С.А. Рамазанова, С.З. Гучетль, Т.А. Челюстникова, Т.С

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 2 (141), 2009
____________________________________________________________________________________________________
С.А. Рамазанова,
кандидат биологических наук
С.З. Гучетль,
кандидат биологических наук
Т.А. Челюстникова,
старший научный сотрудник
Т.С. Антонова,
доктор биологических наук
ГНУ ВНИИ масличных культур
Россия, 350038, Краснодар, ул. Филатова 17,
Тел.: (861) 275-86-53, e-mail.vniimk-center@mail.ru
ТЕХНОЛОГИЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ СОИ НА ОСНОВЕ SSR-ЛОКУСОВ ДНК
Ключевые слова: соя, ssr-локусов ДНК, аллели, генотипирование
УДК 633.853.52:575
Введение. В настоящее время одним из главных методологических подходов в изучении
генетического полиморфизма растений является применение молекулярных маркеров. С их использованием можно различать генотипы растений, т.е. получить индивидуальную характеристику
отдельного генотипа – ДНК-профиль. Метод анализа полиморфизма микросателлитных локусов
позволяет получить воспроизводимые, информативные профили известных фрагментов генома и
поэтому является наиболее перспективным для идентификации, паспортизации и сертификации
сортов и гибридов культурных растений [1, 2].
По данным ряда авторов, высокий уровень полиморфизма у сои, достаточный для паспортизации, удалось выявить только по микросателлитным локусам [3-6].
Поэтому целью наших исследований является разработка удобной в использовании, относительно быстрой и надежной технологии для генотипирования сои на основе анализа полиморфизма микросателлитных локусов ДНК.
Материалы и методы. В работе было использовано 73 генотипа, в том числе 67 сортов сои
из разных стран, три образца полукультурной сои (G. gracilis) и три образца дикорастущей сои
(G. soya).
Выделение ДНК, ее амплификацию, электрофорез и визуализацию продуктов амплификации проводили по стандартным методикам в авторской модификации, описанными нами ранее [7].
Индекс полиморфного информационного содержания (PIC) [8] и эффективное число аллелей [6] вычисляли по формулам:
(1),
где P – частота j паттерна для локуса i и суммирование распространяется на n паттернов.
(2),
где ne – эффективное число аллелей.
Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов проводили с
использованием программы Gel-Pro Analyzer 3.1.
Статистическую обработку результатов и построение дендрограммы проводили с помощью
кластерного анализа методом Уорда.
Результаты и обсуждение. В основе предлагаемой технологии генотипирования сои лежит
метод анализа полиморфизма микросателлитных локусов, выявляемый посредством полимеразной
цепной реакции (ПЦР) с использованием пар праймеров комплементарных последовательностям,
фланкирующим микросателлитные повторы. При выборе праймеров важным критерием являлось
выявляемое ими количество аллелей микросателлитного локуса. Поэтому на основании литературных данных [3, 4, 9] были выбраны 16 пар праймеров к микросателлитным локусам и проанализирована коллекция генотипов, включающая сорта селекции ВНИИМК и других российских и
зарубежных селекцентров, а также дикорастущих генотипов, полиплоидных и реплоидных форм.
Результаты амплификации ДНК 73 генотипов сои показали, что из 16 изученных SSR-локусов
13 проявили себя как полиаллельные, воспроизводимые и информативные. Мономорфными в изученной коллекции генотипов оказались локусы Soyac71 и 138ct04, а локус Sat43 был плохо воспроизводимым. Поэтому анализ выполняли по 13 SSR-локусам, представленным в таблице 1.
