Казахский национальный университет им. аль-Фараби Отбор пробиотиков с антимутагенной активностью
advertisement
Отбор пробиотиков с антимутагенной активностью Казахский национальный университет им. аль-Фараби Кистаубаева А.С., Савицкая И.С., Ахметова Ж.А., Искандарова К.А. Исследована антимутагенная активность культуральных жидкостей трех видов бифидобактерий в бактериальных тестах на мутагенез и репарацию. Показано, что бактериальные антимутагенные метаболиты способны работать как десмутагены, так и проявлять активность на клеточном уровне, являясь универсальными биоантимутагенами. Антимутагены – вещества, снижающие уровень спонтанной и индуцированной мутабильности. Активность антимутагенеза как элемента компенсационного подхода охраны генофонда стала очевидной в результате цикла исследований и разработок в этой области, в которых установлены антимутагенные эффекты различных агентов /1/. Прокариоты как потенциальные источники антимутагенов изучены слабо, хотя обнаружены штаммы пропионовокислых, молочнокислых бактерий, фекальных стрептококков, образующих эффективные антимутагены /2,3/. Они могут быть использованы как источники антимутагенов для предобработки пищевых продуктов и кормов с целью нейтрализации мутагенных/канцерогенных веществ, а также как пробиотики. Бифидобактерии – основная, наиболее многочисленная группа микроорганизмов в составе нормоценоза кишечника. С целью выяснения возможного антимутагенного действия бифидобактерий использовали серию модифицированных бактериальных тестов. Материалы и методы. В качестве источников антимутагенов использовали культуральную жидкость (КЖ) различных штаммов бифидобактерий из коллекции кафедры микробиологии. В качестве прямого мутагена использована нитозометилмочевина (НММ), поскольку нитрозосоединения могут образовываться в кишечнике из некоторых компонентов пищи, пищевых добавок или лекарственных веществ /4/. Оценку антимутагенного действия культуральной жидкости бифидобактерий проводили на микроорганизмах в тесте Эймса и SOS-хромотесте. Для этого использовали индикаторный штамм Salmonella typhimurium TA 100 и Escherichia coli EC 1000 (pJT43). Исследования на мутагенность и SOS-индуцирующую активность проводили по стандартному протоколу /5,6/. Предварительно определяли антимикробную активность культуральных жидкостей бифидобактерий в отношении индикаторных штаммов. Изучение протекторных свойств культуральных экстрактов бифидобактерий проводили в трех вариантах. В первом случае мутаген, индикаторный штамм и культуральная жидкость бифидобактерий вносились в чашки с селективной средой, во второммутаген предварительно инкубировали с фильтратом культуральной жидкости, затем 0,1 мл смеси добавляли к суспензии клеток тест-штамма и производили посев. В третьем варианте с мутагеном предварительно инкубировали суспензию клеток тест-штамма, затем клетки отмывали от мутагена и высевали на чашки с селективной средой, куда вносили фильтраты культуральных жидкостей бифидобактерий. Эффективность антимутагенного действия рассчитывали по специальным формулам /2,3/ и выражали в процентах, отражающих степень угнетения генотоксического эффекта мутагенов. Результаты исследований Традиционно при определении мутагенной активности химических соединений используется бактериальная тест-система Эймса, ставшая уже классической. Метод основан на способности мутагенов вызывать реверсии к прототрофности у ауксотрофных по гистидину штаммов Salmonella typhimurium. Ревертировавшие под действием мутагена клетки при высеве на селективную питательную среду образуют колонии. Если исследуемый агент оказывается мутагеном, то в его присутствии число таких колоний будет больше, чем в контроле (спонтанный уровень мутаций). Антимутагены снижают частоту индуцированных мутаций, что в данном случае регистрируется по уменьшению числа колоний-ревертантов на селективной среде по сравнению с позитивным контролем. С целью выяснения того, присутствуют ли в культуральных жидкостях бифидобактерий метаболиты, оказывающие антимутагенное действие в отношении НММ, клетки индикаторного штамма культивировались в присутствии мутагена и фильтратов бифидобактерий. Результаты этих опытов приведены в таблице 1. Таблица 1. Мутагенная активность нитрозометилмочевины культуральной жидкости бифидобактерий. Вид бифидобактерии Bifidobacterium longum Среднее количество ревертантов/чашку Штаммы в присутствии Антимутагенная активность в % 1 вариант 2 вариант 3 вариант 1 вариант 