Пущинский научный центр Российской академии наук

Пущинский научный центр Российской академии наук
Администрация города Пущино
Пущинский государственный естественно-научный институт
Пущино, 2012
ISBN 978-5-600-00016-2
УДК 573.4; 574.6; 577.1; 577.2; 577.3; 577.4; 581.5; 591.1; 631.4
БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА: 16-я Международная Пущинская школаконференция молодых ученых (Пущино, 16 - 21 апреля 2012 года). Сборник
тезисов.
Международная школа-конференция молодых ученых - ежегодное научное
мероприятие, организуемое и проводимое Пущинским научным центром РАН,
институтами ПНЦ, Пущинским государственным университетом на базе Пущинского
научного центра Российской академии наук.
Целью школы-конференции является ознакомление молодых ученых с
перспективами и новейшими достижениями в области физико-химической биологии.
Работа школы-конференции проводится в форме пленарных и секционных
заседаний по следующим направлениям: молекулярная биология, общая и
функциональная биохимия, биофизика клетки, органов и систем, биология и экология
микроорганизмов, почвоведение и биогеохимия, теоретическая и прикладная экология,
математические проблемы биологии, прикладная биотехнология, приборы и методы
для биологии, биотехнологии и медицины, радиобиология, физиология животных и
биомедицина, фотобиология и физиология растений, социокультурная ниша биологии.
Пленарные заседания включают в себя лекции ведущих российских ученых,
охватывающие перспективные направления физико-химической биологии; молодые
исследователи имеют возможность доложить результаты своей работы в форме устных
сообщений и стендовых докладов в ходе секционных заседаний.
Помимо научных мероприятий в программу работы школы-конференции входят
экскурсии по институтам ПНЦ РАН, выставки научного оборудования, круглые столыдиспуты по актуальным проблемам современной науки, культурная программа. В
работе школы-конференции ежегодно принимают участие более 500 молодых
исследователей из городов России, стран СНГ и дальнего зарубежья.
Биология и экология микроорганизмов
СЕКЦИЯ «Биология и экология микроорганизмов»
МИКОБИОТА КОРМОВЫХ РАСТЕНИЙ ТЕРМИТОВ РОДА
ANACANTHOTERMES
Аллаберганова К.С., Абдуллаев И.И., Ганджаева Л.А. Абдуллаева М.И.
Ургенчский государственный университет
tulipa_83@mail.ru
Термиты (Isoptera) - мелкие и средней величины насекомые, обычно избегающие света и
живущие семьями в специальных гнездах, устроенных в земле, древесине или построенных из
особого картоноподобного материала. Они единственные общественные насекомые, не
входящие в отряд перепончатокрылых.
Наиболее изученными и продвинутыми в практику являются гифальные грибы (класс
Deuteromycetes, сем. Moniliaceae). По количеству видов и встречаемости эти грибы наиболее
значительны. Способность их использовать различные источники питания как растительного,
так и животного происхождения определяет их широкую специализацию, а следовательно, и
широкое распространение по видам и биотопам.
Грибы, поражая древесину и разрушая ее структуру, переводят целлюлозу в более
доступные компоненты. Тем самым гнилая древесина более привлекательна и доступна для
усвоения термитами.
Микологической экспертизой установлено, что на стеблях подсолнечника превалировали
по количеству выделенных изолятов темноцветные грибы из родов Alternaria и Cladosporium.
Из других видов сем. Dematiaceae отмечены виды из родов Stachybotrys, Stemphilium и
Helminthosporium, которые, наряду с сумчатым грибом из рода Chaetomium, активно участвуют
в процессе биологического разложения целлюлозы стеблей подсолнечника.
Нами отмечено, что термиты лучше и охотнее поедали растительный корм, на котором
развивались микромицеты из родов Alternaria и Cladosporium.
Экспериментально было доказано, что предварительная обработка растительного корма
грибами Alternaria alternate или Cladosporiumbrevi-compactum с последующим внесением в эту
смесь энтомопатогена, не влияла на вирулентность Beauveria tenella и гибель всех
инокулированных особей наступила через 10 суток, с признаками микоза. Вирулентность
энтомопатогена была такой, как и в варианте, где инокулированные термиты содержались на
корме без предварительной обработки целлюлозоразрушающими грибами.
Способ предварительной обработки растительного матричного корма спорами грибов
Alternaria alternate или Cladosporium brevicompactum может быть использован для привлечения
термитов в отравляющие приманки без изменения вирулентности последних.
ВЫДЕЛЕНИЕИ И ИДЕНТИФИЦИРОВАНИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАЦИЛЛ ИЗ
ГОРЯЧЕГО ИСТОЧНИКА ДЖОВШАН (ИРАН, КЕРМАН)
Шарифи Амабпур С.Ф., Паносян О.А., Попов Ю.Г.
Ереванский государственный университет, Ереван (Армения)
baharan140@yahoo.com
Одним из естественных природных местообитаний термофилов являются наземные
термальные источники, которые создают уникальные по своим характеристикам ниши для
формирования специфических биоценозов термофильных микроорганизмов. На территории
Ирана зарегистрированы многочисленные теплые и горячие минеральные источники, которые
являются природными банками уникальных микроорганизмов с их широкими возможностями
практического применения.
Целью исследования являлось выделение и изучение таксономического разнообразия
термофильных бацилл горячого источника Джовшан (Иран, Керман) с температурой воды
46,6°C и pH=6.4. Из образцов ила выделены несколько культур факультативных термофильных
бацилл, с интервалом роста 35-75°C. На основании комплекса методов фено- и
3
Биология и экология микроорганизмов
филогенетического анализа (секвенирование гена 16S рРНК) два изолята идентифицированы
как представители вида Bаcillus licheniformis. Изучение ферментативной активности
выделенных штаммов позволило оценить потенциальную возможность их использования в
биотехнологических разработках. Проведен скрининг изолированных штаммов на
протеолитическую, амилолитическую и липолитическую активности.
В результате исследований создана коллекция высокоактивных штаммов, обладающих
различными наборами ферментов, проявляющих активность при разном диапазоне pH, NaCl и
температур и перспективных для дальнейших разработок в биотехнологических целях.
ИЗУЧЕНИЕ МЕЖВИДОВОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В КОРРОЗИОННОАГРЕССИВНЫХ СУЛЬФИДОГЕННЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ
Абдулина Д.Р., Пуриш Л.М.
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины
adara@ukr.net
Механизмы обмена генетической информацией внутри коррозионных сульфидогенных
микробных сообществ практически не исследованы.
Целью нашей работы было изучение наличия внехромосомных элементов, а именно
плазмид, и возможных механизмов обмена генетической информацией у коррозионноагрессивных бактерий, членов сульфидогенного микробного сообщества.
Объектами исследования были коллекционные штаммы коррозионно-агрессивных
бактерий Pseudomonas aeruginosa 27, P. aeruginosa 28, Pseudomonas sp. 29, Aeromonas
hydrophila/caviae 30, а также изоляты бактерий, выделеные из природного сульфидогенного
микробного сообщества. Для проведения трансконъюгационого скрещивания использовали
донорные штаммы бактерий E. coli J53 с трансмиссионными плазмидами RP4 и R68.45.
В клетках аммонифицирующих и железовосстанавливающих бактерий, изолированнх из
природного сульфидогенного микробного сообщества выявлено внехромосомные элементы, а
именно плазмиды, размером от 5 до 10 т.п.н.. Показано, что коллекционные штаммы бактерий
могут воспринимать генетическую информацию в виде плазмид RP4 та R68.45 от донорных
клеток E. coli с помощью конъюгационного скрещивания. Самыми восприимчивыми к
плазмиде R68.45 были клетки штаммов P. aeruginosa 27, и Pseudomonas sp. 29. Частота
возникновения трансконьюгантов у P. aeruginosa 27 была 2,4·10-7, на клетку реципиента, а у
штамма Pseudomonas sp. 29 - 3,0·10-6
Таким образом, показана возможность межвидовых взаимодействий в сульфидогенном
микробном сообществе, проявляющаяся в возможности коррозионно-агрессивных бактерий
воспринимать плазмиды RP4 и R68.45, с помощью конъюгационного переноса.
ПЛАЗМИДНЫЙ СОСТАВ ШТАММОВ AZOSPIRILLUM BRASILENSE
УЗБЕКИСТАНА
Абдуллаев А.К., Шакиров З.С.
Институт микробиологии Академии наук Республики Узбекистан, Ташкент
anvar.abdullayev.76@mail.ru
Плазмиды у многих бактерий, в частности у ассоциативной бактерии рода Azospirillum
контролируют азотфиксирующую активность, подвижность, вирулентность, хозяйскую
специфичность при ассоциации с растением - хозяином. А. brasilense sp7 содержит пять
больших мегаплазмид, 3 с молекулярными массами 46, 90 и 115 МДа и 2 с молекулярной
массой более чем 300 MДа. Плазмида 90 Mда, называемая pRhico или p90, широко
распространена среди бактерий рода Azospirillum и содержит гены, вовлеченные во
взаимодействии с корнями растений, синтез поверхностных полисахаридов, подвижность и
рост на минимальной среде. Гены антибио-тикоустойчивости бактерий находились в 115 MДa
мегаплазмиде. В клетках мутантов Azospirillum brasilense Sp245 выявлено также 5 мегоплазмид
с молекулярными массами 36, 85, 120 и более 300 MДа. В результате исследования было
4
Биология и экология микроорганизмов
установлено, что гены, ответственные за образование жгутиков, полисахаридов и
липолисахаридов, находятся в 120 MДa мегаплазмиде. Исходя из вышеизложенного, изучение
плазмидного состава рода Azospirillum имеет большой научный интерес и определенную
практическую направленность. В связи с этим был изучен в сравнительном аспекте
плазмидный состав местных штаммов рода Azospirillum brasilense А1-3 и А13-6.
Определение плазмидного состава штаммов Azospirillum проводили по методике Экхарда, в
которой лизирование клеток культур и выделение ДНК проводилось непосредственно в лунках
агарозного геля. Культуры выращивали в 4 мл полужидкой среды Доберейнера с 2%
кислородом в пенициллиновых флаконах при температуре 28°С в течение трех дней.
Сравнительный электрофоретический анализ плазмидных составов изученных местных
штаммов рода Azospirillum показал, что 0,4% агарозном геле было обнаружено четыре
плазмиды с молекулярной массой 90, 120 и две более чем 300 MДa. Количество и молекулярная
масса обнаруженных плазмидов изучаемых культур Azospirillum brasilense А1-3 и А13-6
сравнительно одинаковы. Получение нами результаты совпадают с выше перечисленными
работами за исключением отсутствия пятого плазмида.
Полученные результаты могут служить основой для дальнейшего детального изучения
структурно-функциональных и молекулярно-генетических особенностей плазмидной ДНК
местных штаммов рода Azospirillum.
АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ, АССОЦИРОВАННЫЕ С РАСТЕНИЯМИ,
СИНТЕЗИРУЮТ АУКСИНЫ, ГИББЕРЕЛЛИНЫ И РАСТВОРЯЮТ
МИНЕРАЛЬНЫЕ ФОСФАТЫ
Агафонова Н.В.1, Капаруллина Е.Н.2
1
Пущинский государственный естественно-научный институт; 2Федеральное
государственное учреждение науки Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино (Россия)
lady_dragona@mail.ru
Аэробные метилобактерии, использующие метанол, метиламин, формальдегид, формиат и
другие окисленные и замещенные производные метана в качестве источников углерода и
энергии, широко распространены в природе и часто ассоциированы с растениями. Поскольку
летучие органические С1-соединения являются естественными продуктами метаболизма
растений, метилобактерии колонизируют растения и находятся в тесной взаимосвязи с ними.
Цель работы – анализ способности новых штаммов аэробных метилобактерий,
ассоциированных с растениями, к биосинтезу ауксинов, гиббереллинов и растворению
минеральных фосфатов.
Объектами исследования служили 5 штаммов метилобактерий, выделенных из филлосферы
и ризосферы различных растений: Methylobacillus arboreus, Delftia sp. LP-1, Methylobacterium
extorquens G10, Methylophilus flavus Ship, Methylopila musalis MUSA.
Показано, что все исследуемые штаммы синтезируют из триптофана фитогормоны –
ауксины 5-17 мкг/мл культуральной жидкости. Гиббереллиновая активность выявлена у
Methylobacillus arboreus и Methylobacterium extorquens G10. Методами ТСХ и ВЭЖХ
обнаружены вещества, совпадающие по Rf со стандартом гиббереллиновой кислоты (GA3) и
проявляющие активность в биотестах на гиббереллины (рост гипокотилей Latuca sativa).
Обнаружено, что концентрация активного вещества, близкого по времени удержания при
ВЭЖХ с GA3, составляет до 25·10-3 мкг/л культуральной жидкости.
Фосфор является одним из макроэлементов, дефицит которого ограничивает рост и
развитие растений. В почве фосфор находится в виде нерастворимых фосфатов (Ca3(PO4)2,
гидроксиапатиты). Известно, что основным механизмом растворения минеральных фосфатов
является действие органических кислот, синтезируемых микроорганизмами. Нами показано,
что все исследуемые штаммы метилобактерий закисляют среду, образуя муравьиную кислоту,
которая может растворять минеральные фосфаты почвы, переводя их в доступную для
растений форму.
5
Биология и экология микроорганизмов
Таким образом, метилобактерии оказывают положительное влияние на растения,
синтезируя фитогормоны и улучшая фосфорное питание растений, поэтому перспективны для
применения как безопасные стимуляторы роста растений.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 10-04-00808 и ГК 14.740.11.0111.
ОСОБЕННОСТИ АДАПТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ У CHLAMYDOMONAS
REINHARDTII: РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ТРЕГАЛОЗЫ И ГЛИЦЕРИНА
Аникина А.В.
Санкт-Петербургский государственный университет
aav87@mail.ru
Для вегетативных клеток Chlamydomonas reinhardtii, ранее показано участие глицерина в
процессах осмоадаптации и выявлена уникальная особенность водоросли ‒ секреция
осмолитика в среду. Недавнее секвенирование генома C. reinhardtii выявило наличие генов TPS
и TPP семейств, продукты которых, предположительно, вовлечены в биосинтез трегалозы. Мы
проанализировали
накопление
указанных
протекторных
молекул
в
условиях
гиперосмотического стресса и гипотермии.
Анализ процессов осмоадаптации у C. reinhardtii выявил, что к фотопродукции глицерина
способны не только вегетативные клетки, но и гаметы. Оба типа клеток демонстрировали
сходную динамику накопления/секреции глицерина: увеличение уровня осмолитика в клетках
и секреции его в среду в первые несколько часов действия стрессора и после 24 часов
соответственно. Однако количество глицерина, синтезируемого гаметами, было ниже чем у
вегетативных клеток, что, видимо, связано с их более низкой биосинтетической способностью.
Известно, что контроль синтеза глицерина в условиях стресса осуществляется
посттранскрипционно; охарактеризован аквопорин семейства MIP, осуществляющий вывод
глицерина в среду. Анализ экспрессии CrMip в условиях гиперосмотического стресса с
использованием методов real-time PCR выявил, что секреция глицерина так же контролируется
посттранскрипционно.
Выявлено, что в ходе осмоадаптации вегетативные клетки C. reinhardtii так же
синтезируют трегалозу, увеличение уровня которой в клетках фиксировалось уже после 4 часов
действия стрессора; к 48 часам содержание трегалозы увеличивалось в 9-10 раз.
Анализ холодовой акклимации выявил накопление и глицерина, и трегалозы. К 96 часам
содержание глицерина в клетках увеличивалось в 4 раза; схожая динамика наблюдалась и для
секреции глицерина в среду. Однако уровни накопленного/секретированного в процессе
холодовой акклимации глицерина не сравнимы с подобными в процессе осмоадаптации. При
действии одновременно двух стрессоров гипотермии и повышенной осмолярности среды –
клетки так же синтезировали меньшее количество глицерина, что, по-видимому, связано с
подавлением ферментативного синтеза в условиях действия пониженных температур.
Накопление трегалозы в ходе холодовой акклимации фиксировалось уже после 4 часов
действия стрессора, к 24 часам уровень углевода в клетках возрастал в 9-10 раз и далее не
изменялся. Причем действие ингибитора II-ой фотосистемы, ДХММ, блокировало накопление
трегалозы. Анализ экспрессии TPS и TPP генов C. reinhardtii с использованием методов realtime PCR не выявил значительных различий между клетками инкубированными при 10°С и
нормальных температурах. Контроль синтеза трегалозы в условиях холодового стресса, повидимому, в основном осуществляется посттранскрипционно.
ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАЗВУКА НА СПОСОБНОСТЬ ПАТОГЕННЫХ
КОРИНЕБАКТЕРИЙ К УТИЛИЗАЦИИ ГЛЮКОЗЫ
Антушева Т.И.
ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМН Украины»
antushevati@rambler.ru
6
Биология и экология микроорганизмов
В настоящее время бактерии, как и все живые организмы, все больше подвергаются
влиянию многих электрофизических технологий, которые способны вызывать изменение
биологических свойств микроорганизмов, сдвигая процессы метаболизма в ту или другую
сторону. Особый интерес представляют электромагнитные волны миллиметрового диапазона и
ультразвук, действие которых еще недостаточно изучено. Создав экспериментальную модель
воздействия хотя бы одного из этих факторов на изменение катаболизма бактерий, можно
судить об активизации биологических свойст и роста микроорганизмов вследствие
энергетического обмена.
Целью настоящей работы явилось изучение активности окисления глюкозы патогенными
коринебактериями в зависимости от воздействия на них ультразвуком (УЗ) низкой частоты
малой мощности.
Материалом исследования были штаммы коринебактерий C.d gravisи C.d. mitis,
возбудителей тяжелейшей токсикоинфекции, вспышки которой повторяются несмотря на
массовую вакцинопрофилактику. Источником ультразвуковых волн служил стандартный
генератор ГЗ-109 с частотой 60 кГц, продолжительность воздействия колебалась от 1 до 7-ми
часов. Количество окисленной глюкозы определяли в глюкозном субстрате после 18 часов
инкубации культур, предварительно облучив их ультразвуком. Контролем служили
необлученные штаммы бактерий. Результаты проведенных опытов показали, что непрерывное
воздействие УЗ в течение 7-ми часов увеличивало количество утилизованной глюкозы за 18
часов инкубации штаммами C.d. gravis (на 16%) и C.d. mitis (на 26%) по сравнению с
необлученными культурами коринебактерий. В то же время к снижению количества
окисленной глюкозы культурами C.d. gravis (на 18%) приводила экспозиция УЗ 2 часа, а
культурами C.d. mitis (на 10%) экспозиция УЗ 6 часов. Остальные режимы воздействия УЗ на
тест-штаммы патогенных коринебактерий не дали существенных различий в количестве
окисленной глюкозы.
Изучение влияния различных физических факторов на изменение метаболических
процессов имеет важное значение для понимания адаптивних реакций микроорганизмов и
может бать использовано для оптимизации управляемого культивирования штаммовпродуцентов.
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЗАЦИИ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ ПШЕНИЦЫ И
ПОГЛОЩЕНИЕ ИОНОВ КАЛИЯ И НИТРАТ-ИОНОВ ИЗ ВОДНЫХ
РАСТВОРОВ
Апенышева М.В., Минаева О.М., Куровский А.В.
Национальный исследовательский Томский государственный университет
mari-08-90@mail.ru
В связи с участившимися случаями нерационального использования химических
пестицидов наблюдается тенденция биологизации и экологизации сельскохозяйственного
производства. В настоящее время активно используются биопрепараты на основе ризосферных
бактерий, известных как стимуляторы роста и развития растений. Однако механизмы влияния
бактерий на индукцию резистентности растений к возбудителям заболеваний, улучшения их
роста и развития до настоящего времени изучены недостаточно.
Для изучения влияния бактеризации семян на рост и развитие растений пшеницы была
создана простейшая наземная экосистема, состоящая из трех звеньев: полипропилен (субстрат)
– растение – ризосферные бактерии. Звено продуцентов было представлено пшеницей. В
качестве ризобактерий были использованы два вида, по литературным данным известные как
стимуляторы роста растений, повышающие урожайность за счет мобилизации трудно
растворимых веществ, выделения ростстимулирующих соединений и фунгистического
действия, – Pseudomonas sp. В-6798 и Pseudomonas aureofaciens BS 1393.
В проведенных экспериментах установлено, что при использовании бедных по
минеральному составу питательных гидропонных сред наблюдается ингибирование роста и
развития проростков пшеницы ризосферными бактериями, обеспечивающими стабильный
положительный эффект при выращивании растений на многокомпонентных средах. Угнетение
7
Биология и экология микроорганизмов
роста и развития растений происходит за счет конкуренции между бактериями и растениямихозяевами за элементы, присутствующие в недостаточно высоких концентрациях. Отмечено,
что при бактеризации семян увеличивается поглощение нитрат-иона из питательного раствора
растениями по сравнению с проростками баз бактеризации. При анализе концентрации ионов
калия в растении выявлено уменьшение его содержания в корнях, которое связано с более
активным поглощением данного иона из корнеобитаемой зоны бактериями.
Эффект ингибирования успешно снимается увеличением концентрации основных
минеральных компонентов в питательных растворах. При этом используемые для бактеризации
штаммы увеличивают корневую биомассу, количество корней и их суммарную длину у
проростков пшеницы на 12–30% по сравнению с растениями без инокуляции.
Экспериментально показано, что интродуцируемые бактерииPseudomonas sp. В-6798 и
Pseudomonas aureofaciens BS 1393 в модельных условиях успешно конкурируют с
естественными обитателями ризосферы пшеницы и размножаются за счет корневых эксудатов,
увеличивая видовое разнообразие и общую бактериальную численность ризосферных
микроорганизмов.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЕКТИНСВЯЗЫВАЮЩЕГО АНАЛИЗА ПРИ
ИССЛЕДОВАНИИ БИОПЛЕНОК НА МЕТАЛЛЕ
Асауленко Л.Г., Пуриш Л.М.
Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины
lara_76@ukr.net
Лектинсвязывающий анализ широко применяется в медицине, гистохимии, биохимии,
иммунологии. В то же время при исследовании биопленок, сформированных на металлических
поверхностях, метод трансмиссионной электронной микроскопии с использованием лектинов
не применялся.
В работе использованы моно- и ассоциативные культуры бактерий, выделенные из
коррозионного сообщества. Для лектинсвязывающего анализа использовали коммерческие
препараты лектинов, меченых коллоидным золотом, из завязей пшеницы (WGA), картофеля
(STA), чечевицы (LCА), сои (SBA), фасоли (LBA), гороха (PSA), специфических к
определенным углеводам.
Установлено, что связывание лектинов с углеводами происходило, непосредственно в
экзополимерном комплексе (ЭПК), а также на поверхности бактериальных клеток, о чем
свидетельствовало наличие частиц коллоидного золота. В биопленке ассоциативных культур
связывались лектины LСA и PSА, что доказывает наличие в ЭПК глюкозы и маннозы.
Биопленка Desulfovibrio sp.10 и Bacillussubtilis 36 интенсивно взаимодействовала с лектином
LBA, что свидетельствует о присутствии ацетилгалактозамина. Наличие ацетилглюкозамина в
бипленке Desulfovibrio sp. 10 определяли с помощью лектина STA, а клетки и полимер
гетеротрофных спутников - наоборот - лучше всего связывались с лектином WGA. Для
определения локализации D-маннозы и D-глюкозы во всех исследуемых монокультурах лучше
всего подходил лектин PSA. Полученные нами данные о локализации углеводов в ЭПК
биопленок коррелировали с биохимическим анализом его моносахаридного состава.
Таким образом, лектинсвязывающий анализ может быть использован in situ, для
исследования распределения гликополимеров в микробных биопленочных сообществах.
ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ГРУППИРОВОК САПРОФИТНЫХ
БАКТЕРИЙ И ДРОЖЖЕЙ В ЭПИФИТНЫХ КОМПЛЕКСАХ РАСТЕНИЙ
ХЛОПЧАТНИКА
1
Бабажанова В.А. , Нарымбетова Р.Ж.1, Базарбаева Д.О.2
1
ИБЭ ККОАНРУз; 2НГПИ им. Ажинияза (Узбекистан)
venus82@inbox.ru
8
Биология и экология микроорганизмов
Эпифитные дрожжи и растения вместе образуют единую симбиотическую
коэволюционирующую систему, которая может служить хорошей моделью для изучения
многих фундаментальных вопросов экологии и эволюции. Сообщества эпифитных дрожжей
филлосферы и сопряженных с ней растительных субстратов (цветов, плодов, почек) являются
постоянной и неотъемлемой частью любого растения, перестраивающейся в процессе его
онтогенеза (Константинова, 2001). Как правило, при атаке насекомых на различных органах
находят выделения, состоящие из промежуточных продуктов их метаболизма. Из этого
сообщества эпифитного комплекса выявляются большое количество микроорганизмов,
адаптированных к экстремальным условиям существования и являющихся оригинальным
объектом для нанобиотехнологии.
Как показали исследования, сапрофитные бактерии и дрожжи - наиболее типичные
обитатели растений хлопчатника, покрытых высоким содержанием легкодоступных
питательных веществ (сахаров, сахароспиртов, органических кислот и т.п.). Лист, курак и
стебель хлопчатника обильно заселены микроорганизмами. В современных исследованиях
часто особое значение имеет определение в средах обитания микроорганизмов в
микроколичестве тех или иных веществ (витаминов, антибиотиков, биологически активных
веществ).
С помощью углеводных бумажных дисков определен набор простых и сложных сахаров,
усваиваемых ими. В результате исследования установлено, микробиоценозы, формирующиеся
в «ловушках», местах концентрации выделений растений и насекомых, отличаются богато
населенной микрофлорой: широко представлены аммонифицирующие бактерии, дрожжи и
целлюлозоразлагающие микроорганизмы. Заселяя природный субстрат, аммонифицирующие
микроорганизмы осуществляют минерализацию белковых соединений, многие группы доводят
разложение белковых соединений до конечных продуктов распада. Их видовое разнообразие
довольно бедное – не более 18 видов.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТОКСИГЕННЫХ ГРИБОВ И ЭНДОФИТНЫХ БАКТЕРИЙ
В ЗЕРНЕ ПШЕНИЦЫ КАК ОБЪЕКТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СПОСОБОВ БОРЬБЫ С
ТОКСИГЕННЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ
Барчева А.В., Фадеева М.А., Щербаков А.В., Чижевская Е.П., Чеботарь В.К.,
Мальфанова Н.В.
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии» РАСХН, Санкт-Петербург - Пушкин (Россия); Leiden University,
Institute of Biology, Sylvius Laboratory, Leiden (Netherlands)
abarcheva@yahoo.com
Целью исследования явилось изучение эндофитных бактерий, выделенных из зерна
пшеницы различных почвенно-климатических зон Юга России и поиск научного обоснования
способов борьбы с токсигенными инфекциями грибного происхождения.
Нами были исследованы 44 образца семян пшеницы из 5 основных районов возделывания
на Юге России. Зерно озимой пшеницы подверглось фитопатологическому анализу, и были
отобраны чистые культуры токсигенных грибов, заселяющих поверхность данных сортов. В
дальнейшем все выделенные штаммы изучались на способность проявлять фунгицидную,
бактерицидную и ростостимулирующую активности. Были изучены технологические
параметры роста изучаемых штаммов эндофитных бактерий в зависимости от источника
углерода, источника азота, аэрации, температуры культивирования, рН питательной среды и
наработаны опытные партии биопрепаратов.
37 морфотипов выделенных эндофитных бактерий, подверглись идентификации на
основании ПЦР-амплификации и секвенирования гена 16S РНК. Молекулярно-биологический
анализ показал, что наибольшая часть обнаруженных эндофитных бактерий относятся к родам
Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Serratia. На основании изучения фунгицидных,
бактерицидных и ростостимулирующих свойств изучаемых штаммов эндофитных бактерий
были отобраны наиболее перспективные изоляты: 2а,8а,7d,15d,35b,36b. В модельной
гнотобиотической системе показано, что интродуцируемые gfp-маркированные штаммы
9
Биология и экология микроорганизмов
эндофитных бактерий активно колонизируют корни, как пшеницы, так и редиса, причем при
достаточно высоком числе клеток. Таким образом, у отобранных штаммов имеется высокий
колонизационный потенциал, что имеет очень большое значение при конкуренции за
источники питания и сайты локализации на корнях растений в естественных условиях. Впервые
в мире создана уникальная коллекция штаммов эндофитных бактерий, обитающих в зерне
пшеницы различного эколого-географического происхождения и обладающих различными
хозяйственно-ценными свойствами, такими как: фунгицидная, бактерицидная активности и
стимуляция роста растений. Создан лабораторный образец биопрепарата эндофитных бактерий
на основе штамма 8а и подготовлены документы к патентованию этого штамма и способа
производства биопрепарата.
Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ 09-04-13782-офи_ц.
СТРУКТУРА, СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ УГЛЕВОДНЫХ ФРАГМЕНТОВ
ФЛАГЕЛЛИНА БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE
Беляков А.Е., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю.
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и
микроорганизмов РАН, Саратов (Россия)
belyakov-ae@mail.ru
Бактериальный жгутик представляет собой ключевой компонент клеточной подвижности и
хемотаксиса прокариот. Ранее было установлено, что флагеллины некоторых бактерий, в том
числе и Azospirillum brasilense, гликозилированы. Однако до сих пор были неизвестны размеры,
структура и функции О-связанного углевода гликозилированного флагеллина полярного
жгутика типового штамма A. brasilense Sp7.
Целью данной работы было выявление свойств и особенностей функционирования
флагеллинов полярного жгутика ассоциативных бактерий A. brasilense.
В результате проведенного исследования оптимизирована процедура получения
хроматографически и электрофоретически чистых препаратов флагеллина полярного жгутика
штаммов азоспирилл. Показана неспособность к самосборке филамента при нейтральной pH
среды в присутствии ионов Ca2+ и Mg2+, а также термостабильность флагеллина азоспирилл.
Сформулировано предположение о влиянии углеводных фрагментов на свойства флагеллина
полярного жгутика азоспирилл.
В составе углеводных фрагментов флагеллина A. brasilense Sp7 обнаружены галактоза
(Gal), глюкозамин (GlcNAc), рамноза (Rha) и фукоза (Fuc) в соизмеримых количествах. По
данным масс-спектрометрии О-связанный углевод является полисахаридом, с молекулярной
массой 7,7 кДа. Исследования с помощью 1H- и 13C-ЯМР-анализа показали, что полисахарид
флагеллина A. brasilense Sp7 состоит из повторяющихся тетрасахаридных звеньев с Fuc в
боковом положении.
Для штаммов азоспирилл, относящихся к разным серологическим типам, было
установлено, что углеводные фрагменты их флагеллинов проявляют групповую
серологическую специфичность, сходную со специфичностью их О-антигенов. В частности,
для штаммов серотипа Sp7 (A. brasilense Cd, SR55, 7.k.2) показано взаимодействие их
флагеллинов как с антителами к флагеллину A. brasilense Sp7, так и с антителами к
соматическому антигену этого штамма.
Полученные результаты говорят о весьма высокой вариабельности углеводных
фрагментов, входящих в состав флагеллинов полярных жгутиков азоспирилл.
МИКРОБИОЦЕНОЗ ПОЧВ ПРИМАГИСТРАЛЬНЫХ ЭКОСИСТЕМ
Бобрик Н.Ю., Кривцова М.В., Николайчук В.И.
ГВУЗ «Ужгородский национальный университет», Ужгород (Украина)
NadjaBobrik@mail.ru
10
Биология и экология микроорганизмов
Одной из наиболее острых экологических проблем сегодняшнего дня является загрязнение
окружающей среды транспортом, в том числе железнодорожным. Актуальность всестороннего
исследования примагистральных экосистем в условиях Закарпатья обусловлена высокой
интенсивностью транспортных перевозок и приграничным расположением области. В таких
условиях актуальным является исследование суммарного воздействия авто- и
железнодорожного транспорта на примагистральные экосистемы.
Целью наших исследований было изучение влияния железнодорожного и автотранспорта
на микробиоценоз почвы примагистральных экосистем (на примере лучной экосистемы
мониторинговой точки пгт Великий Березный). Отбор проб почвы осуществляли на участке,
который граничил как с авто-, так и железнодорожной магистралью (на расстоянии 0, 50, 100 и
150м от железнодорожного пути). При этом точка отбора проб 150м от железнодорожной колеи
находилась на расстоянии 50м от автомагистрали. Анализ микробного ценоза почвы проводили
с использованием дифференциально-диагностических питательных сред: амонифицирующие
бактерии учитывали на мясопептонном агаре (МПА), актиномицеты − на крахмальноаммиачном агаре (КАА), бактерии группы кишечной палочки (БГКП) − на Эндо, микромицеты
− на среде Сабуро, бактерии рода Azotobacter − на среде Эшби методом обрастания комочков
почвы, олиготрофные микроорганизмы − на голодном агаре (ГА).
Исследования показали, что наивысший показатель амонификаторов зарегистрировано на
расстоянии 50м от железнодорожного полотна, а наименьший − на расстоянии 0м. Такая же
тенденция установлена в отношении БГКП и микромицетов. Резкое увеличение количества
микроскопических грибов (микромицетов) установлено на расстоянии 50м от автомагистрали.
Количество актиномицетов достоверно не менялось, однако на расстоянии 150м от
железнодорожного пути (50м от автодороги) регистрировали резкое (в два раза) снижение
данного показателя. Количество олигонитрофилов в почве закономерно снижалось, что
указывает на уменьшение количества азота по мере приближения к железнодорожной колеи.
Процент азотфиксирующих микроорганизмов закономерно увеличивалась от 0 до 150м от
железнодорожного пути. Регистрировали существенное снижение процента бактерий рода
Azotobacter в почве лучной экосистемы на расстоянии 0м от железнодорожного полотна: в 3
раза по сравнению с точкой отбора почвы 100м. Поскольку бактерии рода Azotobacter являются
чувствительным реагентом на влияние антропогенных факторов, определенная нами
закономерность свидетельствует о повышении влияния техногенной нагрузки с приближением
к железнодорожному полотну. Увеличение количества олиготрофов с приближением к
автомагистрали указывает на создание экологически неблагоприятных условий для развития
других групп почвенных микроорганизмов.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА БИООБРАСТАНИЙ
ПЕСЧАНОЙ ЗАГРУЗКИ ОЧИСТНЫХ СООРУЖЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
Букреева В.Ю.
ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», Воронеж (Россия)
bukreeva-31@yandex.ru
Для подтверждения роли железоокисляющих прокариот родов Gallionella, Leptothrix,
«Siderocapsa» в трансформации растворимых форм некоторых тяжёлых металлов с помощью
электрофизических методов проводили комплексное исследование элементного состава
биообрастаний. Используя сканирующий электронный микроскоп с инертно-дисперсионной
приставкой (JEOL JSM-6380LV Scanning Electron Microscope; INCA Energy–250) определяли
элементный состава элементов песчаной загрузки (ПЗ) с низкой, средней и высокой степени
ожелезнённости и поверхности стёкол обрастаний. Из полученных данных видно, что такие
элементы как С, О, Si, Fe присутствуют на всех исследуемых образцах и с повышением
ожелезнённости наблюдается пропорциональное увеличение атомного процента (А%) С, Fe,
Ca. А% кислорода изменяется незначительно, а атомный процент Si снижается, что, скорее
всего, связано с увеличением интенсивности сорбции ионов металлов на поверхности
11
Биология и экология микроорганизмов
фрагмента ПЗ и за счёт деятельности микроорганизмов. Атомные проценты для Na, Mg, Al не
изменялись.
Исследование элементного состава опытных образцов с углеродным напылением показало,
что А% элементов: Mn, Fe, Cu, Zn возрастает на обрастаниях снятых с поверхности стёкол,
подтверждает наличие окислительных и сорбционных процессов в ПЗ. Высокий атомный
процент элемента углерода обусловлен углеродным напылением. Наличие данного элемента и
увеличение его А% в зависимости от степени ожелезнённости на образцах без напыления
указывает на наличие микроорганизмов обеспечивающих процессы отложения окислов
металлов на поверхности клеток. С использованием методов атомно-абсорбционной
спектроскопии и микрозондового рентгеноспектрального анализа было установлено, что
наряду с Mn и Fe на песчаном фильтре происходило осаждение растворимых соединений
тяжёлых металлов из воды в следующей последовательности: Al > Cr > Zn > Ni > Co > Cu > Cd
> Pb.
Таким образом, наличие элементов Fe, Mn и других тяжёлых металлов на исследуемых
образцах и фотографии их поверхности позволили сделать выводы, об активном участии
железо- и марганецокисляющих микроорганизмов в функционировании песчаного фильтра
модельной установки.
METHYLOPILA MUSALIS SP. NOV. – НОВЫЙ ВИД АЭРОБНЫХ
МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С БАНАНОМ
Быкова Т.В., Капаруллина Е.Н.
Пущинский государственный естественно-научный институт; Федеральное
государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино (Россия)
tatiana.bickova@yandex.ru
Аэробные метилобактерии – группа метилотрофных прокариот, использующих
окисленные и замещенные производные метана в качестве источников углерода и энергии.
Выделение и характеристика новых штаммов не только расширяют представление о
биоразнообразии метилобактерий, но представляют большой интерес для биотехнологии.
Метилобактерии являются продуцентами различных ценных метаболитов из дешевых
непищевых субстратов, деструкторами токсичных С1-соединений и фитосимбионтами.
Цель работы – физиолого-биохимическая и таксономическая характеристика нового
метилотрофного изолята – штамм MUSA.
Из плода банана (Musa paradisiaca var. sapientum) выделен новый факультативный
метилотроф штамм MUSA. Новый изолят представлен аэробными, грамм-отрицательными, не
спорообразующими, подвижными палочками. Размножается бинарным делением. Штамм
использует метанол, метиламин и фруктозу в качестве источников углерода и энергии. Растет в
диапазоне рН 5.5-9.5 (оптимально рН 7.0) и температуры 16-40оС (оптимально 28-30оС).
При росте исследуемого штамма на метаноле в жирнокислотном составе клеток
доминируют C18:1ω7c, C18:ω7c11Me, C20:1, тогда как на триптон-соевом агаре - C18:1ω7c, C18:0 и C20:1.
Основная гидроксикислота – тетрадекановая (3-OH C14:0). В фосфолипидном составе клеток
доминируют
фосфатидилэтаноламин,
фосфатидилхолин,
фосфатидилглицерол
и
фосфатидилмонометилэтаноламин. Основной убихинон Q-10. Образует индол из триптофана,
оксидазо- и каталазоположителен.
Энзиматический анализ показал, что штамм MUSA окисляет метанол до формальдегида
классической метанолдегидрогеназой. Окисление метиламина осуществляется посредством
метиламиндегидрогеназы а также ферментами N-метилглутаматного пути. Штамм реализует
ицл- вариант серинового цикла. В ассимиляции NH4+ принимают участие
глутаматдегидрогеназа и глутаматный цикл.
Содержание Г+Ц в ДНК – 64,5 мол.% (Тпл). По данным секвенирования гена 16S pPHK
штамм MUSA проявил наибольшее сходство с представителями рода Methylopila: 99,5% с M.
jiangsuensis JZL-4T и 97,2% M. capsulata IM1T. Однако ДНК-ДНК гибридизация штамма MUSA
с типовыми штаммами M. jiangsuensis JZL-4T и M. capsulata IM1T выявила только 36-38%
12
Биология и экология микроорганизмов
гомологии, что свидетельствует о их видовом различии. Таким образом, сравнение нового
штамма c типовыми представителями рода Methylopila позволяет предложить для него новое
видовое название – Methylopila musalis MUSAT (VKM B-2646T).
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 10-04-00808 и ГК 14. 740. 11. 0111.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИФАЗНОГО ПОДХОДА ДЛЯ СИСТЕМАТИКИ
ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА NOSTOC
Васильева А.А., Гаврилова О.В.
Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург (Россия)
vasileva_sasha@mail.ru
Род Nostoc, включающий в себя нитчатые цианобактерии, способные к формированию
гормоцитов, относится к субсекции IV «Nostocales» филы BX Cyanobacteria. Современная
систематика цианобактерий находится в состоянии обновления и пересмотра: наряду с
молекулярно-генетическими критериями ведущую роль играют морфологические признаки,
особенности жизненного цикла, физиологии и биохимического состава клеток. В современном
руководстве по систематике бактерий «Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology» форм-род
Nostoc разделяется на кластеры на основе ДНК-ДНК гибридизации коллекционных штаммов,
при этом выделяется всего один вид – Nostoc punctiforme. Такие фенотипические признаки, как
синтез фикоэритрина (PE), хроматическая адаптация определенного типа, формирование
акинет, гетероцист, оказались постоянны в пределах кластера; способность к факультативной
гетеротрофии, степень искривленности трихомов могут варьировать. В работах последних лет в
качестве ведущего критерия используется сходство последовательностей гена 16S рРНК, в
качестве дополнительных признаков рассматриваются происхождение штаммов, особенности
жизненного цикла, пигментный состав, морфометрические характеристики. Подобный подход
получил название «полифазного», и он широко используется в бактериологии. Значимость
фенотипических признаков для систематики внутри рода Nostoc широко обсуждается.
Целью работы является определение систематической принадлежности двух штаммов
Nostoc sp. CALU 1067 и Nostoc sp. CALU 1088 на основании комплекса молекулярнобиологических и фенотипических признаков. Оба штамма были выделены из пресных
водоемов, но на разных географических широтах, конститутивно синтезируют PE, способны к
хроматической адаптации 3-его типа (на зеленом свету накапливается PE и уменьшается
количество фикоцианина - PC, а на красном свету наоборот). Количество PE составляет 8-10%
сухого веса и не снижается даже в условиях азотного голодания. Исследования с
использованием метода микроспектрофлуориметрии также показали, что PE сохраняется у всех
специализированных клеток. Соотношение PE/PC у штамма CALU 1088 постоянно и близко к
1,7, а у штамма CALU 1067 PE/PC изменяется от 1,3 до 2,2 в зависимости от интенсивности
света и соотношения N/P в среде культивирования. Штаммы различаются формой гетероцист.
По своим фенотипическим признакам штаммы близки представителям кластеров: 1 по
Herdman, «А» по Hrouzek, I по Papaefthimiou, «А» по Mateo.
В рамках генетической характеристики с помощью специфичных цианобактериальных
праймеров выделены фрагменты 16S рРНК, и проведено секвенирование. Оценка
принадлежности к определенным генетическим кластерам проводится с использованием
депонированных последовательностей базы NCBI.
Исследование поддержано грантами НШ-65439.2010.4 и НИР СПбГУ (1.37.88.2011 и
1.0.141.2010).
РАСПРОСТРАНЕНИЕ АРХЕЙ В КИСЛЫХ ОТХОДАХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ
ДОБЫЧИ ЗОЛОТА
Герасимчук А.Л., Гонских Ю.Д., Карначук О.В.
Национальный исследовательский Томский государственный университет
gera_2004@rambler.ru
13
Биология и экология микроорганизмов
Экстремально кислые отходы добычи сульфидных руд представляют серьезную угрозу
окружающей среде. Низкие значения рН и высокое содержание ионов металлов в этих
экосистемах связаны с деятельностью микроорганизмов. В отличие от представителей домена
Bacteria, распространение архей в кислых шахтных дренажах изучено недостаточно. В этом
исследовании изучали распространение архей методом разделения фрагментов гена 16S рРНК
путем гель-электрофореза в денатурирующих условиях (PCR-DGGE) в отходах месторождений
добычи золота в Кузбассе. Пробы осадков кислых высачиваний (рН 1.75 – 2.84), содержащих
высокие концентрации As, Fe и других металлов, были отобраны с территории хвостохранилищ
«Комсомольский» и «Новый Берикуль», и отвалов месторождения «Центральный» в августе
2010 и 2011 гг.
PCR-DGGE проводили с использованием системы «Dcode System (Biorad laboratories)». Для
амплификации ДНК архей использовали праймеры Arch915R и Parch519. Были исследованы 7
проб осадков.
Наибольшее количество филотипов (от 9 до 11 полос) обнаружили в образцах осадков
высачиваний хвостохранилищ «Новый Берикуль» и «Центральный». В остальных пробах
обнаружено от 3 до 6 доминирующих филотипов. Большинство доминирующих архей
относилось к представителям Crenarchaeota и новой ветви Thaumarchaeota. Два филотипа,
принадлежащие к Euryarchaeota, имели гомологию 94% с недавно выделенной
термоацидофильной археей Thermogymnomonas acidicola. Все обнаруженные филотипы,
представленные фрагментами гена 16S рРНК размером 249 - 388 п.о., не имели близких
культивируемых родственников с гомологией последовательностей, превышающей 94%.
Ближайшим культивируемым родственником филотипов, относящихся кCrenarchaeota была
ацидофильная гипертермофильная археяIgnisphaera
aggregans,
однако гомология
последовательностей составляла всего 84%. Ближайшим культивируемым родственником
филотипов, относящихся к Thaumarchaeota, является окисляющая аммоний морская архея
Nitrosopumilus maritimus – один из немногих организмов, выделенных в чистую культуру.
Однако гомология последовательностей не превышала 84-86%. Очевидно, что обнаруженные
два доминирующих филотипа представляют новые группы архей с неизвестной физиологией.
Филотип Crenarchaeota был обнаружен в 2-х пробах из географически удаленных сайтов, тогда
как филотип Thaumarchaeota присутствовал в 4-х пробах, различных хвостохранилищ. Эти
факты позволяют предположить важную роль обнаруженных организмов в кислых осадках,
связанных с добычей сульфидных руд. Обнаружение нами в пробах хвостохранилищ
Thaumarchaeota согласуется с только что опубликованными данными о присутствии этой
группы в осадках, загрязненных мышьяком.
Работа поддержана грантами РФФИ и Президента РФ № МК-3489.2011.4.
ОЦЕНКА БАКТЕРИЦИНОЙ АКТИВНОСТИ TIO2-ПЛЁНОК В ОТНОШЕНИИ
ЛИОФИЛЬНОВЫСУШЕННЫХ S. AUREUS 956
Голубева И.С., Плескова С.Н., Голубев А.Н.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева,
Нижний Новгород (Россия)
golubmay@mail.ru
На протяжении последних лет тонкие плёнки диоксида титана (TiO2 – плёнки) являются
объектами теоретических и прикладных исследований. В предыдущих работах нами было
доказано, что TiO2 – плёнки обладают УФ-индуцированными антибактериальными свойствами
в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных штаммов бактерий,
находящихся в суспензионной форме. Однако при повторном использовании пленок их
бактерицидная активность либо существенно снижается, либо полностью исчезает, благодаря
реализации эффекта супергидрофильности, полностью изменяющего свойства поверхности.
Поэтому актуальным становиться вопрос об исследовании бактерицидного эффекта плёнок
диоксида титана в отношении штаммов бактерий, не находящихся в суспензионной форме.
Для бактериологических экспериментов использовали суточную культуру S. аureus 956,
которую смывали физиологическим раствором и взвешивали в конечной концентрации 10 МЕ.
14
Биология и экология микроорганизмов
Затем готовили разведения с целью получения изолированных колоний в количестве 200-300
КОЕ на чашке Петри. Далее бактериальную суспензию, порционно в количестве 1 мл
подвергали лиофилизации. Из флакона лиофильновысушенные S. аureus 956 вносили на чашку
Петри без плёнки (контроль) и на чашку Петри с нанесённой TiO2 – плёнкой (опыт). Облучение
проводили под УФ лампой (λmax = 365 нм) в течении 15 минут. Затем, бактерии переносили в
стерильные пробирки, заливали мясопептонным бульоном и термостатировали в течении 96
часов при 37º С. Для количественной оценки определяли оптическую плотность контрольных и
опытных образцов.
После проведения ряда серий экспериментов было показано, что при 15-минутной
экспозиции на пленках диоксида титана под ультрафиолетовым светом снижение
жизнеспособности лиофильновысушенных S. аureus 956 достигает 95%. Таким образом,
исследуемые плёнки диоксида титана обладают ярко выраженным бактерицидным эффектом
не только в отношении суспендированных микроорганизмов, но и в отношении лиофильновысушенных бактерий.
ПОЛУЧЕНИЕ GFP-МЕЧЕНЫХ ШТАММОВ METHYLOBACTERIUM
RADIOTOLERANS, M. EXTORQUENS И M. NODULANS
Горяйнова О.С., Федоров Д.Н., Доронина Н.В., Фролов Ю.П.
Самарский государственный университет, Самара (Россия); ФГБУН Институт
биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино (Россия)
Pingvinushechka@yandex.ru
Зелёный флюоресцирующий белок (GFP), выделенный из медузы Aequona Victoria, всё
чаще используется как репортёр в экспрессии и регуляции генов как у про-, так и у эукариотов.
GFP экспрессируется у бактерий, растений, насекомых и млекопитающих. Способность GFP к
флюоресценции в отсутствие каких-либо кофакторов делает его особенно удобным в
лабораторной практике. Ген gfp является очень перспективным репортерным геном,
позволяющим проводить разнообразные прижизненные исследования с трансгенными
организмами. Недавно были сделаны изменения в диком типе gfp: определённые мутации
усиливают флюоресценцию и сдвигают максимум с 395 нм до 490 нм. Было показано, что
бактериальные клетки, экспрессирующиеgfp, управляемые сильными промоторами, такими как
lac промотор, заметно флюоресцировали (William G. Miller, 1997).
Целью наших исследований было получение GFP-меченых штаммов Methylobacterium
radiotolerans, M. extorquens и M. nodulans. Сначала клонировался фрагмент, содержащий ген gfp
под контролем mxaF промотора в плазмиду puc18T-miniTn7T, предварительно раскрытой по
сайту EcoRV. В результате получался фрагмент размером 1200 п.н. После этого
трансформировалась E. coli и проводился ПЦР-скрининг клонов на наличие гена gfp.
Специфический ПЦР-фрагмент ожидаемой длины наблюдался только в контрольной пробе с
плазмидой p7A-29gfp.
Для решения этой проблемы клонировался маркер устойчивости к антибиотику из
плазмиды p34S-Km, разрезанной по сайту SacI в плазмиду puc18T-miniTn7T, также раскрытой
по сайту SacI. Затем в плазмиде pGreenTIR амплифицировался участок, содержащий gfp и
лигированеим помещался в puc18T-miniTKm. С помощью полученного вектора в перспективе
возможно создание других векторов - для метилобактерий (клонируются по оставшимся сайтам
Ace651 и Psl1 промоторные участки из плазмид). p7A-29gfp – промоторы
метанолдегидрогеназы для Methylobacterium radiotolerans, p7A34gfp – Methylobacterium
nodulans, pCM-160 – Methylobacterium extorquens. Конечным этапом исследования станет отбор
клонов, флюоресцирующих в УФ-излучении.
15
Биология и экология микроорганизмов
ЭКОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫХ
АКТИНОМИЦЕТОВ ПОЧВ ТУНДРЫ И СЕВЕРНОЙ ТАЙГИ
Дуброва М.С.
МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения
loasa@mail.ru
Долгое время считалось, что актиномицеты с трудом адаптируются к низким
температурам. В последнее время появились сообщения о выделении психротолерантных
актинобактерий из наземных и водных экосистем: арктических песчаных пород, фьордов
Норвегии, почв Арктики.
В результате проведенных нами исследований выделены культуры актиномицетов. По
фенотипическим признакам все они отнесены к разным видам рода Streptomyces.Для двух
штаммов проведено секвенирование генов 16S pРНК и показано сходство штамма 5-4 с новым
видом психротолерантного стрептомицета Streptomycesbeijiangensis, выделенного из почв
Китая, а штамма мох 18 - со Streptomyces parvus.
С использованием расчета радиальной скорости роста колоний стрептомицетов
установлены температурные границы их роста. Психротолерантные стрептомицеты S.
wedmorensis шт. Н-5-2, S. xanthochromogenes шт. Н-5-1, S. parvus шт. мох 18, S.helvaticus шт. 85-3, шт. 8-5-2,. S. caeruleus шт. H-5-4, выделенные из почвы при 5° или 20°С, растут в диапазоне
температур от 5° до 37ºС. Оптимум роста колоний отмечен при 20°С. Streptomyces beijiangensis
шт. 5-4 и S. aburaviensis шт. H-5-6, выделенные при 5°С, имеют диапазон роста от 0 до 28°С.
Оптимум роста отмечен при 5°С, по классификации психрофильных актиномицетов их можно
отнести к умеренным психрофильным стрептомицетам.
В
процессе
сравнительного
исследования
функционального
потенциала
психротолерантной и мезофильной популяции стрептомицетов, выделенных из почв тундры и
тайги, проведенного методом мультиреспирометрического тестирования (МРТ) культуры были
изначально разделены на две условные температурные группы: «группа 1» – психротолеранты
«группа 2» - мезофилы. МРТ почвенных актиномицетов с отличными друг от друга
предпочтениями по фактору температуры позволило также выявить наличие функциональных
особенностей обеих групп. Дискриминантный анализ исследуемого множества популяций
позволил решить диагностическую задачу определения психротолерантных и мезофильных
актиномицетов в 83% случаев с помощью двух дискриминантных функций, в качестве
независимых переменных которых были выбраны показатели потребления актиномицетами
гистидина, маннита и сахарозы. Условно психрофильный актиномицет Streptomyces
beijiangensis шт. 5-4 составил при этом самостоятельную, четко выраженную группировку, не
пересекающуюся с группой 1 и группой 2 .
Таким образом экониши почвенных психротолерантных и мезофильных актиномицетов
расходятся не только по фактору температуры, но и по другим измерениям, отражающим
спектры потребляемых ресурсов.
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АДГЕЗИЮ КЛЕТОК STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS
Ерошенко Д.В., Лемкина Л.М., Коробов В.П.
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
eroshonok@ya.ru
Способность бактерий создавать биоплёнки на различных поверхностях вносит
значительных вклад в развитие полимер-ассоцированных инфекций. Информация о влиянии
различных экологических условий на связывание бактерий S. epidermidis с поверхностью
различных материалов и формирования ими биопленок весьма незначительна.
Целью настоящего исследования была оценка влияния температуры на адгезивные
свойства клеток S. epidermidis 33.
Материалы и методы. Бактерии S. epidermidis 33 экспоненциальной (4 ч) и стационарной
(16 ч) фаз роста на среде LB дважды промывали физиологическим раствором, осаждали при
16
Биология и экология микроорганизмов
3000 g в течение 10 мин на центрифуге «Eppendorf» 5415R, суспендировали в среде LB до
концентрации 107КОЕ/мл и вносили в полистироловые чашки Петри («Медполимер», СанктПетербург). Инкубацию проводили при 10, 25, 37 и 42°С в течение 30 мин, затем осторожным
отсасыванием удаляли несвязавшиеся клетки и трижды промывали 10 мМ фосфатным буфером
(рН 7,2). Количество сорбированных клеток оценивали с помощью микровизора µViso-103
(«Ломо», Санкт-Петербург) после окрашивания 0,1% раствором кристаллического
фиолетового, просматривая по 10 полей зрения в каждой чашке при увеличении х2500 раз.
Учитывали число бактериальных клеток на площади видимого поля зрения, равной 0,004 мм2.
Статическую обработку проводили с помощью компьютерной программы Excel 2003 (Microsoft
Inc., 1999).
Результаты. Показано, что с увеличением температуры инкубирования количество
адсорбированных клеток увеличивалось, достигая максимума при 42°С. Такая зависимость
характерна как для клеток логарифмической, так и стационарной фазы роста, однако, для
первых кривая зависимости количества адгезированных клеток от температуры имела более
крутой наклон.
Полученные данные согласуются с предположением о том, что стрессовая температура
(42°С) активирует продукцию альтернативного ςB фактора, что приводит к повышению
выделения в среду полисахаридного межклеточного адгезина, способствующего связыванию
бактериальных клеток с атакуемой поверхностью.
СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩЕЕ СООБЩЕСТВО ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ
ЩЕЛОЧНЫХ ОЗЕР БАЙКАЛЬСКОЙ РИФТОВОЙ ЗОНЫ
Захарюк А.Г.1, Рыжманова Я.В.1, Щербакова В.А.1, Намсараев Б.Б.2
1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
(Россия); 2Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ (Россия)
kuran82@mail.ru
На территории Байкальской рифтовой зоны встречаются солоноватые, содово-соленые,
соленые озера и рассолы, которые по своим характеристикам относятся к экстремальным
системам из-за высокой минерализации, щелочности и рН. Такие озера являются уникальными
водными экосистемами. Главная роль в биогеохимических процессах в щелочных озерах
принадлежит серному циклу. Высокие концентрации сульфатов и органического вещества в
озерах обуславливают превалирование процесса бактериальной сульфатредукции на
терминальных этапах деструкции органического вещества.
Целью нашей работы явилось изучение распространения, филогенетического разнообразия
алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) в донных отложениях щелочных озер
Байкальской рифтовой зоны, выделение и характеристика чистых культур СРБ.
В различных слоях донных отложений озер Соленое и Сульфатное методом ПЦР в
реальном времени определено общее количество клеток СРБ и изучено филогенетическое
разнообразие микроорганизмов этой группы. Установлено, что общая численность
сульфатредукторов, выявленная в исследуемых образцах с использованием олигонуклеотидных
праймеров на функциональный ген dsrA, изменяется с глубиной. Максимальное число клеток
(3 х 106 кл/см3 пробы) зафиксировано в подповерхностных слоях донных осадков озера
Соленое (рН 10.07). На поверхности донных отложений изучаемых озер число клеток бактерий,
восстанавливающих сульфаты, было минимальным и достигало в среднем 9.5 х 105 кл/см3
пробы. Используя геноспецифичные праймеры на различные группы СРБ, было изучено
филогенетическое разнообразие этих бактерий в исследуемых образцах. Показано, что нижние
слои донных отложений генетически наиболее разнообразны. В образцах, отобранных с
глубины 15-25 см, выявлены бактерии родов Desulfonema, Desulfobulbus, Desulfotomaculum, а
также представители семейства Desulfovibrionaceae.
Из донных осадков озер Соленое и Сульфатное выделены и описаны три штамма
алкалофильных, умеренно-галофильных сульфатредуцирующих бактерий. Клетки изолятов
представлены подвижными грамотрицательными вибрионами. Исследование влияния рН на
рост штаммов Su2, Ki4 и Ki5 показало, что они являются облигатными алкалофилами c
17
Биология и экология микроорганизмов
оптимальным ростом при рН 10, 9.0 и 9.5, соответственно. На основании данных полифазной
таксономии выделенные штаммы отнесены к роду Desulfonatronum, в рамках которого штаммы
Ki4 и Ki5 представляют новые виды алкалофильных СРБ.
ИСТОЧНИКИ ИНФЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ СЕПТОРИОЗА В ТАМБОВСКОЙ
ОБЛАСТИ
Зеленева Ю.В., Судникова В.П.
Среднерусский филиал ГНУ Тамбовского научно-исследовательского
сельскохозяйственного института
zelenewa@mail.ru
Проявление болезни на посевах пшеницы обусловлено главным образом местными
источниками инфекции, которыми являются пораженные септориозом пожнивные
растительные остатки, злаковые травы и всходы пшеницы, зараженные от семян. На
растительных остатках, находящихся на поверхности почвы, патоген сохраняется в виде
мицелия и пикнид.
Нами была поставлена цель: выявление местных источников инфекции септориоза на
посевах пшеницы, их изучение и составление экологически чистых мероприятий по защите
сельскохозяйственных культур от экономически значимых патогенов.
Для реализации поставленной цели применялись методы: сбор инфекционного материала,
изучение видового состава возбудителей септориоза, изучение внутривидовой структуры
возбудителей септориоза (морфолого-культуральные и патогенные свойства), создание
искусственного инфекционного фона. Работы провозились с культурными и дикими злаками.
Результаты. Установлено, что патогенный комплекс возбудителей септориоза пшеницы в
области представлен тремя видами септориальных грибов: Septoria tritici Rob et. Desm.,
Stagonospora avenae f. sp. triticea Jhons., Stagonospora nodorum [Berk] Castellani & E. G.
Germano. Доминирующее положение занимают S. nodorum и S. tritici.
Наблюдения показали, что возбудители S. nodorum и S. tritici способны сохраняться в
форме пикнид, перитециев на растительных остатках в течение межвегетационного и
вегетационного периодов на поверхности почвы (прорастаемость спор 59,6-93,7%).
Запахивание
послеуборочных
остатков
приводит
к
значительному
снижению
жизнеспособности спор патогенов (в 3,0-6,9 раз) или даже к полной их гибели.
Послеуборочные остатки растений, пораженных септориозом, являются местом сохранения
и размножения гриба.
Установлена высокая инфекционность перезимовавших на растительных остатках
пикноспор (степень поражения растений 52-67%).
Возбудители S. nodorum и S. tritici могут сохраняться (прорастаемость спор 74,3-93,3%) в
межвегетационный период также на злаковых травах в форме пикнид и перитециев.
При анализе пораженных листьев злаковых трав, ржи и ячменя, зимовавших в почве на
глубине 20 см., оказалось, что жизнеспособность спор снижается на 5-35%.
Установлена высокая патогенность (степень поражения 40-67%) изолятов S. nodorum и S.
tritici, выделенных с перезимовавших злаковых трав, при заражении яровой пшеницы.
Работа выполнена по Государственному контракту П326 от 07.04.2010г. в процессе
проведения поисковой научно-исследовательской работы в рамках реализации ФЦП «Научные
и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТНОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ МИКОРИЗОВАННЫХ
КОРНЕЙ ПЛЕКТРАНТУСА НА ВИРУЛЕНТНОСТЬ GLOMUS INTRARADICES
Зинатуллина Г.Г., Юрков А.П., Якоби Л.М.
ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии
zingular@mail.ru
18
Биология и экология микроорганизмов
ВНИИСХМ Россельхозакадемии обладает крупнейшей коллекцией грибов арбускулярной
микоризы (АМ) рода Glomus. АМ-грибы поддерживаются в почвенной культуре на
плектрантусе южном (Plectranthus australis R.. Br.). Микоризованные корни плектрантуса
служат инокуляционным материалом в вегетационных и полевых исследованиях. Такой
инокулюм представляет интерес в исследованиях АМ-грибов in vitro. Целью данной работы
является исследование влияния поверхностной стерилизации микоризованных корней
плектрантуса на вирулентность АМ-грибов и симбиотическую эффективность АМ. Для
стерилизации использовали коммерческий препарат – отбеливатель “Белизна”, часто
применяемый для стерилизации биологических объектов. Микоризованные АМ-грибом Glomus
intraradices корни плектрантуса выдерживали в растворах “Белизны” 100% и 33%
концентрации в течение 30, 60 или 180 с. Затем их трижды промывали кипяченой водой.
Оценку вирулентности АМ-грибов и эффективности АМ проводили в условиях вегетационного
опыта. В качестве тест-растения использовали линию яровой люцерны хмелевидной (Medicago
lupulina L. var. vulgaris Koch) сорта ВИК32 – облигатно микотрофную в условиях низкого
уровня доступного для питания растений фосфора в почве.
Нестерилизованные (в контроле) и стерилизованные (в опыте) микоризованные корни
плектрантуса вносили в почву при посадке проростков люцерны. На 56-е сут от посадки
осуществляли учет урожайности растений и интенсивности развития АМ.
Путем микроскопии окрашенных трипановым синим корней люцерны, выявлено снижение
встречаемости АМ в опытных вариантах в среднем на 22% по сравнению с контролем. Кроме
того, выявлены отличия в морфологии арбускул: у опытных растений - мелкие, аморфные, у
растений в контроле - крупные, четко окрашенные. Наблюдение показало также, что обработка
инокулюма приводила к снижению урожая надземной массы растений (в среднем на 26%) и
увеличению числа завязей (в среднем на 176%) по сравнению с контролем. Исключением стал
вариант с обработкой инокулюма 33% раствором «Белизны» в течение 30 с: встречаемость АМ,
морфология арбускул и урожай надземной массы у растений в опытном варианте были
сопоставимы с контролем, а по числу завязей получен максимальный прирост (376% по
сравнению с контролем).
Таким образом, исследование показало, что поверхностная стерилизация «Белизной»
микоризованных с участием гриба G. intraradices корней плектрантуса, не приводит к потере
вирулентности микросимбионта, но при определенных концентрациях и длительности
обработки оказывает негативное влияние на развитие арбускул и эффективность АМ у
люцерны хмелевидной.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ УГЛЕВОДОВ В ВЫДЕЛЕНИЯХ ТЛИ В РАСТЕНИЯХ
ХЛОПЧАТНИКА В КАРАКАЛПАКСТАНЕ
Калимбетова Р.Ю.1, Бабажанова В.А.2
1
Каракалпакский государственный университет им. Бердаха, 2ККОАНРУз (Узбекистан)
bdjdanil@rambler.ru
Хлопчатник - ведущая техническая и стратегическая сельскохозяйственная культура
Узбекистана. Разработаны комплексные агрохимические приемы, новейшие подходы к её
возделыванию, применяются современные средства защиты растений и т.п. Однако все еще
имеются проблемы, которые приводят к огромным потерям и снижению урожая, в частности
формированию клейкости волокна сырца, что приводит к большим экономическим потерям в
связи с получением продукции низкого качества. Поиск причин, приводящих к образованию
клейкого волокна, является важнейшей научно-прикладной проблемой, базирующейся на
фундаментальных исследованиях механизмов, отвечающих за процесс формирования условий,
способствующих этому явлению. Исследования, проведанные раньше, наводят на мысль о
микробных корнях этого. Огромный ущерб наносится хозяйству при возникновении клейкости
волокна у хлопка, причина которого не выяснена. Одной из причин - атака на растения
хлопчатника тлей. Ранее установлено, что в процессе роста и развития хлопчатника, растения
выделяют производные липидов, белков и сахаров, что является благоприятной средой, как для
развития вредителей, так и для различных групп микроорганизмов, приводящих к
19
Биология и экология микроорганизмов
возникновению клейкости волокна хлопка-сырца. Возникают своеобразные “ловушки”, где
формируются сложный микробиоценоз, симбиотическое сообщество растений-тлеймикроорганизмов. Химический состав “ловушек ” включает в себя продукты метаболизма
насекомых в виде их выделений в результате взаимодействия насекомых с растениями. Состав
выделений, образующихся при взаимодействии тлей с хлопчатником до конца не выявлен.
Вместе с тем можно предположить, что эти выделения состоят из сахаров, в том что числе
высокомолекулярных, белков или продуктов их гидролиза, пигментов и других соединений.
Такого рода выделения могут служить субстратом для многочисленных видов
микроорганизмов.
СОЗДАНИЕ КОМПОЗИЦИИ НОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДА
BACILLUS ОБЛАДАЮЩИЕ ВЫСОКОЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТЬЮ
Кистаубаева А.С., Абдулжанова М., Нигметова К., Жумагалиева Ж.
Казахский национальный университет им. аль-Фараби, Алматы (Казахстан)
aida_kaz@mail.ru
Профилактика желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственной птицы, а
особенно ее молодняка в настоящее время является неотъемлемым мероприятием в
организации любого рентабельного птицеводческого хозяйства. В производственной практике
массовый характер заболеваний связывают с особенностями промышленной технологии
выращивания птицы, а их причину – с глубокими изменениями кишечной микроэкологии.
Традиционное применение антибиотиков и химических препаратов для ее коррекции и лечения
желудочно-кишечных заболеваний ведет к появлению и накоплению лекарственно устойчивых
штаммов возбудителей кишечных инфекций. Помимо риска заражения такими штаммами,
через продукцию птицеводства возможно попадание и антибиотиков в организм человека, что
при современных требованиях к экологической безопасности пищевых продуктов не
допускается. Разработка препаратов, альтернативных кормовым антибиотикам – одна из
актуальных задач.
В связи с этим, целью работы является выделение высокоантагонистических штаммов
бактерий рода Bacillus и получение композиции новых штаммов бактерий учитывая их
биосовместимость.Из помета 230 птиц выделено более 200 видов бактерий рода Bacillus, из них
были селекционированы бактерии, антагонистическая активность которых, проявляется к более
широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, чем у других
представителей эндогенной и экзогенной микрофлоры.
Были отобраны активные штаммы Bacillus subtilis В-1, В-2, В-5, В-6, В-8, В-11, В-56, В-81,
В-183, В-195 и Bacillus licheniformis ВL-12, ВL-33, ВL-44, BL-59, BL-98, которые обладают
выраженной антагонистической активностью в отношении возбудителей эшерихиозов,
сальмонеллезов, дизентерии, кокковых инфекций.Исследования показали, что новые штаммы
Bacillus в композиции обладают высоким антимикробным действем по отношению к
бактериям-мишеням с различной степенью выраженности. Однако не все штаммы
биосовместимы друг с другом.
Таким образом, из всех отобранных штаммов по биосовместимости были отобраны 2
штамма Bacillus subtilis В-11 иBacillus licheniformis ВL-12, которые подавляют рост
испытуемых штаммов-мишеней патогенных и условно-патогеннных бактерий (S. enteritidis, E.
аerogenes, Sh. flexneri., E. coli, P.aerogenis, P. vulgaris, S. lutea, St.aureus E.coli, P.aerogenis) в
среднем на 77,6%, по отдельности в среднем на 20% ниже.
СПОСОБНОСТЬ РОДОКОККОВ К ПЛЕНКООБРАЗОВАНИЮ
Клишевич Н.Г., Самсонова А.С.
Институт микробиологии НАН Беларуси
nataliklis@mail.ru
20
Биология и экология микроорганизмов
В природе основная часть микроорганизмов существует в виде ассоциаций, которые
определяются общим термином «биопленки». Это пространственно и метаболически
структурированные сообщества, которые располагаются на границе раздела фаз и заключены
во внеклеточный матрикс. Развитие прикрепленных сообществ – одна из стратегий выживания
бактерий в окружающей среде. Микроорганизмы способны образовывать биопленку на
различных поверхностях. Популяции в биопленках отличаются от суспензионных культур
рядом существенных особенностей: высокой плотностью, сниженной чувствительностью к
воздействию стрессовых факторов и биоцидов, повышенной физической, химической и
метаболической стабильностью, генетической гетерогенностью, обусловленной повышенной
частотой горизонтального переноса генов Преимуществом пребывания микробных клеток в
таком состоянии является то, что в ней могут граничить аэробная и анаэробная зоны. Следует
отметить, что пленка не постоянна, она может переходить в планктонную культуру.
Цель настоящей работы состояла в изучении способности родококков – активных
деструкторов нефти, к пленкообразованию. В работе использовали 22 коллекционных штамма
микроорганизмов рода Rhodococcus. Образование ими биопленок наблюдали и изучали на
поверхности пластмассовых чашек Петри. Для культивирования клеток использовали жидкую
среду LB. В течение недели измеряли оптическую плотность образовавшихся пленок по
уровню экстракции генцианвиолета. О степени пленкообразования судили по интенсивности
окрашивания содержимого чашек красителем. Среди исследованных 22 культур отобрано 2,
обладающие высокой степенью к пленкообразованию – штаммыRhodococcus ruber 2B и
Rhodococcus wratislaviensis Г13. Установлено, что оптическая плотность экстракта красителя
поглощенного пленкой, образованной этими культурами, превышала контроль в 3 (Rh.
wratislaviensis Г13) и 5 (Rh. ruber 2В) раз. При этом штамм Rh. ruber 2В образовывал пленку
быстрее (через сутки), чемRh. wratislaviensis Г13 (через двое суток). Однако при обновлении
среды пленка, образованная штаммом Rh. wratislaviensis Г13, разрушается быстрее, чем без ее
обновления, что сопровождается переходом культуры в планктонное состояние. Пленка,
образованная Rh. ruber 2В стабильна при многократном обновлении среды, что
свидетельствует о наличии у нее высокой способности к пленкообразованию.
СПЕКТР И АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЯЕМЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ БИОТОПОВ
Колмогорова С.В., Обухова Н.А., Скобликов Н.Э.
Краснодарский муниципальный медицинский институт высшего сестринского
образования, Краснодар (Россия)
kosheleva@yandex.ru
Целью работы было исследование спектра условно-патогенных микроорганизмов,
выделяемых у пациентов, обратившихся за обследованием в лабораторию «CityLab»
г.Краснодара, и их антибиотикорезистентности.
Объект исследования – биоматериал от 457 пациентов (доля женщин составила 63,68%,
мужчин – 36,32%). В отношении выделенных бактерий проводилось определение
резистентности к набору из 15 антибиотиков различных групп.
Доля пациентов, обратившихся за исследованием органов мочеполовой системы, составила
67,39% (исследование цервикального канала составило 41,08% всех исследований). Среди
возрастных групп максимальное количество пациентов (23,20%) пришлось на группу возраста
от 25 до 30 лет; доля пациентов в возрасте от 20 до 40 лет составила 70,02%.
Всего было выделено 1013 изолятов условно-патогенных микроорганизмов, среди которых
наиболее часто встречались: Enterococcus faecalis (23,17%), Escherichia coli (14,54%),
Staphylococcus capitis (6,62%), дрожжеподобные грибы рода Candida (6,52%), Staphylococcus
epidermidis (6,12%), Staphylococcusaureus (3,71%), Staphylococcus haemolyticus (3,41%),
Staphylococcushominis (2,21%), Streptococcus bovis (2,11%). Стафилококки составили 27,98%
всех изолятов, энтерококки – 23,97%, стрептококки – 12,74%, энтеробактерии – 21,16%.
Антибиотики, резистентность к которым демонстрировало значительное количество
изолятов: азитромицин (44,65%), кларитромицин (38,91%), эритромицин (31,88%), тетрациклин
21
Биология и экология микроорганизмов
(25,30%). С наименьшей частотой определялась резистентность к амоксиклаву (2,31%),
цефаклору (4,85%), левофлоксацину (7,36%), цефазолину (9,94%).
Работа выполнялась в рамках проекта РФФИ № 12-04-00849-а.
ДЕТЕКЦИЯ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОВЕРХНОСТНЫХ
ВОДАХ ЧЕРНОГО МОРЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
Корнеева В.А., Брюханов А.Л., Пименов Н.В.
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический
факультет; Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н.
Виноградского РАН, Москва (Россия)
busenica@yandex.ru
Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) и метаногенные археи (МА) считаются строго
анаэробными микроорганизмами. Однако к настоящему времени накопилось большое
количество данных, указывающих на их способность не только выживать, но и оставаться
метаболически активными в присутствии кислорода за счет использования различных систем
антиокислительной защиты, а также при развитии в анаэробных микронишах.
Черное море является крупнейшим в мире меромиктическим водоемом. Глубже 200 м его
воды содержат значительные количества растворенных H2S и CH4, образующихся
преимущественно в ходе жизнедеятельности СРБ и МА, соответственно. Основываясь на
профилях содержания H2S и CH4, а также на радиоизотопных измерениях скоростей
сульфатредукции и метаногенеза ранее было доказано прохождение этих процессов не только в
анаэробных водах, но и в поверхностных окисленных водах Черного моря.
Методом FISH показано присутствие в аэробных водах и в нижней зоне хемоклина
физиологически активных метаногенов, принадлежащих к родам Methanobacterium,
Methanobrevibacter, Methanosphaera и к порядку Methanomicrobiales. Среди СРБ в окисленных
водах преобладали физиологически активные представители родов Desulfovibrio и
Desulfotomaculum, а в зоне хемоклина – представители рода Desulfomicrobium.
При ПЦР амплификации участка гена 16S рРНК свободноживущие и ассоциированные
метаногенные археи детектировались как в аэробных водах, так и в зоне хемоклина Черного
моря. По участку гена mcrA (α-субъединица метилкоэнзим-М-редуктазы) метаногены
обнаруживались только среди свободноживущих микроорганизмов и не на всех исследуемых
глубинах. Также было показано наличие в пробах гена dsrB (диссимиляционная сульфитредуктаза),присутствующего у всех СРБ. С помощью ПЦР были обнаружены участки 16S
рДНК представителей групп Desulfotomaculum, Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina и
Desulfovibrio-Desulfomicrobium во всех зонах поверхностных вод, а группы Desulfobacter – в
верхних аэробных, а также в анаэробных водах.
Были получены ДГГЭ профили сообществ архей (по участкам гена 16S рРНК) и СРБ (по
участкам гена dsrB) со всех исследуемых глубин, отличающиеся количеством и расположением
полос ДНК. Данные различия хорошо коррелируют с неоднородностью водных слоев по
гидрохимическим условиям. Анализ сиквенсов выделенных и реамплифицированных участков
исследуемых генов показал гомологию некоторых архейных образцов с геномами метаногенов;
так, для большинства нуклеотидных последовательностей была отмечена 92%-ная гомология с
Methanospirillum hungatei. Для СРБ показана достаточно высокая гомология образцов с геном
dsrB различных морских сульфатредукторов.
22
Биология и экология микроорганизмов
РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА HALOMONADACEAE РАЙОНА
СОЛЕРАЗРАБОТОК ВЕРХНЕКАМСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ СОЛЕЙ
Корсакова Е.С., Пьянкова А.А., Ананьина Л.Н.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и
генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук,
Пермский государственный национальный исследовательский университет
Camomille-08@mail.ru
Цель настоящего исследования - изучение филогенетического разнообразия
культивируемых бактерий семейства Halomonadaceae района разработок Верхнекамского
месторождения солей (г. Березники, г. Соликамск, Пермский край).
Из образцов рассола, породы солеотвала и засоленных образцов почвы на полноценной
среде Раймонда с добавлением 30 г/л, 150 г/л NaCl и на среде АТСС с 200 г/л NaCl было
выделено 39 штаммов бактерий. В результате сравнения последовательностей гена 16S рРНК
изолятов с таковыми из открытой базы данных EzTaxon установлено, что штаммы являются
членами четырех родов (Salinicola, Chromohalobacter, Halomonas и Kushneria) семейства
Halomonadaceae филума Gammaproteobacteria. Уровень сходства 16S рДНК изолятов с
типовыми штаммами узаконенных видов находился в пределах 99.1-100%. Наибольшим
филогенетическим разнообразием характеризовались изоляты рода Halomonas, проявившие
высокий уровень сходства с видами Halomonastitanicae, Halomonas sulfidaeris, Halomonas
alkaliphila,
Halomonasventosae,
Halomonas
taeanensis,
Halomonas
boliviensis
и
Halomonasneptunia. Изоляты рода Chromohalobacter были близкородственны с видами
Chromohalobacter canadensis и Chromohalobacter japonicus, изоляты рода Salinicola
группировались с Salinicola salarius и Salinicola socius, а штаммы рода Kushneria с Kushneria
marisflavi. С целью исследования генетического разнообразия изолятов внутри
филогенетических групп использовали метод BOX-ПЦР.Большинство исследованных изолятов
(66%) характеризовалось уникальными наборами фрагментов ДНК. Кроме того, сравнение
BOX-фингерпринтов изолятов родов Chromohalobacter, Salinicola, Halomonas с таковыми
близкородственных типовых штаммов выявило значительное их различие, что может указывать
на принадлежность выделенных штаммов к новым видам. Полученные результаты показали
филогенетическое разнообразие и генетическую неоднородность бактерий семейства
Halomonadaceae района разработок Верхнекамского месторождения солей.
Работа выполнена в рамках научного проекта молодых ученых УрО РАН №11-4-НП-425.
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНКИ ШТАММАМИ
PSEUDOMONAS AERUGINOSA РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Косиков А.И., Балко А.Б., Авдеева Л.В.
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины
neo12@mail.ru
Известно, что в естественной среде обитания микроорганизмы существуют в составе
специфических многоклеточных образований, названных биоплёнками. Последнее десятилетие
учёные пытаются объяснить механизмы формирования биоплёнки для получения возможности
влияния на её образование. В качестве модели для изучения процесса биоплёнкообразования
широко используют Pseudomonas aeruginosa. В 2002 г. J. William Costerton для этого вида
микроорганизмов описал поэтапную модель формирования биопленки. В наших исследованиях
на отдельных штаммах P. aeruginosa было показано наличие промежуточных структур,
которые позволяют дополнить существующую модель биопленкообразования.
Целью нашей работы было изучение ранних этапов формирования биопленки с
использованием штаммов P. aeruginosa различного происхождения.
Исследование биопленкообразования проводили на 12 штаммах P. aeruginosa, выделенных
от человека, с растений, из внешней среды и клинических изолятах. Изучение структурной
организации биоплёнки осуществляли в стационарной системе на стекле и в камерах для
проточного культивирования при помощи световой, фазово-контрастной, флуоресцентной и
23
Биология и экология микроорганизмов
конфокальной сканирующей лазерной микроскопии на фиксированных и нативных образцах.
Микроструктуры изучали посредством получения на разных этапах образования биопленки
ультрамикрофотографических изображений и их последующей обработки с помощью
программ Axiovision Rel.4.7., Zeiss LSM Image Browser ver. 4.0.0.241, Adobe Photoshop CS5 и
TotalLab TL120.
Было показано, что между предложенными Costerton исходным этапом прикрепления
клеток к стеклу и последующим формированием микроколоний выявляется ряд
промежуточных стадий. В частности, бактериальные клетки после прикрепления образуют
структуры трёх типов - тяжи, конгломераты и розетки. Указанные образования
регистрировались у всех 12 штаммов на ранних и более поздних этапах формирования
биопленки, а также при ее деградации, в связи с чем рассматривались нами как исходные
компоненты биоплёнки P. aeruginosa. Длина тяжей у разных штаммов колебалась от 10 до 31
мкм, площадь конгломератов – 4000-10000 мкм2, а размер клеток в составе розеток
соответствовал таким у их свободно прикрепленных аналогов – 1,3-2,0 мкм. В дальнейшем
исходные компоненты объединялись в специфическую сеткообразную структуру с ореолами –
незаполненными клетками участками образца, вариабельными по площади - 0,11-1,48 мм2. В
центральной части сеткообразной структуры вокруг увеличенных конгломератов происходило
формирование микроколоний, размеры которых составляли от 0,12 до 0,48 мм2. На последнем
этапе, как и у Costerton, микроколонии объединялись в монослой объёмной конфигурации.
Таким образом, на ранних этапах формирования биоплёнки у штаммов P. aeruginosa
различного происхождения выявляются одинаковые по структуре и близкие по размеру
образования, которые можно рассматривать как компоненты промежуточных этапов
биопленкообразования, описанного Costerton.
ВЛИЯНИЕ BACILLUS SUBTILIS И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА РОСТ
РАСТЕНИЙ И ЧИСЛЕННОСТЬ РИЗОСФЕРНЫХ БАКТЕРИЙ
Кочетовская О.В., Курамшина З.М., Хайруллин Р.М.
СГПА им. Зайнаб Биишевой
vitaminka-lesya@yandex.ru
Развитие ризосферной микрофлоры связано, прежде всего, с выделениями из корней
органических веществ, синтезированных растениями. На ризосферную микрофлору влияют
также вид, возраст растений и их состояние, положение и характер распределения корней, тип
почвы и окружение. Интенсивная обработки почв (вспашка, орошение, мелиорация),
применение химических средств борьбы с сорняками (гербициды), всевозможных
протравителей семян, минеральных удобрений, а также загрязнение окружающей среды
тяжелыми металлами оказывают огромное воздействие на микробные ассоциации.
Исследовали влияние тяжелых металлов (кадмия и никеля) и инокуляции семян пшеницы
(Triticum aestivum L.) клетками B. subtilis штаммов 26 Д и 11 ВМ (106 кл/мл) на численность
микроорганизмов ризосферы пшеницы. Семена перед проращиванием промывали в мыльной
воде, споласкивали в проточной и в дистиллированной воде. Металлы в почву вносили в виде
раствора соли однократно после посадки семян, контрольные растения поливали
дистиллированной водой. Через 7 суток методом предельных разведений производили посев
почвенной суспензии на поверхность среды (МПА) и определяли показатель КОЕ. В результате
проведенных исследований выявлено, что численность микроорганизмов ризосферы пшеницы
под действием B. subtilis шт. 26Д и 11 ВМ снижалась на 40% и 36%, соответственно. Анализ
ризосферы растений, выросших в присутствии ионов кадмия в концентрации 10 мг/кг показал,
что количество микроорганизмов у необработанных бациллами растений не изменялось, а
присутствие никеля стимулировало рост численности микроорганизмов ризосферы на 14%,
относительно контроля. Предварительная инокуляция растений B. subtilis шт. 26Д (11 ВМ) и
наличие кадмия (10 мг/кг) в почве вело к снижению численности микроорганизмов на 20 (30%),
относительно контроля. Стимулирующий эффект никеля (10 мг/кг) на численность
микроорганизмов сохранялся и у обработанных бациллами растений. Кадмий в концентрации
200 мг/кг угнетал численность микроорганизмов на у необработанных бациллами растений на
24
Биология и экология микроорганизмов
38%, у обработанных B. subtilis шт. 26Д и шт. 11 ВМ на 36% и 32%, соответственно. Никель
(200 мг/кг) оказывал слабоингибирующее действие.
АНАЛИЗ АДАПТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER sp. K7
K ГЛИФОСАТУ
1
Нешко А.А. , Крючкова Е.В.2, Бурыгин Г.Л.2, Турковская О.В.2
1
Национальный исследовательский Саратовский государственный университет им. Н.Г.
Чернышевского; 2Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и
физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов (Россия)
kryu-lena@yandex.ru
Целью настоящего исследования являлась оценка влияния экзогенных ароматических
аминокислот и витаминов, используемых как модельные соединения корневых экссудатов
растений, на некоторые показатели устойчивости Enterobacter sp. K7 к глифосату.
Показателями, отражающими устойчивость бактерий, служили: ростовые характеристики
культуры, уровень продукции экстраклеточных полисахаридов (ЭПС), а также сравнительный
анализ белковых профилей бактерий, выращенных на различных источниках фосфора. В работе
использован ризосферный штамм, способный к росту на глифосате, в качестве единственного
источника фосфора.
В результате проведённого исследования показано, что в условиях глифосатного стресса
ароматические аминокислоты полностью нивелируют токсическое действие гербицида. У
бактерий, растущих на глифосате без добавления аминокислот, лаг-фаза была длиннее на
сутки, а удельная скорость роста (µ) ниже на 0,02 ч-1, чем у культуры на среде с
аминокислотами. Добавление витаминов в среду культивирования подобного действия не
оказывало.
Показано, что в наименее благоприятных условиях зафиксирована наиболее высокая
продукция ЭПС у культур, растущих только на глифосате, а также на глифосате с витаминами.
Повышение синтеза ЭПС клетками штамма K7 в условиях загрязнения свидетельствует о
защитных механизмах, используемых бактериями в «стрессовых ситуациях». В контрольных
вариантах без гербицида количество ЭПС в пересчёте на бактериальную клетку было в 11 раз
меньше, чем в вариантах с глифосатом.
Сравнительный анализ белковых профилей показал, что у бактерий, выращенных на
гербициде, белковые спектры отличались от контроля, появлением дополнительных полос.
Полученные результаты расширяют представления о биохимических факторах, влияющих на
устойчивость бактерий к органофосфонатам.
СИНЕ-ЗЕЛЕНЫЕ ВОДОРОСЛИ УЧКЫЗЫЛСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА
РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН
Кучимова Х., Халилов С.
НПЦ Ботаника АН РУз
kxosiyat@gmail.com
Учкызылское водохранилище сооружено на реке Сурхандарья и канала Занг.
Водохранилище наливное. Построено водохранилище в 1960 г. В Учкызылском
водохранилище встречаются 58 видов и разновидностей сине-зеленых водорослей. Самый
многочисленный из них род Oscillatoria, представленный в водохранилище 12 видами и
разновидностями (Microcyctis – 4, merismopedia – 4, gloeocapsa – 5, phormidium – 5 и другие).
Вегетация сине-зеленых водорослей в различных участках Учкызылского водохранилища
начинается не одновременно, что связано с неравномерным прогреванием воды
водохранилища. В правой и левой части водохранилища сине-зеленых водоросли появляются в
один и полтора недели раньше, чем в открытой части. Эти берега мелководные, в них
отсутствует течение, поэтому они раньше и быстрее прогреваются. По водохранилищу в целом
25
Биология и экология микроорганизмов
интенсивное развитие сине-зеленых водорослей наблюдается после второй половины весны,
летом и первой половины осени. В основном, сине-зеленые водоросли в тихую погоду
сосредоточены в верхнем двух и трех метровом слое воды. Под влиянием ветров водоросли
могут сноситься с одного места в другое. При этом происходит их более или менее
равномерное перемешивание по всей толще воды. Это подтверждают А. Музафаров (1958,
1965), А.И. Кузьмичев и В.Г. Стойкина (1965), А.Э. Эргашев (1974), С. Халилов (1976) и
многие другие.
Основной фон сине-зеленых водорослей Учкызылского водохранилища составляют
Merismopedia glauca, Microcyctis aeruginosa, Microcyctis auruginosa f.flos.aquae, Microcyctis
pulvera, Oscillatoria limosa и многие другие.
ПЕРСИСТЕНЦИЯ И ВОЗОБНОВЛЕНИЕ РОСТА У БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM
BRASILENSE – ЭНДОФИТНЫХ СИМБИОНТОВ ПШЕНИЦЫ
Кушнерук М.А.1, Нечепурнова Н.А.2, Старичкова Н.И.2, Антонюк Л.П.1
1
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН; 2Саратовский
государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов (Россия)
kushneru-uk@mail.ru
Azospirillum brasilense Sр245 – природный симбионт пшеницы, колонизирующий эту
культуру эндофитно (населяет корневые волоски и межклетники вблизи проводящей системы
корня). Штамм относится к биотехнологически значимым; в связи с этим, а также из-за
предположения о решающем вкладе покоящихся азоспирилл семени в колонизацию корня
растения, начато изучение покоя у A.brasilense. Оказалось, что все изученные штаммы этой
неспорообразующей бактерии способны к образованию цист (в другой терминологии –
цистоподобных покоящихся клеток; см. Микробиология, 2009, 78: 42–51). Образование
жизнеспособных, но временно некультивируемых клеток (ЖВНК) для азоспирилл пока не
описано. Целями работы были: (i) характеристика жизнеспособностиA. brasilense Sp245 при
длительной, более 5 лет, персистенции; (ii) подбор условий для образования этим штаммом
ЖВНК; (iii) изучение стимуляции лектином пшеницы перехода азоспириллы к активному
размножению.
Установлено, что жидкая культура A. brasilense Sp245, выращенная на синтетической
малатной среде (СМС) и хранящаяся при комнатной температуре, сохраняет хорошую
жизнеспособность по крайней мере в течение 5,5 лет и легко возобновляет рост на жидкой и
агаризованной СМС. За время хранения число жизнеспособных клеток снижалось в среднем с
108 до 103 кл./мл. Штаммы-эндофиты пшеницы, A. brasilense Sp245 и SR75, сохраняли высокую
жизнеспособность при персистенции на физрастворе (т.е. в 0,85 NaCl) по крайней мере в
течение 6 месяцев. Мы предприняли попытку получить ЖВНК A. brasilense Sp245, комбинируя
следующие стрессовые факторы: (i) исключение из среды питательных веществ, кроме
сульфата Mg, хлоридов Na и Са; (ii) наличие факторов блокирующих рост: гексилрезорцина
(0,2 мМ) и СuSO4 (0,4 мМ); (iii) кислородный стресс; (iv) низкая стартовая плотность бактерий
– 104 кл./мл., (v) удаление факторов межклеточной коммуникации путем отмывки клеток.
Стрессированные таким образом бактерии не давали роста на твердой СМС, но возобновляли
рост на жидкой СМС. Как в данной, так и в 5,5-годичной культурах световая микроскопия
выявляла наличие однотипных кристаллов, отличных от описанного нами ранее для A.
brasilense Sp245 струвита.
Лектин пшеницы (агглютинин зародышей пшеницы) ускорял восстановление роста после
длительной персистенции культуры. Выраженная стимуляция наблюдалась через 70 часов
роста культуры в тесте КОЕ (колониеобразующих единиц).
26
Биология и экология микроорганизмов
ПОЛИАМИНЫ КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ АДАПТИВНЫХ
ГЕНОВ ESCHERICHIA COLI В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ
РАЗНЫХ КЛАССОВ
Кылосова А.М., Шумков М.С., Ткаченко А.Г.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
aljeshka@yandex.ru
Антибиотикорезистентность – одна из самых актуальных проблем современной
медицинской микробиологии. Решение этой проблемы исключительно путём разработки иных
антибактериальных препаратов невозможно в связи с формированием у микроорганизмов
новых механизмов резистентности.
Раннее работами Лаборатории адаптации микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН было
показано, что в ответ на действие антибиотиков разных классов в клетках E. coli происходит
возрастание концентрации полиаминов с выраженным накоплением кадаверина. Известно, что
кадаверин является продуктом реакции, катализируемой двумя изоферментами
лизиндекарбоксилазы, CadA и LdcC. До недавнего времени считалось, что LdcC является
коститутивным ферментом и в качестве регулятора синтеза и активности LdcC может
выступать RpoS.
Исходя из этого, целью настоящей работы явилось изучение изменения экспрессии ldcC в
ответ на действие антибиотиков разных классов и роли полиаминов в её регуляции.
Для изучения экспрессии rpoS использовали штаммы, любезно предоставленые Р. ХенггеАронис. В исследованиях экспрессионного ответа ldcC, использовали штамм E.coli с
трансляционным генным слиянием, сконструированный в лаборатории адаптации
микроорганизмов. Сублетальные концентрации антибиотиков подбирали таким образом, чтобы
их добавка приводила к 70% подавлению накопления биомассы к 4 часу культивирования.
Установлено, что сублетальное воздействие фторхинолонов приводит к возрастанию
экспрессии rpoS и индукции синтеза полиаминов с преимущественным накоплением в клетках
кадаверина. Этот факт дал основание предположить возможность возрастания экспрессии гена
ldcC в данных условиях. Действительно, после добавки фторхинолонов обнаружено 2-кратное
возрастание экспрессии ldcC, тогда как β-лактамы и аминогликозиды оказывали
противоположный эффект. Путресцин в присутствии фторхинолонов вызывал 50% возрастание
экспрессии ldcC, не оказывая значительного влияния на скорость накопления биомассы. При
этом спермидин вызвал 2-кратное повышение значений оптической плотности с
противоположным влиянием на экспрессию. В случае цефалоспоринов и аминогликозидов
добавка полиаминов не приводила к статистически значимым изменениям.
Установлено, что фторхинолоновые антибиотики повышают экспрессию гена ldcC, тогда
как цефалоспорины и аминогликозиды оказывают обратный эффект.Таким образом,
специфической реакцией микроорганизмов на добавку фторхинолоновых антибиотиков
является возрастание синтеза полиаминов (путресцин, спермидин), оказывающих
положительный модулирующий эффект на экспрессию rpoS, продукт которого контролирует
экспрессию гена лизиндекарбоксилазы ldcC. Это приводит к высокому накоплению кадаверина,
ограничивающего проницаемость пориновых каналов, что частично снимает ингибирующий
эффект антибиотика.
Работа проведена в соответствии с Программой Президиума РАН «Молекулярная и
клеточная биология» (проект №12-П-4-1046) и поддержана грантом РФФИ №11-04-96001.
ОБРАЗОВАНИЕ БАКТЕРИОРОДОПСИНА ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫМ,
ЭКСТРЕМАЛЬНО-ГАЛОФИЛЬНЫМ ШТАММОМ HALOBACTERIUM SP. K91R
Лобанова К.В.1, Сейдаметова Э.А.1, Гулямова Т.Г.1, Конвей П.2
1
Институт микробиологии АН РУз (Узбекистан); 2BAS, Cambridge (UK)
imbuz2012@mail.ru
Одними из представителей экстремофильных микроорганизмов являются галофильные
бактерии, распространенные в засоленных почвах с высоким содержанием преимущественно
27
Биология и экология микроорганизмов
NaCl. Особый интерес к этим микроорганизмам в последние годы обусловлен их способностью
к биосинтезу уникальных соединений. К числу таких соединений относится бактериородопсин.
Данный пигмент является жизненно-важным для галофильных бактерий бассейна Аральского
моря в Узбекистане, так как выполняет засчитную функцию от экстремально-высоких доз
солнечной радиации.
Благодаря своим физическим и химическим свойствам, бактериородопсин может быть
использован в разработке новых электронных устройств. В этом аспекте, представляется
чрезвычайно важным изучение биосинтетических свойств микроорганизмов галофильной
природы с целью выявления перспектив их использования для получения бактериородопсина.
В связи с этим, целью настоящего исследования был скрининг местных штаммов
галофильных бактерий, выделенных из засоленных почв Южного Приаралья, как возможных
перспективных продуцентов бактериородопсина.
Термотолерантные галофильные бактерии растили при температуре 45°С на среде 44,
содержащей
250
г/л
NaCl.
Концентрацию
бактериородопсина
определяли
спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра Spekol-1300 (Analytik
Jena, Германия).
В результате скрининга выделенных из почв галофильных культур было выявлено, что
штамм Halobacterium sp. K91r обладает способностью к биосинтезу до 11.3 мг/л
бактериородопсина. Образование данного пигментного соединения было подтверждено путем
электрофореза в полиакриламидном геле. Отобранный нами дикий штамм Halobacterium sp.
K91r может рассматриваться в качестве перспективной родительской культуры для
дальнейших исследований с целью увеличения уровня накопления бактериородопсина.
ВЛИЯНИЕ ОСМОЛЯРНОСТИ СРЕДЫ НА ПОТРЕБЛЕНИЕ СУБСТРАТОВ
ГАЛОТОЛЕРАНТНЫМИ МИЦЕЛИАЛЬНЫМИ АКТИНОБАКТЕРИЯМИ
Лубсанова Д.А.