Таблица 1 – Характеристика микросателлитных локусов ДНК
Локус
Satt1
Satt 2
Satt5
Satt9
Soypr 1
Soygy 2
Sat 1
Sat 36
Soyhsp176
Soybab
Soyhsp179
Soysc514
138ct21
Среднее
Последовательность фланкирующих
праймеров 5’-3’
AGT ACA TAG ATA TTA AAG TCT
AAA TGA TGA ACG TGA ATT ATT
AAT AAT GTG GAA ACT AAA TGG
TAA TGT GCC TAT CCT TGT CTT
TAT CCT AGA GAA GAA CTA AAA AA
GTC GAT TAG GCT TGA AAT A
ATT ACT AGA GAA ATT AGT TTA
CTT ACT AGG GTA TTA ACC CTT
CGA AGA GCT ACG TGC CAA ATT
GTT AGA AAA CTC CGC CCA CAC
AAA ATT GAA AGT GTC ACA CCC C
TTA AAA TCG ATT AAT TGG CAT GA
CTG GTG GAC TAT TGA TAC GAC C
AAC TGC GAA GAT ACT ACC CTC C
AAA TTC TGT TCA TTG TCC GTC
CAT TTT AAT ATC CCG AGT AGG
TGT GGG CCA CAA AAC GTA TAG
CGT ACG TTC TAG CTA GTC TTC
TAG AAT GAC AGG ACA TCA CAT
TCA TCA TTT TGT AGG CCA ACT
ATA CCA GTT GAT CTG CAT ATT
AAA ACA TCG TCT ACT TAA GTC
AGT CGT AGT CTA GCT ACA TGA C
CAG TGG AAT ATG TGA AGC AAT G
TGA GGC ACA TTG TTC TGG
CGG GTA CCC ATG AAT TGG
Повтор
Молекулярный вес продукта (п.н)
Количество
аллелей
(ATT)24
141-150
4
(AAT)18
140-152
2
(TAA)21
157-177
4
(AAT)12
142-221
5
(TAT)20
163-188
2
(AT)9(ATT)6
167-175
3
(AT)17
188-235
4
(AT)19
115-185
2
(AT)15
118-135
3
(АТ)24
289-342
3
(ТА)10
178-228
2
(АТ)14
171-209
3
(CT)20
85-102
2
-
-
3
Эффективное число
аллелей
3,32
1,72
3,43
5,30
1,87
1,22
3,56
1,45
1,62
1,53
1,59
2,09
1,28
2,31
PIC*
0,70
0,42
0,71
0,81
0,46
0,18
0,72
0,31
0,38
0,35
0,37
0,52
0,21
0,47
* PIC – индекс полиморфного информационного содержания
В изученной группе генотипов по 13 микросателлитным локусам было выявлено всего 39
аллелей. Число аллелей на локус варьировало от 1 до 5, что в среднем составило 3 на локус. У локуса Satt9 было выявлено максимальное количество аллелей – пять, у трех локусов Satt1, Satt5 и
Sat1 – по четыре, у пяти локусов Soygy2, Sat36, Soyhsp176, Soybab, Soysc514 – по три, у локусов
Satt2, Soypr1, Sat36, 138ct21 и Soyhsp179 – по 2 аллеля.
Эффективное число аллелей – показатель, характеризующий локусы по частоте встречаемости аллелей, – в изучаемой выборке генотипов варьировало от 1,22 до 5,3. Среднее эффективное
число аллелей на локус составило 2,34 (табл. 1).
Для анализа данных амплификации микросателлитной ДНК использовали индекс полиморфного информационного содержания (PIC). Он был рассчитан по формуле (1) для каждого SSRлокуса и варьировал от 0,21 для локуса 138ct21 до 0,81 для локуса Satt9 (табл. 1). Среднее значение индекса полиморфного информационного содержания для изученной группы генотипов составило 0,47.
На довольно малое для маркерной системы число PIC повлияло то, что два локуса показали
очень низкие значения – 0,18 (Soygy2) и 0,21 (138ct21). У этих локусов частоты встречаемости аллелей сильно различались, так как некоторые из них были обнаружены только у дикорастущих и
полукультурных генотипов и совсем не выявлены у сортов сои. Например, у локуса Soygy2 аллель
1 выявлен только у полукультурных (G. gracilis), а аллель 3 у дикорастущих (G. soja) генотипов
(табл. 2).