2 вариант 3 вариант 1R 225±12 522±16 255±10 82 34 73 2R 420± 18 580±18 352±12 54 25 62 3R 492± 16 450±14 635±14 46 44 23 47 435±14 675±18 466±12 53 12 48 56 559± 15 596±16 480±18 38 23 45 58 650± 18 420±14 622±20 25 48 25 23 518± 16 622±16 462±16 32 20 36 24 438± 12 672±18 482±14 54 12 45 26 320± 14 582±17 258±8 68 25 74 35R 279± 10 673±16 354±10 73 12 64 6 282± 12 380±18 632±16 75 54 25 8 226± 12 590±20 105±12 82 24 93 45R 522± 18 602±22 630±16 41 52 23 46±5 360± 20 594±20 400±18 62 24 56 Спонтанный фон (негативный контроль) 73± 8 65±5 55±2 ____ ____ ____ НММ, 100 мкг/мл (позитивный контроль) 835± 18 753±18 820±20 ____ ____ ____ 70± 8 56±3 43±2 ____ ____ ____ 790± 16 720±16 795±18 6 3 Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium adolescentis Питательная среда (чистый контроль) НММ+ПС 2 Примечание: Полное подавление мутагенеза (среднее число ревертантов в опыте не отличается от спонтанного уровня) означает 100% антимутагенной активности, при отсутствии антимутагенного эффекта - 0. Оказалось, что фильтраты КЖ бифидобактерий проявляют высокую эффективность антимутагенного действия. Уровень НММ-индуцированных реверсий при введении в индикаторную систему КЖ снижается от 25 до 82% в зависимости от штамма. Такой широкий диапазон степени эффективности протекторного действия свидетельствует о целесообразности отбора наиболее активных штаммов. При этом следует руководствоваться тем, что существует два основных механизма антимутагенного действия, так называемое десмутагенное и биоантимутагенное. В первом случае имеет место химическое взаимодействие между антимутагеном и генотоксикантом, приводящее к инактивации последнего, во втором – антимутаген вмешиватся в метаболизм мутагена внутри клетки, стимулирует репарацию, ингибирует инициируемые им свободнорадикальные реакции, или экранирует сайты мутагенной атаки ДНК /4/. Достаточно часто один и тот же антимутаген может действовать обоими способами, что характерно как раз для микробных метаболитов /2,3/. Поэтому стандартный протокол теста Эймса (вариант 1) был модифицирован следующим образом. Для выявления десмутагенного действия до контакта с индикаторными бактериями НММ инкубировалась 30 минут с КЖ бифидобактерий, а уже затем к этой смеси добавлялись индикаторные бактерии (2 вариант). Для обнаружения возможного биоантимутагенного действия, с мутагеном предварительно взаимодействовали индикаторные бактерии, которые затем отмывались от него, а уже после этого на селективные чашки вместе с тест-штаммом вносились фильтраты КЖ бифидобактерий (3 вариант). С помощью такой модификации схемы проведения эксперимента было установлено, что в КЖ большинства исследованных штаммов присутствуют метаболиты, осуществляющие второй механизм антимутагенеза. Однако у штаммов B. longum 3R; 58 и B. adolescentis 6;45R преобладает активность, осуществляемая по первому типу. Эти данные следует учитывать при отборе штаммов, перспективных для создания комплексных пробиотиковантимутагенов, поэтому желательно исследования проводить в предложенных модификациях. Вместе с тем использование при таком отборе нескольких вариантов протокола проведения теста Эймса усложняет и без того достаточно громоздкую схему опытов, поэтому для скрининга антимутагенных штаммов можно было бы применять и другие менее трудоемкие бактериальные тест-системы. Поскольку биоантимутагенное соединение способно активировать репарационные процессы в клетке /7/, то для вывления штаммов, которые могут продуцировать метаболиты с такого рода активностью, можно использовать бактериальные тесты на репарацию. Существование в клетках E. coli системы генов sos- ответа, выражение которых происходит координированно в ответ на действие мутагенов, создает реальную возможность, путем учета индукции активности любого из известных SOS - генов при действии испытуемого соединения, судить о его мутагенной активности. Эта принципиальная возможность реализована при создании так называемых SOS – хромотестов. В настоящее время SOS – хромотест существует в двух вариантах – «хромосомном» и «плазмидном». В обоих случаях под контроль промотора «din» гена (в первом случае таковым является ген sfiA, во втором – сеа – ген продукции колицина) подставляется ген lacZ, являющийся стуктурным геном β-галактозидазы. Эта подстановка осуществляется с помощью фага Мud lac, который содержит структурный (безпромоторный) ген lacZ. Путем слежения за синтезом βгалактозидазы полученные системы позволяют качественно