МГУ им. М.В. Ломоносова
dashablack@rambler.ru
Засоленность почвы влияет на характер дыхания почвенных обитателей (в том числе
мицелиальных бактерий - актиномицетов), в ходе которого выделяется СО2, влияющий на
климат.
Цель работы - сравнительный функциональный анализ почвенных актиномицетов с разной
осмотической адаптацией с помощью метода мультиреспирометрического тестирования (МРТ),
результаты которого обрабатывались с помощью кластерного анализа.
Объекты исследования - 12 штаммов стрептомицетов, различных по осмолярности среды
выделения и среды культивирования (0,05 и 5% NaCl). Метод исследования - МРТ. В
специальные тест-планшеты с ячейками вносят суспензию актиномицетов и жидкую среду
Гаузе 1 с определенной концентрацией NaCl (0,05, 0,5, 2 или 5%). В крышку планшеты
заливают индикаторный гель, реагирующий на выделяющийся в ходе дыхания CO2. После
инкубации планшет, данные с крышки сканируют, оцифровывают и обрабатывают
статистически.
Кластерный анализ штаммов, различных по осмолярности среды выделения и среды
культивирования, не дал четкого разделения объектов на предполагаемые кластеры. Тем не
менее, у галотолерантных штаммов, культивируемых на среде с 5% NaCl, наблюдаем
тенденцию к более активному потреблению субстрата во всем созданном градиенте
концентраций NaCl по сравнению с негалофильными штаммами, культивируемыми на среде с
концентрацией соли 0,05%. Наблюдение за изменением активностиS. badius при его
культивировании на средах с разными концентрациями NaCl (0,05 и 5%) свидетельствует об
активном потреблении субстрата при предадаптации культуры на среде с концентрацией NaCl
5%.
Таким образом, показана зависимость функциональных показателей роста актиномицетов
от их осмотической адаптации.
28
Биология и экология микроорганизмов
АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS,
КУЛЬТИВИРУЕМЫХ В СРЕДАХ, СОДЕРЖАЩИХ ИОНЫ ТЯЖЁЛЫХ
МЕТАЛЛОВ
Остапенко Е.А., Бузолёва Л.С.
ФГБУ "НИИЭМ" СО РАМН, Дальневосточный Федеральный Университет (ДВФУ)
angel.8807@bk.ru
Целью работы является изучение влияния ионов тяжёлых металлов (Co 2+, Pb 2+, Cu 2+,
Zn 2+, Cd 2+) на факторы патогенности Y. pseudotuberculosis (шт. 2781, шт. Н-3515 и шт. 907).
Материалы и методы. Штаммы Y. pseudotuberculosis выделены от больного. Для
постановки опыта использована методика В.И. Брилис с соавторами (1982). В качестве
экспериментальной модели взяты нативные эритроциты человека О (I) группы Rh (+). Согласно
методике готовили взвесь эритроцитов с концентрацией 100 млн/мл. Взвесь микроорганизмов в концентрации 109 КОЕ/мл. На микропланшет вносили по 0,05 мл культуры и эритроцитов.
Смеси инкубировали при 37ºС во влажной камере. Мазки готовили на тщательно
обезжиренном предметном стекле через 30 минут контакта эритроцитов с иерсиниями.
Полученные мазки окрашивали по Романовскому – Гимзе. Адгезию изучали под световым
микроскопом Биолам – Ломо. Определяли СПА (средний показатель адгезии).
Результаты. Из трёх штаммов Y. pseudotuberculosis наибольшей адгезивной способностью
обладали шт. 2781 и шт. H-3515. Y. pseudotuberculosis (шт.2781), культивируемый в среде,
содержащей ионы Zn 2+, обладал СПА=5,71, а в среде с ионами Pb 2+ его СПА=8,73. Y.
pseudotuberculosis (шт. H-3515) (Zn2+) имел СПА=4,19. Y. pseudotuberculosis (шт. 907) обладал
средней адгезивностью (от 2,01 до 4,00) под действием всех ионов тяжёлых металлов.
По сравнению с контролем (без ионов тяжёлых металлов) Y. pseudotuberculosis (шт. 2781 и Н3515) повысили свои адгезивные свойства под воздействием ионов тяжёлых металлов: Y.
pseudotuberculosis (шт. 2781), ассимилирующий ионы цинка, имел адгезию в 2,3 раза выше, а
ионы свинца - в 3,6 раза; Y. pseudotuberculosis (шт.Н-3515), содержащий ионы цинка, повысил
свои адгезивные свойства в 1,5 раза; Y. pseudotuberculosis (шт. 907), несмотря на то, что
ассимилируя различные ионы тяжёлых металлов, обладал средней адгезивностью, однако
максимальные адгезивные свойства наблюдались для ионов цинка в 2 раза, а для ионов свинца
в 3,2 раза.
Заключение. Исследование показало, что ионы таких тяжёлых металлов как цинк и свинец,
оказывают наибольшее влияние на повышение адгезивности всех взятых в эксперимент
штаммов Y. pseudotuberculosis, а особенно шт. 2781, который в большей степени повысил свой
адгезивный потенциал, а, следовательно, и патогенный.
ОЦЕНКА ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ПОЧВ В РАЙОНЕ
РАЗМЕЩЕНИЯ РАДИАЦИОННО ОПАСНЫХ ОБЪЕКТОВ
Павлова Н.Н.
Обнинский институт атомной энергетики – филиал Национального исследовательского
ядерного университета «МИФИ»
nadpavl@yandex.ru
Микробиота почвы очень чутко реагирует на различные изменения почвенных условий,
поэтому микробиологические показатели в наибольшей степени подходят для ранней
диагностики техногенного загрязнения почв. Чувствительность и высокая индикационная
способность микроорганизмов позволяют использовать показатели их функционирования в
качестве информативных параметров мониторинга антропогенных изменений в биосфере.
Целью данной работы было изучение состояния почвенного микробиоценоза в районе
размещения хранилища радиоактивных отходов г. Обнинска.
Для достижения указанной цели в зоне наблюдения исследовались следующие
биологические показатели: каталазная, инвертазная, уреазная, дегидрогеназная активности,
учет численности микроорганизмов с помощью подсчета количества колониеобразующих
единиц и методом комочков обрастания. Для исследования изменений биологических
29
Биология и экология микроорганизмов
показателей проведена оценка актуальной и потенциальной кислотности почв, механического
состава и удельной активности 137Cs, 226Ra и 232Th.
Объектами исследования являлись 16 почвенных образцов, отобранных в районе
размещения хранилища радиоактивных отходов. Изучение биологических показателей
проводилось стандартными методами, используемыми в почвенной микробиологии.
Кислотность почв оценивали потенциометрическим методом, механический состав определяли
методом Рутковского, активность радионуклидов – методом полупроводниковой гаммаспектрометрии.
Оценка всего массива полученных данных с помощью регрессионного анализа показала,
что каталазная и уреазная активности почв чувствительны к действию 137Cs и эти показатели
можно использовать при проведении биологического мониторинга территорий, загрязненных
данным радионуклидом. На изменения дегидрогеназной, уреазной и каталазной активностей
негативное влияние оказывает кислотность почв, т.е. смещение рН почв в щелочную область
вызывает снижение активности ферментов. Учет численности микроорганизмов методом
комочков обрастания показал, что в 35% точек пробоотбора в районе хранилища РАО бактерий
рода Azotobacter не обнаружено. В 32% точек пробоотбора количество бактерий рода
Azotobacter на 40% ниже, чем в контроле.
Результаты расчета КОЕ в почвенных образцах, отобранных на территории хранилища
РАО обнаружили, что в 90% точек пробоотбора КОЕ на 80% ниже, чем в контроле.
Статистическая обработка данных позволяет утверждать, что численность почвенных
микроорганизмов может быть использована в качестве информативного показателя при
проведении биологического мониторинга территорий, загрязненных 137Cs. Достоверного
(a≤0,05) влияния механического состава, активности226Ra и 232Th на численность
микроорганизмов не выявлено.
Научно-исследовательская работа выполнена в рамкахреализации ФЦП «Научные и
научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
УЛЬТРАСТРУКТУРА И ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ
СООТНОШЕНИЯ У КЛЕТОК УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИИ
CHRYSEOBACTERIUM SOLINCOLA, ШТАММ NF4
Поливцева В.Н., Сузина Н.Е., Шорохова А.П., Абашина Т.Н., Дуда В.И.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино (Россия)
Методом морфометрического анализа электронно-микроскопических изображений
получены данные об ультраструктруной организации и ядерно-цитоплазматических
соотношениях у клеток новой грамотрицательной ультрамикробактерии – Chryseobacterium
solincola, штамм NF4 (1, 2). Клетки штамма NF4 представлены ультрамелкими коккоидными
клетками и короткими палочками с размерами от 0.2 до 0.4 мкм в поперечнике и от 0.2 до 0.5
мкм в длину; их объем составляет в среднем от 0.004 до 0.04 мкм3; среди них значительную
часть (30 – 60%) занимают делящиеся наноформы – крайне мелкие клетки с диаметром 180 –
300 нм и объемом 0.004 – 0.02 мкм3. Клетки штамма NF4 – грамотрицательные, обладают
хорошо выраженной наружной мембраной в клеточной стенке, неподвижные, не обладают
жгутиками и скользящей подвижностью, размножаются делением с помощью перетяжки,
почкованием и множественной септацией удлинённых клеток. Множественность путей
репродукции обусловливает большой полиморфизм клеток.
Установлено, что: а) в цикле развития ультрамикробактерий (УМБ) морфология клеток
изменяется от палочковидной к сферической. При этом размер клеток в стационарных
культурах уменьшается в 2 – 3 раза; б) электронно морфометрический анализ показал, что
клеткам лаг-фазных, частично лог-фазных и экспоненциально развивающихся культур
свойственна полиэнергидность (многонуклеоидность). Для палочковидных клеток характерно
наличие крупных нуклеоидов объёмом ~ 0,1 мкм3, а для самых мелких сферических клеток (d ~
0,3 мкм) всего 0,002 мкм3. Эти мельчайшие нуклеоиды были нами отнесены к «элементарным»
30
Биология и экология микроорганизмов
нуклеоидам, штаммва NF4, содержащим хромосомную ДНК, соответствующую по нашим
данным размеру генома ~ 1,7 Mbp. При этом следует учесть, что клетки изученных УМБ не
содержат плазмид. Полученные данные позволяют решить вопрос о монохромосомности
элементарных нуклеоидов; в) впервые электронная морфометрия позволила охарактеризовать
ядерно-цитоплазматические соотношения в клетках свободноживущих сапротрофных УМБ.
Коэффициент соотношений колеблется от 1:1 до 1: 5 с преобладанием цитоплазматического
компонента.
Выполненные исследования позволили углубить представления о биологии
свободноживущих сапротрофных УМБ.
METHYLOLIGELLA GEN.NOV. – НОВЫЙ РОД АЭРОБНЫХ
ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ
ЭКТОИНА И ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА
Порошина М.Н.1, Капаруллина Е.Н.2
1
Пущинский государственный естественно-научный институт; 2Федеральное
государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино (Россия)
poroshinam@rambler.ru
Аэробные метилобактерии засолённых мест обитания мало исследованы. Выделение новых
штаммов важно для расширения представления о таксономическом биоразнообразии
метилобактерий, исследования механизмов их галотолерантности и биотехнологического
потенциала.
Цель работы - таксономическая и физиолого – биохимическая характеристика новых
изолятов метилобактерий – галотолерантных штаммов С2 (техногенный биотоп, г. Соликамск)
и SK12 (почва Троицкого заказника Челябинской области) и анализ синтезируемых ими
осмопротекторов и запасных веществ.
Выделенные метилобактерии являются облигатными метилотрофами, мезофилами,
нейтрофилами, умеренными галофилами, т.к. растут при 0 – 16% NaCl, но оптимально - при 3 –
4%NaCl. Реализуют ицл- - сериновый путь С1 – метаболизма. Методами полифазной
таксономии, включая секвенирование генов 16S рРНК, mxaF, ДНК – ДНК – гибридизацию,
идентифицированы как представители двух разных видов нового рода Methyloligella gen.nov.,
M. halotolerans C2 ВКМ B – 2706T (= CCUG 61687T = DSM 25045T) и M. solikamskii SK 12 ВКМ
B-2707T (=CCUG 61697T = DSM 25212T).
Показано, что новые метилобактерии представляют интерес для биотехнологии, т.к. при
повышении солёности среды синтезируют из метанола ценный биопротектор эктоин, а при
культивировании в лимите по азоту – биодеградабельный и биосовместимый пластик –
полигидроксибутират (ПГБ). Для получения ПГБ проводили двухстадийное культивирование
штамма С2 на минеральной среде с метанолом в аппаратах АНКУМ-2М (10 л). На первой
стадии создавали условия для получения большого количества биомассы. На второй стадии
создавали лимит по азоту и фосфору, вследствие чего продуцент усиленно синтезировал
полигидроксибутират (ПГБ). Содержание полимера составило 20% от веса сухой биомассы.
Обнаружено, что биополимер, синтезируемый M. halotolerans C2, имеет молекулярную
массу 900 кДа, плёнка из него эластичная и получила высокую оценку при испытаниях в
сердечно – сосудистой хирургии (НИИ Комплексных проблем сердечно-сосудистых
заболеваний СО РАМН, г. Кемерово).
За рубежом налажено производство биопластиков и эктоина на основе микроорганизмов,
растущих на углеводах, прежде всего на глюкозе. Для нашей страны перспективна разработка
биотехнологии получения ПГБ и эктоина на основе метилотрофных продуцентов,
использующих дешёвый метанол-сырец.
Работа выполнена при поддержке ГК 14. 740. 11. 0111.
31
Биология и экология микроорганизмов
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ БАКТЕРИЙ РОДА AGREIA (СЕМЕЙСТВО
MICROBACTERIACEAE)
1
Присяжная Н.В. , Дорофеева Л.В.1, Евтушенко Л.И.1, Лебедев А.Т.2
1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ВКМ
Пущино (Россия); 2МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва (Россия)
labyrinth@land.ru
Для идентификации и классификации бактерий на видовом уровне в настоящее время
используются различные генотипические и фенотипические характеристики организмов.
Относительно новый метод масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной
десорбцией/ионизацией (МАЛДИ) бактериальных клеток находит все более широкое
применение в таксономии, в том числе, при описании новых видов. Пики на масс-спектрах
(диапазон масс 2000-20000 m/z), соответствующие бактериальным пептидам и белкам, в том
числе рибосомальным, используются в качестве хемотаксономических признаков.
С применением метода МАЛДИ масс-спектрометрии нами были изучены 7 штаммов рода
Agreia, выделенные из растительного материала, включая типовые штаммы двух известных
видов (A. bicolorata и A. pratensis). Штаммы для анализа выращивали на соевом агаре (Difco) и
R2A (Difco).
Кластерный анализ с использованием программы BioTyper 2.0 (Bruker Daltonics) показал,
что 3 штамма попадают в один кластер вместе с типовым штаммом A. bicolorata ВКМ Ac1804T. Два других штамма (ВКМ Ac-2052, изолированный из галла, индуцированного
нематодой Heteroanguina graminophila на стебле вейника, и ВКМ Ac-1783 из галла,
индуцированного Anguina agropiry на пырее) четко обособлялись от известных видов. Спектры
штаммов, выращенных на двух разных средах, имели ряд отличий, однако их группировка и
положение на дендрограммах оставались неизменными.
Результаты исследования, согласующиеся с данными анализа нуклеотидных
последовательностей генов 16S рРНК и ДНК-ДНК гибридизации, показывают, что эти два
штамма представляют собой новые виды рода Agreia. При сравнении масс-спектров было
обнаружено 6 пиков (4282, 4431, 5192, 5760, 7116 и 7459 m/z), присутствующих в спектрах всех
изученных штаммов. Пики 2724, 2837, 2856, 2947, 3041, 3062 и 5706 m/z, выявленные в
спектрах всех 4-х штаммов вида A. bicolorata, могут служить хемотаксономическими
маркерами этого вида.
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА АZOSPIRILLUM И КЛУБЕНЬКОВЫХ
БАКТЕРИЙ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ КСЕРОФИТНЫХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ
Расулов Б.А., Шакиров З.С.
Институт микробиологии Академии Наук Республики Узбекистан, Ташкент
zsshakirov@gmail.com
Изучение клубенькообразования, роста и развития ксерофитных бобовых растений в
пустынных полевых условиях имеет большое значение, так как борьба с опустыниванием
(восстановление и повышение плодородия пустынных почв), в основном, зависит от
эффективности азотфиксирующего симбиоза пустынных бобовых растений. В сборе
клубеньков пустынных бобовых растений, было установлено, что не все растения образовали
корневые клубеньки. Это свидетельствует о том, что пустынных почвах популяция бактерий,
образующие клубеньки в корнях бобовых растений имеют очень низкий титр, а также не
занимают широкую территорию пустынь. В связи с этим для изучения формирования бобоворизобиальной системы имеет большое значение не только активность, вирулентность и
конкурентоспособность клубеньковых бактерий, но и их «генетическая» совместимость
(штаммовая специфичность) с различными видами бобового растения – это с одной стороны. С
другой, – высокая адаптированность как растений, так и клубеньковых бактерий к определенным почвенно-климатическим условиям.
32
Биология и экология микроорганизмов
Влияния инокуляции клубеньковых бактерий на рост - развитие исследуемых бобовых
растений в пустынных полевых условиях показало, что в среднем по всем штаммам величина
прибавки биомассы надземной части растений была от 11,2% до 36%. Высокую
симбиотическую эффективность проявляли следующие штаммы клубеньковых бактерий
Rhizobium sp.: АС1-1, АС8-1 (песчаная акация Ammodendron conollyi); AV3, AV9 (кустарник
Astragalus vilossimus); AU30-1(полукустарник Astragalusunifoliolatus); OT121, OT123, OT136
(многолетние травы Onobrychistranscaucasica); OC107 (многолетние травы Onobrychis
chorasanica).
В полевых опытах по изучению влияния смешанных культур (Rhizobium + Azospirillum) на
рост и развитие ксерофитных бобовых растений в условыях пустын показано наибольшая
эффективность по биомассе (6,6-24,3%) у A.conollyi при инокуляции со смешанной культурой
по отношению к вариантам моноинокуляции. При двойной инокуляции A.vilosissimus прибавка
биомассы растений составляла от 6% до 26.1%. Аналогичные результаты получены и
дляA.unifoliolatus, биомассы надземной части растений увеличивается на 8,4%- 21,8% по
сравнению с моноинокулированными растениями. При двойной инокуляции средняя прибавка
биомассыO.transcaucasica составляла 17,2%, а для O.chorassanicа – 23,6%по сравнению с
биомассой моноинокулированных растений.
Полученные результаты указывают на тот факт, что эффект смешанных культур (Rhizobium
+ Azospirillum) азотфиксирующих микроорганизмов имеет огромное значение в обеспечении не
только урожайности бобовых культур, но и играет важную роль в азотном балансе почвы.
ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ “r” МУТАНТОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ
NOSTOC PRUNIFORME УСТОЙЧИВЫХ К ЦИАНОФАГУ NP-1T (5)
Кадырова Г.Х., Расулов Б.А.
Институт микробиологии АН РУз, Ташкент
bahtiyor.rasulov.76@mail.ru
В настоящее время наметилась перспектива использования цианобактерий как источников
биомассы и наиболее дешевых объектов для осуществления микробиологического синтеза,
включая и генную инженерию. Однако, при выращивании цианобактерий в лабораторных и в
производственных условиях одним из факторов ограничивающих их размножения и
использования является лизис специфичными для них цианофагами.
Целью наших исследований является получение фагоустойчивых клонов цианобактерий
Nostoc pruniforme под действием цианофага NP – 1T (5) и сравнительное изучение некоторых
биологических свойств “r” – мутантов и исходной культуры.
При заражении индикаторной культуры N. pruniforme цианофагамиNP-1T (5) серии в
жидкой и агаризованной среде происходит неполный лизис цианобактерий даже при высокой
множественности инфекции в условиях (1011 БОЕ/мл) благоприятных для развития системы
«цианофаг-цианобактерия». Из вторичных клонов путем отбора и рассевов отдельных нитей
получены 25 «r» клонов культуры цианобактерии устойчивых к цианофагу NP-1T (5). Частота
образования устойчивых клонов цианобактерий в пересчете на одну клетку колебалась в
пределах 4,2 - 7,3·10-8. Клетки исходной культуры и устойчивых мутантов по морфологическим
признакам не отличаются. Устойчивость к цианофагу, воздействием, которого было получено,
сохраняется в течение многих пересевов, т.е. устойчивость к данному цианофагу оказалось
наследственной. Из 25 выделенных устойчивых к цианофагу NP-1T(5) “r”-мутантов
цианобактерий, 21 не адсорбировали соответствующего штамма цианофага в пределах 1,5 - 2
часов. У остальных 4-х “r”-мутантов было обнаружено адсорбирование данного цианофага NP1T(5). Результаты испытания на лизогению 4-х “r”-мутантов (NP-1T(5)-2,NP-1T(5)-5, NP-1T(5)20, NP-1T(5)-25) показали, что при культивировании устойчивых клонов в обычных опытных
условиях, т.е. при температуре 29°С не в одном случае не обнаружено появление свободного
цианофага в культуральной жидкости. Однако установлено, что при культивирования
фагоустойчивых мутантов, после воздействия высокой температуры (41–42°С) в течение
одного часа у 4-х “r”-мутантов обнаружено появление цианофагов в культуральной жидкости,
лизирующие исходную культуру N. pruniforme.
33
Биология и экология микроорганизмов
МИКРОБНЫЙ ПЕЙЗАЖ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ ЛЮДЕЙ С
ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА
Ривис О.Ю., Кривцова М.В., Николайчук В.И.
ГВУЗ «Ужгородский национальный университет», Ужгород (Украина)
riviso@ukr.net
Микрофлора полости рта представляет собой сложный микробиоценоз, в котором тесно
сосуществуют аэробы и анаэробы, грамотрицательные, грамположительные бактерии, вирусы,
грибы, простейшие. Изменение качественного и количественного состава микроорганизмов
приводит к нарушению эубиоза ротовой полости, снижению численности облигатной
микрофлоры, увеличению количества условно-патогенной микрофлоры и повышению уровня
микробной интоксикации. Дисбиозы полости рта во многих случаях являются причиной
развития заболеваний пародонта, кариеса и их осложнений, что приводит к полной потере
зубов.
Закарпатье относится к климато-географической зоне с низким уровнем фтора и йода в
окружающей среде и «очень высоким», по критерию ВОЗ, уровнем интенсивности
стоматологических заболеваний, связанных с дефицитом суточного поступления в организм
этих микроэлементов.
Целью наших исследований было изучение микробного пейзажа полости рта (ПР) у людей
с заболеванием тканей пародонта, в частности аэробной флоры.
Проведено исследование микрофлоры ПР 35 пациентов в возрасте от 35 до 75 лет с разной
степенью заболеваемости тканей пародонта. Забор зубного налета для исследования
производился стерильным экскаватором из ротовой полости (парадонтального кармана).
Биологический материал засевали немедленно (в течении двух часов) с момента взятия на
дифференциально-диагностические среды: агар с кровью (КА), желточно-солевой агар (ЖСА),
среду Сабуро и Лакто-агар. В основу идентификации микроорганизмов положены данные
классификации, изложенные в 9-м издании определителя Bergey.
Результаты исследования показали, что наиболее часто из ротовой полости
(парадонтального кармана) изолировали Streptococcus sp. («зеленящие» стрептококки) − 40% и
Neisseria sp. − 37%. Также были выделены патогенные стрептококки, в частности S. pyogenes –
2%.
Род стафилококков был представлен двумя видами: S. epidermidis − 23% и S. aureus − 14%.
В 20% случаев были обнаружены представители рода Lactobacillus, которые являются
представителями облигатной микрофлоры полости рта.
В результате исследований были выделены энтеробактерии (Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter aerogenes) − 8%, которые являются временными представителями микрофлоры
полости рта, однако при нарушении физиологического состояния полости рта представители
транзиторной флоры могут задерживаться в ней и размножаться, вызывая гнойные процессы.
Таким образом, в случаях появления в полости рта условно-патогенных микроорганизмов,
а также снижение численности представителей облигатной микрофлоры, можно сделать вывод
о нарушении эубиоза ротовой полости, что требует дальнейшего лечения или коррекции.
СКРИНИНГ МИКРООРГАНИЗМОВ, СПОСОБНЫХ К ДЕСТРУКЦИИ
ХЛОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
Сабиров А.А., Коршунову Т.Ю., Логинов О.Н.
Уфимская государственная академия экономики и сервиса; Федеральное
государственное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра
РАН, Уфа (Россия)
alfirsabirov@mail.ru
34
Биология и экология микроорганизмов
Хлорорганические соединения широко применяют в качестве гербицидов, инсектицидов,
акарицидов и фунгицидов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур. Обладая
высокой химической стойкостью, эти вещества накапливаются в гидробионтах и почве и
передаются по пищевой цепи, увеличивая свою концентрацию примерно на порядок в каждом
последующем звене. В связи свыше сказанным, утилизация хлорорганических соединений
является актуальной задачей.
Целью настоящей работы являлся поиск и выделение микроорганизмов, способных
разлагать хлорсодержащие производные углеводородов, с перспективой их дальнейшего
использования для биоремедиации окружающей среды.
Выделение штаммов-деструкторов из образцов техногенно загрязненной почвы
осуществлялось методом накопительных культур. Навески почвы помещали в колбы со 100 мл
питательной среды Раймонда без пептона, добавив 1 мл хлорорганического соединения в
качестве единственного источника углерода. Культивирование проводили при температуре
30°С в круговой качалке со скоростью вращения 160 об/мин. Определение титра клеток в
инокуляте проводили путем нанесения культуральной жидкости на агаризованную мясопептонную среду для получения изолированных колоний с дальнейшим подсчетом их числа.
Далее инокулят высевали на твердую питательную среду Раймонда без пептона, используя в
качестве единственного источника углерода соответствующее хлорпроизводное.
В качестве субстрата использовали бутил хлористый. Рост титра составил два порядка. В
дальнейшем планируются работы по использованию выделенных штаммов микроорганизмов
для утилизации иных хлорсодержащих субстратов.
«ЭФФЕКТ ПАМЯТИ» БАКТЕРИАЛЬНОЙ БИОПЛЕНКИ PSEUDOMONAS
AERUGINOSA
1
Сайко А.Р. , Балко О.И.2, Авдеева Л.В.2, Балко А.Б.2
1
Национальный университет пищевых технологий; 2Институт микробиологии и
вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины
sayko.nastya@mail.ru
Микроорганизмы во внешней среде отдают предпочтение существованию в составе
биопленки. Одними из модельных объектов для изучения биопленкообразования являются
Pseudomonas aeruginosa. Считается, что полученные с использованием этих объектов
результаты можно экстраполировать на другие, менее изученные микроорганизмы. Понимание
тонких механизмов образования биопленки необходимо для получения инструментов
регулирования активности этого процесса в природных и искусственных условиях.
Целью нашей работы было изучение особенностей формирования биопленки Pseudomonas
aeruginosa на разных питательных средах.
Исследование биопленкообразования проводили на модели коллекционных штаммов
Pseudomonas aeruginosa УКМ В-1, УКМ В-12 и УКМ В-900 в стационарной системе на стекле в
минимальной среде Козера с 0,1% и 5% глюкозы. Для этого в бюксы с покровными стеклами
вносили бактериальные суспензии титром 2×107 КОЕ/мл и культивировали при 37ºС до 21
суток. Каждые сутки определяли процент покрытия стекол биопленкой, количество
жизнеспособных микроорганизмов в ее составе, а также титр бактерий в планктонной форме.
Было показано, что при культивировании в среде с 0,1% глюкозы у всех использованных
штаммов P. aeruginosa наблюдалась однотипная динамика биопленкообразования. Несмотря на
относительно небольшое количество образованной биопленки, титр микроорганизмов в
планктонной и биопленочной форме поддерживался на стабильно высоком уровне –
соответственно 2-7×107 КУО/мл и 1×105 - 3×106 КУО/мл в течении длительного периода.
Клетки в планктонной форме выявлялись в суспензии вплоть до 15 суток наблюдения, а в
смыве из 16-ти суточной биопленки количество жизнеспособных микроорганизмов составляло
3×103 КУО/мл. Культивирование при оптимальных условиях в МПБ показало, что каждому
штамму характерны свои особенности биопленкообразования. При этом, показатели
выживания микроорганизмов в планктонной форме являлись стабильными, тогда как в составе
биопленки – существенно колебались. Наблюдение за P. aeruginosa в среде Козера с 5%
35
Биология и экология микроорганизмов
глюкозы показало, что до 3-4-х суток биопленкообразование соответствовало такому при
оптимальных условиях, тогда как после этого регистрировалась динамика, характерная для
голодающей культуры.
Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности биопленки P. aeruginosa в
поддержании стабильности микробной популяции. Биопленкообразованию характерен «эффект
памяти», который, очевидно, заложен на генетическом уровне и проявляется в зависимости от
условий культивирования микроорганизмов.
ИЗУЧЕНИЕ МОДИФИЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИФЕНОЛОВ
РАСТЕНИЙ НА АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ БАКТЕРИЙ
ESCHERICHIA COLI
Самойлова З.Ю., Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н.
ФГБУ Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН
samzu@mail.ru
Результаты последних исследований бактериальной антибиотикоустойчивости указывают
на наличие неспецифических механизмов токсического действия антибиотиков, в основе
которых лежат реакции, характерные для окислительного стресса. В связи с этим, актуально
изучение действия противомикробных препаратов в присутствие редокс-активных веществ,
способных в зависимости от ряда факторов усиливать или ослаблять действие антибиотиков. С
этой точки зрения, наиболее актуально исследование модифицирующего влияния растительных
полифенолов, которые обладают про- и антиоксидантной активностью и входят в состав
продуктов питания, фармпрепаратов и косметических средств.
Бактерии Escherichia coli являются, с одной стороны, представителями нормальной
микрофлоры человека и животных, а с другой, хорошо изученным в генетическом и
биохимическом отношении объектом, что позволяет использовать штаммы E. coli как
относительно простые тест-системы для оценки модифицирующего влияния полифенолов
растений на чувствительность бактерий к антибиотикам.
Нами было изучено действие семи полифенолов на величину МИК ципрофлоксацина,
канамицина, хлорамфеникола, рифампицина и ампициллина в культурах E. coli AB1157.
Установлено, что только кверцетин и таннин оказывали протективное действие против
ципрофлоксацина, повышая значение МИК. Измерение удельной скорости роста в культурах E.
coli NM23 и QC772, обработанных ципрофлоксацином, показало, что также как и в тесте на
определение МИК, кверцетин и таннин, оказывали выраженное протективное действие. Наши
данные позволяют предположить, что некоторые полифенолы, являясь компонентами многих
продуктов питания и лекарственных средств, могут взаимодействовать с антибиотиками,
назначаемыми при лечении, модифицируя их действие.
Работа поддержана грантами Президента РФ МК1763.2012.4, РФФИ-Урал № 10-04-96017,
а также грантом Президиума УрО РАН для молодых ученых 11-4-ИП-181.
ДИССИМИЛЯЦИОННАЯ НИТРАТРЕДУКЦИЯ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА
THIOTHRIX
1
Сапельцева Ю.О. , Юревич Л.И.2, Трубицын И.В.1, Андреевских Ж.Г.1
1
Воронежский государственный университет; 2ИБФМ РАН
tru.ivan@mail.ru
Для представителей рода Thiothrix способность к диссимиляционной нитратредукции ранее
не была показана. Однако наши исследования указывают на возможность данного процесса у
подавляющего большинства представителей данного рода. Этот процесс имеет глубокий
экологический адаптационный смысл - местообитание нитчатых бесцветных серобактерий рода
Thiothrixхарактеризуется регулярным суточным ритмом смены аэробно-анаэробного режима в
приливно-отливной зоне литорали или в протоке воды с высоким содержанием сульфида.
36
Биология и экология микроорганизмов
Нами был изучен процесс анаэробного роста с использованием нитрата в качестве
терминального акцептора электронов в ЭТЦ у членов двух групп рода Thiothrix: из группы
«Eikelboom type 021N» - T. eikelboomii АР3Т АТСС 49788 и из группы «T. nivea» - T. unzii
A1ТATCC 49747, Thiothrix sp. AS и T. lacustris BLТ DSM 21227. Установлено, что у всех
изучаемых организмов имеет место процесс восстановления NO3- до NO2-. Процесс
дальнейшего восстановления нитритов до аммония или до газообразных продуктов пока не
ясен. Показано, что у изучаемых организмов процесс восстановления нитрата сопряжен с
окислением восстановленных соединений серы, в частности, при окислении тиосульфата
образуются сульфаты и элементная сера, которая откладывается внутри клеток.
У Thiothrix sp. штамм G1, T. unzii, T. eikelboomii, T. lacustris штамм BL выявлен ген альфасубъединицы мембраносвязаной нитратредуктазы narG, определены нуклеотидные
последовательности. При сравнении полученных фрагментов гена между собой степень
гомологии составила 86,2%. Так же у всех вышеперечисленных организмов по гену narG
показана высокая степень гомологии с другими прокариотами, способными к
диссимиляционной нитратредукции (74-77%).
В ходе выполнения работы у видов T. unzii, T. eikelboomii, T.lacustris BL и Thiothrix sp. AS
измерена суммарная активность нитратредуктаз при аэробном и анаэробном культивировании.
При анаэробном культивировании активность нитратредуктаз возрастает в 2-5 раз (208% у T.
eikelboomii, 539% у T. unzii, 353% у Thiothrix sp. AS и 347% у T. lacustris BL).
Полученные данные наглядно демонстрируют, что у ряда представителей Thiothrix процесс
дыхания на нитратах активно используется при росте в анаэробных условиях.
ВЫДЕЛЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА МИКРОВОДОРОСЛЕЙ И
ЦИАНОБАКТЕРИЙ УЗБЕКИСТАНА
Сафаров И.В., Кадырова Г.Х., Шакиров З.С.
Институт микробиологии Академии наук Республики Узбекистан, Ташкент
ilhom.safarov.76@mail.ru
Одноклеточные зеленые микроводоросли и цианобактерии могут быть самыми
подходящими объектами для получения биодизеля. В процессе фотосинтеза – ключевого
биопроцесса для растений, водорослей и ряда бактерий, энергия солнца перерабатывается в
«химическую энергию». Помимо этого, микроводоросли и цианобактерии умудряются
аккумулировать в качестве запаса энергии и материала для строения клеточных компонентов
различные липиды, масла и жирные кислоты, при этом их содержание колеблется у разных
видов микроводорослей в пределах от 2% до 80% от общего сухого веса.
Целью данных исследований является поиск и скрининг новых активных местных
штаммов микроводорослей и цианобактерий, которые являются высокопродуктивными по
образованию липидов и масла.
Нами было выделено около 80 изолятов микроводорослей из водных и почвеннқх образцов
Кашкадарьинской и Наманганской областей Узбекистана. Для получения накопительной
культуры микроводорослей использовали жидкие среды «Прата» «Тамия», «Чу-10», «Громова»
и «BG-11». Для оценки активности микроводорослей на первом этапе необходимо иметь
альгологически чистые формы. Поэтому следует отдавать предпочтение штаммам водорослей,
выделенным из одной клетки. Сравнительно-физиологическая оценка различных
микроводорослей и предварительный отбор наиболее активных форм проводилась в два
последовательных этапа: по скорости роста колоний и по сухой биомассе. Установлено, что
среда «Тамия» и «BG-11» имеет ряд преимуществ перед средами «Чу-10», «Прата» и
«Громова», так как не образуют осадка и обладают заданным величиной рН, равной 7,4,
близкой оптимальной для роста микроводорослей. В среде «Тамия» различные изоляты
микроводорослей проявили высокую адаптивность (по накоплению биомассы). Наличие в
среде макро- и микроэлементов, являющихся необходимыми компонентами тела водорослей,
имеет решающее значение для интенсивности их развития.
Таким образом, альгологически очищены 20 культур цианобактерий и 40 культур
одноклеточных зеленых водорослей Узбекистана высокопродуктивных по образованию
37
Биология и экология микроорганизмов
биомассы. Исследуемые штаммы микроводорослей и цианобактерий были отнесены к родам:
Chlorella, Ankistrodesmus, Scenedesmus и Nostoc, Anabaena, Synechococcus.
АНАЛИЗ ВОЗРАСТНОЙ ДИНАМИКИ МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
E. COLI «БАКТЕРИЯ-ФАГ-ПЛАЗМИДА» КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА
СВИНЕЙ
Скобликов Н.Э., Зимин А.А.
Северо-Кавказский НИИ животноводства, Краснодар (Россия)
skoblikow@yandex.ru
Несмотря на множество работ, посвящённых микробной экологии различных биотопов,
объектом их изучения, как правило, является либо только бактериальный, либо фаговый
сегменты микробиоценоза.
В результате изучения нами возрастной динамики популяционного состава E.coli в
кишечном микробиоценозе свиней, а также её микроэкологического окружения (коли-фагов и
плазмид), сделаны выводы, характеризующие возрастную динамику системы E.coli «бактерияфаг-плазмида» кишечного микробиоценоза свиней.
Так, установлено, что ни один штамм E. coli не обнаруживался повторно у одного у того же
животного во все периоды отбора материала, что свидетельствует о постоянном замещении
биоваров E. coli кишечного микробиоценоза в онтогенезе; аналогичная картина наблюдалась и
в отношении коли-фагов. Возрастные динамики титров E.coli и коли-фагов обладали
определённой специфичностью и корреляцией. Возрастное разнообразие коли-фагов также
коррелировало с разнообразием популяции E. coli. Большая часть выделенных фагов имела
генетические маркеры принадлежности к фагам Т4-типа семейства Myoviridae.
Предложен оригинальный термин «бактэком», введение которого в оборот позволит точнее
определить элементарные структурно-функциональные единицы микробиоценоза.
«Бактэком (bactecome) – это структурная единица микробиоценоза какого-либо экотопа,
включающая в себя совокупность всех популяций бактерий одного таксона, а также
специфичных к ним бактериофагов и мобильных генетических структур».
Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-96575-р_юг_ц.
ФАКТОРЫ, СПОСОБСТВУЮЩИЕ ПЕРЕХОДУ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM
BRASILENSE В СОСТОЯНИЕ ПОКОЯ
Славкина Е.А.2, Кушнерук М.А.1, Старичкова Н.И.2, Антонюк Л.П.1
1
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН; 2Саратовский
государственный университет им. Н.Г. Чернышеского, Саратов (Россия)
lizka-08@yandex.ru
Бактерии рода Azospirillum являются природными симбионтами высших растений, в том
числе злаковых. В естественных условиях эти бактерии имеют две фазы жизненного цикла:
фазу активной жизнедеятельности, совпадающую с вегетацией растения-хозяина, и фазу покоя.
Известно, что небольшое количество покоящихся клеток азоспириллы переживает зимний
период под оболочками зерновки растения-хозяина. Азоспириллы –неспорообразующие
бактерии, и особенности их переживания (персистенции) зимних условий остаются
малоизученными. Задачей данной работы было выявление факторов, блокирующих рост A.
brasilense и способствующих переходу бактерии в состояние покоя.
В работе использовали два штамма, A. brasilense SR75 и Sp245. Бактерии пересевали на
среды, неблагоприятные для роста и/или близкие по трофическому статусу к условиям
зерновки. Стартовая плотность культур 107 кл./мл. Контрольный вариант выращивали на
синтетической малатной среде (СМС). Стрессированные варианты включали персистенцию на
СМС, содержащей гексилрезорцин и СuSO4, а также на физрастворе и фосфатно-солевом
буфере. Состояние культур оценивали методом КОЕ (колониеобразующих единиц).
38
Биология и экология микроорганизмов
Оценка жизнеспособности бактерий, персистирующих на физрастворе и фосфатно-солевом
буфере, показала очень высокую жизнеспособность азоспирилл, до 105 КОЕ/мл у полугодовых
культур. Через три месяца при высеве на твердую питательную среду азоспириллы имели
типичную для A. brasilense морфологию колоний, а через полгода хранения жидких культур в
тесте КОЕ наблюдали фенотипическую диссоциацию. Присутствие в оптимальной среде двух
токсикантов (гексилрезорцина и ионов меди) приводило к падению жизнеспособности
бактерий: на чашке наблюдали отсутствие роста или единичные колонии с выраженной
фенотипической диссоциацией.
Таким образом, A. brasilense SR75 и Sp245 хорошо адаптируются к острому дефициту
питательных веществ, в то время как добавление к оптимальной среде роста гексилрезорцина
(0,2 мМ) и меди (0,4 мМ) приводит к почти полному подавлению жизнеспособности бактерий.
Изученные стрессовые факторы индуцируют у азоспирилл фенотипическую диссоциацию, что
расширяет их адаптационные возможности и облегчает выживание бактерий в
неблагоприятных условиях.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ
РОДА LISTERIA И ПАТОГЕННОГО ВИДА LISTERIA MONOCYTOGENES
Стародумова С.М., Зайцева Е.А.
ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» СО
РАМН; ГБОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет»
starodumova@gmail.com
В современной лабораторной диагностике листериоза особое место занимает полимеразная
цепная реакция (ПЦР), существенно ускоряющая процесс идентификации L. monocytogenes по
сравнению с бактериологическим выделением. Современные коммерческие ПЦР тест-системы
специфичны в отношении L.monocytogenes и не позволяют выявить другие виды листерий. В то
же время существует объективная необходимость в создании тест-систем, позволяющих на
начальных этапах исследования выявлять другие виды листерий c одновременной
идентификацией патогенного вида L. monocytogenes.
Цель работы – создать ПЦР тест-систему для выявления бактерий рода Listeria и
патогенного вида L.monocytogenes в одной реакции.
С помощью программы Oligo38 были сконструированы две пары праймеров (prs1-prs2 и
plc1-plc2), позволяющие одновременно амплифицировать фрагменты гена prs, кодирующего
родоспецифический белок листерий – фосфорибозилпирофосфатсинтазу, и plcA, кодирующего
видоспецифический белок L.monocytogenes – фосфолипазу С. Было установлено, что
амплификация ДНК контрольного штамма L.monocytogenes (EGD) с указанными праймерами
приводит к образованию двух фрагментов длиной 211 п.н. и 476 п.н., что согласуется с
теоретически рассчитанными длинами фрагментов амплифицируемых участков генов prs и
plcA соответственно. Амплификация ДНК штаммов других видов листерий (L. innocua, L.
ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayi) с теми же парами праймеров приводит к
образованию лишь одного фрагмента длиной 211 п.н., соответствующего участку гена prs.
Специфичность мультиплексной ПЦР-системы была апробирована на культурах листерий
(n=117), выделенных из разнообразных продуктов питания и органов мышевидных грызунов.
Первоначально
все
исследуемые
культуры
листерий
были дифференцированы
микробиологическим методом, который показал, что 38 культур принадлежат к виду
L.monocytogenes, а 79 – относятся к другим видам бактерий рода Listeria. При помощи
мультиплексной ПЦР с указанными парами праймеров, а также тест-системы «ЛИСТЕР»
(«Интерлабсервис»), мы подтвердили результаты, полученные микробиологическим методом.
По результатами мультиплексной ПЦР 38 культур листерий были отнесены к виду L.
monocytogenes, а остальные 79 – к Listeria spp.
Таким образом, данная мультиплексная ПЦР-система позволяет сравнительно быстро (за 3
часа) провести скрининг подозрительных на листерии колоний и одновременно
идентифицировать патогенный вид L. monocytogenes в исследуемых образцах.
39
Биология и экология микроорганизмов
ДЕТЕКЦИЯ ПРОПЕПТИДОВ ЭНДОПЕПТИДАЗ AlpA И AlpB В КЛЕТОЧНЫХ
ФРАКЦИЯХ LYSOBACTER SP. МЕТОДОМ «СЭНДВИЧ»-ИФА
Сухаричева Н.А.1,2, Цфасман И.М.3, Красовская Л.А.3, Степная О.А.3, Руденко
Н.В.2
1
2
ПущГЕНИ; ФИБХ РАН; 3ИБФМ РАН, Пущино (Россия)
natasha-sukharicheva@yandex.ru
Бактериолитические ферменты необходимы для жизнедеятельности и взаимодействия
организмов в природных экосистемах. Известно, что Lysobacter sp. XL1 в числе других
литических ферментов секретирует эндопептидазы AlpA и AlpB, синтезирующиеся в виде
гомологичных предшественников (препробелков), однако, по-разному секретирующихся
(эндопептидаза AlpB, в отличие от AlpA, попадает во внешнюю среду посредством
внешнемембранных везикул).
Для исследования локализации пропептидов и пропептид-содержаших предшественников в
различных компартментах бактериальной клетки были получены два моноклональных антитела
(МА) против пропептида AlpA (ProA) и двенадцать МА против пропептида AlpB (ProB), не
обладающих иммуноперекрестной реактивностью с нативными зрелыми формами AlpА и AlpВ
и соответствующими пропептидами. На основе полученной панели МА были разработаны тестсистемы для определения концентрации ProB и ProA. Для установления детектирующих «пар»
МА, т.е., антител взаимодействующих с антигеном и, не препятствущих друг другу, которые
можно использовать в формате твердофазного «сэндвич»-ИФА, были проверены все
возможные сочетания МА друг с другом, где каждое из них было использовано в качестве
антитела «захвата» и в качестве антитела детекции. С этой целью, каждое моноклональное
антитело было помечено биотином, эти антитела использовались в качестве детектирующих.
Использование биотиновой метки позволило амплифицировать и идентифицировать сигнал с
помощью стрептавидина, меченного пероксидазой хрена.
В результате были разработаны «сэндвич»-ИФА для определения ProB с минимальным
пределом детекции – 0,2 нг/мл и для ProA – 1,5 нг/мл. В результате анализа клеточных фракций
Lysobacter sp. XL1 было показано накопление пропептидов в периплазме.
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА НА КУЛЬТУРУ БАКТЕРИЙ
PSEUDOMONAS FLUORESCENS И ПРОДУЦИРОВАНИЕ МЕТАБОЛИТОВ
Сухушина А.О., Минаева О.М.
Национальный исследовательский Томский государственный университет, Томск
(Россия)
sao_2042@mail.ru
В настоящее время всё возрастающее внимание во всем мире уделяется перспективам
развития нанотехнологий. При этом на первый план выходят проблемы, связанные с изучением
положительного и отрицательного влияния наноматериалов на биологические объекты.
Наноматериалы оказывают отрицательное влияние, которое связано с их повреждающим
действием, оказываемым на клеточные мембраны и органеллы, усилением транспорта
потенциально токсичных компонентов через барьеры организма, а также возможной
генотоксичностью и аллергезтрующим действием. Их токсичность обусловлена, развитием
окислительного стресса и повреждением ДНК, что может приводить к развитию
воспалительной реакции, апоптозу и некрозу клети.
Наиболее широко используемым в настоящее время, как в чистом виде, так и в составе
наноматериалов является диоксид титана. Предварительные исследования показали, что
добавление диоксида титана в микробную культуру при ее культивировании может
способствовать улучшению качества биопрепарата.
В работе было показано влияние наночастиц диоксида титана на численность бактерий
Pseudomonas fluorescens ВКМ АР-33 и скорость потребления глюкозы, выступающей в
качестве единственного источника энергии в среде для культивирования. Кроме того, изучено
влияние наночастиц на биологическую активность данных бактерий.
40
Биология и экология микроорганизмов
Экспериментально установлено, что скорости потребления глюкозы при выращивании
бактерий с добавлением наночастиц диоксида титана и без незначительно различаются между
собой. При этом численности бактериальных клеток по окончании эксперимента в вариантах с
наночастицами оказались значительно выше контрольных (более чем на 2 порядка). Учитывая,
что скорости потребления глюкозы в контрольных и опытных вариантах различаются
незначительно, то увеличение бактериальной численности, по всей видимости, связано с
изменением экономического коэффициента, то есть выхода биомассы на 1 г потребленного
субстрата, что на уровне гипотезы может свидетельствовать о возникновении более
эффективного метаболического пути усвоения глюкозы бактериальными клетками или о
частичном окислении глюкозы до более энергетически эффективного для бактерий субстрата.
Выявлено, что наличие наночастиц диоксида титана в среде для культивирования бактерий
P. fluorescens Р-33 не влияет на их фунгистатическую активность по отношению к
возбудителям семенных инфекций пшеницы. Показано, что наличие наночастиц диоксида
титана в среде для культивирования бактерий способствует усилению их ростостимулирующей
активности по отношению к бактеризованным проросткам пшеницы на 4,2–39,1%.
КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО
ГРИБА FLAMMULINA VELUTIPES (CURTIS) SINGER НА АГАРИЗОВАННЫХ
СРЕДАХ РАЗНОГО СОСТАВА
Танасийчук Б.В.1, Карпов А.В.1, Михайлова О.Б.1,2
1
Национальный университет пищевых технологий; 2Институт ботаники им. Н.Г.
Холодного НАНУ, Киев (Украина)
dana.zanichkovska@gmail.com
С опенка зимнего получен ряд веществ, которые проявляют противоопухолевую
активность. Механизмы их действия заключается в: 1. активации специфического
противоопухолевого клеточного иммунитета; 2. блокировании увеличения кровеносной
системы опухоли; 3. восстановление нормальной запрограммированной гибели раковой клетки
- апоптозу.
Нами было проведено выделение штаммов 2073, 2074, 2075, 2076 гриба F. velutipes в
чистую культуру. Плодовые тела собранны в период их массового появления - в начале
октября, на территории Украины, а именно в Донецке. Штамм 1994 выделен из плодовых тел,
привезенных из Японии, который промышленно культивируется.
Проведенное исследование микроморфологии вегетативного мицелия культуры F. velutipes
с использованием световой и электронной микроскопии позволило установить наличие у
штаммов характерных для данных видов микроструктур: пряжек, конидиального
спороношения, анастомозов. Вегетативный мицелий F. velutipes представлен умеренно
разветвленными, равномерно септированными гифами шириной 1,25 - 5,0 мкм.
Для выбора оптимальной питательной среды использовали: глюкозо-пептон-дрожжевой
агар (ГПДА), сусло-агар (СА), мальц экстракт агар (МЭА), картофельно-глюкозный агар (КГА).
В результате проведенных исследований было установлено, что из всех использованных
питательных сред наиболее благоприятными для роста вегетативного мицелия оказались СА и
МЭА. Морфология колоний всех исследованных штаммов F. velutipes на различных средах при
температурах 22±1°С и 26±1°С была похожей, однако, скорость их роста отличалась. Цвет
колоний белый или светло-кремовый, мицелий плотный и густой, внешняя линия колонии
гладкая. При инкубации культур в условиях повышенной температуры (32±0,1°С) наблюдалось
незначительное опушение инокулята, однако вегетативный рост возобновлялся, когда их
переносили в благоприятные условия культивирования (26±0,1°С). Температура 36±0,1°С
оказалась критической для всех исследованных штаммов F. velutipes, так как рост
вегетативного мицелия не восстанавливался при переносе в благоприятные условия и штаммы
полностью теряли свою жизнеспособность.
Проведенное комплексное исследование позволило установить, что температура,
благоприятная для вегетативного роста мицелия F. velutipes, - 26±0,1°С. Согласно полученным
41
Биология и экология микроорганизмов
значениям радиальной скорости роста исследованные штаммы F. velutipes можно отнести к
группе грибов растущих со средней скоростью роста, так как она не превышала 8,7 мм в сутки.
РАЗВИТИЕ ШТАММОВ PECTOBACTERIUM НА ТКАНИ КЛУБНЯ
УСТОЙЧИВОГО И ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО К МОКРОЙ ГНИЛИ СОРТА
КАРТОФЕЛЯ
Третьякова О.М.
Белорусский государственный университет
o.tratsiakova@yandex.ru
Картофель выращивают в 126 странах, и площадь для культивирования картофеля быстро
увеличивается, особенно в развивающихся регионах. Пектолитические бактерии, вызывающие
мокрые гнили клубней и черную ножку стеблей картофеля, относят к трем самостоятельным,
но близкородственным видам пектолитических бактерий семейства Enterobacteriaceae:
Pectobacterium atrosepticum (Pa), P. carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) и Dickeya sp.
Основным свойством упомянутых выше бактерий является способность секретировать ряд
внеклеточных деполимеризующих ферментов, служащих факторами вирулентности данных
бактерий.
Цель данной работы заключалась в исследовании динамики развития мокрой гнили при
заражении бактериями Pa и Pcc устойчивого (Дельфин) и чувствительного (Веснянка) сортов
картофеля.
В работе использовали бактерии Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 2А,
Pectobacterium atrosepticum 21А. Заражали диски ткани клубней картофеля сорта Дельфин
(устойчивый) и Веснянка (чувствительный) суспензией бактерий с множественностью около
105 клеток на диск. Через каждые три часа после заражения определяла количество
бактериальных клеток, массу мацерированной ткани дисков, пектатлиазную активность в
мацерированной ткани и индукцию PR-генов картофеля.
При заражении одним и тем же штаммом Pcc или Pa масса мацерированной ткани у
чувствительного сорта Веснянка в 3-4 раза превышала массу мацерированной ткани у
устойчивого сорта Дельфин. Кривые роста бактерий на чувствительном и устойчивом сортах
практически совпадали. Пектатлиазная активность при мацерации тканей чувствительного
сорта была в 6-7 раз выше, чем в мацерированной ткани устойчивого сорта.
Определение индукции PR-генов картофеля выявило, что экспрессия генов Pr-3 и HIN,
маркера реакции гиперчувствительности, была выше у сорта Веснянка, по сравнению с сортом
Дельфин при заражении бактериями Ра и Рсс.
Таким образом, полученные данные показывают, что определяющим фактором при
мацерации тканей клубней картофеля являются пектолитические ферменты бактерий, но в
тканях устойчивого сорта наблюдается ингибирование либо синтеза ферментов, либо
ферментативной активности. Связано ли это с индукцией PR-генов картофеля предстоит
выяснить.
ИЗМЕНЕНИЕ EH И УРОВНЯ ТИОЛОВ У БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI ПРИ
ДЕЙСТВИИ ЦИПРОФЛОКСАИНА И СТРЕПТОМИЦИНА
Ушаков В.Ю.
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
ushakovvad@yandex.ru
Ранее было показано, что в ответ на различные стрессы (температурный и осмотический
шок, голодание, действие антибиотиков и т.д.) в аэробных культурах грамположительных и
грамотрицательных бактерий наблюдаются скачки редокс-потенциала (Eh). Так, при
добавлении в среду культивирования бактерий E. coli хлорамфеникола происходило падение
Eh в область отрицательных значений. В дальнейшем было обнаружено, что наблюдаемые при
стрессах
изменения
редокс-потенциала
связаны
с
изменением
концентрации
42
Биология и экология микроорганизмов
низкомолекулярных тиолов снаружи клетки. Было показано также, что у бактерий E. coli
основной вклад в тиолы, выходящие из клетки во время стрессового воздействия, вносит
глутатион (GSH).
Целью настоящей работы было измерение уровня внеклеточных тиолов и Eh в клетках E.
coli родительского типа и мутантах по синтезу глутатиона при действии ципрофлоксацина и
стрептомицина. В экспериментах использовались генно-инженерные штаммы BW25113 (wt) и
JW 2663 (gsh-).Клетки выращивали в аэрируемой среде M9 с глюкозой (1 г/л); в процессе
культивирования производили непрерывную регистрацию Eh и парциального давления
кислорода (рО2).Добавление 0.3 мкг/мл ципрофлоксацина вызывало снижение скорости роста у
обоих исследуемых штаммов на 45%. Высокая концентрация антибиотика (3 мкг/мл) вызывала
полную остановку роста. Изменение редокс-потенциала и уровня экстраклеточных тиолов
зависело от исследуемого штамма и концентрации антибиотика. При добавлении 0.3 мкг/мл
ципрофлоксацина происходило падение Eh и повышение концентрации тиолов в среде у обоих
штаммов. Количество тиолов достоверно увеличивалось на 65% у клеток родительского типа и
на 27% у бактерий, лишенных глутатиона. Обработка 3 мкг/мл ципрофлоксацина приводила к
возрастанию уровня экстраклеточных тиолов у бактерий BW25113 на 65%. В мутантах gshвысокая доза антибиотика не вызывала изменения уровня тиолов снаружи клетки. При
добавлении антибиотика в среду культивирования парциальное давление кислорода
увеличивалось на 25% у обоих штаммов по отношению к контролю, что, вероятно, связано с
ингибированием дыхания.
Таким образом, проведенные исследования показывают, что при действии
ципрофлоксацина происходит выход тиолов из клетки как в штамме родительского типа, так и
в мутантах по глутатиону. Обработка клеток стрептомицином в описываемых условиях не
сопровождалась изменением Eh у обоих штаммов.Работа выполнена при поддержке грантов:
Президента РФ МК1763.2012.4, Президиума УрО РАН для молодых ученых 11-4-ИП-181,
«Молекулярная и клеточная биология» УрО РАН.
К ВОПРОСУ О ТОКСИНООБРАЗОВАНИИ СТАФИЛОКОККОВ,
ВЫДЕЛЕННЫХ С КОЖИ ЛИЦ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ДЕРМАТОЗАХ
Фалова О.Е.1, Ильина Е.Н.2, Боровская А.Д.2, Парфенова Т.В.2
1
Ульяновский государственный технический университет, Ульяновск (Россия); 2НИИ
физико-химической медицины, Москва (Россия)
falova@rambler.ru
Поверхность кожи тела здорового человека является естественной средой обитания для
многих микроорганизмов, в том числе рода Staphylococcus, где они персистируют, не причиняя
вред организму хозяина. При хронических дерматозах происходят изменения состава
естественных микробиоценозов - возрастает степень обсемененности некоторыми
представителями рода Staphylococcus. Известно, что основными поражающими факторами
воздействия стафилококков на эукариотические клетки и ткани являются секретируемые ими
факторы вирулентности и патогенности (токсины). Целью работы явилось исследование
вариабельности геномных комплексов стафилококков, выделенных с кожи людей при
хронических дерматозах, детерминирующих синтез энтеротоксинов A, B, C и др.
В работе использованы стандартные методы микробиологического исследования смывов с
кожи, биологических свойств микроорганизмов. Исследование геномных комплексов
производили методом ПЦР.
Исследованы смывы, полученные с кожи от больных хроническими дерматозами: псориаз,
экзема, атопический дерматит. Наиболее частыми представителями микрофлоры кожи при
хронических дерматозах являлись бактерии рода Staphylococcus. Частота их обнаружения с
пораженных участков кожи составила 82,8% от всего количества выделенных культур, с
интактных участков – 89,8%, в группе сравнения – 66,5%.
Проведенные исследования у выделенных 185 штаммов стафилококков показали наличие
генов sea, seb, sec, sed, see, seg, sei, детерминирующих образование токсинов, у 40,5%
изученных штаммов (75 клинических изолятов). Среди штаммов Staphylococcusaureus частота
43
Биология и экология микроорганизмов
встречаемости указанных генов составила 86,7%, причем среди коагулозо-отрицательных
штаммов – 13,3% случаев. Проанализированы варианты сочетаний и вариабельность набора
данных генов у изученных штаммов. Выявлено, что штаммы обладали от одного до четырех
указанных генов в различных сочетаниях. В геноме 35 изолятов обнаружен только один ген из
набора sea -sei. У 20 штаммов преобладали по два гена и у 20 – от трех до четырех генов.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о значительной вариабельности
геномных комплексов стафилококков, определяющих синтез энтеротоксинов.
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЛЬТРУЮЩИХСЯ ФОРМ МИКРООРГАНИЗМОВ В
ВОДЕ РЫБИНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА
Федотова А.В.
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва (Россия)
mikrobiomsu@list.ru
Известно, что природные пресные воды содержат существенное количество микробных
клеток, способных проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, однако природа этих
клеток изучена слабо. Настоящая работа ставила своей целью определение численности и
молекулярную идентификацию фильтрующихся форм микроорганизмов в поверхностных
водах водохранилища Рыбинское (рН 7.3) в районе гидрологической станции Брейтово.
Общую численность бактериопланктона воды определяли путем учета клеток,
осождённых на мембранных фильтрах «Millipore» с диаметром пор 0.22 мкм путем их окраски
ДНК-специфичным красителем ДАФИ (4', 6' – диамидино-2-фенилиндол). Численность
фильтрующихся клеток определяли путем их осаждения на фильтрах с диаметром пор 0.09
мкм. В целях молекулярной идентификации, осуществляли сбор фракции ультра-мелких клеток
путем пропускания 300 мл воды через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм и последующего
осаждения фильтрующихся форм микроорганизмов на фильтре с диаметром пор 0.10 мкм.
Выделение тотальной ДНК из собранных на фильтрах клеток производили с использованием
набора «FastDNA SPIN kit for soil» (Biol 101, США). Полученную тотальную ДНК
использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с амплификацией
фрагментов генов 16S рРНК бактерий (праймеры 9f и 1492r) и архей (праймеры 109f и 915r).
Полученные ампликоны клонировали с помощью набора «pGem-T Easy Vector System»
(«Promega»), анализировали с помощью рестрикционного анализа и секвенировали.
Общая численность микроорганизмов, выявленных в 1 мл воды водохранилища
Рыбинское, составила 1.44±0.08×106 клеток. Через фильтр с порами 0.22 мкм были способны
проникать 2.28±0.16×104клеток мл-1, то есть 1.6% общего числа микробных клеток в
исследуемой воде.
Ампликоны фрагментов генов 16S рРНК были получены лишь в ПЦР с архейными
праймерами. Сформированная в результате работы библиотека клонированных нуклеотидных
последовательностей генов 16S рРНК архей состояла из 104 клонов, принадлежащих
представителям филума Euryarchaeota. Из них только половина обнаруживала высокое
сходство (до 99%) с генами 16S рРНК таксономически описанных организмов порядков
Methanobacteriales (29 клонов) и Methanomicrobiales (18 клонов). Остальные клонированные
нуклеотидные последовательности были значительно удалены (до 81-86% сходства) от таковых
у всех ранее описанных архей и принадлежали к пока неохарактеризованным классам
мезофильных Euryarchaeota с условными названиями LDS (Lake Dagow Sediment) (49 клонов) и
RC-V (Rice Cluster V) (4 клона). Нуклеотидные последовательности представителей этой
группы были ранее обнаружены в различных, но преимущественно северных пресноводных
экосистемах, таких как реки, озера и болота арктической и бореальной зон. Настоящее
исследование дает основание предположить, что большинство организмов этой группы
представлены ультрамикроформами, способными проникать через фильтры с порами 0.22 мкм.
44
Биология и экология микроорганизмов
ОЦЕНКА КОЛОНИЗАЦИИ РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦЫ ГРИБОМ
FUSARIUM CULMORUM С ПОМОЩЬЮ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Феоктистова А.С., Шахназарова В.Ю., Вишневская Н.А., Струнникова О.К.
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский
институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, Санкт-Петербург,
Пушкин (Россия)
avoskina84@inbox.ru
Факультативный фитопатогенный гриб Fusarium culmorum (W. G. Sm.) Sacc. способен
вызывать корневые и стеблевые гнили, а также болезни колоса важнейших зерновых культур,
нанося урон урожаю и загрязняя зерно микотоксинами. Отбор сортов, наиболее устойчивых к
фузариозам, может быть одним из эффективных способов борьбы с F. culmorum. Важным
критерием отбора является оценка влияния генотипа растения на способность F. culmorum
колонизировать корни.
Колонизационную способность F. culmorum проверяли на пяти сортах гексаплоидной
пшеницы Triticum aestivum Веда, Лебедь, Безостая-1(мягкие озимые), Курьер (мягкая яровая),
Лилек (твердая яровая) и двух генотипах диплоидной пшеницы T. boeoticum (дикий) и T.
monococcum (окультуренный).
Учет поражения растений корневой гнилью проводили по методике, разработанной во
Всероссийском НИИ защиты растений. Для качественной оценки колонизационной
способности F. culmorumиспользовали непрямой метод флуоресцирующих антител. Структуры
гриба, количество микроколоний на поверхности корня, формирование зон некроза оценивали
под люминесцентным микроскопом Imager A 1 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 400.
Для определения количества F. culmorum в корнях применяли метод полимеразной цепной
реакции с детекцией в реальном времени. ДНК из корней растений выделяли
модифицированным в лаборатории методом, основанным на экстракции ДНК СТАВ-буфером.
ПЦР проводили с парой видоспецифичных к F. culmorumпраймеров OPT18 F и OPT18 R. Для
количественного определения ДНК F.culmorum использовали систему iCycler (BioRad, США).
Сочетание методов оценки колонизации корней F. culmorum позволило не только
установить количество гриба на корнях, но оценить процесс заселения корней в динамике и
визуализировать ответные реакции растения. Оценка интенсивности проявления гнили
показала, что сорта пшеницы имеют разную устойчивость к заболеванию. Диплоидные
генотипы пшеницы фузариозом не поражались.
Начальный этап заселения корней F. culmorum проходил активнее на более устойчивых
сортах пшеницы, однако формирование зон некроза на корнях таких растений наблюдалось в
очень редких случаях.
Сравнение количества F. culmorum на корнях с интенсивностью корневой гнили показало
отсутствие прямой зависимости между этими показателями. Несмотря на присутствие F.
culmorum в корнях диплоидных растений, сопоставимое по количеству с другими образцами,
симптомов болезни обнаружено не было. Более того, колонизируя корни диплоидных
генотипов пшеницы, гриб стимулировал их рост.
ПОИСК ЭФФЕКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ
Хамашкеева М.Т., Бубеев А.Т., Цыренов В.Ж.
Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления
14021988@bk.ru
Необходимость исследования механизма биоконверсии растительного сырья обусловлена
прогрессирующим дефицитом невозобновляемых источников энергии и материалов.
Перспективным с экологической точки зрения, является целлюлозосодержащее сырьё.
45
Биология и экология микроорганизмов
Целлюлозоразлагающие микроорганизмы являются основными деструкторами целлюлозы
в природе. Большая часть целлюлозы в природе разлагается анаэробными микроорганизмами.
В промышленных целях используется сравнительно небольшое количество видов
микроорганизмов, в основном относящихся к роду Trichoderma. Однако очень большая
длительность культивирования, сравнительно низкая продуцирующая способность
большинства грибных микроорганизмов создают необходимость дальнейших поисков
перспективных продуцентов.
Цель исследования - выделение и поиск эффективных продуцентов целлюлозолитических
ферментов.
Задачи
исследования:
1.
скрининг
микроорганизмов,
обладающих
целлюлозололитической активностью; 2. исследование динамики роста культуры
микроорганизма
и
его
целлюлозолитической
активности
по
отношению
к
карбоксиметилцеллюлозе.
Для выделения аэробных целлюлозоразлагающих бактерий использовали элективную
среду Гетчинсона, для анаэробов – среду Имшенецкого. Для преимущественного роста
целлюлозоразлагающих бактерий в качестве единственного источника углерода вносили
хроматографическую бумагу в количестве 10 г/л, температуру культивирования поддерживали
на уровне 55 ºС.
Проведён скрининг целлюлозопродуцирующих микроорганизмов, выделенных из навоза
крупного рогатого скота. В результате отобрано 5 бактериальных штаммов аэробного типа
дыхания. Изучение целлюлазной активности отобранных штаммов по изменению
концентрации восстанавливающих сахаров показало что наиболее активным является штамм №
13.
Определяли экзо- и эндо-целлюлазную активности выделенного микроорганизма по
отношению к карбоксиметилцеллюлозе и восстанавливающие сахара по методу ШомодиНельсона. Целлюлазную активность биомассы и культуральной жидкости определяли в
течение 7 суток.
На основании совокупности исследованных морфологических, культуральных, физиологобиохимических характеристик исследуемой культуры выделенный штамм отнесен к роду
Bacillus. Для достоверной идентификации видовой принадлежности необходимо провести
дополнительное изучение его филогенетических характеристик.
Показана целлюлозолитическая активность выбранного штамма микроорганизма, которая
достигает максимального значения на 1-е (2,2 мг/мин) и 5-е (1,9 мг/мин) сутки
культивирования, а также активность внутриклеточных ферментов , максимальное значение
которых наблюдалось на 5-е сутки (1,27 мг/мин).
СКРИНИНГ БАКТЕРИОФАГОВ, АКТИВНЫХ ПРОТИВ SERRATIA
MARCESCENS, ВОЗБУДИТЕЛЯ ГНИЛИ ЛУКА
Чайка Д.О., Харина А.В., Овчаренко Л.П.
Киевский национальный университет им. Тараса Шевченка, ОНЦ «Институт
биологии»; Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины
chaikadaria@mail.ru
Для Украины и мировой общественности не последней по весомости проблемой является
предотвращение потерь урожая ценных сельскохозяйственных культур в результате поражения
бактериальными патогенами. В последнее время в аграрной сфере возник вопрос значительного
снижения продуктивности насаждений лука в связи с контаминацией возбудителем S.
marcescens. Одним из способов борьбы с возбудителями бактериозов растений являются
препараты, разработанные на основе смесей бактериофагов. Учитывая отсутствие таких
препаратов, активных против фитопатогенной S. marcescens, целью нашей работы было
выделение и характеристика фагов, способных лизировать этого возбудителя.
На наличие бактериофагов, активных против S. marcescens, исследовались образцы смывов
овощных культур, сточных вод, почвы. Первичное выделение фагов и очистку проб от
контаминации проводили путем пропускания образцов через бактериальный фильтр.
Исследуемые образцы высевали методом двойных агаровых слоев. Провели выделение чистых
46
Биология и экология микроорганизмов
линий путем многоразового пересева фагов из единичных негативных колоний. Для
определения морфологии и размера фаговых частиц использовали метод электронной
микроскопии.
В результате проведенной работы из образца смыва моркови выделено бактериофаг,
формирующий негативные колонии с четко очерченным краем и диаметром 0,2-0,3 см.
После выделения и накопления титр вируса составил 10-12. На электронограмме определили
сферические частицы с продолговатой головкой и хвостовыми отростками. Предположительно,
исследованные фаги принадлежат к семейству Myoviridae, морфотип А2.
В наше время открыто незначительное количество бактериофагов против фитопатогенной
S. marcescens. Этот этап научных исследований является необходимым для достижения
конечной цели – разработки экологически чистого и эффективного метода борьбы с гнилью
лука (лечебных и профилактических препаратов на основе фагов).
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ BIO-ПРОМОТОРА ЭКЗОГЕННЫМ БИОТИНОМ
В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ШТАММА BACILLUS SUBTILISW6
Чеписюк Н.В.
Белорусский государственный университет, Минск (Беларусь)
Natalia_Chepisiuk@mail.ru
Биотиновый оперон Bacillus subtilis образован структурными генами bioWAFDBI с
предшествующей промоторно-операторной областью. В бактериальной клетке процесс
биосинтеза биотина негативно регулируется конечным продуктом (биотином), выступающим в
роли кофактора белка-регулятора birA.
Ранее на основе штамма B.subtilis2W2 посредством встраивания в область генов
биотинового оперона вектора интеграции pMB6 нами был получен штамм B.subtilisW6.
Основными характеристиками данного штамма являются делеция генов биотинового оперона
bioWAFD, которая произошла в результате интеграции вектора pW6, а также помещение под
контроль нативного промотора биотинового оперона (bio-промотора) гена β-галактозидазы.
Целью исследования являлось определение зависимости регуляции активности промотора
биотинового оперона в клетках штамма B.subtilisW6 от содержания экзогенного биотина в
среде культивирования бактерий. О работе промотора судили по активности β-галактозидазы
при культивировании бактерий в минимальной глюкозо-солевой среде (МГССА) с добавлением
биотина и без него. Определение активности β-галактозидазы проводили в среде с содержанием
биотина: 0,3нг/мл и 1нг/мл, а также без него. По результатам экспериментов активность βгалактозидазы в среде без биотина составила 166 ± 8,8 единиц Миллера, для концентраций
0,3нг/мл и 1нг/мл составила 67 ± 8,7 и 0,75 ± 0,13 единиц Миллера соответственно.
Таким образом, активность bio-промотора штамма B.subtilisW6 зависит от содержания
экзогенного биотина среды, при этом максимальной она является при культивировании
бактерий в среде МГССА без добавления витамина, наличие же биотина в среде приводит к
снижению активности bio-промотора.
МИКРОБНАЯ ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД ОТ ЖИРОВЫХ ВЕЩЕСТВ
Чирикова М.С., Глушень Е.М., Самсонова А.С.
Институт микробиологии НАН Беларуси
Margaritka7777@yandex.ru
Мировая практика микробной очистки сточных вод, содержащих в своем составе не более
3% жироподобных веществ, традиционно использует способы аэробной их обработки с
помощью иммобилизованной и свободноплавающей бактериальной массы штаммов
деструкторов липидов.
В рамках данной работы изучена деструктивная активность 4 штаммов микроорганизмов,
предлагаемых для разработки препарата для очистки сточных вод от жировых веществ.
47
Биология и экология микроорганизмов
Исследования провели в делительных воронках объемом 0,5 л. в условиях постоянного
поддержания стойкой эмульсии.
Установлено, что модельная сточная вода с исходным ХПК, равным 2000 мгО2/л,
очищается при совместном использовании 4 штаммов микроорганизмов до ХПК – 450 мг О2/л
(78%). Каждый из индивидуально использованных в очистке модельной воды штаммов
проявил различную активность в деструкции содержащихся в ней жировых веществ.
Использование Bacillus sp.6/2 АПФ-1 способствовало очистке модельного стока на 73%,
Rhodococcus ruber 2B на 49%, Rhodococcus erythropolis Р1-3ФН на 50%, Pseudomonas putida 10
АП на 60%.
Возможность культивирования микроорганизмов – Rhodococcus ruber 2B, Rhodococcus sp.
Р1-3ФН, Pseudomonas putida 10 АП, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1 определили также на
производственной сточной воде. Производственная сточная вода представлена водным
абсорбентом, образующимся в установке очистки вентвоздуха от барабана сушки стружки.
Данная производственная вода с ХПК 7000 мг О2/л. содержит в качестве загрязняющих
ингредиентов масло моторное, углеводороды и ПАВ.
Установлено, что в варианте выращивания культур на производственной воде с ХПК,
равным 7000 мг О2/л, количество биомассы в ней за 3-е суток увеличилось в 2,5 раза, а ХПК
снизилось до 4000 мг О2/л. Увеличение концентрации масла в воде, используемой для
выращивания вышеперечисленных микроорганизмов, вызывает снижение активности роста
микроорганизмов и накопления ими биомассы. Разбавление производственной воды до ХПК
1000 мг О2/л приводит к увеличению скорости развития в ней микроорганизмов-деструкторов
жировых веществ и очистке ее до ХПК 200 мг О2/л (ПДК сброса на биологическую очистку) в
течение 48 часов.
НОВЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР НА ТЕРРИТОРИИ
УКРАИНЫ
1
1
Шамрайчук В.О. , Цвигун В.А. , Руднева Т.А.2, Бысов А.С.1, Шевченко Т.П.1
1
Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко; 2Институт агроэкологии и
природопользования НААН
shamraichuk@gmail.com
Появляются данные, свидетельствующие о расширении ареалов вирусов культурных
растений, распространении комплексных и латентных инфекций, появлении их новых форм.
Целью работы было исследование распространения вирусных инфекций, поражающих
овощные культуры в Украине.
В открытом и закрытом грунте в Украине обнаружено 8 вирусов. На представителях
семейства Cucurbitaceae в открытом грунте были выявлены вирусы: Zucchiniyellow mosaic virus
(ZYMV), Cucumber mosaic virus (СМV), Watermelon mosaic virus 2 (WMV-2), Cucurbit aphidborne yellows virus (CABYV). В условиях закрытого грунта детектировали Cucumbergreen mottle
mosaic virus (CGMMV) и Impatiens necrotic spot virus (INSV). Что касается вирусов,
поражающих растения семейства Solanaceae, то найдены Pepper mild mottle virus (РММV) и
Turnipmosaic virus (TuMV). За 10 лет вирусного мониторинга впервые были обнаружены
ZYMV и CABYV на тыквенных растениях в полевых условиях Украины. Оба возбудителя
были идентифицированы в Киевской, Полтавской и Одесской областях - основных зонах
выращивания тыквенных культур. ZYMV регулярно выявляли на кабачках и цуккини. CABYVинфекцию диагностировали, в основном, на огурцах, кабачках и дынях. Вирусная инфекция,
вызванная INSV, впервые зафиксирована нами в тепличном хозяйстве Донецкой области на
огурцах. На представителях семейства Solanaceae, перце и помидорах, были впервые
детектированы РММV и TuMV. РММV поражал растения открытого грунта, вызывая желтозеленую мозаику листовой пластинки, локальные некрозы на поверхности плодов, а также
частичную антоциановую окраску плодов. В отличие от РММV, TuMV поражал растения
закрытого грунта.
Появление пяти новых вирусов ZYMV, CABYV, INSV, TuMV и РММV на территории
Украины можно объяснить распространением переносчиков и интродукцией сортов.
48
Биология и экология микроорганизмов
Тепличные условия также создают благоприятные условия для массового размножения
вредителей. Вследствие эффективности векторного пути передачи данных вирусов необходимо
контролировать популяцию насекомых и поднимать вопрос о необходимости
совершенствования мер фитосанитарного контроля.
ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS SYRINGАЕ ИЗ
РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА
Шаповал М.О., Заика С.А., Кот Т.Г., Харина А.В.
Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, ННЦ «Институт
биологии», кафедра вирусологии, проспект Глушкова 2, г. Киев, Украина
miroslava_shapoval@mail.ru
Pseudomonas syringае – экономически важный возбудитель бактериозов многих видов
сельскохозяйственных растений, особенно представителей семейства Solenaceae. Поражая
томаты, перец как в открытых, так и в закрытых грунтах, Pseudomonas syringае вызывает
потери урожая, которые могут составлять от 40 до 100%, ежегодные экономические убытки
исчисляются десятками миллиардов евро.
Представленая работа направлена на выделеление и характеристику бактериофагов,
способных лизировать Pseudomonas syringае с целью создания антибактериального препарата.
В результате проведённой работы, среди множества образцов растительного материала,
специфический к Pseudomonas syringae pt. tomato вирус был выделен из гнилого перца
(Capsicum annuum). Образцы высевали на бактериальный газон по методу Грациа. Отдельные
негативные колонии скалывали, чистые линии выделяли после 3-х пассажей из одиночной
колонии. Накопление и очистку выделенного изолята бактериофага проводили путём
дифференциального центрифугирования.
После накопления титр вируса достигал 10-13. Диаметр негативных колоний выделенного
изолята составлял 5-7 мм. После накопления фаги изучали под электронным микроскопом и
наблюдали сферические вирусные частицы (морфотип d1), диаметром 60-70 нм
(предположительно, фаги относятся к семейству Cystoviridae). Для дальнейшего анализа
проводили электрофорез белков по методу Леммли, полученные молекулярные массы белков
исследуемого вируса сравнили с литературными данными, которые подтвердили
принадлежность выделенного фага к вышеуказанному семейству. Выделенный бактериофаг
может быть задействован в разработках препарата против Pseudomonas syringае, как основная
его составляющая и в значительной степени уменьшить ущерб наносимый данным
фитопатогенным агентом.
БИОЦИДНЫЕ СВОЙСТВА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ
ГЕТЕРОПОЛИСАХАРИДА ХИТОЗАНА
Шахназарян Г.В., Иванова Е.В., Шуршалова Н.Ф., Зудина И.В.
Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов (Россия)
GoAr071089@yandex.ru
Современная методология создания биологически активных материалов и аналоговых
тканеинженерных конструкций биомедицинского назначения предполагает использование
углеводных биополимеров растительного и животного происхождения. В частности, для
решения проблемы закрытия ран различной этиологии значительное внимание уделяется
созданию повязок, губок, гелей и биопокрытий на основе гетерополисахарида хитозана.
Оказалось, что частицы хитозана способны косвенным путем стимулировать пролиферацию
кератиноцитов и фибробластов, а также оказывать ярко выраженный супрессивный эффект по
отношению к провоспалительной реакции. Относительно природы антимикробной активности
хитозана высказано множество гипотез. К сожалению, физиологические механизмы
перечисленных эффектов до настоящего момента не ясны.
49
Биология и экология микроорганизмов
На базе кафедры микробиологии и физиологии растений СГУ была исследована
антибактериальная активность ряда фармацевтических форм хитозана в отношении типовых
штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Нам не удалось выявить четкую
связь между антибактериальной активностью, молекулярной массой и степенью
деацетилирования этого полимера, как это было показано в целом ряде работ других
исследователей. Более того, оказалось, что разные серии одного и того же препарата,
полученные от одного производителя, существенно различаются своими биоцидными
свойствами. В то же время, нами установлена четкая корреляция между ранозаживляющей
активностью материалов из хитозана и их способностью угнетать рост бактерий.
Противоречивые мнения относительно антибактериальной активности хитозана, которые
часто встречаются в литературе, по всей видимости, могут быть обусловлены не только
различиями в способах выделения, индивидуализации и очистки этого гетерополисахарида, но
и наличием вариаций в его структуре и в составе примесей в зависимости от места добычи
сырья. Очевидно, что дальнейшее совершенствование полимерных материалов
биомедицинского назначения невозможно без более глубокого изучения механизмов
взаимодействия этого гетерополисахарида с микробными клетками, а также без комплексных
исследований влияния физико-химических параметров на его биологическую активность.
ПОЛИАМИНЫ И RPOS КАК РЕГУЛЯТОРЫ БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ У
ESCHERICHIA COLI
Широкова O.А., Нестерова Л.Ю., Ткаченко А.Г.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
zloitarakan@mail.ru
Ранее в работах лаборатории адаптации микроорганизмов было показано, что накопление
полиаминов (ПА) является универсальной реакцией на различные виды стресса и обеспечивает
выживаемость клеток под действием антибиотиков. Известно также, что ПА регулируют
содержание RpoS, контролирующего около 100 генов и являющегося мощнейшим регулятором
генной экспрессии в условиях стрессового ответа. Поэтому логично предположить, что для
биопленкообразования, рассматриваемого в последние годы как сложная стрессовая реакция,
ПА также могут быть определяющим фактором.
Исходя из вышеперечисленного, целью нашей работы было исследование влияния
полиаминов и RpoS на способность E. сoli к биопленкообразованию (БП).
Для изучения влияния ПА на биопленкообразование были использованы штаммы E. сoli с
нормально функционирующей системой синтеза ПА (профицитные) и мутантные
(дефицитные) штаммы, способные лишь к транспорту этих веществ. Культивирование
осуществлялось на полноценной среде LB и на декарбоксилазном (DK) бульоне – аналоге LB,
не содержащем аминокислот-предшественников ПА. Для изучения роли RpoS в БП
использовались изогенные штаммы с нормальным и нефункционирующим геном rpoS, а также
штамм с генетической конструкцией, обеспечивающей возможность индуцировать
сверхэкспрессию этого гена.
Мы обнаружили, что при культивировании на DK бульоне биопленкообразование E. сoli
было на 30% ниже, чем при культивировании на LB. Внесение в среду культивирования ПА:
путресцина, диаминопропана, спермина и спермидина в концентрации 10 мМ увеличивало БП
на 40, 115, 230 и 270% соответственно. Культивирование профицитного штамма на DK бульоне
с добавлением предшественника путресцина орнитина увеличивало биопленкообразование на
50%. БП rpoSсверхэкспрессирующего штамма было в 2,5 раза выше, чем у штамма с
нефункционирующим rpoS. Внесение в среду культивирования 1 мМ спермина увеличивало БП
RpoS-содержащего штамма на 60%, в то время как этот показатель для RpoS дефицитного
штамма возрастал на 20%.
Таким образом, показано, что полиамины и их предшественники стимулируют
биопленкообразование E. сoli. Одним из механизмов, обеспечивающих данный эффект, повидимому, является модуляция полиаминами уровня экспрессии rpoS, продукт которого, в
50
Биология и экология микроорганизмов
свою очередь, регулирует экспрессию большого числа генов, вовлечённых в формирование
биопленки.
Работа проведена в соответствии с Программой Президиума РАН «Молекулярная и
клеточная биология» (проект №12-П-4-1046) и поддержана грантом РФФИ №11-04-96001.
СЕКВЕНИРОВАНИЕ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ УЧАСТКОВ L3-ГЕНА
АДЕНО-ВИРУСА ОТ ГОСПИТАЛИЗИРОВАННЫХ ДЕТЕЙ ЗА ПЕРИОД 2009–
2010 гг.
Штыров А.А., Гасич Е.Л., Еремин В.Ф.
Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр
эпидемиологии и микробиологии», Минск (Беларусь)
artemshtyrov@gmail.com
Аденовирусы - ДНК-содержащие безоболочечные вирусы, объединены в семейство
Adenoviridae. Заболевания, вызываемые аденовирусами, занимают в инфекционной патологии
одно из ведущих мест и представляют значительную проблему. Аденовирусы - возбудители
острых респираторных инфекций, регистрируются на протяжении всего года, вызывая подъемы
заболеваемости, в основном среди детских групп населения. В практике врачей-педиатров
аденовирусная инфекция является одним из наиболее часто встречающихся вирусных
заболеваний. Особенностью этой инфекции является склонность к рецидивированию,
хроническому течению и персистенции возбудителя.
Целью работы являлось генотипирование аденовирусных изолятов, выделенных от детей,
госпитализированных в ГДКИБ г. Минска за период 2009-2010 гг.
Исследованы 26 аденовирусных изолята. Идентификация серотипа аденовируса проводили
методом определения нуклеотидной последовательности ампликона, полученных с помощью
праймеров, ограничивающих участок длинной 482 н.п. L3-гена (позиция 1834-2296).
Филогенетическая реконструкция полученных результатов показала, что циркулирующие
аденовирусы представлены двумя группами: Ад-В и Ад-С. При этом из 26 изолятов,
включенных в исследование, 20 (77%) принадлежали к группе Ад-С и только 6 (23%) - к группе
Ад-В. При более детальном изучении группы Ад-С установлено, что 7 изолятов аденовирусов
принадлежат к подгруппе Ад-С1 (35%), 8 - к подгруппе Ад-С2 (40%), 3 - к подгруппе Ад-С6
(15%), 2 - к подгруппе Ад-С5 (10%). При анализе группы Ад-В выявлены 5 изолятов,
принадлежащих к подгруппе Ад-В3 (83,3%) и 1 изолят - к подгруппе Ад-В7 (16,7%).
Все изоляты подтверждены высокой вероятностью топологии (72-95%) с прототипными
серовариантами, депонированными в международной базе данных GenBank, и обладали
высокой степенью гомологии в нуклеотидной последовательности.
Распределение выявляемых генотипов по годам было неравномерным и свидетельствовало
о нестабильности генотипической структуры популяции возбудителя. Серотипы Ад-С
выявлены в 76,4±5,1% случаев, серотипы группы Ад-В - в 23,6±5,1%. В 2009 г. преобладал в
основном Ад-С2 (26,7%), тогда как Ад-С1 и Ад-С6 выявлены в 20% случаев. Серотипы Ад-В3 и
Ад-С5 выделялись на одинаковом уровне, 13,3%. Серотип Ад-С7 выявлен в единичном случае
(6,7%). В 2010 г. картина меняется, и выявляются два серотипа группы Ад-С (Ад-С1 и Ад-С2,
по 36,4%) и Ад-В3 на уровне 27,3%.
Таким образом, в структуре аденовирусной инфекции среди госпитализированных детей за
указанный период времени преобладали аденовирусы группы Ад-С, которые склонны к
хроническому течению и персистенции. Аденовирусы группы Ад-В, которые вызывают
вспышки заболевания, выявлялись в меньшей степени.
Работа поддержана грантом БРФФИ Б10М-169.
51
Биология и экология микроорганизмов
ИЗУЧЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ
ЭНДОФИТНЫХ БАКТЕРИЙ-АССОЦИАНТОВ СФАГНОВЫХ МХОВ
ЛЕНИНГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ
Щербаков А.В., Кузьмина Е.Ю., Брагина А.В., Берг К., Берг Г., Чеботарь В.К.,
Тихонович И.А.
ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург, Пушкин (Россия);
Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург (Россия); Институт
природоведческой биотехнологии, Технологический университет, Грац (Австрия);
Ботанический институт, Карл-Франценс университет, Грац (Австрия)
avsherbakov@bisolbi.ru
Ранее исследованиями австрийских коллег было показано, что сфагновые мхи являются
уникальными местообитаниями для эндофитных бактерий, которые играют важную роль как в
жизни самих растений, так и в формировании болотных экосистем в целом.
Целью данных исследований было выделение культивируемых форм эндофитных бактерий
сфагновых мхов из различных географических точек Ленинградской области и изучение
таксономической структуры бактериальных популяций. Всего в ходе экспедиций в пяти
географически удаленных друг от друга болотных экосистемах Ленинградской области были
отобраны образцы сфагнового мха двух видов.
С помощью методов флуоресцентной in situ гибридизации и конфокальной сканирующей
лазерной микроскопии было показано присутствие эндофитных бактерий в зеленых частях
растений мха. Использование оригинальных методов поверхностной стерилизации растений
мха позволило выделить более 300 изолятов эндофитных бактерий. Все бактерии были
охарактеризованы по культурально-морфологическим и физиолого-биохимческим признакам.
RFLP-анализ фрагмента гена 16-S рРНК с использованием набора рестриктаз позволил выявить
группы сходных рестрикционных профилей как внутри популяций одной болотной
экосистемы, так и в нескольких географически удаленных. Секвенирование фрагментов гена
16-S рРНК различных RFLP-типов позволило установить таксономическую принадлежность
выделенных нами изолятов эндофитных бактерий. Установлено, что доминирующими
группами в этих популяциях являются представители родов Pseudomonas, Collimonas,
Burkholderia, Flavobacterium, Serratia.
52
Биофизика клетки, органов и систем
СЕКЦИЯ «Биофизика клетки, органов и систем»
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ β-ЭКЗОТОКСИНА ИЗ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ
РОДА BACILLUS THURINGIENSIS НА СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА
Алланазарова И.А.,Насиров К.Э., Хошимов Н.Н., Раимова Г.М., Халилов И.М
Институт физиологии и биофизики АН РУз, Ташкент
indira2005@mail.ru
При исследовании было выявлено, что β-экзотоксин, в концентрации 10 мкг/мкл сам не
влиял на тромбопластинообразование, но удлинял как тромбиновое (на 7+2 сек), так и
протромбиновое время (5+2 сек). Вместе с тем обнаружено, что формирование фибринового
сгустка зависит от концентрации ионов кальция в инкубационной среде. В то же время
препарат практически не влиял на экарин-вызванное тромбообразование и формирование
фибринового сгустка.
При изучении влияния β-экзотоксина на агрегацию тромбоцитов было установлено, что без
индуктора штамм №1 в концентрации 100 мкг/мл не вызывает агрегацию тромбоцитов, но
дозозависимо в разной степени ингибирует АДФ- и адреналин- индуцированную агрегацию
тромбоцитов. Ингибирующее действие β-экзотоксина усиливается в присутствии ионов (1 мМ)
Са2+. Выраженное ингибиторное действие β-экзотоксина проявляется, тогда когда агрегация
тромбоцитов индуцируется АДФ. При этом, экзотоксин-β при концентрации 10 мкг/мкл
значительно изменял динамику изменения кривой первой фазы (60%) и почти полностью
ингибировал вторую фазу (90%) АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Возможно, βэкзотоксин, блокируя транспорт Са2+ в тромбоцитах, изменяет не только уровень
мембраносвязанного кальция, но и его внутриклеточную концентрацию.
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ЗАЩИТЫ КЛЕТОК ВРОЖДЕННОГО
ИММУНИТЕТА ВНЕКЛЕТОЧНЫМ БЕЛКОМ ТЕПЛОВОГО ШОКА БТШ70 ОТ
ДЕЙСТВИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ И ЛИПОТЕЙХОЕВОЙ КИСЛОТЫ
Антонова О.Ю., Юринская М.М., Винокуров М.Г.
Пущинский государственный естественно-научный институт; Институт биофизики
клетки РАН, Пущино (Россия)
antonovaolga07@rambler.ru
Известно, что бактериальные эндотоксины (компоненты клеточной мембраны
грамотрицательных бактерий - липополисахариды (ЛПС) и компонент клеточной мембраны
грамположительных бактерий - липотейхоевая кислота (ЛТК)) играют важную роль в развитии
сепсиса, а также ряда социально значимых заболеваний. Основными клетками-мишенями ЛПС
и ЛТК в организме являются клетки врожденного иммунитета – макрофаги, моноциты и
нейтрофилы. Помимо действия на их функциональные свойства (увеличения продукции
активных форм кислорода (АФК), оксида азота и цитокинов), они нарушают регуляцию
апоптоза этих клеток.
В качестве перспективных подходов для защиты организма человека от действия ЛПС и
ЛТК рассматриваются препараты, которые способны конкурировать с ними за рецепторы
клеток-мишеней, а также влиять на регуляцию апоптоза этих клеток. Ранее было показано, что
препарат белка теплового шока БТШ70, полученный из мышц быка, увеличивает
выживаемость животных в модели эндотоксинового шока. Целью нашей работы являлось
исследование механизмов действия внеклеточного индуцибельного рекомбинантного БТШ70 и
БТШ70, полученного из мышц верблюда (конститутивный БТШ70) на нейтрофилы, моноциты
и макрофаги при действии ЛПС и ЛТК.
Сравнение защитного действия рекомбинантного и верблюжьего БТШ70 показало, что
данные белки оказывают идентичное защитное действие на исследованные клетки-мишени.
Нами было показано, что предварительная инкубация нейтрофилов с БТШ70 оказывала
защитный эффект на индуцируемое ЛПС и ЛТК ингибирование апоптоза, а также на
53
Биофизика клетки, органов и систем
продукцию АФК, TNF-α и экспрессию рецептора CD11b/CD18. Подобные защитные эффекты
были выявлены и в отношении генерации АФК и TNF-α моноцитами. Известно, что
эндогенный БТШ70 играет важную роль в большинстве клеточных процессов. Нами были
проведены исследования влияния теплового шока и соответственно экспрессии эндогенного
БТШ70 на продукцию NO мышиными макрофагами J774, показавшие, что эндогенный БТШ70,
также имеет защитные свойства, снижая выделение NO клетками. Также нами были проведены
исследования, направленные на изучение молекулярных механизмов защитного действия
экзогенного БТШ70 при действии ЛПС. В результате проведенной работы было обнаружено
восемь внутриклеточных белков (а именно Нspd1, Dpysl2, Eno1, Crp94 Тrар1, hnRNP K, Sqstm1
и Аnха5), синтез которых изменялся в ответ на тепловой шок, введение экзогенного БТШ70
или эндотоксина.
В заключение можно отметить, что исследованные аспекты защитного действия БТШ70 на
иммунные клетки свидетельствуют о комплексном воздействии этого белка на
функциональную активность этих клеток при действии ЛПС и ЛТК.
О НАРУШЕНИИ CD95-ОПОСРЕДОВАННОГО ПУТИ РЕАЛИЗАЦИИ
АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТАРНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПОД
ВОЗДЕЙСТВИЕМ ОКСИДА УГЛЕРОДА (II)
Бахметьева О.И., Путинцева О.В., Артюхов В.Г.
Воронежский государственный университет
Asp-bpf@rambler.ru
Оксид углерода (II) (монооксид углерода, СО) является распространенным
высокотоксичным химическим веществом, имеющим доступность в быту и на производстве.
СО образуется при неполном сгорании органических веществ в условиях отсутствия кислорода,
например, при работе двигателей внутреннего сгорания, пожарах, использовании в закрытых
помещениях нагревательных приборов с открытой рабочей поверхностью и др. Отравление
угарным газом вызывает развитие полиорганных осложнений в постинтоксикационном
периоде, характеризующихся длительными нарушениями со стороны нервной, сердечнососудистой, дыхательной, эндокринной систем, печени, почек, а также системы крови.
Чрезмерное воздействие монооксида углерода на иммунокомпетентные клетки может привести
к нарушению функционирования систем иммунитета, а возможно, и к гибели
иммунокомпетентных клеток. Лимфоциты – один из видов клеток иммунной системы
организма, которые обеспечивают клеточные и гуморальные формы иммунного ответа. Гибель
лимфоцитов при действии экстремальных факторов может происходить в форме
программируемой клеточной смерти (апоптоза). Известно, что СО может как вызывать, так и
подавлять программируемую клеточную гибель тимоцитов, гепатоцитов, эндотелиальных и
эпителиальных клеток, а также фибробластов и клеток Jurkat.
Цель работы: изучение влияния монооксида углерода в различном интервале времени (60,
75 и 90 минут) на развитие рецептор-опосредованного пути реализации апоптоза
лимфоцитарных клеток человека, показателем которого служил уровень экспрессии CD95
рецептора (маркера готовности иммунокомпетентных клеток к запуску активационного
апоптоза). Уровень анализируемого антигена на поверхности иммуноцитов определяли
методом проточной цитофлуориметрии.
Установлено, что средний уровень флуоресценции CD95 антигенов на поверхности
мембран нативных лимфоцитов составил 35,98±3,12 усл. ед. После модификации суспензии
лимфоцитарных клеток оксидом углерода (II) в течение 60, 75 и 90 минут средний уровень
флуоресценции CD95 комплексов понижался по отношению к контролю.на 12,4%, 19,5% и
27,4% соответственно.
После инкубации образцов иммуноцитов в атмосфере СО могут развиваться следующие
процессы, способствующие падению экспрессии CD95 маркеров на поверхности мембран
клеток: интернализация маркеров в более глубокие слои мембраны лимфоцитов, шеддинг
рецепторов с внешних примембранных слоев гликокаликса клеток, изменение конформации
54
Биофизика клетки, органов и систем
молекул CD95 в результате прямого или опосредованного действия оксида углерода (II), с
возможным блокированием синтеза исследуемых маркеров.
