(Мирная и др., 1990). Завершая самообзор работ по генетике мутантов Chlamydomonas
reinhardtii, лишённых хлорофилла b, упомяну диссертационную работу Карины
Владимировны Никулиной, выполненную под моим руководством, в которой было
показано, что возврат к дикому типу в ходе митотических делений мутантов по гену cbn-1
может быть результатом мутаций независимо наследуемых ядерных генов-супрессоров.
Объектам данного исследования – мутантам ячменя, лишённым хлорофилла b,
посвящён отдельный подраздел обзора литературы:
«Мутанты ячменя линии f2. По литературным данным известно четырнадцать
хлорофилльных аллельных мутаций по локусу clo-f2 хромосомы 3S ячменя культурного
(Hordeum vulgare L.).»
С этим предложением входит в противоречие фраза из автореферата диссертации
Е.В.Тютеревой:
«Мутация clo3613 до настоящего времени не картирована;..».
Известно, что для картирования мутантной аллели до локуса на хромосоме
достаточно картировать любую из аллелей. Действительно, в своём отчёте в 1992 году
David J. Simpson и Diter von Wettstein указывают на принадлежность мутантной аллели
clo3613 к локусу clo-f2 хромосомы 3S. Положение гена fch2 (синоним clo-f2) на
генетической карте ячменя опубликовано. Иными словами, мутация clo3613 к настоящему
времени картирована.
Меня всегда волновал вопрос о функции неоксантина, накапливающегося в клетках
мутантов, лишённых хлорофилла b, и теперь, благодаря работе Е.В.Тютеревой, у меня
появилось ощущение, что я вижу ответ. После снятия затенения с мутантных растений
(как 60%-ного, так и 40%-ного) содержание неоксантина возрастает, а затем возвращается
к исходному уровню (См.Рис.5.5Е и 5.8Е диссертации Е.В.Тютеревой). Смею
предположить, что это временное возрастание содержания неоксантина у мутанта
отражает реакцию мутантных растений на восстановление стрессовых условий
(повышенной по сравнению с подпологовой дневной освещённостью и температурой). На
мой взгляд, эта одинаковая кинетика в содержании неоксантина в разных вариантах
эксперимента является одним из компонентов научной новизны данной работы и
заслуживает того, чтобы быть отражённой в выводах из диссертации. Неоксантин
является предшественником абсцизовой кислоты – фитогормона, участвующего в реакции
растений на стресс. Можно себе представить, что с убылью вновь синтезированного
неоксантина после снятии затенения коррелирует увеличение содержания абсцизовой
кислоты. Проверка этого предположения может быть предметом специального
исследования.
В разделе 7.5. обсуждения рассматриваются изменения в пигмент-белковом составе
ФСА в поколениях потомков высокопродуктивного фенотипа. К сожалению, ни в одной
из глав с описанием собственных результатов диссертанта не показаны
экспериментальные данные, положенные в основу этого обсуждения. В связи с этим,
хотелось бы задать диссертанту несколько конкретных вопросов, ответы на которые,
скорее всего, должны содержаться в протоколах многолетних наблюдений
Е.В.Тютеревой:
1. Когда (в каком году) из семян, собранных с растений cloX, выросли растения
cloY?
2. Когда (в каком году) из семян, собранных с растений cloX, выросли растения
cloXX?
3. Какое количество растений соответствует 100% в каждом из этих случаев.
4. Какова была всхожесть семян cloX в каждом из этих случаев?
5. У скольких растений cloY было измерено содержание хлорофилла b в листьях и
каковы среднее значение использованного показателя и ошибка среднего?
Е.В.Тютерева пытается объяснить полученные данные эпигенетическими
изменениями. Вместе с тем, появление двух разных контрастных фенотипов в результате
одинаковых воздействий требует двух разных объяснений. Появлению эпигенетических
изменений (таких как парамутации у кукурузы), маскирующихся под проявление
мутантных аллелей, найдено объяснение на молекулярном уровне. Появление адаптивных
эпигенетических изменений, наследуемых в ряду мейотических поколений, насколько мне
известно, не описано в современной научной литературе, отражает научную новизну
проведённого исследования и пока ещё не нашло общепринятого толкования. Если
принять точку зрения Дитера фон Веттштайна на природу блока у мутантов chlorina f2
(дефект в гене хлорофилл a-оксигеназы), то представляет интерес рассмотрение мутаций
таких генов у филогенетически близких групп растений в соответствии с законом
гомологических рядов наследственной изменчивости Н.И.Вавилова. У риса Oryza sativa
описан тандем из двух хлорофилл a-оксигеназных генов. Мутанты по одному из генов
имели бледно-зелёный фенотип, а выключение другого гена не изменяло содержания
хлорофилла b. Один из генов был светорегулируемым, а другой, предположительно,
экспрессировался в темноте. Если у исследованного в данной работе мутанта ячменя
chlorina f2 также имеется молчащий ген, не затронутый ядерной мутацией clo3613,
объяснение наследования высокопродуктивного фенотипа может включать в себя
перестройку комплекса транскрипционных белковых факторов активации работы генов и
не нуждается в предположении о том, «что ядерная мутация clo3613 затрагивает одно из
регуляторных звеньев в цепи биосинтеза хлорофиллов», высказанном в заключении
автореферата Е.В.Тютеревой.
Выводы диссертации обоснованы представленным в диссертации
экспериментальным материалом. Автореферат отражает основное содержание
диссертации.
Оценивая работу в целом, можно заключить, что по объёму проведённых
исследований, по научной значимости полученных результатов, по разнообразию и
адекватности применённых методов исследования, диссертация «Реакция
фотосинтетического аппарата chlorina 3613 (Hordeum vulgare L.), лишённого хлорофилла
b, на изменение уровня инсоляции» соответствует требованием ВАК, предъявляемым к
диссертациям на соискание ученой степени кандидата биологических наук, а её автор –
Тютерева Елена Владимировна заслуживает присвоения ей искомой степени кандидата
биологических наук по специальности 03.01.05 – физиология и биохимия растений.
2 декабря 2011 года
А.С.Чунаев – кандидат биологических наук,
доцент кафедры генетики Биологопочвенного факультета СанктПетербургского государственного
университета