и количественно оценивать мутагенную активность тестируемых соединений. В настоящее время имеется достаточно обширный экпериментальный материал сравнения эффективности SOS – хромотеста с широко известным тестом Эймса. Имеющиеся материалы указывают, что по уровню прогностической способности эти тесты примерно одинаковы. Это касается также и порога чувствительности тестов, однако по времени, затрачиваемому на одно измерение, а также простоте и возможности автоматизации SOS – хромотест несомненно превосходит тест Эймса. Следует сказать, что это сравнение относится к случаю – «хромосомного» варианта SOS – хромотеста. Однако проведенные специальные исследования показали, что SOS – хромотест на базе плазмиды pJB43 превосходит «хромосомный» аналог Килларде и др. /6/ по минимально обнаруживаемой концентрации (порогу чувствительности), времени, затрачиваемому на одно измерение и коэффициенту индукции в несколько раз. Этот вариант теста и был использован в данной работе для обнаружения антимутагенного эффекта бифидобактерий (рис.1). Коэффициент индукции SOS-ответа 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 Вариант опыта НММ Linear (НММ) Рисунок 1. Антимутагенные эффекты хромотесте бифидобактерий в SOS- 1- КЖ; 2 – НММ+ КЖ B.longum 1R; 3 –НММ+ КЖ B.bifidum 26; 4 – НММ+ КЖ B.adolescentis 6; 5 – НММ+ КЖ B.longum 58 Для исследования были выбраны по два штамма с наибольшим уровнем десмутагенной и биоантимутагенной активности, обнаруженной в тесте Эймса. Проведенные исследования по влиянию КЖ бифидобактерий на работу ошибочной SOS- репарации показали, что при предварительной обработке клеток индикаторного штамма E. coli EC 1000 (pJT43) индуцибельный SOS-ответ клетки вызванный НММ, значительно снижался. Так, в присутствии культуральной жидкости штаммов B. longum 58 и B. adolescentis 6 происходит снижение уровня индуцибельного SOS-ответа в 1,9 раза и 1,5 раза соответственно. Добавление к индикаторному штамму фильтрата культуральной жидкости двух других штаммов, проявивших наибольшую биоантимутагенную активность в тесте Эймса, снижало коэффициент индукции в 3,4 раза (Bifidobacterium longum 1R) и даже в 4,2 раза (Bifidobacterium adolescentis bifidum 26). Следовательно, в этой тестсистеме еще больше прослеживается различие между штаммами по их способности продуцировать биоантимутагенные агенты. Поскольку известно, что SOS-система включается поэтапно, причем сначала индуцируется синтез репаративных белков, обеспечивающих функционирование безошибочной репарации, в том числе и рекомбинационной /4/, следует обсудить еще и возможность использования другой группы бактериальных тестов, учитывающих поражающее действие в репарационной системе, а именно recА-тест, который в настоящее время существует в разных модификациях (в плане его выполнения). Это прежде всего, диффузионный тест –(«spot»-тест) /8/, получивший наибольшее развитие чашечный метод-«plate incorparation test» /9, 10/. Эти методы разработаны для разных видов бактерий – Proteus mirabilis и разных клеточных линий E. coli K-12 WP2. Принципиально они регистрируют один и тот же эффект – различие в токсичности испытуемых соединений в зависимости от наличия или отсутствия recА функции, одного из ключевых ферментов, участвующих в репарационных процессах. Однако результаты, полученные в «spot»-тесте трудно оценить количественно, в этом методе в большей степени регистрируется качественный эффект. Чашечный тест более трудоемкий, по сравнению с другими модификациями и хуже поддается автоматизации. Измерения же оптической плотности бактериальной культуры может быть легко автоматизировано путем использования методов спектрофотометрии, и в этом отношении суспензионный тест является наиболее перспективным в плане создания автоматизированных систем массового скрининга. Предлагаемая нами модификация этого теста, разработанная в лаборатории молекулярной организации генома Иогена АН России совместно с кафедрой микробиологии КазНУ, связана не с учетом эффективности рассеяния суспензионной культуры, а с учетом галактозидазной активности в lac+ штаммах отдельно для recА+ и recАмутантов. Это связано с наличием специфических красителей для – галактозидазы и в связи с этим высокой точностью измерения ее активности в клетках, т.