Таблица 2 – Формулы генотипов сои
Сорт
Формула*
Сорт
Формула*
Лань (ВНИИМК)
Лира (-//-)
Фора (-//-)
Валента (-//-)
Дельта (-//-)
Парма (-//-)
Рента (-//-)
РВБ (-//-)
РВФ (-//-)
Веста (-//-)
Вилана (-//-)
Лакта (-//-)
Ника (-//-)
Дива (-//-)
Диана (-//-)
А2B2C2D1E1F1G2H3I2J1K1L2M2
A1B1C1D3E2F1G2H2I2J2K2L2M2
A2B1C2D2E1F4G1H3I2J2K2L2M2
A3B2C2D4E1F2G2H3I2 J2K2L2M2
A3B2C2D5E1F1G2H3I2 J2K2L1M2
A3B1C1D4E2F2G2H2I2 J1K2L3M2
A3B2C2D2E1F2G2H3I2 J1K2L3M2
A3B2C2D3E1F2G2H3I2 J1K2L1M2
A2B2C2D2E1F2G2H3I2 J2K2L2M2
A2B1C3D3E1F1G2H3I2 J2K2L3M2
A3A4B2C2D1E1F2G2H3I2J2K2L2M2
A2B2C2D2E1F1G2H3I2 J2K2L2M2
A2B2C2D1E2F1G2H3I2 J2K2L2M2
A2B2C1D5E1F1G2H3I2 J2K2L2M2
A2B1C2D2E3F2G2H3I2J2K2L3M2
A2B1C2D4E2F2G1H3I2 J3K2L1M2
A2B1C3D5E1F1G1H3I2 J2K1L2M2
A3B1C1D1E2F2G1H3I2 J2K2L2M2
A3B2C2D5E2F2G2H3I2 J2K2L2M2
A1B2C1D1E1F1G2H2I2 J2K2L3M2
A3B2C2D5E2F3G2H3I2 J2K1L2M2
A2B1C1D1E2F2G2H3I2 J2K2L2M2
A2B2C2D5E1F2G2H2I2 J2K2L2M2
A3B2C2D1E1F1G2H3I2 J1K1L2M2
A2B1C3D3E1F1G2H3I2 J2K2L3M2
A2B2C1D2E2F2G2H3I2 J2K1L3M2
A1B2C3D5E1F4G2H3I2J3K2L2M2
A1B2C3D3E1F1G2H3I2 J2K2L2M2
A2B2C2D3E1F2G2H3I2 J2K2L2M2
A1B1C4D3D5E1F2G2H3I2J2K1L3M2
Памела (-//-)
Д-6 (-//-)
Д-4 (-//-)
Альба (-//-)
Трембита (-//-)
Лиана (-//-)
Лада (-//-)
Б-2 (-//-)
Дуар (ВНИИМК,
Армавир)
Williams (США)
Hood-75 (-//-)
A3B1C2D3E1F4G2H3I2 J2K2L2M2
A1B2C1D3E2F1G2H2I2J2K2L2M2
A1B2C1D3E2F2G2H2I2J2K2L2M2
A2B2C2D3E2F4G2H3I2J1K2L2M2
A3B2C4D3E2F3G2H2I2J2K2L3M2
A3B2C4D2E2F2G2H2I2J2K2L2M2
A3B2C3C2D4E2F2G2H2I2J1K2L3M2
A2B2C3D1E1F1G2H3I2J2K2L3M2
A4B2C3D1E1F2G2H3I2J2K2L1M2
Sari (Иран)
Sepideh (-//-)
Sahar (Иран)
Safi-Abad1 (-//-)
Shimаbara wase (Япония)
Юг-30 (Украина)
Офелия (-//-)
Припять (Белоруссия)
Брянская Мия (-//-)
Красивая Меча (РФ, Орел)
Ланцетная (-//-)
Алтом (РФ, Алтай)
Сибниисхоз 6 (РФ, Омск)
Эльдорадо (-//-)
Приморская 56
(РФ, Благовещенск)
Касатка (РФ, Рязань)
Светлая (-//-)
Малета (-//-)
Магева (-//-)
Белгородская 6 (РФ, Белгород)
Белгородская 48 (-//-)
Селекта301(РФ, Краснодар)
К-10641 (ВИР)
Кубанская 4958
(КОС ВИР)
Куба (-//-)
K-4947 (G.gracilis)
Т-215 (-//-)
Т-201 (-//-)
Т-245(-//-)
Stine 52 (-//-)
Stine 01 (-//-)
Алдана (Польша)
Goldor (Франция)
Yieso (-//-)
Petit Jaune de Hongrie
(-//-)
Bomax (Канада)
Orinoqua
(Бразилия)
A4B1C2D4E2F4G1H3I1J3K1L3M2
A1B1C4D1E1F2G2H3I2 J2K2L2M2
A2B1C3D2E1F3G2H3I2J2K2L3M1
A2B1C4D5E2F2G1H3I2J2K1L2M2
A2B2C4D5E2F1G1H3I2J2K1L2M2
A3B2C1D4E2F3G2H3I2J2K1L2M2
A1B2C3D5E1F1G2H3I2J2K2L3M2
A2B2C1D5E2F3G1H3I2J2K2L2M2
A3B2C4D1E1F3G2H3I2J2K2L2M2