Снижение содержания CD95 рецептора на поверхности лимфоцитарных клеток человека
под воздействием оксида углерода (II), может сопровождаться нарушением CD95опосредованного пути реализации апоптоза.
АТФ-АЗНАЯ АКТИВНОСТЬ МИОЗИНА МИОКАРДА: СРАВНИТЕЛЬНОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ PH-ЗАВИСИМОСТИ
Гавриляк В.Б.
Киевский университет им. Т. Шевченко, Учебно-научный центр «Институт биологии»
vitaliya.havrylyak@gmail.com
Известно, что во время функционирования клеток во внутриклеточное пространство
поступают ионы водорода, из-за чего снижается уровень рН цитоплазмы в сравнении с
внеклеточным пространством, в свою очередь сократительная способность миоцитов
непосредственно зависит от величины рН. Целью нашей работы было экспериментально
исследовать зависимость АТФ-азной активности сократительных белков миокарда от рН среды
и сравнить результаты с такими данными для других типов тканей. В работе использовали
методы препаративной белковой химии, аналитические биофизические и биохимические
методы исследования белков: хроматографию, электрофорез, спектрофотометрию и др.
Выделение миозина и актомиозина сердечной мышцы проводили общепринятыми методиками
(Margossian, 1985).
Важной функциональной характеристикой миозина является АТФ-азная активность,
которая зависит от таких физико-химических факторов среды, как ионная сила, рН,
температура, наличие катионов, пр. Установлено, что рН-зависимость Са2+-АТФ-азной
активности миозина миокарда имеет два максимума активности: при рН6,0-6,5 и 9,0-9,5,
характерной особенностью Са2+-АТФ-азной активности миозина есть незначительный
максимум при рН 7,5-8,0. Характер изменений Са2+-АТФазной активности миозина в
зависимости рН для других типов мышечной ткани подобный, отличия наблюдаются только
при ее абсолютных значениях. Так, при рН 6,0-6,5 Сa2+-АТФ-азная активность миозина из
скелетных и сердечной мышц практически совпадает, для миозина из гладких мышц при этих
условиях она несколько выше, но при рН 9,0-9,5 АТФ-азная активность при наличии Сa2+
несколько выше для миозина из скелетных мышц сравнительно с гладкими мышцами и
кардиомиоцитами. Проведенное математическое моделирование показало, что скорость
реакции ферментативного расщепления АТФ миозином изменяется в зависимости от
количества ионов водорода, которое может быть задействовано в этом процессе (Данилова,
2006).
Исследуя рН-зависимости Mg2+-АТФ-азной активности миозина сердечной мышцы в
интервале рН 5,5-6,0, наблюдалось увеличение АТФ-азной активности. При дальнейшем
изучении влияния рН было выявлено три максимума активности: первый – при рН 6,5, второй –
при рН 7,5 и третий – при рН 9,0, после чего АТФ-азная активность миозина резко падала.
Существование двух дополнительных максимумов при слабощелочных и слабокислых
значениях рН вместе с характерным оптимумом при нейтральных значениях рН позволяет
предположить, что существует некоторый «запас прочности» в организации сократительного
аппарата сердца, который позволяет поддерживать способность миокарда функционировать в
условиях алкалоза или ацидоза внутриклеточной среды кардиомиоцитов.
В ходе эксперимента было установлено, что миозиновая АТФ-аза имеет два максимума
активности в зависимости от рН, а именно при рН 6,0-6,5 и 9,0-9,5, которые отличаются
абсолютными значениями активности для сердечной, скелетных и гладких мышц.
55
Биофизика клетки, органов и систем
ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ ОСНОВНОГО БЕЛКА МИЕЛИНА (MBP) В РАБОТЕ
МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ПОРЫ
Гордеева А.Е., Бабурина Ю.Л., Крестинина О.В., Азарашвили Т.С.
ИТЭБ РАН
lady.alina1310@yandex.ru
Известно, что белки миелиновой оболочки защищают аксон от повреждений и
способствуют проведению нервных импульсов. Такими белками являются основной белок
миелина (MBP), 2’,3’-циклонуклеотид-3-фосфодиэстераза (CNPаза) и протеолипид миелина.
Однако в последнее время увеличивается число публикаций, указывающих на локализацию
миелиновых белков вне миелина. В связи с этим следует отметить ассоциацию CNPазы, PLP с
митохондриями. CNPаза была недавно идентифицирована нами в митохондриях, где она
локализуется во внешней и внутренней мембранах. В экспериментах, выполненных на культуре
клеток олигодендроцитов с пониженной эксперссией CNPазы было выявлено, что
митохондрии, изолированные из таких клеток, обладают более низкой пороговой
концентрацией кальция, которая может вызвать инициацию открытия неспецифической поры
митохондрий. Повышенный уровень CNPазы в митохондриях увеличивает устойчивость их к
открытию поры. Исследования содержания CNPазы во фракциях, полученных после
разделения на градиенте плотности Перкола показали наивысшее содержание в миелиновой
фракции, меньшее – в синаптической и наименьшее – в несинаптических митохондриях.
В настоящей работе была исследовано ассоциация MBP в тех же фракциях, кроме того, из
несинаптических Мх мозга получали митопласты и внешнюю мембрану по стандартной
методике Райса и Линдсея. При электрофоретическом анализе трёх фракций Мх мозга крысы в
SDS-ПААГ в миелиновой фракции было идентифицировано четыре полосы, соответствующие
4 изоформам MBP: 14 кДа, 17 кДа, 18,5 кДа, 21,5 кДа; для фракции синаптосомальных и
несинаптических Мх - две полосы MBP - 17 кДа и 21,5 кДа. Миелиновую фракцию
использовали как контрольную для MBP. Иммунохимический анализ, с использованием
специфических антител к MBP, показал его присутствие как во фракциях синаптосомальных
Мх (12%), так и во фракции несинаптических Мх (3%). При фракционировании
несинаптических Мх, было детектировано присутствие основного белка миелина, во
внутренней и во внешней мембране, причем во внешней мембране определялись 2 изоформы, а
в митопластах только изоформа 21,5 кДа.
Суммируя полученные
результаты,
демонстрирующие
ассоциацию
MBP с
митохондриальными фракциями, можно заключить, что MBP может в Мх выполнять новые,
пока неизвестные функции.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ МИКРОКАЛОРИМЕТРИЯ
ЛИЗОЦИМА И РИБОНУКЛЕАЗЫ А ПРИ ВЫСОКОМ ДАВЛЕНИИ
Егоров А.Е., Потехин С.А.
Учреждение Российской академии наук Институт белка РАН, Пущино (Россия)
a.egorov@vega.protres.ru
Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии при высоком давлении (до
3000 атм) изучена тепловая денатурация двух небольших глобулярных белков – рибонуклеазы
А и лизоцима.
Показано, что увеличение давления приводит к дестабилизации структуры этих белков и
уменьшению энтальпии денатурации.
Оценены значения объемных денатурационных параметров для рибонуклеазы А включая
изменение объема, и изменения коэффициентов изотермического сжатия и изобарического
теплового расширения. Изменение термодинамического объема при денатурационном переходе
у рибонуклеазы А отрицательно. Нативное состояние в этом смысле менее “компактно”, чем
денатурированное.
С ростом температуры различие по объему между денатурированным и нативным
состоянием уменьшается; коэффициент расширения денатурированного состояния больше, чем
56
Биофизика клетки, органов и систем
нативного. С ростом давления различие увеличивается; сжимаемость денатурированного
состояния выше, чем нативного.
Для изученных белков показано также, что денатурационный скачок теплоемкости растет
не более чем в 1.5 раза при увеличении давления до 1800 атм.
Полученные данные согласуются с представлением о том, что плотность воды,
дополнительно упорядоченной на гидрофобных поверхностях, больше плотности воды вдали
от гидрофобных групп.
Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-00864-а
ИЗУЧЕНИЕ АДСОРБЦИИ ВЕЩЕСТВ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ И
ОРГАНИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ НА ДЕКСТРАНЕ И ПЕКТИНЕ
Кергенцев А.А., Чухно А.С., Дмитриева И.Б.
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, СанктПетербург (Россия)
anton_kergencev@mail.ru
В современном мире адсорбенты используются при интоксикациях и доставке
лекарственных веществ в нужные отделы желудочно-кишечного тракта. Из теории известно,
что на гидрофобных поверхностях адсорбируются неполярные соединения, а на гидрофильных
- полярные. Декстраны - гомополисахариды, состоящие из глюкопиранозных остатков с
эмпирической формулой (С6Н10О5)n. Основным отличием всех декстранов от полисахаридов
типа крахмала и гликогена является то, что большинство глюкозных остатков в их молекулах
связано между собой преимущественно а-1-6-гликозидной связью. Также декстран более
устойчив к действию кислот и щелочей.
Пектиновые вещества или пектины - полисахариды, основой пектиновых веществ является
молекулярная цепь из остатков D-галактуроновой кислоты, имеющих пиранозную
конфигурацию и соединенных 1,4-L-гликозидной связью.
Исследование адсорбции CoSO4 при значениях рН от 3,9 до 4,5, показало, что несмотря на
увеличение концентрации, при приближении к ТНЗ происходит снижение адсорбции. Что было
подтвеждено исследованием адсорбции ионов меди. После чего была проведена адсорбция Cu2+
при более высоких значениях рН (рН=5.1), в этой области декстран имеет отрицательный заряд,
в связи с чем, адсорбция Cu2+ резко увеличилась.
Результаты исследований адсорбции аспарагиновой и уксусной кислот показывают, что их
адсорбция значительно выше, чем у исследуемых электролитов. Аналогичные результаты
получены при исследовании адсорбции перманганата калия (KMnO4) на положительном
заряженном декстране, хотя значения адсорбции значительно ниже, чем в случае
аспарагиновой и уксусной кислот.
Далее мы сравнили адсорбцию тех же веществ на декстране и пектине, результаты
исследования показали, что адсорбция на пектине металлов выше в несколько раз, мы это
связываем со способностью галактуроновой кислоты образовывать хелатные комплексы с
металлами, адсобция же органических соединений несколько ниже.
Таким образом, мы установили, что адсорбция электролита на декстране и пектине в
большей степени определяется положением точки нулевого заряда, и зависит не только от
концентрации ионогенных веществ, но и от наличия различных функциональных групп, как на
поверхности адсорбента, так и в молекуле адсорбата.
СЕНСОР ЦИКЛИЧЕСКОГО АМФ НА ОСНОВЕ CNGA3 СУБЪЕДИНИЦЫ
цГМФ/цАМФ-АКТИВИРУЕМОГО КАНАЛА ОБОНЯТЕЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ
Колесникова А.С., Черкашин А.П., Чурбанов Г.Д., Рогачевская О.А.
Институт биофизики клетки РАН
alisask@rambler.ru
57
Биофизика клетки, органов и систем
С целью создания сенсора для мониторинга внутриклеточного цАМФ в реальном времени
из обонятельного эпителия мыши была клонирована CNGA3 субъединица катионного канала,
активируемого циклическими нуклеотидами цГМФ и цАМФ. Для улучшения цАМФ/цГМФ
селективности и повышения аффинности к цАМФ методом точечного мутагенеза были
введены две замены в аминокислотной последовательности нуклеотид-связывающего центра
этого канального белка. Рекомбинантные аналоги белка дикого типа и его мутантной формы
были гетерологически экспрессированы в клетках линии CHO. Методом patch clamp показано,
что трансфекция клеток соответствующими конструкциями индуцировала в обоих случаях
цАМФ/цГМФ-зависимый ток. Как свидетельствовали кривые доза-ответ, CNGA3 субъединица
дикого типа формировала катионный канал, для которого цГМФ и цАМФ были полными
агонистами с EC50 ~ 0,3 мкМ и 70 мкМ, соответственно. Мутации драматически изменяли
чувствительность канала к агонистам. Для мутированной CNGA3 субъединицы цАМФ/цГМФактивируемый ток стимулировался цАМФ с EC50 ~ 3 мкМ, в то время как цГМФ становился
частичным агонистом с EC50 ~ 20 мкМ и Imax(цАМФ)/Imax(цГМФ) ~ 2.Поскольку CNGA3
каналы хорошо проницаемы для ионов кальция, анализировались свойства мутированной
CNGA3 субъединицы как цАМФ-сенсора с использованием флуоресцентного Са2+-зонда Fluo4. С этой целью рекомбинантный аналог CNGA3-канала был экспрессирован в клетках HEK293, которые затем подвергались различным воздействиям, приводящим к повышению
внутриклеточного цАМФ, при одновременном мониторинге внутриклеточного Са2+. Показано,
что форсколин (активатор аденилатциклазы), IBMX (ингибитор фосфодиэстеразы), 8BrцАМФ
(проникающий аналог цАМФ) вызывали обратимое повышение внутриклеточного Са2+ в
трансфецированных, но не в контрольных клетках HEK-293. Полученные данные в целом
свидетельствуют о функциональности и достаточно высокой чувствительности созданного
цАМФ-сенсора. В сочетании с сенсором примембранного Са2+ данный CNGA3-сенсор может
обеспечить мониторинг локального уровня цАМФ.
Работа поддержана грантами ФЦП (ГК П809) и РФФИ 10-04-01105а.
ДВА ТИПА КАЛЬЦИЕВЫХ ОТВЕТОВ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ
КЛЕТОК НА НОРАДРЕНАЛИН
Котова П.Д., Язев Е.А., Григорьева О.А., Рогачевская О.А.
Институт биофизики клетки РАН, Пущино (Россия); Московский государственный
университет им. М.В. Ломоносова, Факультет фундаментальной медицины, Москва
(Россия)
kpd-88@list.ru
Понимание биологических функций мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и
основополагающих физиологических процессов требует, в частности, адекватного анализа их
рецепторных и сигнальных систем. Таковые на данный момент изучены недостаточно.
В данной работе исследовалась агонист-зависимая Са2+сигнализация в МСК человека.
Клетки выделялись из жировой ткани, полученной при липосакции пациентов, и в дальнейшем
культивировались в течение 2-3 недель. Сигнальные процессы в МСК исследовались с
использованием Са2+ зондов (Fluo-4, Fura-2) и микрофотометрии.
Оказалось, что в первичной культуре популяция МСК гетерогенна как по
чувствительности к различным агонистам, так и по механизмам, лежащим в основе генерации
Са2+ сигналов. В данной работе мы фокусировались на исследовании адренергической
сигнальной системы. Оказалось, что популяция МСК содержит субпопуляцию (~10%) клеток,
отвечающих на норадреналин (50нМ – 1мкМ) мобилизацией внутриклеточного Са2+. Во всех
случаях (76 клеток) Са2+ ответы на норадреналин полностью подавлялись ингибитором
фосфолипазы U73122 (1-5мкМ), свидетельствуя о том, что адренорецепторы сопряжены с
фосфоинозитидным каскадом. Поскольку агонист α2-адренорецепторов гуанобенц (1-10мкМ)
также инициировал Са2+ ответы, а антагонист α2-адренорецепторов иохимбин (0,5 - 4мкМ)
полностью их подавлял, можно заключить что именно α2-адренорецепторы ответственны за
чувствительность МСК к норадреналину. При исследовании роли депо-зависимого и рецепторзависимого входа Са2+ в генерации Са2+ ответов было установлено, что примерно в половине
58
Биофизика клетки, органов и систем
случаев удаление наружного Са2+ полностью ингибирует ответы МСК на норадреналин. Это
показывало, что в таких МСК Са2+ сигналы генерировались за счет стимуляции
норадреналином рецептор-зависимого входа Са2+. В остальных случаях МСК генерировали
практически нормальные, хотя несколько уменьшенные по амплитуде, ответы на
норадреналин, свидетельствуя о преимущественном вкладе высвобождения депонированного
Са2+. Соответственно, ответы клеток, отвечающих в бескальциевой среде, полностью
ингибировались в присутствии ингибиторов IP3 рецепторов 2-APB (20-50мкМ) и Xestospongin С
(10мкМ). Полученные данные указывают на существование двух субпопуляций МСК с
функциональными α2-адренорецепторами, сопряженными с мобилизацией внутриклеточного
Са2+ различными сигнальными каскадами.
ДНК-ЛИПИДНЫЕ КОМПЛЕКСЫ И ИХ РОЛЬ В СБОРКЕ ЯДЕРНОЙ ПОРЫ
Кувичкин В.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Биофизики
Клетки Российской Академии Наук
vkuv@rambler.ru
Исследование комплексов ДНК с липидами имеет 40 летнюю историю и
сотрудники Института биофизики АН ССР внесли достойный вклад в решение данной
проблемы. Работы Б.И. Сухорукова, Н.Б. Стражевской и В.А. Стручкова были
первыми в России после публикации итальянских ученых из лаборатории Manzoli F.A. (1970).
В этих первых работах in vitro была показана принципиальная возможность взаимодействия
столь разнородных веществ как гидрофобные липиды и гидрофильная ДНК. Было обнаружено
влияние липидов на термо- стабильность ДНК, а также то, что ДНК защищает липиды от
окисления, сама при этом подвергаясь окислению радикалами, возникающих при перекисном
окислении липидов. Следующим важным этапом в исследовании ДНК- липидных
взаимодействий были работы В.Г. Будкера по изучению тройных комплексов (ТК): ДНКцвиттерионные липосомы-катионы двухвалентных металлов. Эти исследования получили
продолжение в наших работах относительно роли ТК в формировании ядерной оболочки с
порами.
Если суммировать результаты по исследованию ТК , получится следующее резюме:
1. ТК образуются из липосом, приготовленных из цвиттерионных липидов типа
фосфатидилхолина (ФХ), фосфатдилэтаноламина (ФЭ) и сфингомиелина (СМ). Добавление
других липидов в до 30 вес% может ослаблять или усиливать взаимодействие между ДНК и
липидами либо полностью разрушать ТК.
2.Катионы металлов Mg2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+, Co2+ при разном способе их взаимодействия с
ДНК образуют похожие ТК (при их микроскопическом анализе, в т.ч. и методом электронной
микроскопии).
Токсичные
катионы
металлов:
Cd2+,
Hg2+,
2+
2+
Pb , Ni и др. не только не образуют ТК, но и разрушают ТК, сформированные первой группой
катионов металлов.
3. Взаимодействие между липосомами в ТК является суперпозицией агрегации и слияния
липосом в зависимости от их размеров. Липосомы диаметром до 100 нм
преимущественно сливаются - выше этого размера- агрегируют.
4. При слиянии двух липосом, ДНК в зоне слияния расплетается, располагаясь
по периметру зоны слияния. При этом в других районах, где с липосомами
взаимодействует двух- цепочечная ДНК, она может быть более температурно-стабильной, что
и обнаруживает микрокалориметрия.
5. Поскольку ядерная оболочка в клетке образуется из мембранных везикул, которые почти
наполовину состоят из цвиттерионных липидов, мы предположили участие ТК из таких
везикул, ДНК хроматина и Mg2+ в формировании ядерной оболочки и предложили модель
образования ядерных пор на основе ТК.
6. Добавление к нашей модели нуклеопоринов, из которых по современным
представлениям, формируются ядерные поры позволит объяснить ряд нерешенных вопросов в
59
Биофизика клетки, органов и систем
структуре и функциях ядерных пор, особенно в их участии в транскрипции и регуляции
экспрессии генома.
ВЛИЯНЕ НОКОДАЗОЛА И ТАКСОЛА НА Са2+-ОТВЕТЫ,
ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПРЕПАРАТОМ МОЛИКСАН В МАКРОФАГАХ
Курилова Л.С., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Крутецкая Н.И., Ласточкин В.В.,
Наумова А.А., Войцехович К.О.
Санкт-Петербургский государственный университет
cozzy@mail.ru
Препарат моликсан® (ФАРМА-ВАМ, Москва) (комплекс динатриевой соли окисленного
глутатиона с платиной в наноконцентрации и нуклеозида инозина) относится к группе
препаратов тиопоэтиков, изменяющих редокс-статус клеток; имеет иммуномодулирующий и
гепатопротективный эффекты, применяется в противовирусной терапии гепатитов В и С, в
терапии цирроза печени. Однако механизмы молекулярного и клеточного действия препарата
далеки от полного понимания. Ранее нами показано, что моликсан вызывает двухфазное
увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, [Ca2+]i, связанное с мобилизацией Са2+ из
внутриклеточных Са2+-депо, и последующим депо-зависимым входом Са2+ из наружной среды,
в перитонеальных макрофагах крысы.
Известно, что белки цитоскелета актин и тубулин имеют высокую редоксчувствительность и легко подвергаются S-глутатионилированию. С использованием
каликулина А, вызывающего конденсацию актинового цитоскелета под плазмалеммой, нами
было выявлено участие актиновых филаментов в действии моликсана на [Ca2+]i в макрофагах. В
связи с этим, представлялось целесообразным исследовать возможное участие в действии
моликсана на [Ca2+]i в макрофагах другой важной системы цитоскелета – микротрубочек. В
экспериментах были использованы нокодазол, вызывающей деполимеризацию микротрубочек,
а также таксол (паклитаксель), вызывающий стабилизацию микротрубочек.
С использованием флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM показано, что преинкубация
макрофагов с нокодазолом (20 мкМ) в течение 20 мин до введения 100 мкг/мл моликсана,
вызывает практически полное подавление Са2+-ответов, индуцированных моликсаном.
Преинкубация макрофагов со стабилизатором микротрубочек таксолом (50 мкМ) в течение 30
мин до введения 100 мкг/мл моликсана также приводит к практически полному подавлению
обеих фаз Са2+-ответа, индуцированного моликсаном. Полученные данные свидетельствуют об
участии микротрубочек в действии моликсана на [Ca2+]i в макрофагах. Кроме того, показано,
что добавление 50 мкМ таксола на фоне развившегося входа Са2+, индуцированного
моликсаном, вызывает постепенное подавление входа Са2+ в клетку и возвращение [Ca2+]i к
базальному уровню, что подтверждает полученные нами ранее данные об участии
микротрубочек в регуляции депо-зависимого входа Са2+, индуцированного пуринергическим
агонистом АТФ или ингибитором эндоплазматических Са2+-АТФаз тапсигаргином, в
макрофагах. Полученные данные свидетельствуют также о нежелательности совместного
применения препарата моликсан и нокодазола или таксола, используемых в химиотерапии
опухолей.
ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ГЕМОГЛОБИНА С МОДЕЛЬНЫМИ
ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ МЕТОДОМ РЕЗОНАНСНОГО ПЕРЕНОСА
ЭНЕРГИИ
Куценко О.К., Трусова В.М., Горбенко Г.П., Молотковский Ю.Г.
Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Харьков (Украина);
Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
РАН, Москва (Россия)
olzk@mail.ru
60
Биофизика клетки, органов и систем
Одним из важнейших направлений современной медицины является создание нетоксичной
и неиммуногенной искусственной крови. Наиболее перспективным подходом к решению этой
проблемы является инкапсуляция гемоглобина в липидные везикулы. Однако для успешного
конструирования такого вида переносчиков кислорода необходимо получить исчерпывающую
информацию о взаимодействии гемоглобина (Hb) с бислоями, содержащими различные виды
липидов.
В данной работе с помощью метода резонансного переноса энергии исследовали
взаимодействие Hb с модельными липидными мембранами, состоящими из цвитерионного
липида фосфатидилхолина (ФХ) и его смесей с анионными липидами фосфатидилглицерином
(ФГ), фосфатидилсерином (ФС) и кардиолипином (КЛ). Донором энергии служил
антрилвиниловый флуорофор (АВ), ковалентно присоединенный к ФХ, а акцептором была
гемовая группа гемоглобина.
Анализ данных производился в рамках модели переноса энергии Фанга и Страера.
Полученные результаты были различными для всех видов липосом, что может быть объяснено
структурными особенностями липидных молекул. Для ФХ липосом было обнаружено, что
около 11% белка локализуется на поверхности бислоя, в то время как 13% Hb проникает во
внутренние области мембраны, что согласуется с современными представлениями о
преимущественной роли гидрофобных взаимодействий в связывании белка с липидами. Повидимому, адсорбция Hb на поверхности мембраны приводит к структурным изменениям как
белка, так и бислоя, что приводит к экспонированию гидрофобных участков Hb,
дестабилизации бислоя и способствует проникновению Hb вглубь мембраны. В случае ФХ/КЛ
липосом, во внутренние области бислоя проникло около 11% белка, в то время как ближе к
поверхности оказалось связано 54% Hb. Мембраны, содержащие КЛ, имеют структуру, менее
упорядоченную по сравнению с ФХ бислоем, что способствует проникновению белка во
внутренние регионы мембраны и формированию контактов Hb с неполярными областями
бислоя. Наименьшее количество связанного белка наблюдалось в анионных ФХ/ФГ везикулах
(около 12%). Это подтверждает незначительную роль ионных сил в связывании. Кроме того,
ФГ способен образовывать водородные связи с соседними липидными молекулами, которые
стабилизируют бислой и препятствуют проникновению белка в мембрану. Наименьшее
количество проникшего в мембрану белка (около 1%) наблюдалось в липосомах, содержащих
анионный липид ФС, входящий в состав внутренней поверхности мембран эритроцитов. В этом
случае 28% белка было связано на поверхности бислоя. Возможно, структура ФС-содержащих
бислоев наиболее благоприятна для формирования контактов с положительно заряженными и
гидрофобными участками Hb и стабилизации комплекса.
Полученная информация может быть полезна не только в области фундаментальных
исследований, но и для создания искусственных переносчиков кислорода на основе
инкапсулированного в липосомы гемоглобина.
Работа выполнялась при поддержке ГФФИ Украины проект № Ф41.1/014.
АДСОРБЦИОННАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ АМПИЦИЛЛИНА НА КОЛЛАГЕНЕ
Макарова Е.Л., Ковалева Т.А., Гребенщиков А.В., Петракова И.В
Воронежский государственный университет
makarova7809@mail.ru
Для разработки новых лекарственных препаратов используются вспомогательные
вещества. Перспективным вспомогательным веществом в технологии мазей, суппозиториев,
растворов для инъекций, глазных лекарственных пленок и других лекарственных форм
является коллаген. Предполагается, что включение лекарственного вещества в молекулу
коллагена обеспечивает пролонгированное действие полученного препарата.
Материалом для исследования служили тригидрат ампициллина фирмы «Биосинтез» и
коллаген, выделенный ферментативным методом из соединительной ткани крупного рогатого
скота. Иммобиллизацию проводили адсорбционным методом при периодическом
перемешивании, для определения содержания антибиотика в иммобилизованном препарате
61
Биофизика клетки, органов и систем
применяли метод с использованием фенольного реактива Фолина-Чокальтеу, активность
устанавливали диффузионным методом в агаре.
Осуществлена адсорбционная иммобилизация ампициллина на коллагене при температуре
25 °С и рН 7,0. Рассчитана сорбционная емкость коллагена, которая составила 52,27%.
Ампициллин, адсорбированный на коллагене, сохраняет 88% антибактериальной активности по
сравнению с таблетированной формой. Уменьшение ширины зоны отсутствия роста культуры
Bacillus может быть обусловлено образованием слабых связей между антибиотиком и
коллагеном, усложняющие воздействие вещества на стенки бактерий Bacillus subtilis и
обеспечивающие пролонгированный эффект.
Проведенные исследования позволяют придти к заключению о том, что коллаген может
использоваться в качестве носителя для разработки фармацевтических препаратов
пролонгированного действия.
СТАБИЛИЗАТОР МИКРОТРУБОЧЕК ТАКСОЛ МОДУЛИРУЕТ ЭФФЕКТ
ГЛУТОКСИМА НА ТРАНСПОРТ NA+ В КОЖЕ ЛЯГУШКИ
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Крутецкая Н.И., Бутов С.Н.
Санкт-Петербургский государственный университет
avm242@hotbox.ru
Кожа амфибий — классический модельный объект для исследования механизмов
трансэпителиального транспорта. Ранее нами было показано, что транспорт Na+ в коже
лягушки модулируется окисляющими агентами. Впервые обнаружено, что окисленный
глутатион (GSSG) и его синтетический аналог препарат глутоксим® (ФАРМА-ВАМ, Москва),
приложенные к базолатеральной поверхности кожи, имитируют действие инсулина и
стимулируют транспорт Na+. Показано, что в регуляции GSSG и глутоксимом транспорта Na+ в
коже лягушки участвуют тирозинкиназы, протеинкиназа С, серин/треониновые
протеинфосфатазы РР1/РР2 и фосфатидилинозитолкиназы, а также микротрубочки и
микрофиламенты. Так, предварительная обработка кожи деполимеризатором микрофиламентов
цитохалазином D или деполимеризатором микротрубочек нокодазолом подавляет
стимулирующий эффект глутоксима на транспорт Na+. В связи с этим, представлялось
целесообразным исследовать влияние стабилизатора микротрубочек таксола на эффект
глутоксима на транспорт Na+ в коже лягушки Rana temporaria.
Для регистрации вольт-амперных характеристик (ВАХ) кожи лягушки использовали
автоматизированную установку фиксации потенциала. В интервалах между измерениями ВАХ
трансэпителиальный потенциал (VT) кожи поддерживали при 0 мВ (режим короткого
замыкания) или при потенциале открытой цепи VOC (VOC = VT при трансэпителиальном токе IT
= 0). Из ВАХ определяли электрические параметры кожи: ток короткого замыкания ISC (ISC = IT
при VT = 0), VOC и трансэпителиальную проводимость gT. Транспорт Na+оценивали как
амилорид-чувствительный ISC.
Показано, что таксол, также как нокодазол, оказывает дозо-зависимое ингибирующее
влияние на эффект глутоксима на транспорт Na+ в коже лягушки. Так, таксол в концентрации
20 мкМ приводит к меньшему (по сравнению с действием более высоких концентраций (50
мкМ)) подавлению стимулирующего действия глутоксима на ISC и VOC. Обнаружено также, что
нокодазол и таксол по-разному модулируют влияние глутоксима на транспорт Na+. Ранее было
показано, что нокодазол вызывает полное подавление обеих фаз стимулирующего действия
глутоксима, характерных для влияния этого окисляющего агента на транспорт Na+ в коже
лягушки. В то же время, преинкубация кожи лягушки с таксолом незначительно изменяет
начальную фазу, однако, так же как и при обработке кожи нокодазолом, наблюдается полное
подавление второй фазы стимулирующего действия глутоксима на транспорт Na+ . Таким
образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что любые изменения в структуре
(стабилизация или деполимеризация) тубулинового цитоскелета приводят к существенному
снижению стимулирующего действия глутоксима на транспорт Na+ в коже лягушки.
62
Биофизика клетки, органов и систем
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМОГО
ФОТОТОКСИЧНОГО БЕЛКА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ
Минакова Е.А.1, Ширманова М.В.2, Снопова Л.Б.2, Серебровская Е.О.3, Лукьянов
К.А.3, Евтеева Н.В.1, Турчин И.В.4, Лукьянов С.А.3, Загайнова Е.В.2
1
ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород (Россия); 2НИИ ПФМ НижГМА,
Нижний Новгород (Россия); 3ИБХ РАН, Москва (Россия); 4ИПФ РАН, Нижний
Новгород (Россия)
minakova_kat@mail.ru
В 2005 г. в лаборатории С.А.Лукьянова (ИБХ РАН) был создан первый в мире генетически
кодируемый фототоксичный белок KillerRed. Этот флуоресцентный белок, в связи со своими
структурными особенностями, способен под действием света производить активные формы
кислорода путем реакции фотосенсибилизации I типа.
Фототоксичность этого белка показана in vitro на бактериальной культуре E.coli и
опухолевых клетках (рак шейки матки человека HeLa, меланома В16). Белок KillerRed может
экспрессироваться в разных компартментах клетки совместно со многими клеточными
белками. Ранее было показано, что фототоксичность KillerRed зависит от его клеточной
локализации и возрастает при направлении белка в матрикс митохондрий (KillerRed-mito) и на
внутреннюю сторону плазматической мембраны (KillerRed-mem). Кроме того, клеточные
ответы на облучение KillerRed-mito и KillerRed-mem существенно различаются. В случае
митохондриальной локализации облучение клеток приводило к апоптозу, а при мембранной
локализации клетки погибали по пути некроза. Химерный белок, включающий в себя гистон
Н2B и KillerRed, позволял останавливать клеточные деления облучением зеленым светом.
Однако на сегодняшний день исследования фототоксического действия белка KillerRed
ограничены экспериментами на клеточных культурах in vitro. Целью данной работы являлось
исследование патоморфологических эффектов генетически кодируемого фотосенсибилизатора
KillerRed на опухолях животных.
Эксперименты проводились на иммунодефицитных мышах линии nude с привитой
опухолью HeLa. Клетки опухоли были трансфецированы фототоксичным белком KillerRed,
имеющим максимум возбуждения на 585 нм, максимум флуоресценции на 610 нм. Лазерное
облучение опухолей выполняли многократно. Изменения размеров опухолей и интенсивности
флуоресценции отслеживались in vivo на установке для поверхностного флуоресцентного
имиджинга. После облучения образцы опухолевой ткани ex vivo были отправлены на
гистологическое исследование, электронную и конфокальную флуоресцентную микроскопию.
С помощью прижизненного флуоресцентного имиджинга было установлено, что после
лазерного
облучения
опухолей
интенсивность
их
флуоресценции
снижается,
предположительно из-за фотообесцвечивания хромофора. Патоморфологический анализ
показал дистрофические изменения в леченых опухолях с белком. При анализе динамики роста
опухолей отмечена тенденция к росту опухолей у животных без облучения, тогда как размер
облученных опухолей изменялся не значительно.
Таким образом, в данной работе впервые исследовались фототоксические эффекты
генетически кодируемого белка KillerRed на опухолях животных. Из полученных результатов
можно сделать вывод, что данный белок потенциально может рассматриваться как
генетически-кодируемый фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии опухолей.
ИССЛЕДОВАНИЕ НОВОГО КЛАССА НАНОМАТЕРИАЛОВ
БИОМЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ
Миронова Е.А.
ИТЭБ РАН
mironova_e27@rambler.ru
63
Биофизика клетки, органов и систем
В настоящее время значительно расширяется область использования магнитных
наночастиц в медицине и биологии, в частности, для фотодинамической терапии, магнитной
гипертермии, адресной доставки лекарств, введения магнитных диагностических меток.
Оксиды и оксогидроксиды железа являются перспективной биосовместимой магнитной
фазой, которая может существовать в виде наночастиц различной морфологии, зависящей от
модификации и условий синтеза. Однако, использование суспензий наночастиц в воде или
физиологических жидкостях ограниченно из-за процессов коагуляции. Одним из способов
решения подобных проблем является создание композитов, в которых магнитные наночастицы
заключены в водорастворимую матрицу, и не подвергаются агрегации и процессам старения, а
при растворении высвобождаются с сохранением химического и фазового состава. Другой
возможный подход заключается в создании суспензий поверхностно-модифицированных
частиц или частиц типа «ядро-оболочка», которые одновременно позволяют осуществлять
дальнейшую модификацию частиц.
Исследуемые наночастицы были получены методом пиролиза аэрозолей с образованием
соляных «микрокапсул» с размером ~ 1 мкм, содержащие в своём составе монодисперсные
наночастицы ~ 10. В данной работе определяли размерность наночастиц в культуральной среде
ДМЕМ и исследовали цитотоксичность наночастиц оксидов и оксогидроксидов железа:
сфероидные наночастицы ферроксигита δ-FeOOH, стержнеобразные наночастиц маггемита γFe2O3, гумата Fe, сфероидные наночастицы маггемитая.
Исследование распределения наночастиц по размеру проводили методом измерения
динамического светорассеяния на N5 Submicron Particle Size Analyser «Beckman Coulter».
Приготовление суспензии наночастиц в культуральной среде DMEM приводит к образованию
субмикронных агломератов. Наименьшие размеры частиц наблюдали в суспензии гумата
железа. Поэтому для дальнейших исследований рекомендуется использование наночастиц
гумата железа.
Для оценки цитотоксичности магнитных наночастиц проводили МТТ тест на культурах
клеток NCTC clone L929. Результаты анализа показали, что данные наночастицы не являются
токсичными для клеточной культуры фибробластов подкожной соединительной ткани мышей.
Это дает возможность разработки новых препаратов на основе соединений железа (III).
ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ NADPH ОКСИДАЗЫ ПРИ РЕЦЕПТОРОПОСРЕДОВАННОЙ АКТИВАЦИИ ГРАНУЛОЦИТОВ БОЛЬНЫХ
АУТОИММУННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
Нгуен Тхи Нга, Филина Ю.В.
ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», ГБОУ ДПО
КГМА Минздравсоцразвития России
taktash@mail.ru
Целью работы было изучение оксидазной активности гранулоцитов больных
аутоиммунными заболеваниями (ревматоидным артритом (РА) и системной склеродермией
(ССД)) при стимуляции опсонизированным зимозаном или формилированным пептидом.
Оксидазная активность клеток оценивалась по люминол-зависимой хемилюминесценции.
Обнаружено повышение спонтанного уровня генерации супероксид аниона покоящимися
гранулоцитами больных ССД, ранним и продвинутым РА по сравнению со здоровыми
донорами.
Мы наблюдали двукратное повышение амплитуды ответа при стимуляции гранулоцитов
опсонизированным зимозаном у больных с продвинутым РА и почти трехкратное повышение
ответа у больных с ранним РА по сравнению с контролем. Для больных ССД характерно
незначительное снижение ответа на опсонизированный зимозан. Формилированный пептид
fMLF также вызывал почти двукратное повышение респираторного ответа у больных с ранним
и продвинутым РА по сравнению с контролем; у больных ССД, напротив, ответ на fMLF
практически отсутствовал.
Таким образом, выявлено усиление оксидазной активности гранулоцитов больных РА при
стимуляции Fc-рецепторов, рецепторов компонентов системы комплемента и рецепторов
64
Биофизика клетки, органов и систем
формилированных пептидов, тогда как у больных ССД рецептор-стимулированная активация
NADPH оксидазы ослаблена. Воспалительные факторы, белки острой фазы и продукты
окисления липидов и белков оказывают регуляторное воздействие на оксидазную активность
гранулоцитов. Одним из механизмов модуляции оксидазного ответа может быть предактивация
оксидазы, т.е. дополнительное фосфорилирование компонентов оксидазы либо изменение
экспрессии NADPH оксидазы вследствие хронической стимуляции АФК-продуцирующих
клеток in vivo. Фосфорилирование p47phox компонента оксидазы является необходимым шагом
в активации оксидазы гранулоцитов.
Стимуляция гранулоцитов форболовым эфиром, необратимым активатором протеинкиназы
С, показала, что функциональное состояние NADPH оксидазы пациентов не отличается от
таковой у здоровых доноров, т.е. ослабление рецептор-опосредованных ответов не связано с
нарушением в функционировании оксидазы, но может быть обусловлено нарушениями на
уровне рецепторов и передачи сигнала. Ответ на форболовый эфир гранулоцитов у больных РА
был также повышен, вероятно, вследствие предварительной активации или повышенной
экспрессии NADPH оксидазы. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 09-04-97053.
КОНФОРМАЦИОННАЯ ДИНАМИКА ГОРМОН-АКТИВИРУЕМЫХ G-БЕЛОК
СОПРЯЖЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ.
Новиков Г.В., Сивожелезов В.C.
Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
0wn3r@bk.ru
Рецепторы, сопряжённые с G-белком (G protein-coupled receptors, GPCRs) относятся к
наиболее обширному классу трансмембранных (ТМ) рецепторов . Известно, что данный класс
мембранных рецепторов опосредует отклик на такие внеклеточные сигналы, как гормоны и
нейромедиаторы, пахучие вещества и световые стимулы. В связи с этим очевидна
терапевтическая значимость GPCRs, являющихся основными мишенями для большинства
лекарственных средств .
В рамках данной работы, при помощи современных методов биоинформатики нами было
проведено сравнительное исследование структурной динамики трёх различных гормонактивируемых GPCR, а так же фотоактивируемого рецептора родопсина млекопитающих. В
результате были получены диаграммы, характеризующие основные структурные различия
между исследованными мембранными рецепторами. На данных диаграмах удалось отобразить
проекцию кристаллографических структур различных фотоинтермедиатов светового рецептора
родопсина, а так же известных структур гормон-активируемых (бета-адренергических и
аденозинового) рецепторов на плоскость так называемых “главных компонент”. Одним из
основных достоинств родопсинового рецептора являются обширные экспериментальные
данные. Например, в литературе достаточно давно уже были описаны основные отличия между
отдельными фотоинтермедиатами данного белка, исходя из различий в их спектральных
свойствах. С другой стороны, для гормон-активируемых мембранных рецепторов выделить
отдельные промежуточные состояния подобным образом пока еще не удалось. Наконец, на
сегодняшний день известно, что активация всех родопсин-подобных GPCR сопровождается
крупномасштабными движениями их отдельных ТМ доменов, что является предпосылкой
инициации контакта со специфическими G-белками. Наряду с этим, прямое сравнение
большого количества экспериментальных структур различных рецепторов друг с другом, а так
же, относительно выбранного контроля до настоящего времени никем не проводилось. Таким
образом, на основании полученных нами результатов, можно детально анализировать
функционально-значимую структурную динамику различных GPCR одновременно по двум
параметрам: движению их отдельных ТМ спиралей, а так же внеклеточных петель.
В итоге, предложенный нами метод может быть использован для сравнительных
исследований структурной динамики мембранных рецепторов, исходя из их пространственных
структур. При этом, выборка кристаллографических структур родопсина может быть
использована в качестве контроля. С другой стороны, выборки исследуемых (например,
гормон-активируемых) рецепторов, могут быть получены как при помощи современных
65
Биофизика клетки, органов и систем
физических методов (например, кристаллографии, либо ЯМР анализа ), так и на основании
моделей, полученных при помощи методов компьютерного моделирования. Таким образом,
предложенный в данной работе подход помимо выраженной фундаментальной значимости
обладает так же и прикладным значением, в области разработки и дизайна новых
лекарственных препаратов.
ДЕЙСТВИЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РЯДОВ СИНТЕТИЧЕСКИХ
АНТИОКСИДАНТОВ НА СТРУКТУРУ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ МЕМБРАНЫ.
Паршина Е.Ю.1, Лунева О.Г.1, Гендель Л.Я.2, Рубин А.Б.1
1
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический
факультет; 2Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва
parshinae@gmail.com
Методами спиновых зондов и сканирующей электронной микроскопии в широком
диапазоне концентраций изучено влияние комбинированных антиоксидантов – ихфанов на
структуру эритроцитарной мембраны и морфологию эритроцитов и синтетических
антиоксидантов
и
биорегуляторов
–
представителей
ряда
производных
5гидроксибензимидазола (5-ГБИ). Выявлены структурные изменения эритроцитарной
мембраны, обусловленные встраиванием в мембрану и распределением во внутримембранном
пространстве ихфанов – препаратов нового поколения, обладающих комбинированным
антиоксидантным и антихолинэстеразным действием.
Установлено, что производные ряда ихфанов способны индуцировать уменьшения
микровязкости различных по удаленности от поверхности эритроцитарной мембраны областей
внутримембранного пространства. Морфологические трансформации эритроцитов под
влиянием ихфанов (индукция эхиноцитов и стоматоцитов) свидетельствуют о том, что
антиоксидантное действие производных этого ряда соединений может реализоваться как во
внешнем, так и во внутреннем монослоях эритроцитарной мембраны. Методом спиновых
зондов показано, что наиболее гидрофобные производные ряда 5-ГБИ, имеющие бензильный
заместитель, оказывают структурно-модифицирующее действие на мембрану, выражающееся в
изменении кинетики встраивания спинового зонда в мембрану и емкости мембраны для этого
соединения. Установлено, что все изученные производные проявляют эхиноцитогенное
действие. Это указывает на то, что области распределения производных ряда 5гидроксибензимидазола расположены во внешнем монослое эритроцитарной мембраны.
Определены различия в распределении и эффективности модифицирующего действия разных
по гидрофобным свойствам производных рядов ихфанов и 5-ГБИ.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА В ГЕПАТОЦИТАХ
РАЗЛИЧНОЙ ПЛОИДНОСТИ
Пильщикова Н.С., Кудрявцев Б.Н.
СПбГТИ(ТУ); Институт Цитологии РАН
yalie@yandex.ru
Явление полиплоидии состоит в кратном гаплоидному увеличении числа хромосом в
соматической клетке. При этом степень плоидности клеток может увеличиваться во много раз
(до 16-ти, 32-х и выше). Полиплоидия широко распространена в природе, тем не менее,
сведения о данном явлении весьма скудны и противоречивы. Главным образом, споры
вызывает вопрос о биологической роли соматической полиплоидии.
Ещё в 60х годах прошлого века было показано, что полиплоидная клетка при небольших
степенях полиплоидизации, свойственных тканям млекопитающих, является функциональным
аналогом соответствующего числа диплоидных клеток. То есть полиплоидия, не изменяя
активности одного генома, даёт клеткам другие преимущества, такие как большая генетическая
устойчивость в случае мутагенных воздействий или возможность сокращения митотического
66
Биофизика клетки, органов и систем
цикла для клеток, пролиферация которых происходит наравне с активными
тканеспецифическими синтезами.
Однако в недавно выполненных работах было показано, что синтетическая активность
клеток снижается с ростом их плоидности; был сделан вывод о том, что полиплоидия является
вынужденным состоянием и, хотя она увеличивает выживаемость клеток в стрессовых
ситуациях, приводит, тем не менее, к снижению функционального потенциала тканей.
Получается, что последние данные противоречат результатам, полученным ранее, хотя в обоих
случаях зависимость содержания белка от плоидности клеток (показатель синтетической
активности клеток) измерялась сходными методами.
Из приведённых выше сведений вытекает цель данной работы – сравнение содержания
белка в гепатоцитах различной плоидности. Содержание белка и ДНК в гепатоцитах крысы мы
измеряли классическими цитофотометрическими методами аналогично тому, как это делалось
ранее. При этом мы постарались учесть как можно больше факторов, вызывающих
погрешности в измерениях, являющиеся причиной возможного искажения результатов.
Измерения мы проводили на гепатоцитах крысы. Препарат первоначально картировали,
затем измеряли оптическую плотность неокрашенных клеток (для учёта неспецифических
потерь света), затем окрашивали клетки на белок нафтоловым жёлтым S и измеряли их
оптическую плотность, смывали краситель в этиловом спирте, окрашивали клетки аураминомSO2 на ДНК и измеряли интегральную яркость ядер.
В результате проведённой работы мы обнаружили, что с увеличением количества копий
хромосом в клетках растёт и содержание белка в них, и при этом содержание белка
увеличивается строго пропорционально увеличению содержания генетического материала.
Кроме того, статистические расчёты показали, что для двуядерных и одноядерных клеток
одной степени плоидности содержание белка одинаково в пределах погрешности.
Соответственно, не подтверждаются последние данные об уменьшении содержания белка в
клетках в расчёте на геном с ростом их плоидности. Можно считать необоснованным и вывод о
функциональной неполноценности полиплоидных клеток.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ,
СИНТЕЗИРОВАННЫХ В ОБОЛОЧКЕ ЦИТРАТНЫХ ИОНОВ, С
МОДЕЛЬНЫМИ ФОСФОЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ.
Попов А.Л.1, Григорьев П.А.2
1
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН; 2ФГБУН
Институт биофизики клетки РАН
toshka_bf@mail.ru
Метод бислойных липидных мембран с успехом используется для изучения молекулярных
механизмов биологической активности широкого спектра органических соединений. Метод
также используется для исследования механизмов их антибактериального действия и
механизмов биологической токсичности. Липидный бислой как составная часть биологических
мембран может оказаться мишенью действия различных факторов окружающей среды,
мишенью действия препаратов применяемых в медицине. Искусственные фосфолипидные
мембраны являются адекватными моделями липидного матрикса клеточных мембран, что
обуславливает перспективность их использования в исследованиях механизмов действия
физиологически активных препаратов на биосистемы.
Диапазон измеряемых токов: 10 – 12 - 10 -3 А. Регистраторы тока аналогичны тем, что
используются в установках PatchClamp. Для формирования липидных мембран использовался
фосфатидилхолин (Sigma, 5638), растворенный в гептане до концентрации 10 мг/мл. Диапазон
протестированных концентраций наночастиц СеО2составил 10 -7 – 10 -3 М.
В работе использовались наночастицы диоксида церия СеО2, синтезированные с
использованием биосовместимой лимонной кислоты в качестве стабилизатора.
Предварительно, был проанализирован гидродинамический радиус наночастиц на приборе
Beckman Coulter Nanosizer N5, который составил 5-7 нм. Концентрация исходного водного
раствора СеО2 была равна 10 -2 М.
67
Биофизика клетки, органов и систем
При введении наночастиц в ячейку проводимость мембраны при всех использованных
концентрациях СеО2 не превышает исходной контрольной проводимости. Проводимость
мембраны, измененная действием аламетицина (вещество, формирующее пору в мембране)
примерно на 3 порядка превышает контрольную. Таким образом СеО2 в диапазоне
концентраций от 10 -7 до 10 -3 М не влияет на проводимость лецитиновых мембран. Полученные
результаты хорошо коррелируют с данными об отсутствии эффектов токсичности СеО2 (в
концентрациях 10-5 – 10-11 М), полученными на культурах клеток млекопитающих.
АНАЛИЗ ЭКЗО- И ЭНДОГЕННЫХ ВЛИЯНИЙ НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ
СЕРДЕЧНОГО ЦИКЛА СУСЛИКА ПРИ СПРОВОЦИРОВАННОМ
ПРОБУЖДЕНИИ
Попова С.С.
Филиал Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова в г.
Пущино (Россия)
sp_fh@mail.ru
Гибернирующие животные, в отличие от большинства млекопитающих, способны без
негативных последствий уменьшать частоту сердечных сокращений при понижении
температуры тела до 0ºC. Существуют огромные перспективы использования данных свойств
гибернантов в медицине. Однако до настоящего времени нет количественных оценок режимов
саморазогрева организма гибернантов, нет полноценных сведений о роли сердечно-сосудистой
системы и вкладе ЦНС в процесс пробуждения.
Цель настоящей работы состоит в анализе экзо- и эндогенных механизмов разогрева
суслика в условиях спровоцированного пробуждения и роли ЦНС в этом процессе.
Исследования выполнены на гибернирующих якутских сусликах Spermophilus undulatus обоих
полов массой 594±39 г в период спячки (декабрь - февраль).
Нами экспериментально было показано, что у спровоцировано пробуждающегося суслика,
при разогреве от 1,0°С до 37°С, существуют принципиально различные этапы разогрева
организма и, соответствующие этим этапам, режимы регуляции сердечного цикла.
Также нами показано, что существует по крайней мере три эндогенных источника
саморазогрева: первый (удельной мощностью менее 0,0006 Вт/г) активируется сразу после
пробуждения, второй (удельной мощностью 0,0014 Вт/г), активируется при достижении
сердечной температуры 10 - 12°С и третий (с удельной мощностью 0,216 Вт/г), который
активируется при достижении температуры сердца 19 - 20°С. В температурном диапазоне 18оС
- 21оС синхронизировано 2 процесса: 1) включение мощного эндогенного источника разогрева;
2) резкое усиление влияния ЦНС на сердечный ритм, приводящее к сокращению длительности
сердечного цикла.
Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям: к. б. н.,
заведующей лаборатории механизмов природных гипометаболических состояний ИБК РАН
Захаровой Н.М. и д. ф.-м. н., ведущему научному сотруднику лаборатории биофизики
внутриклеточной регуляции ИТЭБ РАН Асланиди К.Б.
ВЛИЯНИЕ НАНОПОРОШКОВ С ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ ЦЕНТРОМ ER/YB НА
СЕКРЕЦИЮ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ НЕЙТРОФИЛЬНЫМИ
ГРАНУЛОЦИТАМИ
1
Пудовкина Е.Е. , Плескова С.Н.1,2, Горшкова Е.Н.2, Маланина Н.В.2
1
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева;
2
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
pudovkina-kat@mail.ru
Нанокристаллические материалы на основе ортофосфатов, легированных катионами эрбия
и иттербия, обладающих благодаря реализации эффекта ап-конверсии приемлемыми
68
Биофизика клетки, органов и систем
люминесцентными характеристиками (возбуждение, эмиссия), являются перспективными для
биоимиджинга. В их состав входят вещества, которые являются неотъемлемыми
составляющими живых систем, поэтому предположительно они являются малотоксичными для
биологических объектов.
Целью данной работы стало исследование влияния флюоресцентных наночастиц состава
Ca9Er0,14310Yb0,8569(PO4)7 и Ca9Er0,0909Yb0,90909(PO4)7 на активность миелопероксидазы
нейтрофильных гранулоцитов человека. Миелопероксидаза локализуется в азурофильных
гранулах клеток и является одним из важнейших факторов кислородзависимого механизма
неспецифической резистентности нейтрофильных гранулоцитов.
Нейтрофильные гранулоциты для исследований выделяли из гепаринизированной
венозной крови здоровых доноров на двойном градиенте фиколл-урографина по методу
Подосинникова И. С. Определение миелопероксидазы проводилось цитохимическим методом
(метод Грэхема-Кнолля). Принцип этого метода заключается в окислении бензидина
пероксидом водорода в оксибензидин в присутствии миелопероксидазы. Нейтрофильные
гранулоциты (2·106 кл/мл) инкубировали с наноматериалами (30 мин, 37 ˚С), взятыми в
конечной концентрации 10-4 М , готовили и микроскопировали цитоспиновые препараты. В
каждом мазке подсчитывали 100 клеток. Внутриклеточное содержание фермента оценивалось
по величине среднего цитохимического коэффициента (СЦК).
Контрольное значение СЦК составило 1,62±0,42. Для клеток после инкубации с
нанопорошком состава Ca9Er0,14310Yb0,8569(PO4)7 и Ca9Er0,0909Yb0,90909(PO4)7 – 1,91±0,38 и
1,79±0,27 соответственно.
Статистически значимого влияния на ферментативную активность нейтрофильных
гранулоцитов для обоих типов флюорофоров не выявлено, однако наблюдается тенденция к
увеличению секреции миелопероксидазы клетками.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 11-04-97036-р_поволжье_а.
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ В КЛЕТКАХ
НЕЙРОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ SK-N-SH БЕЛКОМ HOMER 1С
Пупышев А.А., Рязанцева М.А., Казначеева Е.В.
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия.
Alex2-92@mail.ru
Активация рецепторов в плазматической мембране (ПМ) нервных клеток, сопряженных с
G белками, активирующими фосфолипазу С – например, метаботропных глутаматных
рецепторов (mGluR)- приводит к повышению концентрации IP3, активации рецептора к IP3
(IP3R) и выбросу Ca2+ из просвета эндоплазматического ретикулума (ЭР) через канал IP3R.
Повышение концентрации Ca2+в цитоплазме, активирует рианодиновый рецептор (RyR), что
также приводит к выбросу кальция из ЭР. В результате понижения концентрации Ca2+в ЭР
происходит передача сигнала кальциевыми сенсорами ЭР на депо-управляемые Ca2+-каналы
(Ca2+-SOCs) в ПМ, их активация и вход кальция в клетку. Субъединицы Ca2+-SOCs белки TRPC
и mGluR 1 и 5 типа, RyR и IP3R являются белками, с которыми специфически связывается
адаптерный белок Homer 1c, узнающий аминокислотную последовательность PPXXF, где X –
это любая аминокислота. Тетрамеры Homer 1c, связанные с белками-мишенями, формируют
большие молекулярные комплексы и организуют передачу сигнала. Сделано предположение,
что адаптерный белок Homer 1c может участвовать в регуляции депо-управляемого входа Ca2+
по пути, сопряженному с фосфолипазой С.
Для изучения активности Ca2+-SOCs, использовался метод локальной фиксации потенциала
в конфигурации «целая клетка». В клетках нейробластомы линии SK-N-SH опустошение депо 1
мкМ блокатором кальциевых АТФаз SERCA тапсигаргином вызывало активацию депоуправляемого кальциевого входа. В этом случае опустошение депо происходило пассивно за
счет утечки Сa2+ из ЭР по градиенту концентрации. Аппликация 25 мкМ селективного агониста
мускаринового ацетилхолинового рецептора карбахола активировала ток больший по
амплитуде, чем аппликация тапсигаргина. При этом активация входа кальция связана с
активацией G белка и фософлипазы С. Добавление в раствор регистрирующей пипетки 1 мкМ
69
Биофизика клетки, органов и систем
пептида PPKKFR, разобщающего связь Homer 1c с белками-мишенями, вызывало активацию
тока большего по амплитуде, чем ток, активируемый при пассивном опустошении депо, но
идентичный току в ответ на карбахол. Добавление в раствор регистрирующей пипетки
контрольного пептида PPKKRR, не распознаваемого Homer 1c в качестве лиганда, не вызывало
активации входа кальция в клетку, но в этих же экспериментах, аппликация тапсигаргина
вызывала активацию депо-управляемого кальциевого входа. Приложение блокатора IP3R 2APB (2-Aminoethoxydiphenyl borate) в концентрации 50 мкМ инактивировала ток как на
карбахол, так и на пептид PPKKFR. Можно сделать вывод, что разобщение связи белка Homer
1c с белками мишенями активирует вход кальция в клетку через путь, сопряженный с
активацией фосфолипазы С.
Работа поддержана РФФИ.
ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ РЯДА АНФЕНОВ НА МОРФОЛОГИЮ
ЭРИТРОЦИТОВ И СТРУКТУРУ МЕМБРАНЫ ЛИПОСОМ
Рахбанова З.М., Паршина Е.Ю., Володькин А.А., Гендель Л.Я.
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический
факультет; Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН, Москва
fatfree23@gmail.com
Новые синтетические антиоксиданты – анфены, являющиеся производными L-тирозина,
синтезированы в ИБХФ им. Н.М.Эмануэля РАН. Они содержат трет-бутильные заместители в
орто-положении от гидроксильной группы, а алифатические заместители различной длины.
Целью работы было исследование влияния четырех представителей ряда анфенов (А-1 – А-4)
на поверхностную архитектонику эритроцитов и структуру мембран липосом, а также
сравнительный анализ эффективности их действия.
Оценка гидрофобности исследованных соединений была проведена с помощью расчета
теоретических значений коэффициентов распределения в системе октанол-вода (Kow) с
использованием программы EpiSuit (KowWin), в основу которой положен метод суммирования
гидрофобности фрагментов соединения.
Значения коэффициентов распределения
увеличивались в ряду А-1 - А-4.
Известно, что изменения формы эритроцитов, индуцируемые интеркалирующими в
мембрану химическими агентами, согласно представлениям, развитым в работах Шитса и
Сингера, отражают особенности распределения этих веществ во внутримембранном
пространстве. Получение информации об особенностях распределения синтетических
антиоксидантов и других биологически активных веществ в клеточных мембранах важно для
понимания механизмов действия этих агентов.
Методом оптической микроскопии в широком диапазоне концентраций было изучено их
влияние на морфологию эритроцитов крысы. Анфены способны изменять морфологию
эритроцитов, оказывая эхиноцитогенное (А-1), стоматоцитогенное (А-2 – А-4 ) действия.
Эффекты производных являются концентрационно-зависимыми. Наиболее выраженное
действие проявляет А-3.
Методом спиновых зондов было изучено влияние антиоксидантов на мембрану липосом. В
работе были использованы спиновые зонды 5- и 16-доксил стеарат (ДС), позволяющие
получать информацию о структуре различных областей внутримембранного пространства.
Показано, что в поверхностных областях мембраны А-1 – А-3 вызывают увеличение
упорядоченности, тогда как А-4 - ее уменьшение. Во внутренних областях мембраны А-1 и А-2
вызывают незначительное увеличение микровязкости мембраны, в то время, как А-3 и А-4
индуцируют уменьшение микровязкости. Эффективность действия вещества зависит от его
гидрофобности.
Таким образом, установлено, что производные ряда анфенов способны интеркалировать в
эритроцитарную мембрану, индуцируя в ходе мембранного транспорта изменения морфологии
эритроцитов и структуры мембраны липосом. На основании полученных данных можно
сделать предположения о локализации соединений во внутримембранном пространстве.
70
Биофизика клетки, органов и систем
ВРЕМЕННАЯ ЗАВИСИМОСТЬ ГИДРОЛИЗА АТФ Na+/K+-АТФазой
ЕМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ВЬЮНА
Романюк М.С., Мандзинец С.М., Бура М.В., Санагурский Д.И.
Львовский национальный университет имени Ивана Франко
myrosik@mail.ru
+
+
Фермент Na /K -АТФ-аза характеризируется кинетическими и каталитическими
свойствами,
выяснение
которых
необходимо
для
понимания
закономерностей
функционирования Na/K-насоса при физиологических условиях, так и при патологических
состояниях в течение эмбриогенеза. Исследование активности этого фермента даст
возможность глубокого понимания отдельных кинетических особенностей, механизмов
активации и инактивации Na+/K+-ATФазы при изучении зародышевых объектов, а также для
создания модели работы данного фермента при действии физических и химических факторов.
При исследовании кинетики накопления продукта Na+/К+-АТФазной реакции
продолжительность инкубации изменяли в диапазоне от 4 до 20 мин (интервал времени
инкубации составлял 1 мин). Кинетика накопления продукта АТФ-гидролазной реакции –
фосфата – удовлетворяет закономерностям реакции нулевого порядка: зависимость линейная с
выходом на плато после 15 мин инкубации. Нами показано, что кривая динамики активности
данного фермента имеет перегиб в точках, которым соответствует время инкубации 10–11 мин.
Очевидно, что после полного насыщения субстратом первого активного центра данного
фермента имеет место процесс насыщения второго активного центра энзима.
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА НА ЦЕЛОСТНОСТЬ МЕМБРАНЫ
ЭРИТРОЦИТОВ
Сарычева А.С. , Паршина Е.Ю.
МГУ
assergevna@gmail.com
Одним из актуальных направлений современной науки является создание частиц,
использующихся
в
биомедицинских
исследованиях
для
усиления
сигнала
комбинационного рассеяния света, регистрируемого от объектов: клеток, белков,
мембран. Поскольку усиление сигнала комбинационного рассеяния коллоидными частицами
серебра или золота вследствие плазмонного резонанса происходит в том случае, когда
расстояние между молекулой, комбинационно рассеивающей свет, и поверхностью частиц
составляет не более 10-20 нм, можно исследовать свойства примембранного гемоглобина,
который, является важным звеном в процессе переноса кислорода. В то же время известно, что
коллоидные частицы благородных металлов ввиду своей реакционной способности могут
оказывать деструктивное воздействие на живые клетки.
Информация о механизмах влияния наночастиц на клетки крови человека позволит
сконструировать наночастицы, обладающие оптимальными характеристиками для усиления
сигнала
КР
и
не
оказывающие
деструктивного
влияния
на
клетки.
В
связи с этим целью данной работы является определение механизма влияния
коллоидных растворов серебра на мембрану эритроцита.
Для достижении данной цели, первостепенной задачей являлось определение состояния НЧ
в среде инкубации клетки. Для инкубации эритроцитов используется буфер Аллена со
значительный содержанием хлорид-ионов, которые обладают сродством к ионам серебра, а
значит равновесие серебро в растворе – серебро в твердой фазе нарушается, что приводит к
снижению содержания ионов серебра в растворе. В то же время известно, что ионы серебра
оказывают токсическое влияние на живые клетки. Исходя из этого, мы поставили перед собой
следующие задачи: 1. Оценить влияние ионов серебра на эритроциты 2. Подобрать бесхлорную
среду, оптимальную для инкубации клеток 3. Оценить влияние бесхлорного буфера на клетки,
наночастицы
и
клетки
с
наночастицами 4. Оценить степень гемолиза клеток при действии различны НЧ серебра 5.
Выявить локализацию наночастиц на поверхности эритроцита.
71
Биофизика клетки, органов и систем
В ходе проделанной работы был подобран буфер для инкубации клеток, содержащий
нитрат-ионы вместо ионов хлора. Синтезированы НЧ серебра по методу Леопольда-Лендла,
определён размер частиц, дзета-потенциал и положение максимума плазмонного резонанса.
Показано, что разрушению клетки при добавлении НЧ предшествует изменение формы.
Выявлено, что нано частицы в нитратом буфере оказывают большую деструкцию, чем в буфере
Аллена, это позволяет предположить, что разрушающее действие на клетку оказывают ионы
серебра, которые в случае буфера Аллена связываются хлорид-ионами. Показано, что частицы
коллоидного серебра адсорбируются на поверхности эритроцита.
НОВЫЙ БЕЛОК ИЗ ТОНКИХ НИТЕЙ ЗАПИРАТЕЛЬНОЙ МЫШЦЫ МИДИИ
ГРЕЯ
Симонян А.О., Крутецкая З.И., Добржанская А.В., Шелудько Н.С., Сиренко В.В.,
Боровиков Ю.С.
Санкт-Петербургский государственный университет, Институт биологии моря им. А.В.
Жирмунского ДВО РАН, Институт цитологии РАН
armen1989s@gmail.com
Недавно был выделен новый актин-связывающий белок из тонких нитей запирательной
мышцы мидии Crenomytilus grayanus с молекулярной массой 40 кДа (ABP40). Решающим
фактором, определяющим содержание ABP40 при его выделении, оказалась температура. При
температуре 220C экстрагирующего раствора ABP40 в высоком количестве соосаждается с
актином, тогда как при 20С–остается в супернатанте. Было показано, что ABP40 ингибирует
Mg2+-АТФазную активность актомиозина гладких мышц. Определение аминокислотной
последовательности ABP40 показало 40% гомологию с 45-кДа кальпониноподобным белком из
мышцы переднего биссусного ретрактора мидии Mytilus galloprovincialis и в связи с
структурно-функциональными
особенностями,
ABP40
был
назван
как
новый
кальпониноподобный белок (усл. CLP40).
В представленной работе с помощью метода поляризационной флуориметрии исследовали
влияние CLP40 на конформационное состояние актомиозина (АМ) в теневом мышечном
волокне (GF) при моделировании некоторых стадий АТФазного цикла. Модификацию
субфрагмента 1 миозина (S1) осуществляли при помощи флуоресцентного зонда 1,5-IAEDANS.
В полученных результатах оценивали следующие параметры: степень поляризации
флуоресценции Р при ориентации GF перпендикулярно P^ и параллельно P‖ плоскости
поляризации возбуждающего света, углы ориентации осцилляторов поглощения и излучения
(ΦА и ΦЕ, соответственно), количество хаотически расположенных осцилляторов N. Ход
эксперимента контролировали ПААГ-электрофорезом в присутствии NaDodSO4. При
декорировании S1-1,5-AEDANS в GF оказалось, что число хаотически расположенных
осцилляторов N в структурном состоянии А•М составляет ~30%; следовательно, относительное
число ориентированных – 70%, что свидетельствует о том, что в состоянии А•М головки
миозиновых молекул обладают высокой аффинностью и жестко связаны с F-актином при
формировании так называемой сильной формы связывания. С добавлением в систему CLP40
параметр N увеличивался на 18% и угол наклона флуоресцентного зонда 1,5-AEDANS ФЕ
также увеличивался с 42,5 до 44,7 град.
Аналогичные результаты получаются в отсутствие CLP40 при моделировании стадии
А•М•АДФ•Фн. Так как флуоресцентная метка 1,5-AEDANS присоединяется к Cys707, который
локализован в каталитическом домене на конце короткой α-спирали, полученные данные
можно объяснить тем, что 40-кДа белок, по-видимому, сдвигает головку миозина с места на
актине, отвечающее за формирование сильной формы связывания и, скорее всего, тем самым
ослабляет взаимодействие актина с миозином. Предполагается, что этот белок конкурирует с
головкой миозина за сайт(ы) связывания S1 с актином и ингибирует существенные для
генерации силы формирование сильных форм связывания миозина с актином.
Работа была поддержана грантом РФФИ (проект 11-04-00244).
72
Биофизика клетки, органов и систем
МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ПАЛЬМИТАТ/СА2+-ИНДУЦИРУЕМАЯ ПОРА КАК
НЕСПИЦИФИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ВЫХОДА СА2+
Трудовишников А.С., Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В.
ИТЭБ РАН
idillviell@gmail.com
Известно, что транспорт митохондриями Са2+ играет фундаментальную роль в контроле
различных физиологических процессов, в то время как нарушение митохондриального
Са2+гомеостаза приводят к гибели клеток. Несмотря на многолетние исследования в этой
области, молекулярная природа переносчиков Са2+ через мембрану митохондрий остается
неясной. Известен ряд переносчиков, ответственных за поглощение Са2+ митохондриями, но
основную роль играет ингибируемый рутениевым красным (RR) Са2+ унипортер. Среди
структур, ответственных за высвобождение Ca2+ из митохондрий, следует отметить
таинственный H+/Са2+обменник и чувствительную к циклоспорину А (ЦсА) МРТ-пору, чьё
открытие, как правило, трагически сказывается на судьбе клетки.
В данной работе предполагается, что системой, ответственной за выброс Ca2+ из
митохондрий, может быть липидная пора, индуцированная пальмитиновой кислотой (ПК) и
Са2+. Открытие этой поры является кратковременным, не ингибируется ЦсА и после закрытия
пор функциональная целостность митохондрий восстанавливается. Ранее нами обнаружено, что
порообразование может быть результатом активации митохондриальной Ca2+-зависимой
фосфолипазы А2 (PLA2) и накопления свободных жирных кислот (в том числе ПК) в мембране
митохондрий.
Классическим экспериментом по обнаружению выхода Са2+ из митохондрий является
загрузка органелл одним импульсом Са2+, а затем ингибирование входа Са2+ рутениевым
красным. Для предотвращения образования MPT пор использовался 1 мкМ ЦсА. После добавки
Са2+, митохондрии достигают устойчивого состояния баланса между входом и выходом Са2+ (34 мин.), а после добавки RR наблюдается выход ионов Са2+. Ингибитор Ca2+-зависимой
PLA2AAC(O)CF3 (14мкМ) подавлял RR-индуцируемый выброс Са2+, в то время как ингибитор
Ca2+-независимой PLA2 BEL (10мкМ) был неэффективен. Кроме того, добавка ПК после
загрузки митохондрий Ca2+, приводит к небольшому выбросу Са2+, незначительному снижению
потенциала и высокоамплитудному набуханию митохондрий. Стоит отметить, что скорость
ПК-индуцированного RR-чувствительного выхода Са2+ из митохондрий была выше, чем в
отсутствии ПК.
По нашему мнению, самое простое объяснение полученных результатов состоит в том, что
липидная пора, индуцированная пальмитиновой кислотой и Са2+, способна участвовать в
рециклизации Са2+ как неспецифическая система выхода Са2+ из митохондрий и может
рассматриваться как ещё один потенциальный участник в механизме поддержания Са2+
гомеостаза.
Работа была поддержана грантами РФФИ (10-04-00920-а, 12-04-00430-а), и грантом
президента РФ для молодых кандидатов наук (МК-145.2012.4).
ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ NADPH ОКСИДАЗЫ ПРИ РЕЦЕПТОРОПОСРЕДОВАННОЙ АКТИВАЦИИ ГРАНУЛОЦИТОВ БОЛЬНЫХ
АУТОИММУННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
Нгуен Тхи Нга, Филина Ю.В.
ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», ГБОУ ДПО
КГМА Минздравсоцразвития России
taktash@ymail.com
Целью работы было изучение оксидазной активности гранулоцитов больных
аутоиммунными заболеваниями (ревматоидным артритом (РА) и системной склеродермией
(ССД)) при стимуляции опсонизированным зимозаном или формилированным пептидом.
Оксидазная активность клеток оценивалась по люминол-зависимой хемилюминесценции.
Обнаружено повышение спонтанного уровня генерации супероксид аниона покоящимися
73
Биофизика клетки, органов и систем
гранулоцитами больных ССД, ранним и продвинутым РА по сравнению со здоровыми
донорами. Мы наблюдали двукратное повышение амплитуды ответа при стимуляции
гранулоцитов опсонизированным зимозаном у больных с продвинутым РА и почти трехкратное
повышение ответа у больных с ранним РА по сравнению с контролем. Для больных ССД
характерно незначительное снижение ответа на опсонизированный зимозан. Формилированный
пептид fMLF также вызывал почти двукратное повышение респираторного ответа у больных с
ранним и продвинутым РА по сравнению с контролем; у больных ССД, напротив, ответ на
fMLF практически отсутствовал. Таким образом, выявлено усиление оксидазной активности
гранулоцитов больных РА при стимуляции Fc-рецепторов, рецепторов компонентов системы
комплемента и рецепторов формилированных пептидов, тогда как у больных ССД рецепторстимулированная активация NADPH оксидазы ослаблена. Воспалительные факторы, белки
острой фазы и продукты окисления липидов и белков оказывают регуляторное воздействие на
оксидазную активность гранулоцитов. Одним из механизмов модуляции оксидазного ответа
может быть предактивация оксидазы, т.е. дополнительное фосфорилирование компонентов
оксидазы либо изменение экспрессии NADPH оксидазы вследствие хронической стимуляции
АФК-продуцирующих клеток in vivo. Фосфорилирование p47phox компонента оксидазы
является необходимым шагом в активации оксидазы гранулоцитов. Стимуляция гранулоцитов
форболовым эфиром, необратимым активатором протеинкиназы С, показала, что
функциональное состояние NADPH оксидазы пациентов не отличается от таковой у здоровых
доноров, т.е. ослабление рецептор-опосредованных ответов не связано с нарушением в
функционировании оксидазы, но может быть обусловлено нарушениями на уровне рецепторов
и передачи сигнала. Ответ на форболовый эфир гранулоцитов у больных РА был также
повышен, вероятно, вследствие предварительной активации или повышенной экспрессии
NADPH оксидазы. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 09-04-97053.
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ И
ДИНАМИЧЕСКОГО СВЕТОРАССЕЯНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРОВ
МОЛЕКУЛ ИНУЛИНАЗ
Холявка М.Г., Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Гречкина М.В., Останкова И.В.,
Волкова С.А.
Воронежский государственный университет, Воронеж
holyavka@rambler.ru
Изучение структурных особенностей инулиназ (КФ 3.2.1.7) имеет теоретическое и
прикладное значение. Эти ферменты участвуют в углеводном метаболизме высших растений и
микроорганизмов, являются важнейшими компонентами сигнальных путей, играют одну из
ключевых ролей в контролировании процессов клеточной дифференцировки и развития. Они
также могут быть использованы в циклах производства сахаров с различной степенью
полимеризации, в частности, фруктозы и инулоолигосахаридов – неотъемлемых компонентов
функционального питания.
Цель данной работы заключалась в изучении структурной организации инулиназ из
различных продуцентов.
Путем сочетания атомно-силовой микроскопии с методами динамического светорассеяния,
гель-хроматографии и электрофореза были определены размеры и молекулярные массы
инулиназ различного происхождения, установлено, что инулиназы из Kluyveromyces marxianus
(радиус 6.1±0.2 нм, 63±2 кДа) и Aspergillusniger (радиус 12.6±2.4 нм, 102±4 кДа), а также
инулиназа I изHelianthus tuberosus (радиус 5.5±0.5 нм, 65±3 кДа) образуют гетеродимеры, а
инулиназы II (радиус 1.0±0.1 нм, 31±2 кДа) и III (радиус 1.1±0.2 нм, 25±1 кДа) представлены
мономерными формами.
Для разрушения четвертичной структуры ферментов мы использовали раствор
додецилсульфата натрия в концентрации 3.5·10-5 моль/л. Хотелось бы отметить, что даже в
нативном препарате дрожжевой инулиназы наблюдалось наличие частиц с радиусом 5.3±0.3
(0.1-1%) и 0.9±0.3 (0.3-5%) нм, в образцах изAspergillus niger – частиц с радиусами 4.6±0.8 (0.3-
74
Биофизика клетки, органов и систем
7.6%) и 1.6±0.4 (2-12.8%), а во фракции инулиназы I из топинамбура – 3.1±0.3 (0.2-14.6%) и
1.1±0.2 (1-12%) нм, которые, вероятно, соответствуют субъединицам фермента.
При добавлении додецилсульфата натрия во фракции инулиназы II и III не происходило
статистически достоверных изменений размеров радиусов частиц, которые составили
соответственно 0.9±0.1 и 1.0±0.1 нм, что подтверждает отсутствие надмолекулярной
организации у этих ферментов.
Наши результаты согласуются с данными литературы: размер молекулы инулиназы из
Aspergillus awamori составляет 64.726×82.041×136.075 Å (Arand et al., 2002).
Несмотря на потенциальную перспективу применения инулиназ в кондитерском деле,
фармацевтической промышленности и медицине, вопрос о существовании у них
надмолекулярной организации до сих пор окончательно не решен, до конца не установлены
эволюционные связи не только среди всех гликозидгидролаз, но и внутри группы инулиназ,
выделенных из различных продуцентов.
Возможно, процессы ассоциации-диссоциации инулиназы и родственных ей ферментов
играют важную роль в регулировании процессов метаболизма растений и микроорганизмов,
использующих в качестве запасных питательных веществ инулин, различные фруктаны и
фруктоолигосахариды.
РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ БУФЕРНЫХ СИСТЕМ В
РЕГУЛЯЦИИ КИНЕТИКИ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА В НЕРВНОМЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ ТЕПЛОКРОВНЫХ
Хузахметова В.Ф., Бухараева Э.А.
Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань (Россия)
venerik87@mail.ru
В нервно-мышечном синапсе ритмическая стимуляция двигательного нерва вызывает
изменение основных параметров процесса нейросекреции - числа освобождаемых квантов и
кинетики их выделения. Поскольку в ходе ритмической стимуляции в аксоплазме создаются
условия для накопления ионов Са2+, играющих ведущую роль в экзоцитозе синаптических
везикул, встает вопрос о роли внутриклеточных кальциевых буферных систем, регулирующих
концентрацию Са2+ в пресинаптической области при ритмической стимуляции.
Внутриклеточные Са2+-АТФазы закачивают излишки Са2+ в депо, а рианодиновые рецепторы
(РиР) регулируют выход Са2+ в аксоплазму. Однако как изменение активности Са2+-депо влияет
на выраженность синхронного и асинхронного освобождения квантов при ритмической
стимуляции до конца не известно. Цель работы: сопоставить временные параметры квантового
освобождения медиатора на фоне блокады Са2+-АТФаз тапсигаргином, а также при активации и
блокаде РиР при разных режимах частотной стимуляции двигательного нерва. С помощью
экстраклеточной регистрации одноквантовых токов концевой пластинки при сниженном
внеклеточном содержании Са2+ анализировали квантовый состав и истинные синаптические
задержки (временные интервалы, с которыми выделялись отдельные кванты после развития
пресинаптического спайка) на нервно-мышечном препарате мыши. Тапсигаргин (5 мкмоль/л)
увеличивал квантовый состав при повышении частоты стимуляции от 0.5 до 15 Гц, и
количество квантов в синхронной и асинхронной фазах секреции. Это объясняется тем, что при
действии тапсигаргина, блокирующего Са2+-АТФазы, происходит выброс Са2+ из
внутриклеточных депо и не устраняется Са2+, накапливающийся при ритмической стимуляции.
Активация РиР показала, что действие рианодина в активирующей концентрации (1 мкмоль/л)
не приводило к достоверному увеличению количества выделяющихся квантов медиатора,
которое можно было бы ожидать в случае выхода Са2+из депо вследствие активации РиР.
Однако наблюдалась тенденция увеличения доли асинхронно выделившихся квантов при
повышении частоты стимуляции. Блокада РиР рианодином (3 мкмоль/л), ТМВ-8 (25 мкмоль/л)
привела к снижению квантового состава и перераспределению квантов в разных фазах
секреции, в большей степени подавляя асинхронное освобождение. Отсутствие достоверно
выраженных эффектов рианодина в активирующей концентрации возможно обусловлено тем,
что при сниженной концентрации Са2+ в среде депо накапливают Са2+ недостаточно для того,
75
Биофизика клетки, органов и систем
чтобы при активации РиР он смог существенно повлиять на параметры секреции. Вместе с тем,
эффекты изменения активности Са2+-АТФаз и РиР на распределение квантов в синхронной и
асинхронной фазах свидетельствует о вкладе внутриклеточных буферных систем в модуляцию
временных параметров секреции медиатора и формирование амплитудно-временных
параметров постсинаптического ответа.
ДЕЙСТВИЕ ПРОТОПИНА, ДИГИДРОАТИЗИНА И ЗОНГОРИНА НА
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ В ТИМОЦИТАХ
КРЫСЫ
Чернова Л.А., Наджимова Х.К., Насиров К.Э., Усманов П.Б.
Институт физиологии и биофизики АН РУз, Ташкент (Узбекистан)
larisa_chern@mail.ru
Было изучено влияние алкалоидов протопина, дигидроатизина и зонгорина на изменение
уровня внутриклеточного Са2+ ([Ca2+]i) в тимоцитах крысы. Было показано, что алкалоиды
протопин и зонгорин вызывают дозозависимое снижение [Ca2+]i в тимоцитах крысы, в то время
как в присутствии дигидроатизина наблюдалось повышение [Ca2+]i. При этом действие
протопина обусловлено блокированием Са2+L-каналов плазматической мембраны и
увеличением Са2+ пула ЭПР. Зонгорин оказывал незначительное влияние на Са2+-каналы
плазматической мембраны, а его эффекты связаны с его влиянием на митохондриальный
кальциевый пул. Дигидроатизин вызывает опустошение Са2+ пула ЭПР за счет ингибирования
Са2+-АТФазы, но не оказывает существенного влияния на митохондриальный Са2+ пул и Са2+
каналы плазматической мембраны.
ВЛИЯНИЕ ВАРИАБЕЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА НА ФОТОСИНТЕЗ И
ДЫХАНИЕ ВЫСШЕГО РАСТЕНИЯ НА ПРИМЕРЕ ГОРОХА (PISUM SATIVUM
L.)
Шерстнева О.Н., Сурова Л.М., Румянцев Е.А., Неруш В.Н., Сухов В.С.
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний
Новгород (Россия)
sherstneva-oksana@yandex.ru
Электрические сигналы способны вызывать быстрое повышение устойчивости растений к
действию стрессоров. Это требует участия процессов энергообмена, что подтверждается
влиянием электрических сигналов на фотосинтез и дыхание. Однако данные о направленности
ответов и их параметрах противоречивы, а в случае дыхания немногочисленны. Исследование
параметров фотосинтеза и дыхания осуществлялось на растениях гороха (Pisum sativum L.) с
помощью измерительной системы, включающей PAM-флуориметр Dual-PAM-100 и
газоанализатор GFS-3000. Параллельно проводилась регистрация биопотенциалов с
использованием стандартной электрофизиологической установки с экстраклеточным
отведением. Показано, что ожог листа вызывал распространяющиеся электрические сигналы по
типу вариабельного потенциала (ВП). При прохождении ВП в исследуемый лист наблюдались
изменения параметров газообмена и световой стадии фотосинтеза. После начальной быстрой
стадии инактивации фотосинтеза (3–10 минут) наблюдалось частичное восстановление его
параметров, затем развивалась медленная стадия (30 минут – час и более). Инактивация
фотосинтеза проявлялась в снижении уровня ассимиляции СО2, уменьшении эффективности
переноса электронов в цепи и росте нефотохимического тушения. Снижение концентрации
внешнего СО2 частично подавляло быструю инактивацию и слабо влияло на медленную. Для
исследования влияния ВП на дыхание анализировались параметры газообмена листа в темноте.
Показано, что проходящий в лист ВП вызывал кратковременное увеличение интенсивности
дыхания, сопоставимое по длительности с быстрой инактивацией фотосинтеза. Полученные
результаты показывают, что ВП влияет на фотосинтез и дыхание у гороха. При этом вызванные
76
Биофизика клетки, органов и систем
ВП изменения энергообмена имеют скоординированный характер на небольших интервалах
времени. На длительных интервалах такой эффект не обнаружен (наблюдается лишь медленная
инактивация фотосинтеза). Вероятные различия в механизмах быстрой и медленной
инактивации подтверждают возможность разных путей участия энергообмена в формировании
вызванного ВП системного ответа растения на различных интервалах времени.
Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации для поддержки молодых
российских ученых (МК-1869.2012.4).
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ СА 2+ И FE 2+ НА ПРОЦЕССЫ АГРЕГАЦИИ И СЛИЯНИЯ
НАНОЛИПОСОМ ИЗ ФОСФАТИДИЛХОЛИНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ
ФЛАВОНОИДОВ
Ягольник Е.А., Музафаров Е.Н.
Тульский государственный университет
yea_88@mail.ru
Показано, что флавоноиды: кверцетин, таксифолин, катехин и морин в присутствии ионов
железа способны инициировать агрегацию липосом из пальмитоил-олеоил-фосфатидилхолина,
что сопровождается ростом светорассеяния. В присутствии катионов кальция указанный
эффект усиливается. Анализ обмена липидов между липосомами по величине FRET между
флуоресцентными
липидами
NBD-фосфатидилэтаноламин
и
лиссамин-родамин-Вфосфатидилэтаноламин показало, что кальций инициирует медленный процесс обмена липидов
между липосомами, развивающийся в течение десятков минут. При этом фотоннокорреляционная спектроскопия и электронная микроскопия замораживания-скалывания
обнаруживают увеличение размеров частиц, слияние липосом и образование гигантских
везикул. Указанные явления не наблюдались при использовании флоретина, не способного
образовывать комплекс с молекулами двухвалентного железа, а также рутина, не
взаимодействующего с фосфолипидным бислоем.
Полученные экспериментальные данные и компьютерные расчеты липофильности и
распределения зарядов в молекулах комплексов позволяют предположить, что молекулы
кверцетина, таксифолина, катехина и морина, находящиеся в соседних мембранах, могут
взаимодействовать друг с другом через мостик, образуемый катионами железа, что вызывает
адгезию липосом. Катионы кальция способствуют сближению мембран и инициируют слияние
липосом, поскольку могут образовывать мостики между фосфатными группами липидов
соседних бислоев.
Возможное участие флавоноидов в процессах адгезии мембран является еще одним
важным аспектом их влияния на организм и предположительно может оказывать влияние на
динамику процессов эндо- и экзоцитоза в клетке. Эти явления могут пролить свет на роль
растительных полифенолов в защите клеток от различных видов инфекции, протекающих с
участием эндоцитоза, или в развитии воспалительных процессов.
Возможно, что флавоноиды, участвуют также в процессах межклеточного взаимодействия
и коммуникации, где адгезия мембран играет существенную роль.
77
Математические проблемы биологии
СЕКЦИЯ «Математические проблемы биологии»
СИСТЕМНАЯ БИОЛОГИЯ МИТОГЕНЕЗА: УСПЕХИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО И
КАЧЕСТВЕННОГО ПОДХОДОВ
Кузьмина Н.Б., Буздин А.А., Зяблицин А.В., Жестков Б.Г., Крупнов А.В., Иванова
Е.Н., Громова Н.В., Смирнов Ф.Ю., Галяутдинова Ж.Ж., Борисов Н.М.
ФГБУ «ГНЦ – Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И.Бурназяна
ФМБА России», Москва (Россия)
nicolasborissoff@gmail.com
В последние годы отмечалось, что назначение раковым больным таргетных препаратов
(моноклональных антител – мабов, ингибиторов киназ – нибов и т.д.) по неполным данным об
уровне экспрессии отдельных белков-онкогенов может оказаться неэффективным из-за неучета
большого количества других онкогенов и онкосуппессоров, которые могут нейтрализовать
терапевтическое действие назначенного препарата [O'Shaughnessy J.О. et al. ASCO Annual
Meeting (2009), Giezen T.J. et al. JAMA 300 (2008) 1887]. С другой стороны, в биоинформатике и
системной биологии клетки за последнее десятилетие достигнут значительный прогресс в
качественном и количественном моделировании промитотических сигнальных путей. Такие
модели уже верифицированы нами для сигналов, инициированных ростовыми факторами,
антиапоптозными факторами, цитокинами и др. [Kiyatkin A. et al. J Biol Chem 281 (2006) 19925,
Borisov N. et al. Mol Syst Biol, 5 (2009) 256, Kuzmina N.B. and Borisov N.M. Intnl Proc of Chem,
Biol and Environ Engng 5 (2011) 76].
Мы разработали систему поддержки принятия решений о назначении противоопухолевых
препаратов, основанную на массиве данных о про- и антимитотических сигнальных каскадах в
клетке. Исходными данными для такой оценки являются:
- уровни экспрессии многих тысяч онкогенов и онкосуппессоров в злокачественных и
нормальных клетках для конкретного пациента, полученные, например, с помощью
микрочипирования матричной РНК клеток биоптата опухоли, а также в здоровых тканях,
окружающих опухоль.
- данные о механизмах действия, показаниях, противопоказаниях, а также стоимости
таргетных противоопухолевых препаратов (http://www.drugbank.ca).
- данные о белках, генах, входящих в состав сигнальных каскадов, способствующих или
препятствующих митогенезу (http://www.sabiosciences.com/pathwaycentral.ph).
К настоящему времени наша система поддержки принятия решений содержит данные о 74
сигнальных каскадах и 25 препаратах. Она испытана на 17 пациентах с раком мочевого пузыря,
проходивших лечение в МНИОИ им. П.А.Герцена, а также на 40 больных с опухолями головы
и шеи, проходивших лечение в Летбриджском университете (Канада).
ЗНАЧЕНИЕ РАСЧЕТА ОБЩЕГО ПРЕДКА ПО МУЖСКОЙ ЛИНИИ ДЛЯ
РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ СУДЕБНО ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ
Курганов С.К., Ахмедова Д.Ш., Икрамов А.А., Рахматуллаев Н.Н., Норматов Э.А.,
Филатова В.А., Мухамедова С.Ю., Тошева Д.М.
Республиканский центр судебной экспертизы им. Х.С. Сулеймановой, Ташкент
(Узбекистан)
kurganov_sardor@yahoo.com
В практике судебной генетической экспертизы бывают случаи, когда биологический след
на вещественных доказательствах оставлен неизвестным лицом мужского пола. В подобных
случаях наряду с определением генотипа неизвестного лица по STR-локусам ядерной ДНК
проводят исследования по Y-хромосоме. В большинстве случаев эти исследования приводят к
успешному раскрытию преступления. Но иногда, несмотря на большое число исследованных
образцов, подозреваемого невозможно идентифицировать. В большинстве таких случаев
исследуют образцы ДНК лиц, проживающих в одной и той же местности. В настоящее время
78
Математические проблемы биологии
для сужения круга подозреваемых проводят расчет времени жизни общего предка, с помощью
которого можно получить информацию о родственной близости и сузить круг подозреваемых
лиц. Также эти данные позволяют получить полезную информацию для популяционных
генетиков, лингвистов и историков.
Время жизни общего предка популяции вычисляется по совокупности гаплотипов его
потомков, принимая во внимание число мутаций, накопившееся в популяции, нормированное
на гаплотип или маркер, и на константу скорости мутации или частоту мутации в расчете на
поколение. Так же расчет времени жизни общего предка популяции позволяет делать
предположения о времени и направлениях миграции популяций в древности.
Для расчета времени жизни общего предка были собраны 400 образцов крови в 6 больших
роднях. Выделение ДНК проведено классическим методом фенол-хлороформной экстракции.
Фрагментный анализ 17 локусов STR-маркеров (DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS456, DYS19,
DYS385a, DYS385b, DYS458, DYS437, DYS438, DYS448, GATA_H4, DYS391, DYS392,
DYS393, DYS439, DYS635) проведен с использованием набора Y-filer PCR Amplification Kit
(Applied Biosystems, США) на секвенаторе ABI 3130xl (Applied Biosystems, США).
Статистический анализ гаплотипов проведен с помощью программы «Network 4.6». По
рассчитанным показателям частоты мутаций в двух семьях установлен общий предок,
объединяющий 15 поколений. В третьей и четвертой семьях установлен общий предок,
объединяющий 25 поколений. И в пятой и шестой семьях установлен общий предок,
объединяющий 46 и более поколений.
МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА C-КАДГЕРИНА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ
МОЛЕКУЛЯРНО-ДИНАМИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ
Лихачев И.В.1, Балабаев Н.К.1, Гесснер Р.2
1
Институт математических проблем биологии РАН, Пущино (Россия); 2Department of
Abdominal, Thoracic, Vascular and Transplant Surgery Leipzig University Hospital, Leipzig
(Germany)
ilya_lihachev@mail.ru
Молекулы семейства кадгеринов играют важную роль в процессах межклеточной адгезии.
Принято считать, что кадгерин – Ca2+-зависимый гликопротеин в составе межклеточных
контактов. Экстрацеллюлярная часть кадгерина состоит из 5 повторяющихся доменов EC1EC5. Согласно структуре C-Cadherin из Protein Data Bank (PDB), между доменами
располагаются по 3 иона Ca2+. Считается, что именно эти ионы влияют на механические
свойства белка, позволяя ему сохранять свою форму.
Работа посвящена исследованию механических свойств C-Cadherin методом молекулярной
динамики. Помимо структуры кадгерина из PDB, были проведены опыты с C-Cadherin с
заменой ионов Ca2+ на ионы Mg2+, K+ и Na+.
Моделирование молекулярной динамики (МД) кадгерина проводилось с помощью
программного комплекса PUMA. Для анализа полученных траекторных файлов использовалась
программа TAMD (Trajectory analyzer of molecular dynamics). Обе программы разработаны в
ИМПБ РАН. Результаты нашего моделирования хорошо согласуются с данными [M.Sotomayor
and K.Schulten, Biophys. J. 94 (2008) 4621].
Проведены МД-эксперименты с четырьмя структурами C-Cadherin (c 12 ионами Ca2+ и
Mg2+, и с 24 ионами Na+ и K+). Они включали релаксацию начальной структуры, растяжение
за концы с постоянной скоростью, циклическое растяжение/сжатие с постоянной скоростью
(0,1 А/пс), растяжение с постоянной силой (100, 200, 400, 800 пН) и др.
Для лучшего понимания возможного влияния ионов на механические свойства кадгерина
были проведены численные эксперименты по растяжению двух молекул глютаминовой
кислоты и иона одного из исследуемых типов между ними как в водном окружении, так и в
вакууме. Как и предполагалось, в вакууме для всех типов ионов сила взаимодействия Glu-ionGlu значительно выше, чем в водном окружении. Ион Ca2+ и Mg2+ связывают глютамины
значительно сильнее, чем ионы K+ и Na+.
79
Математические проблемы биологии
В ходе циклических экспериментов по растяжению/сжатию кадгерина за концы была
обнаружена картина гистерезиса. Предложена механическая модель, включающая упругость и
текучесть кадгерина при растяжении, и объясняющая результаты наблюдаемых явлений.
В настоящей работе впервые проведены МД-эксперименты кадгерина с ионами магния.
Показано, что кадгерины с ионами магния и кальция обладают схожими механическими
характеристиками. Поведение кадгерина с ионами калия и натрия отлично от его поведения с
ионами магния и кальция.
БЫСТРЫЙ ПОИСК ПРОТЯЖЕННЫХ ПОВТОРОВ В ГЕНОМАХ
Пятков М.И., Панкратов А. Н.
Институт математических проблем биологии РАН, Пущино (Россия)
mpyatkov@gmail.com
Одним из самым значимым достижений последнего десятилетия является секвенирование
генома человека и основных модельных эукариотических организмов. Появившиеся в
распоряжении исследователей огромные хранилища генетической информации позволяют
проводить полномасштабные исследования этих геномов и продвигаться вперед в понимании
их структурно-функциональной организации. Одной из легко формализуемых задач, связанных
с секвенированными последовательностями, является исследование повторяющихся элементов
(повторов), изучение их структуры и распределения в геномах.
Подавляющее большинство программ для поиска повторов ориентировано на поиск
коротких последовательностей, однако в последнее время все больше внимания уделяется
изучению протяженных повторов, как в контексте филогенетических исследований, так и в
связи с возможной ролью повторов в укладке и реорганизации геномов и функционировании
отдельных генов. Для этого требуются инструменты, позволяющие быстро работать с
нуклеотидной последовательностью в разном масштабе.
Авторами рассматривается задача поиска протяженных неточных повторов и предлагается
подход для решения данной задачи, в основе которого лежат спектральные методы.
Отличительной особенностью предлагаемого алгоритма, по сравнению с существующими
аналогами, является высокая эффективность работы за счет использования многоуровневого
параллелизма, анализ нуклеотидных последовательностей в разном масштабе, а также
возможность поиска различных типов повторов (прямых, инвертированных, тандемных)
одновременно.
ПРОГРАММНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ МАТЕМАТИЧЕСКОГО
МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ МАГНИТНОЙ
ЭНЦЕФАЛОГРАФИИ
Рыкунов С.Д., Сычев В.В., Устинин М.Н.
Институт математических проблем биологии РАН, Пущино (Россия)
stanislavrykunov@gmail.com
Задача магнитной энцефалографии (МЭГ) состоит в том, чтобы узнать, как работает мозг,
по магнитному полю, измеренному у поверхности головы. В данной работе создан
программный комплекс для моделирования данных МЭГ, включающий в себя структурные
модели мозга, модели его электрической активности и различные конфигурации
регистрирующих приборов.
Комплекс состоит из расчетного модуля, редактора источников поля и модуля
визуализации. Расчетный модуль отвечает за решение прямой задачи магнитной
энцефалографии для заданного набора источников поля и детекторов. В качестве моделей
головного мозга используются T1-взвешенные магниторезонансные томограммы,
отображающие структуру мозга с достаточной для целей локализации полнотой.
Использование таких моделей позволяет наглядно и физиологически корректно размещать
источники полей с пространственной точностью, соответствующей постановке эксперимента.