е. с повышением разрешающей способности метода спектрофотометрии. Вначале этот тест был апробирован на ряде классических мутагенов, индуцирующих в ДНК различные типы первичных повреждений. У recA+ и recA- штаммов E.coli после 2-х часовой обработки мутагеном определялась оптическая плотность суспензии и активность –галактозидазы. Результаты этих экспериментов суммированы в таблице 2. Таблица 2. Сравнительная эффективность суспензионного и recА-хромотеста для различных классических мутагенов. Доза, (мкг/мл), при которой наблюдается 50 % снижение регистрируемых параметров Активность -–галактидазы Оптическая плотность (600 нм) Мутаген recA- recA+ R50 rec A- recA+ R50 Митомицин С 1,5 120 0,0013 17 120 0,14 Метилметансульфонат 2 131 0,013 177 327 0,5 Нитрозогуанидин 0,2 6,2 0,03 6,7 5,8 1,1 Нитрозаметилмочевина 9 121 0,07 56 148 0,4 Нитрозоэтилмочевина 4,2 213 0,02 97 176 0,5 Нитрозобутилмочевина 11 545 0,08 163 270 0,6 Этидидиумбромид 36 43 0,8 70 92 0,7 2-Аминопурин 227 212 1,1 205 274 1,1 Эффективность работы системы оценивалась по величине коэффициента R50, регистрирующего кратность показателей 50% снижения активности фермента или плотности культуры у recA+ и recA- штаммов после воздействия мутагена. Видно, что R50 значительно различаются в зависимости от того, какого типа повреждения ДНК вызывает тот или иной мутаген. Так, при воздействии таких агентов как 2-Аминопурин и этидиумбромид, коэффициент R50 для –галактозидазы и концентрации клеток не различаются. Этого и следовало ожидать, поскольку данные мутагены индуцируют повреждения, которые реализуются как ошибки репликации. Зато для других использованных в работе мутагенов, запускающих работу репарационных систем, значения коэффициента R50 для –галактидазной активности и оптической плотности культуры различаются на 1-2 порядка. Поэтому эта новая система «recА-хромотест» является сверхчувствительной и может быть использована не только для обнаружения мутагенов, но и биоантимутагенов. Таким образом, модифицированные краткосрочные бактериальные тест-системы, применяемые в генетической токсикологии, могут быть использованы в скрининге пробиотических бактерий, проявляющих антимутагенную активность. Список литературы 1. Алекперов У.К Антимутагенез и охрана генофонда –М.: Знание. – 1999. – 63 с. 2. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Антимутагенное действие бактерий против мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолин1-оксидом у Salmonella typhimurium // Микробиология. – 2002. -№ 6. – С. 109-113. 3. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Биоантимутагенное действие культуральной жидкости Streptococcus faecalis против мутагенеза, индуцированного 2-нитрофлуореном у Salmonella typhimurium ТА1538 и ТА98 // Микробиология. – 1996. – т.65, № 1. – С. 79-83. 4. Порошенко Г.Г., Абилев С.К. Антропогенные мутагены и природные антимутагены //Итоги науки и техники. Серия общая генетика. – М.:ВИНИТИ.1988. – Т.12. – 206с. 5. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности среды с помощью бактериальных тест-систем // Методические указания. М.:Наука. – 1985. – 34 с. 6. Джеджелава Дж.А., Егоров И.А., Тарасов В.А. Рекомбинантная плазмида для выявления мутагенов, индуцирующих SOS-функции в клетках Escherichia coli // Докл. АН СССР. 1988. Т.298, № 2. С.473-476. 7. Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Карамова Н.С. Антимутагенная активность ферментного препарата «Биназа» в микробных тестсистемах //Микробиология. – 1995. – т.64, №2, С.234-238. 8. Kada T., Morita K., Inoue T. Antimutagenic action of vegetable factora on the mutagenic principle of tryptophane pyrolysate// Mutation Res.-1978.-53, Р.351-353. 9. Leifer Z., Kаda T., Mandel M., Zeiger E., Stafford R., Rosenkrans H.S. An evalution of testing using DNA repair – deficient bacteria for predicting genotoxity and carcinogenecity// Mutat. Res.-1981.-87, №3. –P.211-297. 10. Mamber S.W., Bryson V., Kats S.E. Evalution of the Escherichia coli K12 indu-test for detection of potentional chemical carcinogens// Mutat. Res.1984. –130, №3. –P.141-151. Summury Antimutagen activity culture liquids of three kinds bifidobacteria in bacterial tests on mutagens and a reparation is investigated. It is shown, that bacterial antimutagen metabolits are capable to work as desmutagens, and to show activity at a cellular level, being universal bioantimutagens. Түйін Мутагенез және репарацияға арналған бактериалды тестегі үш түрлі бифидобактерияның культуралық сұйықтығы зерттелінген. Бактериалды антимутагенді метаболиттер десмутаген ретінде жұмыс істей отырып, әмбебап биоантимутаген ретінде клеткалық дәрежеде белсенді болатыны көрсетілген.