K-5683 (G.gracilis)
K-5142 (G.gracilis)
К-1007(G.soya)
Соя-93 (G.soya)
Соя-133 (G.soya)
Е-шен-доу (Китай)
RP-Вилана
Вилана (тетраплоид)
Williams (тетраплоид)
A2B2C3D1E2F1G2H3I2 J2K2L2M2
A2A4B1C2D1E2G2F2H1I1J2K1K2L3
M1
A2B1C3D4E2F4G2H3I1J2K1K2L2M1
A2B2C2D5E2F4G1H1I2J2K1L3M1
A4B1C1D3 E1F4 G2H3I2 J2K2L2M1
A4B2 C1D2E2 F3G2H2I3J2K1L2M1
A4B2 C1D2E2 F3G2H2I3J1K2L2M1
A4B1C2D4E2F4G2H3I1J3K1L3M1
A2B2C2D1E2F1G2H3I2J1K2L2M2
A1B2C4D5E1F2G2H3I2 J2K2L2M2
A3B2C3D3E1F2G2H3I2 J2K2L1M2
A2B2C3D5E1F1G2H2I2J2K2L2M2
A3B2C2D4E2F1G1H3I2J2K2L2M1
СП-1422-1461
A2B2C4D5D4E1F4G2H3I2 J2K2L3M2
A2B2C4D5E1F1G2H3I2J1K2L2M2
A2B2C2D1E2F1G1H3I2 J2K2L2M2
A3B2C3D3E1F3G2H3I2J2K2L3M2
A3B2C2D1E1F2G2H2I2J2K2L1M2
A3B2C2D4E2F3G2H3I2J2K2L2M2
A3B2C4D3E1F3G1H3I2J2K1L1M2
A1B2C2D5E2F2G2H2I2J2K2L2M2
A4B2C4D2E2F3G2H3I2J3K1L2M2
A4B2C2D1E1F1G2H3I2 J1K2L2M2
A3B2C1D4E2F3G2H3I1 J2K2L2M2
A4B2C3D5E1F4G2H2I2 J2K2L1M2
Примечание: код локуса A-Satt1; B-Satt2; C-Satt5; D-Satt9; E-Soypr1; F- Sat1; G-Sat36;
H-Soyhsp176, I-Soygy2, J-Soybab, K-Soyhsp179, L-Soysc514,M-138ct21.
На начальном этапе исследования были выбраны 9 пар микросателлитных праймеров, описанных в работах зарубежных авторов [3, 4]. Был оценен их уровень полиморфизма в коллекции,
содержащей 61 генотип сои, включающей 52 сорта сои (G. max) разных стран, три образца полукультурной сои (G. gracilis), три – дикорастущей сои (G. soja) и 3 – полиплоидных и реплоидных
форм сои.
Результаты амплификации ДНК 61 генотипа сои, описанные нами ранее [7], показали, что
девяти изученных SSR-локусов было недостаточно для идентификации всех образцов. Для сорта
Ника селекции ВНИИМК и реплоидной формы, полученной из сорта Вилана, а также дикорастущих генотипов Соя-93 и Соя-133 по девяти SSR-локусам были получены идентичные наборы аллелей. Увеличение количества анализируемых локусов с 9 до 13 позволило отличить сорт Ника от
реплоидной формы (форма с возвратной кратно пониженной плоидностью), полученной из сорта
Вилана, по локусу Soybab, а по локусам Soyhsp179 и Soybab различить дикорастущие генотипы
Соя-93 и Соя-133 (табл. 2)
В результате исследований для каждого сорта на основании полученного набора аллелей
микросателлитных локусов были составлены молекулярно-генетические паспорта, или так называемые «генетические формулы генотипов», представленные в таблице 2. Большими буквами латинского алфавита был обозначен код локуса, а нижний индекс – аллельное состояние данного
локуса.