80
Математические проблемы биологии
В качестве источников электрической активности мозга рассматриваются наборы
эквивалентных токовых диполей в проводящей сфере. Программный комплекс позволяет
моделировать как постоянные, так и изменяющиеся с течением времени источники поля.
Временные зависимости источников можно описывать периодической функцией, задаваемой в
диалоговом режиме, а также задавать внешним временным рядом. Модель прибора
представляет собой набор параметров, определяющих число датчиков, их размер, тип,
пространственное расположение и ориентацию. Модуль визуализации отвечает за отображение
модели мозга, положения источников поля и регистрирующего прибора, карты напряженности
магнитного поля и вида сигнала, фиксируемого датчиками прибора.
С
помощью
созданной
программы
можно
оценивать
функциональность
магнитоэнцефалографа любой заданной конфигурации, калибровать прибор, планировать
эксперименты. На построенных модельных данных настраиваются методы и отлаживаются
программы обработки и анализа экспериментальных данных МЭГ. Программы, входящие в
состав комплекса, написаны на языке C# с использованием математической библиотеки
Math.NET Numerics.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №10-07-00300, 11-07-12033-офи-м-2011,
11-07-00577.
ПРОБЛЕМА ТОПОЛОГИЧЕСКОЙ СВЯЗНОСТИ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ
БОЛЬШИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ НЕЙРОННЫХ СЕТЕЙ
Собинов А.Р.1, Дрижук Д.Д.1, Параскевов А.В.2
1
Московский физико-технический институт (государственный университет);
2
Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва (Россия)
nishbo@yandex.ru
При моделировании больших биологических нейронных сетей не существует общего
алгоритма задания топологии (т.е. архитектуры межнейронных связей) сети. В большинстве
работ из области вычислительной нейронауки, топология нейронной сети задается случайным
образом: однонаправленная связь между любыми двумя нейронами создается с вероятностью p.
Биологический нейрон обычно имеет один аксон, по которому передаются потенциалы
действия (спайки), генерируемые нейроном. Конец аксона разветвляется на терминали,
которые образуют связи с другими нейронами через синаптические контакты. Количество m
терминалей у аксона нейрона варьируется от нескольких штук до нескольких десятков, обычно
m ~ 10. Если задавать межнейронные связи указанным выше способом, то в нейросети из N
нейронов среднее число эффективных терминалей нейрона равно p·N. Альтернативно, можно
задать фиксированное число m терминалей у любого нейрона, а затем для каждой терминали
данного нейрона случайным образом выбирать нейрон, с которым она связана. При генерации
больших (N ~ 104 и более) модельных нейросетей, биологически-релевантных по числу
(реальных или эффективных) терминалей нейрона (m, <m> ~ 5÷10), возникает некоторое
количество нейронов, не имеющих входных связей (т.н., «изолированные» нейроны). Вероятно,
что такое же количество нейронов используется in vivoдля соединения нескольких нейронных
подсетей в большую гетерогенную сеть, какой является мозг. Однако, с позиции
моделирования динамических коллективных эффектов, наличие таких нейронов нежелательно,
поскольку может привести к существенному искажению динамики нейросети.
В данной работе показано, что в случае равновероятных межнейронных связей (что
типично для большинства нейросетевых моделей, в которых не рассматриваются
пространственные координаты нейронов) число изолированных нейронов Nisol =N·exp(-m) при
N >> m. Предложены несколько итеративных алгоритмов генерации топологии нейросети,
позволяющих значительно уменьшить долю изолированных нейронов.
СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОЦЕДУР ПРЕДСКАЗАНИЯ НАЛИЧИЯ
АЛЬТЕРНАТИВНЫХ КОНФОРМАЦИЙ В ПРОЦЕССЕ
81
Математические проблемы биологии
КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКОГО УТОЧНЕНИЯ СТРУКТУРЫ
МАКРОМОЛЕКУЛ
Соболев О.В.
Институт математических проблем биологии РАН, Пущино (Россия)
oleg@impb.ru
Математически, уточнение структуры белка – это процедура минимизации некоторой
целевой функции в многомерном пространстве. При этом, размерность пространства может
доходить до 105, а целевая функция может включать в себя порядка 106сильно осциллирующих
слагаемых. Все это делает процесс минимизации нестабильным, и для решения этой проблемы
в целевую функцию вводятся дополнительные штрафные функции (стереохимические
ограничения). Использование кристаллов высокого качества позволяет усложнить модель,
включив в нее альтернативные конформации (АК) для подвижных аминокислотных остатков, и
отказаться от штрафных функций. Выявление остатков, для которых необходимо введение АК
является трудоемким этапом.
Ранее нами были разработаны автоматические процедуры для предсказания наличия АК
для остатков на основе анализа сдвигов атомов в процессе уточнения без стереохимических
ограничений. Мы полагаем, что остатки, атомы которых сильно сдвинулись в процессе такого
уточнения, с большей вероятностью находятся в АК. Процедуры различаются выбором
характеристики остатка, на основе которой делается предсказание (средний сдвиг атомов
остатка, максимальный сдвиг, полный набор сдвигов), и принципом принятия решения
(сравнение с пороговым значением, оценка правдоподобия).
В качестве характеристики остатка вместо атомных сдвигов могут использоваться
величина температурного фактора или значение электронной плотности на синтезе Фурье.
Всего было проанализировано 15 типов процедур, для которых были рассчитаны вероятности
ошибок первого и второго рода, и суммарные характеристики, используемые при оценке
качества процедур предсказания.
В ходе работы было показано превосходство критериев основанных на анализе величин
атомных сдвигов.
Данная работа выполнена при частичной поддержке РФФИ, грант № 10-04-00254-а.
КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРОМОТОРОВ НА ОСНОВАНИИ
ФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДНК ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ
Темлякова Е.А., Сорокин А.А., Джелядин Т.Р.
Институт биофизики клетки РАН, Пущино (Россия)
evgenia.teml@gmail.com
Узнавание промоторов, осуществляемое РНК-полимеразой (РНКП), играет ключевую
ролей в регуляции транскрипции в прокариотах. Известно большое количество элементов
промоторных последовательностей, участвующих в этом процессе. Так, например, известно что
σ-субъединица РНКП связывается со специфическими нуклеотидными последовательностями,
расположенными в -10 и -35 области от точки старта транскрипции и позволяющим ферменту
начать транскрипцию в верном направлении. Дополнительные контакты могут возникать, при
наличии у промотра «extended-10» последовательности, олигоA-трэка или AT-богатой
последовательности в up-stream области. Исследования таких детерминант узнавания,
проводимые на протяжении более чем 30 лет не привели к возникновению четкого понимания
процессов полимеразно-промоторного узнавания и способов регуляции транскрипции.
В данной работе мы сфокусируемся на электростатическом потенциале промоторной ДНК,
как одном из ключевых параметров промоторно-полимеразного узнавания. Поскольку и ДНК, и
РНКП являются заряженными полимерами с гетерогенным распределением потенциала по
поверхности , очевидно, что электростатические взаимодействия должны играть важную роль в
промоторно-полимеразном узнавании. Ранее было показано [Kamzolova S.G. et al. J.B.S.D.
18(2000)
1135],
что
профили
электростатического
потенциала
промоторных
последовательностей E.coli сильно отличаются от профилей кодирующих последовательностей.
82
Математические проблемы биологии
Распределение электростатического потенциала в кодирующих последовательностях является
более гомогенным, в то время как промоторные последовательности характеризуются боле
отчетливыми паттернами и локальными неоднородностями с выраженными отрицательными и
положительными областями. Выявление таких особенностей может быть использовано в
предсказании расположения промоторов в геномах. Однако профили электростатического
потенциала промоторов настолько многообразны, что применять их в качестве критерия по
определению свойств последовательности пока затруднительно. Классификация паттернов
распределения электростатического потенциала может приблизить нас к такому критерию и
стать дополнительным подтверждением к текстовому анализу последовательностей ДНК. Мы
применили агломеративно-иерархическую кластеризацию по методу Ворда к набору из более
350 промоторов, существование которых было подтверждено экспериментально. В качестве
меры близости промоторов при кластеризации использовалась евклидово расстояние между
профилями электростатического потенциала в core части промоторов (-45 – 0 п.н.) и расстояние
между профилями электростатического потенциала в upstream области (-90 – -55 п.н.). В
результате кластеризации при классификации по коровой части промотора профили
электростатического потенциала разделились на два устойчивых кластера, в случае
классификации по up-stream области – на три. Дополнительный анализ полученных кластеров
показал, что сгруппировавшиеся вместе промоторы контролируют гены, отвечающие за схожие
биологические процессы.
СОВМЕЩЕНИЕ ИМИТАЦИОННОГО И АНАЛИТИЧЕСКОГО ПОДХОДОВ
ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ТУНДРОВОГО СООБЩЕСТВА
Саранча Д.А., Тращеев Р.В.
Вычислительный центр им. А.А. Дородницына РАН, Москва (Россия); Институт
фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино (Россия)
tslav85@mail.ru
Предложен комплексных метод исследований, включающих в себя полный набор
операций, объединяющий формальные и неформальные методы, имитационные и
аналитические подходы.
Применение данного подхода для анализа колебаний численности тундровых животных
позволило построить набор сопряженных моделей, включающих в себя имитационную модель
тундрового сообщества «растительность-лемминги-песцы» (РЛП) и упрощенную модель, в
виде одномерного разностного уравнения, связывающего численности леммингов в двух
соседних годах. Используя набор моделей, опираясь на это уравнение, удалось сформулировать
гипотезы о ведущих механизмах, определяющих колебания численности тундровых животных.
Кроме того, на основе совместного анализа эколого-биологической информации и результатов
вычислительных экспериментов удалось ввести дополнительные предположения и получить
расчетные формулы,связывающие параметры модели РЛП и разностного уравнения.Таким
образом, упрощенное разностное уравнение можно использовать для настройки модели РЛП на
необходимые режимы функционирования, а саму модель РЛП для более подробного изучения
процесса.
Исследование разностного уравнения показало, что при изменении параметров
последовательно возникают зоны стабильности с устойчивыми циклами, которые разделены
переходными зонами с более сложными «квазистохастическими» режимами, в которых
происходит изменение динамических режимов на конечных временах при малом изменении
параметров. Анализ имитационной модели РЛП показал, что в ней так же возникают
описанные зоны.
83
Математические проблемы биологии
РАЗРАБОТКА ИНТЕРАКТИВНОЙ УЧЕБНОЙ 3D МОДЕЛИ,
ДЕМОНCТРИРУЮЩЕЙ ОСНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
ЖИВОЙ КЛЕТКИ В ИГРОВОЙ ФОРМЕ
Ким В.Л.1, Филиппов С.В.2, Шаба Л.Н.1, Устинин М.Н.2
1
Пущинский государственный естественно-научный институт; 2Институт
математических проблем биологии РАН, Пущино (Россия)
sni.86@mail.ru
Целью работы является разработка игровой компьютерной программы, демонстрирующей
учащемуся:
- строение мембранных структур живой клетки в виде компьютерных 3D моделей при
взгляде изнутри;
- важнейшие биохимические реакции и процессы в форме игровых ситуаций.
В основе игрового процесса лежит перемещение наблюдателя внутри мембранных
клеточных структур, выступающих в роли игрового окружения. Модели клеточных структур
непрерывно генерируются из набора базовых 3D элементов с помощью генератора
псевдослучайных чисел непосредственно перед их визуализацией в поле зрения игрока. Эти
базовые элементы «бесшовно» стыкуются друг с другом в любых комбинациях, формируя
неповторяющуюся бесконечно протяженную модель определенной клеточной структуры
(митохондрия, аппарат Гольджи, гладкий и шероховатый эндоплазматический ретикулум).
Важнейшим условием течения игрового процесса является прохождение заданных
отрезков пути внутри клеточной органеллы за определенное время.
Определяющим параметром, контролируемым игроком является скорость его
перемещения, которая зависит от:
1. Доступной игроку условной энергии.
В качестве источника энергии выступают модели молекул АТФ, а так же компоненты
метаболических реакций (например, цикл Кребса), которые учащийся должен осмысленно
собирать с целью получения энергии.
2. Условной массой «внутриклеточного корабля».
Сбор игровых объектов, представляющих собой внутриклеточные молекулы и их
структуры способен улучшать энерговооруженность игрока, но при этом ведет к росту массы,
снижающему скорость. Игроку необходимо осмысленное соблюдение баланса массы и
энергоэффективности «подбираемого» или «игнорируемого» игрового объекта.
3. Быстроты реакции игрока.
Столкновение с клеточными структурами и прочим пассивным игровым окружением
напрямую снижают скорость перемещения. Столкновения с условно агрессивными игровыми
объектами (протеазы, нуклеазы и т. п.) приводит к усложнению игрового процесса.
Важнейшим элементом учебного процесса разрабатываемой игровой программы является
демонстрация учащемуся строения живой клетки и трехмерных структур биологических
макромолекул, сопровождаемая постоянной подачей игроку реальной информации о
наблюдаемом объекте (название, функциональность, физико-химические свойства) в
специальном информационном поле пользовательского интерфейса программы.
В качестве программной платформы выбран бесплатно распространяемый 3D графический
пакет с открытым исходным кодом – Blender 2.6x.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ОБРАЗОВАТЕЛЬНОМ ПРОЦЕССЕ ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ
КОМПЬЮТЕРНОЙ МОДЕЛИ РЕГУЛЯТОРИКИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Шахмуров Г.А.1, Мусаева Ш.Н.2, Абдувалиев А.А.2, Гильдиева М.С.3
1
Национальный университет Узбекистана им. Мирзо Улугбека; 2Институт биохимии
АН РУз; 3Республиканский онкологический научный центр МЗ РУз, Ташкент
(Узбекистан)
gyuloglan89@mail.ru
84
Математические проблемы биологии
Существующие биологические экспериментальные данные и теоретические положения о
структурно-функциональной организации щитовидной железы на клеточном уровне позволяют
строить математические модели для количественного анализа регуляторики численности
клеточного сообщества фолликула щитовидной железы в норме и при аномалиях на основе
метода моделирования регуляторных механизмов живых систем и уравнений регуляторики
клеточных сообществ.
Созданная нами компьютерная модель регуляторики численности клеток фолликулов
щитовидной железы может занять важное место в процессе обучения студентов высшей школы
с целью повышения наглядности, информативности и практической реализации полученных
знаний при изучении физиологии и системы сигналинга эндокринной системы.
Одним из перспективных направлений в области практического исследования
функционирования регуляторных механизмов (регуляторики) живых систем на уровне
клеточных сообществ органов и тканей является математическое и компьютерное
моделирование. Компьютерное моделирование значительно расширяет возможности других
методов исследования. Модель даёт дополнительные возможности экспериментирования,
предоставляя исследователю аналог живой клетки или органа, более доступный для
манипулирования, чем его прототип. Относительно самостоятельное поведение модели, а
также отвлечение от её прототипа подсказывают новые гипотезы, поисковые и проверочные
эксперименты.
МОДЕЛИРОВАНИЕ РЕАКЦИЙ ОТКЛИКА РАСТЕНИЙ НА СТРЕССОРНОЕ
ВОЗДЕЙСТВИЕ
Шемет С.А., Феденко В.С.
Днепропетровский национальный университет им. О. Гончара, Днепропетровск
(Украина)
opticlab@ukr.net
Методы математического моделирования позволяют исследовать приспособительные
реакции растительного организма к неблагоприятным условиям среды на уровне
функциональных зависимостей показателей от дозы стрессора. Среди таких функциональных
зависимостей следует отметить диагностические показатели физиологического состояния и
адаптивных изменений организма.
Цель работы – разработать математические модели для сравнительного изучения
функциональных зависимостей фитотоксичности ксенобиотиков и стресс-индуцированного
накопления фенольных антиоксидантов.
С учетом двухфазного характера растительного организма на стрессорное действие
разработана модель определения влияния токсикантов на функциональное состояние растений.
Модель имеет вид модифицированной экспоненты. При наличии только фазы угнетения
модель состоит из одного, а в случае фаз стимулирования и угнетения – двух блоков.
Диагностику проводят по значениям коэффициентов, рассчитанным на основании
экспериментальных данных. При этом определяют степень и относительное ослабление
ингибирующего эффекта, а также степень стимулирующего эффекта, концентрацию,
соответствующую его максимальному значению, и предельную дозу, при которой наблюдается
стимулирование. Зависимость накопления фенольных антиоксидантов состояла из двух блоков.
Первый блок – базовая функция (линейная или полиномиальная зависимость), которая задает
одинаковую направленность изменений. Второй блок – колебательная функция (синусоида),
амплитуда и период которой могут изменяться специфически для каждого ксенобиотика и
зависят от фитотоксичности. Совместное использование разработанных алгоритмов позволяет
исследовать различные аспекты устойчивости растений к химическим стрессорам.
85
Молекулярная биология
СЕКЦИЯ «Молекулярная биология»
ZP-ДОМЕН СОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ ПЛАСТИНКИ
КОНТАКТА ООЦИТА СЦИФОИДНОЙ МЕДУЗЫ AURELIA AURITA
Адонин Л.С.1,2, Котова А.В.1,2, Матвеев И.В.1, Подгорная О.И.1,2
1
Институт цитологии РАН; 2Санкт-Петербургский государственный университет
leo.adonin@gmail.com
Представители типа Кишечнополостные (Coelenterata/Cnidaria) – низшие многоклеточные
животные, тело которых образовано двумя эпителиальными слоями (эпи- и гастродермой),
между которыми расположена прослойка мезоглеи. Ранее среди полипептидов мезоглеи
сцифоидной медузы Aurelia aurita, путем разделения в условиях SDS-электрофореза по
Лэммли, выявлено несколько мажорных белков. Одним из них является белок с молекулярной
массой 47 кДа – мезоглеин (Shaposhnikova et al., 2005; Matveev et al.,2007). При помощи
антител (RA47), полученных к мезоглеину, удалось определить его локализацию:
специфические гранулы мезоглеальных клеток и в составе «эластических» волокон
межклеточного матрикса мезоглеи зрелых медуз. Также на парафиновых срезах тканей гонад
самок A.aurita, методом непрямого иммунофлуоресцентного анализа, показано связывание
антител из сыворотки RA47 со специфической структурой на анимальном полюсе зрелого
ооцита A.aurita, а на более ранних этапах созревания последнего антитела связываются с
компонентами специфических гранул, локализованных в периферической цитоплазме ооцита
(Адонин и др., 2009). Учитывая расположение пластинки контакта – анимальный полюс ооцита
– одной из потенциально возможных функций этой структуры является привлечение и
связывание сперматозоида, как это показано для белков входящих в состав Zona Pellucida
млекопитающих или других аналогов блестящей оболочки, широко представленных в
животном мире.
Вероятно, сыворотка RA47 содержит большой пул антител против ZP-домена, входящего в
состав мезоглеина и занимающего более половины аминокислотной последовательности
последнего, поэтому можно предположить, что антиген/ны локализованные в пластинки
контакта и специфических гранулах ооцита являются ZP-доменными белками. Данное
предположение экспериментально подтверждается результатами использования ПЦР-анализа:
к известной последовательности кДНК мезоглеина подобраны специфичные праймеры к
участкам ZP-домена, а также вне его. В результате показано, что, амплификация идет со всеми
подобранными праймерами в эксперименте, где в качестве матрицы использована кДНК,
полученная из тотальной пробы РНК мезоглеальных клеток (где идет синтез мезоглеина). Если
же в качестве матрицы используется кДНК, полученная в ходе обратной транскрипции
тотальной РНК гонад самок сцифомедузы, то амплифицируются только участки, находящиеся
внутри ZP-домена, что еще раз говорит в пользу выдвинутой ранее гипотезы.Задачей
настоящего исследования являлось получение полной последовательности кодирующей части
ДНК белка/ов гонад самой медузы Aurelia auritac помощью 3’- и 5’-RACE-ПЦР.
ПРИОНОПОДОБНЫЙ ДЕТЕРМИНАНТ [NSI+] ВЫЗЫВАЕТ СНИЖЕНИЕ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРМИНАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ У ДРОЖЖЕЙ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Нижников А.А., Кондрашкина А.М., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П.
Санкт-Петербургский государственный университет, СПб Филиал ИОГен РАН
Ant.nizhnikov@gmail.com
Прионы это белки, которые способны в одинаковых физиологических условиях находиться
в нескольких изоформах, как минимум одна из которых обладает инфекционными свойствами.
[NSI+] – новый прионоподобный детерминант дрожжей S. cerevisiae, который вызывает
супрессию нонсенс-аллелей ade1-14UGA и trp1-289UAG, что ведет к росту штаммов на средах без
аденина и триптофана. В данном исследовании мы решили установить природу молекулярных
86
Молекулярная биология
механизмов наблюдаемой нонсенс-супрессии. Мы предположили, что данный эффект мог быть
вызван либо изменением количества мРНК генов ADE1 и TRP1, либо снижением
эффективности терминации трансляции. Для проверки первой гипотезы мы сравнили
количество мРНК гена ADE1 в [NSI+] и [nsi-] штаммах, с помощью реакции обратной
транскрипции и полимеразной цепной реакции в реальном времени. Результаты показали
отсутствие достоверных различий в количестве мРНКADE1 в штаммах [NSI+] и [nsi-]. Таким
образом, нонсенс-супрессия в штаммах [NSI+] не связана с изменением количества мРНК
ADE1.Для того чтобы установить, зависит ли наблюдаемая нонсенс-супрессия от снижения
эффективности терминации трансляции, мы использовали метод бицистронной
люминесценции. Нами получены данные о том, что в штаммах [NSI+] частоты прочтения стопкодонов UGA и UAG приблизительно в 2,5 раза выше, чем в штаммах [nsi-]. Это позволяет
сделать вывод, что возникновение [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации
трансляции, которое приводит к нонсенс-супрессии и росту дрожжевых штаммов на средах без
аденина и триптофана.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009-2013 годы (Госконтракт №П1354). Работа выполнена за счет
средств тематического плана НИР СПбГУ.
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ МОНОНУКЛЕАРНОЙ
ФРАКЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ
ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
1
Алексашин Н.А. , Тимошкина Н.Н.2, Матишов Д.Г.2, Коган М.И.3, Водолажский
Д.И.2
1
2
Южный федеральный университет; Южный научный центр РАН; 3Ростовский
государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону (Россия)
K20111990@yandex.ru
Рак предстательной железы (РПЖ) относится к одному из наиболее распространенных
онкологических заболеваний мужчин зрелого и пожилого возраста. Наличие циркулирующих
опухолевых клеток и их маркеров (Circulating Tumor Cells - CTCs) в периферической крови
является безусловным доказательством процесса малигнизации.
Было проведено сравнительное исследование паттерна экспрессии генов мононуклеарной
фракции периферической крови пациентов у больных РПЖ.
Материалом для исследований служила венозная кровь 58 мужчин в возрасте от 50 до 80
лет, прошедших обследование на базе урологической клиники Ростовского государственного
медицинского университета (РГМУ).
ПЦР-РВ в присутствии EVA Green I использовали для определения экспрессии 9 ядерных
генов (vegfA, vegfB, bcl2, bax, p53, tnf-α,gstp1, tert, malat1) и некодирующего локуса
митохондриальной ДНК (hv2). В качестве референтного гена использовали ген β-актина (actb).
Сравнение степени экспрессии генов группах условно здоровых доноров, ДГПЖ, РПЖ Т12 и РПЖ Т3-4 выявили ингибирование экспрессии гена tnf-α во всех без исключения
экспериментальных группах: ДГПЖ, РПЖ Т1-2 и РПЖ Т3-4 по сравнению с показателями
контрольной группы, что подтверждает важную роль активности данного гена в онкогенезе.
Полученные в данном исследовании результаты хорошо согласуются с концепцией
возможного увеличения количества CTCs в периферической крови пациентов по мере
прогрессии заболевания и отвечают таким требованиям как повышение активности
антиапоптозных генов (bcl2) и угнетение активности проапоптозных генов (tnf-α и bax).
РОЛЬ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L25 И ЕГО МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ
КОНТАКТОВ В ФОРМИРОВАНИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-АКТИВНОЙ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ РИБОСОМЫ IN VIVO
87
Молекулярная биология
Аникаев А.Ю., Коробейникова А.В., Корепанов А.П., Кляшторный В.Г., Никонов
С.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М.
Институт белка Российской академии наук
anikaev.al@rambler.ru
Рибосомный белок L25 Escherichia coli и его гомологи являются особенностью бактерий.
Однодоменный белок L25, образуя контакты только с 5S рРНК и белком L16, занимает в
рибосоме достаточно обособленное положение и не взаимодействует напрямую с лигандами
трансляции. Возникал вопрос, необходим ли белок L25 для функционирования бактериального
аппарата трансляции? Ранее нами было установлено, что в отсутствие рибосомного белка L25
клетки E. coli выживают, однако рибосомы из клеток такого штамма обладают низкой
белоксинтезирующей активностью.
Целью данной работы было выяснение роли белка L25 и его контактов с 5S рРНК в
формировании функционально-активной рибосомы in vivo. Показано, что рибосомы из клеток
∆L25 штамма, очищенные от компонентов трансляции стандартным образом, содержат
значительное (30-50%) количество диссоциированных субчастиц. Анализ «свободных» 50S
субчастиц показал, что они утратили еще один рибосомный белок, L16, и функционально
неактивны. Мы предполагаем, что отсутствие белка L25 вызывает дестабилизацию
прилегающей области (центральный протуберанец) рибосомной субчастицы, тем самым
ослабляя удержание в рибосоме белка L16. Ранее нами было показано, что белок L25 с
одиночной заменой в его РНК-связывающем модуле не образует комплекс с изолированной 5S
рРНК.
В настоящей работе была создана серия мутантных штаммов E. coli, содержащих в
хромосоме ген рибосомного белка L25 с разными изменениями в его РНК-связывающем
модуле. Одиночная замена в белке L25 не влияла на его встраивание в рибосому in vivoи
эффективность функционирования рибосом. Замена двух или трех аминокислотных остатков в
белке L25 приводила к замедлению роста клеток и ослаблению его удержания в рибосоме.
Таким образом, взаимодействие с 5S рРНК не является обязательным условием для
встраивания белка L25 в рибосому in vivo. Однако образование прочного контакта с 5S рРНК
оказывается строго необходимым для удержания этого белка в работающей рибосоме. Причем
присутствие даже слабоудерживаемой мутантной формы белка в рибосоме положительно
отражается на росте клеток, стабильности ассоциации их рибосомных субчастиц и
функциональной активности рибосом. На основании полученных данных можно заключить,
что рибосомный белок L25, эволюционное приобретение бактериального аппарата трансляции,
необходим для стабилизации структуры функционально важного участка рибосомы.
Работа поддержана РФФИ и Программой «Молекулярная и клеточная биология» РАН.
ВЫЯВЛЕНИЕ УЧАСТКОВ БЕЛКА PRP, ОТВЕЧАЮЩИХ ЗА СВЯЗЫВАНИЕ
ЕГО АГРЕГИРОВАННОЙ ФОРМЫ С АМИЛОИДНЫМ ПЕПТИДОМ БЕТА
Антонец К.С., Галкин А.П., Рубель А.А.
Санкт-Петербургский государственный университет, СПб Филиал ИОГен РАН
kir_ant@mail.ru
В связи с увеличением продолжительности жизни, большое значение приобретает
исследование нейродегенеративных заболеваний, многие из которых возникают у лиц
преклонного возраста.. В основе многих болезней, связанных с нейродегенерацией, лежит
изменение конформации белков центральной нервной системы. В случае болезни Альцгеймера
гибель нервных клеток вызывают олигомеры амилоидного пептида бета (Aβ), продукта
протеолиза белка APP, а в случае прионных заболеваний патология определяется агрегацией
белка PrP. В последние годы показано, что олигомеры PrP способны связывать мономеры
пептида Aβ и индуцировать его агрегацию.
Таким образом, взаимодействие PrP и Aβ может играть существенную роль в развитии
болезни Альцгеймера. В представленной работе мы проанализировали, какие эпитопы PrP,
ответственны за связывание полимеров этого белка с пептидом Aβ, используя в качестве
88
Молекулярная биология
модельного объекта дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Ранее было показано, что белки PrP и Aβ
формируют в цитоплазме дрожжевых клеток агрегаты, сходные по своим характеристикам с
амилоидными полимерами, которые выявляются в мозге больных млекопитающих. Мы
сконструировали плазмиды, в которых различные последовательности PrP (PrP(23-231), PrP(90231) и PrP(110-231)) были слиты с последовательностью, кодирующей флуоресцентный белок
CFP. Последовательность, кодирующая пептид Aβ, была объединена с последовательностью
флуоресцентного белка YFP.
Были получены штаммы ко-продуцирующие белок Aβ-YFP с каждым из трёх вариантов
белка PrP, слитого с последовательностью CFP. Мы оценивали частоты колокализации
агрегатов PrP с химерным белком Aβ-YFP, а также эффективность их физического
взаимодействия при помощи метода FRET. Метод FRET основан на передаче энергии между
флуорохромами CFP и YFP в случае их физического сближения. Наибольшие частоты
колокализации и эффективности FRET были отмечены при анализе агрегатов PrP(23-231)-CFP
и белка Aβ-YFP. Делеция фрагмента PrP с 23-й по 89 аминокислоту приводит к
незначительному, хотя и достоверному снижению эффективности FRET и частоты
колокализации Aβ-YFP с прионными полимерами. На фоне делеции фрагмента PrP с 23-й по
109-ю аминокислоту исследуемые показатели снижаются в несколько раз. На основании
проведённых исследований можно заключить, короткая последовательность PrP c 90-й по 109ю аминокислоту определяет высокую эффективность взаимодействия агрегатов этого белка с
амилоидным пептидом бета.
ИССЛЕДОВАНИЕ мРНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ СВОЙСТВ γ-СУБЪЕДИНИЦЫ
АРХЕЙНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 С ПОМОЩЬЮ
САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
Архипова В.И., Столбоушкина Е.А., Никонов О.С., Никонов С.В., Гарбер М.Б.
Институт белка РАН
avalenti@rambler.ru
В процессе инициации трансляции у эукариот и архей фактор инициации трансляции 2
(e/aIF2) в ГТФ-связанной форме доставляет инициаторную метионил-тРНК (Met-тРНКi) на
рибосому. После узнавания инициирующего кодона мРНК антикодоном Met-тРНКiпроисходит
гидролиз ГТФ, и e/aIF2 в комплексе с ГДФ покидает рибосому. Последующий обмен ГДФ,
связанного с e/aIF2, на ГТФ возвращает фактору способность образовывать комплекс с MetтРНКi и вступать в новый раунд инициации трансляции.
У эукариот и архей фактор инициации трансляции 2 состоит из трех субъединиц (α, β и γ).
Кроме основной роли, у архей фактор инициации трансляции 2 выполняет неканоническую
функцию: γ-субъединица связывает мРНК на 5’-конце которых находится трифосфат и
защищает их от 5’-3’ направленной деградации. γ-Субъединица e/aIF2 относится к семейству
G-белков, содержащих нуклеотид-связывающий домен, с которым взаимодействует ГДФ или
ГТФ. Нашей группой была определена структура aIF2γ в комплексе с ГДФ и нерасщепляемым
аналогом ГТФ. В результате анализа этой структуры был обнаружен дополнительный ГТФсвязывающий сайт на γ-субъединице aIF2. Кроме этого, в экспериментах по конкурентному
связыванию мы наблюдали, что мРНК и ГТФ конкурируют между собой за связывание с γсубъединицей aIF2. Было сделано предположение, что местом для взаимодействия 5’-конца
мРНК на белке может служить один из ГТФ-связывающих сайтов.
Для проверки нашего предположения мы провели сайт-направленный мутагенез каждого
нуклеотид-связывающего сайта и полученные мутантные формы aIF2γ методом гель-шифта
протестировали на способность связывать мРНК. Оказалось, что мутации, внесенные в
дополнительный ГТФ-связывающий сайт, не повлияли на мРНК-связывающие свойства белка:
мутантные формы aIF2γ связывали мРНК в эквимолярных количествах, как и белок дикого
типа, а ГТФ и мРНК продолжали конкурировать между собой за связывание с мутантными
формами белка. В то же время точечная мутация His20Phe, внесенная в область главного
нуклеотид-связывающего сайта aIF2γ, значительно ослабила связывание белка с мРНК. Повидимому, данный нуклеотид-связывающий сайт является местом для взаимодействия 5’-конца
89
Молекулярная биология
мРНК. В настоящее время мы продолжаем исследования, направленные на локализацию сайта
связывания мРНК на белке aIF2γ.
Работа поддержана Программой МКБ РАН.
ПРОЯВЛЕНИЕ ПОЛОВЫХ РАЗЛИЧИЙ В ДЕЙСТВИИ ЦИПЛАТИНА НА
АКТИВНОСТЬ ПАРП1 В ЯДРАХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ И ТИМОЦИТОВ КРЫС
Асатрян А.Л., Маргарян А.В., Арцруни И.Г., Матинян К.С.
Ереванский государственный университет
anushassatrian@gmail.com
Злокачественное перерождение клеток является многоэтапным процессом. Его сложность
обусловлена тем, что он складывается из нарушения нормальной работы базовых клеточных
механизмов, которые ответственны как за пролиферацию, так и за элиминацию поврежденных
клеток. Выживание раковых клеток часто обусловлено эпигенетическими изменениями
наследственных программ их самоуничтожения. Более чем в половине случаев у раковых
клеток отмечаются мутации генов, задействованных в р53-зависимом апоптозе или генов,
кодирующих поли(АДФ-рибозо)полимеразу1 (ПАРП1). В настоящее время установлено, что
активность ПАРП1 является одним из важнейших факторов, определяющих выживание раковоперерожденных клеток, и поиск эффективных ингибиторов фермента является одним из
приоритетных направлений противораковой химиотерапии.
Данное исследование посвящено изучению действия мощного цитотоксического
противоопухолевого препарата цисплатина на активность ПАРП1 в ядрах клеток печени и
тимоцитов крыс. Нами было показано, что в действии препарата на активность ПАРП 1
проявляется явный половой диморфизм. Так, в ядрах клеток печени самцов цисплатин
(10мг/1000г, 48ч) вызывает более чем двукратное подавление активности фермента и
активацию ПАРП1 почти в 2,5 раза в ядрах тимоцитов. В аналогичных условиях действия
цисплатина, в ядрах клеток печени и тимоцитов самок не происходит достоверных изменений
активности ПАРП1.
Результаты данного исследования выявляют необходимость дальнейшего изучения
влияния половых различий на эффективность химиотерапевтических схем лечения больных.
РАЗНООБРАЗИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ТЕРМАЛЬНОЙ
АДАПТАЦИИ НА ОСНОВЕ ГЕНОВ БТШ70 У ВИДОВ, ОБИТАЮЩИХ В
КОНТРАСТНЫХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЯХ
Астахова Л.Н.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной
биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
ibis31@rambler.ru
Белки теплового шока (БТШ) известны как наиболее эволюционно древняя и
универсальная защитная система, предохраняющая клетку от воздействия различных
стрессовых факторов. При этом вопрос об участии БТШ в адаптации к неблагоприятным
условиям окружающей среды на физиологическом уровне в течение длительного времени
оставался неисследованным. В нашей работе, выполненной на широком спектре видов
(беспозвоночные, млекопитающие) было показано большое разнообразие молекулярных
механизмов адаптации на основе группы БТШ70.
Основным объектом нашей работы были: а) верблюд Camelus dromedarius как
млекопитающее, обитающее в неблагоприятных условиях; б) термоконтрастные виды
двукрылых. Для клонирования генов БТШ70 верблюда и нескольких видов двукрылых были
получены и проскринированы их геномные фаговые библиотеки. Экспрессию генов БТШ70
определяли с помощью ПЦР с обратной транскрипцией и 5’- и 3’-RACE PCR.
Гены БТШ70 позвоночных имеют более консервативное строение, чем у других
организмов, и адаптационные механизмы работают на регуляторном уровне. Показана высокая
90
Молекулярная биология
консервативность кластера генов БТШ70 и расположения основных регуляторных элементов в
составе промоторных участков генов БТШ70 млекопитающих. Несмотря на это, активность
промоторов у разных видов млекопитающих в репортерной системе различается, что может
объясняться нуклеотидными заменами, имеющимися в промоторных участках разных видов.
При этом у различных видов двукрылых обнаружена высокая вариабельность кластера
генов БТШ70. Показано, что термоадаптированные виды характеризуются более компактным
расположением и большим числом генов БТШ70. По сравнению с ними у
термочувствительных видов гены БТШ70 отделены друг от друга протяженными участками
ДНК и наблюдается тенденция к появлению псевдогенов. Ранее считалось, что промотор
теплового шока универсален для широкого спектра видов, однако нами показано, что промотор
гена БТШ70 S. singularior неактивен в клетках D. melanogaster. Подобная видоспецифичность
промотора показана нами впервые.
Сравнение структуры кластера генов БТШ70 млекопитающих и БТШ70 беспозвоночных
свидетельствует о различных путях термальной адаптации в ходе эволюции различных
таксонов. Уровень экспрессии и накопления БТШ70 в клетках у разных видов может
определяться: на уровне регуляции транскрипции, числом генов БТШ70, а также разной
степенью стабильности БТШ70.
ПОИСК АССОЦИАЦИИ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ МИНИСАТЕЛЛИТНОГО
ПОВТОРА ГЕНА МОНОАМИНООКСИДАЗЫ А С РАЗВИТИЕМ
ПАНИЧЕСКОГО РАССТРОЙСТВА У ЧЕЛОВЕКА
Афончикова Е.В., Климов Е.А., Кокаева З.Г., Фокина Н.М., Азимова Ю.Э.
МГУ им. М.В. Ломоносова, ГНУ Центр экспериментальной эмбриологии и
репродуктивных биотехнологий Россельхозакадемии, Отдел неврологии и клинической
нейрофизиологии НИЦ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова
alenaafonchikova@gmail.com
Паническое расстройство (ПР) – это тревожное заболевание, характеризующееся
внезапными и рецидивными атаками страха или тревоги (паническая атака), часто
сопровождаемое физическими симптомами. Ген, кодирующий фермент моноаминоксидазу А
(МАОА), рассматривается как один из кандидатов, вовлеченных в процесс развития ПР. В
промоторной части МАОА был обнаружен минисателлитный повтор (VNTR), длиной 30 п.н.,
который может быть представлен 3, 3,5, 4 и 5 копиями (Sabol et al., 1998). Данные, полученные
в результате изучения промоторной части МАОА, чрезвычайно противоречивы. Считается, что
длинные аллели (3,5, 4, и 5) более функционально активны, чем короткий аллель (3), и как
следствие повышенная активность гена МАОА связана с развитием ПР человека (Schulze et al.,
2000). Maron с соавторами считают, что пациенты менее подвержены развитию
индуцированных панических атак при наличие длинных аллелей гена МАОА, что не
согласуется с данными полученными от других исследователей (Deckert et al., 1999).
Целью данной работы было исследование вариабельности минисателлитного повтора в
промоторной части МАОА, на выборке пациентов из Москвы и Московской области с
диагнозом ПР (n=68, образцы предоставлены Отделом неврологии и клинической
нейрофизиологии НИЦ Первого МГМУ им. И.М.Сеченова) и контрольной выборке
необследованных жителей Москвы и Московской области (n=186, образцы с московской
станции переливания крови).
Работа проведена с использованием стандартных молекулярно-биологических методов
(ПЦР, капиллярный электрофорез) и популяционо-статистических методов обсчета
полученных данных. Аллели 3,5R и 5R не были обнаружены в исследованных выборках. Для
остальных аллелей были показаны следующие частоты у больных ПР: 2R – 0,404±0,060, 3R –
0,588±0,060, 4R – 0,007±0,010, в контрольной выборке: 2R – 0,363±0,035, 3R – 0,621±0,036, 4R –
0,016±0,009. Сравнение частот аллелей у больных и контроля не выявил статистически
значимых отличий.
91
Молекулярная биология
Таким образом, на выборке жителей Москвы и Московской области показано, что
вариабельность минисателлитного повтора в промоторной части гена МАОА не привносит
значимого вклада в развитие панических расстройств.
ИЗМЕНЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ГЛИЦИНОКСИДАЗЫ ИЗ
BACILLUS SUBTILIS 4K35. УВЕЛИЧЕНИЕ ГЛИФОСАТ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
Баранец А.П., Евтушенков А.Н., Селезнева Ю.В., Николайчик Е.А.
Белорусский государственный университет, Минск (Беларусь)
Baranetsdenis@gmail.com
Глифосат является одним из самых распространенных гербицидов в мире. Его широкое и
долгосрочное использование привело к необходимости создания трансгенных растений,
устойчивых к глифосату. Одним из способов получения таких растений является введение в
растительный организм генов, кодирующих ферменты, расщепляющие гербицид с
образованием безвредных для клетки веществ. Глициноксидаза (GO) из бактерий Bacillus
subtilis является одним из таких ферментов, который осуществляет окислительное
дезаминирование глифосата. Уровень активности глициноксидазы по отношению к глифосату
невысок, поэтому необходимо модифицировать фермент так, чтобы мутантные варианты
обладали повышенным сродством к гербициду.
На начальном этапе работы нами клонирован ген, кодирующий глициноксидазу бактерий
B. subtilis 4К35. Далее нами проведен сайт-направленный мутагенез указанного гена, для чего
мы использовали систему «Altered Sites II» компании «Promega». Мы разработали мутагенные
праймеры, которые позволили нам осуществить замену семи нуклеотидов, что на уровне белка
привело к замене Gly51 на Ser, Ala54 на Arg, His244 на Ala. Согласно литературным данным,
замена Gly51 на Ser и Ala54 на Arg приводит к изменению активного центра GO, в результате
чего фермент связывается с глифосатом в оптимальном положении для катализа. Замена His244
на Ala приводит к увеличению сродства субстрата с ферментом и к двукратному увеличению
экспрессии фермента. В результате проведенного мутагенеза были получены мутантные
варианты гена GO B. subtilis из штамма 4К35, несущие три мутации(Gly51Ser, Ala54Arg,
His244Ala).
В чашечных тестах было показано, что бактерии E. coli DH5α, несущие плазмиду pAlterI с
нативным геном глициноксидазы, неспособны расти на минимально-солевой среде с
глифосатом в концентрации выше 2ммоль/л, в то время как бактерии E. coli DH5α с плазмидой,
обеспечивающей синтез мутантной глициноксидазы с тремя аминокислотными заменами,
могут расти на средах с 20 ммоль/л глифосата. В дальнейшем планируется создание векторной
конструкции, несущей мутантный вариант гена глициноксидазы из B. subtilis 4К35 для
осуществления агробактериальной трансформации растений рапса.
КОМПЛЕКС ТРОПОМИОЗИН-1/МИОЗИН-9 РЕГУЛИРУЕТ ОБРАЗОВАНИЕ
СТРЕСС-ФИБРИЛЛ
Бобков Д.Е., Назарова И.В., Галактионов Н.К., Краснов И.А., Кропачева И.В.,
Пинаев Г.П.
Институт цитологии РАН
bobkovde@yandex.ru
Тропомиозин и миозин обнаруживаются в цитоплазме культивируемых клеток в составе
белковыx комплексов с молекулярными массами в пределах 250-800 кДа. Среди таких
комплексов можно выделить как тропомиозиновые мультимеры с мол. массой около 250 кДа,
так и более высокомолекулярные белковые комплексы сложного состава, объединяющие
тропомиозин с белками теплового шока либо с миозином-9. Тропомиозин образует
суперспиральные палочковидные гомо- и гетеродимеры, которые могут полимеризоваться в
длинные нити в результате агрегации по принципу «голова к хвосту» с перекрыванием 8-9
аминокислотных остатков в NH2- и COOH-концах. Состав изоформ тропомиозина довольно
92
Молекулярная биология
разнообразен за счет альтернативного сплайсинга продуктов трех тропомиозиновых генов. В
первичной аминокислотной последовательности тропомиозина выделяют протяженный мотив,
представляющий собой ритмичное чередование гидрофобных и заряженных аминокислотных
остатков, что позволяет этому белку принимать альфа-спиральную конформацию и
образовывать суперспирали. Миозин-9 содержит моторный актин-связывающий головной
домен, обладающий АТФазной активностью, и способен в виде мономера перемещаться по
актиновым филаментам со скоростью 1 мкм/сек.
При анализе доменов предсказанной аминокислотной последовательности было
обнаружено, что в хвостовой части миозин-9 содержит мотив лейциновой застежки, цинковый
палец и последовательность, гомологичную RhoGAP белку. Такое строение позволяет миозину9 вступать во взаимодействие с другими альфа-спиральными белками. Миозин-9
обнаруживается как в цитоплазме в составе белковых комплексов, так и в ядре культивируемых
клеток крысы и человека. В ядре он взаимодействует с ядерным белком HMGB1, а наличие
мотивов лейциновой застежки и цинкового пальца позволяют предполагать и его
взаимодействие с ДНК. Комплекс тропомиозин-1/миозин-9 был выделен из цитоплазмы клеток
с различным содержанием стресс-фибрилл. Возможно, что тропомиозин-1 ингибирует RhoGAP
активность миозина-9 путем взаимодействия с его хвостовой частью. Механизм подобного
взаимодействия остается неясным, но мы предполагаем, что оно может протекать с
образованием суперспиралей и регулироваться за счет вторичных модификаций белков. Для
тропомиозина такой модификацией является ацетилирование по N-концу, которое может
приводить к избирательному взаимодействию либо с актином, либо с миозином-9.
Ацетилированный тропомиозин связывается с актином и осуществляет за счёт разнообразия
изоформ тонкую регуляцию стабильности филаментов. Полноразмерная изоформа
тропомиозина (284 аа) стимулирует таким образом образование стресс-фибрилл, что показано в
экспериментах на нормальных и трансформированных фибробластах крысы. Ингибирование
RhoGAP-активности миозина-9 может приводить к активации малой ГТФазы Rho,
принимающей участие в формировании стресс-фибрилл.
Таким образом, тропомиозин обеспечивает как структурную организацию так и
сигнальную регуляцию процесса реорганизации цитоскелета.
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА УРОВНЯ НОНСЕНС-СУПРЕССИИ,
ВЫЗВАННОЙ ПРИОНОМ [PSI+], НА ФОНЕ МУТАЦИЙ В N-ДОМЕНЕ БЕЛКА
Sup35
Беседина Е.Г., Бондарев С.А., Трубицина Н.П., Каява А.В., Журавлева Г.А.
СПБГУ, Санкт-Петербург (Россия); Centre de recherche de biochimie macromoleculaire,
Montрellier (France)
stanislavspbgu@gmail.com
Согласно современным представлениям термином прион обозначают агент белковой
природы, способный передаваться в чреде поколений или от одного организма к другому.
Механизм передачи этих факторов заключается в их способности индуцировать
конформационные изменения определенных клеточных полипептидов. Одним из первых
описанных прионов является фактор [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae, который
представляет собой изоформу фактора терминации трансляции eRF3 (Sup35p). При переходе в
прионную конформацию Sup35p образует в клетке фибриллярные агрегаты, это приводит к его
инактивации и, как следствие, к нонсенс-супрессии (распознаванию стоп-кодонов как
значащих). В нашей лаборатории был получен ряд мутантных аллелей гена SUP35, которые
оказывают влияние на поддержание и стабильность фактора [PSI+] (дестабилизируют прион
или же меняют его свойства). Эти аллели были названы sup35-M2, sup35-M3, sup35-M4, sup35M5 и sup35-M6.
В ходе данной работы мы провели количественную оценку уровня нонсенс-супрессии в
штаммах, несущих различные аллели SUP35. Для этого мы использовали методику,
основанную на измерении относительного количества ß-галактозидазы. Благодаря тому, что
этот ферменты синтезируется в клетках дрожжей с искусственных конструкций только в
93
Молекулярная биология
результате прочтения преждевременных стоп-кодонов, мы можем оценивать уровень нонсенссупрессии. На основании полученных нами данных мы смогли убедиться в «ослаблении»
приона на фоне алеллейsup35-M4 и sup35-M6, а также в его потере в случае аллелейsup35-M2 и
sup35-M3. Тем не менее, мы не наблюдали усиления нонсенс-супрессии на фоне sup35-M5,
которое ранее детектировали фенотипически.
Авторы благодарны А.С. Борхсениусу за предоставленные штаммы. Работа поддержана
Российским фондом фундаментальных исследований (10-04-00237), тематическим планом НИР
СПбГУ (1.37.115.2011 и 1.37.113.2011) и программой фундаментальных исследований
Президиума РАН «Проблемы происхождения жизни и становления биосферы»
НОВЫЙ СТРУКТУРНЫЙ ПОДКЛАСС (α+β)-БЕЛКОВ
Бошкова Е.А., Ефимов А.В.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино (Россия)
boshkova.e.a@rambler.ru
В результате анализа Банка белковых структур (РDB) выделен новый структурный
подкласс (α+β)-белков. Анализуруемые белки (или белковые домены) состоят из сильно
скрученных β-листов, и одной или нескольких альфа-спиралей, упакованных на вогнутой
поверхности β-листа. Таким образом, β-лист служит своеобразной обёрткой для альфа-спирали.
В связи с этим, белкам данного подкласса дано название «wrap-белки».
Пространственная структура wrap-белков определяется наличием структурного мотива с
уникальной укладкой – сильно скрученной β-шпильки. Сильно скрученная и изогнутая βшпилька образует в пространстве двойную спираль из β-тяжей. Она имеет вогнутую и
выпуклую поверхности. Скрученная шпилька обладает хиральностью: она практически всегда
правая, т.е. если смотреть на неё со стороны вогнутой поверхности, то второй тяж по
направлению от N- к С-концу располагается справа относительно первого.
Для найденных wrap-белков построено структурное древо. Структурное древо белков – это
совокупность всех разрешённых промежуточных и конечных пространственных структур,
которые могут быть получены из одной стартовой структуры путём последовательного
пристраивания к ней других элементов вторичной структуры в соответствии с набором правил,
выведенных из известных принципов структурной организации белков.
В качестве корневого мотива при построении структурного древа для данной группы
белков использована сильно скрученная β-шпилька.
При моделировании предпочтение отдано тем путям роста, которые ведут к более
быстрому пристраиванию α-спирали, т.к это резко уменьшает площадь доступной для воды
гидрофобной поверхности, характерной для вогнутой стороны сильно скрученных β-шпилек.
Белки и белковые домены, содержащие wrap-белки, отобраны визуально из банка белковых
данных PDB и системы классификации SCOP 1.75. На древо нанесены только те укладки,
которые ведут к известным белкам.
Построенное структурное древо включает в себя 93 негомологичных белка (белковых
домена), и содержит 54 укладки, заполненные известными белками.
В настоящее время ведётся работа по построению полного теоретического структурного
древа, содержащего все теоретически возможные укладки wrap-белков.
Данная работа поддержана грантом РФФИ № 10-04-00727-а.
ДИЗАЙН КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА,
НЕСУЩЕГО МОТИВ ЦИНКОВОГО ПАЛЬЦА
Бродская А.В., Егоров В.В., Васин А.В.
ФГБУ НИИ Гриппа Минздравсоцразвития
alexandra.b_05@mail.ru
Материалы, структурированные «снизу-вверх», от нанометровых масштабов представляют
сегодня особый интерес, так как могут быть использованы в различных областях человеческой
94
Молекулярная биология
деятельности – от создания оптически активных сред до разработки новых вакцин. Многие
биологические макромолекулы способны к самоорганизации в растворе, что делает
перспективным их использование в качестве компонентов самоорганизующихся систем.
Способность белков к самоорганизации в растворе часто обусловлена наличием участков
первичной структуры, способных к специфическому взаимодействию. Одним из мотивов,
встречающихся в белковых последовательностях является так называемый мотив цинкового
пальца, Zn-finger motif, который может координровать ионы Zn,стабилизируя тем самым свою
конформацию.
Таким
образом
мотив,
способен
формированию
определенной
пространственной структуры белка только в присутствие ионов Zn, что позволяет влиять на
специфические белок-белковые взаимодействия и процесс образования белковых структур в
растворе путём изменения содержания ионов в среде.
Целью исследования была разработка генетической конструкции на основе бактериальной
плазмиды, способной к экспрессии рекомбинатного белка слияния гемагглютинина и
аминокислотной последовательности, содержащей мотив цинкового пальца, для последующего
изучения зависимости способности данного белка к олигомеризации от содержания ионов
цинка в растворе.
При компьютерном анализе последовательности белка М1 вируса гриппа был обнаружен
мотив цинкового пальца. С использованием программного пакета PCGene была проведена
аналитическая обратная транскрипция мотива из белка M1 и получена кодирующая его
нуклеотидная последовательность, оптимизированная по распространённости кодонов для
E.Coli. В терминальные части последовательности были внесены нуклеотидные
последовательности, соответствующие “липким концам” плазмиды pET22b+. Были получены
кодирующая и некодирующая нити данного фрагмента, подобраны специфические условия
гибридизации для получения двунитевой ДНК после их отжига. Подобраны праймеры и
получен ПЦР-продукт, кодирующий фрагмент гемагглютинина вируса гриппа А. Проведена
вставка данных участков ДНК в экспрессионную плазмиду. С использованием прогрманого
пакета HiperChem было проведено компьютерное молекулярное моделирование
рекомбинантого белка гемагглютинина,включающего мотив цинкового пальца, и оценена
способность таких белков к самоорганизации в вакууме и в присутствие ионов Zn.
Таким образом, на данном этапе исследования завершен дизайн генетической конструкции,
кодирующей белок слияния гемагглютинина и аминокислотной последовательности-мотива
цинкового пальца. Планируется получить достаточное количество данного белкового продукта
для изучения его самоорганизации в растворе в зависимости от концентрации ионов цинка.
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ДЕТЕРМИНАЦИИ РИСКА РАЗВИТИЯ
ПРОГРЕССИВНОГО АТЕРОСКЛЕРОЗА
Булгакова А.А., Вечканов Е.М., Сорокина И.А.
ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет»
bullet867@rambler.ru
Атеросклероз является сложным комплексным заболеванием и развивается на основе
тесного взаимодействия фенотипа больного и факторов среды.
С целью идентификации генов-кандидатов атеросклероза проведён биоинформационный
анализ распределения генотипов и аллелей функциональных полиморфизмов генов липидного
обмена: HindIII —гена липопротеинлипазы (ЛПЛ); HhaI—гена аполипопротеина Е (апоЕ);
TaqIB
—гена
белка
переносчика
эфиров
холестерина
(CETP);
I/D—
ангиотензинпревращающего фермента (АПФ). Полиморфизмы генов, вовлеченных в процессы
воспаления и иммунного ответа, также ассоциированы с прогрессированием атеросклероза. К
этим генам можно отнести: ген CRP (C-реактивного белка), ген ICAM1 (молекулы
межклеточной адгезии 1), ген IL1A (интерлейкина 1 а), ген PON1 (параоксоназы-1), ген PPARA
(пероксисомногопролифератор-запускаемого альфа-рецептора), ген SELE (Е-селектина), ген
TNFA (альфа-фактора некроза).
Значительное внимание уделяется абнормальным состояниям стенок сосудов, которые
способствуют активации свёртывания крови через внутренний механизм и увеличивать
95
Молекулярная биология
вероятность тромботических случаев. В этой связи в качестве генов-кандидатов,
ассоциированных с прогрессированием атеросклероза, рассмотрены гены, кодирующие
компоненты ренин-ангиотензиновой системы (AGN, ACE, AT2R1, CYP11B2), эндотелиальные
факторы (EDN1, NOS3, MTHFR), гены системы антиоксидантной защиты (PON1, PON2,
SOD2), гены системы гемостаза (PROS, FGB, THBD).Среди большого числа генов-кандидатов
особое внимание привлекает ген рецептора (тип 1) ангиотензина II (AGTR1), продукт
которогообусловливает основные кардиоваскулярные эффекты ангиотензина-II. Полиморфизм
гена AGTR1 A1166C является маркером повышенного риска развития атеросклероза.
Таким образом, полиморфные варианты генов липидного обмена, воспалительных
процессов и иммунного ответа, ренин-ангиотензиновой системы, эндотелиальных факторов,
антиоксидантной защиты и систем гомеостаза являются молекулярно-клеточной основой
патогенетических реакций развития прогрессирующего атеросклероза.
ВЛИЯНИЕ GD2-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ НА РЕГУЛЯЦИЮ
КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
Вишнякова П.А., Холоденко Р.В., Молотковская И.М.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
vpa2002@mail.ru
Множество лабораторий по всему миру занимаются проблемой лечения рака, которая по
сей день не утратила своей актуальности. В настоящее время разрабатываются новые подходы
для лечения онкологических заболеваний, одним из которых является использование в терапии
моноклональных антител. В качестве антигенных мишеней на поверхности опухолевых клеток
могут выступать не только молекулы белковой природы, но также и липиды, например,
ганглиозиды. Так, ганглиозид GD2 высоко экспрессирован на ряде опухолей. Ранее в нашей
группе была показана прямая апоптоз-индуцирующая активность GD2-специфичных антител
(GD2-Mab) на клетках мышиной лимфомы EL-4 и изучены механизмы проведения
апоптотического сигнала.
В данной работе был отработан метод окрашивания клеток красителем CFSE и их
многопараметрического цитометрического анализа. Для оценки клеточной гибели
использовали пропидиум йодидный тест. Также проводили внутриклеточное окрашивание
циклинов для проточной цитофлуориметрии.
Результаты, показали, что 24-х часовая инкубация клеток с GD2-Mab и классическим
химиопрепаратом доксорубицином привела к появлению апоптотических клеток. В то же
время, живые по морфологическим признакам клетки, обработанные доксорубицином и GD2Mab, обладали существенно большей интенсивностью флуоресценции CFSE относительно
интактных клеток, что говорит о низком уровне пролиферации в пуле живых клеток,
подвергшихся воздействию препаратов. Таким образом, воздействие исследуемых веществ
приводит к двум эффектам: цитостатическому и цитотоксическому. Анализ прохождения
клеточного цикла в PI-тесте показал значительное снижение доли клеток, находящихся в G1
стадии, как под действием доксорубицина, так и GD2-Mab. Для клеток, обработанных
доксорубицином, наблюдается значительное накопление в G2 стадии, воздействие GD2-Mab
приводит к равномерному распределению клеток по стадиям клеточного цикла. Изучение
механизмов наблюдаемых эффектов станет следующим этапом исследования.
Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., государственный контракт
№П1065.
ВЛИЯНИЕ N-КОНЦЕВОГО АЦЕТИЛИРОВАНИЯ НА СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПАРВАЛЬБУМИНА
96
Молекулярная биология
Вологжанникова А.А., Емельяненко В.И., Жадан А.П., Казаков А.С., Пермякова
М.Е, Лаптева Ю.С., Князева Е.Л., Пермяков С.Е.
ФГБУН Институт биологического приборостроения с опытным производством
Российской академии наук
lisiks.av@gmail.com
N-концевое ацетилирование (Nt-ацетилирование) - это универсальная энзиматическая
модификация белков, широко распространенная у эукариот, несущая не вполне ясную
функцию. Хотя некоторые аспекты Nt-ацетилирования хорошо изучены, информация о
молекулярных последствиях Nt-ацетилирования на уровне белкового субстрата крайне
ограничена.
Нами исследовано влияние Nt-ацетилирования на свойства парвальбумина (ПА),
растворимого Ca2+-связывающего фактора релаксации быстрых скелетных мышц, с
использованием комбинации биофизических и биохимических методов. N-концевая ацетильная
группа интактного ПА отсутствует в бактериально экспрессированном рекомбинантном (WT)
белке, что подтверждено масспектрометрически. По сравнению с интактным α-ПА щуки, WT
белок демонстрирует изменение термостабильности (снижение на 26°C стабильности Mg2+загруженной формы и изменение теплового поведения Ca2+-загруженной формы), уменьшение
α-спиральности (на 24% и 7-10% для апо- и металл-связанных форм, соответственно), а также
снижение сродства к Ca2+ и Mg2+ (на 1-4 и 2-3 порядка величины, соответственно). Структурная
дестабилизация WT белка хорошо согласуется со снижением устойчивости белка к
расщеплению химотрипсином. Константы скорости диссоциации и ассоциации Ca2+ с WT
белком заметно (в 2-62 раз) отличаются от таковых для интактного ПА, что свидетельствует об
измененном функциональном статусе WT белка. Положительное влияние N-концевой
ацетильной группы на свойства ПА не наблюдалось для крысиного α-ПА, демонстрирующего
сходные свойства интактной и WT форм белка. Несмотря на выраженное различие во влиянии
Nt-ацетилирования на свойства ортологов ПА, данная модификация нормализует физикохимические свойства ПА. В целом, показано, что Nt-ацетилирование необходимо для
поддержания структурного и функционального статуса некоторых парвальбуминов.
ОЦЕНКА АМИЛОИД-СПЕЦИФИЧНОСТИ НОВЫХ БЕНЗАНТРОНОВЫХ
ЗОНДОВ
1
1
Вус Е.А. , Трусова В.М. , Горбенко Г.П.1, Кирилова Е.2, Кирилов Г.2, Калниня И.2
1
Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина (Украина);
2
Даугавпилский университет (Латвия)
katenka.vus@mail.ru
В настоящее время актуальным является вопрос поиска флуоресцентных зондов,
способных изменять свои спектральные свойства при взаимодействии с фибриллярными
белковыми агрегатами, отложение которых в организме связано с развитием большого
количества конформационных болезней человека.
Целью настоящего исследования являлась оценка чувствительности 14 бензантроновых
зондов к полярности и вязкости окружения путем анализа их спектральных свойств в разных
средах: 1) этанол (Э), 2) смесь глицерин/этанол (ГЭ) с содержанием глицерина 67.4%, и 3)
амилоидные фибриллы яичного лизоцима, полученные in vitro путем шестидневной инкубации
раствора белка (30 мг/3 мл) в глициновом буфере при температуре 65 ˚С. Связывание зондов с
фибриллами лизоцима сопровождалось сдвигом максимума спектра флуоресценции в
коротковолновую область по сравнению со спектрами зондов в буфере. Данный эффект можно
объяснить переносом красителей в менее полярную среду, а также иммобилизацией
флуорофоров в молекуле белка, что затрудняет их вращение и уменьшает тем самым
вероятность безызлучательной деактивации зондов. Кроме этого, и связывание красителей с
фибриллярным лизоцимом, и помещение их в ГЭ, вызывало 10-кратное увеличение
анизотропии флуоресценции бензантронов по сравнению с зондами в буферном растворе, что
свидетельствует об их чувствительности к вязкости окружения. Образование комплексов
97
Молекулярная биология
белок-зонд сопровождалось также возрастанием квантового выхода флуоресценции зондов в
присутствии фибрилл. Примечательно, что зонды, показавшие возрастание интенсивностей
флуоресценции в смеси глицерин/этанол (например, для АМ18, IAH, IBH, ISH) по сравнению с
интенсивностями флуоресценции в более полярном и менее вязком этаноле (т.е. большую
чувствительность к вязкости, чем к полярности окружения), не все оказались лучшими
маркерами для фибриллярных агрегатов лизоцима. Например, если зонд АМ18 благодаря
высоким значениям квантового выхода (~0.23) в присутствии фибрилл и высоким значениям
относительного возрастания интенсивностей флуоресценции по сравнению с интенсивностями
«свободного» зонда и в присутствии нативного лизоцима, является одним из наиболее
чувствительных (среди 14 зондов) к амилоидному лизоциму, то зонды IAH, IBH, ISH находятся
в середине ряда, характеризующего падение чувствительности зондов к фибриллам лизоцима.
Перед ними в ряду – зонды А8, АМ1, А6, менее чувствительные к вязкости, но более
чувствительные к полярности окружения. Такое распределение можно объяснить различной
донорной силой заместителей бензантрона в положении 3, а также различным расположением
энергетических уровней локально возбужденного состояния (LE) и состояния с переносом
заряда (TICT), которое также зависит от заместителя.
Таким образом, высокая чувствительность бензантроновых зондов к фибриллам лизоцима
объясняется влиянием обоих факторов: вязкости и полярности окружения.
Работа была выполнена при поддержке гранта от Государственного фонда
фундаментальных исследований (проэкт номер Ф.41.4/014).
НОВЫЙ МЕТОД ШИРОКОМАСШТАБНОГО ПОИСКА
ГИПОМЕТИЛИРОВАННЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА
Баскаев К.К., Гаража А.В., Буздин А.А.
Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
garazha@gmail.com
Области метилирования ДНК устанавливаются в раннем развитии организма, и
поддерживаются на протяжении всего времени его развития, за исключением областей
тканеспецифических промоторов, статус метилирования которых может изменяться в течение
тканевой и клеточной дифференцировки [2]. Также статус метилирования некоторых локусов
может меняться при различных клеточных патологиях, например, при раке [3].
На данный момент существует стандартный метод определения статуса метилирования
произвольного локуса ДНК, основанный на различной чувствительности цитозина и 5метилцитозина к обработке бисульфитом в условиях высокой температуры и низкого рН [4,5].
Тем не менее, такое «точечное» определение не дает представления о распределении
метилированных последовательностей по геному в целом и не позволяет сравнивать целые
геномы, к примеру, нормальной и раковой клетки.
Нами был предложен новый метод широкомасштабного поиска гипометилированных
последовательностей генома (назван nMETR, non-MEthylated Tag Recovery, рис.1). Принцип
метода состоит в следующем: геномную ДНК обрабатывают чувствительной к метилированию
эндонуклеазой рестрикции (например, BspFNI, расщепляющей только по последовательностям
неметилированного тетрануклеотида CGCG с образованием тупых концов), к полученному
рестрикту лигируют супрессионные адаптеры и производят ПЦР-амплификацию с праймерами
к адаптеру и последовательности геномных повторов Alu. Затем продукты ПЦР секвенируют.
Для анализа результатов высокопроизводительного секвенирования, нами было
разработано
программное
обеспечение,
позволяющее
находить
адаптерную
последовательность,
последовательность
Alu-повтора,
картировать
полученные
последовательности на человеческий геном, а также проводить их фильтрацию по наличию
рестрикционного сайта CGCG. Кроме того, программа позволяет аннотировать требуемый
геномный локус, например, информацией о ближайшем CpG-островке.
Данное программное обеспечение позволило автоматически отобрать полноразмерные
прочтения и найти достоверные nMETR последовательности. В результате анализа данных
секвенирования пилотной библиотеки были выявлены 1113 различных локусов (содержащих
98
Молекулярная биология
6589 идентифицированных последовательностей), 711 (64%) из них оказались расположены
вблизи известного CpG-островка (не удалённее 200 п.н. от конца последовательности).
Таким образом, пилотные клонотеки действительно содержали последовательности,
фланкированные участками узнавания рестриктазы BspFNI с одной стороны и
последовательностью повтора Alu – с другой. Проверка результатов стандартным методом
бисульфитного секвенирования, подтвердила высокую эффективность метода nMETR,
особенно для выявления слабометилированных CpG-островков генома человека.
Предложенный метод универсален и может служить для быстрого обнаружения
эпигенетических маркеров одновременно для большого количества тканей и образцов.
ИММУНОФОТОТОКСИН 4D5SCFV-miniSOG НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ:
ПОЛУЧЕНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Гобова К.Е., Прошкина Г.М., Деев С.М.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
(Россия)
kgobova@gmail.com
Разработка лекарственных противоопухолевых агентов, способных с высокой
селективностью поражать раковые клетки, не затрагивая здоровые, является актуальной
задачей в современной терапии злокачественных опухолей человека. Концепция терапии
нацеленного воздействия на опухоль базируется на использовании макромолекулярных
иммуноконьюгатов, содержащих в своем составе как "адресный" домен, обладающий
специфической аффинностью к поверхностным опухолевым маркерам, так и цитотоксический
домен, вызывающий гибель раковой клетки. В иммунофотосенсибилизаторах цитотоксический
домен представлен фотоактивируемым соединением, способным вырабатывать активные
формы кислорода под действием света определенной длины волны.
В нашей лаборатории генноинженерным способом получен иммунофотосенсибилизатор,
способный селективно связываться с клетками аденокарциномы человека и вызывать их гибель
при облучении синим светом. Эффекторный домен в молекуле созданного нами
иммунофототоксина представлен высокотоксичным белком miniSOG (mini Singlet Oxygen
Generator), который, как известно из литературных данных, способен генерировать синглетный
кислород при облучении синим светом (Shu X. et al., PLoS Biol., 2011). Адресная часть
иммунотоксина представлена гуманизированным рекомбинантным мини-антителом 4D5-scFv,
которое содержит в составе единой полипептидной цепи вариабельные фрагменты тяжелой и
легкой цепей молекулы иммуноглобулина и селективно узнает рецептор эпидермального
фактора роста HER2/neu.
Фотоиндуцированная цитотоксичность полученного рекомбинантного белка изучалась на
HER2/neu-положительных клеточных линиях аденокарциномы человека SK-BR-3 и было
установлено, что белок в концентрации 1 µМ вызывает 100% гибель раковых клеток in vitro.
С помощью
конфокальной микроскопии показано,
что
созданный нами
иммунофотосенсибилизатор связывается с клеточным рецептором HER2/neu, а также
интернализуется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, проникая внутрь клетки.
Таким образом, в разработанном нами иммунофототоксине оба домена, адресный и
эффекторный, являются функциональными: сохранена специфичность к опухолевому антигену
и высокая фототоксичность.
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР ДЛИННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ
УРОВНЕЙ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГЕНОМНОЙ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК
BOMBUS TERRESTRIS
Горбачева Т.М.
Воронежский государственный университет, Воронеж (Россия)
99
Молекулярная биология
soki-tanya@yandex.ru
Энергозатраты во время полета насекомых велики, что достигается интенсивной работой
электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) и особенно ярко выражено у таких представителей, как
Bombus terrestris. Как известно, 2-5% О2 идет на образование активных форм кислорода (АФК).
Митохондрии выступают не только источником АФК, но и мишенью их действия.
Целью работы было измерить уровень повреждения митохондриальной и геномной ДНК с
помощью метода ген-специфичной количественной полимеразной цепной реакции длинных
фрагментов ДНК (кПЦР). Принцип метода основан на том, что АФК вызывают изменения в
структуре цепи ДНК (разрывы, образование сшивок), которые тормозят работу
термостабильной полимеразы, что влияет на выход продуктов кПЦР. Кроме того, данный
метод можно использовать для оценки ДНК репарации.
Объектом исследования служили летательные мышцы B. terrestris. Для проведения кПЦР
подбирали специфические праймеры к протяженным участкам ядерного и митохондриального
геномов: митохондриальный участок - 11198 п.о, прямой: tcgtcccggaatttattttg, обратный:
tatggcggcttttcattctt; геномный участок - 10578 п.о., прямой: caattcagcgcacactaaga, обратный:
cgtatttcgacttggcctgt. Измельченный гомогенизатором Поттера материал подвергали обработке 10
мМ Н2О2 в течение 15 и 30 мин, выделяли ДНК (Genomic DNA Purification Kit, Fermentas),
проводили кПЦР (Encyclo PCR kit, Evrogen) на приборе ДТ-332 (“ДНК-технология”) по
программе: 950Сx5 мин – денатурация; 940 Сx20 сек, 570 Сx40 сек, 720 Сx3 мин – 25 циклов; 720
Сx5 мин – финальная элонгация, концентрацию измеряли на спектрофотометре СФ-102, по
формуле Пуассона вычисляли частоту повреждений на фрагмент: λ=-lnAD/AO, где λ – частота
повреждений, AD – уровень амплификации поврежденной цепи, AO – уровень амплификации
неповрежденной цепи.
В результате было получено: в случае ядерного фрагмента – частота повреждений при
экспозиции с Н2О2 в течение 15 и 30 мин - соответственно 0,15 и 0,08. При 15 мин обработке
повреждений больше, чем при 30 мин. Скорее всего, это связано с тем, что для ферментных
систем репарации нужно значительный промежуток времени для исправления возникших
повреждений. Для митохондриального фрагмента - частота повреждений при экспозиции с
Н2О2 в той же концентрации в течение 15 и 30 мин - соответственно 0,05 и 1,14. Таким образом,
обработка Н2О2 в течение 30 мин вызывает повреждения в обоих геномах, но в
митохондриальном геноме повреждения в 14 раз сильнее. Несмотря на наличие
антиоксидантных систем и репарационных ферментов митохондрии не обеспечивают
высокого, подобного ядерному, уровня защиты генома от АФК.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА И ПОЛОЖЕНИЯ МЕСТ СЛУЧАЙНОЙ ИНТЕГРАЦИИ
ИЗВЕСТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В КЛЕТОЧНЫЙ ГЕНОМ
Гордеев А.А., Четверина Е.В., Четверин А.Б.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка
Российской академии наук
aagordeev@gmail.com
Мы разработали метод прямого выделения клонов путем выращивания колоний
эукариотических клеток в плоской трехмерной культуре, полученной с помощью слитых
гидрогелей. Этот метод использовали для выделения линий клеток, стабильно продуцирующих
зеленый флуоресцентный белок (GFP), из популяции эмбриональных человеческих клеток HEK
293, трансформированных GFP-кодирующей плазмидой, не содержащей последовательностей,
обеспечивающих репликацию плазмиды в эукариотической клетке или направляющих ее
интеграцию в геном. В таких условиях стабильная продукция GFP может быть только
результатом случайной (не сайт-специфической) интеграции его гена в хромосомную ДНК.
Было получено несколько линий с различающимися фенотипическими признаками, такими как
интенсивность флуоресценции и скорость роста клеток. Целью данной работы было
определение числа интегрированных копий гена GFP и их точного местоположения в
клеточных хромосомах.
100
Молекулярная биология
Первую задачу решали путем определения числа копий гена GFP в образце, содержащем
известное число клеток, с помощью метода молекулярных колоний. Результаты показывают,
что в каждом исследованном случае на один диплоидный набор хромосом приходится лишь
одна копия гена GFP.
Для решения второй задачи разработали метод, позволяющий определить точное место
интеграции известной экзогенной последовательности в отсутствие какой-либо
дополнительной информации кроме того очевидного факта, что интегрирована селективная
часть этой последовательности, то есть та, которая кодирует селективный признак (в данном
случае, GFP). Принцип метода состоит в том, что выделенную хромосомную ДНК полностью
расщепляют с помощью эндонуклеазы рестрикции, для которой хотя бы один сайт есть в
селективной части и нет сайтов в остальных частях экзогенной последовательности (вставки).
Полученные фрагменты ДНК подвергают самолигированию с образованием кольцевых
структур. Затем два кольца, включающие участки вставки с прилегающими к ним участками
хромосомы, размножают в ПЦР с использованием пар направленных врозь праймеров,
специфичных к селективной части. Образующиеся линейные продукты представляют собой
фланкированные экзогенными последовательностями искомые участки хромосомы.
Секвенирование продуктов позволяет точно установить обе границы и размер интегрированной
последовательности.
ЭНДОЦИТОЗ СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ ПРИ СПОНТАННОЙ СЕКРЕЦИИ
МЕДИАТОРА
Григорьев П.Н., Зефиров А.Л.
ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Росздрава
grigorievp@yahoo.com
Несмотря на продолжительный период изучения механизма передачи информации в
синапсе, остается неизвестным вопрос, участвуют ли в спонтанной и вызванной секреции те же
самые везикулы, или существуют две различные популяции везикул, обслуживающих каждый
свой вид секреции.
В опытах на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки Rana
Ridibunda с использованием электрофизиологического (внутриклеточная регистрация
постсинаптических сигналов) и оптического (флуоресцентная конфокальная микроскопия)
подходов исследовались процессы спонтанной и вызванной секреции медиатора и экзоэндоцитоз синаптических везикул.
Обнаружено, что частота миниатюрных потенциалов концевой пластинки в стандартном
растворе составляет 0,41±0.06 c-1. Исходный квантовый состав первого потенциала концевой
пластинки (ПКП), рассчитанный через дисперсию их амплитуд, при стимуляции с частотой 20
Гц составлял 470±80 квантов. В процессе высокочастотного раздражения наблюдалось
постепенное снижение квантового состава ПКП, который через 3 мин раздражения составлял
8.2±2.7% от исходного уровня. При раздражении нерва (20 Гц, 3 мин) в содержащем FM 1-43
(2-6 мкМ) растворе в двигательном нервном окончании появлялись флуоресцентные пятна
(ФП), отражающие скопления везикул, участвовавших в вызванной секреции медиатора и экзоэндоцитозе. Последующая стимуляция секреции медиатора раздражением в стандартном
растворе (20 Гц) или добавлением раствора с увеличенной до 40мМ концентрацией ионов
калия приводила к выбросу красителя посредством экзоцитоза и исчезновению ФП. После 2-5
часовой экспозиции препарата в растворе, содержащем FM 1-43 (2-6 мкМ) обнаружено
появление ФП, отражающих скопления везикул, участвовавших в спонтанной секреции
медиатора и экзо-эндоцитозе. Флуоресцирующие пятна сохранялись при последующей
стимуляции секреции медиатора раздражением или гиперкалиевым раствором.
Полученные результаты позволяют предположить, что пулы везикул, участвующих в
спонтанной и вызванной секреции, различны, что требует дальнейшего исследования.
Исследование поддержано грантами РФФИ 11-04-00568-а и НШ-4670.2012.4.
101
Молекулярная биология
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УЧАСТКОВ ЛОКАЛИЗАЦИИ ДУПЛИКАЦИЙ D-СЕГМЕНТОВ
ГЕНА IgH В 15 ХРОМОСОМЕ ЧЕЛОВЕКА
Губский А.Ю.
Одесский национальный университет им. И.И. Мечникова
gubsky2003@mail.ru
В структуре генов иммуноглобулинов (Ig) и Т-клеточных рецепторов (TCR) выделяют
группы V-, D-, J-сегментов (кодируют вариабельную область белковой молекулы) и Ссегментов (кодируют константную область белковой молекулы). Установлено, что в геноме
человека, вне локусов Ig и TCR генов (в 1, 2, 8, 9, 15, 16, 21, 22 хромосоме), существуют, по
крайней мере, дупликации 63 V-, 10 D- и 4 C-сегментов этих генов. Дупликации 10 Dсегментов гена IgH (кодирует тяжелую цепь иммуноглобулина), обнаружены в 15 хромосоме в
районе 15q11.2. Исследуя участки локализации, найденных в 15 хромосоме человека (сборка
Build 37.3) структурных аналогов сигнальных последовательностей рекомбинации (RSS) генов
Ig, TCR человека, мы обнаружили отсутствие в её описании (в описании контига NT_037852.6)
какой-либо информации об участках локализации (координатах) дупликаций D-сегментов гена
IgH.
Эти данные также отсутствуют в более ранних описаниях нуклеотидной
последовательности 15 хромосомы. Данную ситуацию мы рассматриваем в качестве примера
не совершенства процесса аннотации генома человека. В этой связи, для того чтобы дополнить,
существующее в настоящее время, описание нуклеотидной последовательности 15 хромосомы
человека, мы выполнили работу в результате которой установили точные координаты
дупликаций 10 D-сегментов гена IgH в контиге NT_037852.6. Для этого, при помощи megablast,
мы провели выравнивание взятых из литературы последовательностей дупликаций Dсегментов с нуклеотидной последовательностью 15 хромосомы. Рассмотренные дупликации
имеют следующие координаты: IGHD1OR15-5b (209093..209115), IGHD1OR15-4b
(210050..210068), IGHD1OR15-3b (211158..211188), IGHD1OR15-2b (213655..213685),
IGHD1OR15-1b (216406..216422), IGHD1OR15-5a (1215823..1215845), IGHD1OR15-4a
(1216780..1216798), IGHD1OR15-3a (1217888..1217917), IGHD1OR15-2a (1220377..1220407),
IGHD1OR15-1a (1223129..1223145). Полученные данные позволили так же установить какие из
обнаруженных нами RSS появились в 15 хромосоме человека в следствие дупликаций
фрагментов IgH гена, а какие в результате случайных комбинаций нуклеотидов и
распространения повторов.
ПРИОНИЗАЦИЯ БЕЛКА SFP1 У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
ЗАВИСИТ ОТ ГЕНОТИПИЧЕСКОГО ФОНА ШТАММА
Дроздова П.Б., Радченко Э.А., Рогоза Т.М., Хохрина М.А., Миронова Л.Н.
Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург (Россия)
drozdovapb@gmail.com
У дрожжей Saccharomyces cerevisiae найдено несколько белков, способных существовать в
специфической агрегированной форме, называемой прионной. Особенностью прионной
конформации является её способность индуцировать аналогичный конформационный переход
других молекул того же белка. Таким образом, прионы дрожжей — наследственные
детерминанты белковой природы. Некоторые из них, в том числе детерминант [ISP+], прионная
форма транскрипционного фактора Sfp1, влияют на эффективность терминации трансляции,
что может изменить эффективность считывания стоп-кодонов, возникших в результате
мутаций в кодирующей части гена.
[ISP+] обнаружен по снижению эффективности считывания стоп-кодонов, то есть
антисупрессии, в штаммах, несущих нонсенс-супрессорную (приводящую к считыванию стопкодонов как значащих) мутацию sup35-25 или sup35-10 в гене SUP35, кодирующем фактор
терминации трансляции eRF3. Позже было показано, что для проявления [ISP+], помимо
мутаций sup35, необходимо наличие криптической (не обладающей собственным
102
Молекулярная биология
супрессорным эффектом) мутации в гене SUP45, кодирующем фактор терминации трансляции
eRF1. При этом комбинация мутаций sup35 и sup45 в каждом случае специфична.
Вероятность возникновения [ISP+] возрастает при сверхпродукции белка Sfp1. В связи с
этим представляет интерес изучение эффектов сверхэкспрессии гена SFP1 в штаммах, несущих
различные мутации sup35, на генотипическом фоне, отличающемся от генотипического фона
штаммов, в которых [ISP+] был обнаружен ранее. Для этого мы использовали штамм дрожжей
с делецией SUP35, имеющий независимое происхождение от штаммов, использованных ранее.
Клетки этого штамма трансформировали центромерными плазмидами, несущими мутантные
аллели sup35-10, sup35-25, sup35-228 и sup35-240, а затем — мультикопийной плазмидой,
несущей SFP1. Анализ фенотипа полученных трансформантов показал, что сверхэкспрессия
SFP1 приводит к антисупрессии по отношению ко всем использованным мутациям sup35. Мы
предположили, что этот эффект обусловлен увеличением количества белка Sup35 в клетках,
сверхэкспрессирующих SFP1, приводящим к компенсации дефекта терминации трансляции.
Это предположение было подтверждено с помощью вестерн-блоттинга, показавшего
увеличение количества белка Sup35 при сверхэкспрессии SFP1 в 1,6-4 раза в зависимости от
клона. Вместе с тем после элиминации мультикопийной плазмиды у всех изученных клонов с
мутациями sup35-25, sup35-228, sup35-240 и более 95% клонов с sup35-10 наблюдалось
восстановление нонсенс-супрессии. Это говорит о том, что на таком генотипическом фоне
[ISP+] не возникает или возникает с намного меньшей частотой. Нельзя также исключить, что
прионизация Sfp1 в этих штаммах происходит, но не проявляется фенотипически в связи с
отсутствием криптических мутаций в гене SUP45. Дальнейший анализ [ISP+]-статуса
полученных клонов и их генотипа является предметом текущей работы.
Работа поддержана РФФИ (11-04-00146) и грантами Президента РФ (НШ-5345.2012.4 и
МК-165.2012.4).
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ УКРАИНСКИХ
СОРТОВ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО (TRIFOLIUM PRATENSE L.) ПО ISSRМАРКЕРАМ
Дугарь Ю.Н.
Харьковский национальный агарный университет им. В.В. Докучаева, Харьков
(Украина)
julijadugar@rambler.ru
ДНК-маркеры являются удобным инструментом для исследования молекулярногенетической структуры сортов сельскохозяйственных культур. Среди многочисленного числа
молекулярных маркеров особое место занимают ISSR-маркеры. Они относятся к полилокусной
группе маркеров, не требуют предварительного секвенирования, больших затрат ресурсов и
времени для анализа. Данные о проведении экспериментов по изучению генома клевера
лугового с помощью ISSR-маркеров в литературе отсутствуют. Цель нашей работы - изучение
молекулярно-генетического полиморфизма 15 украинских сортов клевера лугового с помощью
ISSR-маркеров.
ДНК выделяли из смеси семян СТАВ-методом. Для проведения ПЦР использовали 10
ISSR-праймеров: ISSR5, ISSR807, ISSR810, ISSR812, ISSR825, ISSR826, ISSR834, ISSR842,
ISSR 846, ISSR 857. Амплификацию ДНК проводили в пробирках с лиофилизированным
набором реактивов для ПЦР (GenePak PCR core) в амплификаторе «Терцик» (Россия).
Конечный объем реакционной смеси составил 20 мкл: 20 нг ДНК и 0,2 мкМ праймера.
Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в
1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (1г/100мл). Электродный буфер
использовали с низкой ионной силой. Молекулярный вес ампликонов рассчитывали с помощью
программы “TotalLab TL120”. Уровень полиморфизма вычисляли как соотношение
полиморфных локусов к общему количеству локусов для каждого праймера и выражали в
процентах.
Из 10 праймеров 9 детектировали полиморфизм. С использованием праймера ISSR857
амплифицировался только 1 компонент (~ 852 пн), т.е. все сорта клевера лугового были
103
Молекулярная биология
мономорфными по выявленному локусу. Количество ампликонов варьировало в пределах от 4
до 16 для ISSR5 и ISSR810, соответственно, что в среднем составило 7,5 ампликонов на один
праймер. Размер выявленных фрагментов варьировал от ~105 до ~1591 пн. Для некоторых
сортов обнаружены уникальные, присущие только им, компоненты, которые могут
представлять интерес для дальнейших генетико-селекционных исследований. Всего
исследовано 75 ампликонов, из которых 59 были полиморфными (78,7%).
Таким образом, использование ISSR-анализа позволило изучить межмикросателлитные
участки генома клевера лугового и выявить достаточно высокий уровень молекулярногенетического полиморфизма между украинскими сортами клевера лугового.
ДНК-СВЯЗУЮЩИЕ СВОЙСТВА БЕЛКА RecX ИЗ ESCHERICHIA COLI
Дудкина А.В., Швецов А.В., Бахланова И.В., Байтин Д.М.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт
ядерной физики им. Б.П. Константинова», НИЦ «Курчатовский институт»
doudkina@mail.ru
Белок RecA – центральный фермент гомологичной рекомбинации в бактериальной клетке,
обеспечивающий поиск гомологии между двумя молекулами ДНК и обмен гомологичных
нитей. Его активность регулируется вспомогательными белками, в число которых входят SSB и
RecX. Белок SSB взаимодействует с онДНК, препятствуя инициации филамента белком RecA,
но если инициация произошла, он расплавляет вторичную структуру ДНК, позволяя RecA
занять все свободные сайты онДНК. Белок RecX – негативный регулятор белка RecA in vivo и
in vitro, он препятствует элонгации филамента, приводя к его диссоциации от онДНК. Мы
показали, что белки RecX и SSB –функциональные антагонисты: в присутствии SSB
значительно снижается негативное воздействие RecX на RecA. Конкуренция осуществляется
опосредованно, так как данных в пользу прямых межбелковых взаимодействий между RecX и
SSB не найдено.
Мы изучали механизм регуляции белка RecA белком RecX, используя преимущества,
которые дает точечная мутация D112R. По таким биохимическим показателям, как скорость
гидролиза АТР или степень олигомеризации, мутантный белок RecAD112R не отличается от
белка дикого типа.
Белок RecAD112R устойчив к действию RecX и более эффективно конкурирует с SSB за
сайты связывания на онДНК, чем RecA дикого типа, а также активнее мультимеризуется на
онДНК. Мы предложили модель, в которой повышенная устойчивость мутанта RecAD112R к
RecX может определяться в ходе особых конкурентных отношений с белком SSB. При высокой
концентрации SSB наклон кривой активности АТРазы, определенной в присутствии белка
RecX, не слишком отличается от такой кривой, полученной в отсутствие RecX. Вместе с тем, в
опыте с poly(dT) и в отсутствии SSB филамент RecAD112R обладает устойчивостью к RecX.
Методами молекулярного моделирования и докинга было показано, что минимальное
расстояние от RecX до аминокислотного остатка в положении 112 в комплексе
RecA::онДНК::ATP::RecX составляет около 28 Ǻ, что исключает возможность прямого влияния
замены D112R на взаимодействие с RecX.
Мы полагаем, что в основе повышенной устойчивости RecAD112R к RecX скорее всего
лежит изменение динамики взаимодействия филамента с онДНК. Нами предложена модель
ингибирования ATPазы RecA белком RecX, в которой мономеры мутантного белка эффективно
опережают связывание RecX с растущим концом филамента. Такая модель не только может
объяснить преимущество RecA с повышенной динамикой филаментации, вызванной заменой
D112R либо ATP®dATP, но и разъясняет природу антагонизма между SSB и RecX. Занимая
сайт онДНК перед филаментом, SSB удерживает пространство на этом участке ДНК от
взаимодействия с RecX, позволяя новым мономерам RecA достраивать филамент.
Обнаруженная нами способность белка RecX связываться с онДНК позволяет
предположить, что RecX остается на онДНК после разборки филамента, откуда смещается
белком SSB.
Работа поддержана грантом РФФИ 11-04-01229-a.
104
Молекулярная биология
ИСКУССТВЕННЫЙ БЕЛОК АЛЬБЕБЕТИН СПОСОБЕН ОБРАЗОВЫВАТЬ
ПУЧКИ АМИЛОИДНЫХ ФИБРИЛЛ РАЗМЕРОМ ДО 100 МКМ
Егорова А.Г., Балобанов В.А., Катина Н.С., Мачулин А.В., Елисеева И.А., Ильина
Н.Б., Черткова Р.В., Долгих Д.А., Бычкова В.Е.
Институт белка РАН, Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова РАН
aegorova@phys.protres.ru
Образование амилоидных агрегатов является одним из свойств полипептидной цепи.
Исследование этого процесса актуально как с точки зрения медицины, так и с точки зрения
биоинженерии. Искусственно сконструированный белок альбебетин представляет собой
полипептидную цепь из 73 аминокислотных остатков. Структурно он состоит из двух
идентичных α-β-β элементов, но не имеет плотной упаковки боковых групп. Этот белок
способен при определённых условиях образовывать амилоидные агрегаты. Изучение
образования таких агрегатов альбебетином было проведено методами флуоресценции, КД в
дальней УФ области, атомно-силовой и флуоресцентной конфокальной микроскопии.
Результаты микроскопического исследования показывают, что в процессе образования
агрегатов в течении 48 часов формируются пучки амилоидных фибрилл длиной до 100 мкм и
около 5-10 мкм в поперечнике. Эти фибриллы связывают тиофлавин Т, являющийся
специфическим красителем амилоидных агрегатов, при этом интенсивность его флуоресценции
повышается в 30 раз. Спектры КД в дальней УФ области показывают, что белок в результате
процесса агрегации претерпевает значительное изменение вторичной структуры. По данным
литературных источников в состав остова амилоидной фибриллы входит лишь небольшая часть
белка (~ 8-10 а.к.о.), а это значит, что оставшаяся часть может каким либо образом принимать
участие во взаимодействии фибрилл между собой и образовании ими больших пучков.
Свойство альбебетина образовывать столь большие пучки может найти какое-либо
практическое применение.
Работа поддержана программой МКБ РАН, грантами РФФИ(09-04-01348) и
ФАНИ(02.770.11.0295).
НЕОБЫЧНЫЕ СВОЙСТВА РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ DEINOCOCCUS
RADIODURANS
1,2
Есюнина Д.М. , Пупов Д.В.1, Кульбачинский А.В.1
1
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной
генетики Российской академии наук; 2Московский государственный университет им.
М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва (Россия)
es_dar@inbox.ru
РНК-полимераза (РНКП) – фермент, осуществляющий транскрипцию, то есть синтез РНК
на ДНК матрице. Cтруктура и механизмы регуляции активности РНКП схожи у разных
организмов, однако, адаптация к условиям обитания может играть большую роль в различиях
некоторых свойств этого фермента. Катализ в активном центре РНКП осуществляется при
участии двух ионов металла, координированных остатками аспарагиновой кислоты
консервативного мотива NADFDGD. Считается, что in vivo в активном центре РНКП связаны
ионы магния. В то же время, in vitro реакции РНКП могут катализировать ионы других
двухвалентных металлов, прежде всего, марганца; однако, роль этих металлов в синтезе РНК в
клетках остается неизвестной. С этой точки зрения большой интерес представляет
исследование РНКП Deinococcus radiodurans– бактерии, живущей в ядерных реакторах. Ранее
было показано, что устойчивость этой бактерии к повышенному уровню радиации тесно
связана с повышением концентрации ионов марганца в клетке. Поэтому в данной работе мы
исследовали активность РНКП D. radiodurans в сравнении с РНКП Escheirichia coli в
105
Молекулярная биология
присутствии ионов магния и марганца на всех стадиях транскрипции: инициации, элонгации и
терминации. Как оказалось, в отличие от РНКП E. coli, активность РНКП D. radiodurans на
стадии инициации значительно повышается в присутствии ионов марганца. Марганец также
несколько снижает точность включения нуклеотидов на стадии элонгации транскрипции. Ионы
марганца стимулируют реакцию расщепления РНК у обеих РНКП, при этом у РНКП D.
radiodurans в присутствии ионов марганца изменяется картина расщепления. На стадии
терминации транскрипции РНКП D. radiodurans также проявляет значительные отличия от
РНКП E. coli. Выявленные различия могут играть роль в регуляции активности РНКП этих
бактерий in vivo.
Работа поддержана ФЦП «научные и научно-педагогические кадры инновационной
России» на 2009-2013 годы (госконтракт № 02.740.11.0771) и Грантом Президента РФ для
государственной поддержки молодых российских ученых (МД-618-2011-4).
ОБРАЗОВАНИЕ НАПРЯЖЕННЫХ ЭЛОНГАЦИОННЫХ КОМПЛЕКСОВ ПРИ
ФОРМИРОВАНИИ СИГМА-ЗАВИСИМЫХ ПАУЗ В ХОДЕ ТРАНСКРИПЦИИ
РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ ESCHERICHIA COLI
Жилина Е.В., Есюнина Д.М., Кульбачинский А.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной
генетики Российской академии наук, Москва (Россия)
katerina-zhilina@rambler.ru
Синтез РНК бактериальной РНК-полимеразой (РНКП) на стадии элонгации транскрипции
не является непрерывным процессом и может сопровождаться паузами, которые различаются
по своей природе и выполняют регуляторные функции. Недавно было показано, что фактор
инициации – сигма-субъединица РНКП, основная роль которой заключается в узнавании
промоторных элементов в ДНК, может также связываться с элонгационным комплексом РНКП
E. coli, узнавая в нематричной цепи транскрибируемой ДНК последовательность,
напоминающую -10 элемент промоторов, и вызывать паузы транскрипции. Механизмы
структурных перестроек элонгационного комплекса, происходящих при образование сигмазависимой паузы, к настоящему времени изучены недостаточно. Используя модель
элонгационного комплекса in vitro и различные методы футпринтинга, мы показали, что
механизм формирования сигма-зависимых пауз транскрипции с участием РНКП E. coli
включает образование напряженных элонгационных комплексов, в которых внутри РНКП
находится избыточная ДНК. Это связано с тем, что при «заякоривании» элонгационного
комплекса в участке паузы, которое происходит за счет специфического связывании сигмасубъединицы с ДНК, РНКП продолжает удлинение РНК и прочтение ДНК спереди по ходу
транскрипции. При достижении РНК критической длины происходит изомеризация
напряженного комплекса в состояние “обратного смещения”. В таком состоянии 3’-конец РНКтранскрипта теряет связь с активным центром РНКП и элонгация останавливается –
формируется пауза транскрипции.
Работа поддержана Грантом Президента РФ для государственной поддержки молодых
российских ученых (МД-618.2011.4) и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009-2013 годы (госконтракт № 02.740.11.0771).
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ГОРОХА ПОСЕВНОГО (PISUM SATIVUM L.),
КОНТРОЛИРУЮЩАЯ ЭФФЕКТИВНЫЕ СИМБИОТИЧЕСКИЕ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ПОЧВЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
Жуков В.А., Неманкин Т.А., Рычагова Т.С., Жернаков А.И., Титов В.С., Сулима
А.С., Федорина Я.В., Штарк О.Ю., Борисов А.Ю., Проворов Н.А., Тихонович И.А.
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург - Пушкин (Россия)
106
Молекулярная биология
zhukoff01@yahoo.com
Растения семейства Бобовые (Fabaceae) способны вступать в симбиотические
взаимодействия с грибами арбускулярной микоризы, клубеньковыми бактериями и другими
полезными почвенными бактериями. Формирование симбиозов повышает устойчивость
растений к воздействию биотических и абиотических факторов. Изучение генетических систем
растения, ответственных за образование мутуалистических симбиозов, открывает возможности
для селекции новых сортов бобовых культур, направленной на повышение эффективности
симбиотических взаимодействий.
В пределах вида горох посевной можно выявить группы, демонстрирующие различную
эффективность симбиотических взаимодействий. Дикорастущие формы отвечают на
инокуляцию микробиологическими препаратами большими прибавками семенной
продуктивности, чем культурные сорта. Для облегчения внедрения данного признака в новые
сорта гороха и других культурных бобовых необходимо выявить генетические маркеры
эффективности симбиотических взаимодействий.
Секвенирование различных Sym-генов у линий гороха, контрастных по данному признаку,
не позволяет выявить корреляции аллельных состояний данных генов и степени эффективности
образуемых симбиозов. По нашему предположению, маркерами эффективного симбиоза
являются гены-симбиозины, кодирующие «молекулярную машину симбиоза». Использование
современных методов пиросеквенирования для масштабного секвенирования транскриптома
линий гороха с различной эффективностью симбиозов, позволит выявить такие маркеры.
Для повышения эффективности симбиозов бобовых в полевых условиях, на фоне активной
аборигенной микрофлоры, целесообразно использовать высокоэффективные штаммы
симбиотических бактерий и сорта бобовых растений, несущие комплементарные гены
взаимного узнавания.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ
(Государственные контракты № 02.740.11.0276, 16.512.11.2155, П1304), грантов президента РФ
(НШ-3440.2010.4) и РФФИ (09-04-91054, 10-04-00961, 10-04-01146).
СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ САЙТА СВЯЗЫВАНИЯ БЕЛКА PB1 И
БЕЛКА PA ВИРУСА ГРИППА А
Забродская Я.А., Егоров В.В., Матусевич О., Гармай Ю.П., Васин А.В., Киселёв
О.И.
Отдел молекулярной вирусологии ФГБУ НИИ гриппа МЗСР РФ, Отдел молекулярной
и радиационной биофизики ФГБУ ПИЯФ
zabryaka@gmail.com
Пептиды являются перспективной основой для создания лекарственных препаратов.
Достоинствами пептидов являются низкая токсичность и высокая специфичность
взаимодействия с целевым белком, недостатками – краткое время жизни в организме и
затруднённое проникновение в клетку. Недостатки пептидных препаратов могут быть
минимизированы оптимальным выбором N- и С- концевых аминокислотных остатков и
отсутствием в первичной структуре сайтов для распространённых в организме протеаз.
Концепция создания лекарств на основе пептидов подразумевает поиск активных сайтов
или функционально значимых участков на белке-мишени и подбор пептидов, способных к
специфическому взаимодействию с такими сайтами. Создание подходов для рационального
поиска потенциальных пептидных ингибиторов структурно-функциональных детерминант
белков позволит значительно расширить спектр терапевтических препаратов на основе
пептидов. Грипп является одним из инфекционных заболеваний, для которых проблема
создания новых противовирусных препаратов весьма актуальна. В данной работе
рассматриваются пептиды, потенциально способные взаимодействовать с целевыми белками
вируса гриппа, входящими в полимеразный комплекс.
В процессе развития инфекции, вызванной вирусом гриппа, ключевую роль играет РНКполимераза, состоящая из трёх субъединиц – PA, PB1 и PB2. В ряде работ было показано, что
структурной детерминантой взаимодействия белков PA и PB1 при образовании полимеразного
107
Молекулярная биология
комплекса вируса гриппа является фрагмент 1-25 белка PB1. Данная работа посвящена
изучению структурных особенностей N-концевого пептида из белка PB1 для разработки нового
потенциального пептидного ингибитора полимеразного комплекса вируса гриппа.
При анализе первичной структуры пептида PB1 1-25 обнаружен зеркально-симметричный
мотив (ЗСМ) 6-25. В ряде работ показана роль ЗСМ в формировании функциональных сайтов
белков, а также в олигомеризации. Показано, что частота встречаемости ЗСМ вблизи
функциональных сайтов превышает таковую в среднем по аминокислотным
последовательностям природных белков. Исходя из предположения о возможной роли ЗСМ в
образовании комплекса РА-РВ1, мы провели моделирование пространственной структуры
пептида РВ1 6-25 с помощью симуляции молекулярной динамики в присутствие растворителя
(100 нс). При анализе траекторий было установлено, что в рамках используемых методов
пептид склонен к образованию структуры типа бета-шпильки. Пептид приобретал данную
конформацию на ранних этапах симуляции. Дальнейшая симуляция приводила лишь к
незначительным перестройкам, не затрагивающим вторичную структуру пептида. В
предположении о наличии конформации бета-шпильки PB1 6-25 предложена первичная
структура потенциального пептидного ингибитора взаимодействия PB1 и PA – пептида PB1 613. Показано, что пептид PB1 6-13 способен взаимодействовать с пептидом PB1 6-25 in vitro.
Планируется изучить влияние пептида PB1 6-13 на свойства полимеразного комплекса вируса
гриппа.
ПОЛУЧЕНИЕ ДЕЛЕЦИОННЫХ МУТАНТОВ METHYLOBACTERIUM
RADIOTOLERANS ПО ГЕНАМ БИОСИНТЕЗА ФИТОГОРМОНОВ
Замахаева С.А., Екимова Г.А., Федоров Д.Н.
Уральский федеральный университет, Екатеринбург (Россия); Пущинский
государственный естественно-научный университет; Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.
Г.К. Скрябина РАН, Пущино (Россия)
s.zamakhaeva@yandex.ru
Аэробные метилобактерии широко распространены в природе и часто симбиотически
связаны с растениями. Эта связь обусловлена тем, что метилобактерии стимулируют рост и
развитие растений за счет продукции биоактивных веществ: фитогормонов (ауксинов,
цитокининов), а также витаминов. При этом метилобактерии потребляют метанол, выделяемый
растениями в значительном количестве в окружающую среду. Одним из модельных видов
метилотрофов, симбиотически связанных с растениями, является Methylobacterium
radiotolerans, для которого известна полная последовательность генома. В результате его
анализа выяснили, чтоM. radiotolerans обладает генами acdS, кодирующим 1аминоциклопропан-1-карбоксилатдезминазу,
miaA,
кодирующим
изопентенил-тРНКтрансферазу (биосинтез цитокинов), и ipdC, кодирующим индолил-3-пируватдекарбоксилазу
(биосинтез ауксинов), которые могут определять стимулирующее влияние метилобактерий на
растения.
Цель нашей работы - получение нокаут-мутантов M radiotolerans по генам miaA, acdS и
ipdC, а так же их функциональная проверка.
Для мутагенеза M. radiotolerans методом ПЦР амплифицировалифрагменты ДНК,
содержащие полные последовательности геновmiaA, acdS и ipdC, которые затем клонировали в
мобилизуемом суицидальном векторе pK18mob. Далее, с использованием различных
эндонуклеаз рестрикции вместо центральных частей генов клонировали кассеты устойчивости
к стрептомицину, тетрациклину и гентамицину, соответственно. Полученные плазмиды
использовали для генерации мутантов M. radiotolerans при помощи конъюгативного переноса с
применением штамма Escherichia coliS17-1. С помощью специфических методов анализа
фитогормонов, а также в результате исследования активностей ферментов доказано, что
штаммы ∆miaA, ∆acdS и ∆ipdC являются делеционными мутантами M. radiotolerans по
соответствующим генам.
108
Молекулярная биология
В дальнейшем планируется использовать данные мутанты M.radiotolerans для изучения
роли соответствующих генов в фитосимбиозе метилобактерий с растениями.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 10-04-00808-а и ГК 14.740.11.0111
СВЕТОИНДУЦИРУЕМЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СКОРОСТИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И
РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПО ФАЗАМ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ФОТОТОКСИЧЕСКИЙ
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК KILLERRED СОСТАВЕ ХРОМАТИНА
Злобовская О.А., Серебровская Е.О.
МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет; ИБХ РАН
olgazlob@yandex.ru
Фототоксичный красный флуоресцентный белок KillerRed, способный к генерации
активных форм кислорода при облучении зеленым светом, может быть использован в качестве
генетически кодируемого фотосенсибилизатора. Особый интерес представляет его ядерная
локализация, обеспеченная слиянием с коровым гистоном H2B, из-за крайней
чувствительности хроматина к воздействию активных форм кислорода. Во избежание
димеризации KillerRed, ведущей к потере функции слитого с ним H2B, была создана
псевдомономерная тандемная метка, содержащая две копии KillerRed, соединенные гибким
линкером. Тандемный KillerRed преимущественно образует внутримолекулярные димеры, что
не приводит к нарушению функции гистона; была получена клеточная линия, стабильно
экспрессирующая конструкцию H2B-tandem KillerRed (H2B-tKR).
Методом проточной цитофлуориметрии было показано, что при облучении клеток данной
линии (HeLa Kyoto H2B-tKR) наблюдается существенное снижение доли митотических и
находящихся в G1-фазе клеток, что сопровождается ростом доли клеток в S-фазе.
Предположительно, фотоповреждение геномной ДНК приводит к активации сверочной точки
S-фазы клеточного цикла: клетки не могут перейти к следующей фазе, пока не произойдет
полная репарация повреждений. Также наблюдается небольшое увеличение доли
полиплоидных клеток.
Методом индивидуальных колоний показано, что облучение оказывает значительное
влияние на частоту делений клеток, экспрессирующих H2B-tKR. Через 29 часов
культивирования облученных клеток наблюдается достоверная разница между средним
количеством клеток в колонии для контрольных клеток HeLa Kyoto и опытных HeLa Kyoto
H2B-tKR (для опытных клеток это значение меньше). Это может быть объяснено
необходимостью репарации ДНК клеток, подвергшейся фотоповреждению, и активацией
соответствующих сверочных точек клеточного цикла.
Выводы: влияние химерного белка H2B-tKR на клеточный цикл HeLa Kyoto при облучении
заключается в изменении распределения клеток по фазам клеточного цикла и снижении
частоты делений.
МУТАЦИИ ГЕНОВ ГЛУТАМАТЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
НЕЙРОТРАНСМИССИИ У ЛИЦ С ПСИХИЧЕСКИМИ РАССТРОЙСТВАМИ
Иванова Е.В, Лобанова Л.П., Зудина И.В.
Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского
ivanova_ev_89@mail.ru
В научной литературе активно обсуждаются гипотезы, предполагающие, что причиной
возникновения многих психических расстройств являются нарушения в функционировании
различных нейрохимических систем. В частности, возникновение различного рода мутаций в
генах глутаматергической системы может привести к сбоям в глутаматной нейротрансмиссии,
и, как следствие, к развитию у человека психических или когнитивных нарушений. Данная
работа посвящена выявлению корреляции между наличием полиморфных однонуклеотидных
109
Молекулярная биология
замен (SNP) в генах глутаматергической системы и предрасположенностью к развитию таких
психических расстройств, как шизофрения и биполярное аффективное расстройство (БАР).
Было исследовано 100 образцов ДНК пациентов психиатрических отделений больниц г.
Саратова, из которых 61 человек с установленным клиническим диагнозом БАР и 39 человек –
с диагнозом шизофрения. Контрольная группа была составлена из образцов ДНК здоровых
доноров (61 человек), не имеющих наследственных, психических и хронических заболеваний.
Анализировали 7 SNP, имеющих локализацию в пределах генов DAO, DAOА и GRIK4.
Амплификацию полиморфных участков генов осуществляли методом аллель-специфической
ПЦР. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов программ
Statistica v.5.5. Различия считали статистически достоверными при p<0.05.
Сравнительный анализ частот распределения полиморфных аллелей генов DAO, DAOА и
GRIK4 во всех группах наблюдения позволил выявить статистически достоверную корреляцию
между наличием двух SNP в гене GRIK4 и развитием БАР. У лиц, заболевших шизофренией,
наблюдалась аналогичная статистически достоверная корреляция только с одной нуклеотидной
заменой в гене GRIK4. Обнаруженные нами закономерности распределения частот аллелей и
генотипов исследуемых нами локусов в геномах психически нездоровых людей однозначно
свидетельствуют о вовлеченности гена GRIK4 в патогенез БАР. По всей видимости, это
происходит из-за фатальных изменений в организации высокоаффинной субъединицы
ионотропных глутаматных рецепторов каинатного типа, что в свою очередь обусловливает
нарушение процесса глутаматной нейротрансмиссии. На наш взгляд, аллельный полиморфизм
гена GRIK4 в данных двух SNP может негативно повлиять на фолдинг белка субъединицы
рецептора и привести к следующим последствиям: 1) произойдет нарушение общей структуры
рецептора, в результате чего увеличится/снизится или прекратится проницаемость ионного
канала; 2) изменится структура или расположение сайтов связывания с глутаматом, что также
может вызвать гипо-/гиперфункцию рецептора; 3) нарушится структура сайтов связывания с
продуктами работы метаботропных рецепторов, регулирующих проницаемость ионных
каналов постсинаптической мембраны. Выяснение характера их влияния на работу
глутаматергической системы в целом позволит приблизиться к пониманию этиологии и
патогенеза БАР и шизофрении, что, несомненно, может оказаться полезным при диагностике и
терапии этих серьезных заболеваний.
НОВЫЕ ИЗОФОМЫ ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ OCT-1
Игумнова Т.Н. Панкратова Е.В. Степченко А.Г.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной
биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
tanjnij86@mail.ru
Вопрос о регуляции транскрипции имеет важное значение для понимания механизмов
дифференциальной
активности
генов
в
онтогенезе
организма.
Единственный
транскрипционный фактор может участвовать в регуляции самых разнообразных процессов в
течение всей жизни организма. Примером полифункциональных молекул является белок Oct-1 .
Oct-1 принадлежит к POU-семейству факторов транскрипции. Транскрипция гена Oct-1
находится под контролем двух промоторов, промотор U – находится перед экзоном 1U,
который входит в состав вездесущих Oct-1 изоформ, а промотор L - перед экзоном 1L, который
входит в состав тканеспецифической Oct-1L изоформы. В настоящее время о роли Oct-1
известно, что кроме генов домашнего хозяйства, под его контролем находится транскрипция
многих тканеспецифических генов в иммунной системе и мозге.
Целью выполнения работы было исследование изоформ Oct-1. Методами 5’-RACE и
обратной транскрипции-ПЦР нами были выявлены две новые изоформы Oct-1 человека: Oct-1X
и Oct-1Y. Изоформа Oct-1X характеризуется наличием на 5’-конце мРНК Oct-1 нового экзона,
который сплайсируется с экзоном 2 в результате чего с мРНК Oct-1X транслируется
укороченный на N-конце белок, который не имеет первого экзона соответствующего
изоформам Oct-A или Oct-1L. Новая изоформа мРНК Oct-1Y образуется в результате
альтернативного сплайсинга при сплайсировании дополнительного экзона между экзоном 3 и
110
Молекулярная биология
экзоном 4 в молекуле Oct-1L. Присутствие нового экзона в этой мРНК приводит к образованию
множественных стоп-кодонов в 5’-области и открытая рамка считывания начинается с ATGкодона в новом экзоне. На N-конце молекулы Oct-1Y транслируется новая последовательность.
Методом ПЦР в реальном времени была изучена экспрессия этих изоформ в тканях человека и
показано, что Oct-1Y преимущественно экспрессируется в мозге, тогда как максимальная
экспрессия Oct-1X определяется в лимфоидных клетках.
В результате наших исследований обнаружены две новые изоформы фактора транскрипции
Осt1, которые отличаются на N- конце белка от известных изоформ Oct-1. Эти изоформы
экспрессируются преимущественно в мозге и лимфоидной ткани человека.
МУТАНТНАЯ ЛИНИЯ agnts3 D. MELANOGASTER – МОДЕЛЬ
НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ
Каминская А.Н., Медведева А.В., Журавлев А.В., Захаров Г.А., Долгая
Ю.Ф.,Теремецкая И.Ю., Паялина Т.Л., Саватеева-Попова Е.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии им.
И.П. Павлова Российской академии наук
kaminskayaan@mail.ru
LIMK1, являясь ключевым регулятором ремоделирования актина, вызывает перестройку
шипиков дендритов, обеспечивая тем самым синаптическую пластичность, обучение и память.
Ранее методом Вестен-блот анализа нами было показано, что у линий дикого типаBerlin,
Oregon- R и Canton-S – соотношение D- и С-изоформ LIMK1 представлено по-разному при
сопоставимом суммарном содержании. У мутантной линии agnts3 показано более высокое
содержание обеих изоформ LIMK1 по сравнению с Canton-S. При регистрации параметров
звукопродукции во время ухаживания у самцов agnts3 выявлено усиление частоты импульсов и
синусов. При определении нуклеотидной последовательности гена limk1 у анализируемых
линий в 5’-регуляторной и структурной областях генаlimk1 у Canton-S и Berlin обнаружены
однонуклеотидные полиморфизмы, которые у Oregon-R и agnts3 закреплены в форме
однонуклеотидных замен. Инсерция, зарегистрированная нами в интроне 1 гена limk1 у OregonR и agnts3, возможно, обуславливает формирование микро РНК гомологичной микро РНК dmemir-1006, способной регулировать звукопродукцию и формирование памяти. Методом условнорефлекторного подавления ухаживания самцовDrosophila при регистрации звукопродукции
была проведена оценка способности к обучению при двух режимах тренировки – 30 мин. и 5 ч.
У самцов agnts3 как после 30 мин, так и после 5 ч тренировки условно-рефлекторного
подавления ухаживания не наблюдается - обучение не происходит. С помощью
флуоресцентного красителя Thioflavin S и методов конфокальной микроскопии у самцов
линииagnts3 выявлены амилоидные включения в области нейромышечных контактов II
дорзального нерва в зоне ветвления аксонов образующих поперечные перемычки с большей
частотой по сравнению с Canton-S.
Таким образом, повышение содержания изоформ LIMK1 у agnts3сопровождается усилением
частоты импульсов и синусов при звукопродукции, отсутствием способности к обучению и
образованием белковых агрегатов, что является основными диагностическими признаками
нейродегенерации и позволяет использовать мутантную линию agnts3 для скрининга
лекарственных препаратов, корректирующих проявление нейродегенеративных нарушений.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АМИЛОИДНЫХ ФИБРИЛЛ ЛИЗОЦИМА С
ЛИПИДНЫМИ МОНОСЛОЯМИ
Касторная А.П., Трусова В.М, Горбенко Г.П.
Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина
anna_kastornaya@ukr.net
111
Молекулярная биология
Более чем 20 заболеваний человека, включая болезни Альцгеймера, Паркинсона, диабет 2
типа и др. характеризуются формированием нерастворимых высокоупорядоченных белковых
агрегатов (амилоидных фибрилл) и их отложением в различных тканях организма. Как
показали многочисленные исследования, амилоидные белки вызывают повреждение клеточной
мембраны, что приводит к нарушению клеточных функций. Несмотря на то, что за последние
годы был достигнут значительный прогресс в понимании токсичного действия амилоидов,
множество аспектов этой проблемы остаются невыясненными. В частности, на данный момент
нет единого мнения относительно того, разрушается ли мембрана путем проникновения в нее
зрелых фибрилл, белковых олигомеров или вследствие связывания с амилоидогенными
мономерами белка, что приводит к нуклеации и формированию фибрилл на мембране.
Ввиду этого, целью данной работы являлось изучение молекулярных особенностей
взаимодействия амилоидных фибрилл лизоцима с модельными мембранами. С использованием
монослоев Лэнгмюра была исследована способность фибриллярного белка встраиваться в
липидные монослои, состоящие из димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) и его смеси с
анионным липидом димиристоилфосфатидилсерином (ДМФС) (40 мол.% ДМФС).
Фибриллярные агрегаты лизоцима были получены путем инкубации белка в глициновом
буфере (рН=2.2) при температуре 60оС в течение 8 дней. Начальное поверхностное давление
(π0) липидной пленки было 10 мН/м. Введение в субфазу фибриллярного лизоцима привело к
возрастанию поверхностного давления в двух исследуемых системах, что свидетельствует о
встраивании фибрилл в монослой. При концентрации белка 0.08 мкМ увеличение
поверхностного давления (∆π) составило ~9 мН/м. С ростом концентрации лизоцима
увеличивалась степень и скорость проникновения белка в липидный монослой. При
концентрации фибрилл 0.56 мкМ поверхностное давление возросло на 14 мН/м в ДМФХ и на
16 мН/м в ДМФХ:ДМФС (40%) монослоях. На следующем этапе исследования были получены
кинетические кривые встраивания фибриллярного лизоцима и вычислены значения ∆π при
четырех различных π0. Линейная аппроксимация зависимости ∆π(π0) дала возможность
определить предельное поверхностное давление, при котором еще возможно встраивание
белка. Это значение оказалось равным 30 мН/м для ДМФХ монослоя и 40 мН/м для монослоя,
содержащего 40 мол.% ДМФС, что свидетельствует о более эффективном встраивании
фибриллярного лизоцима в отрицательно заряженные монослои. Учитывая тот факт, что
плотность упаковки липидных молекул в биологических мембранах соответствует
поверхностному давлению ~30 мН/м, можно предположить, что амилоидные фибриллы
лизоцима способны проникать в клеточные мембраны in vivo.
Работа была выполнена при поддержке государственного фонда фундаментальных
исследований (проект № Ф41.4/014).
СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ НОВОГО ФАКТОРА, РЕГУЛИРУЮЩЕГО
ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ
Качаев З.М., Воробьева Н.Е., Шидловский Ю.В.
ИБГ РАН, лаборатория регуляции экспрессии генов
k-z-m@mail.ru
Экспрессия генов – важный процесс, который контролируется большим количеством
различных факторов. Наиболее важную роль в регуляции экспрессии генов выполняют
факторы транскрипции.
Фактор транскрипции Supporter of Activation of Yellow Protein (SAYP) у Drosophila
кодируется геном e(y)3. Его гомологом у млекопитающих является белок PHF10. В нашей
лаборатории ранее охарактеризован данный белок. Молекулярная масса SAYP составляет
примерно 250 кДа. Показано, что данный белок способен собрать суперкомплекс BTFly массой
около 2 МДа, состоящий из Brahma и TFIID. Brahma является хроматин-ремоделирующим
фактором, TFIID – основным фактором транскрипции. BTFly привлекается на промоторы генов
и активирует их транскрипцию.
SAYP взаимодействует с ядерным рецепторным белком DHR3. DHR3 является
компонентом каскада, индуцируемого горомоном 20-гидроксиэкдизоном. DHR3 важен для
112
Молекулярная биология
эмбриогенеза во время развития личинки у дрозофилы. Также показано, что SAYP
взаимодействует с транскрипционным активатором Stat, компонентом Jak/Stat сигнального
пути. Jak/Stat путь участвует в формировании герминальных клеток и в морфогенезе, а также за
дифференциацию и пролиферацию клеток. Таким образом, показана достаточно
широкомасштабная роль транскрипционного коактиватора SAYP в развитии дрозофилы.
Гомолог PHF10 у мыши участвует в поддержании статуса стволовых клеток мозга.
SAYP состоит из N-концевого домена, двух цинковых пальцев типа PHD и нового
эволюционно- консервативного домена SAY. Функции SAY-домена были охарактеризованы
ранее: он выполняет функции транскрипционного активатора и служит основой для сборки
BTFly. Функциональная роль PHD доменов белка SAYP не установлена.
Для доменов такого типа характерно распознавание модифицированного, а также
немодифицированного состояния гистона Н3, т.е. они являются доменами, распознающими
гистоновый код. Эта функция важна в активации или репрессии генов-мишеней.
В ходе работы планируется выяснить роль PHD доменов в активации генов-мишеней. Для
этого будут изучены свойства полноразмерного белка SAYP и SAYP без PHD доменов.
ПОДБОР ОПТИМАЛЬНЫХ РЕФЕРЕНСНЫХ ГЕНОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РЕДИСА (RAPHANUS SATIVUS L.)
Кирюшкин А.С., Додуева И.Е.
Санкт-Петербургский государственный университет
k_91as@mail.ru
Одним из объектов исследований на кафедре генетики СПбГУ являются инбредные линии
редиса со спонтанным опухолеобразованием, которые используются для изучения
генетического контроля процессов пролиферации и дифференцировки растительных клеток. В
ряде случаев необходимо проведение количественного анализа экспрессии генов редиса
методом ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). Для нормализации данных по экспрессии
генов методом ОТ-ПЦР-РВ необходим подбор референсных генов; в качестве последних, как
правило, используют «гены домашнего хозяйства» (housekeeping genes), экспрессия которых
практически не зависит от стадии развития и внешних условий.
Поскольку ранее изучение экспрессии генов редиса методом ОТ-ПЦР-РВ не проводилось,
целью нашей работы являлся подбор оптимальных для этого объекта референсных генов. На
первом этапе были выбраны пять «генов домашнего хозяйства», которые широко используются
в качестве референсных генов у Arabidopsis thaliana: UBQ10, GAPDH, EF1a,TUA3 и 25S. На
основании имеющихся баз данных по последовательностям генов Arabidopsis thaliana и
Brassica rapa были подобраны праймеры к консервативным участкам геновUBQ10, GAPDH,
EF1a, TUA3 и 25S, которые были использованы для амплификации участков соответствующих
генов редиса. Анализ последовательностей ПЦР-фрагментов редиса показал высокий уровень
сходства с соответствующими участками генов арабидопсиса: 93% для EF1a и TUA3, 86% для
UBQ10 и GAPDH,85% для 25S. Для анализа стабильности экспрессии выявленных генов редиса
мы проанализировали их экспрессию в разных образцах: базальной и верхней частях
бескорневых эксплантов линий 19 и 30 при культивации на безгормональной среде и на среде с
цитокинином БАП, а также в разных органах проростков и взрослых растений редиса линий 19
и 30. Каждый образец был проанализирован в трех независимых биологических повторностях.
Для оценки стабильности экспрессии RsUBQ10, RsGAPDH, RsEF1a,RsTUA3 и Rs25S (Rs–
Raphanus sativus) мы использовали два метода: прямое сравнение пороговых циклов
экспрессии во всех пробах с подсчетом коэффициентов вариации (Cv) и анализ с помощью
статистической программы NormFinder. Наибольшая стабильность экспрессии была выявлена
для генов убиквитина (RsUBQ) и фактора элонгации 1a (RsEF1a).
Исследования поддержаны грантом РФФИ 11-04-01687-а, госконтрактом 02.740.11.0698,
грантом СПбГУ 1.38.67.2011 и грантом президента РФ по поддержке ведущих научных школ.
113
Молекулярная биология
СРАВНЕНИЕ ПРОФИЛЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ DMR ГЕНОВ IGF2 И H19 У
ОБРАБОТАННЫХ И НЕОБРАБОТАННЫХ TGFa ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ
ЭМБРИОНОВ МЫШЕЙ
1,2
Климов Е.А. , Ростамзадех Д.3, Головатенко-Абрамов П.К.3, Платонов Е.С.3,
Сулимова Г.Е.3
1
МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет; 2ГНУ ЦЭЭРБ
Россельхозакадемии; 3ИОГен РАН, Москва (Россия)
klimov_eugeney@mail.ru
Геномный импринтинг (ГИ) – эпигенетический процесс, обуславливающий репрессию
одного из двух аллельных генов, локализованного на материнской или отцовской хромосоме.
Один из механизмов избирательной репрессии генов при ГИ – метилирование ДНК. При
культивировании партеногенетических эмбрионов мыши in vitro с добавлением ростовых
факторов показано появление экспрессии репрессированных генов. Однако остается не ясным
механизм активации транскрипционной активности. ЛокусIgf2/H19 является традиционной
моделью для изучения феномена геномного импринтинга у млекопитающих.
Целью данной работы было сравнение характера метилирования дифференционально
метилируемых регионов (DMR) генов Igf2 и H19 у обработанных (n=4) и необработанных (n=5)
TGFа партеногенетических эмбрионов мышей на 9,5-й день беременности. Анализ
метилирования проводили методом бисульфитного секвенирования.
Нами показано, что DMR А и В гена H19 гипометилированы у 9,5-дневных
партеногенетических зародышей, обработанных TGFа, и их паттерны метилирования сходны с
таковыми у материнского аллеля нормальных зародышей. Три сайта связывания СТСF фактора
транскрипции (R1, R3 и R4) в регионах А и В у партеногенетических зародышей не были
метилированы на 9,5-й день беременности. Сравнение профилей метилирования DMR1 и
DMR2 гена Igf2 в группах обработанных TGFа и необработанных 9,5-дневных
партеногенетических эмбрионов мышей позволило впервые установить роль метилирования
CpG-островков Igf2-DMR2 (СpG 1-6), расположенных в 5-ом экзоне гена, в регуляции
экспрессии Igf2. Наблюдаемое изменение метилирования при обработке TGFа говорит о
важности этого процесса в формировании явления ГИ, а также о возможности модулировать
его эффекты.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы Президента РФ «Поддержка
молодых кандидатов наук» (МК-2761.2011.4).
ИНГИБИТОРЫ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ
Ковалевская Ж.И.1, Чулин А.Н.2, Солонин А.С.1
1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН; 2Филиал Института
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино
(Россия)
hemolysin@rambler.ru
Цитолитические пороформирующие токсины, продуцируемые микроорганизмами внутри
организма хозяина, играют главенствующую роль в развитие заболеваний. Один из
цитолитических порообразующих токсинов Bacillus cereus – гемолизин II (HlyII) представляет
особый интерес, так как он широко распространен среди бацилл цереусной группы. Ген
гемолизина II обнаружен не только в B. cereus, который может вызывать диаррейный и
эметический синдромы, а также заболевания глаз, маститы и другие болезни, но и в клетках B.
thuringiensis, являющимся патогенным для насекомых и использующимся для производства
инсектицидных препаратов, и в клетках B. anthracis, чьи отёчный и летальный токсины
участвуют в развитие инфекционного процесса сибирской язвы. Гемолизин II продуцируется
бактерией в окружающую среду в форме мономера и, взаимодействуя с клеточными
мембранами, олигомеризуется с образованием открытых трансмембранных структур – нанопор,
что приводит в итоге к лизису клетки, т.е. к ее гибели. При заражении макроорганизма
114
Молекулярная биология
бактерией, продуцирующей гемолизин II, может происходить лизис множества клеток, что
приводит к нарушению функционирования атакуемых органов и гибели организма хозяина.
Таким образом, цитолитическое патогенное действие HlyII на разные клетки и макроорганизмы
обусловлено образованием ионпроводящих каналов в клеточных мембранах. Цитолитические
токсины, являются основными факторами патогенности и их исследование имеет выраженный
медицинский аспект. В настоящее время отсутствуют эффективные пути защиты организма от
действия гемолизина Bacillus cereus, чтобы нейтрализовать действие гемолизина II и подобных
пороформирующих токсинов, мы провели поиск веществ-ингибиторов (блокаторов) действия
уже секретированного токсина в организм хозяина. Нами отобраны вещества с разной
эффективностью нейтрализующие действие порофомирующего токсина гемолизина II
оказываемое на эритроциты человека, это ПЭГи (600-6000) и циклодекстрины. Внешний
диаметр тора β-циклодекстрина 15,3 Å, а диаметр гептамерной поры гемолизина II,
полученный из анализа осмотической протекции, на основе электронных микрофотографиях и
3D гомологичного моделирования составляет около 2 нм при входе в пору, 1.2 нм при начале
трансмембранного стебля и от 1 нм до 1.6 нм вдоль остального стебля, можно предположить,
что циклодекстрин должен хорошо размещаться внутри кэп домена, тем самым уменьшая
проход поры и вызывая ингибирование гемолиза эритроцитов. Химически синтезированные
производные циклодекстринов протестированы на способность предотвращать гемолиз (лизис)
человеческих эритроцитов, вызываемый пороформирующими токсинами, они с разной
эффективностью закрывают пору, и как следствие вызывают до 100% ингибирование гемолиза
эритроцитов.
Таким образом, подобраны вещества способные с разной эффективностью
нейтрализовывать действие порофомирующего токсина гемолизина II и подобных ему
токсинов.
Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России» на 2009-2013 годы.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРЫ
СОВРЕМЕННЫХ СОРТОВ ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ НА ОСНОВЕ
АНАЛИЗА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ
Колесник О.А.1, Чеботарь С.В.1, Хохлов А.Н.2, Сиволап Ю.М.1
1
Южный биотехнологический центр в растениеводстве НААН; 2Селекционногенетический институт ─ Национальный центр семеноводства и сортоиспытания
НААН, Одесса (Украина)
emerald-olga@ukr.net
Мировые генетические ресурсы растений рассматриваются как важный источник
улучшения сельскохозяйственных культур на ближайшие десятилетия. В странах Западной
Европы украинские сорта-популяции, имеющие высокое качество зерна и стойкость к
абиотическим и биотическим стрессам, часто используют как исходный селекционный
материал. Новый сорт сельскохозяйственной культуры, как результат научноисследовательской разработки является инновационным продуктом. Регистрация украинских
сортов и гибридов за рубежом сдерживается или блокируется в оновном из-за генетической
неоднородности, которая противоречит международным требованиям, в частности правилам
УПОВ (Международного союза по охране новых сортов растений).
С целью исследования молекулярно-генетического полиморфизма сортов пшеницы
селекции разных лет, пополнения базы данных аллелей, характеризующей современные сорта,
а также для определения генетических дистанций (ГД) между современными сортами озимой
мягкой пшеницы юга Украины, нами исследовано 27 сортов пшеницы селекции СГИ-НЦНС с
помощью микросателлитного анализа (МС-анализа) 11 высокополиморфных локусов.
Определение аллельного состава проводили, анализируя зерна пяти колосьев каждого сорта.
Кластерный анализ позволил выявить сложную структуру взаимосвязей между изученными
генотипами пшеницы. Для получения подробной информации о генетической однородности
сортов проводилось определение ГД по данным МС-анализа зерен отдельных колосьев каждого
115
Молекулярная биология
сорта. Исследованные сорта полностью дифференцированы по данным молекулярногенетического анализа 11 МС-локусов, генотипы изученных сортов объединены в два крупных
кластера А и В. Обращает на себя внимание, что сорта, которые являются гетерогенными, а
именно: Подяка, Годувальница одесская, Змина и Эпоха одесская, показали разную
локализацию генотипов отдельных колосьев на дендрограмме. Для большинства сортов
генотипы отдельных колосьев объединены между собой. Крупнейшими ГД между генотипами
отдельных колосьев одного сорта характеризовались сорта Подяка (0,334 у.е.) и Змина (0,281
у.е.), а также сорта Годувальница одесская (0,142 у.е.) и Запорука (0,116 у.е.). В скобках
представлены максимальные ГД между генотипами отдельных колосьев соответствующих
сортов. Для сравнения: минимальной ГД, которая позволила дифференцировать отдельные
сорта между собой, было расстояние 0,042 у.е. между сортами Эпоха одесская и Лытанивка,
которые созданы в отделе акад. М.А Литвиненка. Гомогенные по анализируемым локусам
сорта Кирия, Лытанивка, Дальницкая, Оксана имеют одинаковую молекулярно-генетическую
характеристику МС-локусов в пределах каждого сорта, поэтому на дендрограмме они не
разделялись. Проведенный детальный кластерный анализ исследованных сортов на основе
молекулярно-генетического анализа МС-локусов помог осветить структуру современных
сортов, разделившихся на линейные и гетерогенные.
НОНСЕНС-СУПРЕССИЯ В ШТАММАХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES
CEREVISIAE, НЕСУЩИХ ДЕТЕРМИНАНТ [NSI+], ОПОСРЕДОВАНА
СНИЖЕНИЕМ КОЛИЧЕСТВА мРНК ГЕНА SUP45
Кондрашкина А.М., Галкин А.П., Нижников А.А.
Санкт-Петербургский государственный университет; СПб Филиал ИОГен РАН
alex_sandra2502@mail.ru
Прионоподобный детерминант [NSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae вызывает
нонсенс-супрессию, которая приводит к росту на средах без аденина и триптофана. Это явление
наблюдается только в штаммах, несущих делецию N-терминального домена вспомогательного
фактора терминации трансляции Sup35. Вторым и основным фактором терминации трансляции
у дрожжей является Sup45. Мы обнаружили, что экспрессия дополнительной копии генаSUP45
на центромерной плазмиде приводит к подавлению нонсенс-супрессии в штаммах [NSI+],
причем это не связано с мутациями вSUP45. Возможное объяснение наблюдаемого эффекта
состоит в том, что в штаммах [NSI+] снижен уровень экспрессии SUP45, что закономерно
приводит к нонсенс-супрессии. Для проверки этой гипотезы, мы сравнили относительные
количества мРНК SUP45 в штаммах [NSI+] и [nsi-] при помощи обратной транскрипции и
полимеразной цепной реакции в реальном времени, используя генACT1 в качестве контроля.
Полученные результаты показали, что количество мРНК SUP45 в штамме [NSI+] действительно
достоверно ниже, чем в штамме [nsi-]. Таким образом, нонсенс-супрессия в штамме [NSI+]
вызвана снижением количества мРНК SUP45. Эти данные также свидетельствуют в пользу
того, что детерминант [NSI+] является транскрипционным фактором или участвует в регуляции
стабильности мРНК.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009-2013 годы (Госконтракт №П1354). Работа выполнена за счет
средств тематического плана НИР СПбГУ. Работа поддержана грантом Правительства СанктПетербурга для студентов, аспирантов вузов и академических институтов, расположенных на
территории Санкт-Петербурга.
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНОГО МАРКЕРА delta 32 ГЕНА ССR5 С
САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ТИПА 1
Копылова О.И., Лаврикова Е.Ю., Никитин А.Г.
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
okopylova7@gmail.com
116
Молекулярная биология
Сахарный диабет типа 1 (СД типа 1) относится к полигенным, многофакторным
заболеваниям. Генетическая предрасположенность к СД типа 1 связана с наследованием
определенных аллелей обычных «здоровых» генов. Ген CCR5 кодирует белок из семейства
хемокинов. Хемокины расположены на поверхности ряда клеток системы гемопоэза,
взаимодействие которых с рецепторами хемокинов в значительной мере определяет
интенсивность развития воспалительного процесса. Так как воспалительные процессы играют
важную роль в развитии СД типа 1, ген CCR5 может рассматриваться как потенциальный генкандидат.
Целью данной работы было изучение ассоциации полиморфого маркераdelta 32 гена ССR5
с СД типа 1.
В исследование включены группа больных сахарным диабетом типа 1 (177 человек) и
группа здоровых индивидов (408 человек) русскго происхождения. Определение аллелей и
генотипов полиморфного маркера проводилось с помощью амплификации «в реальном
времени».
Результаты. Наличии в гене CCR5 делеции 32-ух нуклеотидов в кодирующей области
приводит к синтезу укороченного и функционально неактивного варианта хемокина из-за
сдвига рамки считывания. При этом у гетерозиготных носителей экспрессия генаCCR5
снижена, а у гомозиготных носителей наблюдается функциональный блок этого рецептора. В
нашем исследовании частота гомозиготных генотипов delta 32 среди больных СД типа 1 (4%)
значительно превышала превышала частоту гомозиготных генотипов среди здоровых
индивидов (0,5%). Частоты гетерозиготных генотипов равнялись 20,9% и 21,6%,
соответственно.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что носительство гомозиготных
генотипов delta 32 гена ССR5 может определять предрасположенность к СД типа 1.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки
Российской Федерации (государственный контракт 16.512.11.2045) и Российского фонда
фундаментальных исследований (проект 09-04-01443-а).
ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКА Gαo В КОМПЛЕКСЕ С GOLOCO I ФРАГМЕНТОМ
БЕЛКА PINS ИЗ ДРОЗОФИЛЫ
Костарева О.С., Тин У.Ф., Тищенко С.В., Гарбер М.Б.
Институт белка РАН
zelle@rambler.ru
Гетеротримерные G-белки участвуют в системе переноса сигнала от рецепторов,
расположенных на поверхности клеток, к эффекторным молекулам в цитоплазме. G-белки
состоят из трех субъединиц: Gα, Gβ и Gγ. При взаимодействии с сигнальными рецепторами Gα
субъединица связывается с ГТФ, субъединицы диссоциируют и взаимодействуют с
эффекторными белками для передачи сигнала. Ранее было показано, что белок Pins,
относящийся группе рецептор-независимых регуляторных белков, может быть мишенью в
процессе передачи сигнала от рецепторов, связанных с G-белками. Причём, белок Pins может
связываться как с Gαо/ГДФ формой белка, так и с Gαо/ГТФ формой, что необычно для такого
типа взаимодействий. Необходимым и достаточным для взаимодействия Gαо и Pins является
GoLocoI фрагмент белка Pins. Определение кристаллической структуры Gαо/ГДФ, Gαо/ГТФ из
дрозофилы в комплексе с GoLocoI доменом белка Pins (36 аминокислотных остатков)
позволило бы определить молекулярные основы этого взаимодействия.
В целях получения кристаллизуемого препарата белка Gαо, нами были сконструированы
плазмиды и выделены белки, лишённые неупорядоченной N-концевой последовательности.
Наиболее пригодной для кристаллизации оказалась мутантная форма белка, лишённая 24
аминокислотных остатков (Gαо -24). Для получения Gαо-24 в комплексе с GoLocoI фрагментом
белка Pins мы решили создать генетическую конструкцию, несущую слитые последовательно
гены Gαо -24 и GoLocoI, которые разделены гексагистидиновой последовательностью,
ограниченной с двух сторон сайтами для протеазы Xa. Такая конструкция позволит выделить
данный комплекс на смоле Ni-NTA агароза, следующим этапом будет отрезание
117
Молекулярная биология
олигогистидиновой вставки. В настоящее время данная конструкция получена и ведется
разработка схемы очистки данного белка.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных
Исследований (№ 11-04-00859) и Программы Президиума МКБ РАН.
ВЛИЯНИЕ ПРОЛИЛИЗОМЕРАЗЫ PPIH НА КИНЕТИКУ ОБРАЗОВАНИЯ
АМИЛОИДНЫХ ФИБРИЛЛ БЕЛКОМ YB-1 IN VITRO
Кретов Д.А., Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П.
Воронежский государственный университет, Воронеж (Россия); ФГБУН Институт
белка РАН, Пущино (Россия)
dmitry_kretov@rambler.ru
YB-1 является многофункциональным РНК- и ДНК-связывающим белком. Он состоит из
трех доменов: аланин-пролин-богатого (А/P), домена холодового шока (CSD) и С-концевого.
Домен холодового шока обладает фиксированной трехмерной структурой, а А/P и С-концевой
домены являются неструктурированными. Было показано, что белок YB-1 в условиях высокой
ионной силы (2 M LiCl) образует протяженные амилоидоподобные фибриллы. Оказалось, что
за формирование таких структур отвечает CSD.
А/P и С-концевой домены богаты пролиновыми остатками. Известно, что свободные
энергии цис- и транс-конформаций пролина отличаются не так сильно, как у других
аминокислот, что позволяет пролину существовать в обоих конформациях при
физиологической температуре. Энергетический барьер между конформациями затрудняет
свободный переход из одной в другую, однако существуют специальные ферменты,
пептидилпролил-цис-транс-изомеразы, ускоряющие такой переход. Известно, что эти
ферменты обладают также свойствами белковых шаперонов. Ранее сообщалось, что в
присуствии пролилизомеразы существенно ускоряется образование амилоидов α-синуклеином.
Было предположено, что при образовании амилолоидоподобных структур белка YB-1
конформация пролина также играет роль.
Для проверки этого предположения было решено исследовать влияние пролилизомеразы
PPIH на скорость образования амилоидоподобных структур белком YB-1. Выбор этой
пролилизомеразы обусловлен тем, что в геноме млекопитающих ген этого белка всегда
расположен рядом с геном YB-1, что может указывать на их участие в общих процессах.
Обратной транскрипцией из сумммарной мРНК культивируемых клеток человека HEK293
нами была получена кДНК PPIH и клонирована в плазмиду pET-28a. Белок PPIH был
синтезирован и очищен из клеток E. coli c помощью ряда последовательных хроматографий.
Активность фермента была подтверждена с использованием модельного субстрата.
Изучение кинетики роста фибрилл YB-1 осуществлялось с помощью красителя тиофлавина
Т, флуоресценция которого значительно увеличивается при связывании с амилоидной кросс-βструктурой. В эксперименте были использованы полноразмерный YB-1 и его фрагмент YB-11129, содержащий только домены AP и CSD. Оказалось, что присутствие каталитических
количеств PPIH сильно подавляло образование амилоидоподных структур как полноразмерного
белка YB-1, так и его фрагмента.
Таким образом, PPIH либо за счет своей пролил-изомеразной, либо шаперонной
активности влияет на конформации А/P и С-концевого доменов таким образом, что
препятствует образованию амилоидоподобных структур YB-1.
КОНСЕНСУСНАЯ ИНТЕГРАЗА СУБТИПА А ВИЧ-1: ДИЗАЙН,
ПРОКАРИОТИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ И КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
Кротова О.А.1,2,3, Агапкина Ю.Ю.4, Виклунд А.3, Стародубова Е.С.1,3, Готтих М.Б.4,
Лукашов В.В.2,5, Исагулянц М.Г.2,3
1
ИМБ РАН, Москва (Россия); 2ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского», Москва
(Россия); 3Каролинский институт, Стокгольм (Швеция); 4НИИ ФХБ им. А.Н.
118
Молекулярная биология
Белозерского МГУ, Москва (Россия); 5АМЦ Университета Амстердама, Амстердам
(Нидерланды)
oakrotova@inbox.ru
Рекомбинантные
белки,
представляющие
консенсусные
последовательности
высоковариабельных вирусных антигенов, находят все более широкое применение для
иммунодиагностики, при разработке новых лекарственных средств – ингибиторов вирусной
репликации, и для конструирования вакцин. На основе консенсусной аминокислотной
последовательности интегразы ВИЧ-1 субтипа А, распространенного на территории
Российской Федерации, нами составлена нуклеотидная последовательность и осуществлен
синтез гена этого белка. Также получен ген каталитически неактивной интегразы, содержащей
мутацию D64V в активном центре. Оба гена включены в состав вектора pET15b для
прокариотической экспрессии. Плазмидами трансформированы клетки E.coli штамма BL21
(DE3), содержащие плазмиду pRARE из штамма Rosetta (DE3) E.coli. После индукции синтеза в
бактериальных клетках оба препарата интегразы очищены с помощью аффинной
хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Методом иммуноблоттинга с использованием
специфических антител к интегразе подтверждено получение препарата искомого белка. Оба
препарата интегразы получены с высоким выходом (10 мг/л).
Определение каталитической активности полученных белков осуществлялось с
использованием стандартных синтетических 21-звенных ДНК-дуплексов, последовательность
которых соответствует концевой последовательности U5 LTR района вирусной ДНК.
Активность препаратов белка определялась в двух реакциях, 3'-процессинга и переноса цепи,
катализируемых интегразой. В качестве контрольной, использовалась интеграза субтипа В.
Консенсусная интеграза субтипа А показала высокую активность в обеих реакциях,
превышающую почти в два раза активность интегразы ВИЧ-1 субтипа В (штамм HXB2).
Интеграза с мутацией D64V была неактивна в обеих каталитических реакциях.
Таким образом, показано, что созданная нами консенсусная интеграза ВИЧ-1 обладает
высокой каталитической активностью, а мутация D64V в активном центре полностью ее
инактивирует. Активная интеграза субтипа А может быть использована для тестирования
новых ингибиторов репликации ВИЧ-1. Кроме того, вариант неактивной консенсусной
интегразы может быть использован для создания безопасной прототипной ДНК-вакцины.
ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРМ
ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ Oct-1 ЧЕЛОВЕКА
Крылова И.Д.1, Панкратова Е.В.2
1
Московский педагогический государственный университет; 2Институт молекулярной
биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Фактор транскрипции Oct-1 найден у многих многоклеточных животных. Известно, что
Oct-1 регулирует транскрипцию как генов «домашнего хозяйства» таких, как ген гистона Н2В,
гены мяРНК U2, U6, 7SK, так и транскрипцию многих тканеспецифических генов таких, как
гены иммунной системы: интерлейкинов (IL) 2, 3, 5, 8, иммуноглобулинов (Ig) α, β, Ly9, легких
и тяжелых цепей иммуноглобулинов; гены эндокринной системы: гонадолиберина, пролактина,
тиротропина, тиреоидного фактора транскрипции. При этом Oct-1 «работает» и как активатор и
как репрессор транскрипции. Кроме этого Oct-1 участвует в репликации аденовирусных
геномов и, вероятно, геномов эукариот, задействован в прикреплении петель хроматина к
ядерной мембране и формировании участков прикрепления к ядерному матриксу, связан с
апоптозом и контролем эмбрионального развития организма.
Существуют особые механизмы, обеспечивающие многофункциональность фактора
транскрипции Oct-1. К таким механизмам относят особенности структуры самого белка Oct-1,
фосфорилирование Oct-1 в ходе клеточного цикла; альтернативный сплайсинг пре-мРНК Oct-1,
альтернативные промоторы в гене oct-1; взаимодействие Oct-1 с разными участками ДНК,
взаимодействие с другими факторами транскрипции и коактиваторами, взаимодействие с
белками ядерного матрикса и ядерными белками с высокой подвижностью (HMG); различия в
119
Молекулярная биология
регуляции экспресси самого гена oct-1 в разных клетках приводит к изменению уровня белка
Oct-1 в этих клетках.
Нами были получены четыре изоформы фактора транскрипции Oct-1 человека: две
убиквитарные, отличающиеся числом аминокислотных остатков на N-конце и две
тканеспецифические для лимфоидных клеток и клеток мозга, отличающиеся аминокислотной
последовательностью на С-конце. Исследована транскрипционная активность этих изоформ в
отношении промотора гена гистона Н2В и альтернативного тканеспецифического L промотора
самого гена Oct-1в клетках эритромиелоидной лейкемии человека линии К 562 и
эпителиоподобных клетках линии HeLa.
В клетках эритромиелоидной лейкемии линии К 562 все изоформы Oct-1 человека
активируют промотор гена гистона H2B – в 3,1-5,68 раз по сравнению с контролем, при этом
наибольшим активатором транскрипции является убиквитарная изоформа Oct-1A человека,
активирующая промотор в 1,6-1,84 раза по сравнению с другими изоформами Oct-1 человека. В
отношении участка L промотора гена Oct-1 в клетках линии К 562 все изоформы также
являются активаторами – в 1,52-3,86 раз по сравнению с контролем, при этом наиболее активна
также изоформа Oct-1А.
В эпителиоподобных клетках человека линии HeLa все изоформы Oct-1 человека являются
активаторами промотора гена гистона H2B – в 1,68-11,05 раз по сравнению с контролем,
наибольшим активатором транскрипции является тканеспецифическая изоформа Oct-1R. В
отношении участка L промотора гена Oct-1 все изоформы Oct-1 человека активируют L
промотор – в 1,57-10,1 раз по сравнению с контролем, при этом в большей степени
альтернативный L промотор активируют изоформы Oct-1L, Oct-1А и Oct-1x – в 10,1, 8,35 и 7,39
раз соответственно.
В результате синтеза с альтернативных промоторов и альтернативного сплайсинга премРНК образуются изоформы белка Oct-1, которые обладают разной транскрипционной
активностью и имеют разный уровень экспрессии в клетках, что обеспечивает
дифференциальную транскрипцию генов «домашнего хозяйства» и тканеспецифических генов.
КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА БЕЛКА КАПСИДА
БЕЛОРУССКОГО ШТАММА ЦВС-2 В КЛЕТКАХ E.COLI
Кудин К.В., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет
kiryl.kudin@gmail.com
Цирковирус свиней 2 типа (ЦВС-2), принадлежащий к семействуCircoviridae и
одноименному роду Circovirus, представляет собой сравнительно небольшой одноцепочечный
ДНК вирус с несегментированным замкнутым в кольцо геномом и является основным
возбудителем целого ряда заболеваний, объединяемых в англоязычной литературе под общим
названием Porcine Circovirus-Associated Diseases (сокр. PCVAD – заболевания, связанные с
цирковирусом свиней). Несмотря на то, что многие из этих заболеваний являются результатом
одновременной ко-инфекции ЦВС-2 и какого-либо распространенного инфекционного агента,
именно присутствие ЦВС-2 делает заболевание достаточно серьезным для того, чтобы в
значительном проценте случаев оно заканчивалось летальным исходом. В настоящее время
инфекции, обусловленные ЦВС-2, присутствуют в каждой стране, связанной со свиноводством,
и частота их встречаемости постепенно растет. На сегодняшний день темпы распространения
цирковирусной инфекций таковы, что она стала существенной экономической угрозой
всемирной индустрии свиноводства. В связи с возрастающим влиянием ЦВС-2 на
экономическое благополучие свиноводческих хозяйств в различных странах, все большие
средства направляются на разработку вакцин и методов диагностики данного вируса.
Представленная работа направлена на изучение генетического разнообразия штаммов
ЦВС-2, расширение знаний об их генетических особенностях и распространении на территории
Беларуси, а также разработку методик, способствующих обнаружению и профилактике
инфекций ЦВС-2. В рамках приведенного исследования были проанализированы
последовательности геномов группы штаммов ЦВС-2 из базы данных нуклеотидных
120
Молекулярная биология
последовательностей
GeneBank.
По
результатам
множественного
выравнивания
последовательностей геномов исследованных штаммов построено их филогенетическое древо и
определена консенсусная последовательность генома, на основе которой разработаны две пары
праймеров, использованные в работе для амплификации области генома нескольких
белорусских
штаммов
ЦВС-2.
Амплифицированные
фрагменты,
содержащие
последовательность гена белка капсида вируса, были клонированы в векторе pUC18 и
секвенированы. Результаты анализа сиквенсов подтвердили принадлежность клонированных
последовательностей к геному ЦВС-2 и позволили на основании структуры консервативного
мотива белка капсида отнести хозяев этих последовательностей ЦВС-2 к филогенетической
группе ЦВС-2b. Кроме того, открытая рамка трансляции гена белка капсида одной из
последовательностей была перенесена с помощью ПЦР и разработанной по результатам
сиквенса пары праймеров в вектор экспрессии pET-24b(+). В эксперименте по индукции
экспрессии гетерологичных белков в штамме E. coli BL21 Codon Plus (DE3) был получен белок
с приблизительной массой ~27,9 кДа, что соответствует ожидаемому размеру продукта
экспрессии клонированного гена белка капсида ЦВС-2.
НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЗ МОРСКИХ ЖИВОТНЫХ В ИССЛЕДОВАНИИ
НИКОТИНОВЫХ АЦЕТИЛХОЛИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Кудрявцев Д.С.1, Макарьева Т.Н.2, Уткина Н.К.2, Стоник В.А.2, Цетлин В.И.1,
Кашеверов И.Е.1
1
Институт биоорганической химии РАН; 2Тихоокеанский институт биоорганической
химии Дальневосточного отделения РАН
kudryavtsevden@gmail.com
Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы или нАхР - типичные представители
суперсемейства Cys-петельных рецепторов. Рецепторы этой группы представлены гомо- и
гетеропентамерами различных типов субъединиц. Субъединицы обозначаемые α1 - α10
необходимы для формирования кармана связывания агониста, субъединицы β (а в случае
мышечного подтипа рецептора и γ, δ и ε) играют при этом второстепенную роль. Эти
рецепторы — обязательные участники нормальных физиологических процессов, известно
множество самых разных патологий, вызванных нарушениями в работе холинэргической
системы (мышечная дистрофия, шизофрения, болезнь Альцгеймера). Существует
необходимость постоянного поиска новых холинэргических лигандов, которые могут быть
использованы в исследовательских целях и в клинической практике. При исследованиях Cysпетельных
рецепторов широко
применяются
модельные
системы
на
основе
ацетилхолинсвязывающих белков (АхСБ) брюхоногих моллюсков Lymnaea stagnalis и Aplysia
californica, гомологичных внеклеточным доменам рецепторов. Наиболее ценными источниками
лигандов нАхР последние годы служили яды змей и морских моллюсков рода Conus. В данной
работе нами были описаны холинэргические свойства низкомолекулярных веществ,
выделенных из морских анемон и асцидий, среди которых присутствовали различные
циклические основания, полисульфиты, сфинголипиды и стероиды. Вещества были
протестированы с помощью радиолигандного анализа на сродство к АхСБ Limnea stagnalis и с
помощью двухэлектродной фиксации потенциала на способность подавлять функциональную
активность α7 нАхР человека, гетерологически экспрессированного в ооцитах Xenopus laevis.
Некоторые из протестированных веществ показали высокую антагонистическую активность к
нАхР, что говорит о перспективности поиска новых лигандов Cys-петельных рецепторов у
морских анемон и асцидий.
НАПРАВЛЕНИЕ НЕСТРУКТУРНОГО БЕЛКА NS1 ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО
ЭНЦЕФАЛИТА ПО ПРОТЕАСОМНОМУ ПУТИ ПРОЦЕССИНГА
Кузьменко Ю.В., Стародубова Е.С., Тимофеев А.В., Карпов В.Л.
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта
121
Молекулярная биология
Kuzmenko-yulia@mail.ru
Неструктурный белок NS1 вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) является сильным
иммуногеном, но в виде ДНК-вакцины недостаточно эффективен. Для повышения
эффективности ДНК-препарата и улучшения его распознавания клетками иммунной системы
проводят перенаправления белков-антигенов по различным путям процессинга. Нами было
предложено два способа усиления протеасомной деградации неструктурного белка NS1.
Поскольку NS1 ВКЭ распределяется как внутри клетки так и на ее поверхности, мы
предположили, что его блокирование внутри клетки приведет к его более эффективной
деградации на протеасоме. Для этого создана ДНК-конструкция, кодирующая NS1 без
последовательности на N-конце (25 а.к.), ответственной за секрецию. А также на С-конец двух
вариантов белка NS1 добавлен короткий фрагмент орнитиндекарбоксилазы мыши (ODCsig) из
53 С-концевых а.к., ответственных за связывание с протеасомой. Полученные ДНКконструкции протестированы в культуре клеток НЕК293. Слияние обоих вариантов белка NS1
с ODCsig привело к снижению содержания химерных белков в клетке, по сравнению с
исходными вариантами. Анализ влияния ингибиторов протеасомы и других клеточных протеаз
показал, что белок NS1 с удаленным сигналом на секрецию, также как и химерные белки с
ODCsig, деградируют преимущественно на протеасоме. Эксперименты по определению
времени жизни показали, что скорость деградации белка NS1 без сигнала на секрецию в 1.5
раза больше, чем у белка с сигналом. Таким образом, за счет внесения сигнала ODCsig в
неструктурный белок NS1 ВКЭ нам удалось повысить скорость деградации неструктурного
белка NS1 на протеасоме.
Работа была выполнена при поддержке гранта Президента РФ МК-5287.2011.4.
РОЛЬ УЧАСТКА 11–14 МЕТАЛЛ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА БЕТААМИЛОИДА В ПАТОГЕНЕЗЕ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА
Куликова А.А., Цветков Ф.О., Козин С.А., Макаров А.А.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной
биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
kulikovaaa@gmail.com
Болезнь Альцгеймера (БА) – неизлечимое нейродегенеративное заболевание и наиболее
распространенная форма деменции. БА характеризуется внеклеточным отложением в тканях
мозга насыщенных ионами металлов агрегатов β-амилоида (Аβ). Согласно амилоидной
гипотезе ключевым событием в патогенезе БА является димеризация Аβ, приводящая к
последующему накоплению нейротоксичных олигомеров Аβ и нерастворимых агрегатов –
амилоидных бляшек. Критическую роль в процессе димеризации могут играть абнормальные
взаимодействия между металл-связывающими доменами Аβ в присутствии ионов Zn2+.
Первые шестнадцать аминокислотных остатков Аβ формируют его металл-связывающий
домен. Не смотря на то, что ранее с помощью метода ЯМР была получена структура металлсвязывающего домена Аβ в присутствии и отсутствии ионов цинка, также существовали и
альтернативные модели координации иона цинка Аβ. Мы использовали метод изотермической
калориметрии титрования для определения термодинамических параметров связывания ионов
Zn2+ с фрагментами Аβ и его мутантами в физиологических условиях. Было показано, что
участок 6–14 является минимальным Zn2+-связывающим сайтом Аβ, в котором ион цинка
координируется His6, Glu11, His13 и His14. Кроме того, с помощью квантовомеханического/молекулярно-механического моделирования была построена модель узнавания
ионов Zn2+ Аβ и был выявлен первичный сайт узнавания ионов цинка Аβ – участок 11–14.
Затем был проведен анализ взаимодействий фрагментов Аβ с иммобилизованным металлсвязывающим доменом Аβ в присутствии и отсутствии ионов цинка с помощью метода
поверхностного плазмонного резонанса. Было установлено, что цинк индуцирует димеризацию
металл-связывающего домена и участок 11–14 контролирует этот процесс.
Таким образом, можно заключить, что участок 11–14 Аβ является потенциальной
лекарственной мишенью, направленное блокирование которой будет предотвращать процесс
Zn2+-зависимой димеризации Аβ и, следовательно, развитие БА.
122
Молекулярная биология
ИССЛЕДОВАНИЕ ЧАСТОТЫ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ СИСТЕМЫ
РЕПАРАЦИИ СРЕДИ ЖИТЕЛЕЙ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ
Лаптина Т.А.
Южный федеральный университет
laptina@bk.ru
Деление клетки находится под сложным контролем системы регуляторов. Мутации в генах,
ответственных за репарацию ДНК, приводят к потери их способности восстанавливать
нарушенную структуру ДНК, к возникновению мутаций в протоонкогенах и генах-супрессорах.
Эксцизионная репарация является едва ли не самой определяющей в восстановлении структуры
ДНК после повреждения. Если на этом этапе не осуществляется эксцизионная репарация
нуклеотидов или оснований, образовавшиеся мутации закрепятся в геноме. Рядом
исследований показано, что полиморфизмы генов системы эксцизионной репарации ДНК
APEX1, hOGG1, XPD, XPG служат фактором риска развития различного вида раковых
заболеваний.
Целью работы было исследование частоты полиморфизма генов APEX1, hOGG1, XPD,
XPG среди жителей Ростовской области.
В исследование были включены жители Ростовской области, не страдающие
онкологическими заболеваниями, родственники которых были больны различными видами
рака (50 человек). Полученные данные сравнивали с контрольной группой лиц, не имеющих
родственников, больных раком (50 человек).
Для изучения полиморфизма генов репарации ДНК из лейкоцитов цельной крови выделяли
ДНК термокоагуаляционным методом и проводили полимеразную цепную реакцию.
Генотипирование полиморфных маркеров: APEХ1 Asp148Glu, hOGG1 Ser326Cys, XPD
Lys751Gln, XPG Asp1104His проводили с использованием реагентов SNP-экспресс (Литех,
Москва). Продукты полимеразной реакции анализировали методом электрофореза в 3%
агарозном геле.
В результате исследований установлено, что полиморфизм Asp148Glu гена APEХ1
составил 48% в группе контроля и 54% в группе сравнения. Генотип 148GluGlu встречается с
частотой 24% и 18% соответственно. Статистически значимых отличий между двумя группами
не выявлено. Полиморфизм Ser326Cys гена hOGG1 составил 30% в контрольной группе и 20%
в группе сравнения. Полиморфизм 326CysCys встречается с частотой 6% и 8% соответственно.
Статистически значимых отличий между двумя группами не обнаружено. Наличие
полиморфизма Lys751Gln гена XPD повышает риск развития заболевания (OR═2.08). Частота
полиморфизма 38% в группе контроля и 56% в группе сравнения. Для полиморфизма
751GlnGln статистически значимых отличий не выявлено (36% и 16% соответственно). Для
полиморфизмов Asp1104His и 1104HisHis гена XPG статистически значимых отличий между
двумя группами не выявлено. Анализ сочетанного носительства полиморфизмов показал, что
полиморфизмы трех генов APEX1 XPD XPG увеличивают риск развития заболевания
(OR=2.08). Полиморфизмы двух генов XPD XPG также увеличивают риск развития
онкологического заболевания (OR=3.13).
Таким образом установлено, что у лиц, имеющих родственников с раковыми
заболеваниями чаще выявляются полиморфизмы по нескольким генам. Наличие полиморфизма
в одном гене не свидетельствует о повышении риска развития онкологии.
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ МЕТИЛОТРОФНОГО ШТАММАПРОДУЦЕНТА ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА/ВАЛЕРАТА
Лежнин Ю.Н.1, Екимова Г.А.2, Федоров Д.Н.3
1
Уральский федеральный университет, Екатеринбург (Россия); 2Пущинский
государственный естественно-научный институт; 3Федеральное государственное
123
Молекулярная биология
бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.
Г.К. Скрябина, Пущино (Россия)
ura033@mail.ru
Аэробные метилобактерии, использующие метанол и другие С1-соединения в качестве
источников углерода и энергии, перспективны для промышленного производства различных
веществ, ввиду дешевизны ростовых субстратов. Естественным запасным веществом для
метилобактерий рода Methylobacterium является полигидроксибутират (ПГБ), который может
широко применяться, как упаковочный материал, а также в различных отраслях
промышленности и медицины, так как этот пластик является биодеградабельным и
биосовместимым.
Ранее в нашей лаборатории разработали технологию получения ПГБ и его сополимера
полигидроксибутирата/валерата (ПГБ/В) с высоким выходом на основе штамма
Methylobacterium extorquens G10, культивируемого на метаноле или метаноле с пентанолом.
Однако данный штамм является розовоокрашенным метилотрофом, что создаёт необходимость
вводить дополнительную стадию очистки ПГБ и ПГБ/В от красного пигмента. Кроме того для
получения сополимера ПГБ/В в питательную среду добавляют пентанол, который при высоких
концентрациях ингибирует рост метилобактерий.
Цель данной работы – получение бесцветного мутанта Methylobacterium extorquens G10, а
также штаммов со сверх экспрессией генов ПГБ-синтазы (phaC) и искусственного оперона
phaCAB.
Для мутагенеза M. extorquens G10 при помощи ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК,
содержащий полную последовательность гена crtI, кодирующего один из ферментов
биосинтеза пигмента. Этот фрагмент клонировали в мобилизуемом суицидальном векторе
pk18mob. Затем, вместо центальной части гена crtI, была клонирована кассета устойчивости к
гентамицину. При помощи конъюгационного переноса из штамма E. coli S17-1 эту
конструкцию пренесли в клетки штамма G10 для генерации мутации. В результате на средах с
метанолом был отобран бесцветный мутант M. еxtorquens G10.
При помощи ПЦР, амплифицировали фрагменты ДНК, содержащие phaC и phaAB гены M.
extorquens G10, которые последовательно клонировали в экспрессионном векторе pCM160. В
результате чего получили два вектора pCM160phaC и pCM160CAB, которые затем перенесли в
клетки M. extorquens с помощью конъюгационного преноса.
Мутант ∆crtI, и его производные ∆crtI/ pCM160phaC и ∆crtI/ pCM 160phaCAB,
протестированы на способность к биосинтезу ПГБ, а также произведена оценка свойств
биопластика.
Получен бесцветный продуцент биопластика, более эффективный чем исходный штамм.
Данная работа поддержана грантами РФФИ 10-04-00808-а и ГК 14.740.11.0111.
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ТИОЛОВЫХ РЕДОКС-СИСТЕМ ПРИ
КОМБИНИРОВАННОМ ДЕЙСТВИИ ТЕМПЕРАТУРНЫХ СТРЕССОВ И
ЦИПРОФЛОКСАЦИНА У БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI
Лепехина Е.В., Смирнова Г.В.
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
alenshick@mail.ru
Внутриклеточные тиоловые редокс-системы у E. coli включают редокс-системы глутатиона
и тиоредоксина. Они играют важную роль в поддержании восстановленного состояния SHгрупп в белках. Обе редокс-системы прямо или косвенно участвуют в ответе на окислительный
стресс. Ранее было обнаружено, что температурные стрессы сопровождаются изменением
экспрессии антиоксидантных генов katG и sodA и уровня глутатиона внутри и снаружи клеток,
а мутанты по антиоксидантным генам и синтезу глутатиона обладают повышенной
чувствительностью к экстремальным температурам. Все эти факты свидетельствуют о наличии
окислительного стресса при резких изменениях температуры культивирования. В последние
годы показано, что в аэробных условиях бактерицидное действие антибиотиков различной
124
Молекулярная биология
природы также сопряжено с развитием окислительного стресса. В этой связи изучение роли
тиоловых редокс-систем при комбинированном действии экстремальных температур и
антибиотиков представляет большой теоретический и практический интерес.
Целью настоящей работы являлось изучение устойчивости бактерийE. coli к совместному
действию температурных стрессов и ципрофлоксацина (ЦП) и роли тиоловых редокс-систем в
этих условиях. Использовали следующие штаммы: RI89, wt; RI336, gsh(мутант по синтезу
глутатиона); RI363, trxA (мутант по синтезу тиоредоксина А) и RI 319, trxB (мутант по синтезу
тиоредоксинредуктазы).
Бактерии, находящиеся в экспоненциальной фазе аэробного роста, подвергали холодовому
(37 → 20ºС) или тепловому шоку (37 → 42ºС или 37 → 46ºС) и через час после температурного
стресса в культуру добавляли ЦП в концентрации 3 мкг/мл.
Эксперименты показали, что через час после добавлении антибиотика как при 37ºС, так и
при 42ºС наблюдали снижение выживаемости клеток E. coli на два порядка. Спустя два часа
после добавления ЦП выживаемость падала еще на порядок. Обработка клеток той же дозой
ципрофлоксацина при температурах 20ºС и 46ºС вызывала снижение выживаемости у всех
штаммов примерно в три раза. Спустя два часа после добавления ЦП, наблюдали падение
выживаемости еще на 10%. Таким образом, культивирование бактерий при экстремальных
температурах значительно повышало их устойчивость к действию антибиотика.
Сравнение поведения различных штаммов показало, что температурные стрессы в
наибольшей степени модифицировали действие ЦП в штаммах E. coli, мутантных по синтезу
глутатиона и тиоредоксина, и в наименьшей – у мутантов по тиоредоксинредуктазе. В целом,
проведенные исследования свидетельствуют о влиянии температурных стрессов на
устойчивость бактерий к ципрофлоксацину и о существенной роли тиоловых редокс-систем в
этих условиях.
Работа выполнена при поддержке грантом Президента РФ МК1763.2012.4, а также грантом
программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ФАКТОРА CHD1 В РЕГУЛИРОВАНИИ СТРУКТУРЫ
ХРОМАТИНА ПРИ ТРАНСКРИПЦИИ НА МОДЕЛИ ПОЛИТЕННЫХ
ХРОМОСОМ DROSOPHILA MELANOGASTER
Макасе А.А., Конев А.Ю.
Отделение молекулярной и радиационной биофизики, Петербургский Институт
ядерной физики им. Б.П. Константинова, Гатчина (Россия)
anna.makase@gmail.com
Эпигенетическое наследование, т.е. наследуемое изменение функционального состояния
генов, не сопровождающееся изменением их нуклеотидных последовательностей, является
фундаментальным для регуляции развития многоклеточных организмов. Основными
механизмами эпигенетической регуляции являются метилирование ДНК и динамичные
преобразования хроматина.
Консервативный хроматин-ремоделирующий белок CHD1 необходим для происходящей на
уровне всего генома независимой от репликации реорганизации хроматина спермия у
дрозофилы. CHD1 связывается с регионами активной транскрипции – пуфами и междисками в
политенных хромосомах и ко-локализуется с элонгирующей формой РНК полимеразы II.
Целью данной работы было исследование роли белка CHD1 в регулировании структуры
хроматина политенных хромосом в процессе транскрипции на модели пуфов теплового шока,
позволяющей легко «включать» процесс транскрипции.
В условиях теплового шока у дрозофилы при синтезе кодирующих белки теплового шока
РНК на политенных хромосомах возникают вздутия (пуфы). Эти области отвечают наиболее
деконденсированному состоянию хроматина, где осуществляется активный синтез РНК. При
снятии теплового шока пуфы постепенно исчезают, и хроматин возвращается в исходное
состояние. Мы исследовали динамику образования и убывания пуфов при тепловом шоке и
относительную локализацию элонгирующей формы РНК полимеразы II и фактора CHD1 в
125
Молекулярная биология
политенных хромосомах у особей дикого типа, нуль-мутантов по гену chd1, при
гиперэкспрессии белка CHD1, а также его доминант-негативной формы.
В хромосомах особей дикого типа локализация элонгирующей формы РНК полимеразы II и
фактора CHD1 совпадает все время в процессе теплового шока и после его снятия. При
гиперэкспрессии как доминант-негативной формы белка CHD1, так и его нативной формы,
CHD1 отсутствует в пуфах теплового шока. При гиперэкспрессии как доминант-негативного,
так и нативного CHD1, после снятия теплового шока нормальная структура хроматина
восстанавливается значительно дольше, чем у дикого типа. При этом транскрипция генов
теплового шока продолжается даже после снятия стимула – теплового стресса. В хромосомах
личинок нуль-мутантных по гену chd1 особей (у которых присутствует продукт гена chd1
материнского происхождения) наблюдается задержка восстановления нормальной структуры
хроматина после снятия теплового шока в 27% случаев по сравнению с диким типом.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что белок CHD1 участвует в восстановлении
структуры хроматина у личинок Drosophila melanogaster по завершению транскрипции.
УКОРОЧЕНИЕ ПЕТЛИ α3-β4 РИБОСОМНОГО БЕЛКА L5 ПРИВОДИТ К
СНИЖЕНИЮ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РИБОСОМ IN VIVO
Максимова Е.М., Корепанов А.П., Коробейникова А.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе
Г.М.
Институт белка РАН
bridgitta2009@yandex.ru
Рибосомный белок семейства L5 обладает консервативной структурой и формирует
консервативные межмолекулярные контакты в рибосоме, что может свидетельствовать об
универсальности выполняемых им функций. Согласно современным кристаллографическим
данным при взаимодействии белков L5 и S13 формируется межсубъединичный мостик B1b. В
образовании этого межмолекулярного контакта могут принимать участие петли α3-β4 и β4-β5
белка L5. Структурные исследования функциональных комплексов рибосом свидетельствуют о
том, что этот мостик является одним из тех структурных элементов рибосомы, которые
подвергаются наибольшим конформационным изменениям во время транслокации. Настоящая
работа посвящена изучению роли петель α3-β4 и β4-β5 белка L5 в формировании мостика B1b и
функционировании рибосомы Escherichia coli. Нами был проведен направленный мутагенез в
соответствующих структурных элементах белка L5. Показано, что укорочение петли β4-β5 в
белке L5 не влияет ни на рост клеток, ни на функциональную активность их рибосом. В то же
время, клетки, содержащие белок L5 с укороченной на 4 или 6 аминокислотных остатков
петлей α3-β4, замедляют свой рост, проявляя при этом холодочувствительный фенотип.
Показано, что внесенные изменения в петлю α3-β4 существенно понижают эффективность
синтеза полипептида (β-галактозидазный тест) в системе in vivo. Учитывая то, что петли α3-β4
и β4-β5 белка L5 могут участвовать в образовании межсубъединичного мостика, была
проверена стабильность ассоциации рибосомных субчастиц из полученных мутантных
штаммов. Оказалось, что делеции в петле β4-β5 не влияют на ассоциацию рибосомных
субчастиц, тогда как укорочение петли α3-β4 белка L5 приводит к нарушению стабильности их
ассоциации. Таким образом, полученные данные указывают на то, что именно петля α3-β4
белка L5 участвует в формировании межсубъединичного мостика B1b, а ее укорочение влияет
не только на ассоциацию рибосомных субчастиц, но и на эффективность трансляции в
бактериальной клетке.
Работа поддержана грантом РФФИ № 09-04-01747-а и Программой «Молекулярная и
клеточная биология» РАН.
ВЛИЯНИЕ Т-НЕЗАВИСИМЫХ АНТИГЕНОВ 2-ГО ТИПА (ТН-2 АГ) НА
ФЕНОТИП И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ LAMINA
PROPRIA КИШЕЧНИКА МЫШИ
126
Молекулярная биология
Снегирева Н.А., Мартынова Е.В., Гаврилова М.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение научно-исследовательский
институт им. И.И. Мечникова
elenamartynova22@gmail.com
В лимфоциты являются неотъемлемым компонентом гуморального иммунитета. Их
подразделяют на В-1 и В-2 субпопуляции, различающиеся по локализации в организме,
фенотипическим признакам и функциям. В-2 клетки локализованы в селезенке и лимфоузлах,
отвечают на Т-зависимые АГ, образуя при первичном иммунном ответе IgM-, а при вторичном
IgG-антитела (АТ). Для переключения изотипа необходимо присутствие Т-хелперов; в процессе
принимает участие индуцированная активацией цитидин-дезаминаза (AID).
В-1 лимфоциты локализованы в перитонеуме и плевральной полости и в lamina propria
(LP) кишечника. В-1 клетки отвечают на Т-независимые АГ 1-го и 2-го типов (ТН-1 и ТН-2 АГ
соответственно), образуют IgM-АТ и не нуждаются в помощи Т-хелперов. В то же время В-1
лимфоциты кишечника продуцируют значительные количества IgA - основной Ig слизистых
секретов.
Вопрос о механизме переключения синтеза Ig с IgM на IgA в В-1 клетках без помощи Тхелперов остается открытым. Предполагается, что факторы, способствующие переключению
изотипа, В-1 клеткам «поставляют» γδТ клетки, которые так же, как и В-1 лимфоциты, в
онтогенезе образуются первыми и локализуются в эпителии и слизистой оболочке кишечника.
Очевидно, AID должна играть роль и в этом процессе.
Начальный этап исследований, направленных на выяснение роли γδТ лимфоцитов и AID в
образовании IgA В-1 клетками кишечника, представленный в тезисах, посвящен
характеристике клеток LP мышей CBA в норме и при иммунизации ТН-2 антигенами.
Из LP кишечника мышей линии СВА были выделены лимфоциты (LPL), и в полученной
моноклеточной суспензии методом проточной цитофлуориметрии исследован клеточный
состав ткани. В работе использовали меченные фикоэритрином и ФИТЦ антитела к CD3, CD19,
CD5, CD43, MHC, γδ T, IgM, IgA, B220 и CD23. Показано, что LP мышей линии СВА содержит
50-60% Т лимфоцитов, из них 10% представлено γδТ клетками, и 5-8% В лимфоцитов, из них 46% являются В-1 клетками. Из В клеток 11-17% несут на своей поверхности IgA и не более 2%
- IgМ.
Для определения функциональной активности клеток LP мышам внутрибрюшинно вводили
ТН-2 АГ (поливинилпирролидон (ПВП) массой 350 кДа и α-1→3 декстран), на разные сроки
выделяли LPL и определяли методом ELISPOT число IgM- и IgA-продуцентов. Иммунизация
приводила к увеличению на 4-е сутки количества В-лимфоцитов (в 2 раза), что свидетельствует
о циркуляции клеток между брюшной полостью и LP кишечника. Увеличивались также
количества тотальных продуцентов Ig: при введении ТН-2 АГ на 4 сутки число IgA АТ к ПВП ~
в 2 раза и к декстрану - в 1,3 раза; число IgМ АТ к ПВП увеличивалось в 1,5 раза по сравнению
с нормой. Увеличивалось также количество IgA- и IgМ-антителообразующих клеток против
ПВП.
В LPL на 4-е сутки методом проточной цитофлуориметрии было подтверждено увеличение
числа клеток с поверхностными IgA и IgM в 6 и 2 раза соответственно.
Получены данные по выявлению AID в срезах кишечника.
ПОИСК ГЕНОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА НЕСОВМЕСТИМОСТЬ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ
SUP45 С ПРИОНОМ [PSI+] У SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Матвеенко А.Г., Землянко О.М., Журавлева Г.А.
Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции
Studentmag@rambler.ru
В последние годы изучению терминации трансляции было посвящено множество
исследований. Тем не менее, до сих пор остаются неизвестными многие аспекты регуляции и
точности процессов, составляющих данный этап экспрессии генетической информации.
Главными участниками этого процесса у эукариот являются факторы терминации трасляции
127
Молекулярная биология
eRF1 и eRF3, которые у дрожжей S. cerevisiae кодируются генами SUP45 и SUP35
соответственно. Как известно, продукт гена SUP35 является структурным белком прионного
детерминанта [PSI+], который выступает в качестве омнипотентного нонсенс-супрессора. Белок
Sup45 считается жизненно важным, однако, были получены жизнеспособные штаммы
дрожжей, несущие мутации в гене SUP45. Эти штаммы так же демонстрируют нонсенссупрессию, которая возникает вследствие некорректной работы аппарата терминации
трансляции. В нашей лаборатории было показано, что клетки дрожжей, мутантных по гену
SUP45, при скрещивании с клетками, несущими детерминант [PSI+], как правило, дают
нежизнеспособных гибридов. Это происходит вследствие дефектов трансляции,
несовместимых с жизнью клеток. На основании этого явления в нашей лаборатории была
разработана тест-система, которая позволяет находить факторы, влияющие на прионизацию
Sup35 и на аппарат трансляции.
В результате скрининга банка дрожжевых генов нами было отобрано 9 конструкций,
усиливающих несовместимость. Было показано, что две конструкции содержат
перекрывающиеся участки, куда входят ген с неизвестной функцией YMR160W и ген HLJ1,
продукт которого является кошапероном семейства Hsp40. Ген HLJ1 был переклонирован в
мультикопийную плазмиду pRS425. Сверхэкспрессия гена HLJ1 также приводила к снижению
несовместимости в тест-системе. Возможно, Hlj1, подобно другим белкам семейства Hsp40,
таким как Ydj1 и Sis1, взаимодействует с прионом [PSI+].
Среди генов, обнаруженных на остальных 7 конструкциях, присутствуют гены MCA1 и
MCM1, продукты которых потенциально могут формировать собственные прионы, а так же ген
TEF2, кодирующий фактор элонгации трансляции eEF1A. Мы предполагаем, что
взаимодействие между факторами элонгации и терминации трансляции может являться частью
неизвестного ранее механизма контроля экспрессии на уровне белкового синтеза.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (РФФИ 10-0400237-а) и тематическим планом НИР СПбГУ (1.37.113.2011 и 1.37.115.2011).
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА ДНК С НИКУЮЩЕЙ ЭНДОНУКЛЕАЗОЙ
NT.BSPD6I МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРСКОПИИ
Мачулин А.В., Дерюшева Е.И., Юнусова А.К.
Институт белка Российской академии наук, Тульский государственный университет,
Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук
and-4@ya.ru
Никующие эндонуклеазы, являющиеся уникальными по своим функциям ферментами, уже
нашли применение в ряде биотехнологических методов, таких как изотермическая реакция для
амплификации олигонуклеотидов и геномной ДНК. Никующая эндонуклеаза Nt.BspD6I
является гетеродимерной эндонуклеазой рестрикции, одна из субъединиц которой проявляет
специфическую никующую активность: связывается с двухцепочечной ДНК и вносит разрыв в
одну цепь на расстоянии 4-х нуклеотидов от сайта связывания. Специфическая никующуя
активность никазы была хорошо изучена и описана. Тем не менее, структурных исследований
сайт-специфического взаимодействия для комплекса ДНК-никаза проведено не было. В данной
работе атомно-силовая микроскопия была использована для визуализации специфического
связывания и места посадки белка. Подобранные ионные условия, а также соотношение ДНК к
белку в конечном растворе позволили нам с высоким разрешением визуализировать
образовавшийся после взаимодействия ДНК-белковый комплекс. Через пять минут после
инкубации раствора ДНК c никующей эндонуклеазой на изображениях наблюдались молекулы
ДНК со связанным белком, который располагался в ожидаемом месте связывания и «разделял»
цепь ДНК на два сегмента (равных, примерно, 1/3 и 2/3 длины). Кроме того, молекула ДНК
рядом с местом связывания имела высоту, соответствующую одноцепочечной молекуле ДНК,
что согласуется с внесением одноцепочечного разрыва никазой при комлексообразовании.
Поскольку до сих пор не удалось получить пригодные для рентгеноструктурного анализа
кристаллы комплекса ДНК с никазой, полученные в данной работе результаты являются
128
Молекулярная биология
первым наглядным подтверждением описанного ранее механизма взаимодействия ДНК с
никующей эндонуклеазой.
РОЛЬ F-ПЕТЛИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В СИНТЕЗЕ И
РАСЩЕПЛЕНИИ РНК
Миропольская Н.А.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной
генетики Российской академии наук
acetabularia@yandex.ru
Исследования РНК-полимераз из разных бактерий показали, что РНК-полимеразы
термофильных бактерий являются более термостабильными по сравнению с гомологичными
ферментами мезофильных бактерий и обладают сниженной активностью при умеренных и
низких температурах. Это, вероятно, является следствием снижения структурной подвижности
активного центра ферментов термофилов, что необходимо для повышения их
термостабильности. Различия в каталитических свойствах РНК-полимераз термофильных и
мезофильных бактерий делают возможным поиск функционально-важных элементов РНКполимеразы, задействованных в катализе и определяющих функциональные различия между
разными ферментами. Ранее при сравнении каталитических свойств РНК-полимераз двух
родственных бактерий – термофильной Thermus aquaticus и мезофильной Deinococcus
radiodurans, – был обнаружен новый элемент активного центра РНК-полимеразы, F-петля, и
было показано, что F-петля аллостерически влияет на катализ, в том числе, на скорость синтеза
РНК. На основании полученных данных была высказана гипотеза, что F-петля способствует
правильному сворачиванию G-петли, которая задействована непосредственно в присоединении
нуклеотидов к растущей РНК, в результате происходит формирование закрытой конформации
активного центра, что стимулирует присоединение нуклеотидов.
В данной работе было продолжено исследование структурно-функциональной организации
активного центра РНК-полимеразы T. aquaticus и проверка высказанной гипотезы о влиянии Fпетли на структурные перестройки активного центра (в том числе G-петли) в процессе
присоединения нуклеотидов. Были получены мутантные РНК-полимеразы T. aquaticus с
точечными заменами в участках F-петли, G-петли и в соседних районах, а также с делециями
обеих этих петель. Все полученные ферменты были исследованы при разных температурах (от
10 до 40 оС) с применением разнообразных биохимических методов, в том числе метода
быстрой ферментативной кинетики. Было показано, что замены отдельных аминокислот в
области F-петли и активного центра практически не влияют на скорости синтеза и расщепления
РНК, тогда как делеции F- и G-петель значительно снижают скорости синтеза и расщепления
РНК. Интересно, что фермент с делецией обеих петель характеризуется большей скоростью
катализа, чем фермент с делецией одной только G-петли.
Работа поддержана грантом президента МК-7156.2012.4 и Государственным контрактом
№02.740.11.0771.
СТЕХИОМЕТРИЯ РИБОСОМНОГО L12-ВЫСТУПА БАКТЕРИЙ И АРХЕЙ
Митрошин И.В., Кравченко О.В., Никонов С.В., Гарбер М.Б.
Институт белка РАН
ivan-mitroshin@rambler.ru
Рибосомы всех доменов жизни содержат высокоподвижный протуберанец, называемый
L12-выступом. Он участвует во взаимодействии рибосомы с факторами инициации и
элонгации, активируя их ГТФазную активность. L12-выступ состоит из белков L10 и L12 и
фрагмента домена II 23S рРНК. Белок L12 – единственный рибосомный белок, который
представлен на рибосоме в нескольких копиях. L12 образует в растворе стабильные димеры, Nконцевые домены которых взаимодействуют с С-концевой частью белка L10.
129
Молекулярная биология
Ранее комплекс L10-L12 из бактерий, архей и эукариот описывался как пентамерный,
состоящий из одной копии белка L10 и четырех копий белка L12. В 2005 году была определена
структура гептамерного комплекса бактериального белка L10 с N-концевыми доменами димера
белка L12. Это открытие стало отправной точкой для новых исследований стехиометрии
комплекса L10-L12 и нового этапа в обсуждении роли количества димеров белка L12 в
функционировании рибосомы. Результаты последних исследований показывают, что
эукариотические рибосомы и рибосомы мезофильных бактерий содержат два димера белка
L12, тогда как рибосомы термофильных бактерий – три димера L12. Для рибосом
гипертермофильной археи Pyrococcus horikoshii характерно наличие гептамерного комплекса.
Тогда как в мезофильных археях было обнаружено сосуществование двух совокупностей
рибосом, содержащих пентамерный и гептамерный комплекс. Притом, соотношение этих
рибосом изменяется в зависимости от фазы роста клеток.
Мы исследовали стехиометрию комплекса L10-L12 в растворе. Используя метод гельфильтрации мы показали, что комплексы L10-L12 из термофильной бактерии Geobacillu
stearothermophilus и гипертермофильных архей рода Methanococcus являются пентамерными.
Титрование белка L10 белком L12 и последующий анализ полученных комплексов методами
электрофореза в денатурирующих и неденатурирующих условиях и методом гель-фильтрации
также показал, что данные комплексы являются пентамерным.
Работа финансировалась Программой МКБ РАН и грантом РФФИ (№ 11-04-00327-а).
МИКРОСАТЕЛЛИТНАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ И АЛЛЕЛЬНЫЙ ДИСБАЛАНС
1q32 В ПАПИЛЛЯРНЫХ ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНЫХ КАРЦИНОМАХ
Михайленко Д.С.1, Москвина Л.В.2, Андреева Ю.Ю.2, Михальченко А.Е.3, Залетаев
Д.В.1
1
ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН; 2ФГУ Московский научноисследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росздрава; 3ФГОУ ВПО
«Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва (Россия)
dimserg@mail.ru
Рак почки входит в 10 наиболее распространенных злокачественных новообразований,
однако для него не разработана панель белковых и ДНК-онкомаркеров. Данные о молекулярногенетических нарушениях относятся, преимущественно, к наиболее частой форме –
светлоклеточной карциноме, составляющей 80% случаев. Папиллярная карцинома (15%, вторая
по частоте) менее изучена, поэтому для нее особенно актуален поиск диагностических и
прогностических маркеров. По данным ряда авторов дупликация 1q32 ассоциирована со
снижением продолжительности жизни пациентов. Целью нашей работы являлся анализ
аллельного дисбаланса в области 1q32 и микросателлитной нестабильности (МН) с помощью
STR-маркеров для оценки прогностической значимости этих нарушений при ПРП. В настоящей
работе изучены 39 парных образцов ПРП (опухолевая и прилегающая к ней морфологически
нормальная ткани) по локусам D1S2142 и D1S3465 (локус 1q32) с помощью ПЦР и
фрагментного анализа на секвенатореABI3100 “Applied Biosystems”. Частота аллельного
дисбаланса составила 36.8% информативных случаев, в 48.7% случаев была обнаружена МН.
Не выявлено ассоциации этих нарушений со стадией заболевания, степенью дифференцировки
первичной опухоли и наличием метастазов на момент постановки диагноза. В то же время,
наблюдали тренд увеличения частоты МН при снижении степени дифференцировки опухоли,
что может указывать на ассоциацию этого нарушения с прогрессией папиллярной карциномы,
однако это предположение требует исследования на большей выборке ПРП. Показана
генетическая гетерогенность разных опухолевых узлов при мультифокальном ПРП, а также
вовлеченность прилагающей к ним нормальной паренхимы в формирование опухолей, что
согласуется с представлением о полях канцеризации при первично-множественном ПРП. В
целом, впервые показано, что аллельный дисбаланс 1q32 и МН являются частыми событиями в
папиллярных карциномах почки, встречающимися на всех стадиях заболевания, а при
мультифокальном раке – и в участках морфологически не измененной паренхимы.
130
Молекулярная биология
Целесообразно изучить МН на большей выборке ПРП для решения вопроса о ее
прогностической значимости.
ПОИСК МИНИМАЛЬНОГО УЧАСТКА СВЯЗЫВАНИЯ РИБОСОМНОГО
БЕЛКА L4 НА МРНК S10-ПОДОБНОГО ОПЕРОНА АРХЕИ METHANOCOCCUS
JANNASCHII
Михайлина А.О., Сарских А.В., Костарева О.С., Тищенко С.В., Гарбер М.Б.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН,
Пущино (Россия)
lisenok020388@mail.ru
В бактериях и археях экспрессия генов рибосомных белков в большинстве оперонов
регулируется по принципу «обратной связи». Известно, что экспрессия 11 генов S10 оперона
Еscherichia coliрегулируется белком L4 на уровне трансляции и транскрипции. Участок
связывания белка L4 расположен в некодирующей лидерной 172-нуклеотидной области мРНК,
расположенной с 5'-конца от первого гена - S10. В археях область S10-подобного оперона
отличается от бактериальной, она короче и первым геном является ген рибосомного белка L3
(rpl3), причём 5'-нетранслируемая область мРНК rpl3 не содержит детерминант, похожих на
участки связывания бактериального белка L4.
Целью данной работы является определение минимального участка связывания белка
MjaL4 на мРНК белка L3 M.jannaschii (MjaL3). Ранее нами было показано, что добавление
архейного рибосомного белка L4 Methanococcus jannaschii (MjaL4) в бесклеточную
сопряжённую систему транскрипции-трансляции in vitroспецифически ингибирует синтез белка
MjaL3 с плазмид, кодирующих ген rpl3 и 200-нт 5’-лидерную область мРНК (НТО), 150-нт и
50-нт НТО, соответственно.
Для уточнения участка связывания белка MjaL4 на мРНК MjaL3 были созданы три
генетические конструкции, которые кодируют, соответственно: 1) 200-нт 5’-НТО и 100 нт rpl3;
2) 150-нт 5’-НТО и 70-нт rpl3; 3) 50-нт 5’-НТО и 50-нт rpl3. Были наработаны меченые
фрагменты мРНК и определены константы связывания данных фрагментов мРНК с
рибосомным белком MjaL4 методом связывания на фильтрах. Было показано, что белок MjaL4
специфически связывается со всеми фрагментами мРНК, однако константа диссоциации (Кd)
комплекса MjaL4 c самым коротким фрагментом мРНК в два раза выше, чем Кd комплексов с
более длинными фрагментами. По-видимому, основной участок связывания MjaL4 расположен
в области, включающей 150-100-нт НТО и начало структурной части гена rpl3 (50-70 нт).
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных
исследований и Программы МКБ РАН.
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСПОРТА БЕЛКА YB-1 В ЯДРО
Мордовкина Д.А., Ким Е.Р., Елисеева И.А., Овчинников Л.П.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино (Россия)
darja-mordovkina@rambler.ru
YB-1 – это мультифункциональный ДНК/РНК-связывающий белок, большая часть
которого сосредоточена в цитоплазме, где он вовлечён в регуляцию трансляции, локализацию и
стабилизацию мРНК. Было показано, что в ответ на некоторые внутри- и внеклеточные
стимулы YB-1 может переходить в ядро, где он вовлекается в сплайсинг, регуляцию
транскрипции и репарацию ДНК. В условиях ДНК-повреждающего стресса YB-1 расщепляется
20S протеасомой и транспортируется в ядро. Переход белка в ядро может сопровождать
процесс злокачественной трансформации клеток и возникновение множественной
лекарственной устойчивости. Повышенное содержание YB-1 в ядрах опухолевых клеток
коррелирует с более агрессивным ростом опухоли и способностью к метастазированию.
Однако механизм перехода YB-1 в ядро остается малоизученым.
131
Молекулярная биология
Импорт большинства белков в ядро осуществляется особым классом белков импортинов-β,
наиболее исследованными из которых являются импортин-β1 и импортин-β2. Импортины-β
узнают в транспортируемых белках особые аминокислотные последовательности, называемые
сигналами ядерной локализации (NLS), которые ответственны за переход белков в ядро. В
молекуле белка YB-1 было предсказано наличие PY-NLS. NLS такого типа обычно узнаются
импортином-β2.
Изучать механизм транспорта YB-1 в ядро мы решили с помощью системы
пермеабилизированных клеток HeLa. Данная система наиболее полно удовлетворяет всем
требованиям о минимальных повреждениях клеточных структур и воспроизводит
характеристики, свойственные ядерно-цитоплазматическому транспорту in vivo. Для этой
системы используются клетки с пермеабилизованной мембраной и цитозоль, полученный из
клеток с активным ядерно-цитоплазматическим транспортом.
Мы показали, что лизат из клеток HeLa обеспечивает транспорт, как модельных
субстратов, так и белка YB-1. При использовании лизата из ретикулоцитов кролика транспорт
YB-1 в ядро не наблюдается. Сравнение лизатов по количеству транспортных факторов
показало, что содержание импортина-β1 примерно одинаково, а импортина-β2 значительно
больше в лизате из клеток HeLa. Это может косвенно свидетельствовать о том, что транспорт
YB-1 зависит от импортина-β2.
Известно, что остатки пролина и тирозина критичны для функционирования PY-NLS
Методом сайт-направленного мутагенеза эти остатки в предсказанном PY-NLS в белке YB-1
были заменены на аланин. Мы предполагаем, что мутантные формы белка YB-1 не будут
транспортироваться в ядро, что подтвердит наше предположение об импортин-β2-зависимом
транспорте YB-1.
ТЕРМОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (THERMOFLUOR ASSAY) КАК
НОВЫЙ МЕТОД ПОИСКА И ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ
КРИСТАЛЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ НА ПРИМЕРЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ БЕЛКА
HFQ
Мурина В.Н., Вейс М.С., Мюллер У., Гарбер М.Б., Никонов. С.В., Никулин А.Д.
Пущинский филиал Московского государственного университета им. М.В.
Ломоносова, Пущино (Россия), Гельмгольц-Центр, Берлин (Германия), Институт белка
РАН, Пущино (Россия)
thyrada@rambler.ru
Поиск условий кристаллизации белков в настоящее время – сложный и длительный
процесс тестирования от десятков до тысяч различных условий кристаллизации методом проб
и ошибок. Известно, что способность формировать совершенные кристаллы коррелирует с
гомогенностью, стабильностью и растворимостью белка. Имеются данные, что белки с
температурой плавления выше 45°С кристаллизуются с вероятностью около 50%, тогда как
белки, температура плавления которых ниже 45°С, кристаллизуются значительно хуже
(вероятность получения совершенных кристаллов около 25%). Для повышения стабильности
белков используют различные добавки органического и неорганического происхождения.
Одним из недавно предложенных методов определения влияния добавок на стабильность
белка является метод термофлуоресцентного анализа. В его основе лежит способность
красителя SYPRO Orange флуоресцировать при взаимодействии с гидрофобными областями
белка. Нагревая раствор белка с SYPRO Orange, можно фиксировать температуру, при которой
начинает проявляться флуоресценция красителя, так как при плавлении белка происходит
экспонирование гидрофобных областей. С помощью этого метода можно подбирать добавки,
повышающие температуру плавления белка, тем самым увеличивая вероятность формирования
совершенных кристаллов белка.