Риcунок – Дендрограмма генетических взаимоотношений между 73 генотипами сои,
построенная по данным анализа 13 SSR-локусов.
На основании полученных данных о частоте встречаемости аллелей и об их размере была
проведена оценка степени генетического родства изученных генотипов сои. Для этой цели был
прменен кластерный анализ с использованием дисперсионного анализа оценки расстояний между
кластерами (метод Уорда). Полученная дендрограмма представлена на рисунке. Анализ
полученного иерархического дендрита позволил выделить в выборке исследованных генотипов сои
два основных кластера.
Кластер I можно разделить еще на два крупных субкластера. В один из них наряду с
сортами вошли образцы дикорастущей и полукультурной сои Соя-133, Соя-93, К-1007 (G. soya) и
К-4947, К-5683, К-5142 (G. gracilis), а также стародавний китайский сорт Е-шен-доу.
Дендрограмма характеризует генетические расстояния между сортами сои, что представляет интерес для селекционеров при выборе пар скрещиваний для создания новых сортов.
Выводы. В результате проведенной работы было установлено, что дискриминационный
потенциал изученной маркерной системы достаточно высок для того, чтобы использовать ее для
идентификации и паспортизации сортов сои. Были идентифицированы 73 генотипа сои, в том числе 24 сорта селекции ВНИИМК, для каждого из них были получены уникальные наборы аллелей.
На основании полученных данных об аллельном разнообразии изученных микросателлитных локусов разработаны молекулярно-генетические формулы, которые предложено использовать как
соответствующие паспорта для идентификации и сертификации сортов сои.
Предлагаемая технология предназначена для решения таких задач, как поддержание генетических коллекций, подбор родительских пар для скрещиваний, регистрация новых сортов, контроль генетической подлинности сортов и защита прав селекционеров.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и региональных инвесторов (проект № 08-04-99058).
Список литературы
1. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях // Научнометодическое руководство / Под. ред. Сиволапа Ю.М. – Киев: Аграрна наука, 1998. – 156 с.
2. Сулимова, Г. Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г. Е. Сулимова – 2004. – [Электронный ресурс] – режим доступа:
http://www.labsgi.by.ru
3. Morgante, M. Genetic mapping and variability of seven soybean simple sequence repeat loci /
M. Morgante, A. Rafalski, P. Biddle, S. Tingey et al // Genome. – 1994. – V. 37. – № 5. – P. 763-769.
4. Rongven, J. The use of microsatellite DNA markers for soybean genotype identification / J.
Rongven, M. Akkaya, A. Bhagwat, U. Lavi et al // Theor. Appl. Genet. − 1995. − V. 90. − P. 43-48.
5. Глазко, В. И. Генетически детерминированный полиморфизм ферментов у некоторых
сортов сои (Glycine max) и дикой сои (Glycine soja) / В.И. Глазко // Цитол. и генетика. – 2000. – Т.
34. – № 2. – С. 83-90.
6.Maughan, P. Microsatellite and amplified sequence length polymorphism in cultivated and wild
soybean / P. Maughan, M. Saghai -Maroof, G. Buss // Genome. − 1995. − V. 38. − P. 715-723.
7. Рамазанова, С. А. Полиморфизм микросателлитных локусов ДНК сортов сои селекции
ВНИИМК / С. А. Рамазанова, С.З. Гучетль, Т.А. Челюстникова, Т.С. Антонова // Сб. докл. межд.
научно-практ. конф. «Современные проблемы научного обеспечения производства подсолнечника», посвященной 120-летию со дня рождения академика В.С. Пустовойта» ВНИИМК, Краснодар,
Россия, 19-22 июля, 2006. – С. 234-239.
8. Botstein, D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Botstein, R.L. White, M. Skolnick, R.W. Davis // Am. J. Hum. Genet. –1980. – V. 32 –
P.314−331.
9. Hossain, K.G. Characterization and identification of (CT)n microsatellites in soybean using
sheared genomic libraries / K.G. Hossain, H. Kawai, M. Hayashi, M. Hoshi et al. // DNA Research. –
2000. – № 7. – P. 103-110.