В рамках исследования влияния изменений первичной структуры белка Hfq на его
четвертичную структуру и стабильность, были определены температуры плавления мутантных
форм белка методом термофлуоресцентного анализа и проведен поиск добавок,
стабилизирующих мутантные формы белка Hfq для последующей их кристаллизации.
132
Молекулярная биология
Показано, что температуры плавления мутантных форм белка Hfq, определенные данным
методом, находятся в соответствии с данными, полученными другими методами. Полученные
результаты позволили найти условия кристаллизации мутантных форм белка Hfq с заменами
D40A, N28A, YKHA/RGDT.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 12-04-00718) и программы
Молекулярная и клеточная биология Президиума РАН.
РАЗРАБОТКА СХЕМЫ ОЧИСТКИ ЛОШАДИНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО α2ИНТЕРФЕРОНА
Муттар А.Арафат, Потапович М.И., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет
arafataam3@mail.ru
Интерфероны это большое семейство мультифункциональных секретируемых белков,
которые принимают участие в антивирусной защите, регуляции клеточного роста и активации
иммунитета.
В настоящее время в животноводстве особенно остро стоит проблема инфекционных
заболеваний, которые приводят к значительным экономическим потерям. Для лечения
заболеваний бактериальной этиологии выпускается огромное количество антибиотиков, однако
антивирусных лечебных ветеринарных препаратов практически не существует. В этом плане
большие надежды связывают с препаратами интерферонов.
Ген лошадиного лейкоцитарного α2-интерферона с использованием сконструированных
специфических праймеров амплифицирован методом ПЦР на матрице тотальной ДНК,
выделенной из крови, клонирован в составе вектора pUC18 и отсеквенирован. На следующем
этапе работы полученная последовательность переклонирована в вектор экспрессии pET24b(+)
в клетках E. coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIPL. После индукции ИПТГ в бактериальных клетках
наблюдалось накопление белка, соответствующего по молекулярной массе лошадиному α2интерферону (около 18 кДа). Белок накапливался внутри клеток в виде так называемых «телец
включения».
Бактериальные клетки разрушали на проточном дезинтеграторе EmulsiFlex-C5 и тельца
включения собирали центрифугированием. Отмытые тельца включения растворяли в буфере с
гуанидингидрохлоридом и мочевиной, после чего проводили хроматографию на колонке с
диэтил-аминоэтил целлюлозой. Дальнейшую очистку осуществляли с помощью ионообменной
хроматографии на Q-сефарозе. По данным ВЭЖХ полученный раствор содержал более 97%
мономеров лошадиного α2-интерферона. Антивирусную активность очищенного белка, которая
составила 1,6х109 МЕ/мг, определяли с использованием клеток линии MDBK и вируса
везикулярного стоматита.
ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ
СОСУДИСТЫЙ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЙ И ГЛИАЛЬНЫЙ
НЕЙРОТРОФИЧЕСКИЙ ФАКТОРЫ РОСТА
Мухаметова Л.Р., Черенкова Е.Е.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет
vixen_133@mail.ru
Поиск оптимального вектора-переносчика генетической информации, отвечающим таким
требованиям, как малая иммуногенность, биобезопасность, способность кодировать
значительный объем трансгенной информации и долговременность экспрессии
рекомбинантных генов, является одним из ключевых вопросов в генной терапии.
Лентивирусы вызывают широкий ряд патологий у различных видов животных.
Отличительной чертой данных вирусов является их способность к инфекции и интеграции в
геном покоящихся клеток, что, безусловно, привлекательно в контексте генной терапии.
133
Молекулярная биология
Целью нашего исследования стало получение и очистка рекомбинантных лентивирусов,
экспрессирующих различные нейротрофические и нейропротекторные факторы (сосудистый
эндотелиальный фактор роста VEGF121, VEGF165 и VEGF189, глиальный нейротрофический
фактор GDNF). В работе использовали технологию Gateway клонирования, в основе которой
лежит сайт-специфическая рекомбинация между сайтами attплазмид-доноров (pENTRVEGF121, pENTR-VEGF165, pENTR-GDNF) и вектором-реципиентом pLX301. Рекомбинантные
лентивирусы получили с помощью котрансфекции клеток НЕК293Т (human embryonic kidney
293Т) полученными векторными плазмидами (pLX-VEGF121, pLX-VEGF165, pLX-VEGF189 и
pLX-GDNF) и упаковочными плазмидами pCMV-VSV-G и psPAX2. Эффективность экспрессии
рекомбинантных белков подтверждена иммунофлуоресцентным анализом с применением
специфичных антител (Santa Cruze).
Таким образом, были получены рекомбинантные лентивирусы, экспрессирующие
нейропротекторные и нейротрофические факторы VEGF121, VEGF165, VEGF189 и GDNF. В
дальнейшем полученные вирусы будут использованы в экспериментах in vivo и in vitro для
разработки эффективных методов генно-клеточной терапии нейродегенеративных и
сердечнососудистых заболеваний.
ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ
РАПСА
Наргилова Р.М., Карпова О.В., Искаков Б.К.
Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина
rufina.tur@mail.ru
Рапс (Brassica napus) – перспективный источник пищевого масла и кормового белка. В
семенах этой культуры содержится от 32 до 50% масла и до 23% белка. В последнее время
рапсовое масло используется в качестве дизельного топлива. Рапсовое масло особо ценится
своими уникальными целебными свойствами. Широкому внедрению этой культуры в
Казахстане препятствует отсутствие сортов, адаптированных к местным почвенноклиматическим условиям. Поэтому возникает потребность в разработке биотехнологических
методов для создания сортов рапса, устойчивых к условиям Казахстана.
Нами были проведены эксперименты по созданию трансгенных растений рапса с
использованием нескольких методов: андрогенеза; трансформации листовых дисков взрослых
растений; а также гипокотилей и котиледонов, полученных из проростков семян.
Трансформацию проводили кокультивацией с агробактериями штамма pGV2260S A.
tumefaciens, содержащего плазмидный вектор pCAMBIA 2300, который нес в своем составе
кассету [35S-pro-5’PVY-AtDREB1A-3’TMV–nos-ter] или [35S-pro-5’PVY-GUS-3’TMV–nos-ter].
Первая серия экспериментов по проведению трансформации изолированных пыльников на
стадии одноядерной микроспоры, а также контрольных экспериментов (без инокуляции
агробактериями) по регенерации листовых дисков пробирочных растений была неудачной.
Побегов ни в случае гаплоидной трансформации, ни в случае с листовыми дисками получить не
удалось.
В следующей серии экспериментов использовались 8-10-дневные проростки семян рапса
сортов «Крис», «Гадемин» и «Hyola». Проростки разбирались на гипокотили и котиледоны,
затем помещались на среду для каллусообразования, содержащую гормоны: для гипокотилей 2,4 Д в концентрации 1мг/л; для котиледонов – 4,5 мг/л БАП. Через 2 дня экспланты
инокулировались агробактериями с добавлением ацетосирингона 200 µМ в течение 10 минут и
далее помещались на среду для каллусообразования. Для удаления агробактерий
использовались цефотаксим (500 мг/л), а для селекции трансформантов – канамицин (100 мг/л).
Через 2 недели гипокотили переносились на среду для побегообразования, содержащую БАП 4
мг/л и зеатин 2 мг/л, тогда как котиледоны продолжали инкубироваться на среде с
концентрацией БАП 4,5 мг/л. Через 6-8 недель инкубации экспланты помещались на среду с 0,5
мг/л БАП. Первые растения-регенеранты были получены через 8-10 недель. В итоге,
наибольшее число растений показал метод кокультивации гипокотилей.
134
Молекулярная биология
Таким образом, в ходе оптимизации условий трансформации котиледонов и гипокотилей
растений рапса получены растения-трансформанты. Из листьев были выделены препараты
ДНК, которые анализировались методом ПЦР. Эффективность трансформации была разная: из
26 проверенных растений сорта «Hyola» 21 растение, из 12 растений сорта «Крис» 4, а из 18
растений сорта «Гадемин» только 2 растения дали положительный ответ.
ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР P1.1 ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ СТАБИЛЬНОЙ
ЭКСПРЕСИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ БЕЛКОВ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТКАХ КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА
Орлова Н.А., Ковнир С.В., Усакин Л.А., Воробьев И.И.
Институт биоорганической химии Российской академии наук
nobiol@gmail.com
Продукция фармацевтически значимых белков в культивируемых клетках китайского
хомячка - одна из центральных задач биотехнологии. Продуктивность линии, в основном,
определяется уровнем мРНК целевого гена, а ее стабильность – устойчивостью промотора
целевого гена к метилированию, длиной и копийностью генетической кассеты. Широко
используемый промотор цитомегаловируса обеспечивает высокий уровень транскрипции,
однако подвержен инактивации, вызванной метилированием, его эффективность зависит от
контекста точки интеграции. Использование промоторов и регуляторных областей генов
клетки-хозяина потенциально позволяет увеличить долю высокопродуктивных клонов и
избежать инактивации целевого гена. Наилучшие результаты в данной области фиксируют для
нетранслируемых областей (НТО) гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского
хомячка (CHEF1). Среди ограничений существующих векторов с CHEF1 низкая эффективность
трансфекции и низкая частота амплификации целевого гена в геноме, вызванная большим
размером генетической кассеты и возможностью независимой амплификации гена
селекционного маркера.
Результаты. Сконструирован плазмидный вектор p1.1, несущий фрагменты НТО CHEF1,
конкатемер фрагментов терминального повтора вируса Эпштейна-Барр (EBV) и кДНК
дигидрофолатредуктазы мыши, под контролем внутреннего сайта связывания рибосом вируса
энцефаломиокардита. Свойства вектора проверены с использованием кДНК флуоресцентного
белка (EGFP) и кДНК делеционного варианта фактора свертывания крови VIII. При
трансфекции клеток CHO DG-44 плазмидой p1.1-EGFP и контрольной плазмидой без повторов
EBV, показано, что эффективность интеграции в геном плазмиды с повторами EBV выше в 24
раза. При проведении амплификации целевого гена под действием метотрексата (МТХ) в
стабильно трансфицированных плазмидой p1.1-EGFP клетках показано, что уровень продукции
EGFP возрастает приблизительно в 10 раз при увеличении концентрации МТХ до 800 нМ.
Продуктивность 10 линий значимо не изменялась при последовательном культивировании в
течение 60 дней. Основываясь на полученных для модельного белка данных, было исследовано
два способа генерации клональных линий-продуцентов фактора VIII – получение пула
стабильно трансфицированных клеток с последующей селекцией клонов при различных
концентрациях МТХ и прямая генерация клональных линий при концентрации МТХ 50 нМ.
При использовании первого способа были отобраны три линии с продуктивностью 6-10 МЕ/мл
в адгезионной культуре, при использовании второго способа – одна линия с продуктивностью
5,4±0,5 МЕ/мл. После реадаптации линий к суспензионному культивированию была
зафиксирована концентрация фактора VIII 25 МЕ/мл при плотности клеток 2 млн/мл.
Выводы. Плазмидный вектор p1.1, содержащий фрагменты гена фактора элонгации
трансляции 1 альфа китайского хомячка и вспомогательные генетические элементы, пригоден
для получения высокопродуктивных клональных линий-продуцентов фармацевтически
значимых белков.
135
Молекулярная биология
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА DREB2A ARABIDOPSIS THALIANA ПОД РАЗЛИЧНЫЕ
ВАРИАНТЫ 5´-НТП В ВЕКТОР pBluescript KS+ ДЛЯ ПРОВЕРКИ ЕГО
ЭКСПРЕССИИ В СИСТЕМЕ IN VITRO
Писаренко А.М., Карпова О.В., Искаков Б.К.
Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина
alena_pisarenko@inbox.ru
Транскрипционные факторы являются критическими регуляторами изменения экспрессии
генов в зависимости от условий окружающей среды. В настоящее время серьезные усилия
направлены на обнаружение и описание транскрипционных факторов, вовлеченных в
стрессоспецифическую регуляцию генов. Белок DREB2A относится к AP2/ERF-типу факторов
транскрипции, он регулирует экспрессию многих стресс-индуцируемых генов, входя в состав
каскадного механизма их активации. Показано, что ген DREB2Aэкспрессируется у разных
культур в ответ на засуху, засоление и, возможно, низкие температуры.
В качестве матрицы для наработки кодирующей последовательности гена DREB2A с
помощью ПЦР был использован выделенный нами препарат тотальной ДНК растений
A.thaliana. ПЦР-продукт, содержащий кодирующую последовательность гена и восемь
гистидиновых повторов на 3'-конце, был клонирован в вектор pBluescript KS+ под контроль
промотора Т3. Клонирование проводили таким образом, чтобы кодирующая
последовательность гена AtDREB2A стояла также под контролем одного из следующих
вариантов 5´-нетранслируемых последовательностей (НТП): 5´- НТП Y вируса картофеля,
«3хARC» – синтетической последовательности размером в 45 н., комплементарной 18S рРНК
риса в положении с 1115 по 1131 н., 5´Ω – НТП вируса табачной мозаики или 5´-AMV – НТП
вируса мозаики люцерны. Ранее было показано, что все эти варианты 5'-НТП проявляют
энхансерные свойства в системе трансляции in vitro. Таким образом, были получены
следующие варианты кассет: [5´-Y –AtDREB2A – HisTag], [«3хARC» - AtDREB2A – HisTag], [5'Ω –AtDREB2A – HisTag], [5´-AMV – AtDREB2A – HisTag] в составе плазмидного вектора
pBluescript под контролем промотора Т3.
В литературе имеются указания на то, что центральная область белка AtDREB2A содержит
негативный регуляторный домен (с 254 по 335 аминокислотный остаток), делеция которого
приводит образованию конститутивно активной формы белка в условиях стресса. В результате
метода делеционного мутагенеза нами была синтезирована мутированная ДНКпоследовательность, которая содержала кодирующую область гена AtDREB2A с делецией в
районе с 594 пн по 683 пн. Эта последовательность (mutDREB2A) аналогичным образом была
клонирована в вектор pBluescript с теми же вариантами 5´-НТП.
Далее созданные нами рекомбинантные ДНК планируется использовать для экспрессии в
бесклеточной системе пшеницы in vitro с целью оценки уровня синтеза белка AtDREB2A с
различными вариантами 5´-НТП.
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА DDX5 В ХОДЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА И
ВО ВРЕМЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ JURKAT И U937
Пономарцев Н.В., Енукашвили Н.И.
Институт цитологии РАН, ИнЦ группа «Некодирующей ДНК», Санкт–Петербург
(Россия)
ponomartsev@yandex.ru
Белок DDX5 относится к семейству DEAD- бокс содержащих РНК-хеликаз. На
сегодняшний день известно, что этот белок вовлекается в различные процессы РНК
метаболизма, такие как транскрипция, сплайсинг РНК, созревание рРНК. Также
предполагается, что он принимает участие в процессах пролиферации и дифференцировки
клеток.
Целью нашей работы являлось изучение изменения экспрессии белка DDX5 в ходе
клеточного цикла и во время дифференцировки клеток. Эксперимент по изучению изменения
экспрессии DDX5, во время пролиферации проводили на иммортализованных Т-лимфоцитах
136
Молекулярная биология
человека клеточной линии Jurkat. Для изучения распределения клеток по фазам клеточного
цикла в зависимости от концентрации белка DDX5 мы комбинировали окраску антителами
против DDX5 с окраской йодистым пропидием.
В эксперименте по дифференцировке использовали суспензионную моноцитоподобную
клеточную линию U937 человека. Клетки этой линии под действием различных химических
агентов, способны дифференцироваться в макрофагоподобные клетки, приобретая
специфические макрофагальные маркеры и утрачивая способность к пролиферации. В качестве
такого агента мы использовали форболовый эфир. Клетки культивировали в присутствии
форболового эфира 1-24 ч, после чего окрашивали антителами либо против DDX5, либо против
CR3 (CD11b/CD18, поверхностный маркер макрофагов). Данные анализировали на проточном
цитометре. При анализе зависимости распределения клеток по фазам клеточного цикла от
концентрации в них DDX5, мы разделили все клетки на две группы с низким и высоким
содержанием DDX5. 67% клеток с низким содержанием белка DDX5 находилось в фазе G1.
Тогда как 85% клеток с высокой концентрацией DDX5 располагалось в S/G2 фазах.
В эксперименте по изучению экспрессии DDX5 во время дифференцировки клеток U937,
примерно через полчаса после внесения форболового эфира в культуральную среду, часть
клеток адгезировала на поверхности 24 луночного планшета. При этом, в первые два часа после
внесения форболового эфира наблюдалась повышение концентрации DDX5 в клетках по
сравнению с клетками, не обработанными форболовым эфиром. Далее концентрация DDX5
снижалась, и в клетках, которые культивировали более 5 ч в присутствии форболового эфира,
концентрация DDX5 была меньше чем в контрольных недифференцированных клетках, тогда
как концентрация CR3 на поверхности макрофагов начинала возрастать только к 24 ч после
внесения в среду форболового эфира.
Таким образом, было показано, что экспрессия DDX5 возрастает при переходе клетки от
G1 к S фазе, а также на начальных стадиях дифференцировки, и после прохождения основного
этапа дифференцировки концентрация DDX5 в клетках снижается.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СПОРОЦИСТ ТРЕМАТОД РОДА
LEUCOCHLORIDIUM, ПАРАЗИТИРУЮЩИХ В МОЛЛЮСКАХ SUCCINEA SP.
(PULMONATA)
Поспелова А.А., Токмакова А.С.
РГПУ им. А. И. Герцена, Санкт-Петербург
alina.pospelova@zooherzen.org
Спороцисты трематод рода Leucochloridium, паразитирующие в моллюсках янтарках,
широко известны своей способностью внешне подражать личинкам насекомых. Ярко
окрашенные и подвижные отростки спороцист прорастают в щупальца улиток и привлекают
птиц, которые инвазируются склёвывая отростки. Одним из основных морфологических
критериев видовой принадлежности трематод данного рода является цвет и характер окраски
отростков спороцист. В целях проверки объективности таких критериев был проведён
молекулярно-генетический анализ спороцист рода Leucochloridium (с использованием ДНКмаркеров). Для этого в районе пос. Вырица и г.Любани (Ленинградская область) были собраны
моллюски Succinea sp., зараженные L. paradoxum Carus, 1835 (с зелёными отростками) и L.
perturbatum Pojmanska, 1965 (с коричневыми отростками).
Исследования проводили на хромосомной ДНК партенит. Для анализа из моллюсков
собранных в Вырице было отобрано 10 спороцист L. paradoxum и 8 – L. Perturbatum; в Любани
– 8 спороцист L. paradoxum и 2 – L. perturbatum. Выделенную ДНК анализировали методом
ПЦР со специфическими праймерами, соответствующими рибосомным генам Leucochloridium
sp. Фрагменты ДНК спороцист (Любань) L. paradoxum были идентичны на 100%, L. perturbatum
– на 98%. Фрагменты ДНК спороцист (Вырица) обоих видов были идентичны на 100%. Между
последовательностями спороцист разной окраски выявлены различия в районе ITS1 и ITS2,
составившие 5,00% для L. paradoxumи 3,88% для L. perturbatum. Сравнение данных,
полученных нами на ДНК спороцист, изучаемых трематод с аналогичными
последовательностями участков рДНК трематод L. paradoxum и L. perturbatum, представленных
137
Молекулярная биология
в Gene Bank, подтверждает правомерность использования для таксономического анализа
данных видов трематод традиционных морфологических критериев, в том числе окраски
отростков спороцист.
Полученные нуклеотидные последовательности рДНК, включающие ITS1 и ITS2, а также
ген 5,8S РНК и частично участок гена 28S рРНК особей L. paradoxum и L. perturbatum из
Вырицкой популяции зарегистрированы в Gene Bank. Работа выполнена в лаборатории
экспериментальной зоологии РГПУ, при поддержке гранта РФФИ №10-04-00938а и гранта
Министерства образования «Развитие научного потенциала высшей школы» (2009-2011).
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА КУРИНОГО α-ИНТЕРФЕРОНА В КЛЕТКАХ
ESCHERICHIA COLI И PSEUDOMONAS PUTIDA
Потапович М.И., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет
mpatapovich@mail.ru
Интерфероны являются представителями семейства важных регуляторных белков,
называемых цитокинами. Интерфероны обладают широким спектром биологических эффектов,
основными
из
которых
являются
противовирусный,
антипролиферативный
и
иммуномодулирующий.
В настоящее время в животноводстве остро стоит проблема лечения и профилактики ряда
высокоопасных заболеваний вирусной этиологии, в связи с чем возрос интерес к разработке и
созданию эффективных лекарственных средств. В этом отношении интерфероны животных
являются перспективными кандидатами, выступая в качестве основы для лечебнопрофилактических препаратов.
В ходе работы ген куриного лейкоцитарного α-интерферона клонирован в составе вектора
экспрессии pET24b(+) в клетках E. coliBL21. После индукции ИПТГ наблюдалось накопление
белка, соответствующего по молекулярной массе куриному α-интерферону (около 19 кДа), при
этом содержание целевого продукта составило более 30% от общего белка клеток.
В дальнейшем было определено, что белок накапливается внутри клеток в виде так
называемых «телец включения» - плотных агрегатов, которые состоят в основном из
нефолдированного или частично фолдированного целевого белка. Это затрудняет
последующую очистку продукта, поскольку необходимо проводить этап рефолдинга, что в
свою очередь сопряжено с большими потерями материала и является весьма трудоемким.
Из литературных данных известно, что в клетках Pseudomonas не образуются тельца
включения при экспрессии гетерологичных генов, кроме того, в литературе отсутствуют
данные о попытках экспрессии генов α-интерферонов в клетках бактерий р.Pseudomonas.
На следующем этапе работы было решено переклонировать ген куриного α-интерферона в
клетках P. putida. Предполагалось, что это позволит получить конститутивную экспрессию гена
куриного альфа-интерферона и, кроме того, белок будет накапливаться в клетках в
растворимой форме, а не в тельцах включения.
Ген куриного α-интерферона был клонирован в составе вектора pEDV6 под контролем
промотора эффекторного белка AvrRPS4 P.syringae в клетках E. coli BW19851, после чего
рекомбинантная конструкция была передана путем конъюгации в клетки штаммаP. putida
PPT2. После выращивания клеток в течение 12 часов при 28 оС в жидкой LB-среде было
показано накопление белка куриного α-интерферона, при этом содержание целевого продукта
составило около 17-20% от общего содержания белка в клетках, что значительно ниже, чем в E.
coli. Однако в клетках Pseudomonas не образуются тельца включения, и белок аккумулируется
в растворимой форме, что позволит облегчить процедуру его выделения и очистки при гораздо
меньших потерях продукта.
РОЛЬ СИГМА-СУБЪЕДИНИЦЫ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В
СИНТЕЗЕ РНК НА СТАДИИ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ
138
Молекулярная биология
Пупов Д.В., Кузин И.А., Кульбачинский А.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной
генетики Российской академии наук; Московский государственный университет им.
М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва (Россия)
danila@pupov.ru
У бактерий сигма-субъединица играет главную роль в узнавании промоторов
холоферментом РНК-полимеразы (РНКП). Районы 2 и 4 сигма-субъединицы, участвующие в
узнавании двух консервативных участков промотора (-10 и -35 элементов), разделены гибким
линкером, который образован консервативным районом 3.2 сигма-субъединицы и формирует
белковую петлю, располагающуюся в канале выхода РНК недалеко от активного центра
фермента. Ранее нами было показано, что делеция нескольких аминокислотных остатков (513519) в этой петле в сигма70-субъединице Escherichia coli нарушает инициацию синтеза РНК, а
также изменяет картину коротких РНК-продуктов, образующихся в ходе абортивной
инициации. В данной работе при помощи методов транскрипции in vitro и РНК-белковых
сшивок исследованы эффекты делеций различного размера в районе 3.2 сигма70-субъединицы
РНКП E. coli на инициацию транскрипции. Показано, что делеции нарушают связывание
инициаторных нуклеотидов на промоторах различной структуры, причем дефекты мутантных
РНКП частично компенсируются при проведении инициации транскрипции в присутствии
коротких РНК-затравок. Установлено, что профиль абортивных продуктов, синтезируемых в
процессе инициации транскрипции, изменяется в зависимости от размера делеций. Это
позволяет предположить, что район 3.2 сигма70-субъединицы, за счет своей близости к
активному центру, принимает участие в связывании инициаторных нуклеотидов, а также в
процессе абортивной инициации и переходе к элонгации транскрипции, за счет конкуренции с
синтезируемым транскриптом в канале выхода РНК.
Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России» на 2009-2013 годы (госконтракт № 02.740.11.0771) и Грантом Президента РФ для
государственной поддержки молодых российских ученых (МД-618.2011.4).
ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СЕМЕЙСТВА ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ НА
ОСНОВЕ СПЕКТРИНОВОГО SH3-ДОМЕНА
Ратникова Н.М.1,2, Гущина Л.В.1, Филимонов В.В.1
1
Учреждение Российской академии наук Институт белка РАН, Пущино (Россия);
2
ФГБУВПО Удмуртский государственный университет, Ижевск (Россия)
ratnikova-nm@rambler.ru
SH3-домены - небольшие глобулярные белки длиной 55–70 аминокислотных остатков,
являющиеся распространенными компонентами многих регуляторных белков. Взаимодействуя
с пролин-богатыми участками белков-партнеров, находящимися в конформации
полипролиновой спирали II, они выполняют свои регуляторные функции. С целью выяснения
параметров белок-пептидных взаимодействий в системе SH3-домен/лиганд, было
сконструировано несколько последовательностей химерных белков по схеме: мет-лигандлинкер-КП, где лиганды - это декапептиды с последовательностями GAPPLPPESA (SH3-F1),
GAPPLPPYSA (SH3-F2, -F3, F4), линкеры – GNG (SH3-F1), GG (SH3-F2), GAG (SH3-F3),
GGTG (SH3-F4). КП-круговой пермутант S19-P20s с разрывом в RT-петле.
Гены белков были сконструированы, клонированы и экспрессированы в клетках E. coli.
Данные триптофановой флюоресценции показали, что в новых белках F3 и F4 лиганд занимает
на месте связывания то же положение, что в ранее изученном варианте F2. Обнаружено, что
стабильность структур вариантов F3 и F4 значительно меньше, чем у структуры F2, но выше,
чем у кругового пермутанта. Небольшая разница в стабильностях между F4 и F3, однако,
свидетельствует в пользу того, что трехчленный линкер создает некоторую напряженность в
структуре химеры, которая, по-видимому, ослабляется в случае четырехчленного линкера
GGTG. Методом сканирующей микрокалориметрии определены термодинамические
параметры образования новых кооперативных единиц и через них параметры связывания
139
Молекулярная биология
лигандов в нетипичной для этого белка ориентации. С целью уточнения термодинамических, а
также спектроскопических данных предпринимаются попытки получить точную информацию
о структуре белков методами ЯМР И РСА.
Работа проведена при финансовой поддержке гранта Президента Российской Федерации
(МК-2917.2010.4).
НОВАЯ СТРАТЕГИЯ ДИЗАЙНА И СКРИНИНГА КОМБИНАТОРНЫХ
БИБЛИОТЕК ВАРИАНТОВ ГЕНА ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА
Романова И. В., Шингарова Л.Н., Петровская Л.Е., Долгих Д.А.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
medvegonok_sneg@mail.ru
Использование комбинаторных библиотек играет важнейшую роль в белковой инженерии.
Оно позволяет проводить направленную молекулярную эволюцию, в частности, отбирать
искусственные связывающие белки, которые могут быть перспективными терапевтическими
агентами для лечения различных патологических состояний.
Фактор некроза опухолей-альфа человека (ФНО) относится к группе цитокинов,
регулирующих важнейшие процессы организма (воспалительные реакции, противоопухолевый
иммунитет, апоптоз). Кроме того, доказано участие ФНО в патогенезе ревматоидного артрита,
болезни Крона и других. Разработка новых ингибиторов ФНО, блокирующих биологическую
активность этого цитокина, является актуальной задачей белковой инженерии.
Для конструирования ФНО-связывающих белков мы выбрали 10 домен фибронектина III
типа (домен фибронектина, Fn3). Он является структурным аналогом вариабельного домена
тяжелой цепи иммуноглобулинов. Изменение последовательностей аминокислот в трех
петлевых участках Fn3, соответствующих CDR участкам антитела, придают таким мутантным
белкам способность связывать разные антигены.
Нами была разработана новая стратегия поиска ФНО-связывающих белков, включающая
метод синтеза библиотеки и способ отбора вариантов, связывающих белок-мишень.
Рандомизация вариабельных участков гена Fn3 проводилась с использованием тримерных
синтетических блоков,а скрининг библиотеки - с помощью метода бесклеточного CIS-дисплея.
На первом этапе работы были рандомизированы последовательности, соответствующие
участкам петель BC,DE и FG домена фибронектина, таким образом была получена библиотека
кодирующих последовательностей. На втором этапе для поиска вариантов, связывающих ФНО,
использовали метод бесклеточного CIS-дисплея. Белки, обнаружившие наибольшую
связывающую способность, были экспрессированы в клетках E. coli. Показано, что
сконструированные нами белки специфически взаимодействуют с ФНО в ELISA и Вестернблоте.
В результате проделанной работы была получена новая комбинаторная библиотека
вариантов домена фибронектина для получения рекомбинантных белков, связывающих ФНО и
другие лиганды. Были выделены и охарактеризованы несколько десятков афинных вариантов,
связывающих ФНО, свойства которых исследуются.
Благодарности. Работа проводится при финансовой поддержке гранта НШ- 5597.2012.4,
программы РАН «Молекулярная и клеточная биология» и федеральной целевой программы
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 г.
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ АМИДОВ 9ЗАМЕЩЕННЫХ ФЕНАЗИН-1-КАРБОНОВИХ КИСЛОТ
Васильченко О.В., Рыбак М.Ю., Пальчиковская Л.И., Бабкина М.М., Костина В.Г.
Институт молекулярной биологии и генетики Национальной академии наук Украины,
Институт ветеринарной медицины ААН Украины
marijka_rybak@mail.ru
140
Молекулярная биология
В качестве исследования было избрано феназин-1-карбоновую кислоту (ФКК-1) и ее
производные – природные соединения, которые являются вторичными метаболитами, что
синтезируются небольшим количеством бактерий, в том числе Pseudomonas, Streptomyces,
Brevibacterium, Nocardia. Интерес к синтезу производных ФКК-1 обусловлен их
антибактериальным свойством, а также способностью замедлять возникновение
резистентности к лекарственным препаратам.
Как известно, 9 положение феназинового гетероцикла является важным для формирования
биологической активности ФКК-1. Так, разные заместители в этом положении
этилендиаминового амида ФКК-1 значительно влияют на уровень его противоопухолевого
действия. В связи с этим был проведён синтез трёх серий ариламидов ФКК-1: не замещенной,
9-метил- и 9-метокси-ФКК-1. Всего было синтезировано 29 соединений.
Одним из самых важных этапов в изучении действия биологически-активных соединений
in vitro является выбор модельной системы. В нашем случае была избрана тест-система на
основе РНК-полимеразы бактериофага Т7 (РНКП) благодаря тому, что она имеет очень
высокую продуктивность, не нуждается поэтому в радиоактивной метке для детекции процесса
полимеризации и является достаточно универсальной благодаря своей структуре, а также
система релаксации суперспирализированной формы ДНК топоизомеразой І E.сoli. РНКП
является одним из самих важных ферментов, что отвечает за воспроизведение и развитие
бактериофага Т7. Проведенный первичный скрининг соединений на модельной системе
транскрипции, обнаружил 16 активных соединений с IC50 в пределах 5-50 мкМ. Система
релаксации ДНК (топоизомераза І E.сoli) оказалась не чувствительной к исследованным
веществам в пределах концентрации 100 мкМ.
Исследования антимикробных способностей синтезированных ариламидов феназин-1карбоновых кислот на широком спектре бактериальных моделей определило ряд соединений,
которые проявляют избирательную ингибирующую активность относительноMicrococcus spp.,
Erysipelothrix. Bacillus cereus, Salmonella choleraesuis. По ходу эксперимента были
использованы общепринятые методы: выделения плазмидной ДНК, приготовления
компетентных клеток, проведения трансформации, рестрикции, транскрипции in vitro и гельэлектрофореза.
Проведенное исследование показано эффективное концентрационно- и структурнозависимое угнетение синтеза РНК представителями фениламидов всех трех серий ФКК-1. Из 16
соединений, активных в модельной системе транскрипции Т7 РНКП, 7 веществ проявили
изберательную способность существенно гальмировать рост вышеуказанных бактерий. Таким
образом, использованные модификации базовой молекулы феназин-1-карбовой кислоты
привели к появлению селективной антибактериальной активности синтезированных
соединений.
ЛИГАНД-ИНДУЦИРУЕМАЯ СБОРКА ШАПЕРОНА КЛЕТОК E.COLI GroEL “in
vitro”: ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИЕЙ
Рябова Н.А., Селиванова О.М., Котова Н.В., Марченков В.В., Семисотнов Г.В.
Институт белка РАН, Пущино (Россия)
ryabova@phys.protres.ru
Белок теплового шока клеток E.coli GroEL (Hsp 60) относится к классу шаперонов и
является сложным олигомерным белком, ассистирующим сворачивание многих клеточных
белков, предотвращая их неспецифическую агрегацию. GroEL состоит из 14 идентичных
субъединиц (60 кДа каждая), которые образуют два взаимодействующих гептамерных кольца.
Процесс формирования сложной олигомерной структуры этого шаперона инициируется его
лигандами (Mg-ATP, Mg-ADP и белковым ко-шапероном GroES (Hsp 10)), но изучен
недостаточно.
Ранее в результате равновесных и кинетических исследований процесса лигандиндуцируемой сборки GroEL нами была предложена модель этого процесса, согласно которой
сборка полной частицы GroEL происходит через формирование промежуточного олигомера –
однокольцевой гептамерной структуры, стабилизированной взаимодействием с гептамерным
141
Молекулярная биология
ко-шапероном GroES. В данной работе мы визуализировали процесс сборки GroEL-частицы с
помощью электронной микроскопии методом негативного контрастирования.
На первом этапе олигомеризации GroEL были обнаружены кольцевые структуры, как
свободные, так и занятые ко-шапероном GroES. Данные по исследованию кинетики
олигомеризации GroEL методами рассеяния света и электрофореза указывают на то, что в этом
временном интервале полных частиц GroEL нет. Таким образом, мы подтвердили, что сборка
двухкольцевой GroEL-частицы происходит через формирование однокольцевой гептамерной
конформации, которая способна взаимодействовать с ко-шапероном GroES. На поздней стадии
сборки GroEL-частицы были также обнаружены симметричные комплексы полной GroELчастицы с двумя молекулами ко-шаперона GroES, которые присутствуют в предложенной нами
модели сборки GroEL.
Работа поддержана программами «Молекулярная и клеточная биология», ФЦП №
02.740.11.0295, ФЦП № П304 и грантом РФФИ (09-04-00768-а).
ТРАНСФЕКЦИЯ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА РНК В КОМПЛЕКСЕ С
РЕКОМБИНАНТЫМ АНАЛОГОМ НУКЛЕОФОЗМИНА 1
Савельева А.В., Семенов Д.В., Коваль О.А., Рабинов И.В., Кулигина Е.В., Рихтер
В.А.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины сибирского отделения
РАН; Новосибирский государственный университет
savelevaav@gmail.com
Известно, что РНК присутствуют во внеклеточном пространстве в составе апоптотических
телец, экзосом, микровезикул, липопротеидов, а также в составе свободных
рибонуклеопротеиновых комплексов. Внеклеточные РНК биологических жидкостей человека
включают в себя обширный набор некодирующих РНК, в том числе и микроРНК,
регулирующие трансляцию мРНК. Ранее Wang K. с соавторами было показано, что
секретируемый клетками человека белок нуклеофозмин 1 взаимодействует с микроРНК, и
микроРНК в комплексе с нуклеофозмином 1 проявляет повышенную устойчивость к действию
РНКазы А in vitro. Целью данного исследования являлось изучение способности
рекомбинантного аналога нуклеофозмина 1 человека с 6*His аффинным лигандом (Npm16*His) опосредовать проникновение некодирующих РНК в клетки человека.
Для наработки целевого белка в клетках E. coli нами были сконструированы плазмидные
векторы, кодирующие рекомбинантный аналог нукелофозмина 1 человека (Npm1-6*His).
Получены штаммы-продуценты аналога, разработана методика выделения и очистки белка из
лизата клеток E. coli, проведена препаративная наработка рекомбинантного белка Npm1-6*His.
Структура полученного рекомбинантного аналога нуклеофозмина 1 была подтверждена
методом MALDI-TOF масс-спектрометрии продуктов исчерпывающего трипсинолиза. С
помощью электрофоретического разделения белковых препаратов Npm1-6*His в нативных
условиях было показано, что рекомбинантный аналог Npm1 представлен мономерной и
мультимерной формами.
Для оценки влияния Npm1-6*His на эффективность трансфекции клеток человека
синтетическими РНК клетки MCF-7 инкубировали в среде, содержащей комплексы
нуклеофозмина 1 с аналогами малых ядрышковых РНК и Alu-РНК. Показано, что количество
синтетичекой Alu-РНК в клетках MCF-7 значительно (≈30 раз) возрастает при трансфекции
клеток комплексом Alu-РНК/Npm1-6*His по сравнению с пассивной трансфекцией. На
доставку аналогов малых ядрышковых РНК нуклеофозмин 1 не оказывает существенного
влияния.
В совокупности полученные данные показывают, что ядрышковый фосфопротеин
нуклеофозмин 1 способен взаимодействовать с синтетическими аналогами некодирующих РНК
и опосредовать процесс интернализации РНК с развитой вторичной структурой клетками
человека.
Работа поддержана грантами РФФИ: № 10-04-01386-а, РФФИ № 10-04-01442-a; грантом
поддержки молодых ученых компании «ОПТЭК».
142
Молекулярная биология
СОЗДАНИЕ ВИЗУАЛИЗИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ
ИССЛЕДОВАНИЯ ТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ Β-АМИЛОИДА
Сапронова А.А.1,2, Шепеляковская А.О.1, Lathe R.2
1
Филиал института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН; 2Пущинский государственный естественно-научный институт
sashulka.s@gmail.com
Болезнь Альцгеймера (БА) – неизлечимое нейродегенеративное заболевание,
начинающееся, чаще всего, после 65 лет. Установлено, что БА является протеинопатией,
связанной с накоплением в мозге больных аномально свернутых и деградированных белков в
виде амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков гиперфосфорилированного тау-белка.
Показано, что в отсутствие тау, токсичность β-амилоида не проявляется.
Другой характерной чертой патологии при БА является митохондриальная дисфункция.
HSD17B10 – митохондриальный фермент класса SDR, был идентифицирован как партнер для
связывания с β-амилоидом. Тем не менее, ингибирование его энзиматической активности не
является причиной гибели нейронов.
Целью данного исследования явилось создание клеточной модели для визуализации
процессов, вызванных β-амилоидом.
В ходе данной работы была создана конструкция, включающая ген HSD17B10, связанный с
геном красного флуоресцентного белка (RFP), которая коэкспрессировалась с конструкцией,
включающей ген тау, связанный с GFP, в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y.
ДНК в клетки вводили при помощи липофекции и электропорации для получения
временной и стабильной экспрессии. Для получения стабильных линий использовалась
селекция на неомицине и пуромицине. При помощи конфокальной и флуоресцентной
микроскопии было изучено распределение рекомбинантных белков внутри клетки.
Были получены трансформанты со стабильной и временной экспрессией меченных белков,
причем их локализация соответствовала ожидаемой.
Таким образом нами получена визуализированная клеточная модель, которая может стать
полезным инструментом для изучения токсического эффекта β-амилоида и, возможно, для
отбора потенциальных терапевтических средств для лечения БА.
РЕФЕРЕНСНЫЕ ГЕНЫ КУКУРУЗЫ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ И РАНЕВОМ
СТРЕССАХ
Сафина А.Ф., Горшков В.Ю., Топоркова Я.Ю., Гоголев Ю.В
КФУ, КИББ КазНЦ РАН
anita-safina@mail.ru
Характеристика особенностей экспрессии генов занимает одно из ведущих мест в
фундаментальных и прикладных исследованиях, поскольку дает ценную информацию для
понимания механизмов функционирования живых организмов. Серьезной проблемой при
оценке уровня экспрессии генов является невозможность абсолютного выравнивания
анализируемых образцов традиционными способами. Поэтому на сегодняшний день
единственный грамотный подход для оценки экспрессии интересующих исследователя генов
заключается в сопоставлении уровня экспрессии целевого гена (т.е. экспрессия которого
изучается) и генов со стабильным уровнем экспрессии, которые также называют референсными
генами. При этом уровень экспрессии последнего принимается за константную величину.
Референсного «универсального» гена, который всегда проявляет одинаковый уровень
экспрессии в различных условиях, при различных воздействиях и на разных стадиях онтогенеза
не существует. Поэтому отправной точкой в исследованиях, касающихся изучения
особенностей экспрессии генов, является грамотный подбор референсных генов, позволяющих
адекватно интерпретировать экспериментальные данные при определенных условиях и
воздействиях.
143
Молекулярная биология
Цель настоящей работы заключалась в разработке тестовой системы для выявления
стабильно экспрессирующихся генов кукурузы (Zea mays L.) при раневом и окислительном
стрессах. На основе данных литературы были выбраны «гены-кандидаты», которые у ряда
видов растений охарактеризованы как стабильно экспрессирующиеся. В число кандидатов
входили следующие гены: актина, тубулина, глицеральдегид-3- фосфат дегидрогеназы, фактора
элонгации и контроля клеточного деления. С помощью пакета программ Vector NTI Advance 9
были сконструированы праймеры и флуоресцентные зонды TaqMan, необходимые для
проведения количественного ПЦР-анализа в реальном времени. Расчет стабильности
экспрессии генов провели при помощи программы GeNorm.
При помощи разработанной тестовой системы и программы GeNorm были выбраны
стабильно экспрессирующиеся гены кукурузы при раневом и окислительном стрессах. На этой
основе была оценена динамика экспрессии гена алленоксидсинтазы – одного из ферментов
липоксигеназного сигнального каскада, при раневом и окислительном стрессах. Обнаружено,
что динамика экспрессии этого гена отличается при воздействии разных стрессоров. При
раневом стрессе уровень экспрессии этого гена достигал максимума через 4 часа после
воздействия; далее транскрипционная активность значительно снижалась. В случае
окислительного стресса уровень экспрессии гена алленоксидсинтазы постепенно увеличивался
в течение всего времени наблюдения. Эти результаты свидетельствуют о том, что стрессовые
воздействия активируют экспрессию генов ферментов сигнальных систем, и что различные
типы стрессоров «запускают» работу сигнальных систем по различным механизмам.
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗНЫХ ГЕНОВ
АРАБИДОПСИСА
Селиванова Н.В., Почивалина А.Э., Хамвиталла М., Махмуд Али С., Хамад А.Х.Х,
Федорин Д.Н.
Воронежский государственный университет
kir2202@yandex.ru
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ; КФ 1.3.5.1) встроена во внутреннюю мембрану
митохондрий, являясь одновременно комплексом II ЭТЦ и функциональной частью ЦТК. СДГ
в геномах высших растений характеризуется наличием полигенного семейства. В связи с этим
целью
данной
работы
явилось
изучение
филогенетического
родства
генов
сукцинатдегидрогеназы A. thaliana.
При исследовании использовали известные последовательности генов СДГ Arabidopsis
thaliana L., взятые из международной базы данных базы данных GenBank.Кластерный анализ
нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы PHYLIP.
Кластерный анализ нуклеотидных последовательностей мРНК сукцинатдегидрогеназы
генов sdh1-1 и sdh1-2 позволил установить, что сходство их состава составляет 61,6%. При этом
в составе последовательностей выявлены высококонсервативные участки с гомологией более
90%. Максимальное сродство в структуре генов обнаруживается в составе экзонов, что
указывает на консерватизм основных структурных и функциональных компонентов белковой
молекулы сукцинатдегидрогеназы.
В тоже время, общая гомология между тремя генами, кодирующими субъединицу В
сукцинатдегидрогеназы арабидопсиса, составляет 24,5%. Однако, гены sdh2-1 и sdh2-2 имеют
большее эволюционное сродство между собой, что, вероятно, обесславливает их общее
эволюционное происхождение. Анализ интрон-экзонного строения генов sdh2-1, sdh2-2 и sdh23 из арабидопсиса также указывает на сходство строения генов sdh2-1 и sdh2-2, как и их мРНК.
Они имеют в своем составе два консервативных участка, имеющих высокий процент
гомологии. А в структуре гена sdh2-3 A. thaliana выявлено пять экзонных участков.
Т.о., полученные данные позволяют предположить, что гены sdh2-1и sdh2-2 произошли в
результате сравнительно недавно произошедшего события дупликации и что отделение гена
sdh2-3было более ранним. Что, вероятно, связано с различными функциями, выполняемыми
белками СДГ2-1, СДГ2-2 и белком СДГ 2-3. Дополнительная форма сукцинатдегидрогеназы
может участвовать в утилизации сукцината, образующегося в результате функционирования
144
Молекулярная биология
глиоксилатного цикла на этапах интенсивного развития растений, выполняя биосинтетическую
роль.
ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МУТАНТА E.COLI, ТОЛЕРАНТНОГО К
БУТАНОЛУ
Серегина Т.А., Осипов Г.А., Шакулов Р.С., Миронов А.С.
ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Академическая
группа академика РАМН Ю.Ф. Исакова при Научном центре сердечно-сосудистой
хирургии РАМН, ФГУП ГосНИИ генетики и селекции промышленных
микроорганизмов
tatyana.s82@gmail.com
Устойчивость к бутанолу является ключевым фактором, влияющим на способность
микроорганизмов генерировать экономически выгодные количества бутанола. В настоящей
работе на основе штамма E.coli MG1655 с помощью метода направленной эволюции в средах,
содержащих бутанол, был получен мутант, способный расти в присутствии 1.5% бутанола в
среде. Полученный мутант (ButR) проявлял ряд фенотипических свойств, свидетельствующих о
нарушении функционирования компонентов клеточной стенки. Прежде всего, мы показали, что
выживаемость мутанта ButR резко снижается под воздействием гиперосмотической среды, по
сравнению с родительским штаммом. Кроме того, бутанол-толерантный мутант обнаруживал
повышенную чувствительность к антибиотикам b-лактамного ряда, а также к антибиотикам
ингибирующим синтез белка и РНК (хлорамфениколу, рифампицину, аминогликозидам), и, в
то же время, демонстрировал повышенную устойчивость к антибиотикам, механизм действия
которых связан с нарушением синтеза липидов (циклосерин) и дезорганизацией мембраны
(сурфактин). В условиях оксидативного стресса, вызванного паракватом, мутант ButR
характеризовался повышенной чувствительностью к данному стрессовому фактору.
Определение липидного состава мембран штаммов MG1655 и MG1655 ButR выявило
появление новых, нехарактерных для штамма дикого типа жирных кислот: тридекановой и
двух изомеров пентадеценовой кислоты. Более того, в мембранной фракции мутанта ButR
значительно увеличилось содержание ненасыщенных жирных кислот по сравнению со
штаммом дикого типа (14,1% для MG1655 и 26,4% для MG1655 ButR). Еще одним указанием
на изменение функционирования клеточной мембраны у мутанта ButR являются выявленные
нами в его геноме нуклеотидные замены, затрагивающие регуляторную область гена ompC,
который кодирует синтез трансмембранного белка-порина OmpC. На последнем этапе работы
было изучено влияние суперэкспресии белков холодового шока на устойчивость к бутанолу. С
этой целью клетки E.coli штаммов MG1655 и MG1655 ButR были трансформированы
плазмидами pINCspA, pINCspC и pINCspE, в которых гены, кодирующие белки холодового
шока (Csp) находились под контролем изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG)
индуцибельного промотора. Активация экспрессии генов белков семейства CspA приводила к
снижению устойчивости к бутанолу как у родительского штамма, так и у бутанол-устойчивого
мутанта MG1655 ButR.
Совокупность полученных в ходе работы данных позволяет заключить, что полученный
нами бутанол-толерантный мутант MG1655 ButR обладает рядом фенотипических
характеристик, свидетельствующих о структурных перестройках клеточных мембран,
затрагивающих, как липидную, так и белковую компоненты.
ПЕТЕЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМАТИНА В ПРОФАЗЕ I МЕЙОЗА И
МОДЕЛЬ ОБРАЗОВАНИЯ ГЕНОМОВ ТЕПЛОКРОВНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ
Сизова Т.В., Карпова О.И.
ИОГен РАН
olonare@mail.ru
145
Молекулярная биология
Изохоры - протяженные, достаточно гомогенные по GC-составу участки хромосом, тесно
связанные с рядом основных биологических свойств: плотностью генов, временем начала
репликации, частотами рекомбинации, распределением сайтов метилирования и мобильных
генетических элементов. Они являются основой цитогенетического хромосомного бэндинга.
Синаптонемный комплекс - субъядерная структура, возникающая в профазе первого деления
мейоза и объединяющая гомологичные хромосомы в биваленты. Молекулы ДНК гомологичных
хромосом на этой стадии организованы в фибриллы хроматина, которые в виде петель
прикреплены к боковым элементам СК. СКАР ДНК - семейство последовательностей геномной
ДНК, лежащих в основаниях петель, обладающих рядом специфических свойств и
обогащенных консервативными последовательностями. Изохорные композиционные фракции
геномов человека, золотистого хомячка и цыпленка использовались в качестве зондов для
ДНК-ДНК – гибридизации с последовательностями СКАР ДНК, ранее выявленными в геноме
золотистого хомячка. Синаптонемные комплексы, образующиеся в ядрах сперматоцитов
золотистого хомячка, являются наиболее удобными для выделения. Выявленная нами ранее
эволюционная консервативность СКАР ДНК позволила использовать в качестве зондов
геномную ДНК не только золотистого хомячка, но и других позвоночных.
Определена плотность распределения последовательностей СКАР ДНК в разных
изохорных компартментах геномов золотистого хомячка, человека и цыпленка. Она обратно
пропорциональна длинам петель ДНК, прикрепляющихся к СК. Сделан вывод о том, что в
разных изохорных компартментах геномов человека, цыпленка и золотистого хомячка длины
петель ДНК, прикрепляющихся к СК, различны и изменяются сходным образом. Оценено
количество генов в петлях ДНК. Предложена модель образования GC-богатых изохор в
геномах теплокровных позвоночных, согласно которой происходило не только увеличение GCсостава, но и сжимание некодирующих и не значимых функционально участков ДНК, а также
объединение сжимающихся изохор.
СЕНСОРНАЯ РНК КОНТРОЛИРУЕТ Rho-ЗАВИСИМУЮ ТЕРМИНАЦИЮ
ТРАНСКРИПЦИИ ЛИДЕРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА ribB E. COLI
Склярова С.А., Прошкин С.А., Миронов А.С.
ФГУП ГосНИИгенетика, Москва (Россия)
sklyarovasveta@yahoo.com
В 5'-лидерных областях многих бактериальных мРНК обнаружены регуляторные элементы,
названные сенсорными РНК (или рибопереключателями, riboswitches), которые способны
формировать альтернативные вторичные структуры в зависимости от присутствия
специфического лиганда и включать или выключать процесс элонгации транскрипции мРНК
или инициации трансляции этих мРНК. В структуре сенсорных РНК можно выделить два
функциональных модуля: аптамерный, отвечающий за распознавание и связывание метаболита,
и экспрессионный, вовлеченный в регуляцию активности прилегающих генов. Как правило, в
состав экспрессионного модуля входит фактор-независимый терминатор транскрипции либо
секвестор трансляции. Однако в последнее время обнаружены малые РНК, содержащие
аптамерный модуль без фактор-независимого терминатора.
Изучая регуляцию экспрессии гена ribB E.coli, кодирующего один из ферментов
биосинтеза рибофлавина, мы обнаружили новый механизм контроля транскрипции с участием
сенсорной РНК. Мы установили, что специфический ингибитор Rho-фактора бицикломицин
повышает уровень транскрипции гена ribB при репрессирующей концентрации лиганда.
Сенсорная РНК напрямую контролирует терминацию транскрипции лидерной области, т.к. в
очищенной системе in vitroFMN стимулирует Rho-зависимую терминацию транскрипции в
отсутствии трансляции. Мутации в лидерной области гена ribB, стабилизирующие такую
конфигурацию РНК, которая имитирует комплекс с FMN, способствуют Rho-зависимой
терминации in vivo и in vitro. С другой стороны, мутации, приводящие к формированию
альтернативной конформации РНК, подавляют FMN-зависимую репрессию транскрипции гена
ribB. Таким образом, изменение конфигурации сенсорной РНК в результате связывания с FMN
146
Молекулярная биология
приводит к подавлению дальнейшей транскрипции структурной части этого гена в результате
Rho-зависимой терминации.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ТРАНСПОЗОНА HEMAR1 ВАРИАБЕЛЬНА В
КЛОНАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ HIMASTHLA ELONGATA
Соловьева А.И., Галактионов Н.К., Подгорная О.И.
Санкт-Петербургский государственный университет; Институт цитологии РАН
orcinuca@gmail.com
Трематоды имеют сложный жизненный цикл, протекающий с чередованием
партеногенетических и гермафродитного поколений. Считали, что партеногенетические
личинки трематод, происходящие от одной материнской особи, являются клонами. Однако
использование ДНК-маркеров позволило установить генетическую гетерогенность клонов
дочерних спороцист, редий и церкарий. Такая изменчивость могла стать следствием
перемещения мобильных элементов в геноме.
Для изучения возможной роли транспозонов в формировании клональной изменчивости
партенит трематод взяты партеногенетические личинки Himasthla elongata (Echinostomatidae).
Изоляты партенит H.elongata выявляли в первом промежуточном хозяине Littorina littorea.
Особь L.littorea несет группу партенит, произошедших из одного мирацидия и представляющих
собой генетически идентичные клоны. Настоящее исследование провели на уровнях пулов
церкарий,выделенных из особей L.littorea,и отдельных церкарий. В геноме H.elongata известна
одна последовательность мобильного элемента – hemar1, из семейства транспозонов mariner.
Чтобы определить,участвует ли hemar1 в формировании генетической вариабельности
партенит, использовали метод S-SAP (Sequence-specific amplification polymorphism). После
обработки геномной ДНКHindIII, с сайтом узнавания в 5'UTR hemar1,к рестриктам лигировали
адаптерные последовательности. ПЦР проводили в 2 раунда: ПЦР рестриктов с праймеров
специфичных адаптеру и консервативному району транспозазы hemar1 (Mar276R), далее
селективно реамплифицировали полученные продукты праймерами, помеченными γ33P dATP.
Определили, что последовательностьhemar1 выявляется в полиморфном наборе полос.
Выявлены консервативные и вариабельные зоны. Последние характеризуют отдельные особи
партенит. Гетерогенность распределения полиморфных фрагментов ДНК особей из разных
клональных популяций выше, чем из одной. Для подтверждения того, что выявляемая
гетерогенность действительно связана с консервативной областью hemar1, продукты первой
реакции были селективно реамплифицированы с меченным праймером к адаптерной
последовательности и Mar276R. Выявлен гетерогенный набор зон, среди которых
присутствуют как консервативные для всех партенит полосы, так и полиморфные на уровне
межклональных и клональных популяций. Зоны, выявляемые при амплификации с меченного
радиоактивно Mar276R не присутствуют среди продуктов реакции с меченного праймера к
адаптерной последовательности. Зоны же, выявляемые в присутствии меченного Mar276R,
действительно содержат последовательности, гомологичные hemarI, что может
свидетельствовать о вовлечении элемента hemarI в генетическую вариабельность партенит H.
elongata.
АНАЛОГИ C/D БОКС РНК КАК ИСКУССТВЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ
ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Степанов Г.А., Семенов Д.В., Кулигина Е.В., Коваль О.А., Рихтер В.А.
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
(Россия)
stepanov_g@ngs.ru
Малые ядрышковые C/D бокс РНК (мяоРНК) направляют сайт-специфичное 2’-Ометилирование нуклеотидов рРНК и малых ядерных РНК клеток эукариот. Недавно было
показано, что некоторые C/D бокс РНК, а также короткие продукты их внутриклеточного
147
Молекулярная биология
процессинга регулируют пост-транскрипционную модификацию комплеменарной пре-мРНК
либо трансляцию зрелой мРНК.
В данной работе были сконструированы и синтезированы аналоги U24 малой ядрышковой
C/D бокс РНК, направленные на нуклеотиды 28S и 18S рРНК, а также пре-мРНК и зрелой
мРНК белка теплового шока hsc70. Было показано, что при трансфекции клеток
аденокарциномы человека MCF-7 флуоресцентно и радиоактивно мечеными аналогами C/D
бокс РНК в комплексе с липофектамином, мяоРНК накапливаются в цитоплазме и ядре клеток.
При этом синтетические РНК сохраняются внутри клеток в течение, как минимум, 72 ч.
Установлено, что трансфекция клеток человека синтетическими аналогами C/D бокс РНК,
несущими область узнавания, комплементарную пре-мРНК белка hsc70, вызывает частичное
нарушение процессинга мРНК-мишени – исключение одного из экзонов при сплайсинге премРНК. При повышении концентрации синтетической РНК в культуральной среде от 40 нМ до
250 нМ наблюдается концентрационно-зависимое подавление уровня экспрессии целевой
мРНК гена HSPA8.
Для выявления клеточных процессов, в регуляции которых могут принимать участие
синтетические мяоРНК, нами проанализировано влияние аналогов U24 C/D бокс РНК,
направленных на нуклеотиды 18S и 28S рРНК, на жизнеспособность клеток человека в
сочетании с ингибиторами трансляции, транскрипции, репликации и внутриклеточного
транспорта. Установлено, что аналоги U24 C/D бокс РНК, вызывают аддитивное снижение
жизнеспособности клеток MCF-7 в сочетании с тамоксифеном, циклогексимидом,
бластицидином S и цисплатином.
Таким образом, совокупность полученных нами данных позволяет заключить, что
синтетические мяоРНК, проникая в клетки человека, способны участвовать в регуляции посттранскрипционного процессинга РНК-мишени. При этом искусственные аналоги C/D бокс РНК
активируют сигнальные каскады, участвующие в регуляции жизненно важных процессов
клеток человека.
Работа поддержана грантами: РФФИ № 10-04-01386-а, РФФИ № 10-04-01442-а, грантом
поддержки молодых ученых компании «ОПТЭК».
ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕТЕРМИНАНТА ПОВЫШЕННОЙ
СПЕЦИФИЧНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГОРОХА ПОСЕВНОГО (PISUM
SATIVUM L.) С КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ RHIZOBIUM
LEGUMINOSARUM BV.VICIAE
Сулима А.С., Жуков В.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А.
Санкт-Петербургский государственный университет, ГНУ ВНИИСХМ
В пределах вида горох посевной (Pisum sativum L.) выделяется контрастная группа,
отличающаяся высокой избирательностью взаимодействия с симбиотическими бактериямиазотфиксаторами (ризобиями). Данный признак обусловлен наличием у растений особого
генетического детерминанта Sym2. Линии гороха, несущие аллель Sym2A (от «Sym2 афганская»,
так как впервые она была обнаружена у растений из Афганистана) взаимодействуют лишь со
штаммами ризобий (Rhizobium leguminosarum bv. viciae), имеющими ген nodX. Данный ген
определяет дополнительное ацетилирование бактериальной сигнальной молекулы, Nodфактора, благодаря которому её способны распознавать рецепторы растений «афганской»
группы.
Гены рецепторных киназ Sym37 и K1, которые локализуются в том же участке генома, что
и ген Sym2, являются наиболее вероятными кандидатами на его роль. Исходя из этого, можно
было предположить наличие характерных для «афганских» линий гороха нуклеотидных замен
в последовательностях данных генов-кандидатов. Однако проведённое секвенирование
рецепторных участков данных генов у десяти линий гороха не выявило характерных только для
«афганских» линий нуклеотидных замен и изменений аминокислотного состава белковых
продуктов.
В ходе работы был выявлен ещё один ген-кандидат на роль Sym2, гомологичный Sym37 и
K1, и названный LykX. Чтобы выявить его влияние на специфичность взаимодействия гороха с
148
Молекулярная биология
микросимбионтами, а также сделать окончательное заключение о роли генов Sym37 и K1 в
определении «афганского» фенотипа, необходимо изучить полиморфизм этих геновкандидатов у линий гороха с разной специфичностью симбиоза, отобранных из коллекции
ВИР.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ
(Государственные контракты № 02.740.11.0276, 16.512.11.2155, П1304), грантов президента РФ
(НШ-3440.2010.4) и РФФИ (09-04-91054, 10-04-00961, 10-04-01146).
ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ ФОТОКОНВЕРСИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ И
СОЗДАНИЕ СВЕТОЗАВИСИМЫХ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНЫХ ЦЕПЕЙ НА
ИХ ОСНОВЕ
Тительмаер А.В., Богданов А.М., Лукьянов К.А.
Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
РАН, Москва (Россия)
nastia131313@gmail.com
Недавно было обнаружено, что GFP и другие зеленые флуоресцентные белки могут
выступать в роли светоиндуцируемых доноров электронов в присутствии подходящих
окислителей. Эта реакция сопровождается конверсией флуоресцентного белка в красную
флуоресцентную форму (т.н. окислительная фотоконверсия). В данной работе, мы проверили
способность к окислительной фотоконверсии ряда желтых флуоресцентных белков (YFP),
содержащих аминокислотную замену T203Y. Проведенный анализ показал существенные
различия желтых флуоресцентных белков между собой, а также по сравнению с зелеными
флуоресцентными белками, по эффективности окислительной фотоконверсии и ее
чувствительности к составу среды.
Перспективным направлением применения феномена окислительной фотоконверсии
является создание искусственных светозависимых электрон-транспортных цепей и биосенсоров
на их основе. Мы сконструировали и охарактеризовали несколько простейших химерных
белков такого назначения. В качестве потенциальных акцепторов электронов мы выбрали
флаводоксин, небольшой ФМН-содержащий одноэлектронный переносчик, и одну из
субъединиц рибонуклеотидредуктазы, содержащую в нативном состоянии стабильный
тирозильный радикал. В слитных белках, состоящих из EGFP (в качестве донора электронов) и
флаводоксина или рибонуклеотид-редуктазы (в качестве акцепторов) наблюдалось увеличение
эффективности окислительной фотоконверсии в несколько раз по сравнению с EGFP.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что между компонентами химерных белков
происходит эффективный перенос электрона.
КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ ГОРОХА ПОСЕВНОГО (PISUM SATIVUM L.) С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ТИПА CAPS
Титов В.С.1,2, Жуков В.А.1,Борисов А.Ю.1,Тихонович И.А.1,2
1
ГНУ ВНИИСХМ; 2Санкт-Петербургский государственный университет
tit1106@rambler.ru
Одним из типов молекулярных маркеров, используемых для картирования генов, в том
числе и симбиотических генов гороха посевного, являются ген-специфичные маркеры CAPS
(cleaved amplified polymorphic sequence). Картирование с использованием CAPS маркеров
основано на амплификации фрагмента определенного гена и специфичного расщепления
только одной из его аллелей определенной эндонуклеазой рестрикции.
С использованием данного типа маркеров было произведено картирование гена Crt, ранее
локализованного в V группе сцепления. Данный ген в мутантном состоянии приводит к
формированию компактной скрученной корневой системы при развитии растения в плотном
субстрате (например, песке). На выборке, состоящей из 350 растений F2 (I-x × SGEcrt), было
149
Молекулярная биология
проанализировано наследование мутантного фенотипа crt и молекулярных маркеров,
созданных на основе последовательностей генов люцерны слабоусечённой (Medicago truncatula
Gaertn.), локализующихся в гомологичном участке генома. Полученные результаты позволили
точно картировать локус crt и выявить три гена-кандидата на роль Crt, секвенирование которых
проводится в настоящее время.
Другим геном, картированным с использованием набора CAPS маркеров в данной работе,
является ген Sym36. Мутанты по данному гену характеризуются нарушением развития как
азотфиксирующего, так и арбускулярно - микоризного симбиоза. На выборке из 96 растений F2
(RisNod24 × NGB1238) осуществлено картирование генаSym36 относительно маркеров ACCox,
ThiolP, Xift, SbeI, Clpser, Sus3, N61, Gbsts2, SST1. По результатам картирования было
обнаружено сцепление гена sym36 с маркерами VI группы сцепления гороха Sus3, N61, Gbsts2,
SST1.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ
(Государственные контракты № 02.740.11.0276, 16.512.11.2155, П1304), грантов президента РФ
(НШ-3440.2010.4) и РФФИ (09-04-91054, 10-04-00961, 10-04-01146).
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЦЕТИЛИРОВАННОГО ГИСТОНА Н3 НА МЕТАФАЗНЫХ
ХРОМОСОМАХ ИЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ВЗРОСЛЫХ
ИНДИВИДОВ И ПУПОВИННОЙ КРОВИ ПЛОДОВ ЧЕЛОВЕКА
Тихонов А.В., Ефимова О.А., Пендина А.А., Чиряева О.Г., Петрова Л.И., Садик
Н.А., Дудкина В.С., Кузнецова Т.В., Баранов В.С.
Санкт-Петербургский государственный университет; НИИ акушерства и гинекологии
им. Д.О. Отта СЗО РАМН
tixonov5790@gmail.com
Эпигенетическим модификациям, в частности модификациям гистонов, принадлежит
важная роль в регуляции функциональной активности генома. Ацетилирование гистона H3 по
лизину в 9-ом положении (AcH3K9) связанно с транскрипционно активным, или потенциально
активным, хроматином.
В работе анализировали характер распределения ацетилированного по лизину в 9-ом
положении гистона Н3 на метафазных хромосомах из лимфоцитов. Материалом исследования
служили препараты метафазных хромосом из ФГА-стимулированных лимфоцитов пуповинной
крови 14 плодов человека сроком развития 20-24 недели и лимфоцитов периферической крови
13 взрослых индивидов человека. Всего было проанализировано 365 фрагментов метафазных
пластинок (180 фрагментов метафазных пластинок из лимфоцитов взрослых и 185 фрагментов
– из лимфоцитов плодов). Препараты метафазных хромосом для локализации AcH3K9 были
приготовлены с использованием спиртового фиксатора с 2% содержанием уксусной кислоты.
Распределение AcH3K9 на метафазных хромосомах изучали путем иммунофлуоресцентного
окрашивания препаратов с использованием моноклональных антител к AcH3K9 (Abcam, USA).
Хромосомы идентифицировали с помощью дифференциального окрашивания DAPI.
Выявлены отличия между гомологичными хромосомами в характере распределения
AcH3K9 на метафазных хромосомах лимфоцитов пуповинной крови плодов по следующим
сегментам: 1p36.3, 2p23, 2q33, 10p11.2, 11p15. Выявленные отличия указывают на
функциональную неравнозначность гомологов, наиболее вероятно, вследствие геномного
импринтинга.
В 5 сегментах: 2q31, 5p13, 5p15, 9q13 и 16p13, наблюдали различия в уровне
ацетилирования гистона Н3 между хромосомами из лимфоцитов взрослых и плодов. Анализ
интенсивности флуоресценции выявленных сегментов хромосом был проведен с помощью
программного обеспечения ImageJ 1.34s. В сегментах 2q31, 5p13, 5p15 и 16p13 была показана
большая степень интенсивности флуоресценции у взрослых индивидов по сравнению с таковой
у плодов человека 20-24 недель развития. Сегмент 9q13 характеризуется пониженным уровнем
интенсивности флуоресценции у взрослых индивидов по сравнению с таковым у плодов. По
всей видимости, наблюдаемые различия в иммунофлуоресценции могут быть обусловлены
разным уровнем ацетилирования гистона Н3 у плодов и взрослых. В связи с тем, что
150
Молекулярная биология
ацетилированный гистон Н3 – маркер активного хроматина, выявленные различия, вероятно,
связаны со стадиоспецифичностью экспрессии генов, расположенных в описанных участках
хроматина.
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА
RS2294008 ГЕНА PSCA У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА
Убайдуллаева М.И.1, Турдикулова Ш.У.1, Абдихакимов У.Н.2, Касимов А.А.2,
Абдихакимов А.Н.2, Мухаммедов Р.С.1, Адилов Б.1, Ахмедов Б.1
1
Центр медицинской генетики Академии наук Республики Узбекистан; 2Ташкентский
областной онкологический центр МЗ РУз
Asal_81@inbox.ru
В исследованиях в области молекулярной и популяционной биологии последних лет
показало, что генетические полиморфизмы человека ассоциированы с воспалительными
процессами, метаболизмом канцерогенов, антиоксидантной защитой и регуляцией клеточной
пролиферации. Полиморфизмы генов вовлеченных в развитие этих процессов были
исследованы в качестве биомаркеров предрасположенности к раку желудка. В работе Study
Group of Millennium Genome Project for Cancer было изучено генетические мутации в гене
PSCA ассоциированные с предрасположенностью к диффузному типу рака желудка и
опубликовано в журнале Nature Genetics в 2008 году (Sakamoto и др.,2008). В этом
исследовании была обнаружена статистически достоверная связь двух SNP гена PSCA (prostate
stem cell antigen) ассоциированных с раком желудка. Один из этих полиморфизмов rs2294008
расположен в 1 экзоне этого гена, замена цитозина (C) на тимин (T) снижает
транскрипционную активность гена PSCA. Интересном фактом этого исследования явилось то,
что этот SNP – rs2294008 является мажорными аллелем для Японской популяции и минорным
аллелем для Корейской популяции, что показывает различное распределение этого
однонуклеотидного полиморфизма в зависимости от этнической принадлежности, поэтому
может вносить различное влияние на развития рака желудка в зависимости от популяции.
Проведение генотипирования в Китае и Корее подтвердило ассоциацию этого полиморфизма
гена PSCA с развитием рака желудка ( Chen Wu и др., 2009, Yan Lu и др., 2010). Однако
проведение подобного исследования на Европейской популяции (Nuria Sala и др., 2011 )
выявило полиморфизм в промоторной части этого гена ассоциированный с раком желудка, а
также были выявлены еще два SNP находящиеся в неравновесном сцеплении с rs2294008,
описанной в работе японских авторов. Белок PSCA – является небольшим
гликозилфосфатидилинозитол (GPI) заякоренным белком, принадлежащим к семейству Thy1/Ly-6. У человека этот белок экспрессируется в эпителиальных клетках простаты, мочевого
пузыря, почек, кожи, пищевода и желудка (Saeki N. и др., 2010), но при раке желудка
наблюдается снижение уровня экспрессии PSCA (Amara N., 2001, Elsamman E.M., 2006, Argani
P.,2001, Feng H.C.,2008, Cao D., 2005). Этот полиморфизм был выбран нами для исследования у
людей больных раком желудка в Узбекистане, потому что было выявлено связь с
предрасположенностью к раку желудка в Азиатской популяции.
На данный момент был создан банк ДНК в популяции Узбекистана, оптимизирован
постановка ПЦР и ПДРФ на rs2294008C>T полиморфизм гена PSCA.
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
СИМБИОТИЧЕСКИХ МУТАНТОВ ГОРОХА ПОСЕВНОГО (PISUM SATIVUM
L.)
Федорина Я.В., Штарк О.Ю., Жуков В.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А.
ВНИИСХМ
f.jaroslava@gmail.com
151
Молекулярная биология
Бобовые растения (семейство Fabaceae) способны вступать в симбиотические
взаимодействия с грибами арбускулярной микоризы отдела Glomeromycota, с клубеньковыми
бактериями семейства Rhizobiaceae, и другими полезными ризосферными бактериями.
Изучение симбиотических генов, контролирующих такие взаимодействия, представляет собой
актуальную задачу современной биологии.
Мутационный анализ является мощным инструментом для изучения растительных
симбиотических генов, их структуры и функций. На горохе посевном получена обширная
коллекция мутантов с нарушениями различных стадий развития симбиозов, изучение которых
проводится в лаборатории уже более 20 лет.
В работе проводилась генетическая локализация гена гороха Sym14, вовлеченного в
развитие азотфиксирующего симбиоза, с использованием выборки F2 (SGENod--2 x NGB1238)
из 88 растений с фенотипом Nod-, а также дополнительно 23 растения с фенотипом Nod+.
Поскольку из литературных источников известно, что ген Sym14 был ранее локализован во II
группе сцепления (ГС), в нашей работе были использованы генетические маркеры II ГС (PpIlike, PpGM, cerberus). В результате была подтверждена локализация гена Sym14 во II ГС и
показано сцепление с маркером cerberus. Симбиотический ген cerberus лядвенца японского
(Lotus japonicus (Regel.) Larsen) предположительно является гомологом гена Sym14гороха. В
дальнейшем планируется секвенировать мРНК генаcerberus у линий гороха, мутантных по гену
Sym14, с целью поиска мутаций в рамке считывания. По предварительным данным, уровень
микоризации мутантной линии E135N (Sym14) снижен по сравнению с линией «дикого типа»
Sparkle, что свидетельствует о вероятной роли гена Sym14 в развитии как клубеньков, так и
арбускулярной микоризы (в отличие от Cerberus, для которого роль в контроле микоризации не
была показана).
На основании данных о локализации гена Sym42 гороха была предположена его гомология
с геном CCS52a люцерны слабоусеченной (Medicago truncatula Gaertn.). Планируется
секвенировать ген, гомологичный CCS52a, у линии гороха RisFixV, несущей мутацию в гене
Sym42.
В работе исследуются также нарушения авторегуляции образования симбиозов у трех
мутантных линий гороха SGEMyc++-1 (102-1), SGEMyc++-2 (103-1), и SGEMyc--3 (53-2).
Показано, что интенсивность образования клубеньков у мутантных растений выше, чем у
исходной линии SGE, и корни мутантных растений также отличаются большим размером по
сравнению с линией «дикого типа». Мутантная линия SGEMyc++-1 (102-1) характеризуется
большей интенсивностью микоризации по сравнению с линией «дикого типа» SGE.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ
(Государственные контракты № 02.740.11.0276, 16.512.11.2155, П1304), грантов президента РФ
(НШ-3440.2010.4) и РФФИ (09-04-91054, 10-04-00961, 10-04-01146).
АНАЛИЗ ЭНХАНСЕРНЫХ РНК И МОДИФИКАЦИЙ ХРОМАТИНА В
ТРАНСФЕЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ S2 DROSOPHILA MELANOGASTER,
СОДЕРЖАЩИХ РЕПОРТЕРНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ
Федосеева Д.М., Кретова О.В., Чуриков Н.А.
Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН
dfedoseeva86@yandex.ru
Механизмы работы энхансеров и инсуляторов до сих пор не выяснены. В последние годы
было обнаружено, что индукция синтеза некодирующих РНК осуществляется в обе стороны от
энхансера и примерно соответсвует уровню транскрипции контролируемого энхансером гена.
В настоящей работе мы впервые проанализировали энхансерные РНК (эРНК) дрозофилы, а
также изучили влияние энхансера на структурно-функциональное состояние хроматина. В ходе
исследования с использованием репортерных генетических конструкций было определено, что
размеры некодирующих РНК варьируют в пределах от 300 до 1050 п.н. Старты транскрипции
эРНК (TSS) были обнаружены на различном расстоянии от энхансера, однако большая часть
TSS эРНК приходится на область R3, удаленную от энхансера на 265 п.н., что было независимо
152
Молекулярная биология
подтверждено в экспериментах 5’RACE и primer extension а также при анализе TSS с помощью
глубокого секвенирования.
В последовательности самого энхансера было обнаружено лишь небольшое количество
TSS эРНК. Добавление инсулятора между энхансером и промотором приводит к заметному
подавлению синтеза всех наблюдаемых эРНК. Подобное распределение TSS вероятно
обеспечивается энхансерными белками и белковыми комплексами, которые, связываясь с
энхансером, вызывают образование петель ДНК и модификации хроматина на расстоянии 265
п.о. от энхансера. Эти модификации и служат основными сигналами старта транскрипции эРНК
РНК полимеразой II. С использованием модельной системы, которая исключает влияние
регуляторных элементов геномного окружения, мы выяснили, что сами энхансеры
приобретают характерные метки хроматина - H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac и H3K18ac. В
районе R3 конструкций, где обнаружена основная часть TSS, энхансер вызывает модификации
H3K4me3 и H3K18ac. Инсулятор же в этом районе уменьшает содержание данных
модификаций и вызывает увеличение количеств модификаций H3K4me1 и H3K27ac.
Полученные данные подтверждают нашу гипотезу, согласно которой энхансер функционирует
в основном опосредованно, эпигенетически, через модификации хроматина в области
удаленной от энхансера на 265 п.н.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ, КОДИРУЮЩИХ
ФАКТОРЫ РОСТА СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ И ГЛИАЛЬНЫЕ
НЕЙРОТРОФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ГЕННОКЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ
Усманов Р.Х., Черенкова Е.Е.
Казанский (Приволжский) федеральный университет
yesmanov.ravil@gmail.com
Среди актуальных вопросов генной терапии является конструирование оптимальных
векторов для переноса рекомбинантной генетической информации. Вирусы, являясь
естественной биологической системой, переносят гены в эукариотические клетки. Прогресс в
области клонирования привел к созданию вирусных векторов, которые используются для
экспрессии рекомбинантных белков для терапии генетических заболеваний, повышения
регенеративного потенциала тканей при травмах, производства вакцин (антигенная
экспрессия), стабильной продукции антител in vivo, клеточной трансдукции и
репрограммирования соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные
стволовые клетки, и др.
Вектора на основе аденовирусов способны эффективно переносить гены как в делящиеся,
так и в покоящиеся клетки, при этом не встраиваются в геном и обеспечивают высокие титры
рекомбинантного вируса при продукции, а также высокий уровень экспрессии трансгенов в
системах in vivo и in vitro.
В нашем исследовании целью являлось создание и очистка рекомбинантных аденовирусов,
экспрессирующих нейротрофические и нейропротекторные факторы (эндотелиальный
сосудистый фактор роста VEGF121 и VEGF165, глиальный нейротрофический фактор GDNF).
Клонирование осуществляли по технологии Gateway (Invitrogen, США), базирующейся на сайт
– специфической рекомбинации между сайтами att плазмиды-донора (pENTR –VEGF121,
pENTR-VEGF165, pENTR-GDNF) и вектора-назначения (pAd/CMV/V5-Dest). Трансфекция
клеточной линии HEK293A (human embryonic kidney 293) рекомбинатными плазмидами (pAd –
VEGF121, pAd – VEGF165, pAd - GDNF) привела к эффективной экспрессии рекомбинантных
генов, что подтверждено иммунофлуоресцентным анализом с применением специфичных
антител, и получению высокого титра вирусных частиц. Таким образом, получены
рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие нейропротекторные и нейротрофические
факторы VEGF121, VEGF165 и GDNF. В дальнейшем полученные вирусы будут использованы
в экспериментах in vivo и in vitro для разработки методов генной и генно-клеточной терапии
различных заболеваний человека, в том числе нейродегенеративных.
153
Молекулярная биология
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО BFT-2 BACTEROIDES
FRAGILIS
Харлампиева Д.Д, Манувера В.А, Подгорный О.В.
ФГБУН «НИИ физико-химической медицины» ФМБА
harlampieva_d@mail.ru
Представители рода Вacteroides составляют значительную часть микрофлоры кишечника
человека. Однако выявлены энтеропатогенные штаммы, персистенция которых ассоциирована
с возникновением колитов и развитием колоректального рака. Фактором вирулентности
энтеропатогенных штаммов Вacteroides fragilis является секретируемая во внешнюю среду
металлопротеаза (BFT, известная также как фрагилизин). В природных условиях фрагилизин
синтезируется в виде препробелка, затем от него отщепляется лидерный пептид и продомен.
Зрелый белок, представленный каталитическим доменом, Вacteroides fragilisсекретирует во
внешнюю среду. В литературе имеются данные о выделении, очистке и характеристике BFT-1
и BFT-3, в то время как подобные сведения об изоформе-2 отсутствуют.
Цель данной работы – получение каталитически активного BFT-2 при экспрессии
кодирующего его гена в E.coli.
Последовательности, кодирующие профрагилизин и каталитический домен фрагилизина,
были клонированы в составе векторов для регулируемой экспрессии в E.coli. Оптимизированы
условия культивирования штаммов-продуцентов рекомбинантгых белков. Выделены и
очищены при помощи металлохелатной хроматографии рекомбинантные каталитический
домен фрагилизина-2 и профрагилизин-2. Известно, что вырабатываемый Bacteroides
fragilisфрагилизин расщепляет E-кадгерин, вследствие этого разрушаются контакты между
колоноцитами. Однако при обработке линии клеток HT-29 рекомбинантным каталитическим
доменом BFT-2 такого эффекта не наблюдалось. Разработана также схема получения
фрагилизина-2 путем ограниченного трипсинолиза пробелка, подобраны оптимальная
концентрация трипсина, время и температура инкубации. При помощи секвенирования белка
по Эдману показано, что N-концевая последовательность белка, составляющего мажорную
фракцию после проведения ограниченного трипсинолиза профрагилизина, соответствует Nконцевой последовательности природного аналога (AVPSEP). Продемонстрировано нарушение
клеточных контактов в культуре клеток НТ-29 при воздействии на них фрагилизина-2,
полученного из пробелка. При инкубировании HT-29 с пробелком нарушение клеточных
контактов происходило на более поздних сроках, чем в случае с активной формой, полученной
протеолизом пробелка. Таким образом, разработан способ получения активного фрагилизина-2
в гетерологичной системе E.coli.Предполагается, что продомен играет роль в процессах
фолдинга фрагилизина-2, а также в регуляции его активности.
ВЛИЯНИЕ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА РАСТИТЕЛЬНОЙ ДНКМЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ НА МОРФОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
Череватенко А.М., Тарлачков С.В., Дьяченко О.В., Руденко Н.В., Шевчук Т.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
(Россия); Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки
Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
РАН, Пущино (Россия)
almihcher@gmail.com
Энзиматическое метилирование генома эукариот принимает участие в регуляции
экспрессии генов, клеточной дифференцировки и эмбриональном развитии, эпигенетическом
контроле геномного импринтинга и ремоделировании структуры хроматина. При этом картина
сложной сети реакций модификации структуры хроматина пока только устанавливается, и мы
лишь подходим к понимаю механизмов эпигенетических процессов. У эукариот обнаружено
154
Молекулярная биология
три типа метилирования ДНК: CpG, CpH и CpHpG (H - A, T или C). Однако, в данной области
существуют значительные пробелы, связанные с изучением преимущественно CpG-типа
метилирования. Существует семейство растительных ДНК-метилтрансфераз, отличающихся
наличием в молекуле хромодомена, через который осуществляется ее взаимодействие с
белками хроматина и с ядерной мембраной. Принадлежащая к этому семейству ДНКметилтрансфераза CMT3 принимает участие в метилировании CpHpG- и CpHпоследовательностей генома.
Для анализа влияния CpHpG-специфичного гиперметилирования на морфологобиохимические особенности животных клеток была создана генетическая конструкция на
основе вектора pEGFP, содержащая ген растительной ДНК-метилтрансферазы CMT3 под
контролем промотора цитомегаловируса. Полученной конструкцией были трансформированы
клетки эмбрионального почечного эпителия человека HEK293. В качестве контроля для
трансформации клеток НЕК293 использовали ненагруженный вектор pEGFP. После
проведенной селекции на основе устойчивости к генетицину G418 были отобраны и получены
стабильные клеточные линии, экспрессирующие ген CMT3 и GFP в контрольном варианте.
Показаны фенотипические отличия клеток, экспрессирующих ген СМТ3, от контрольных
клеток,
трансформированных
ненагруженнымй
вектором
pEGFP.
Кроме
того,
экспрессирующие CMT3 клетки, отличаются от контрольных выраженным изменением уровня
метилирования генома в последовательностях CpWpG (W - A или Т).
ПОЛУЧЕНИЕ ДЕЛЕЦИОННЫХ МУТАНТОВ ШТАММОВ BACILLUS CEREUS
ПО ГЕНАМ resD И hlyIIR
Шапырина Е.В., Солонин А.С.
ФГБУН Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Патогенные свойства Bacillus cereus определяются синтезом многочисленных белковых
токсинов, которые различаются по механизму действия. Одним из таких потенциальных
факторов патогенности представителей группы Bacillus cereus является гемолизин II (hlyII),
токсин, относящийся к классу порформирущих токсинов. Описано, что его экспрессия
контролируется собственным транскрипционным регулятором HlyIIR, а также Fur –
регулятором метаболизма железа и патогенности. Недавно в промоторной области гена
гемолизина II была выявлена последовательность, узнаваемая ResD – транскрипционным
регулятором редокс-чувствительной системы сигнальной трансдукции ResDE. Эта
двухкомпонентная система участвует в регуляции генов при анаэробном росте и регуляции
генов метаболизма углеводов, а также в биосинтезе энтеротоксинов B. cereus - hblC, nhe, а так
же участвует в регуляции транскрипции гена капсулы- capA B. anthracis. На основе
исследований штаммов цереусной группы, представленной в коллекции ВКМ, а также анализа
геномов, представленных в базе GenBank, нами было выявлено два типа промоторнооператорных областей hlyII.Это- PRDhlyII-, которые характерны для B. anthracis и B. cereus с
патогенными свойствами, и PRDhlyII+, характерные для микроорганизмов, выделенных из
почвы и насекомых.
Цель нашей работы - получение нокаут-мутантов штаммов B. cereus ATCC14579T , B370(ВКМ) ( штамм с PRDhlyII+) и 771(ВКМ) ( штамм с PRDhlyII-) по генам resD, и hlyIIR и
получение двойных мутантов, где сразу выключены оба гена. Для мутагенеза штаммов B.
cereus методом ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК, содержащий усеченную
последовательности гена hlyIIR, которая была клонирована в суицидальном векторе pZERO-2 .
Далее, с использованием эндонуклеаз рестрикции в центральную часть гена клонировали
кассету устойчивости к хлорамфениколу. Полученной плазмидой pZERO2∆hlyIIR методом
электропорации были получены мутанты B.cereus ATCC14579T , B-771, B-370 по гену hlyIIR.
Мутанты отбирали на селективном антибиотике и проверяли с помощью ПЦР.Для генерации
мутантов B.cereus ATCC14579T , B-771, B-370 по гену ∆resD , а также двойных мутантов по
генам ∆ resD и ∆hlyIIR, методом ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК с усеченной
последовательностью гена resD. Полученный фрагмент был клонирован в мобилизуемом
суицидальном векторе pK18mob. На следующем этапе плазмиду pK18mob∆resD использовали
155
Молекулярная биология
для генерации мутантов при помощи конъюгативного переноса с применением штамма E. coli
S17-1. Отбор мутантов проводили аналогичным образом. В дальнейшем планируется
использовать данные мутанты B.cereus для изучения роли двухкомпонетной системы ResDResE в регуляции гена hlyII в аэрбных и анаэробных условиях.
МЕХАНИЗМЫ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВОГО
КОМПЛЕКСА TAG7-HSP70 НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ. ИНГИБИРОВАНИЕ
ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ TAG7-HSP70 IN VITRO И IN VIVO
Шелудченков А.А., Яшин Д.В., Кабанова О.Д.
Институт биологии гена РАН
antonio@phystech.edu
Белок Tag7 (PGRP-S) впервые обнаружили в нашей лаборатории у мышей. Практически
одновременно этот белок был обнаружен зарубежными учёными у насекомых, и в настоящий
момент он известен своей важной ролью в обеспечении врождённого иммунитета у последних.
О роли же этого белка у млекопитающих известно мало. В нашей лаборатории установили, что
Tag7 формирует (как in vitro, так и in vivo) с белком теплового шока Hsp70 устойчивый
белковый комплекс Tag7-Hsp70, обладающий цитотоксической и противоопухолевой
активностью. Далее в лаборатории были обнаружены два белка – HspBP1 и Mts1, – каждый из
которых способен ингибировать формирование этого комплекса. Цель настоящей работы
состояла в установлении механизмов цитотоксической активности Tag7-Hsp70 в отношении
восприимчивых к его воздействию линий опухолевых клеток, а также в объяснении причин
устойчивости невосприимчивых или маловосприимчивых опухолевых клеточных линий (из
числа тех, которые анализировались).
Белки комплекса Tag7-Hsp70 наращивались в E. coli, затем выделялись из клеток и
очищались с помощью хроматографии. Цитотоксичность комплекса проверялась на
опухолевых клеточных линиях HeLa, K562, L-929, CSML-0, Yurkat. Исследование механизмов
цитотоксичности мы проводили на клеточной линии L-929 (мышиная фибросаркома).
При добавлении Tag7-Hsp70 к клеткам L-929 мы наблюдали два пика гибели клеток: через
3 часа и через 18 часов. Нам удалось получить отдельные клоны, один из которых проявлял
гибель только через 3 ч, а другой – только через 18 ч. При этом в клетках, погибавших через 3 ч
после обработки комплексом, наблюдалась активация каспаз, характерная для апоптоза. В
клетках, погибавших через 18 ч, каспазной активности не наблюдалось, однако добавление к
этим клеткам Nec-1, ингибирующего киназную активность RIP1-киназы, предотвращало их
гибель, из чего мы заключили, что клетки этого клона гибнут по пути некроптоза. Таким
образом, имеет место два механизма гибели опухолевых клеток – каспазозависимый (апоптоз)
и каспазонезависимый (некроптоз), – запускаемые Tag7-Hsp70. Кроме того, мы обнаружили,
что белок HspBP1 может выступать в роли ингибитора образования цитотоксического
комплекса Tag7-Hsp70, конкурентно связываясь с его компонентом Tag7.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСКРИПТОВ ПЕРЕКРЫВАЮЩИХСЯ ГЕНОВ КАК
МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ КВОРУМ-СЕНСИНГА У
PECTOBACTERIUM ATROSEPTICUM
1
Шлыкова Л.В. , Гоголева Н.Е.2, Горшков В.Ю.2, Даминова А.Г.2, Гоголев Ю.В.2
1
Казанский (Приволжский) федеральный университет; 2Казанский институт биохимии
и биофизики КазНЦ РАН, Казань (Россия)
persent_89@mail.ru
Взаимодействие цис-кодируемых антисмысловых транскриптов является особым
механизмом регуляции генной экспрессии у разных организмов. Нами обнаружено, что в
геноме Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 (Pba) гены регуляторной системы "кворум
сенсинга" - expI и expR - перекрываются 3'-концевыми участками, что может приводить к
156
Молекулярная биология
взаимодействию транскриптов этих генов. Было показано, что, в отличие от классической
схемы кворум-регуляцииVibrio fisheri, у Pba ceнсорный белок ExpR не влияет на экспрессию
гена ацилгомосерин лактон-синтазы expI.Мы предположили, что регуляторная роль
принадлежит не ExpR-белку, а expR-транскрипту.
Для проверки этого предположения expI и expR были помещены под арабинозный и
лактозный промоторы, соответственно, и перенесены в экспрессирующий вектор pET-51.
Полученная таким образом плазмида была перенесена в клетки E. coli BL21. В присутствии
арабинозы в среде культивирования рекомбинантного штамма наблюдалась дозозависимая
продукция ацилгомосерин лактона (АГЛ). Добавление ИПТГ в качестве индуктора
регуляторного генаexpR в низких концентрациях приводило к увеличению концентрации АГЛ в
культуральной жидкости. В то же время, высокие концентрации ИПТГ репрессировали АГЛпродукцию. Две нонсенс-мутации ниже стартового кодона expR не оказывали видимого
эффекта на регуляторные функции этого гена. При добавлении ИПТГ в культуру того же
штамма E. coli BL21, но несущего рекомбинантную плазмиду, в которой гены expI и expR были
расположены последовательно друг за другом (что исключает возможность образования
перекрывающихся транскриптов этих генов), не происходило репрессии АГЛ-продукции.
Полученные данные свидетельствуют о том, что регуляция «кворум-сенсинга» у Pba
осуществляется посредством взаимодействия антисмысловых транскриптов генов expI и expR.
Образование антисмысловых транскриптов, связанное с особенностями топологии генов,
широко распространено среди прокариот и может вносить существенный вклад в регуляцию
транскрипции большого числа бактериальных генов.
НЕКОТОРЫЕ ОГРАНИЧЕНИЯ МИКРОЭВОЛЮЦИИ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ
МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ
Шулюпин О.К.
Фирма «Проинтех», Пущино
olkoshu@rambler.ru
Наиболее признанная и логичная гипотеза возникновения и эволюции белок-нуклеиновой
формы жизни идет по схеме – химическая эволюция, накопление большого количества
абиогенной органики, появление первых живых форм, эволюционирующих, потребляя готовую
органику по гетеротрофному пути, потом появление автотрофных форм.
Рассмотрим некий гипотетический гетеротрофный микроорганизм типа микоплазмы,
размножающийся на среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода и энергии
при наличии прочих необходимых компонент. Предположим, что через некоторое время
глюкозу съели, но в среде присутствует немало лактозы. Для выживания необходимо перейти
на новый субстрат. Как? – Согласно синтетической теории эволюции путем спонтанной
изменчивости некого дуплицированного гена. Какой ген может послужить основой бетагалактозидазы, расщепляющей лактозу на глюкозу и галактозу? Предположим, есть достаточно
близкий. По самому оптимистическому варианту для полного превращения нужно изменить
одну – две аминокислоты в активном центре фермента. Это 3- 6 нуклеотидов. Какова
вероятность спонтанного мутагенеза даже 2-х нуклеотидов? Это по самым скромным оценкам
порядка 10-12
с учетом избыточности кода, практически невозможное событие. Кроме
фермента нужны пермеаза, некий 3-й белок и не имеющие аналогов регуляторные участки ДНК
[2,3].
Дальнейшее усложнение прокариот – возникновении автотрофии, разнообразных стенок и
масса совершенно новых регуляторных фрагментов ДНК. Если рассмотреть необходимый
момент – переход с органических источников азота на атмосферный – нужна нитрогеназа. И в
данном случае двумя нуклеотидами не ограничиться.
Тем более при переходе с
гетеротрофного питания к фотосинтезу – нужно не менее десятка новых ферментов и
вероятность такого спонтанного события исчезающее мала.
Появление многоклеточных животных связано с появлением нервной системы и
многочисленных интронов, не имеющих аналогов у прокариот.
157
Молекулярная биология
Следовательно, белок - нуклеиновая форма жизни не имеет внутренних свойств к
спонтанному усложнению метаболизма. Приходится допустить возможность существования
формы жизни (и разума) на иных физико-химических основах, которые сознательно
направляли изменчивость белок-нуклеиновой формы жизни в сторону усложнения
метаболизма и, в конечном счете, появлению разумных и высоко разумных форм.
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ
ДИОКСИГЕНАЗЫ АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, БАКТЕРИЙДЕСТРУКТОРОВ РОДА RHODOCOCCUS
Шумкова E.С., Ананьина Л.Н., Егорова Д.О.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и
генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь (Россия)
Ekaterinash80@mail.ru
Информация о генах, кодирующих диоксигеназные системы, осуществляющие первый этап
деструкции ароматических соединений (АС) – включение кислорода в бензольное кольцо –
является основой для выявления роли исследуемых бактерий в трансформации и деградации
устойчивых органических соединений в природной среде. Полученные знания о генах
деструкции АС позволят эффективно использовать тот или иной штамм при создании
препаратов для очистки окружающей среды.
Нами исследованы бактерии-деструкторы, выделенные из почвы, загрязненной АС (ОАО
«Галоген», г. Пермь): Rhodococcus sp. G10, Rhodococcus sp. P29а и R. ruber P25. Культуры
Rhodococcus sp. G10 и Rhodococcus sp. P29а способны к росту на бензоле, толуоле и нафталине,
но не на бифениле, в отличие от R. ruber P25, который является активным деструктором
бифенила/полихлорбифенилов и нафтлина.
Методом ПЦР с праймерами, подобранными к консервативным участкам генов narAa,
narAb (α- и β- субъединицы нафталин диоксигеназы (ДО), соответственно) Rhodococcus sp.
NCIMB12038 (GenBank: AF082663), у вышеперечисленных бактерий выявлены гены
деструкции нафталина, филогенетически родственные генам narAa и narAb бактерий родов
Rhodococcus и Gordonia, а также генам nidA и nidB (α- и β- субъединицы о-ксилол ДО,
соответственно) бактерий рода Rhodococcus. У R. ruber P25 с помощью праймеров,
подобранных к консервативным участкам генов α-субъединиц бифенил ДО бактерий рода
Rhodococcus, выявлен ген α-субъединицы ДО, имеющий существенные отличия от известных
генов, кодирующих гомологичные белки, а у Rhodococcus sp. G10 – ген α-субъединицы ДО,
филогенетически близкий гомологичному гену штамма-деструктора бензола, принадлежащего
к роду Arthrobacter, а также генам, кодирующим α-субъединицы бензол ДО, некоторых
некультивируемых бактерий.
Таким образом, исследуемые бактерии обладают характерными для родококков narAaAb –
генами, отвечающими за деструкцию нафталина и уникальными генами, которые
предположительно, кодируют ферменты, отвечающие за деструкцию бифенила, бензола и
толуола.
Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»,
грантом РФФИ-Урал №11-04-96028р_урал_а.
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ БЕЛОК PIWI У DROSOPHILA MELANOGASTER
Якушев Е.Ю., Клёнов М.С., Соколова О.А., Михалёва Е.А., Гвоздев В.А.
Институт молекулярной генетики РАН
krom@img.ras.ru
Белки, принадлежащие к семейству PIWI, участвуют в самообновлении стволовых клеток
зародышевого пути, а также в подавлении экспрессии генов по механизму РНК-интерференции
(сайленсинге). В ходе сайленсинга короткие РНК в составе рибонуклеопротеиновых
комплексов способны узнавать комплементарные последовательности РНК в клетке и
158
Молекулярная биология
катализировать их разрезание, что приводит к деградации РНК или транскрипционной
репрессии гена в ядре. Белки Piwi связывают короткие РНК особого типа, которые были
названы Piwi-interacting RNA (piRNA). piRNA, в основном, комплементарны мобильным
элементам (транспозонам) и повторенным последовательностям генома. Таким образом, белки
семейства Piwi осуществляют репрессию мобильных элементов, обеспечивая целостность
генома и защиту от транспозиций.
Один из 3-х белков семейства Piwi у Drosophila melanogaster (собственно Piwi)
локализуется в ядрах клеток яичников. Мухи, содержащие нуль-мутацию в гене piwi, имеют,
кроме того, неразвитые яичники вследствие дефектов в процессах деления герминальных
стволовых клеток. В этой работе мы исследовали мутантный белок Piwi (PiwiNt), в котором
сохранены домены, осуществляющие связывание коротких РНК и расщепление РНК-мишени,
однако отсутствует N-конец, предположительно содержащий сигнал ядерной локализации. Мы
показали, что PiwiNt локализуется не в ядре, а в цитоплазме герминальных клеток яичников. У
piwiNt мутантных мух мы обнаружили значительную дерепрессию различных
ретротранспозонов, причем накопление транскриптов мобильных элементов происходило как в
ядрах, так и в цитоплазме. В то же время, в отличие от нуль-мутаций гена piwi, у piwiNtмутантов поддерживаются герминальные стволовые клетки, однако скорость их делений
снижена. Таким образом, для сайленсинга транспозонов с помощью piRNA необходим
транспорт белка Piwi в ядро, а в процессе самообновления герминальных стволовых клеток
Piwi функционирует в цитоплазме. Кроме того, нами также показано участие Piwi в процессе
эмбриогенеза.
159
Общая и функциональная биохимия
СЕКЦИЯ «Общая и функциональная биохимия»
КОМПЛЕКС ТЕСТОВ ДЛЯ ПОИСКА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНДУКТОРОВ
ЭКСПРЕССИИ HSP70
Абкин С.В., Панкратова К.М., Онохин К.В., Гужова И.В., Маргулис Б.А.
ФБГУН Институт цитологии РАН
sergeyabkin@gmail.com
Повышение уровня белка Hsp70 в клетке делает ее устойчивой к широкому кругу
цитотоксических факторов. Кроме увеличения содержания внутриклеточного шаперона стресс
способен вызывать выход Hsp70 на клеточную поверхность или во внеклеточное пространство
в комплексе с клеточными антигенами, что в результате приводит к активации врожденного и
адаптивного иммунитета. Поэтому особое значение приобретает поиск веществ, способных
безвредным образом повысить содержание шаперона в тканях и клетках организма.
Целью данной работы является отработка комплекса тест-систем, необходимых для
скрининга малых молекул, потенциальных индукторов экспрессии белков теплового шока.
На первом этапе скрининга предлагается репортерная система на базе клеток HeLa,
конститутивно экспрессирующую слитный ген HSE-Luc. При активации HSF-1 каким-либо
фактором начинается экспрессия люциферазы, активность которой измеряется с помощью
специальных наборов Bright-Glo™ Luciferase Assay System (Promega). По результатам этого
теста мы можем судить об активации транскрипции гена hsp70 в условиях действия
определенного вещества. Для того чтобы определить, связано ли повышение уровня
транскрипции с накоплением белка, проводится анализ с помощью иммуноблоттинга; с этой
целью получена панель антител, которые позволяют оценить уровень содержания белка в
клетках животных разных видов. Далее определяется способность выбранных веществ
стимулировать шаперонную активность белков Hsp70 и Hdj1/Hsp40 с помощью разработанного
нами теста ШАП-ИФА. Наконец для анализа возможного выхода Hsp70 во внеклеточное
пространство нами используется метод аффинной преципитации шаперона АТФ-агарозой из
среды клеток, обработанных определенным веществом. Проведение комплекса тестов
позволяет всесторонне оценить эффективность веществ, стимулирующих синтез, накопление
шаперона Hsp70 и его выход во внеклеточное пространство. В качестве эталонного соединения
мы использовали производную эхинохрома U-133 из коллекции ФГБУН ТИБОХ ДВО РАН и
показали, что данное вещество вызывает накопление шаперона в клетках разного
происхождения и его экстраклеточный экспорт. В настоящее время тест-системы проходят
испытания с использованием широкого спектра клеточных линий и низкомолекулярных
соединений натурального и синтетического происхождения. В докладе будут также
представлены модификации некоторых тест-систем.
ВЛИЯНИЕ ЭНДОГЕННЫХ ПОЛИАМИНОВ НА АКТИВНОСТЬ
ИЗОФЕРМЕНТОВ АРГИНАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС
Автандилян Н.А., Джаврушян А.Г.
Ереванский государственный университет, Ереван (Армения)
nikolay.avtandilyan@gmail.com
Существует два изофермента аргиназы: уреотелическая (УА), которая участвует в
орнитиновом цикле образования мочевины для нейтрализации аммиака в печени, и
неуреотелическая (НУА), которая имеет широкое биологическое распространение и иные
метаболические функции, в частности снабжение орнитином процессы биосинтеза пролина,
глютамата и полиаминов. Полиамины, главные из которых путресцин, спермидин и спермин,
встречаются во всех клетках млекопитающих, участвуют в пролиферации, дифференциации
клеток и играют важную роль при патогенезе различных заболеваний. В настоящее время
является актуальным вопрос о роли изоферментов аргиназы в синтезе полиаминов.
160
Общая и функциональная биохимия
Целью представленной работы было изучение влияния полиаминов печени на активность
аргиназ белых лабораторных крыс (200-220г) in vitro,что дает почву для ответа на
вышеуказанный вопрос. Для получения полиаминов было произведено гомогенизирование
печени в 5%-ом HClO4 (100мг/мл) с последующим центрифугированием (15.000g, 20мин) и
нейтрализацией карбонатом калия. Полиамины определяли методом высокоэффективной
тонкослойной хроматографии (ПТСХ-АФ-В, силикагель КСКГ). После выявления на пластинах
пятен полиамин-нингидриновых комплексов, измеряли их при длине волны 550нм (Genesys
10). Очистка УА и НУА печени производили последовательно, используя гель-филтрацию
(Сефадекс G-150) и ионообменную хроматографию (КМ-целлюлоза). Активность аргиназ во
фракциях определяли количеством образовавщейся мочевины при длине волны 478нм.
Исследования показали, что при добавлении 0,5мл (134мкг) и 1мл (268мкг) экстрактов
полиаминов в инкубационную среду ферментов печени, наблюдалось понижение активности
УА и повышение активности НУА. Результаты показали так же повышение активности НУА
мозга и почек при воздействии полиаминами печени. Вероятно, что уреотелическая аргиназа
ингибируется
полиаминами
конкурентным
механизмом.
Повышение
активности
неуреотелической аргиназы особое явление, это новый механизм регуляции фермента
посредством метаболитов орнитина. Эти механизмы могут иметь важную роль в синтезе
полиаминов и во внутриклеточных процессах связанных с ними.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ HMGB1 И HMGB2 С
АПУРИНОВЫМИ/АПИРИМИДИНОВЫМИ САЙТАМИ В ДНК
Агдаулетова С.А.
Новосибирский государственный университет, Институт химической биологии и
фундаментальной медицины СО РАН
sauleag@mail.ru
HMGB1 и HMGB2 – это многофункциональные высококопийные негистоновые белки
хроматина. HMGB1 является кофактором эксцизионной репарации оснований (ЭРО), которая
направлена на исправление наиболее многочисленных повреждений ДНК, и задействован в
регуляции развития опухолей и метастазировании. HMGB2, в отличие от его ближайшего
гомолога – HMGB1, изучен в значительно меньшей степени. Ранее было установлено, что оба
HMGB-белка способны образовывать основания Шиффа с апуриновыми/апиримидиновыми
(АР-) сайтами – интермедиатами ЭРО, но функциональная значимость этих взаимодействий не
исследована.
В данной работе использован подход аффинной модификации выделенных из тимуса
теленка белков HMGB1/2 5’-[32P]- меченной ДНК, содержащей одиночные или множественные
АР-сайты. Продукты модификации белков HMGB1 и HMGB2 анализировали электрофорезом
по Лэммли, за целостностью цепей ДНК наблюдали электрофорезом в полиакриламидном геле.
Нами был проведен сравнительный анализ взаимодействия белков HMGB1 и HMGB2 с АРсайтами, одиночными и в составе кластерных повреждений. ДНК с кластерными
повреждениями помимо основного АР-сайта содержали дополнительный АР-сайт (или его
аналоги) в комплементарной цепи, причем расстояние между АР-сайтами варьировало в
пределах 1-2 витков спирали ДНК. Для этого же набора ДНК был проведен сравнительный
анализ модификации белков клеточного экстракта HeLa и HMGB1, выявивший аддукты,
которые могут быть отнесены к HMGB1. С использованием ДНК-интермедиатов длинно- и
короткозаплаточного путей ЭРО было рассмотрено влияние HMGB1/2 на активность основных
ее ферментов – АР-эндонуклеазы 1 (APE1) и ДНК-полимеразы β (pol β).
Таким образом, HMGB1 и HMGB2 наиболее эффективно взаимодействуют с ДНК,
содержащей два АР-сайта в пределах одного витка спирали. Также, оба белка оказывают
ингибирующий эффект на активность APE1 и pol β. При этом наблюдаемые эффекты более
выражены для HMGB2, по сравнению с HMGB1. Для HMGB1 выявлена возможность
взаимодействий с АР-ДНК в присутствии других ДНК-связывающих белков экстракта HeLa.
161
Общая и функциональная биохимия
АЦИЛНЕЙРОТРАНСМИТТЕРЫ И ПРОСТАМИДЫ – НОВЫЕ
МЕТАБОЛИЧЕСКИ СВЯЗАННЫЕ СЕМЕЙСТВА БИОАКТИВНЫХ ЛИПИДОВ
Акимов М.Г., Бобров М.Ю., Грецкая Н.М., Безуглов В.В.
ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН, Москва (Россия)
akimovmike@yandex.ru
Ацилнейротрансмиттеры – это семейство эндогенных амидов жирных кислот и биогенных
аминов, активность которых наиболее выражена в нервной и иммунной системах животных.
Для разных представителей этого семейства данные о путях их образования находятся в
диапазоне от принципиальной возможности для ацилсерина до двух альтернативных путей
(окисление и прямое ацилирование) с охарактеризованными ферментами для ацилглицина. Нам
удалось выяснить некоторые аспекты биосинтеза и катаболизма ацилдофаминов, а также
показать присутствие докозагексаеноилдофамина в тканях пресноводной гидры. Катаболизм
ацилнейротрансмиттеров может происходить по трём принципиальным направлениям:
гидролиз (имеет малое значение для производных дофамина и серотонина); биохимические
превращения остатка нейротрансмиттера и окисление остатка полиненасыщенной жирной
кислоты. Последние два типа процессов могут приводить не к инактивации молекулы, а к
образованию новых семейств биоактивных липидов; наиболее значимым является переход к
простамидам – продуктам активности циклооксигеназ.
Оказываемые ацилированными нейротрансмиттерами эффекты можно разделить на
несколько групп: участие в ноцицепции, нейромодуляция (изменение нейрональной
пластичности), иммуносуппрессия. При этом сигналы рассматриваемых молекул передаются
через каннабиноидные и ванилоидные рецепторы, ряд других G-белоксопряженных
рецепторов, а также через некоторые внутриклеточные белки.
Из всех ацилнейротрансмиттеров ацилдофамины обладают наиболее широким спектром
биологической активности, который включает в себя ингибирование агрегации тромбоцитов
человека, увеличение мозгового кровообращения, защиту нейронов от действия токсических
факторов, цитотоксичность по отношению к трансформированным клеткам. Эти эффекты лишь
частично опосредованы взаимодействием ацилдофаминов с каннабиноидными и
ванилоидными рецепторами. С помощью ингибиторного анализа нами показано, что для
разных ацилдофаминов существует свой набор внутриклеточных киназ, участвующих в
реализации нейрозащитного эффекта.
При метаболическом переходе между семействами нейролипинов происходит изменение
спектра их активности. Так, мы установили, что простамид E2 оказывает выраженное
нейрозащитное действие, но, в отличие от анандамида, не обладает способностью угнетать
клетки глиомы C6, тогда как дофаминамид простагландина E2является цитотоксическим
агентом для этих клеток. Можно предположить, что клетки глиомы в состоянии до некоторой
степени защищаться от токсического действия анандамида превращением его в простамид, но
не могут противостоять ацилдофаминам. Работа частично поддержана грантом Президента РФ
МК-4679.2012.4 и грантом РФФИ 11-04-01469а.
УРОВЕНЬ АНТИТЕЛ К ТИРЕОПЕРОКСИДАЗЕ И ТИРЕОГЛОБУЛИНУ В
СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ ДИФФУЗНО-УЗЛОВЫМ ЗОБОМ
Сиротян Ю.А., Кеца О.В.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы (Украина)
ksen808@mail.ru
Актуальной проблемой современной эндокринологии являются заболевания щитовидной
железы, частота возникновения которых быстро прогрессирует, а терапия в большинстве
случаев является малоэффективной. К группе таких заболеваний относится диффузно-узловой
зоб. Характерной особенностью данного заболевания является потеря иммунологической
толерантности к тиреопероксидазе (ТПО) и тиреоглобулину (ТГ). При этом специфическими
маркерами патологии являются обнаруженные в сыворотке крови антитела к ТПО и ТГ.
162
Общая и функциональная биохимия
Цель работы – определить уровень антител к ТПО и ТГ в сыворотке крови больных на І, ІІ
и ІІІ стадиях протекания диффузно-узлового зоба в условиях лечения L-тироксином и
препаратом Цефасель.
Анализ результатов исследования показал, что у больных диффузно-узловым зобом в
сыворотке крови повышается концентрация антител к ТПО и ТГ, максимальный уровень
которых наблюдается на ІІІ стадии заболевания. Повышение уровня антител к ТПО и ТГ
свидетельствует о выраженной атрофии ткани щитовидной железы, трансформации
фолликулярного эпителия, что способствует прогрессированию явлений фиброзирования в
строме.
Терапия гормонами щитовидной железы приводит к снижению уровня антител к ТПО и ТГ
в сыворотке крови больных на всех стадиях заболевания, однако уровень исследуемых
показателей не достигал значений нормы.
Применение натрия селенита (Цефаселя) в течении трех месяцев в комбинированной
терапии с L-тироксином вызывало снижение концентрации антител к ТПО и ТГ к уровню
нормы. Вероятно, селен необходим для активации и метаболизма гормонов щитовидной
железы, служит для элиминации эндогенных и экзогенных гидропероксидаз и выступает в
качестве мембранного стабилизатора.
Таким образом, протекание диффузно-узлового зоба сопровождается повышением антител
к тиреопероксидазе и тиреоглобулину на І, ІІ и ІІІ стадиях заболевания. Использование натрия
селената (Цефаселя) в течении трех месяцев обеспечивает существенное снижение уровня
антител к ТПО и ТГ у больных с диффузно-узловым зобом.
НОВЫЙ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС
Артюшкин М.В.1, Волков А.Г.2, Волкова Л.В.1,3, Коробов В.П.4
1
Пермский национальный исследовательский политехнический университет; 2Пермская
государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера Минздравсоцразвития
России; 3ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России, филиал «Пермское
научно-производственное объединение «Биомед»; 4Институт экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН, Пермь (Россия)
disko_machine@mail.ru
Антибактериальные пептиды играют важную роль в защитной системе организма от
патогенов и эффективны против широкого спектра бактерий, грибов и вирусов. Проведенные
нами ранее исследования позволили выявить пептидную природу антибактериального
комплекса, синтезируемого донорскими лейкоцитами в процессе интерфероногенеза (Волкова
Л.В., 2004).
Цель данного исследования – унификация технологии получения антибактериального
пептидного комплекса (АБПК). Определение антибактериальной активности, полученного
криоконцентрата проводили микрометодом двукратных разведений в 96-луночном планшете. В
качестве контроля антибактериального действия использовали референтный штамм
Staphyiococcus epidermidis 33. В процессе исследования отобраны образцы АБПК с исходной
активностью не менее 100-200 УЕ/мл, которые в последующем были сконцентрированы и
получены фракции с антибактериальной активностью от 2048 УЕ/мг до 4096 УЕ/мг. Оценка
молекулярной массы АБПК методом ВЭЖХ ГКЧ показала, что препарат представляет собой
комплекс пептидов с молекулярной массой от 1,7 до 5,5 кДа.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗНИКНОВЕНИЯ КОМПЛЕКСА МЕЖДУ
АНТИБИОТИКАМИ ПЕНИЦИЛЛИНОВОГО РЯДА И БЕЛКОМ
КОНДУКТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Кутина А.А., Орлова Е.А., Банкина А.Н., Бриллиантова Е.Ю., Чухно А.С.
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия
amylee2208@mail.ru
163
Общая и функциональная биохимия
Известно, что антибиотики и белки занимают важное место в жизни каждого человека. Они
представляют большой интерес для медицины, фармакологии и биологии. Белки –
высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, молекулы которых построены
из остатков аминокислот.
Используемый в данной работе альбумин имеет третичную структуру и молекулярную
массу 276649 моль/г. Представляет собой рассыпчатый порошок желтоватого цвета,
некристаллической структуры, образующий при растворении в воде мутные растворы. В нашей
работе использовался яичный альбумин.
Бензилпенициллин натриевая соль обладает антимикробным действием. Представляет
собой белый мелкий кристаллический порошок без запаха, горького вкуса, слегка
гигроскопичен, легко растворяется в воде, метаноле и этаноле, легко разрушается при действии
кислот, щелочей и окислителей, при нагревании в водных растворах. Устойчив к действию
солнечного света.
Целью данной работы является исследование комплексообразования в системе антибиотикбелок. При титровании 1г белка раствором 10-3 М соляной кислоты была получена
кондуктограмма с уменьшающимися значениями удельной электрической проводимости ǽ, и
конечная точка титрования так и не была достигнута. Далее использовались кислоты
концентрации 10-1 , 10-2М. При этой концентрации кислоты была достигнута конечная точка
титрования. В работе исследовались системы с различной концентрацией антибиотиков.
Полученные кондуктограммы титрования смеси 1г белка с антибиотиком соляной
кислотой схожи с кривой титрования белка этой же кислотой, но идут ниже, что возможно
происходит в связи с образованием комплекса между бензилпенициллином и альбумином.
Из полученных данных мы делаем вывод, что бензилпеннициллин взаимодействует с
белками с образованием комплекса, структура и возникновение которого изучается.
ЭФФЕКТ ФЛАВОНОИД-СОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА «ЭКСТРАЛАЙФ» НА
ПРОДУКЦИЮ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В МИТОХОНДРИЯХ РАЗЛИЧНЫХ
ТКАНЕЙ КРЫС
Белова С.П.1,2, Мурзаева С.В.1
1
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН; 2Пущинский
государственный естественно-научный институт, Пущино (Россия)
Swetbell@mail.ru
Важную роль в защите сердца от гипоксии играют митохондриальные АТФ-зависимые
калиевые каналы (митоКАТФ). Предполагается, что открытие митоКАТФ, активируя вход калия во
внутренние мембраны митохондрий, стимулирует работу ЭТЦ, при этом восстанавливается
синтез АТФ и снижается накопление АФК. В предыдущих наших работах было показано, что
растительный препарат «Экстралайф» (ЭЛФ), содержащий в своем составе флавоноиды, в
малых концентрациях активирует митоКАТФ, причем в митохондриях сердца эффекты
проявляются интенсивнее, чем в печени. Предполагают, что активация канала предотвращает
образование АФК в митохондриях, а закрытие канала приводит к их накоплению. Существует
мнение о взаимном регулировании активности митоКАТФ канала и образуемого Н2О2 в
митохондриях, что указывает на возможность участия ЭЛФ в этих процессах за счет
антиоксидантной активности или/и модуляции митоКАТФ.
Для установления особенностей участия ЭЛФ в механизмах регулирования АФК в ЭТЦ и
митоКАТФ разных тканей в настоящей работе оценивалась скорость образования Н2О2 в
митохондриях сердца, печени и мозга крысы в присутствии ЭЛФ с разными субстратами
дыхания. Показано, что ЭЛФ стимулировал скорость образования Н2О2 с НАД-зависимыми
субстратами и в условиях ингибирования комплекса I(МК I) (сукцинат+ротенон) в
митохондриях печени в 2,3-2,5 раза, сердца в 2-3 раза и мозга в 1,3-2,4 раза. В энергизованных
митохондриях (при добавлении АТФ) скорость образования Н2О2 увеличивалась, что
свидетельствовало о закрытии митоКАТФ и соответствовало литературным данным. АТФиндуцируемое увеличение Н2О2 снималось ЭЛФ в митохондриях сердца, печени и мозга с
глутамат-малатом на 137, 30 и 13% соответственно. С пируват-малатом скорость образования
164
Общая и функциональная биохимия
Н2О2уменьшалась в сердце на 27, в печени на 38%, а в митохондриях мозга не выявлялось
какого-либо эффекта. В условиях ингибирования МК I эффект снимался только в
митохондриях сердца (на 80%).
Таким образом, полученные результаты показывают разные эффекты ЭЛФ в тканях сердца,
печени и мозга. Ткани сердца проявляют повышенную чувствительность к адаптогену по
сравнению с печенью и мозгом при функционировании МК I, что указывает на возможное
участие ЭЛФ в модуляции митоКАТФ. Митохондрии печени и особенно мозга отличаются
меньшими эффектами ингибирования АТФ-индуцированого производства Н2О2под влиянием
ЭЛФ как в МК I, так и в условиях его ингибирования. По-видимому, эффекты адаптогена,
обладающего редокс свойствами, связаны с различными механизмами действия на мембраны
митохондрий, отражающими функциональную специфичность тканей.
Работа поддержана грантами РФФИ №07-04-00759а, «Развитие научного потенциала
высшей школы» №2.1.1/3840 и грантом Президента РФ (МК-145.2012.4).
ФЕРМЕНТЫ ОБМЕНА АММИАКА И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИТЕМЫ В
МОЗГЕ КРЫС С ПОРТОКАВАЛЬНЫМ ШУНТИРОВАНИЕМ
Белоушко Е.Е., Тихонова Л.А., Косенко Е.А., Каминский Ю.Г.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и
экспериментальной биофизики Российской академии наук; Пущинский
государственный естественно-научный институт, Пущино (Россия)
katrin.macabre@mail.ru
Аммиак является нормальным клеточным метаболитом, и его концентрация в крови в
норме поддерживается на невысоком уровне благодаря наличию в печени ферментов цикла
мочевины. Повышение концентрации аммиака в крови, или гипераммониемия, приводит к
неблагоприятным последствиям и может служить одним из факторов возникновения
печёночной энцефалопатии.
Существует множество моделей для изучения механизмов токсичности аммиака, одна из
которых - портокавальное шунтирование (ПКШ), или хирургическое исключение печени из
системного кровообращения. Эта модель имитирует врожденные или приобретенные при
хронических заболеваниях печени анастамозы между системой воротной вены и нижней полой
веной.
В данной работе измерена активность ферментов обмена аммиака и ферментовантиокислителей в митохондриях и цитоплазме неокортекса, мозжечка, полосатого тела и
гиппокампа крыс с ПКШ.
Было обнаружено, что ПКШ приводит к достоверному повышению концентрации аммиака
в крови и мозге животных. При этом активность глутаминсинтетазы повышается в цитоплазме
неокортекса и мозжечка, а активность аспартатаминотрансферазы повышается в митохондриях
всех отделов мозга. Активность глутаминазы повышается в митохондриях всех отделов мозга
кроме гиппокампа. Наиболее выраженные изменения в антиоксидантной системе затрагивают
глутатионтрансферазу, активность которой снижается почти во всех исследованных отделах
мозга. Активность марганцевой супероксиддисмутазы снижается в митохондриях мозжечка, а
активность глутатионредуктазы снижается в митохондриях полосатого тела.
Таким образом, разные отделы мозга имеют разную чувствительность к аммиаку, что
выражается в разной степени изменения активности ферментов-антиокислителей и ферментов
обмена аммиака. Повышение активности ферментов, участвующих в переаминировании и
детоксикации аммиака, говорит об адаптивных процессах, протекающих при ПКШ в мозге. В
то же время повышение активности глутаминазы, обнаруженное также на других моделях
гипераммониемии, может рассматриваться как появление дополнительного источника аммиака.
Снижение активности ферментов-антиокислителей способствует развитию окислительного
стресса, который в разной степени проявляется в разных отделах мозга. Особый интерес
вызывает факт снижения во всех исследованных отделах мозга активности
глутатионтрансферазы, что дополнительно указывает на нарушение процессов детоксикации
электрофильных ксенобиотиков и повышенную чувствительность мозга к токсинам при ПКШ.
165
Общая и функциональная биохимия
ВЛИЯНИЕ РАЗНЫХ ГАЗОВЫХ СРЕД НА ПРОДУКЦИЮ АФК В ПРОРОСТКАХ
КУКУРУЗЫ В ПРИСУТСТВИИ ФИТОГОРМОНОВ
Бердникова О.С., Ершова А.Н., Семендяева Е.С.
ФГБОУ ВПО Воронежский государственный педагогический университет
olgaberdn@mail.ru
Известно, что фитогормоны обладают высокой биологической активностью, участвуя в
регуляции роста и развития растений. Показано, что кинетин и эпибрассинолид (ЭБ) повышают
устойчивость растений к различным стрессовым воздействиям, включая гипоксию.
Проростки кукурузы (10-дневные) в течение 12 часов обрабатывали растворами кинетина и
ЭБ (концентрация 10 мг/л), затем их помещали в условия кратковременной (6-24 ч) гипоксии и
среды диоксида углерода. В клетках растений определяли интенсивность свободнорадикального окисления (СРО), содержание супероксидного анион-радикала и пероксида
водорода.
Показано, что фитогормоны снижали интенсивность СРО в первые часы опыта.
Предобработка растений кинетином уменьшала СРО в через 3-6 ч опыта в условиях гипоксии
на 10-40%, и более значительно (на 60%) через 6 ч действия СО2-среды. ЭБ препятствовал
накоплению свободных радикалов в клетках проростков кукурузы в гипоксии на 30%, а в СО2среде на 50% в начале опыта.
Отмечено, что в проростках кукурузы под действием кинетина продукция АФК снижалась
только к концу опыта по отношению к контрольным растениям. Предобработка проростков ЭБ
стабилизировала уровень супероксида и пероксида водорода лишь в первые 6 ч опыта. При
действии гипоксического стресса в проростках кукурузы (среднеустойчивых к дефициту
кислорода) содержание исследуемых типов АФК в первые 6 ч опыта было значительно ниже
уровня контроля (на 30-60%) и только к 24 ч оно возрастало в 3 раза. В условиях СО2-среды
накопление АФК происходило также к концу опыта и превышало уровень аэрируемых
растений в 2-2,5 раза. Предобработка растений кинетином и ЭБ тормозила образование
исследуемых форм у растений, подвергнутых гипоксическому стрессу, но только в последние
часы опыта. При этом уровень пероксида водорода снижался к 24 ч в 1,5-2 раза в клетках
растений по сравнению с контролем. При действии высоких концентраций диоксида углерода
на проростки кукурузы ЭБ более значительно предотвращали образование АФК и также только
в последние часы опыта.
Полученные нами результаты позволяют заключить, что фитогормоны снижают процессы
образования АФК в аэрируемых растениях. Кроме того, предобработка проростков данными
фитогормонами повышает их устойчивость к действию гипоксии и среды высоких
концентраций диоксида углерода. Следовательно, в основе защитного действия фитогормонов
лежит их способность тормозить образование АФК, вызывающих процессы окисления
мембранных структур клеток.
ГЕНЫ И ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА САХАРОЗЫ У ГАЛОТОЛЕРАНТНОГО
МЕТАНОТРОФА METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z
Бут С.Ю., Решетников А.С.
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
(Россия)
flash20063@rambler.ru
У галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z обнаружено
накопление сахарозы в ответ на увеличение солености среды культивирования. Биосинтез
сахарозы широко распространен у цианобактерий, где она по-видимому является запасным
питательным веществом, а также участвует в адаптации к неблагоприятным условиям среды
(высушивание, осмотический шок). Для протеобактерий же накопление сахарозы
166
Общая и функциональная биохимия
малохарактерно, гены биосинтеза данного дисахарида обнаружены всего у нескольких
представителей хемоавтотрофных и метилотрофных бактерий.
Однако роль сахарозы у этих микроорганизмов остается непонятной. В связи с этим
представляет интерес идентификация генов и характеристика ферментов, участвующих в
метаболизме сахарозы у M. alcaliphilum 20Z. В частично аннотированном геноме M.
alcaliphilum 20Z обнаружен кластер генов, предположительно кодирующих соответственно
сахарозофосфатсинтазу (SPS), сахарозофосфатфосфатазу (SPP), сахарокиназу PfkB-семейства и
амилосахаразу (Ams). Данные гены были клонированы и получены электрофоретически
гомогенные препараты соответствующих рекомбинантных ферментов. Препарат SPS-His6 не
проявлял активности и в связи с этим был получен инсерционный мутант, дефектный по гену
sps. Было обнаружено что клетки мутантного штамма не накапливали сахарозу, что указывает
на ключевую роль сахарозофосфатсинтазы в биосинтезе сахарозы у 20Z. Полученный препарат
рекомбинантной сахарофосфатфосфатазы катализировал гидролиз сахарозо-6-фосфата до
сахарозы и неорганического фосфата. Также было обнаружено, что препарат рекомбинантной
амилосахаразы in vitro катализировал трансгликозилирование с переносом глюкопиранозного
остатка сахарозы на полигликан и одновременный гидролиз сахарозы до фруктозы и глюкозы.
Нами было обнаружено, что сахарокиназа PfkB-семейства катализирует АТФ-зависимое
фосфорилирование фруктозы до фруктозо-6-фосфата, следовательно данный фермент является
фруктокиназой (FruK). С помощью ОТ-ПЦР была показана котранскрибция генов fruK и
ams,что указывает на участие фруктокиназы в реутилизации фруктозы, образующей при
катаболизме эндогенной сахарозы у M. alcaliphilum 20Z.
ВЛИЯНИЕ ЗАПАСОВ РЕТИНОИДОВ НА ГИДРОКСИЛАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ
ЦИТОХРОМА Р-450 ПРИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ
Бучковская И.М., Копыльчук Г.П., Шмараков И.А.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы (Украина)
ivannabuchkovska@mail.ru
Цитохромы Р-450 (ЕС 1.14.14.1; СYP) обеспечивают окислительную биотрансформацию
поступающих в организм ксенобиотиков и липофильных биорегуляторных молекулэндобиотиков. Значительное количество изоформ CYP принимают участие в метаболизме
ретиноидов и играют важную роль в гомеостазе ретиноевой кислоты. Различные
патологические состояния (вирусные гепатиты, цирроз, фиброз, частичные резекции) в печени
сопровождаются изменениями монооксигеназих активностей цитохрома Р-450.
С целью исследования влияния обеспеченности организма витамином А на активности
компонентов клеточной системы детоксикации в экспериментах использовано трансгенных
мышей, нокаутных за геном Lrat (экспериментальная модель мышей, не способных
синтезировать ретинилэфиры в печени) и дикого типа (с нормальным уровнем ретинилэфиров в
печени). Животные дикого типа и мыши Lrat-/- подвергались частичной гепатэктомии (ЧГЭ).
ЧГЭ заключалась в резекции 2/3 ткани печени и проводилась в утренние часы в условиях
анестезии.
Результаты проведенных нами исследований показали снижение n-гидроксилазной и Nдеметилазной активностей цитохрома Р-450 в микросомальной фракции клеток печени Lrat-/-мышей на ранних этапах регенерации ткани . В период 12 и 24 ч после частичной гепатэктомии
исследованные активности цитохрома Р-450 снижались на 46% и 43% соответственно по
сравнению с показателями контрольных животных. Известно, что ретиноиды путем активации
ядерных рецепторов RAR и RXR, проявляют модулирующее влияние на энзимные системы
метаболизма ксенобиотиков и процессы их элиминации из организма. Вполне вероятно, что
снижение гидроксилазной активности в печени мышей Lrat-/- нивелирует адекватную и
своевременную инактивацию потенциально опасных липофильных молекул-эндобиотиков
(стероидов, арахидонатов, ретиноидов и др.) и ксенобиотиков, что может приводить к
снижению функции детоксикации печени как основного гомеостатического органа.
167
Общая и функциональная биохимия
Таким образом, отсутствие запасов витамина А сопровождаются пониженным уровнем nгидроксилазной и N-деметилазной активностей цитохрома Р-450 на ранних этапах регенерации
печени.
МЕТАБОЛИЗМ ФОФОЛИПИДОВ И КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ ТИМОЦИТОВ У
КРЫС В СОСТОЯНИИ ИСКУССТВЕННОГО ГИПОБИОЗА
Быкова О.В.1, Афанасьев В.Н.1, Сирота Н.П.2, Коломийцева И.К.1
1
Институт биофизики клетки РАН; 2Институт теоретической и экспериментальной
биофизики РАН, Пущино (Россия)
lelechek@list.ru
Изучение возможностей адаптации человека и животных к условиям низких температур –
одна из актуальнейших задач современной биологии и медицины. При переходе функций
организма млекопитающих на пониженный уровень активности в условиях низкой
температуры среды существенная роль отводится липидам в связи с их ролью в регуляции как
физико-химических свойств биологических мембран, так и в регуляции активности
мембранных ферментов.
Целью нашей работы было исследование изменений метаболизма фосфолипидов,
клеточного цикла и состояния ДНК в клетках тимуса крыс при искусственном гипобиозе.
Искусственный гипобиоз у крыс (tтела=15-17 С) достигался в условиях гипоксии-гиперкапнии
методом закрытого сосуда при tсреды=1-2 С.
В состоянии искусственного гипобиоза крыс в тимоцитах: увеличивалось содержание
фосфатидилхолина (ФХ) на 28%, фосфатидилинозитола (ФИ) в 2 раза, фосфатидилэтаноламина
(ФЭА) на 23%, количество кардиолипина уменьшалось на 59%. Через 24 часа после окончания
процедуры охлаждения содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина приходило в
норму, оставалось повышенным количество фосфатидилинозитола в 2,3 раза, увеличивалось
содержание фосфатидилсерина в 2,4 раза, количество кардиолипина уменьшалось в 2,3 раза.
Количество сфингомиелина (СМ) не изменялось.
Известно, что накопление ФХ и рост отношения фосфатидилхолин/сфингомиелин
кореллирует с активацией пролиферации тимоцитов. Искусственный гипобиоз вызывает
увеличение числа клеток в стадии S клеточного цикла и отношения ФХ/СМ (за счет увеличения
количества ФХ). Можно полагать, что увеличение количества ФХ, ФЭА и стойкое увеличение
ФИ имеют адаптивный характер и направлены на поддержание клеточной пролиферации.
Концентрация кардиолипина в ядрах тимоцитов равна его концентрации в клетке. Поэтому
можно предположить, что кардиолипин ядер вносит существенный вклад в кардиолипин
тимоцитов, а искусственный гипобиоз оказывает влияние на кардиолипин ядер тимоцитов.
Известно, что среди ДНК-связанных липидов кардиолипин занимает особое место, показано
его участие в регуляции клеточной пролиферации. Снижение числа клеток в фазе S на 18%
через 24 часа после окончания охлаждения коррелирует с уменьшением количества
кардиолипина.
Тимоциты – высоко чувствительны к различным внешним воздействиям. Представляло
интерес выяснить, влияет вхождение в состояние искусственного гипобиоза на структуру ДНК
тимоцитов. Метод «комета-тест» позволяет проанализировать наличие двойных и одиночных
разрывов ДНК, а также уровень апоптоза в клеточной популяции. Не выявлено различий при
сравнении значений ТДНК (процент ДНК в хвосте кометы) тимоцитов, изолированных в
состоянии нормотермии и в состоянии гипотермии крыс.
Таким образом, состояние искусственного гипобиоза вызывает эффект последействия,
выраженный в адаптивных изменениях метаболизма липидов и клеточного цикла, что
обеспечивает выживание млекопитающих в экстремальных условиях.
168
Общая и функциональная биохимия
ОНТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА МЕДИ В КЛЕТКАХ
НАДПОЧЕЧНИКОВ КРЫС
Василенко Ю.А.
Санкт-Петербургский государственный политехнический университет
yulvasilenko@gmail.com
У млекопитающих медь, элемент переходной группы тяжелых металлов, является
структурным и каталитическим фактором жизненно важных ферментов, а также принимает
участие в сигналинге, формировании иммунного ответа и ответа на гипоксию, развитии
апоптоза. Мы предполагаем, что множество и разнообразие биологических функций меди
предусматривает наличие в организме (в клетках и вне их) пулов меди, не входящей в состав
активных центров купроэнзимов, благодаря которым осуществляется регулируемое
перераспределение меди между компартментами клетки, внеклеточной и внутриклеточной
медью. В рамках этого предположения было показано, что медь поступает в надпочечники по
механизму, сходному с механизмом ее поступления в печень. У адреналэктомированных крыс в
печени происходит накопление меди, в крови повышается содержание белка холоцерулоплазмина. Данные, возможно, указывают на существование контроля над экскрецией
меди в желчь со стороны надпочечников, о метаболизме меди в которых сведений нет.
В представленной работе изучены некоторые стороны метаболизма меди в надпочечниках.
Показано, что у новорожденных крыс в первые дни жизни по данным атомно-абсорбционной
спектрометрии накапливается медь. Ее концентрация снижается к 5-ому дню жизни. В печени в
этот период жизни увеличивается концентрация меди только в ядрах, а после снижения
концентрации меди в надпочечниках, в печени медь обнаруживается в митохондриях, где
накапливается до 13-го дня жизни. Относительное содержание зрелых продуктов генов
внутриклеточных и внеклеточных купроэнзимов, медьтранспортных белков, белков,
транспортирующих и депонирующих железо, чей метаболизм зависит от медных ферроксидаз,
было определено методом ОТ-ПЦР в надпочечниках 3-ти дневных и взрослых крыс.
Результаты показали, что в надпочечниках в течение онтогенеза снижается
содержаниеCOMMD1-мРНК, продукт трансляции которой ответственен за экскрецию меди.
Также снижается экспрессия генов ферритина и трансферрина, в то время как экспрессия гена
специфического рецептора трансферрина повышается. Обсуждаются особенности метаболизма
меди в надпочечниках.
Работа поддержана грантом РФФИ №12-04-01530-а.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ НОВОЙ
КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ ПРОЦЕССИНГА НЕЙРОПЕПТИДОВ
Волосникова Ж.А., Никулина Ж.В., Соловьев В.Б.
Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского
jeannette-s@yandex.ru
На заключительной стадии процессинга в образовании физиологически активных форм
пептидов принимают участие карбоксипептидазо-В-подобные ферменты, контролирующие
реакции отщепления основных аминокислот (аргинин, лизин).
Нами разработаны методы выделения и очистки карбоксипептидазы, специфически
ингибируемой фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ) из печени крыс и изучены некоторые
ее физико-химические свойства и специфичность действия. Сочетанием методов высаливания
сернокислым аммонием, хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, сефадексе G-75 достигнута
очистка в 277 раз. Максимальная степень экстракции достигалась при рН 4,0 в натрийацетатном буфере в присутствии 100 мМ ЭДТА. Очищенный препарат фермента имел Mr =
100-110 кДа и не содержал примесей других основных карбоксипептидаз. Оптимум рН
действия фермента - 6,0-6,5, однако, в присутствии 0,05 М NaCl оптимум рН становился более
широким и сдвигался в нейтральную зону до 6,75. Фермент полностью ингибировался ФМСФ,
ПХМБ. 2-меркаптоэтанол, N-этилмалеимид, Со2+, гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота не
влияли на его активность.
169
Общая и функциональная биохимия
Анализ продуктов гидролиза субстрата (Leu5-энкефалин-Arg6) показал, что фермент
отщепляет только аргинин, и дальнейшего гидролиза субстрата не происходило. Км фермента
по гидролизу дансил-Phe-Leu-Arg составила 48 мкм, дансил-Phe-Ala-Arg 96 мкм. Фермент
обнаружен в различных органах и тканях. Сопоставление физико-химических свойств
фермента с другими известными карбоксипептидазами позволяет считать, что обнаруженный
фермент не был описан ранее, а специфичность его действия и тканевое распределение,
которое коррелирует с содержанием регуляторных пептидов, позволяет высказать
предположение об участии фермента в генезе нейропептидов.
ВЛИЯНИЕ ПИРИМИДИНОВ БИДЖИНЕЛЛИ НА СУПЕРОКСИДГЕНЕРИРУЮЩУЮ СПОСОБНОСТЬ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ
ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ
Алунгулес Г.И., Волощук О.Н.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы (Украина)
oxbm@mail.ru
Поиск препаратов, модулирующих АФК-генерирующую способность как опухолевых, так
и не трансформированных клеток опухолеосителей, является одним из перспективных
направлений экспериментальной онкологии. В последнее время возник интерес к изучению
биологических эффектов синтетических пиримидинов Биджинелли. Целью нашей работы было
изучение влияние 11 структурно разных пиримидинов Биджинелли на супероксидгенерирующую способность митохондрий активно растущей опухолевой ткани. В основе
синтеза пиримидинов Биджинелли лежит трехкомпонентная конденсация СН-кислотных
карбонильных соединений, альдегидов и мочевины. Все исследуемые соединения Биджинелли
растворяли в DMSO. Концентрация DMSO в среде определения супероксида не превышала 1%
от общего объема пробы.
Результаты проведенных исследований показали, что в условиях инкубации митохондрий
печени опухоленосителей в средах, содержащей 10-3 М препаратов пиримидинов Биджинелли,
наблюдается снижение интенсивности генерации супероксид анион-радикала во всех
исследуемых образцах. В тоже время следует отметить, что наиболее выраженное
ингибирующее влияние на супероксид-генерирующую способность митохондрий проявляют
бромсодержащие пиримидины Биджинелли. В условиях инкубации митохондрий
нетрансформированных клеток животных с трансплантированной карциномой Герена в средах
с бромсодержащими пиримидинами Биджинелли интенсивность генерации супероксида в 2-3
раза ниже в сравнении с синтетическими пиримидинамы, содержащими другие компоненты.
Итак, установленный факт ингибирования супероксид-генерирующей способности
митохондрий печени крыс опухоленосителей пиримидинами Биджинелли открывает
перспективы для дальнейшего исследования биологических эффектов синтетических
бромсодержащих пиримидинов.
ВЛИЯНИЕ ГЕЛДАНАМИЦИНА НА ЭКСПРЕССИЮ И СЕКРЕЦИЮ БЕЛКОВ
ТЕПЛОВОГО ШОКА КЛЕТКАМИ BHK-21 И VERO
Врублевская В.В., Снигирева А.В., Моренков О.С.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики
клетки РАН
v_vrublevskaya@mail.ru
Гелданамицин (ГА) – антибиотик ансамицинового ряда, является естественным
ингибитором белков теплового шока (БТШ) семейства 90 (hsp90α, hsp90β и hsp96). ГА образует
комплекс с АТФ-связывающим участком молекулы HSP90, что приводит к ингибированию
функционирования HSP90 как шаперона.
170
Общая и функциональная биохимия
Целью данной работы было определение экспрессии и секреции Hsc70, Hsp70, Hsp90α,
Hsp90β и Grp94 в клетках BHK-21 и Vero, при ингибировании функционирования БТШ
семейства HSP90 гелданамицином. Содержание внутри- и внеклеточных БТШ исследовали с
помощью Вестерн-блот анализа с использование специфических антител. Показано, что при
инкубации клеток BHK-21 и Vero с ГА в нетоксичной концентрации (1,0 мкМ) в течение 8 ч
происходит повышение внутриклеточного содержания Grp94 в 2-2,5 раз, которое сохраняется
на высоком уровне в течение 24 ч. Уровень внутриклеточого содержания Hsp70 в клетках BHK21 и Vero повышался при инкубации с ГА в течение 8 ч в 1,5-2 раза. Дальнейшая инкубация
приводила к некоторому снижению (на 20-30%) уровня Hsp70 в клетках BHK-21, в то время как
уровень Hsp70 в клетках Vero продолжал повышаться. На обеих клеточных культурах уровни
внутриклеточного содержания hsp90α, hsp90β и Hsc70, не менялись под действием ГА. ГА
практически не влиял на секрецию всех исследованных БТШ.
Полученные данные свидетельствуют о взаимосвязи белков внутриклеточной шаперонной
машины. Функциональное ингибирование семейства HSP90 под действием ГА приводило к
повышению содержания одного из представителей HSP90 – Grp94, локализованного в
эндоплазматическом ретикулуме, но не влияло на содержание цитоплазматических hsp90α и
hsp90β. Кроме этого, наблюдалось влияние ГА на БТШ другого семейства – Hsp70;
повышалось внутриклеточное содержание индуцибельного Hsp70, в то время как содержание
конститутивного Hsc70 не изменялось.
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ
МЕТАЛЛОТИОНЕИНОВ ВОДНЫХ ЖИВОТНЫХ
Гнатишина Л.Л., Фальфушинская Г.И., Турта О.А., Горин О.И., Грицай И.И., Жук
М.В., Осадчук О.И., Романчук Л.Д., Столяр О.Б.
Тернопольский национальный педагогический университет им. Владимира Гнатюка
lesyafoxy@i.ua
Металл-депонирующие белки металлотионеины (МТ) свойственны большинству животных
и одноклеточных. Однако, в зависимости от филогенетического положения организма, и в
соответствии с приоритетами в обеспечении гомеостаза цинка или меди, способность МТ
обратимо связывать ионы металлов и поддерживать редокс-состояние SH-групп может
существенно отличаться. Это подтверждается сравнительными исследованиями реакции МТ
водных животных на действие одних и тех же неблагоприятных факторов среды обитания и
модельных эффектов (Falfushynska et al., 2009, 2010, 2011, 2012).
Целью нашей работы было дать сравнительную характеристику свойств МТ
двустворчатого моллюска Anodonta anatina, рыбы карася серебристого Carassius auratus gibelio
и жабы озерной Rana ridibuna. МТ из печени рыбы и жабы и пищеварительной железы
моллюска получали методом гель-хроматографии на сефадексе G-50. Определяли состав
металлов (цинк, медь, кадмий) в МТ, содержание МТ по количеству связанных металлов (МТМе), содержанию тиолов (МТ-SH) и иммуноферментным методом (ELISA). Выделяли
отдельные домены МТ гидролизом субтилизином реконструированных гомометаллических
МТ. Реактивность SH-групп МТ и отдельных доменов определяли по взаимодействию с
дитионитробензойной кислотой (ДТНБ).
Установлено α/β-доменное строение МТ у всех исследованных видов животных. Выделено
α- и β-домены с М 4 кДа, которые отличаются по составу металлов и спектральным
характеристикам. Наблюдали олигомеризацию доменов, наиболее выраженную у карася для αдомена (16 кДа), а у жабы и моллюска – для β-домена (12 кДа). Титрование при избытке ДТНБ
в реакции псевдо-первого порядка показало, что кинетические константы доменов МТ
моллюска мало отличаются между собой, у карася реактивность α-домена значительно выше,
чем β-домена, а у жабы, наоборот, как результат повышенной чувствительности β-домена к
окислению. МТ жаб легко теряют способность к связыванию ионов меди, особенно, цинка, их
соотношение в составе МТ уменьшается в ряде: жаба–моллюск–рыба. При действии модельных
неблагоприятных факторов (тиокарбаматный пестицид, ионы цинка и кобальта) общее
содержание МТ-SH и МТ-Ме в тканях карася возрастает. При этом, содержание
171
Общая и функциональная биохимия
иммунореактивной конститутивной формы МТ у карася уменьшается, что свидетельствует об
усилении экспрессии индуцибельной формы МТ. У моллюсков в токсической среде
уменьшается содержание МТ-SH, а у жаб – МТ-Ме. Очевидно, α-домен МТ в силу большей
лабильности связей обеспечивает облегченный обмен ионами цинка с другими его клеточными
лигандами, особенно у рыб, что позволяет реализовать главную функцию этих цинк-МТ,
стресс-респонсивную, а β-домен более задействован в депонировании металлов, что важно у
медь-МТ моллюсков при запасании меди для дыхательного пигмента.
Работа выполнена при поддержке МОНМС Украины (М/65-2006, М/256-2008, М/567-2009,
М/13-2009, №118Б) и Западно-Украинского Биомедицинского общества.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИСТАФИЛОКОККОВОГО БЕЛКА LYS K
174
Голенченко С.Г., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет, Минск (Беларусь)
golenchenko@inbox.ru
Staphylococcus aureus – один из наиболее распространённых патогенов животных и
человека, вызывающий ряд опасных и экономически важных заболеваний. Широкое
применение антибиотиков обусловило появление и распространение мультирезистентых
штаммов данного вида бактерий. Например, в некоторых регионах Европы до 70%
стафилококковых
инфекций
вызывается
метициллин-резистентными
штаммами.
Использование антибактериальных ферментов вместо антибиотиков при терапии заболеваний с
известной стафилококковой этиологией позволяет не только преодолеть существующую
резистентность, но и, как считается, препятствует возникновению новых её разновидностей.
Ранее в клетках Escherichia coli BL21 (λDE3) нами была клонирована последовательность,
ответственная за синтез участка лизирующего фермента стафилококкового бактериофага К,
содержащего пептидазный домен (CHAP). В результате экспрессии был получен белковый
продукт, содержащий первые N-174 остатка соответствующего фермента, который
накапливался в тельцах включения. После рефолдинга и гель-фильтрационной очистки нами
была измерена антибактериальная активность полученного препарата в отношении 11-ти
штаммов S. aureus (139, 140, 141, 142, 143, 144, 388, 365, Р209, АТСС6538, АТСС25922); в
качестве отрицательных контролей использовали культуры клеток E. coli XL-1 Blue и Bacillus
subtilis 168. Антибактериальная активность измерялась турбидиметрически по Horgan M. et al,
2008; единицей активности считали такое количество белка, которое вызывало падение ОП600 с
0,4 до 0,2 за 15 минут.
Все исследованные штаммы S. aureus были в равной степени чувствительны к
исследуемому препарату, в то время, как ни один из контролей чувствительности не проявил.
Единице активности соответствовало 14,6 мг белка, что эквивалентно 68 ЕА/мг или 1,5
ЕА/нмоль чистого белка. В результате исследования концентраций от 0,5 ЕА/мл до 800ЕА/мл
было установлено, что в концентрации более 200 ЕА/мл белок проявлял свойства
автоингибитора, и активность стремительно снижалась с ростом концентрации. Эффект был
обратим и исчезал при разбавлении. Предположительно, причиной автоингибирования
является процесс обратимой агрегации исследуемого белкового продукта. Оптимум активности
LysK 174 лежал в диапазоне от 20 до 200 ЕА/мл.
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛЕВОЙ ПИРУВАТКИНАЗЫ
СИНТЕТИЧЕСКИМИ 11-ДЕЗОКСИПРОСТАНОИДАМИ ГРУППЫ Е
Губич О.И., Мышко И.В.
Белорусский государственный университет, Минск (Беларусь)
Hubich_Oksana@tut.by
Пируваткиназа (ПК) – важнейший гликолитический фермент, участвующий в реакции
субстратного фосфорилирования АДФ. В организме человека фермент представлен 4
172
Общая и функциональная биохимия
изоформами, различающимися по особенностям регуляции биокатализа, ферментативной
активности и локализации в тканях. При злокачественной трансформации клеток изоформы ПК
димеризуются и превращаются в опухолевый изофермент (Tu-ПК), являющийся
перспективным метаболическим онкомаркером и потенциальной мишенью в опухолевой
химиотерапии.
Данная работа посвящена изучению способности простаноидов подавлять активность TuПК in vitro. Исследование выполнено с использованием аналогов 11-дезокси-ПГЕ1,
синтезированных в Лаборатории химии ПГ Института биоорганической химии Беларуси.
Работа проводилась на гомогенатах клеток линии Kasumi-1. Активность Tu-ПК измерялась
в сопряженной с лактатдегидрогеназой ферментной системе. Статистическая обработка
результатов проводилась с помощью пакета программ Stadia 6.0.
Установлено, что простаноиды способны достоверно подавлять протекание ПК реакции.
Этот эффект проявлялся в диапазоне концентраций 1·10-10 – 1·10-6 моль/л. Максимально
эффективными оказались концентрации, равные 1·10-7 – 1·10-8 моль/л. По величине
ингибирования простаноиды образуют следующий ряд эффективности: 11-дезокси-ПГЕ1 (90,6% к контролю) > ТЯ-246 (-72,9% к контролю) > ЯК-32 (-67,5%) ≥ ТЯ-227 (-65,5%) > ПГ
F2α(-56,3%) ≥ ТЯ-239 (-55,2%) > ЯК-83 (-50,1%) ≥ ПГI2 (-49,5%) ≥ ПГЕ2(-48,8%) ≥ ПГА2 (-47,3%)
> ТЯ-280 (-37,5%) ≥ ЯК-109 (-32,6%) > ЯК-115 (-25,6%) ≥ ТЯ-65 (-21,3%) ≥ ТЯ-263 (-20,8%) =
ТЯ-246 (-20,1%) = ЯК-122 (-20,0%) ≥ ТЯ-287 (-19,8%) ≥ ТЯ-286 (-12,5%) > ТЯ-240≈ 0 .
Максимальный эффект наблюдался в присутствии соединений, обладающих 13аминогруппой в мононенасыщенной ω-цепи (ТЯ-246) и 13-изоксазольной структурой,
соединенной с фенильным заместителем по С15 (ТЯ-227) или не соединенной с ним (ЯК-32).
Действие этих соединений превосходило эффект широко используемого в клинической и
экспериментальной практике ПГI2. Величины ингибиторного действия природных ПГ на TuПК коррелировали с их способностью подавлять пролиферацию трансформированных клеток,
описанную в литературе.
ИНДУКЦИЯ α,ω -ГЕКСАДЕКАНДИОЛОВОЙ КИСЛОТОЙ ЦИКЛОСПОРИН АНЕЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ПОРЫ ВО ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЕ
МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ, НАГРУЖЕННЫХ ИОНАМИ ДВУХВАЛЕНТНЫХ
МЕТАЛЛОВ
Дубинин М.В., Адакеева С.И., Иванова А.Е., Самарцев В.Н.
Марийский государственный университет, Йошкар-Ола (Россия)
Dubinin1989@gmail.com
Хорошо известно, что предельные монокарбоновые жирные кислоты способны
индуцировать Ca2+ - зависимую неспецифическую проницаемость митохондрий, в том числе и
нечувствительным к циклоспорину А путем. Также известно, что такое действие жирных
кислот на митохондрии может сопровождаться гибелью клеток. Одним из путей метаболизма
длинноцепочечных жирных кислот в печени является их ω-окисление с образованием α,ωдикарбоновых кислот. В настоящее время имеются лишь фрагментарные данные о влиянии
α,ω-дикарбоновых кислот на митохондрии печени. Представляет интерес исследовать действие
α,ω-дикарбоновых кислот как индукторов неспецифической проницаемости внутренней
мембраны митохондрий печени.
В работе была использована α,ω-гексадекандиоловая кислота (ГДК). Известно, что ГДК
является естественным метаболитом пальмитиновой кислоты, образующимся в клетках печени
путем ее ω-окисления.
Установлено, что добавление к суспензии митохондрий ГДК в присутствии ионов Ca2+ или
2+
Sr индуцирует выход ионов Ca2+ (Sr2+) из матрикса, стимуляцию дыхания, а также увеличение
объема матрикса органелл. Циклоспорин А, как и в случае использования пальмитиновой
кислоты, не подавлял наблюдаемое появление проводимости внутренней мембраны
митохондрий. Хелатор ионов Ca2+ и Sr2+ - ЭГТА препятствовал открытию поры.
Преинкубирование митохондрий с АТФ и АДФ приводило к существенному ингибированию
высокоамплитудного набухания, что, возможно, связано с хелатирующим эффектом этих
173
Общая и функциональная биохимия
нуклеотидов. Предварительное добавление БСА к суспензии митохондрий лишь увеличивало
лаг-период высокоамплитудного набухания и выхода ионов Ca2+ (Sr2+). В то же время БСА
существенно ингибировал набухание, индуцированное добавлением пальмитиновой кислоты.
Возможно, это связано с тем, что дикарбоновые кислоты на порядок хуже связываются БСА,
чем их монокарбоновые аналоги.
Известно, что пора, индуцированная монокарбоновыми жирными кислотами и ионами
Ca2+(Sr2+) способна самопроизвольно закрываться. В экспериментах с высокомолекулярным
ПЭГ (МА=36 кДа) показано, что пора, индуцированная ионами Ca2+(Sr2+) и ГДК также обладает
таким свойством.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что естественные метаболиты
монокарбоновых жирных кислот - α,ω-дикарбоновые кислоты, также способны индуцировать
открытие неспецифической Ca2+-зависимой ЦсА- нечувствительной поры.
ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГРЫЗУНОВ СО
СНИЖЕННЫМ СТАТУСОМ МЕДИ КАК МОДЕЛИ
АЦЕРУЛОПЛАЗМИНЕМИИ – ВРОЖДЕННОЙ ОШИБКИ МЕТАБОЛИЗМА
ЖЕЛЕЗА
1
2
Ильичева Е.Ю. , Скворцов А.Н. , Петрова Е.С.1, Коржевский Д.Э.1, Цымбаленко
Н.В.1, Пучкова Л.В.1,2
1
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский
институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской
академии медицинских наук; 2Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего профессионального образования «СанктПетербургский государственный политехнический университет»
ikaterina2705@yandex.ru
Ацерулоплазминемия (АЦ) – аутосомно-рецессивное заболевание обмена железа. При АЦ
оно аккумулируется в печени и в отделах мозга. Это приводит к развитию дегенерации
сетчатки, сахарному диабету, атаксии, анемии и деменции в позднем периоде жизни. Болезнь
вызывают мутации в гене церулоплазмина (ЦП), мультимедной ферроксидазы, которая
синтезируется в печени. Помимо того, что ЦП является транспортером меди по внеклеточным
пространствам, он как ферроксидаза принимает участие в транспорте ионов железа через
мембраны.
Разрабатываемая нами модель является ненаследственным дефицитом меди, вызываемым
добавлением серебра в пищу. Ag(I) является изоэлектронным Сu(I), они связываются
медьтранспортными белками и переносятся по тем же маршрутам, что и медь.
Целью данной работы было изучение влияния серебряной диеты (50 мг AgCl/кг массы тела
в сутки) на метаболизм железа. Исследование проведено на лабораторных грызунах (мышах и
крысах), получавших серебро в течение 3 недель, а также группе крыс, получавших серебро с
первого дня рождения до 6 месячного возраста.
У грызунов, получавших хлорид серебра в течение трех недель происходит исчезновение
оксидазной и ферроксидазной активностей в сыворотке крови, снижается концентрация меди.
В клетках печени происходит накопление железа в цитозольной и микросомальной фракциях.
В то же время, по данным иммуноблотинга содержание белка ЦП в крови не меняется.
Относительная активность гена ЦП, трансферрина, рецептора трансферрина, легкой и тяжелой
цепей ферритина у контрольных и Ag-животных одинакова. UV/vis сканирование очищенного
ЦП показало, что с ним связано Ag(I). Данные КД спектроскопии показывают, что третичная
структура молекулы Ag-ЦП значительно нарушена по сравнению с таковой у холо-ЦП. У
животных, в течение 6 месяцев содержавшихся на серебряной диете, активность генов
трансферрина, рецептора трансферрина, легкой и тяжелой цепей ферритина не меняется.
Концентрация железа в клетках печени, мозга, сыворотке крови не изменяется достоверно и
повышается в селезенке. Включения железа выявляются гистологическими методами только в
174
Общая и функциональная биохимия
селезенке. Обсуждается
ацерулоплазминемии.
возможность
использования
этой
модели
для
изучения
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ И ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА В
ЭРИТРОЦИТАХ ПРИ ДЕЙСТВИИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА
Кабаева Г.Н., Кузьмичева Л.В., Исаева И.А., Дораев М.И., Савкина Е.Ю.
ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева»
kabaevagalina4889@mail.ru
Исследовали влияние коллоидных наночастиц серебра на морфофункциональную
активность эритроцитов. Исследование проводилось на белых беспородных крысах, самцах,
массой 180-200 г. Животные делились на 2 группы: 1-ая – контрольная, рацион животных
состоял из зерна и воды; 2-ая – помимо обычного кормления зерном крысы получали
коллоидный раствор наночастиц серебра per ros (100 мкл) один раз в сутки в течение 7 дней.
Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами
проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Материалом исследования служила суспензия эритроцитов крыс. Контроль за состоянием
морфологии эритроцитов производился при помощи метода лазерной интерференционной
микроскопии (ЛИМ). Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре
«UV-mini-1240». Продукты ПОЛ (МДА), активность каталазы определяли общепринятыми
биохимическими методами. При поступлении в организм крыс коллоидного серебра в течение
7 суток в эритроцитах содержание гемоглобина уменьшается на 7%, при этом площадь
эритроцитов увеличивается на 5% по отношению к контрольной группе. В эритроцитах
происходят изменения и в спектральных характеристиках гемоглобина. Так, уменьшаются пики
при 540 нм и 414 нм, показывающие оксигемоглобин, на 64,5% и 16,1% соответственно. Пик
при 555 нм, относящийся к гемоглобину, снижается на 73,5%. При 570 нм и 538 нм пики,
отражающие карбоксигемоглобин, снижаются на 28,2% и 64,1% соответственно по отношению
к контрольной группе. Через 7 дней кормления крыс коллоидным серебром содержание МДА в
эритроцитах остается в пределах контрольных значений, а активность каталазы снижается на
66,7% по отношению к контролю. Сорбционная емкость клеток уменьшается на 65,8%. Таким
образом, при поступлении коллоидных частиц наносеребра наблюдаются изменения
морфофункциональной активности эритроцитов, что проявляется в изменении содержания и
перераспределении гемоглобина.
ПРОТЕИНАЗЫ СЕМЕЙСТВА КАЛЬПАИНОВ У БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
ЖИВОТНЫХ И РЫБ: ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ
Канцерова Н.П., Лысенко Л.А., Ушакова Н.В., Немова Н.Н.
ИБ КарНЦ РАН, ИБВВ РАН, Петрозаводск (Россия)
nkantserova@yandex.ru
Кальпаины – внутриклеточные кальций-зависимые цистеиновые протеиназы (клан СА,
семейство С02), выполняющие функцию ограниченного протеолиза в клетках всех
эукариотических и ряда прокариотических организмов. К настоящему времени
идентифицирована 1051 последовательность, кодирующая кальпаины и их гомологи.
Кальпаины принимают участие в основных Са2+-зависимых клеточных процессах – передаче
сигнала, клеточном цикле, пролиферации, дифференцировке, слиянии мембран транспортных
везикул, формировании мышечных волокон, реализации клеточной гибели и других. К
настоящему моменту система кальций-зависимого протеолиза, включающая кальцийзависимые протеиназы семейства кальпаинов и их эндогенный ингибитор кальпастатин,
достаточно хорошо изучена у млекопитающих, хотя и в этой области остается ряд нерешенных
проблем. Сведения же о кальпаинах рыб и особенно беспозвоночных животных сравнительно
фрагментарны и зачастую исчерпываются идентификацией кодирующих их нуклеотидных
последовательностей. В настоящей работе исследовали уровень активности, структурные и
175
Общая и функциональная биохимия
энзиматические свойства кальпаинов беспозвоночных животных различных таксономических
групп (малощетинковые черви, пиявки, ракообразные, насекомые, брюхоногие и
двустворчатые моллюски), а также костистых рыб. Показано, что кальпаины беспозвоночных
животных отличаются от типичных кальпаинов позвоночных как особенностями структуры
(отсутствие малой субъединицы, отсутствие олигомерных форм), так и свойств (большая
потребность в кальции для активации, меньшая термостабильность, более широкая субстратная
специфичность). В тканях беспозвоночных животных отсутствует эндогенный ингибитор
активности кальпаинов – кальпастатин. Вероятно, выявленные отличия отражают как усиление
пространственно-временного контроля активности кальпаинов в эволюционном ряду, так и
изменение спектра выполняемых ими функций в метаболизме клетки.
Работа выполнена при поддержке программы ФЦП «Научные и научно-педагогические
кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 14.740.11.1034), программы
Президента РФ «Ведущие научные школы» (НШ-3731.2010.4, НШ-1642.2012.4), программы
№28-2 Президиума РАН «Проблемы происхождения жизни и становления биосферы», гранта
РФФИ №11-04-00167-а.
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ПРОПЕПТИДА
ЭНДОПЕПТИДАЗЫ AlpA, СЕКРЕТИРУЕМОЙ LYSOBACTER SP. XL1
Кирток А.Н.1,2, Сухаричева Н.А.2,3, Линник А.И.4, Красовская Л.А.5, Степная О.А.5,
Руденко Н.В.2
1
Филиал МГУ им. М.В. Ломоносова в г. Пущино; 2ФИБХ РАН; 3ПущГЕНИ; 4ФГБОУ
ВПО КемТИПП; 5ИБФМ РАН
alexeykirtok@mail.ru
Исследование молекулярных механизмов секреции белков является важнейшей задачей,
как фундаментальной науки, так и биотехнологии. Особый интерес в этом плане представляет
исследование грамотрицательной бактерии Lysobacter sp. XL1, продуцирующей внеклеточные
ферменты, лизирующие клеточную стенку других микроорганизмов, в том числе и патогенных.
Комплекс ферментов, секретируемых Lysobacter sp. XLI, является перспективным для
разработки антимикробного препарата нового поколения не вызывающего привыкания, в
качестве альтернативы антибиотикам. Для исследования механизмов секреции одного из
литических ферментов Lysobacter sp. XL1 - эндопептидазы AlpA, были получены и
охарактеризованы моноклональные антитела (МА) против пропептида фермента. Известно, что
его аминокислотная последовательность высокогомологична последовательности протеазы
AlpB (степень гомологии - 59%), что значительно усложнило получение антител. Так, из
представительной панели, составляющей двенадцать МА, только два (PROA-1 и PROA-2) не
обладали иммуноперекрестной реактивностью с пропептидом эндопептидазы AlpВ и зрелыми
формами AlpA и AlpB, что было установлено иммуноферментным анализом и
иммуноблоттингом. МА PROA-1 и PROA-2 взаимодействовали с нативной и с
денатурированной формами исследуемого антигена. Кафф, определенные по методу Битти,
равнялись 5х109М-1 и 2,9х109М-1,соответственно. Показано, что полученные МА выявляют
предшественник эндопептидазы AlpA в лизате клеток Lysobacter sp.XL1. Методом «сэндвич»ИФА было продемонстрировано, что эпитопы этих моноклональных антител расположены на
молекуле пропептида AlpA, таким образом, что не препятствуют взаимодействию друг друга.
Полученные характеристики МА предполагают, что они могут быть инструментом
исследования белок-белковых взаимодействий в процессе секреции AlpA.
ГЕПАТО- И НЕФРОТОКСИЧЕСКОЕ ВЛИЯНИЕ КОЛЛОИДНЫХ
НАНОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЗОЛОТА И СЕРЕБРА
Клымчук И.М., Лазарук Н.В., Шмараков И.А.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича
ivanka.klymchuk@gmail.com
176
Общая и функциональная биохимия
Интенсивное использование нанотехнологий в современной биологической науке и
значительные успехи их применения не исключают вопроса их токсического воздействия на
биологические системы. Благодаря наноразмерам они проявляют качественно новые свойства,
лежащие в основе их биологической активности и возможного токсического воздействия.
Печень и почки – основные органы накопления и детоксикации наночастиц после их попадания
в организм через желудочно-кишечный тракт, поэтому пероральное применение
нанопрепаратов требует первоочередной оценки их потенциальной гепато-и нефротоксичности.
Целью работы было оценить гепато- и нефротоксичность коллоидных наночастиц (НЧ) на
основе Ag и Au в системе in vivo. В эксперименте использованы коллоидные растворы моно-и
биметаллических наночастиц на основе Ag и Au размером 5-20 нм, стабилизированных
додецилсульфатом натрия (ДСН) и триптофаном (Трп).
Анализ морфологических и биохимических параметров позволил выявить общую
закономерность относительно гепато- и нефротксического воздействия наночастиц,
стабилизированных ДСН, при их пероральном введении в использованной дозе (0,1 мг/кг)
независимо от компонентного состава металла. Во всех опытных группах животных нами
фиксировалось возрастание аланинаминотрансферазной (АлАТ) и γ-глутамилтрансферазной
(ГГТ) активностей в сыворотке крови при введении ДСН-стабилизированных НЧ, а также
отклонения от референтных величин уровня креатинина и мочевины.
Параллельные изменения изучаемых показателей в группе опытного контроля
свидетельствовало, что причиной выявленного выступал не только металлический компонент, а
также использованный при синтезе стабилизатор. В тоже время использование триптофана в
качестве стабилизатора при синтезе НЧ на основе серебра и золота позволяло снизить их
потенциальную гепато-и нефротоксичность, что проявлялось в сохранении исследуемых
показателей на уровне контрольных величин.
Наименее гепатотоксичной и наиболее биосовместимой оказалась биметаллическая
триптофан-стабилизированная НЧ (Ag/Au/Трп). Вместе с тем, введение монометаллических
наночастиц (Ag/Трп, Au/Трп) характеризировалось повышением исследуемых ферментативных
активностей относительно контроля, но только в случае самок. При этом наиболее
отрицательная динамика, выраженная в повышенных уровнях АлАТ и ГГТ, а также нарушении
фильтрационной способности почек, фиксировалась в случае монометаллической наночастицы
на основе серебра.
Таким образом, на основе проведенного ервичного биохимического скрининга гепато-и
нефротоксичности наночастиц, приемлемым с позиций низкого токсического воздействия на
печень и почки, а также биосовместимости оказывается биметаллический нанокомпозит,
стабилизированный триптофаном.
УЧАСТИЕ ВНЕШНЕМЕМБРАННЫХ ВЕЗИКУЛ В СЕКРЕЦИИ
РЕКОМБИНАНТНОЙ ЛИТИЧЕСКОЙ ЭНДОПЕПТИДАЗЫ Л5 В
PSEUDOMONAS FLUORESCENS
1,2
Кудрякова И.В. , Шишкова Н.А.3, Сузина Н.Е.2, Васильева Н.В.2, Степная О.А.2
1
МарГУ, Йошкар-Ола; 2ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино; 3ФБУН ГНЦ ПМБ,
Оболенск (Россия)
kudryakovairina@yandex.ru
Образование везикул является распространенным процессом для грамотрицательных
микроорганизмов. Последние исследования в этой области показали их значимость во многих
процессах жизнедеятельности бактериальной клетки, связанные с секрецией белков,
межбактериальными взаимодействиями, а также с взаимодействиями «бактериальный патогенхозяин». Однако, несмотря на изучение везикул на протяжении нескольких десятилетий,
вопрос об их биогенезе остается открытым. Некоторые наши наблюдения позволяют
предположить участие секретируемых белков в процессе их формирования.
Грамотрицательная бактерия Lysobacter sp. XL1 секретирует в культуральную среду пять
бактериолитических ферментов (Л1-Л5). Бактериолитическая эндопептидаза Л5 – один из
наиболее изученных внеклеточных ферментов этой бактерии. Ранее было показано, что
177
Общая и функциональная биохимия
фермент Л5 попадает в окружающую среду посредством внешнемембранных везикул,
образуемых клетками Lysobacter sp. XL1. Известна нуклеотидная последовательность гена,
кодирующего этот фермент. Получена экспрессионная система эндопептидазы Л5 в
рекомбинантном штамме Pseudomonas fluorescens Q2-87/В.
Методами электронной микроскопии показано, что клетки P.fluorescens Q2-87/В образуют
внешнемембранные везикулы, как и родительский штамм P. fluorescens Q2-87. Везикулы были
выделены из культуральной жидкости обоих штаммов и частично охарактеризованы. Было
отмечено, что клетки P. fluorescence Q2-87/В, экспрессирующие белок Л5, образуют большее
количество везикул, имеющих и больший размер, по сравнению с везикулами родительского
штамма. При определении концентрации белка было установлено большее его содержание в
препарате везикул штамма, экспрессирующего бактериолитическую эндопептидазу Л5. С
помощью высокочувствительного теста на чашке с вплавленными в агарозный гель
автоклавированными клетками Staphylococcus aureus209P в препарате везикул штамма Q2-87/В
была выявлена бактериолитическая активность. Иммуноферментным анализом с антителами к
белку Л5 установлено присутствие последнего в везикулах рекомбинантного штамма. Это
указывает на участие везикул, образуемых P. fluorescence Q2-87/В, в секреции
рекомбинантного белка Л5. Совокупность данных позволяет также предположить, что сам
секретируемый белок играет важную роль в процессе формирования везикул.
Действие везикул P. fluorescence Q2-87/В было проверено в отношении живых клеток
вакцинного штамма Bacillus anthracis 71/12 и метициллинрезистентного (MRSA) штамма S.
aureus 55. Показано, что везикулы, содержащие литическую эндопептидазу Л5, активно
лизируют выбранные тест-культуры. Полученные результаты могут способствовать
дальнейшему изучению везикул в качестве лекарственного средства.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕЛАТОНИНА В КАЧЕСТВЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРА
ПРИ ВНЕПЕЧЕНОЧНОМ ХОЛЕСТАЗЕ
Кузнецова Е.И., Семак И.В.
Белорусский государственный университет, Минск (Беларусь)
hju2002@mail.ru
Холестаз, являющийся исходом целого ряда хронических и острых заболеваний печени,
развивается в результате нарушения образования и оттока желчи в кишечник и сопровождается
накоплением ее компонентов в печени и крови. Увеличение концентрации потенциальных
прооксидантов (желчных кислот, билирубина и ионов меди (II)) на фоне снижения
внутриклеточной антиоксидантной защиты приводит к развитию окислительного стресса,
повреждению митохондрий и в конечном итоге к гибели гепатоцитов. Учитывая важную роль
повреждения митохондрий в патогенезе заболеваний печени, представляется актуальным поиск
природных антиоксидантов, способных предотвращать повреждение митохондрий в условиях
холестаза. Особый интерес в этом плане представляет мелатонин - эндогенный антиоксидант,
максимальная внутриклеточная концентрация которого обнаружена в митохондриях.
Мелатонин метаболизируется в митохондриях с образованием 6-гидроксимелатонина, Nацетилсеротонина и N-ацетил-N-формил-5–метоксикинурамина, которые также проявляют
антиоксидантную активность.
Внепеченочный холестаз у белых крыс самцов вызывали хирургическим путем в
результате перевязки и перерезки общего желчного протока. Все показатели измерялись на 14
сутки после операции. Ежедневное внутрибрюшинное введение «холестазным» крысам
мелатонина в дозе 0,5 мг/кг приводило к значительному снижению активности щелочной
фосфатазы (ЩФ), γ-глутамилтрансферазы (ГГТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ),
аланинаминотрансферазы (АЛТ) и содержания общего билирубина по сравнению с
«холестазными» крысами, которым не вводили мелатонин. На фоне тенденции к нормализации
показателей холестаза у опытных животных, получавших мелатонин, наблюдалось увеличение
активности дыхательных комплексов I, II, III и IV митохондрий печени на 63,3%, 13,5%, 30,5%
и 24,1% соответственно по сравнению с «холестазными» крысами. Обнаруженный эффект
скорее всего обусловлен антиоксидантной активностью мелатонина и его метаболитов, в
178
Общая и функциональная биохимия
пользу чего свидетельствует снижение содержания карбонильных соединений и продуктов
ПОЛ в митохондриях печени холестазных крыс, подвергавшихся лечению, на 53,6% и 27,2%
соответственно. Это предположение дополнительно подтверждается результатами,
полученными in vitro. Мелатонин и его производные эффективно предотвращали накопление
карбонильных соединений и продуктов ПОЛ и восстанавливали активности I, II, III и IV
комплексов митохондрий печени крыс в условиях экспериментального окислительного стресса,
индуцированного гидропероксид трет-бутилом.
Обнаруженные закономерности свидетельствуют о перспективности проведения
дальнейших экспериментальных работ с целью создания на основе мелатонина и его
производных новых препаратов направленного действия для предотвращения повреждения
митохондрий при поражениях гепатобилиарной системы.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЛИГАНДОВ КАЛИЕВОГО КАНАЛА KV1.3 В ЯДЕ
ЧЕРНОГО СКОРПИОНА ORTHOCHIRUS SCROBICULOSUS
Кузьменков А.И., Кудряшова К.С.,Василевский А.А., Королькова Ю.В.,
Некрасова О.В., Феофанов А.В., Гришин Е.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
anteka@ya.ru
Ионные каналы участвуют в важнейших клеточных процессах, играют роль в патогенезе
многих заболеваний и являются мишенями широкого спектра фармацевтических препаратов.
Анализ лиганд-рецепторных взаимодействий является актуальной задачей с точки зрения
изучения структурно-функциональных особенностей рецепторов и соответствующих лигандов,
а также для создания новых биологически активных соединений, способных модулировать
активность мембранных белков.
В настоящей работе предложена система поиска лигандов потенциал-чувствительного
калиевого канала Kv1.3, которая базируется на экспрессии в мембране бактерий Escherichia coli
химерного белка KcsA-Kv1.3. Гибрид KcsA-Kv1.3 был получен путем встраивания
внеклеточных петель калиевого канала человека Kv1.3 в гомологичный участок бактериального
канала KcsA. Показано, что гибридный канал сохраняет способность связывать поровые
блокаторы Kv1.3, a c применением метода конфокальной микроскопии возможно дать
количественную оценку образования комплексов между флуоресцентно-меченым блокатором
калиевых каналов агитоксином-2 (AgTx2) и лиганд-связывающим участком Kv1.3 на
поверхности клеток E. coli, экспрессирующих KcsA-Kv1.3.
C помощью этой системы был проведен поиск блокаторов Kv1.3 в составе яда черного
скорпиона Orthochirus scrobiculosus, способных вытеснять меченый AgTx2 из комплекса с
гибридным KcsA-Kv1.3. Для исследования был взят как цельный яд, так и отдельные его
компоненты, которые были выделены в индивидуальном виде с помощью хроматографических
методов. Оказалось, что среди большого разнообразия соединений, входящих в состав яда,
только одно обладает активностью по отношению к данной изоформе калиевых каналов. Это
компонент полипептидной природы OSK1, который был ранее выделен и охарактеризован
Гришиным Е.В. и др.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТОЧНЫХ ФОСФОМОНОЭСТЕРАЗ
НА ВВЕДЕНИЕ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ ПОЛИМЕРНЫХ ЧАСТИЦ IN VIVO
Кузьмина А.М., Горева А.В., Шишацкая Е.И.
Сибирский федеральный университет, Красноярск (Россия)
anna.kuzmina88@gmail.com
Современное развитие науки приводит к все более широкому внедрению в медицине
высокомолекулярных соединений – биополимеров, синтезируемых живыми системами.
179
Общая и функциональная биохимия
Полигидроксиалканоаты (ПГА) – природные полиэфиры алкановых кислот, продуцируемые
микроорганизами. Эти биополимеры имеют способность разрушаться до конечных продуктов
(аэробно, до СО2 и Н2О) в различных биологических средах, что является одним из наиболее
ценных их свойств. В связи с этим ПГА имеют широкие перспективы в качестве
биорезорбируемого материала для создания систем контролируемой доставкой лекарств.
Цель настоящей работы – конструирование полимерных микрочастиц, исследование их
характеристик и определение активности сывороточных фосфомоноэстераз (кислой и
щелочной фосфатаз) на их имплантацию in vivo.
В качестве полимерного носителя был взят полимер β-гидроксимасляной кислоты (поли-3гидроксибутират, П3ГБ). Образцы П3ГБ синтезированы по технологии Института биофизики
СО РАН. Методом испарения растворителя из двукомпонентной эмульсии были получены
П3ГБ микросферы для внутривенного введения (средний диаметр 0,7±0,12 мкм) и
внутримышечного введения (средний диаметр около 20±0,95 мкм). Исследовано размерное
распределение частиц и электрокинетический потенциал систем.
Для анализа биохимических перестроек исследованы в динамике активность кислой и
щелочной фосфатаз, которые наиболее ярко реагируют на повреждение тканей. Изменение
активности щелочной фосфатазы в динамике эксперимента связано с незначительной
воспалительной реакцией организма в первые дни после введения и процессом васкуляризации
к концу эксперимента. Активность кислой фосфатазы макрофагов и гигантских клеток
инородных тел, как маркера интенсивности биодеструкции полимерных материалов,
значительно увеличивалась в ходе эксперимента
Полученные результаты характеризуют реакцию на введение П3ГБ полимера, как
продолжительное воспаление по местному типу, а активность ферментов, увеличивающаяся
второй недели, свидетельствует о биодеградации материала в живом организме. В целом,
выполненные исследования полигидроксиалканаотов и изделий из них в условиях in vivo
свидетельствуют о высоких медико-биологических свойствах данного материала. Это
позволяет рекомендовать данный класс биодеградируемых полимеров для создания
контролируемых систем доставки лекарственных средств.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Правительства Российской
Федерации № 220 (проект «Биотехнологии новых биоматериалов») и программы Президента
Российской Федерации для молодых докторов наук (грант № МД-3112.2012.4).
РОЛЬ 3-БЕТА-ГИДРОКСИСТЕРОИД ДЕГИДРОГЕНАЗЫ MYCOBACTERIUM SP.
AC-1815Д В ОКИСЛЕНИИ СТЕРИНОВ
Лебедева Е.С., Ивашина Т.В., Николаева В.М., Довбня Д.В., Донова М.В.
Пущинский государственный естественно-научный институт; Институт биохимии и
физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино (Россия)
EkaterinaLebedeva2612@mail.ru
Микробиологическая трансформация природных стеринов является основой получения
ключевых предшественников синтеза фармацевтических стероидов. Изучение генетического
контроля катаболизма стеринов микроорганизмами представляет собой важную задачу
биотехнологии, решение которой открывает перспективы создания новых штаммов –
продуцентов андростанов.
Быстрорастущий непатогенный штамм Mycobacterium sp. ВКМ Ac-1815Д осуществляет
окислительную деградацию стеринов с образованием в в качестве основного продукта
андростендиона (АД). Начальным этапом окисления стеринов является структурная
перестройка стероидного ядра, при которой 3β-ол-5-ен группировка стерина преобразуется в 3кето-4-ен-структуру. К ключевым ферментам, катализирующим данную реакцию, относятся
холестерин оксидазы (ХО) и 3β-гидроксистероид дегидрогеназы/изомеразы (ГСД). Основная
задача работы заключалась в идентификации гена ГСД Ac-1815Д и изучении свойств
кодируемого им фермента с целью дальнейшего выяснения возможности одностадийного
микробиологического получения 3β-ол-5-ен-андростанов из стеринов.
180
Общая и функциональная биохимия
Анализ нуклеотидной последовательности геномной ДНК Ас-1815Д позволил выявить
ОРС (обозначена как hsd) длиной 1101 п.о. с высокой вероятностью кодирования ГСД (40,19
кДа). На основании сравнения аминокислотной последовательности, выведенной из
нуклеотидной последовательности гена hsd, ГСД отнесена к суперсемейству белков SDR.
Наибольшая гомология белка (78-80% идентичных а.о.) выявлена с гидроксистероид
дегидрогеназами штаммов M. tuberculosis H37Rv, M. smegmatis mc2155 и M. gilvumPYR-GCK. В
N-концевом участке ГСД выявлен консервативный НАД(Ф)-связывающий мотив G-X-G-(X)2G-(X)10-G.
Для подтверждения функции ГСД сконструирован штамм с повышенным синтезом белка.
Для этого ОРС hsd амплифицировали с использованием специфических праймеров и
клонировали в векторе pET22b. Рекомбинантную плазмиду pET-hsd, кодирующую ГСД с
дополнительными аминокислотными остатками на С-конце (LEHHHHHH), использовали для
экспрессии гена hsd в клетках E. coli BL21(DE3). Экспрессия гена в E. coli привела к синтезу
функционально активной ГСД (41,21 кДа). Исследуемый белок очищен с помощью аффинной
хроматографии на колонке с Ni- NTA агарозой. Исследована субстратная специфичность
фермента. Показано, что рекомбинантный белок обладает как 3β- так и 17β-гидроксистероид
дегидрогеназной активностью.
Получен штамм Ac-1815Д с мутацией в гене hsd. Сохранение стеринтрансформирующей
активности у hsd-мутанта свидетельствует о наличии в клетках исследуемого штамма других
ферментов, способных к окислению 3β-ОН группы стеринов.
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
ПОЛИФЕНОЛСОДЕРЖАЩИХ ЭКСТРАКТОВ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР
ПАЖИТНИКА ГРЕЧЕСКОГО
Логвина А.О.
Белорусский государственный университет, Минск (Беларусь)
hanna.lohvina@gmail.com
Фенольные соединения представляют собой один из наиболее многочисленных и широко
распространенных классов биологически активных веществ. Являясь продуктами вторичного
метаболизма растений, они принимают активное участие в окислительно-восстановительных
процессах, выработке иммунитета, регуляции роста. Кроме этого фенольные соединения
являются эффективными природными антиоксидантами, предохраняющими молекулы ДНК,
белков и липидов от свободно-радикального окисления. С этим связывают способность многих
метаболитов данного класса действовать в качестве агентов, проявляющих противораковое,
кардиопротекторное, противовоспалительное, иммуномодулирующее действие.
Пажитник греческий (Trigonella foenum-graecum L.) – древнейшее культивируемое
лекарственное растение. Широко применяется в лечении и профилактике целого ряда
заболеваний. Представляет собой богатый источник ценных биологически активных веществ
вторичного происхождения, в том числе фенольных соединений. Установленной является
взаимосвязь между содержанием фенолов в экстрактах семян и листьев пажитника и
демонстрируемой ими способностью связывать свободные радикалы. Альтернативным
способом получения активного полифенольного комплекса пажитника греческого в
промышленных масштабах может служить применение культуры клеток in vitro, полученной на
его основе.
В связи с этим целью данной работы было определение общего содержания фенольных
соединений (ОСФС) в каллусах Trigonellafoenum-graecum и изучение антирадикальной
активности их водно-спиртовых экстрактов.
Объектами исследования служили листовые и стеблевые каллусные ткани пажитника
греческого ярового (Ovari 4) и озимого (PSZ.G.SZ) сортов. ОСФС определяли в 70% водноспиртовых экстрактах методом Фолина-Чокальтеу в пересчете на галловую кислоту. Для
оценки антирадикальной активности экстрактов использовали метод DPPH (2,2-дифенил-1пикрилгидразил).
181
Общая и функциональная биохимия
В ходе проведенных экспериментов установлено, что среди исследуемых клеточных
культур наиболее высокий биосинтетический потенциал в отношении фенолов был характерен
для листового каллуса пажитника ярового сорта (9,7 мг/г сухой массы). Тогда как уровень
накопления фенольных соединений в остальных каллусах составил лишь 4,7-6,3 мг/г сухой
массы, причем достоверных отличий в полученных значениях выявлено не было. Аналогичная
зависимость наблюдалась при изучении антирадикальной активности. Так, через 30 мин после
начала реакции компонентами экстракта листового каллуса пажитника ярового сорта было
ингибировано 59% радикалов DPPH, что на 30-40% выше по сравнению с вытяжками
остальных исследуемых каллусных тканей. Таким образом, полученные результаты
свидетельствуют о наличии положительной корреляции между ОСФС в каллусах пажитника
греческого и демонстрируемой их экстрактами антирадикальной активностью.
ОЧИСТКА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ
АКТИВНОГО ЦЕНТРА МДГ ИЗ БАКТЕРИЙ RHODOVULUM STEPPENSE
ШТАММ A-20S
Лященко М.С., Шульгина Е.В., Ларченков В.М.
Воронежский государственный университет
lyaschenkom@list.ru
Обмен веществ был бы не возможен без участия биологических катализаторов –
ферментов. Изучение структурных особенностей активных центров ферментов и
характеристика входящих в их состав функциональных групп аминокислотных остатков,
представляет большой научный интерес и огромное практическое значение. Особое внимание
вызывает малатдегидрогеназная система, обеспечивающая приспособление к стрессовым
условиям на уровне клеточного метаболизма.
В ходе многостадийной очистки был получен гомогенный препарат малатдегидрогеназы
(КФ 1.1.1.37.) из бактерий Rhodovulum st. штамм A-20S. На очищенных препаратах определена
молекулярная масса фермента, исследованы некоторые кинетические и регуляторные свойства
малатдегидрогеназы: константа Михаэлиса для прямой и обратной реакций, влияние ионов
металлов на активность фермента. Методом SDS-электрофореза определена молекулярная
масса субъединиц и выявлено субъединичное строение фермента. Изучено модифицирующее
влияние специфических ингибиторов на существенные для катализа аминокислотные остатки.
Инкубация МДГ в присутствие диэтилпирокарбоната и n-хлормеркурибензоата приводила к
потере активности фермента, что указывает на возможность присутствия аминокислотных
остатков гистидина и цистеина в активном центре МДГ. Установлен выраженный эффект
защитных агентов и показана важная роль имидазольной и сульфгидрильной групп.
Присутствие SH-групп в белках эукариот, имеющих митохондриальную организацию, и их
отсутствие в активном центре цитоплазматических глиоксисомальных изоферментов
свидетельствует о различном генетическом происхождении этих двух групп молекулярных
форм малатдегидрогеназной системы. Проведенное нами исследование позволило сделать
вывод, что МДГ галофильных бактерий по своей значимости приближается к
митохондриальным белкам, участвующим в энергетическом обмене эукариот. Произведен
расчет количества модифицированных остатков гистидина и цистеина в активном центре МДГ:
установлено, что в присутствие реагентов модифицируется один существенный для катализа
гистидиновый остаток и один остаток цистеина активного центра фермента
Таким образом, полученный нами ферментативный препарат позволил изучить физикохимические и кинетические свойства МДГ, показать модифицирующее влияние nхлормеркурибензоата и диэтилпирокарбоната на существенные для катализа аминокислотные
остатки и рассчитать их количество в активном центре фермента.
182
Общая и функциональная биохимия
ГЕНЕРАЦИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НАНОЧАСТИЦАМИ ОКСИДА
ЖЕЛЕЗА И ИОНАМИ ЖЕЛЕЗА
Малина Ю.Ю., Машкина Ю.В., Рябченко Н.И., Рябченко В.И.
ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России; Институт атомной энергетики НИЯУ
«МИФИ»; ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России; ФГБУ МРНЦ
Минздравсоцразвития России, Обнинск (Россия)
malina.yulia@gmail.com
Особое внимание во многих исследованиях уделяется наночастицам (НЧ), полученным на
основе оксида железа, которые обладают магнитными свойствами, способны адсорбировать на
своей поверхности лекарственные препараты и направленно доставлять их к различным
органам и тканям.
Железо участвует в осуществлении многих важнейших биохимических процессов и
формировании активных центров окислительно-восстановительных ферментов. С другой
стороны, ионы железа катализируют химические реакции, в результате которых с участием
анион-радикала кислорода (реакция Хабера-Вейса), Н2О2 (реакция Фентона), а также
органических перекисей происходит образование активных гидроксильных радикалов OH•,
которые повреждают клеточные мембраны, ДНК, белки, липиды и являются химической
основой появления свободно-радикальных патологий.
Целью проведенных нами исследований является анализ участия НЧ Fe2O3 в генерации
активных форм кислорода (АФК). В качестве показателя генерации АФК использовали
флуоресцентный метод анализа (2,7-дихлорфлуоресцеин) появления флуоресцирующих
производных при воздействии на АФК. В качестве показателя появления ОН• использовали их
способность индуцировать при воздействии на дезоксирибозу (система Фентона) производных,
реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) и обладающих поглощением при 532 нм.
Методом соосаждения FeCl3 и FeSO4 в щелочной среде и последующей обработкой в качестве
суфрактанта олеиновой кислотой и Твин-80 получены диспергируемые в воде НЧ Fe2O3,
которые были использованы для сравнения с ионами Fe2+ и Fe3+ в их способности генерировать
АФК и OH•.
Полученные результаты показали, что ионы железа и НЧ Fe3O4 (конц. 0,01 мМ) приводят к
окислению дезоксирибозы. НЧ Fe3O4 генерируют в 3,6 раза меньше ОН•, чем ионы железа в той
же концентрации. В присутствии аскорбиновой кислоты ионы Fe2+ и НЧ Fe2O3 в концентрациях
0,04; 0,1 и 0,2 мМ индуцируют появление флуоресцирующих продуктов, концентрация которых
увеличивается по мере увеличения концентрации железа в реакционной среде. Сравнительный
анализ показал, что НЧ Fe3O4 по сравнению с ионами Fe2+ более эффективны в генерации АФК.
Показано, что меньшие концентрации наножелеза по сравнению с ионами железа в
соответствующих концентрациях, вызывают большее увеличение АФК. С увеличением
концентрации ионов железа, различия в генерировании АФК становятся менее заметными. Так,
в концентрации 0,04 мМ АФК, продуцируемые НЧ Fe3O4 выше на 70%, чем ионами железа; в
концентрации 0,1 мМ – на 70%; в концентрации 0,2 мМ – на 40%. Данная тенденция
сохраняется спустя 30 мин от начала эксперимента.
Полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что НЧ Fe2O3 способны
участвовать в реакциях генерации АФК и OH•, что необходимо учитывать при разработке
рецептур и методов их медицинского использования.
Работа выполнена при финансовой поддержке (грант № 12-04-97581-р_центр_а) РФФИ и
Правительства Калужской области.
МЕТАБОЛИЗМ ГЛИЦЕРИНА У RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS ЕК-1,
ACINETOBACTER CALCOACETICUS К-4 И NOCARDIA VACCINІI К-8
Мащенко О.Ю., Шулякова М.А., Пирог Т.П., Шевчук Т.А.
Национальный университет пищевых технологий; Институт микробиологии и
вирусологии (Украина)
maschencooksana@gmail.com
183
Общая и функциональная биохимия
С каждым годом увеличиваются объемы производства биодизеля, в результате чего в
избытке образуется технический глицерин и возникает необходимость его утилизации.
Решением этой проблемы является использование глицерина в технологиях микробного
синтеза для получения практически ценных продуктов, в том числе поверхностно-активных
веществ (ПАВ).
Ранее нами была показана принципиальная возможность интенсификации синтеза ПАВ
Rhodococcus erythropolis ЕК-1, Acinetobacter calcoaceticus К-4 и Nocardia vaccinii K-8 на смеси
глицерина и гексадекана. Однако для обеспечения максимальной конверсии углерода в целевой
продукт необходимо установление оптимального для его синтеза молярного соотношения
концентраций моносубстратов в смеси. Поскольку для осуществления таких расчетов
необходимо знать пути метаболизма соответствующих моносубстратов, целью данной работы
было исследование особенностей метаболизма глицерина у продуцентов ПАВ R. erythropolis
ЕК-1, A. calcoaceticus К-4 и N. vaccinii K-8.
Известно,
что
у
микроорганизмов
глицерин
может
превращаться
в
дигидроксиацетонфосфат двумя путями: через глицерин-3-фосфат и через дигидроксиацетон.
Ключевыми ферментами глицерин-3-фосфатного пути являются глицеринкиназа и глицерин-3фосфатдегидрогеназа или глицерин-3-фосфатоксидаза, а дигидроксиацетонового – НАД+- или
пиролохинолинхинон (ПХХ)-зависимая глицериндегидрогеназа и дигидроксиацетонкиназа.
У A.calcoaceticus К-4, R. erythropolis ЕК-1 и N. vacсinii К-8 обнаружена активность ПХХзависимой глицериндегидрогеназы. Учитывая широкую субстратную специфичность нитрозоN, N-диметиланилин(НДМА)-зависимых алкогольдегидрогеназ A. calcoaceticus К-4 и R.
еrythropolis ЕК-1, на следующем этапе изучали роль этих ферментов в окислении глицерина.
Было установлено, что у штаммов К-4, ЕК-1 и К-8 функционируют ферменты
дигидроксиацетонового пути: ПХХ-зависимая глицериндегидрогеназа, НДМА-зависимая
алкогольдегидрогеназа, осуществляющие окисление глицерина, и дигидроксиацетонкиназа.
При анализе активности ферментов глицерин-3-фосфатного пути у всех трех штаммов
выявлена достаточно высокая активность глицеринкиназы и НАД+-зависимой глицерин-3фосфатдегидрогеназы.
Как анаплеротические пути при росте на глицерине у R. erythropolis ЕК-1 функционирует
глиоксилатний цикл и фосфоенолпируват (ФЕП)-карбоксилазная реакция, а у A. calcoaceticus
К-4 и N. vacсinii К-8 – только ФЕП-карбоксилазная реакция.
Итак, катаболизм глицерина у штаммов К-4, ЕК-1 и К-8 до дигидроксиацетонфосфата
может осуществляться двумя известными путями. Полученные данные являются исходными
для проведения теоретических расчетов энергетических потребностей синтеза ПАВ и биомассы
для повышения уровня синтеза ПАВ A.calcoaceticus К-4, R. erythropolis ЕК-1 и N. vacсinii К-8 на
смеси ростовых субстратов.
ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОИМПУЛЬСНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА
БИОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И СОСТОЯНИЕ ПРО- И
АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ В КРОВИ КРЫС ПРИ ОКСИДАТИВНОМ
СТРЕССЕ, ВЫЗВАННОМ ОСТРОЙ ГИПОКСИЕЙ.
Вечканов Е.М., Сорокина И.А., Парибек И.М., Алилуев И.А., Лукаш А.И.
ФГАОУ ВПО ЮФУ
evechka@rambler.ru
В настоящее время оксидативный стресс считается главным фактором в развитии
патологических состояний. Острое гипоксическое воздействие с последующей реоксигенацией,
как правило, вызывает интенсивную генерацию активированных кислородных метаболитов с
широким
спектром
повреждающего
действия.
Воздействовать
на
активность
свободнорадикальных процессов и динамику равновесия системы прооксидантыантиоксиданты возможно как при помощи фармакологических препаратов, так и при
использовании немедикоментозных методов лечения, в связи с чем становится актуальным
применение новых методов элекронейростимуляции, в частности СКЭНАР – терапии
высокоамплитудными коротковолновыми низкочастотными электросигналами.
184
Общая и функциональная биохимия
Целью работы явилось комплексное исследование интенсивности перекисного окисления
липидов (ПОЛ) по уровню его молекулярныхпродуктов: малонового диальдегида (МДА),
шиффовых оснований (ШО), диеновых конъюгатов (ДК); оценка функционального состояния
мембран эритроцитов по уровню суммарной пероксидазной активности (СПА) и изучение
состояния антиоксидантной системы плазмы крови экспериментальных животных на примере
ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в условиях физиологической нормы, при
острой гипобарической гипоксии (ГПО) как типового патологического процесса и на фоне
применения СКЭНАР-терапии.
Эксперимент проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 200-220 г в возрасте
9 месяцев. Все подопытные животные были разделены на 6 группы: 1 группа – контроль –
интактные животные, содержащиеся на обычном рационе в стандартных условиях вивария; 2 и
3 группа – крысы, подвергнутые действию контролируемой ГПО в режиме 230 мм. рт. ст. в
течение 180 минут и декапитированные сразу и через сутки по окончании ГПО соответственно;
4 группа – крысы, которым в течение суток проводили сеанс СКЭНАР-воздействия; 5 группа –
животные, прошедшие предадаптацию путём СКЭНАР – обработки за сутки до ГПО (180 мин.,
230 мм. рт); 6 группа – животные, которым проводили постгипоксическую коррекцию с
помощью СКЭНАР-терапии в течение суток по окончании ГПО.
В процессе эксперимента в плазме крыс, предадаптированных СКЭНАР-воздействием и в
плазме животных, которым проводили постгипоксическую коррекцию были обнаружены
достоверные изменения показателей активности антиоксидантных ферментов (СОД и
каталазы); также после СКЭНАР-терапии в плазме крыс было зарегестрировано достоверное
уменьшение концентрации МДА, ДК, ШО, а уровень СПА приблизился к нормальных
значениям по отношению к животным с ГПО.
Таким образом, СКЭНАР-терапия, являясь электроимпульсным низкоинтенсивным
нейроподобным воздействием с обратной связью, оказывает мембранопротекторное действие,
активирует ключевые стресс – лимитирующие ферменты и купирует развитие гипоксического
состояния у экспериментальных животных.
ВЗАИМОСВЯЗЬ СЕЗОННОЙ ДИНАМИКИ ЛИПИДНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
ТКАНЕЙ РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ PARASALMO MYKISS (WALBAUM, 1792) С
РЕЖИМОМ КОРМЛЕНИЯ РЫБ
Назарова М.А., Васильева О.Б., Немова Н.Н.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии
Карельского научного центра Российской академии наук
marinamarina35@yandex.ru
Годовая динамика липидных показателей тканей рыб зависит от различных условий среды.
Одним из ведущих факторов, оказывающих влияние на вариабельность данных параметров,
является трофический. При этом важную роль играет не только качественный состав пищи, но
и режим кормления рыб, который включает в себя количество комбикорма и частота его
внесения, зависящая от температуры воды и темпов роста рыб. В данной работе проводилось
изучение влияния режима кормления на годовую динамику уровня общих липидов в мышцах,
печени и внутреннем жире культивируемой формы радужной форели Parasalmo mykiss
(Walbaum, 1792). Используя стандартные методы липидного анализа, определяли содержание
общих липидов (ОЛ), триацилглицеринов (ТАГ), фосфолипидов (ФЛ), холестерина (ХС),
эфиров холестерина (ЭХС).
В осенний период показано значительное возрастание содержания запасных и структурных
липидов во всех исследованных тканях форели, связанное с переходом на режим регулярного
многоразового кормления и, как следствие, активизацией ростовых процессов рыб в нагульный
период. Максимальный уровень структурных компонентов (ФЛ и ХС) во всех исследованных
органах зафиксирован в октябре, что может свидетельствовать не только об активизации роста
радужной форели в данный период, но и о преимущественном использовании экзогенных
липидов в пластическом обмене. Зимой, напротив, происходило уменьшение уровня всех
исследованных фракций липидов в мышцах, печени и внутреннем жире форели, которое,
185
Общая и функциональная биохимия
вероятно, определялось снижением количества внесенного корма и замедлением
метаболических процессов у рыб при низких температурах. После зимовки установлена
обратная корреляция концентрации ТАГ в мышцах и жировой ткани форели с количеством
внесенного корма (апрель – май), что, возможно, обусловлено увеличением двигательной
активности рыб, сопровождаемое усилением энергообмена и расходом запасных веществ.
Показано незначительное уменьшение концентрации ТАГ с июля по сентябрь в мышцах,
внутреннем жире и печени форели, связанное, вероятно, с тем, что в июле и августе кормление
рыб практически не осуществлялось из-за высокой температуры воды в данный период.
Таким образом, сезонная динамика уровня общих липидов и их индивидуальных фракций в
тканях радужной форели во многом определяется режимом кормления рыб.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 11-04-00167-а и
программы Президента РФ «Ведущие научные школы России» НШ № 1642.2012.4.
КАРДИОПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА
ОКТАРФИНА
Некрасова Ю.Н., Наволоцкая Е.В.
Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
nekr-jul@mail.ru
Пептидный гормон β-эндорфин наиболее активный и полифункциональный представитель
семейства опиоидных пептидов. Показано, что он взаимодействует с µ- и δ- и κ-опиоидными
рецепторами, а также с рецептором, нечувствительным к антагонисту опиоидных рецепторов,
налоксону. До настоящего времени структура и функции неопиоидного рецептора β-эндорфина
остаются малоизученными.
Мы определили участок в молекуле β-эндорфина, ответственный за связывание с
неопиоидным рецептором: им оказался фрагмент 12-19 (TPLVTLFK). Был синтезирован пептид
(авторское название - октарфин), соответствующий этой последовательности. Показано, что
меченный тритием октарфин ([3H]октарфина, удельная активность 28 Ки/моль) с высоким
сродством (Kd1 = 1,8 ± 0,2 нМ) и специфичностью связывался с неопиоидным рецептором βэндорфина мембран миокарда крысы. Спустя 24 часа после экспериментального инфаркта
миокарда (ЭИМ) сродство [3H]октарфина к рецептору снижалось (Kd2 = 3,6 ± 0,3 нМ).
Частичное восстановление способности рецептора связывать [3H]октарфин (Kd3= 2,2 ± 0,3 нМ)
наблюдалось при интраназальном введении крысам немеченого октарфина в дозе 20 мкг/кг
сразу после инфаркта.
В последующих экспериментах было показано, что при интраназальном введении
октарфина в дозе 2 и 20 мкг/кг один раз в сутки в течение 7 дней после ЭИМ происходит
нормализация электрокардиографических, морфометрических и биохимических показателей по
сравнению со сроком наблюдения до ЭИМ. Таким образом, октарфин обладает мощным
противоишемическим (улучшает коронарный кровоток и увеличивает сократительную
активность миокарда) и кардиопротективным действием (снижает интенсивность цитолиза
миокарда, интенсивность перекисного окисления липидов, способствует повышению уровня
антиоксидантной защиты). Полученные данные являются первым экспериментальным
доказательством участия неопиоидного рецептора β-эндорфина и его агониста, синтетического
пептида октарфина, в регуляции функций миокарда.
ЛЕКТИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ПОЛЫНИ
Нургалеева Э. З., Хайруллина Р. А., Усачев С. А.
ФГБОУ Башкирский государственный университет, Уфа (Россия)
nurgaleewa.elina@yandex.ru
Лечебное действие растений обусловлено наличием в их составе различных биологически
активных веществ, которые при поступлении в организм животного или человека проявляют
186
Общая и функциональная биохимия
физиологически активные свойства. Они имеют разнообразный состав и относятся к
различным классам химических соединений. Большинство лечебных соединений - это
органические вещества.
В настоящее время известно свыше 4 миллионов органических соединений, многие из них
имеют лечебные свойства. Наиболее важные из них - аминокислоты, углеводы, органические
кислоты, жирные и эфирные масла, смолы, фитонциды, ферменты, витамины, гликозиды,
фенольные соединения, алкалоиды, макро- и микроэлементы.
Многие авторы изучают выше перечисленные биологически активные соединения, но мало
известно о функциональной активности лектинов лекарственных растений. Лектины – это
белки неферментативной природы, относящиеся к классу гликопротеинов и обладающие
свойством специфично и обратимо связывать углеводные лиганды биополимеров без
изменения их ковалентной структуры. В качестве таких лигандов выступают рецепторные
структуры мембран клеток. Важнейшим функциональным свойством лектинов является
реакция агглютинации эритроцитов, а также способность к избирательному взаимодействию с
другими клетками крови.
На сегодняшний день многие авторы изучают химический состав эфирного масла полыни,
но мало кто касается лектинов полыни. Поэтому целью нашей работы являлось исследование
лектиновой активности различных видов полыни, которая относится к семейству
Сложноцветных.
Лектины выделяли из высушенных соцветий разных видов полыней ацетатным буфером
рН 3,8. Содержание лектинов в Artemisia balchanatrum и Artemisia taurica соответственно 2,4 и
6,4 мг/мл.
Также был проведен иммунохимический анализ белков полыни. Для этого мы провели
реакцию иммунодиффузии по Ухтерлони. Лектины полыни при проявлении антисывороткой на
лектины дягиля лекарственного дают одну линию преципитации. Три и наибольшее число
линий преципитации обнаружено у полыни горькой. Здесь при проявлении гетерологичной
сывороткой выявляется три линии преципитации, доказывая наличие антигенной близости этих
культур.
С другой стороны, в спектре трех других видов полыни проявляется по две и одной линии
преципитации, что позволяет предположить об органной и видовой специфичности лектинов
изученных видов.
ДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНА НА ФОСФОЛИПИДНЫЙ СОСТАВ ФРАКЦИИ
ХРОМАТИНА КЛЕТОК ТИМУСА КРЫС
Оганесян А.Г., Акопян Н.Р., Явроян Ж.В., Геворкян Э.С.
Ереванский государственный университет
agapi@parliament.am
Хорошо известно, что липиды ядер локализованы не только в ядерной оболочке.
Определенное их количество обнаруружено также во внутриядерных структурах, таких, как
ядерный матрикс и хроматин. Наличие в хроматине «своего», не организованного в
мембранные структуры, постоянного липидного компонента предполагает его участие в
основных функциях ядра - репликации ДНК и транскрипции. Содержание липидов, как
минорных компонентов хроматина, значительно меняется в зависимости от функционального
состояния клетки. Например, при опухолеобразовании наблюдается изменение содержания и
состава хроматиновых липидов.
Показано, что активно транскрибирующий хроматин содержит в 5 раз больше липидов,
чем репрессированный. Установлено также, что липиды в зависимости от концентрации
оказывают стабилизирующее или дестабилизирующее действие на молекулу ДНК. Вместе с
тем известно, что основной мишенью противоопухолевого препарата цисплатина является
молекула ДНК. Неисключено также участие липидов, прочно связанных с молекулой ДНК в
реализации проапоптических эффектов цисплатина. В связи с этим, представляется интересным
изучение фосфолипидного состава хроматина печени крыс после 24 часового in vivo
воздействия противоопухолевого препарата цисплатина.
187
Общая и функциональная биохимия
Полученные результаты свидетельствуют о наличии пяти фракций фосфолипипидов в
препаратах хроматина тимуса крыс, 4 из которых проявляют чувствительность к цисплатину.
Так, после воздействия цисплатина наблюдается разнонаправленное изменение содержания
двух холин-содержащих фосфолипидов. Повышение содержания сфингомиелина примерно на
25% сопровождается сокращением количества фосфатидилхолина на 15%. Примерно на 13%
уменьшается содержание фосфатидилинозитола, а количество фосфатидилэтаноламина не
меняется. Особый интерес вызывает повышение на 15% содержание кардиолипина, который,
как известно активно участвует в ингибировании топоизомераз I и II. Это происходит в
результате прямого взаимодействия кардиолипина с щелочным белком фермента, благодаря
чему блокируются места связывания ДНК с ферментом. Наблюдаемые сдвиги позволяют
предпологать о возможной причастности фосфолипидов к механизмам реализации эффектов
цисплатина.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
НАНОРАЗМЕРНОГО ПОЛИМЕРА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНОГО АДЬЮВАНТА
ДЛЯ СОЗДАНИЯ ВАКЦИН
Олийнык А.В., Козак М.Р., Влизло В.В., Москвин М.М., Заиченко А.С.
Институт биологии животных НААН Украины; Национальный университет
«Львовская политехника», Львов (Украина)
lucaspulsar@gmail.com
В медицинской практике используют вакцины только с 2 адъювантами – алюминий
гидроксидом и алюминий фосфатом. Каждый из них имеет ряд недостатков (сенсибилизация
организма к соединениям алюминия, риск развития болезни Альцгеймера). Поэтому создание
эффективных и безопасных вакцин на основе веществ, обладающих адъювантным свойствами перспективное направление медицины, клинической биохимии и ветеринарии.
Целью наших исследований был поиск полимерных соединений, которые способны
усиливать иммунный ответ на антиген, при этом не вызывая токсического воздействия на
организм. Исследуя физико-химические свойства полимеров различной химической природы
было установлено, что полимер с кодовым названием МГ-4, благодаря своей структуре и
наличию эпоксидных групп способен адсорбировать и связывать белок. Это было
подтверждено с помощью турбидиметрического титрования и электрофореза в 10%
полиакриламидном геле в нативных условиях. Размер частиц этого полимера составлял 820±10
нм. При взаимодействии полимера с белком овальбумином величина частиц уменьшалась и
составляла 700±10 нм, что свидетельствует о компартменизации частиц.
Проведя биологические исследования было установлено, что полимер МГ-4 в
концентациях 3 мг/мл, 2 мг/мл и 1 мг/мл не вызывает гибели лабораторных животных.
Клинические показатели концентрации глюкозы, гемоглобина, мочевины и уровень общего
белка крови подопытных животных по сравнению с контрольной группой существенно не
изменялись. Аллергических реакций на исследуемое вещество, а также летальных исходов не
было. В результате гистоморфологического исследования тканей после введения полимера МГ4 патологических изменений не обнаружено.
Полученные данные свидетельствуют о том, что полимер МГ-4 способен связывать белок,
при этом токсического влияния на лабораторных животных не обнаружили. Целью будущих
исследований будет подтверждение адьювантных свойств исследуемого наноразмерного
полимера.
ЭФФЕКТ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПЕРОКСИРЕДОКСИНОВ НА
АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА КРЫС
Палутина О.А., Карадулева Е.В., Шарапов М.Г.
Институт биофизики клетки РАН, Пущино (Россия)
Olesia-alis@rambler.ru
188
Общая и функциональная биохимия
Решение проблем, связанных со снижением негативных последствий окислительного
стресса в сердце имеет большое значение при различных операциях на сердце, а также при его
трансплантации. Одним из способов борьбы с повреждающим действием свободных радикалов
является применение антиоксидантов, таких как пероксиредоксины.
В данной работе изучалось воздействие Protein transduction domain (PTD)модифицированных пероксиредоксинов на антиоксидантный статус сердца. В качестве модели
использовалась реперфузия изолированного сердца крыс раствором пероксиредоксинов.
При введении перекиси водорода в аорту изолированного сердца наблюдалось резкое
возрастание пульса и уменьшение разницы давления между систолой и диастолой, причем этом
эффект развивался в течение первой минуты. Предварительная реперфузия сердца раствором
пероксиредоксина (как обычного, так и PTD-модифицированных) не изменяет частоту
сокращения изолированного сердца. Последующее введение экзогенной перекиси водорода
практически не влияет на сердцебиение и разницу давления между систолой и диастолой. Это
означает, что действие различных пероксиредоксинов (как обычного, так и PTDмодифицированных) значительно снижает вызванное перекисью водорода перекисное
окисление
липидов.
Было
отмечено,
что
адсорбция
PTD-модифицированных
пероксиредоксинов несколько выше, чем у нативного. Это может быть связано с повышенной
способностью PTD-модифицированных пероксиредоксинов проникать внутрь клеток, а также с
высокой степенью их сорбции на мембранных структурах, вследствие увеличения
положительного заряда молекул данных белков.
С целью выявления локализации экзогенных пероксиредокинов в тканях разных отделов
сердца был проведен иммуноблотинг экстрактов мышечной ткани после реперфузии. Было
отмечено, что наиболее эффективное включение пероксиредоксинов наблюдается в
предсердиях по сравнению с желудочками сердца. Иммуногистохимические исследования
показали, что модифицированные пероксиредоксины обнаруживаются в кровеносных сосудах
сердца, в областях, примыкающих к соединительной ткани и клеткам миокарда. Важно
отметить, что исследуемые белки адсорбируются в тех же местах, в которых локализован
эндогенный пероксиредоксин, тем самым существенно повышая антиоксидантный статус
сосудов и прилегающих к ним тканей сердца.
Таким образом, как нативный, так и PTD-модифицированные пероксиредоксины могут
быть эффективными протекторами против перекисного окисления липидов клеток миокарда,
снижая уровень окислительного стресса в сердце.
Работа поддержана грантом Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ ИММУНОГЕНЕЗА И
РОЛИ СИГНАЛЬНОЙ ТРАНСДУКЦИИ В СТРЕССОВОМ ОТВЕТЕ МЫШЕЙ
НА НИЗКИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ АММИАКА
Парфенюк С.Б., Глушкова О.В., Хренов М.О., Новоселова Т.В., Лунин С.М.
Новоселова Е.Г.
Институт биофизики клетки РАН, Пущино (Россия)
lana_kras@mail.ru
Изучали влияние четырех ингибиторов сигнальных каскадов NF-κB, SAPK/JNK и
рецептора TLR4 (Inhibitor XII, SP600125, CLI-095 и OxPAPC) на ответ макрофагальных клеток
RAW 264.7 при их культивировании в присутствии малой дозы аммония. Судя по увеличению
продукции ряда цитокинов, таких как ФНО-α, ИФН-γ и ИЛ-6, низкая концентрация аммония
вызывала провоспалительный ответ клеток, при этом была показана активация сигнальных
каскадов NF-κB и SAPK/JNK, а также увеличение экспрессии рецептора TLR4. Каждый из
использованных ингибиторов в той или иной степени редуцировал провоспалительный ответ
клеток RAW 264.7 на химический токсин путем снижения продукции цитокинов. При этом
наиболее заметным был эффект ингибитора активности каскада NF-κB (IKK Inhibitor XII),
который не только предотвращал развитие провоспалительного ответа клеток на добавление
аммония, но и снижал продукцию цитокинов ниже контрольного уровня. Почти столь же
эффективным противовоспалительным действием обладал ингибитор экстраклеточного домена
189
Общая и функциональная биохимия
рецепторов TLR2 и TLR4 (OxPAPC), а добавление в среду культивирования клеток ингибитора
каскада JNK (SP600125) практически полностью нейтрализовало действие ионов аммония
через снижение продукции цитокинов до контрольного уровня.
ВЛИЯНИЕ ТЯЖЁЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ
ФЕРМЕНТОВ МИДИИ (MYTILUS EDULIS L.)
Пархомук М.М.1, Крупнова М.Ю.2
1
Петрозаводский государственный университет; 2Институт биологии Карельского
научного центра РАН, Петрозаводск (Россия)
biohimik87@yandex.ru
Все возрастающее антропогенное загрязнение различных экосистем, в том числе морских,
делает актуальным изучение механизмов воздействия тяжелых металлов на организмы.
Токсичность тяжелых металлов, в основном, определяется их действием на ферментативную
активность. Одними из наиболее удобных объектов для изучения влияния ксенобиотиков, в том
числе тяжелых металлов,признаны морские беспозвоночные. Важные характеристики мидий
как объектов токсикологических исследований - высокая способность к аккумуляции
загрязнителей из среды в тканях, короткие пищевые цепи, а так же способность производить на
единицу массы своего тела большее количество белка, чем представители других видов с более
высоким трофическим уровнем. Весьма показательными для оценки токсической нагрузки на
организм являются лизосомальные протеиназы, такие как катепсины. В связи с этим целью
нашего исследования явилось изучение влияния различных концентраций меди и кадмия на
изменение активности катепсинов B и D в жабрах и гепатопанкреасе мидий Mytilus edulis L.
В ходе проведенного эксперимента обнаружено, что при разных разведениях изученных
металлов и в зависимости от органа, наблюдаются различные реакции активности
лизосомальных протеиназ. Более явные изменения обнаружены в гомогенатах жабр (медь активность катепсина В при 250мкг/л, активность катепсина D при 5мкг/л, кадмий - активность
катепсина В при 10, 100, 500 мкг/л). В гепатопанкреасе, в связи с тем, что активность
катепсинов выше в структурах с более интенсивным белковым обменом, активация протеиназ
отмечена уже при низкой концентрации ионов изученных металлов.
Ингибирование цистензависимых ферментов (катепсин В) не только снижает скорость
белкового обмена и реакций, регулируемых этими ферментами, но и подавляет защитную роль
лизосом, т.к. известно, что ферменты лизосом принимают участие в процессах экскреции и
детоксикации низких доз катионов тяжёлых металлов.
Данные, полученные в ходе выполнения данного исследования, подтверждают, что
протеолитические ферменты играют важную роль в процессах адаптации внутриклеточного
метаболизма к изменяющимся условиям внешней среды.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
(ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ) НА ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ ТОЧКУ
БЕЛКОВ
Пестерева А.А., Банкина А.Н., Бриллиантова Е.Ю., Чухно А.С.
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, Санкт
Петербург (Россия)
anuta-0792@mail.ru
Изучение систем содержащих белки, представляет интерес, как с теоретической, так и с
практической точек зрения. Отличительной особенностью таких систем является
специфический характер сорбции на белках органических соединений ввиду сложного состава
и строения их молекул. Нередко процесс сорбции сопровождается изменением их
конформации, реакциями химической конденсации и поверхностного комплексообразования с
активными центрами сорбентов. Специфический характер сорбции органических соединений
190
Общая и функциональная биохимия
влияет на изоэлектрическую точку (ИЭТ). Большинство фармацевтических препаратов в
настоящем времени представляют собой гетероциклические соединения. Спектр их действия
невероятно велик: от лечения туберкулеза до облегчения головной боли.
Целью данной работы является выявление закономерности смещения ИЭТ белка в
растворах лекарственных средств, производных азотсодержащих гетероциклов.
Для исследования были выбраны лекарственные средства: барбитуровая кислота,
метронидазол, фуразидин, дибазол, проксифеин, фтивазид, этиразол, фталазол антибиотики
пенициллинового ряда. В качестве белков были взяты альбумин (водорастворимый
глобулярный белок входит в состав молока, сыворотки крови, цитоплазмы клеток),
желотиноль, желатина (продукт гидролиза белка коллагена). Для создания различных рН
использовались растворы HCl и KOH.
В работе определялись ИЭТ методом вискозиметрии, по степени набухания,
макроэлектрофорезом. Измерения проводились по стандартной методике. По построенным
графикам зависимости степени набухания и вязкости рН наблюдали смещение ИЭТ в кислую
область (у некоторых препаратов), что говорит о специфической сорбции анионов на белке и в
основную область, что говорит о взаимодействии катиона азотсодержащего гетероцикла с
белком.
СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА ЦИКЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ ПРИ
УСЛОВИЯХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО РОСТА И ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ
Раецкая Я.Б., Химич Н.В., Остапченко Л.И.
Институт биологии Киевского национального университета им. Тараса Шевченка, Киев
(Украина)
raetska@yandex.ru
В последнее время лечения злокачественных новообразований основывается на
индивидуальном подходе к выбору методов. Радиотерапия остается одним из главных методов
лечения злокачественных новообразований, наряду с хирургическим и химиотерапевтическим
лечением. Существует ряд работ, о ходе биохимических процессов при злокачественном росте
и в условиях радиотерапии, но те механизмы, которые функционируют в процессах передачи
сигналов в клетке, остаются мало исследованными.
Целью данной работы было выяснение молекулярных механизмов трансдукции сигналов в
клетках различного происхождения при развитии карциномы Герена, локальном рентгеновском
облучении животных в терапевтических дозах.
В опытах использовали белых лабораторных крыс-самцов массой 130±10 г, (разведение
вивария УНДИОР), содержавшихся на стандартном рационе вивария. Животным
трансплантировали карциному Герена путем подкожной инъекции в область бедра задней
конечности 20%-ной суспензии опухолевых клеток на 0,9% растворе NaCI, полученных от
крысы-донора. При исследовании молекулярных механизмов трансдукции сигнала опухоль на
8-е сутки после прививки подвергали локальному рентгеновскому облучению в
терапевтических дозах на аппарате РУМ - 17. Животных декапитировали через 1, 3 и 7 суток
после локального облучения.
Аденилат-и гуанилатциклазы, а также ФДЭ цГМФ и цАМФ являются ключевыми
ферментами сигнальной системы циклических нуклеотидов. Нарушение их функционирования
влияет на развитие патологических процессов. Показано двукратное уменьшение активности
АЦ в селезенке, тимусе и опухоли по сравнению с контролем как в условиях развития
патологии, так и на фоне облучения. Активность ГЦ увеличивалась во все сроки после
облучения. Изменения активности ФДЭ цАМФ в исследуемых органах имели
разнонаправленный характер: так, в начальные сроки исследований во всех органах активность
фермента снижалась в сравнении с контрольными значениями, в конечные сроки после
облучения активность ФДЭ цАМФ незначительно повышалась в лимфоидных и опухолевых
клетках. Активность ФДЭ цГМФ в селезенке и тимусе уменьшалась незначительно, в основном
на 3-ю и 7-е сутки после облучения.
191
Общая и функциональная биохимия
Итак, радиотерапия на определенном этапе динамики развития опухолей приводит к
нормализации биохимических показателей клеточного метаболизма. Количественные
изменения активности ферментов синтеза и гидролиза и тех, которые катализируют
завершенные этапы прохождения сигналов, удостоверяющих участие регуляторных систем в
формировании адаптационных реакций на повреждающее влияние злокачественного роста и
радиации. Полученные результаты могут быть использованы для диагностики злокачественных
и доброкачественных новообразований.
ЦИКЛОСПОРИН А-ЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ СТИМУЛЯЦИЯ ДЫХАНИЯ
МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ α,ω-ТЕТРАДЕКАНДИОЛОВОЙ КИСЛОТОЙ БЕЗ
УЧАСТИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ
Рыбакова С.Р., Дубинин М.В., Самарцев В.Н.
ФГБОУ ВПО «Марийский государственный университет», Йошкар-Ола (Россия)
snezhar@yandex.ru
Свободные длинноцепочечные жирные кислоты играют важную роль в окислительном
метаболизме как эффективные природные разобщители окислительного фосфорилирования.
Важной физиологической функцией этого так называемого «мягкого» разобщения у
млекопитающих является продукция тепла для поддержания необходимой температуры тела, а
также снижение в митохондриях генерации токсичных активных форм кислорода.
Естественными метаболитами монокарбоновых жирных кислот являются α,ω-дикарбоновые
(диоловые) жирные кислоты, образующиеся в клетках печени путем их ω-окисления.
Наше внимание привлекла одна из дикарбоновых жирных кислот – α,ωтетрадекандиоловая кислота (ТДК). Ранее О.В. Марковой и В.Н. Самарцевым было
установлено, что стимуляция дыхания митохондрий печени ТДК не сопровождалось
снижением мембранного потенциала. Вместе с тем, полученные данные не позволяют
достаточно четко объяснить механизм стимуляции дыхания митохондрий дикарбоновыми
жирными кислотами. В частности, остается не изученным, как влияет ТДК на окислительный
синтез АТР в митохондриях печени.
В результате проведенных исследований стало известно, что ТДК в концентрации 400 мкМ
увеличивает скорость дыхания митохондрий печени на 80%. Последующее добавление к
митохондриям циклоспорина А в концентрации 10 мкМ приводит к ингибированию дыхания
до исходного уровня. В том случае, если циклоспорин А был добавлен к митохондриям в
начале, стимуляции дыхания не наблюдалась.
Установлено, что ТДК не влияет на дыхание митохондрий в активном метаболическом
состоянии (состояние 3), но в два раза увеличивает скорость дыхания в состоянии 4. При этих
условиях ТДК в два раза уменьшает коэффициент дыхательного контроля, но при этом не
влияет на коэффициент ADP/O. Согласно литературным данным, действие классических
разобщителей-протонофоров заключается в стимуляции дыхания в состоянии 4 и в снижении
коэффициента дыхательного контроля так и коэффициента ADP/O. Аналогичным действием на
окислительное фосфорилирование обладают и монокарбоновые жирные кислоты.
Следовательно, действие ТДК отличается как от действия классических разобщителейпротонофоров, так и от действия монокарбоновых жирных кислот.
Вместе с тем, полученные результаты позволяют говорить о том, что имеется и общее в
механизме действия моно- и дикарбоновых жирных кислот. По-видимому, составляющая
разобщающего действия монокарбоновых жирных кислот чувствительная к циклоспорину А и
разобщающее действие дикарбоновых жирных кислот осуществляются по одному и тому же
механизму.
192
Общая и функциональная биохимия
МЕТАЛЛ-СВЯЗЫВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ СЫВОРОТОЧНОГО
АЛЬБУМИНА И ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКИ
МОДИФИЦИРОВАННОГО АЛЬБУМИНА
Рякшина А.В., Литус Е.А.
Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград (Россия)
mbf2012@yandex.ru
В первой половине 1990-х было обнаружено, что способность альбумина связывать многие
двухвалентные катионы, в частности меди, никеля или кобальта, снижается при его контакте с
ишемизированной тканью. Связывающая способность представляет интерес для изучения, так
как на основе анализа её изменения при окислении возможна разработка диагностических
тестов. В свое время был разработан тест для определения ишемически модифицированного
альбумина (ИМА), основанный на определении кобальт-связывающей способности сыворотки
крови. За время применения этого теста в лабораторной медицине было накоплено достаточное
количество противоречивых данных, создающих существенные проблемы при его клинической
интерпретации.
В настоящее время имеются данные о четырех металл-связывающих сайтах в молекуле
альбумина: сайт, расположенный в N-конце, сайт А, включающий His-67, сайт В, и сайт,
включающий Cys-34. В 2006 году появились данные о том, что связывание кобальта с сайтом,
расположенным в N-конце молекулы альбумина, происходит только после заполнения сайтов А
и В. Появились свидетельства, что изменение металл-связывающей способности ИМА может
быть связано не только со структурными изменениями в результате его окислительной
модификации, как это считалось ранее. В настоящее время нет чётких доказательств
определенных структурных особенностей альбумина, изменённого в результате окислительной
модификации при ишемизации миокарда, как до сих пор сам ИМА не был выделен в
очищенном виде. Возможно, что возникающие при ишемии миокарда и других тканей
изменения функциональных свойств сывороточного альбумина могут определяться его
взаимодействием с другими соединениями.
Целью нашей работы была оценка взаимовлияния различных катионов на кобальтсвязывающую способность сывороточного альбумина.
Основные результаты. Нами было установлено, что существует выявляемая зависимость
между кобальт- и никель-связывающей способностью альбумина. Выявлено, что у альбумина
никель-связывающая способность ниже, чем кобальт-связывающая. Показано, что присутствие
кальция в реакционной смеси может влиять на никель- и кобальт-связывающую способность
альбумина. Повышение концентрации приводит к пропорциональному монотонному
ослабления связывания кобальта. В то же время, эффект кальция на связывание никеля носил
двухфазный характер.
ОЧИСТКА И НЕКОТОРЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ И КИНЕТИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ФУМАРАТГИДРАТАЗЫ ИЗ ЩИТКОВ КУКУРУЗЫ
Селиванова Н.В., Федорин Д.Н., Селезнева Е.А., Махмуд Али С
Воронежский государственный университет
Peachlena@rambler.ru
Растения представляют собой сложный взаимосвязанный организм, работу которого, на
ряду со многими факторами, регулируют ферменты. Поскольку растительные организмы в
процессе развития характеризуются физиологическим переходом, очень важно изучать
механизм регуляции этого процесса для создания целостной картины генезиса метаболических
процессов при прорастании семян. Одну из ключевых ролей в данном процессе может
принимать фумаратгидратаза. Фумараза является маркерным ферментом ЦТК и митохондрий,
поэтому его регуляция связана с функционированием всего метаболического цикла клетки.
Поэтому очень важно исследовать различные способы регуляции фермента, что позволит
осуществлять тонкий контроль за скоростью работы митохондрий в целом и цикла Кребса в
частности.
193
Общая и функциональная биохимия
Для того, чтобы понять функциональную роль фумартгидратазы, необходимо исследовать
влияние различных кинетических параметров на неё. Объектом исследования служили щитки
4-х дневных прорастающих семян кукурузы. Активность фермента определяли
спектрофотометрически при 240нм. Для получения гомогенного ферментативного препарата
нами была проведена 4-х стадийная очистка исследуемого энзима из щитков кукурузы.Элюцию
с ДЭАЕ-целлюлозой осуществляли линейным градиентом KCl. Применение такой схемы
очистки позволило получить митохондриальную форму фумаразы из щитков кукурузы в
гомогенном состоянии.
Исследование митохондриальной формы фумаратгидратазы позволило установить, что она
сходна с ферментативными прапаратами из других объектов исследования по регуляторным и
кинетическим характеристикам. Нами было изучено влияние различных концентраций ионов
водорода на активность изоформ фумаразы. Исследования показали, что зависимость
активности митохондриальной формы фумаратгидратазы от концентрации ионов водорода
имеет колоколообразный характер, при этом оптимальным значением концентрации ионов
водорода для работы фермента является 7,2.
Кроме того, выявлено, что активаторами работы митохондриальной формы фумаразы
выступают ионы магния, а другие двувалентные катионы не проявляют модулирующего
действия на данный фермент. При этом катионы магния могут связываться с субстратом или
активным центром фермента и образовывать так называемый «истинный субстрат».
Таким образом, нами был получен гомогенный препарат фумаратгидратазы из щитков
кукурузы и исследованы некоторые его свойства. Установлено, что основные кинетические
регуляторные
характеристики
митохондриальной
фумартгидратазы
сходны
с
ферментативными препаратами из других источников. Показана зависимость активности
исследуемого фермента от содержания катионов магния и других двувалентных катионов, а
также выявлено оптимальное значение pH среды.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ СТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ
АРГИНИНА НА АГРЕГАЦИЮ БЕЛКОВ
Смирнова Е.Ю., Гурвиц Б.Я.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им.
А.Н. Баха Российской академии наук
smeu1989@mail.ru
Предотвращение стресс-индуцируемой агрегации белков или рефолдинг белков из
агрегированного состояния после снятия денатурирующего воздействия во многих случаях
осуществляются с помощью введения в среду низкомолекулярных добавок. Аргинин является
наиболее часто применяемым агентом. Однако молекулярные механизмы действия аргинина
окончательно не выявлены и их исследования в настоящее время представляются весьма
актуальными.
В данной работе с использованием методов динамического лазерного светорассеяния и
спектрофотометрии получены новые парадоксальные данные, свидетельствующие о том, что
добавление аргинина в инкубационную среду, содержащую модельный субстрат aлактальбумин коровьего молока (14.2 кДа, pI 4.8), агрегирующий под действием
дитиотреитола, приводит к значительному ускорению агрегации белка. Этот результат
противоречит общепринятому мнению о том, что аргинин является универсальным
шапероноподобным агентом, тормозящим агрегацию белков. При сопоставлении кривых
зависимостей величины интенсивности светорассеяния и значения гидродинамического
радиуса (Rh) агрегатов от времени, обнаружено, что аргинин в концентрации 50 – 100 мМ
вносит изменения в кинетический режим агрегации белкового субстрата (1 мг/мл).
Наблюдается увеличение значения Rh и интенсивности светорассеяния, но снижение
продолжительности лаг-периода. Эффект зависит от концентрации аргинина и времени его
добавления после начала агрегации. При концентрации аргинина, превышающей 200 мМ,
наблюдается обратное действие аргинина, т. е. торможение агрегации субстрата. С помощью
трансмиссионной электронной микроскопии продемонстрирована трансформация формы и
194
Общая и функциональная биохимия
размера высокоструктурированных агрегатов α-лактальбумина, образование которых
индуцируется под действием низких концентраций аргинина. В отсутствие аргинина
наблюдали формирование лишь аморфных агрегатов. Поскольку при использовании в качестве
субстратов щелочного белка лизоцима куриного яйца (pI 11), или рекомбинантного инсулина
человека (pI 6.9) процесс агрегации не ускоряется в присутствии аргинина, предположено, что
в основе наблюдаемых эффектов аргинина лежат электростатические взаимодействия между
гуанидиновой группой аминокислоты и отрицательно заряженными аминокислотными
остатками белка.
Полученные результаты следует учитывать при использовании аргинина в качестве
добавки с целью повышения выхода биологически активных рекомбинантных белков в
биотехнологическом процессе. Представляется также возможным применение аргинина для
структурирования белковых агрегатов с заданными свойствами, что актуально при решении
нанотехнологических и медицинских задач.
Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и
Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 11-04-00932-а).
ВЛИЯНИЕ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА 90 (HSP90) НА МИГРАЦИЮ КЛЕТОК
ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА (A172) IN VITRO
Снигирева А.В., Врублевская В.В., Моренков О.С.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики
клетки РАН
snigireva.s@gmail.com
Белки теплового шока семейства 90 (HSP90) обнаружены во всех живых клетках и
выполняют множество внутриклеточных функций: отвечают за фолдинг и деградацию белков,
участвуют в стабилизации мультимолекулярных комплексов, играют важную роль в клеточной
сигнализации и регуляции клеточного цикла. Недавно было показано, что HSP90
обнаруживается на поверхности плазматических мембран и во внеклеточном пространстве.
Установлено, что экстраклеточный HSP90 стимулирует инвазию опухолевых клеток in vitro и
метастазирование ряда экспериментальных опухолей мышей. Целью работы было изучение
влияния нативного HSP90 на миграцию клеток глиобластомы человека (А172) in vitro.
Нативный HSP90 очищали из мозга мыши и быка с использованием ранее разработанного
метода на основе тиофильной хроматографии. Чистота препарата HSP90 составляла не менее
97% согласно данным SDS-электрофореза в полиакриламидном геле. Для оценки влияния
HSP90 на миграцию клеток in vitro использовали метод измерения скорости зарастания
поврежденного участка монослоя клеток. Для этого, на сформированном монослое удаляли
участок клеток, проделывая борозду шириной около 200 мкм. После этого клетки помещали в
обедненную среду, содержащую 0,1% сыворотки, и инкубировали при температуре +37°C в
присутствии 5% CO2. Для контроля миграции клеток, через 2, 4 и 6 ч проводили
фотографирование и последующее определение площади зарастающего монослоя. Изменения
скорости миграции клеток в присутствии HSP90 в среде в различных концентрациях
сравнивали с контрольным образцом без HSP90.
Препараты HSP90 не обладали токсичностью в используемых в экспериментах
концентрациях. Мышиный и бычий нативные HSP90 стимулировали миграцию клеток А172.
При концентрации HSP90 0,1 мг/мл скорость миграции клеток была достоверно выше на
18±4% в сравнении с контрольным образцом. В отдельных экспериментах стимулирование
миграции клеток наблюдали при концентрации HSP90 0,01 мг/мл.
Полученные результаты свидетельствуют о стимулировании миграции глиобластомы
человека под действием нативных HSP90, и согласуются с данными других авторов,
исследовавших влияние HSP90 на инвазию опухолевых клеток. С учетом стимулирующей роли
HSP90 в поддержании инвазивности опухоли, ингибирование экстраклеточного HSP90
представляется перспективным направлением в создании нового класса противоопухолевоых
препаратов, способных блокировать метастазирование опухолей.
195
Общая и функциональная биохимия
ВЛИЯНИЕ Cu2+ НА СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS ИМВ Ас-5017 НА РАЗЛИЧНЫХ СУБСТРАТАХ
Софилканич А.П., Филюк И.В., Антонюк С.О., Пирог Т.П.
Национальный университет пищевых технологий
anmo_july@mail.ru
Ранее установлена способность Rhodococcus erythropolis ИМВ Ас-5017 синтезировать
поверхностно-активные вещества (ПАВ) при культивировании на гидрофильных и
гидрофобных субстратах: н-гексадекане, жидких парафинах, этаноле, глюкозе, глицерине. В
дальнейших исследованиях была показана возможность интенсификации синтеза ПАВ и при
внесении в среду с этанолом (н-гексадеканом, глицерином) органических кислот,
использовании смешанных ростовых субстратов и масштабировании процесса на
ферментационное оборудование.
Цель данной работы – исследовать рост и синтез ПАВ при культивировании R. erythropolis
ИМВ Ас-5017 на средах с различными источниками углерода в присутствии катионов меди.
В качестве источника углерода и энергии использовали этанол, н-гексадекан, жидкие парафины
(С10-С18), а также подсолнечное масло в концентрации 2% (по объему). При культивировании
штамма ИМВ Ас-5017 на среде с подсолнечным маслом в среду дополнительно вносили 0,1%
глюкозы. В начале процесса культивирования, в экспоненциальной и стационарной фазе роста
R. erythropolis ИМВ Ас-5017 в среду вносили Сu2+ (0,01-0,1 мМ) в виде 1М раствора
CuSO4•5H2O.
Показано, что при добавлении 0,01 мМ Сu2+ в экспоненциальной фазе роста R. erythropolis
ИМВ Ас-5017 на среде с этанолом наблюдали увеличение условной концентрации ПАВ на 25%
по сравнению с культивированием штамма на среде без Сu2+. Внесение 0,01 мМ Сu2+ в
стационарной фазе роста R. erythropolis ИМВ Ас-5017 на среде с этанолом или повышение
концентрации катионов меди до 0,05 мМ не сопровождалось каким-либо существенным
изменением показателей роста и синтеза ПАВ.
Установлено, что клетки, растущие на н-гексадекане или подсолнечном масле, оказались
устойчивыми к более высоким концентрациям катионов меди, а стимуляция синтеза ПАВ была
более существенной, чем на этаноле. Так, внесение 0,1 мМ Сu2+ в экспоненциальной фазе
роста R. erythropolis ИМВ Ас-5017 на среде с н-гексадеканом или подсолнечным маслом
сопровождалось увеличением условной концентрации ПАВ на 40-42% по сравнению с
культивированием бактерий на средах без Сu2+.
Известно, что окисление н-гексадекана у штамма ИМВ Ас-5017 осуществляется
трехкомпонентным алкангидроксилазным комплексом, состоящим из растворимой НАДНрубредоксинредуктазы, растворимого рубредоксина и мембрансвязанной монооксигеназы, или
алкангидроксилазы (АлкБ). Мы предположили, что интенсификация синтеза ПАВ обусловлена
стимулирующим действием катионов меди на активность алкангидроксилазы. Эксперименты
показали, что в присутствии 0,05 и 0,1 мМ Cu2+ активность алкангидроксилазы повышалась в
1,5 и 2 раза соответственно.
Таким образом, в результате проведенной работы установлена возможность
интенсификации синтеза ПАВ R. erythropolis ИМВ Ас-5017 на гидрофобных (н-гексадекан,
жидкие парафины, подсолнечное масло) и гидрофильных (этанол) субстратах при внесении
катионов меди в экспоненциальной фазе роста продуцента.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДИПЕПТИДОВ ДЛЯ ХИМИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ
СТРЕССОВЫХ СОСТОЯНИЙ УРБАНИСТИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ
Сунчаляев Р.Н., Рогачева С.М.
Саратовский государственный технический университет им. Гагарина Ю.А.
sunchalyaev.r.n@gmail.com
Известно, что дистресс, т.е. отрицательный стресс, формирующийся в результате
производственных (урбанистических) нагрузок, существенно влияет на психоэмоциональный
статус человека, вызывая панические, маниакально-депрессивные, конвульсивные состояния, в
196
Общая и функциональная биохимия
результате чего резко снижается эффективность его деятельности. Для устранения негативных
последствий стресса, коррекции вышеперечисленных состояний в настоящее время
используются антидепрессанты различного механизма действия, в большинстве своем
обладающие побочными эффектами. Огромный интерес в качестве антидепрессантов
представляют препараты на основе аминокислот - медиаторов ЦНС, в частности пептиды.
Пептидные вещества могут обладать высоким сродством к органам-мишеням, устойчивостью
во внутренних средах организма, эффективностью действия в малых дозах и не вызывать
побочных реакций.
Целью работы являлась оценка эффективности использования дипептидов,
синтезированных из глицина, глутамина и аспарагина, для химической коррекции
индуцированных стрессовых состояний, аналогичных производственным. Исследования
проводились на белых беспородных крысах. Стресс у животных инициировали
внутрибрюшинным введением резерпина. На пике развития стрессовой реакции (через 4 ч)
животным вводили тестируемые пептидные вещества: L-пироглутаминглицинамид (pGlu-Glya)
и L-пироглутаминаспарагинамид (pGlu-Aspa) в различных дозах. В качестве препарата
сравнения использовали циталопрам. Регистрировали изменение двигательной активности,
температуры тела, характер выработки условных рефлексов, проявление кататонии и реакцию
блефароптоза.
Установлено, что при однократном введении исследуемых пептидов pGlu-Glya и pGlu-Aspa
в дозах 0,7±0,09 мг/кг и 0,52±0,06 мг/кг, соответственно, происходит подавление эффектов
резерпина, а именно нормализация двигательной активности, устранение гипотермии и
блефароптоза. При повторном введении (через 7 ч) наблюдалось полное устранение действия
резерпина – восстанавливались процессы выработки условных рефлексов, устранялась
кататония. Для препарата сравнения доза полного купирования проявлений резерпина
составляла 0,87± 0,03 мг/кг.
Таким образом, тестируемые пептидные вещества способны корригировать стрессовые
состояния, в дозах меньших, чем известный антидепрессант циталопрам. Это свидетельствует о
перспективах использования средств данного типа для лечения и профилактики нарушений,
вызываемых стрессом урбанистической природы.
АКТИВНОСТЬ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ И ГЛУТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ
В ОБЩЕЙ ФРАКЦИИ КЛЕТОК ЖЕЛУДКА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
ГАСТРОКАНЦЕРОГЕНЕЗЕ
Тимошенко М.А., Кравченко О.А., Гайда Л.Н., Остапченко Л.И.
Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, Киев (Украина)
maria.bulavka@gmail.com
Известно, что окислительный стресс является одним из факторов, вовлеченных в
злокачественную трансформацию клеток посредством модификации свободными радикалами
липидов, металлсодержащих белков, окисления тиоловых групп, взаимодействия с онкогенами
и генами-супрессорами опухолевого роста, разрыва спиралей ДНК. Это определяет особый
интерес к изучению систем, направленных на поддержание внутриклеточного редоксгомеостаза в области восстановленных значений. Реализация такой поддержки осуществляется
глутатионовой системой, частью которой являются глутатионзависимые трансфераза (ГТ) и
пероксидаза (ГПО). Согласованная работа последних по конъюгации экзо- и эндогенных
электрофильных веществ (ГТ) и восстановлению Н2О2 и органических гидроперикисей (ГПО),
устраняет как причины, так и следствия окислительного повреждения клеточных структур.
Оценить особенности работы ГТ и ГПО путем определения их активности в условиях развития
экспериментального рака желудка было целью работы.
Материалы и методы. В течении 10 недель крысам инициировали гастроканцерогенез,
заменяя питьевую воду 0,001% раствором канцерогена N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина
и кормом с 5% содержанием хлорида натрия. По окончанию 10 недели животных переводили
на стандартный рацион вивария. Выделение клеток слизистой оболочки желудка, определение
активности ГТ и ГПО проводили на 4, 6, 8, 10, 12, 18 и 24 неделю экспериментальной модели.
197
Общая и функциональная биохимия
Результаты. Показано статистически достоверное возрастание активности ГТ в 1,3 и 1,9 раз по
сравнению с контролем на начальных этапах развития модели, по окончанию 4 и 6 недели, что,
вероятно, объясняется интенсификацией катаболической переработки канцерогена структурно
подобного типичным субстратам ГТ. На 12 недели наблюдалось снижение активности ГТ в 2
раза, вероятно произошедшее вследствие ингибирующих эффектов продуктов катализируемой
реакции – конъюгатов глутатиона или недостаточность главного субстрата – восстановленного
глутатиона. Зафиксировано увеличение активности ГТ и на завершающих этапах
моделирования гастроканцерогенеза (18 и 24 недели) в среднем в 1,5 раз, очевидно,
обусловленное вовлечением фермента в детоксикацию цитотоксических пероксидов
эндогенного происхождения.
Начиная с 6 недели экспериментальной модели ГПО характеризовалась достоверным
увеличением активности (в среднем в 4,7 раз) с максимальным увеличением в 8,7 раз на 24
недели. Известно, что активность ГПО положительно коррелирует с интенсивностью
окислительного метаболизма, претерпивающего изменения в следствии постепенно
развивающейся патологии слизистой оболочки желудка.
Выводы. Таким образом, были установлены изменения активности ГТ и ГПО, что может
свидетельствовать об участии этих ферментов в инициации и прогрессии гастроканцерогенеза.
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ШУНТА РАПОПОРТА-ЛЮБЕРИНГА И
КОНЦЕНТРАЦИЯ 2,3-ДИФОСФОГЛИЦЕРАТА В ЭРИТРОЦИТАХ
ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ АЛЬЦГЕЙМЕРА
Тихонова Л.А., Белоушко Е.Е., Косенко Е.А., Каминский Ю.Г.
ИТЭБ РАН; Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино
(Россия)
ljudasik09@rambler.ru
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой повреждение нервной системы, наиболее
распространенное среди людей пожилого возраста и ограничивающее их физические и
интеллектуальные возможности. Многолетние исследования показали, что при этом
заболевании поражается не только мозг, но и периферические ткани. Это говорит о том, что БА
является системным заболеванием. Одним из биохимических признаков БА является
торможение аэробного обмена глюкозы в мозге и накопление лактата, что может быть связано
с изменениями в гликолитической системе и с недостаточным поступлением кислорода в
ткани. Эритроциты являются переносчиками кислорода, и их способность отдавать кислород
тканям зависит от концентрации 2,3-дифосфоглицерата, который образуется в шунте
Рапопорта-Люберинга. Мы определяли активность ферментов этого шунта и концентрации
некоторых интермедиатов гликолиза в эритроцитах пациентов с БА и с деменцией смешанного
типа. Активность дифосфоглицератмутазы и дифосфоглицератфосфатазы повышалась у
пациентов с БА. Также увеличивалась активность Na,K-АТФазы. Концентрация 2,3дифосфоглицерата и АТФ, сумма адениннуклеотидов и аденилатный энергетический заряд в
эритроцитах снижались у пациентов двух групп.
Мы предполагаем, что снижение концентрации 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах
может нарушать отдачу кислорода тканям, в частности, мозгу и способствовать развитию
патологических процессов, характерных для БА.
СОДЕРЖАНИЕ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА В УСЛОВИЯХ
ВВЕДЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ КВЕРЦЕТИНА ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА
Торгало Е.А., Остапченко Л.И
Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, Киев (Украина)
torgalo.e@yandex.ru
198
Общая и функциональная биохимия
В условиях развития геморрагического инсульта в организме происходит нарушение
отдельных звеньев процесса обмена веществ, что является одной из причин снижения
интенсивности защитных реакций организма, в частности, уменьшение содержания
восстановленного глутатиона. Активные формы кислорода довольно легко вступают в реакции
окисления сульфгидрильных групп глутатиона, что является одной из причин нарушения
процессов общего метаболизма и, в частности, ослабление антиоксидантной защиты организма.
Целью нашего исследования было изучить влияние липофлавона и кверцетина на
содержание восстановленного глутатиона в головном мозге, селезенке и почках крыс при
экспериментальной модели геморрагического инсульта. В опыте использовали белых крыс
массой 180±10 г. Геморрагический инсульт в вызывали путем введения во внутреннюю
капсулу головного мозга аутогенной крови. Кверцетин вводили перорально, а липофлавон
внутривенно в дозе 10 мг/кг в течении 7 дней. Содержание восстанновленого глутатиона
определяли по содержанию соединения аллоксан-305.
При геморрагическом инсульте происходит снижение восстановленного глутатиона в мозге
и селезенке на 40%, в почках на 52%. При введении кверцетина нами установлено его
нормализующее влияние на этот показатель в исследуемых органах. При введении
липофлавона было установлено, что значение приближалось к контрольным. Таким образом,
геморрагический инсульт приводят к снижению защитных реакций организма, а именно к
снижению содержания восстановленного глутатиона.
Установлено, что введение антиоксидантных препаратов приводит к нормализации
показателей содержания восстановленного глутатиона в исследуемых органах, что указывает
на стимуляцию защитных реакций организма.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФИТОЛЕКТИНОВ KALANCHOE BLOSSFELDIANA
МЕТОДОМ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ, ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ И
ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА
Усачев С.А., Ямалеева А.А.
Башкирский государственный университет, Уфа (Россия)
nuggetus@mail.ru
Объектом исследований было выбрано растение, которые имеют многовековой опыт
применения в народной и нетрадиционной медицине - Kolanchoe Blossfeldiana. Это растение
недостаточно изучено с точки зрения биохимии и медицины.
Целью данных исследований было выделить и очистить лектины Kolanchoe Blossfeldiana
методом аффинной хроматографии на овогеле, изучить их свойства и химический состав.
Материалы и методы: Выделение лектинов Kolanchoe Blossfeldiana проводили путем
экстракции ацетатным буфером (рН=3,8). Дальнейшую очистку лектинов делали с помощью
хроматографического фракционирования на колонке с овогелем. Анализ лектиновой
активности проводился по реакции гемагглютинации с эритроцитами. После выделения и
очистки лектинов Kolanchoe Blossfeldiana, мы изучили их химические характеристики.
Относительную молекулярную массу белковых образцов определяли с помощью
электрофореза. Визуализация белковых полос осуществлялась методом окраски геля при
помощи 0,2%-ного раствора Coomassie’ Brilliant Blue G-250. Определение аминокислотного
состава выделенных фитолектинов проводилось традиционными методами. Количественное
определение сахаров проводили по реакциям с пикриновой кислотой (по Крезелиус - Зейферт),
с 3,5-дииитросалицнловой кислотой и по Моррису-Роэ. Определение кальция в лектинах
проводили фотометрическим методом. Для изучения влияния температуры раствор лектинов
ставили в различные температурные условия на разное время. Для изучения влияния рН на
активность лектинов добавляли ацетатный буфер, дистиллированную воду, раствор натрия
гидрооксида для получения различных показателей рН.
Анализ результатов: Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета
программ «Statistika for Windows». По результатам определения количества лектинов по методу
Лоури, в исследуемых растениях содержится большое количество белков, включая лектины
(32,5 мг/г сухого вещества). Относительная молекулярная масса выделенных на овогеле
199
Общая и функциональная биохимия
лектинов составила около 58-65 кД. Из определяемых аминокислот обнаружили аланин,
лейцин, изолейцин, тирозин, цистеин. В составе лектинов содержатся углеводы (около 10 12%). Удалось выявить в составе лектинов кальций (менее 0,01мкг). Опыты показали, что
лектины Kolanchoe Blossfeldiana являются термостабильными (от +5°С до +85°С) и
кислотоустойчивыми (оптимум рН=3,5-7,0).
ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИОНОСВЯЗАННОЙ С КЛЕТОЧНОЙ
СТЕНКОЙ β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ РАСТЕНИЙ ГОРОХА
Фатуллаева А.С., Ершова А.Н., Чичиль Т.С.
ФГБОУ ВПО Воронежский государственный педагогический университет, Воронеж
(Россия)
aynur_fatullaeva@mail.ru
Клеточная стенка является важнейшим компартментом, на котором может находиться
целый ряд ферментов, среди которых встречаются β-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21),
катализирующие гидролиз β-гликозидной связи с β-D-арил- и олигоглюкопиранозидах
растительных клеток. В проростках гороха наряду с цитоплазматической были обнаружены
связанные с клеточной стенкой адсорбированная и ионосвязанная молекулярные формы βглюкозидазы.
Исследовали термостабильность, субстратную специфичность и кинетические параметры
(рК1 и рК2, ∆Н) ионосвязанной с клеточной стенкой β-глюкозидазы. Фермент выделяли из
фракций клеточных стенок 10-дневных проростков гороха (Рамонский 77), очищали путем
высаливания сульфатом аммония и гель-хроматографии на G-25. Был получен ферментативный
препарат ионосвязанной β-глюкозидазы с удельной активностью 113,7 Е/мг. При анализе
зависимости активности фермента от величины рН среды, определили значения рК ионогенных
групп белка, участвующих в акте катализа. Они были соответственно равны для рК1 4,2 и рК2
5,3. Рассчитанные по уравнению Вант-Гоффа величины ∆Н реакции составили 5,6 кДж·моль-1 и
28,5 кДж·моль-1, что подтверждает присутствие в активном центре фермента карбоксильной
группы глутаминовой или аспарагиновой кислот, а также имидазольной группы гистидина.
При исследовании термостабильности, было показано, что максимальную активность фермент
проявлял при +37°С. Повышение температуры до +60°С снижало его активность через 2 часа
на 40%, что свидетельствует о низкой термостабильности фермента. Используя различные
дисахариды и арилглюкопиранозиды, было показано, что эта форма β-глюкозидазы проявляла
наибольшее сродство к целлобиозе (Кm 0,97 мМ), β-гентиобиозе (Кm 1,06 мМ), изосукцинимид
β-D-гликозиду (Кm 0,93 мМ) и р-НФГ ( Кm 1,03 мМ), но с меньшей скоростью расщепляла
салицин (Кm 4,32 мМ) и УДФ-глюкозу (Кm 2,46 мМ). Кинетика реакций в присутствии всех
субстратов подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен.
Полученные результаты показали существенное отличие ионосвязанной с клеточной
стенкой молекулярной формы β-глюкозидазы не только от цитоплазматической, но и от
адсорбированной по термостабильности, теплоте и константе ионизации каталитически
активных групп.
СООТНОШЕНИЕ ФОСФАТОВ АДЕНОЗИНА В ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ПРИ
РЕГЕНЕРАЦИИ В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ
ВИТАМИНОМ А
Чопык Л.Н., Бучковская И.М., Шмараков И.А.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы (Украина)
leska-craz@mail.ru
Ретиноиды (витамин А и его метаболиты) – потенциальные транскрипционные регуляторы
клеточной пролиферации, дифференциации и апоптоза. 70% всех ретиноидов, присутствующих
в организме человека, приходится на печень и 70-80% из них хранится в липидных каплях
200
Общая и функциональная биохимия
стеллатных клеток, указывая на исключительную роль этих эссенциальных факторов в
нормальном функционировании печени. Уникальностью печени является ее способность к
регенерации, включающая метаболически регулируемую и энергетически контролируемую
пролиферацию и рост клеток. Поскольку все эукариотические клетки экспрессируют
высокоактивную аденилаткиназу, поддерживающую равновесие реакции 2AДФ↔AMФ+ATФ,
соотношение АМФ/АТФ изменяется приблизительно как квадрат соотношения АДФ/АТФ,
делая его чрезвычайно чувствительным индикатором клеточного энергетического статуса.
Цель работы – определить динамику соотношения АМФ/АТФ в клетках печени при
регенерации на модели частичной гепатэктомии в условиях различной обеспеченности
витамином А. В экспериментах использовали нокаутную линию мышей Lrat-/- не способных
синтезировать ретинилэфиры и не владеющие запасами ретиноидов в печени.
Показано, что начальные этапы регенерации (12 часов после гепатэктомии)
сопровождаются увеличением соотношения АМФ/АТФ (с 0,11 до 0,17 ), объективно отражая
снижение доли АТФ в клетках печени, усиленно использующийся в энергозависимых реакциях
клеточного ответа на острое поражение и высвобождаемый гепатоцитами как регулятор
регенерации. Начиная с 24 часа после проведенной резекции паренхимы печени, наблюдается
снижение соотношения АМФ/АТФ (до 0,08), отражающее возрастание доли АТФ в гепатоцитах
с максимумом на 72 час эксперимента, ввиду объективной потребности клеток печени в
энергии для пролиферативных и ростовых процессов, направленных на восстановление
тканевой массы. Наряду с этим отсутствие запасов витамина А в печени Lrat-/- обуславливает
увеличение соотношения АМФ/АТФ (до 0,19), указывая на относительную энергетическую
недостаточность гепатоцитов данной группы, сохраняющуюся на протяжении 7 дней после
проведенной гепатэктомии. Вместе с тем относительно высокий уровень АМФ может
выступать сигналом для активации АМФ-киназы, ингибирующей пролиферативные процессы,
и негативно отражаясь на темпах восстановления паренхимы печени.
Таким образом нами установлено, что периоды активного восстановления паренхимы
печени характеризируются относительно низким показателем соотношения АМФ/АТФ, в то
время как отсутствие витамина А в регенерирующей печени отражается на перераспределении
фосфатов аденозина в сторону превалирования АМФ.
ВЛИЯНИЕ АБЛЯЦИИ РЕЦЕПТОРА РЕТИНОЕВОЙ КИСЛОТЫ НА
РЕГЕНЕРАЦИЮ ПЕЧЕНИ
Шмараков И.А., Морозевич Ю.Д.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича
igor.shmarakov@gmail.com
Рецепторы ретиноевой кислоты вовлечены в сигнальные и метаболические пути,
обеспечивая действие ретиноидов (витамин А и его метаболиты). Ретиноевая кислота –
основной транскрипционно активный вид ретиноидов – регулирует более 500 генов,
участвующих в таких клеточных процессах как пролиферация, дифференциация и апоптоз.
Полностью-транс- и 9-цис-изомеры ретиноевой кислоты регулируют транскрипцию,
связываясь с одним из шести ядерных рецепторов – рецепторы ретиноевой кислоты (RARα,-β
и-γ) и ретиноид Х рецепторами (RXRα,-β, и - γ). В литературе показано, что продолжительность
жизни зрелых гепатоцитов лишенных RXRα намного короче, и уменьшается в разы в
пролиферирующих гепатоцитах при регенерации печени. Не совсем ясно, принимает ли RARα
прямое участие в контроле пролиферации гепатоцитов и в ответе на острое поражение печени.
Цель работы – установить влияние абляции α изоформы рецептора ретиноевой кислоты
(RARα) на процесс регенерации печени, вызванной частичной гепатэктомией (ЧГЭ). Поскольку
нокауты по RARα летальны, нами использована модель гепатоцит-специфической абляции α
изоформы рецептора ретиноевой кислоты с помощью доминантно негативной формы RAR
(RARdn). Трансгенных животных с флоксированным геном RARdn скрещивали с животными
Alb-Cre; в гепатоцитах потомков (опытная группа) рекомбиназа Cre удаляла
последовательности преждевременной терминации в конструкции RARdn, обеспечивая её
транскрипцию с последующим образованием белкового продукта доминантно негативной
201
Общая и функциональная биохимия
формы RAR. Группу опытного контроля составляли потомки животных RARdn, нескрещенных
с Alb-Cre. Контрольную группу составляли животные, подвергавшиеся лапаротомии
(ЛАП).Показано, что при 100% постоперационной выживаемости животных обоих генотипов в
первые 24 часа после ЧГЭ, на 3-и сутки уровень летальности в опытной группе составлял 50%.
Уровень восстановления печени животных опытной группы в указанный период не превышал
60% от преоперационных величин, тогда как у животных RARdn эта величина была выше 70%.
Гистологический анализ регенерированной печени показал наличие зон очагового некроза уже
через 24 часа после ЧГЭ, а также значительное увеличение аланинаминотрансферазной
активности (743,1±56,3 МЕ/л у мышей опытной группы против 567,8±70,9 МЕ/л у мышей
группы опытного контроля) в сыворотке крови, указывающие на глубокие поражения
паренхимы. Двукратное увеличение индекса ДНК-комет в сравнении с группой опытного
контроля и наличие в ядерной фракции печени неупорядоченных фрагментов ДНК размерами
от сотен до сотен тысяч пар нуклеотидов подтверждали массовую некротическую гибель
гепатоцитов регенерирующей печени мышей с доминантно негативной формой рецептора
ретиноевой кислоты. Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что
нормальное функционирование ретиноид-зависимого сигнального пути посредством
канонических ядерных рецепторов является жизненно важным для печени при ее остром
поражении.
ДЕМОНСТРАЦИЯ УСКОРЕНИЯ ПРОЦЕССА ОБРАЗОВАНИЯ ПЕПТИДНОЙ
СВЯЗИ ПОБОЧНЫМ ПРОДУКТОМ СТАДИИ АКТИВАЦИИ РЕАГЕНТОМ
САКАКИБАРЫ
Щанникова М.П.1, Лоскутова И.В.1, Азев В.Н.2, Котелевцев Ю.В.1
1
ПущГЕНИ; 2ФИБХ РАН
mshannikova@mail.ru
Синдекан
белок,
несущий
хондроитинсульфатные
и
гепарансульфатные
гликозаминогликаны. Он обнаружен в клеточной мембране и особенно выражен на базальной
поверхности эпителиальных клеток в местах их контакта с базальной пластинкой.
Протеолитическое удаление синдекана со стенок сосудов может являться показателем развития
атеросклероза. Фрагменты его внеклеточного домена необходимы нам для создания тестсистемы для определения синдекана в плазме крови.
Дипептид Boc-Pro-Pro-OH, необходимый нам для получения фрагментов белка синдекана,
был синтезирован посредством one-pot превращения Boc-Pro-OH в пентафторфениловый эфир
с помощью реагента переэтирификации (реагента Сакакибары) и последующей конденсацией
активированного эфира с незащищённым пролином. Такая реакционная схема для получения
дипетидов значительно отличается от общепринятой. Во-первых, не используется С-концевая
защитная группа; во-вторых, реакция проводится в органической среде в отсутсвии сильных
оснований. Химический выход дипептида получаемого по новой схеме оказался выше, чем в
случае ряда вариантов описаных в литературе. К достоинствам нового метода следует отнести
меньшее количество операций и, следовательно, затраченного времени.
В ходе выполнения синтеза был продемонстрирован эффект значительного ускорения
реакции конденсации активированного эфира с пролином посредством трифторацетата
пиридиния (CF3CO2-PyH+ (1))– побочного продукта стадии получения пентафторфенилового
эфира по сравнению с условиями, когда заведомо полученый активированый эфир вступал во
взаимодействие с пролином в DMF. При использовании соли 1 в качестве катализатора
отсутсвует влияние нуклеофильных добавок (HOBt, HOAt) как на скорость реакции
конденсации так и на химический выход продуктов. Однако, показано, что HOBt в отсутствие
соли 1, существенно эффективнее ускоряет стадию конденсации, чем 1, но не влияет на
химический выход дипептида. Несмотря на кажущуюся эффективность, метод с использования
HOBt имеет недостатки. К ним следует отнести некоторые проблемы с анализом продуктов
реакционной смеси и сложности с отделением продукта от HOBt после реакции.
202
Общая и функциональная биохимия
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЛАККАЗЫ – КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И
ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ
Юревич Л.И.1,2, Захарова М.В.2, Лисов А.В.2, Леонтьевский А.А.1,2
1
Пущинский государственный естественно-научный институт; 2ИБФМ РАН
lyubov_yurevich@mail.ru
Лакказы – ферменты, относящиеся к семейству медьсодержащих оксидаз. Повышенный
интерес к данному классу ферментов вызван их востребованностью в различных сферах
производства. Лакказы применяются для делигнификации древесных волокон, в пищевой
промышленности, для биодеградации ксенобиотиков. В последнее время повышенный интерес
вызывают лакказы бактерий. Они отличаются от лакказ грибов большей термостабильностью,
устойчивостью к ряду классических ингибиторов лакказ.
Целью данной работы было клонирование генов лакказ бактерий рода Streptomyces,
экспрессия, очистка и определение физико-химических параметров полученных белков. Гены
двух бактериальных лакказ из штаммов Streptomyces lividans (Ac-1709 ВКМ) и Streptomyces
viridochromogenes (Ac-629 ВКМ) были клонированы в экспрессионный вектор pQE-30.
Подобраны условия для оптимальной наработки рекомбинантных белков. Очистка лакказ
осуществлялась с помощью афинной хроматографии на колонке HiTrap и гельфильтрации на
колонке HiLoad Superdex 200. Определены физико-химические параметры очищенных
ферментов. Обе лакказы были гомодимерными белками, молекулярная масса мономера
лакказы штамма Ас-1709 составляла 38 кДа, Ас-629 – 34 кДа. pH-Оптимумы лакказы штамма
Ас-1709 для нефенольных и фенольных субстратов составили 4,0 и 8,5, лакказы штамма Ас-629
– 4,5 и 8,4. Эффективными ингибиторами лакказы штамма Ас-629 являлись 1,10-фенантролин и
ЭДТА, 1,10-фенантролин ингибировал белок штамма Ас-1709. Классический ингибитор лакказ
– азид натрия, не выступал эффективным ингибитором лакказ бактерий, наблюдалось
ингибирование окисления субстратов в кислых условиях, в то время как при щелочных
значениях рН ингибирования реакции азидом натрия не наблюдалось. Лакказы обоих штаммов
проявляли высокую термостабильность. Лакказа штамма Ас-1709 сохраняла 50% активности
при инкубировании в течение 50 минут при 60°С, в течение 30 минут при 70°С и 20 минут при
80°С. Лакказа из штаммаАс-629 сохраняла более 50% активности при инкубировании в течение
70 минут при 80°С, 48% активности при инкубировании в течение 70 минут при 90°С.
Полученные данные создают хорошую основу для дальнейших исследований, целью
которых будет выступать разработка практического использования белковых препаратов в
различных целях.
203
Почвоведение и биогеохимия
СЕКЦИЯ «Почвоведение и биогеохимия»
ПРОЕКТ КРАСНОЙ КНИГИ ПОЧВ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
Александрова А.Б., Бережная Н.А., Григорьян Б.Р., Иванов Д.В., Кулагина В.И.
Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан,
Казань (Россия)
adabl@mail.ru
Работы по созданию Красной книги почв Республики Татарстан (РТ) были начаты в 2008
году по инициативе Института проблем экологии и недропользовании АН РТ. В 2010 и 2011
годах эти исследования были поддержаны Министерством экологии и природных ресурсов РТ.
Значительную помощь и поддержку в проведении работ на особо охраняемых природных
территориях оказало Министерство лесного хозяйства РТ. Базовой картографической основой
при проведении почвенного обследования служила «Почвенная карта Татарской АССР» (1985)
масштаба 1:600000. Использовались также опубликованные материалы почвенных
исследований, фондовые данные организаций, а также личная информация ученых и
специалистов. В 2011 году создан проект Красной книги почв РТ, который представляет собой
первое «пилотное» издание книги (10 экземпляров). Она состоит из разделов: 1. Введения, в
котором освящается географическое распространение и общая характеристика почв РТ, краткая
характеристика факторов почвообразования, история изучения почв РТ, научные основы
создания Красной книги почв РФ, концептуальные подходы к созданию и ведению Красной
книги почв РТ, структура Красной книги почв РТ; 2. Очерка по охраняемым почвам; 3
Приложения. Согласно научно-методическим подходам, использованным при создании
Красных книг почв в регионах РФ и специфики почвенного покрова региона, в Красную книгу
почв РТ включено 5 основных категорий почв: 1.Эталоны: 1.1. Основные эталоны (зональные);
1.2. Локальные эталоны (интразональные и азональные); 2. Редкие почвы: 2.1.Редкие почвы;
2.2. Уникальные; 3. Исчезающие почвы; 4. Почвы высокой культуры земледелия; 5 Почвы –
объекты мониторинга. В Красной книге почв РТ отдельные таксономические группы почв
представлены в следующей последовательности: черноземы, серые лесные, подзолистые и
дерново-подзолистые, дерново-карбонатные, болотные, аллювиальные почвы, солончаки.
Ввиду того, что включенные в Красную книгу представители отдельных таксономических
единиц могут одновременно относиться к нескольким категориям, например, эталонная почва
может являться и объектом мониторинга, категории охраны почв выделены цветом в названии
соответствующих почвенных разностей. В каждом типе последовательно представлены
исчезающие, редкие и эталонные почвы. В связи с тем, что уровень распаханности
сельхозугодий республики составляет в среднем 77%, в категорию зональных эталонов были
включены не только естественные почвы, но и их пахотные аналоги. В очерке охраняемых почв
представлено описание 53-х почвенных индивидуумов. Названия почв и индексы почвенных
горизонтов приводятся согласно классификациям 1977 г. и 2004 г. Данные о физикохимических свойствах, гранулометрическом составе приводится в приложении. В дальнейшем
книга будет доработана и издана более крупным тиражом.
СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА МИКРОФЛОРЫ И ФЕРМЕНТАТИВНОЙ
АКТИВНОСТИ В МЕРЗЛОТНОЙ ПАЛЕВО-БУРОЙ ТИПИЧНОЙ ПОЧВЕ
(ЦЕНТРАЛЬНАЯ ЯКУТИЯ)
Харитонова Т.Е., Богдокумова М.В., Плотникова А.С., Щелчкова М.В.
ФГАОУ ВПО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова»,
Биолого-географический факультет, Якутск (Россия)
Marianna291289@mail.ru
Мерзлотные почвы характеризуются особенностями гидротермического режима. Поэтому
для понимания функционирования комплекса почвенных микроорганизмов все исследования
необходимо проводить в динамике.
204
Почвоведение и биогеохимия
Динамические исследования гидротермического режима, численности микроорганизмов и
активности почвенных ферментов проводили в разрезе мерзлотной палево-бурой типичной
почвы в течение летних, осенних и зимних месяцев 2011 г. Установлено, что в исследуемой
почве формируется микробная сукцессия, индуцированная поступлением на поверхность
почвы свежего растительного опада в конце августа и начале сентября. На первом этапе
сукцессии развиваются микроскопические грибы – активные гидролитики органических
полимеров, их максимальная численность в этот период составляет 35,5 тыс. КОЕ/г почвы.. На
втором этапе сукцессии активно развиваются бактерии, использующие органические
источники азота и выделяемые на МПА. Максимум их численности – 14 млн. КОЕ/г фиксируется в начале июля. Вслед за бактериями-гидролитиками развиваются актиномицеты и
олигонитрофилы, использующие в качестве источников питания соответственно минеральный
азот и следовые количества азота. Наибольшая численность этих микроорганизмов
наблюдается в начале августа и составляет соответственно 4,45 и 7, 20 млн. КОЕ/г. В зимний
период в замороженных почвах численность микроорганизмов сохраняется на уровне,
характерном для позднеосеннего периода.
Сезонная динамика ферментативной активности в исследуемой почве сопряжена с
гидротермическим режимом и периодичностью поступления свежего органического вещества в
почву. Для гидролитических ферментов фосфатазы, протеазы, уреазы, аспарагиназы и
инвертазы характерно наличие осеннего максимума активности, который обусловлен
поступлением в почву растительного опада, в составе которого содержится большое
количество органических соединений, в том числе и специфических субстратов для
гидролитических ферментов. Для окислительно-восстановительных ферментов дегидрогеназы
и полифенолоксидазы, участвующих в биогенезе гумуса, выявляется летний пик активности.
Показатели температуры, влажности, численности микроорганизмов и ферментативной
активности наиболее динамичны в верхних слоях почвы. Большинство изученных
микроорганизмов и ферментов обнаруживаются до глубины 30 см. В нижележащих горизонтах
биологическая активность постепенно «затухает» и ее динамика выражена слабо.
АГРОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ БИОЭКОЛОГИЧЕСКОЙ
СТАНЦИИ ТГПУ им. Л.Н. ТОЛСТОГО
Корнева А.Д., Лобанова Т.Н., Бабицкая О.А., Бойкова О.И.
Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого, Тула
(Россия)
benosi@mail.ru
Основным условием стабильного развития агропромышленного комплекса и источником
его расширения является сохранение, воспроизводство, рациональное и эффективное
использование плодородия земель сельскохозяйственного назначения. Перед собственниками
земель стоит задача не допустить деградации пахотных земель, снижения их плодородия и
других качественных показателей.
Цель настоящих исследований заключалась в оценке агрохимического состояния почв
биоэкологической опытной станции ФГБОУ ВПО «ТГПУ им. Л.Н. Толстого» и на основе
полученных результатов в определении конкретных путей воспроизводства их плодородия и
эффективного использования земель сельскохозяйственного назначения с учетом современного
развития земельных отношений.
Почва биоэкологической опытной станции ТГПУ им. Л.Н. Толстого представлена серыми
лесными почвами, а по механическому составу - суглинистые.
Результаты определения степени кислотности показали, что почвенные образцы имеют
близкую к нейтральной (рНКСl = 5,6 – 5,9) или среднекислую (рНКСl = 4,8) реакцию
почвенного раствора, что является весьма благоприятной для развития сельскохозяйственных
культур.
Определение содержание органического вещества (гумуса) в почве проводили по методу И.В.
Тюрина. Почва биоэкологической опытной станции имеет низкое содержание органического
вещества (гумуса) ≈ 2,0%.
205
Почвоведение и биогеохимия
Азотом эти почвы бедны. Все исследуемые образцы почвы исследовали по методу И.В.
Тюрина и М.М Кононовой и имеют относительно низкое содержание легкогидролизуемого
азота (4,7-4,9 мг/100 г почвы), причем самое низкое содержание (4,0 мг/100 г почвы) имеют
образцы внешнего поля. При определении подвижного фосфора по методу А.Т. Кирсанова
почвы биоэкологической опытной станции показали в основном низкое (41,5-44,5 мг/кг почвы)
или среднее содержание (97,3 мг/кг почвы) подвижного фосфора, доступного для растений.
Емкость поглощения по методу Е.В.Бобко-Д.Л. Аскинази- С.Н.Алешина, так же имеет средние
показатели от 20,0 до 23,2 мг·экв/100 г почвы. Для каждого образца определена сумма
поглощенных оснований (от 12,9 до 17,2 мг•экв/100г).
Полученные данные свидетельствуют, что почвы биоэклогической опытной станции не
нуждаются в известковании, а так же применение фосфоритной муки в качестве фосфорного
удобрения не целесообразно и экономически не эффективно.
Использование результатов исследования позволит наметить пути сохранения плодородия
почвы биоэкологической опытной станции ФГБОУ ВПО «ТГПУ им. Л.Н. Толстого», а также
повысить уровень ее окультуренности и эффективного использования.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОКАЗАТЕЛЯ МАГНИТНОЙ ВОСПРИИМЧИВОСТИ В
ИССЛЕДОВАНИЯХ СЛОЖНЫХ ПАЛЕОКРИОМОРФНЫХ ПОЧВ
Вагапов И.М.
Пущинский государственный естественно-научный институт; Федеральное
государственное бюджетное учреждение науки Институт физико-химических и
биологических проблем почвоведения РАН, Пущино (Россия)
vagapovim@mail.ru
Как известно, почвы центра Восточно-Европейской равнины прошли криогенную стадию
формирования, что обусловило значительную пространственную вариабельность почвенных
свойств. Для выявления закономерностей в распределении почвенных свойств мы
использовали показатель, определяемый без какой-либо предварительной обработки образцов,
а именно объемную магнитную восприимчивость (МВ) – физическую величину,
характеризующую способность веществ намагничиваться в магнитном поле. По величине МВ
судят об интенсивности протекания некоторых элементарных почвенных процессов, а также
палеоэкологических условиях.
Исследования проводились в Тульской области, в типичных для Среднерусской
возвышенности условиях, на черноземах глинисто-иллювиальных типичных и оподзоленных.
Черноземы подстилались позднеплейстоценовыми покровными лессовидными суглинками и
мореной, а также содержали горизонты криоморфных погребенных почв (ПП). Из типов
палеокриогенных структур выявлены: псевдоморфозы по повторно-жильным льдам, крупные
клиновидные грунтовые структуры (ККГС), пятна-медальоны и солифлюкционные
деформации.
В результате 3-летних исследований выявлены следующие факты: в гумусовых горизонтах
современных почв, расположенных над системой ККГС, наблюдаются области, имеющие
высокие значения МВ и увеличенную мощность. Выявлена положительная связь (R2=0,95)
между распределением величин МВ и профильным распределением С орг. Высокие значения
МВ обусловлены присутствием педогенных высокомагнитных оксидов Fe, что свидетельствует
о чередовании здесь процессов увлажнения-иссушения, переменном pH и участии
органического вещества. В одном из разрезов на глубине 250 см между горизонтами [А1] и
[А1В] ПП было выявлено резкое увеличение значений МВ до значений, характерных
гумусовым горизонтам современных почв. Этот факт может свидетельствовать о наличии
между указанными горизонтами литологической границы. Мы предполагаем, что горизонт
[А1В] на самом деле является самостоятельной ПП, сформировавшейся в автоморфной
позиции при относительно теплых климатических условиях и сезонном иссушении. Аномально
высокие значения МВ (1,44-3,03×10-3 ед. СИ) обнаруживаются на контакте горизонта [А1В] и
морены. Уклон поверхности морены и различия в ее гранулометрическом составе с
перекрывающими отложениями способствуют развитию внутрипочвенного латерального стока,
206
Почвоведение и биогеохимия
обуславливая здесь контрастный водно-воздушный режим. В литературе это обычно
связывается с благоприятными для хемосинтеза сильномагнитных железистых минералов
условиями. Наличие таких условий подтверждают многочисленные субгоризонтальные и
субвертикальные охристые прослои.
Таким образом, в межблочных понижениях над системой ККГС существуют области,
имеющие высокие значения МВ и увеличенную мощность. Кроме того, на основе МВ удалось
инструмаентально обнаружить признаки, выявление которых морфологически было
затруднено.
Работа выполняется при поддержке гранта РФФИ №11-04-00354.
ИССЛЕДОВАНИЕ ДИСПЕРСНЫХ СИСТЕМ ОКСИДОВ МАРГАНЦА
Гришина А.В., Чухно А.С., Гришин В.В.
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, СанктПетербург (Россия)
rabbit2003@list.ru
Марганец принадлежит к распространенным элементам, составляя 0,03% от общего числа
атомов земной коры и около 0,1% по массе. В свободном виде марганец не встречается.
Диоксид марганца MnO2 – наиболее распространенное природное соединение марганца,
существующее в нескольких полиморфных формах. Марганец – микроэлемент, постоянно
присутствующий в живых организмах и необходимый для их нормальной жизнедеятельности.
Особое значение имеет присутствие двуокиси марганца в почве. Она является не только
необходимым микроэлементом, но и важна для подержания буферных свойств почвы и
прохождения ряда биохимических процессов. Наличие- амфотерных свойств диоксида
марганца позволяет ожидать возможности взаимодействия его с кислотами и щелочами.
Следует ожидать специфической адсорбции кислот и щелочей на молекуле диоксида.
Достаточно информативным методом изучения специфической адсорбции ионных соединений
является макро - и микроэлектрофорез. Изучение методом электрофореза золя диоксида
марганца с кислотами и щелочами позволило нам сделать выводы, о их поверхностной
адсорбции. Кислоты обладают большим сродством к поверхности оксида марганца, чем
основания. Наибольшее сродство проявляет сульфат ион и серная кислота. Поэтому двуокись
марганца, полученная по сульфатной технологии, содержит сульфат ион. Основное
преимущество этой технологии – получение двуокиси марганца в гамма модификации с высоко
развитой поверхностью. На практике отмыть оксид марганца от сульфат иона промывками
водой не удается. Оставшийся на кристалле сульфат ион значительно уменьшает активность
диоксида марганца в биоорганических реакциях. Применение растворов азотной кислоты, а
также ультразвука позволяют интенсифицировать процесс отмывки, но остается еще
достаточное количество сульфат иона, определяемого при анализе восстановлением диоксида
марганца. Можно предположить нахождение сульфат иона внутрикристалльно диоксида
марганца, поэтому и требуется применение более интенсивных методов, таких как
электродиализ.
ОСОБЕННОСТИ МИКРОФЛОРЫ ПОЧВ ТРАНСПОРТНЫХ ЗОН г. ЯКУТСКА
Жерготова М.С., Щелчкова М.В.
ФГАОУ ВПО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова»,
Биолого-географический факультет, Якутск (Россия)
naumova87mari@mail.ru
Развитие автомобильного транспорта в г. Якутске оказывает существенное влияние на
химические и биологические свойства почв. Особую опасность представляют собой выхлопные
газы. В их состав входят разнообразные высокотоксичные вещества и тяжелые.
207
Почвоведение и биогеохимия
Мы изучали численность основных эколого-трофических групп микроорганизмов в
мерзлотной лугово-черноземной почве на разном удалении от одной из наиболее загруженных
автотрасс города «Аэропорт-Якутск».
Исследования показали, что в мерзлотной лугово-черноземной почве присутствуют все
основные таксоны микроорганизмов – бактерии, актиномицеты, грибы. В микробоценозе на
долю бактерий приходится около 60%, что составляет 546-1096 тыс. КОЕ/г, на долю
актиномицетов – около 40% (183-623 тыс. КОЕ/г). Грибов в мерзлотных лугово-черноземных
почвах очень мало (3-5 тыс. КОЕ/г), что вероятно объясняется слабощелочной реакцией среды.
Среди основных трофических групп доминируют олигонитрофильные бактерии (43%) и
бактерии, использующие органические источники азота (33-37%). Их количество в почве
достигает соответственно 1800 и 1600 тыс. КОЕ/г. На долю бактерий и актиномицетов,
использующих минеральный азот, приходится 20-26%. При этом в их составе преобладают
актиномицеты. Высокое содержание актиномицетов характерно для почв степного ряда, к
которым в частности относится мерзлотные лугово-черноземные почвы.
В почвах, загрязненных выхлопами автотранспорта, проявляется тенденция повышения
численности бактерий, использующих органические источники азота. Численность
олигонитрофильных бактерий при загрязнении почв выхлопами автотранспорта также остается
высокой. Для актиномицетов и грибов характерна более сложная картина с несколькими
пиками численности на разном расстоянии от источника загрязнения. На фоне широкого
колебания численности микроорганизмов разных эколого-трофических и таксономических
групп, наблюдается закономерное изменение в таксономическом составе микробного
комплекса почв. При приближении к источнику загрязнения в микробоценозе изменяется
относительное содержание актиномицетов и бактерий. Если в почвах фонового участка (250 м
от автотрассы) на долю актиномицетов приходится 40% от общего содержания
микроорганизмов, а на долю бактерий соответственно 60%, то в наиболее загрязненных почвах
(2-50 м от автотрассы) резко возрастает доля бактерий – до 75-80%, а участие актиномицетов
уменьшается до 20-25%. Эта закономерность коррелирует с накоплением в почвах валового
свинца и цинка.
МИКРОБНЫЙ ПУЛ ПОЧВЫ И ЕГО ДЫХАТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ В
ЕСТЕСТВЕННЫХ И АНТРОПОГЕННО-ПРЕОБРАЗОВАННЫХ
ЭКОСИСТЕМАХ СЕВЕРО-ВОСТОКА МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ
Иващенко К.В., Васенёв В.И.
Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино; Российский
университет дружбы народов, Москва (Россия)
kyzj_111@mail.ru
Цель работы – изучение функционирования почв и конструктозёмов Сергиево-Посадского
и Шатурского р-нов Московской обл. через оценку их микробного компонента и его
дыхательной активности.
На территории диагностировали естественные (лес, луг) и антропогенно-преобразованные
(пашня, конструктозём рекреационной (Р), селитебной (С) и промышленной (П) зон)
экосистемы, в каждой из которых было выбрано пять пространственно-удаленных точек отбора
образцов. Пробы (всего 30) отбирали из слоя 0-10 см (без растительной подстилки).
В образцах определяли (4 повторности) углерод микробной биомассы (Смик) методом
субстрат-индуцированного дыхания, микробное (базальное) дыхание (МД), содержание
почвенного органического углерода (Сорг) и рассчитывали интегральные показатели (qCO2 = БД
/ Смик и Смик / Сорг).
Содержание Сорг в почве изученных р-нов составило 1.5–12.2, а в конструктозёмах – 1.3–
8.3%. Величины Смик в верхнем горизонте почвы леса, луга и пашни Сергиево-Посадского р-на
достигали в среднем 318, 434 и 313, а Шатурского – 257, 569 и 179 мкг С г-1соответственно.
Скорость МД почвы леса, луга и пашни Сергиево-Посадского р-на была в среднем 2.38, 1.17 и
0.50, а Шатурского – 0.95, 1.92 и 0.59 мкг СО2-С г-1 ч-1 соответственно.
208
Почвоведение и биогеохимия
В конструктозёме Р, С и П зон двух р-нов содержание Смиксоставило в среднем 464, 445 и
238 мкг С г-1, а скорость МД – 0.89, 0.59 и 0.63 мкг СО2-С г-1 ч-1 соответственно. Интегральный
показатель функционирования микробного сообщества (qCO2) достигал в среднем 2.2, 1.5 и 3.1
мкг СО2-С мг-1Смик ч-1 для Р, С и Пзон соответственно, указывая на стрессовые условия
конструктозёма промышленной зоны. Отношение Смик / Сорг в конструктозёме Р, С иП зон двух
р-нов составило в среднем 0.93, 1.04 и 0.53% соответственно.
Выявлено, что в почве естественных экосистем (лес, луг) величины Смик и МД были в
среднем на 40% и в 2.5 раза больше, а отношение Смик / Сорг – напротив, в 1.3-1.9 раза меньше,
чем в конструктоземе промышленной зоны соответствующего р-на.
Таким образом, в почвах северо-востока Московской обл. наибольшее содержание Смик,
МД и Смик / Сорг отмечено на лугах, а наименьшее – на пашнях, а в конструктоземах
промышленной зоны эти показатели существенно меньше, чем в соответствующих
естественных аналогах.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта Правительства РФ № 11.634.31.0079
ВЛИЯНИЕ ЛЕСНЫХ НАСАЖДЕНИЙ НА ЗАПАСЫ УГЛЕРОДА В ПОЧВАХ
ЮЖНЫХ РЕГИОНОВ ЕВРОПЕЙСКОЙ РОССИИ
Каганов В.В.
ЦЭПЛ РАН, Москва; ИФХиБПП РАН, Пущино (Россия)
saganss@rambler.ru
Цель работы - изменение запасов углерода почв при смене типа растительности с
травянистого на лесной. Изучено 4 объекта в Воронежской, Волгоградской и Астраханской
обл. Закладывалось по 2 ключевых участка – под лесом и на безлесной территории. На участках
копались почвенные разрезы, образцы отбирались послойно через каждые 10 см до 50 и 100
см., после чего определялось содержание общего и органического углерода. Полученные
данные показывают, что при облесении территорий на совокупности объектов не происходит
значимого увеличения запаса углерода почвы. В условиях Каменной степи и Джаныбекского
стационара, отмечается некоторое уменьшение запаса общего углерода в 100 см (Каменная
степь, с 465,6 т.га-1 на залежи до 413,4 т.га-1 под лесом) и в 50 см (Джаныбек, с 107,6 т.га-1 на
целине до 79,7 т.га-1 под лесом). В почвах Козловской лесной дачи (100 см) и ОС Зеленый сад (в
50 см) содержание общего углерода на обоих ключевых участках остается примерно равным:
451,4 т.га-1 на целине и 451,2 т.га-1 под лесом – для Козловской ЛД, 27,2 т.га-1 на целине и 28,4
т.га-1под насаждением - для ОС Зеленый сад. На объектах Каменная степь и Козловская ЛД при
разделении общего пула углерода на органический и неорганический наблюдается замещение
углерода карбонатов органическим. В Каменной степи в почве под лесом максимум накопления
карбонатов смещается вниз по профилю и выходит за пределы исследуемого слоя, доля
органического углерода возрастает с 84,2% до 97,6%, по сравнению с почвой залежного
участка, а доля углерода карбонатов уменьшается с 15,8% до 2,4%. То же отмечается и в почве
Козловской ЛД, но в этом случае наблюдается перераспределение карбонатных солей в
границах 100 см слоя. Суммарная доля углерода карбонатов в метровом слое лесной почвы,
составляющая 24,4%, мало отличается от доли углерода карбонатов почве целины (29,7%). На
ту же величину (~5%) в почве под лесом возрастает доля органического углерода. Это явление
обусловлено изменением водного режима почв объектов под влиянием древостоя.
Дополнительное накопление влаги в насаждениях и равномерное её расходование приводят к
более глубокому промачиванию профиля лесных почв по сравнению с почвами целинных
участков. Это приводит к увеличению мощности аккумулятивного горизонта почвы под лесом,
что позволяет ей наращивать запас органического углерода, а также к смещению карбонатов
вниз по профилю.. Полученные результаты свидетельствуют, что запасы углерода почвы под
лесными насаждениями лесостепной и степной зон примерно совпадают с таковыми в почвах
под травянистыми фитоценозов. При этом лесные насаждения существенно превышают
травянистые фитоценозы по запасу углерода фитомассы, т.е. лесные насаждения даже в южных
регионах страны можно использовать в качестве механизма связывания и консервации
органического углерода.
209
Почвоведение и биогеохимия
ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ ПЛОДОРОДИЯ ПОЧВ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ УГОДИЙ ООО «АТАМАНСКОЕ»
ПАВЛОВСКОГО РАЙОНА КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ
Кривко Е.В.
Кубанский государственный университет, Краснодар (Россия)
lena51290@mail.ru
Хозяйство ООО «Атаманское» входит в число 300 лучших хозяйств России. Земельная
территория хозяйства расположена в северо-западной части Павловского района, в северной
зоне Краснодарского края. Основное направление хозяйства – зерновое. Посевы озимой
пшеницы занимают 40–45% площади пашни.
Цель работы – изучить динамику изменения плодородия почв ООО «Атаманское»
Павловского района.
Почвы хозяйства – обыкновенные (карбонатные) черноземы, которые сформированы на
тяжелых лессовидных суглинках и бурых глинах, поэтому характеризуются относительно
тяжелым механическим составом.
Сравнивая агрохимические показатели между циклами обследования за период с 1968 по
2011 годы, следует отметить, что за указанный период произошли значительные изменения.
Подвижный фосфор является важнейшим показателям плодородия почв на карбонатных
черноземах, в сбалансированности питания растений занимает ведущее место. Первое
обследование почв 1968 году показало, что содержание подвижного фосфора составило всего
15 мг/кг, то есть 69,0% или 4375 га. Начиная с 1993 года использование удобрений резко
сократилось, и содержание подвижного фосфора начало падать. К 2011 году содержание
подвижного фосфора увеличилось до 33 мг/кг.
Содержание обменного калия с 1968 года повышалось в почве с 333 мг/кг (I цикл
обследования 1968 г.) до 441 мг/кг (VI цикл обследования 1991 г.). С 1991 года по 2006 год
содержание обменного калия в почвах хозяйства стало снижаться и достигло в 2006 году 397
мг/кг. К 2011 году содержание обменного калия в почвах повысилось до 489 мг/кг.
Плодородие почвы определяется многими факторами, но главным является содержание и
качественный состав гумуса в почве. Среднее содержание гумуса в хозяйстве с 1991 года по
2006 год снизилось на 0,2%. А для того чтобы повысить содержание гумуса в почве на 0,2%
необходимо вносить от 8 до 10 т навоза на гектар пашни. К 2011 году содержание гумуса в
почве не изменилось. Среднее содержание гумуса по хозяйству – 3,9%.
Таким образом, на данный момент почвы сельскохозяйственных угодий ООО
«Атаманское» (7533,31 га) имеют повышенное содержание подвижного фосфора (33 мг/кг),
высокое содержание калия (489 мг/кг) и низкое содержание гумуса (3,9%).
Сохранить и повысить плодородие почвы возможно при использовании в земледелии
научно-обоснованных агрохимических мероприятий. К ним в первую очередь относится
эффективное применение органических и минеральных удобрений, как главного фактора
повышения урожайности сельскохозяйственных культур, получение высококачественной
продукции, сохранения и воспроизводства почвенного плодородия.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ТРАНСФОРМАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ
ОСТАТКОВ В РАЗЛИЧНЫХ МИНЕРАЛЬНЫХ СРЕДАХ МЕТОДОМ
ДЕНСИМЕТРИЧЕСКОГО ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ
Мальцева А.Н., Пинский Д.Л.
Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино
(Россия)
anasmalts@rambler.ru
210
Почвоведение и биогеохимия
Метод денсиметрического фракционирования позволяет выделить отдельные
функционально значимые группы органического вещества (ОВ), связанного с различной
степенью прочности с минеральной матрицей, без существенных изменений его нативного
состояния. Цель работы - исследование закономерностей перераспределения и стабилизации
ОВ между компонентами различных минеральных субстратов при разложении растительных
остатков (РО). В лабораторных условиях проведена инкубация РО кукурузы в песке и
покровном суглинке при температуре 20° С и влажности 60% ПВ. Из образцов, отобранных в
разные сроки инкубации (1, 3, 6, 9.5 и 19 месяцев), с помощью тяжелой жидкости
поливольфрамата натрия Na6O39W12×H2O последовательно выделены три денсиметрические
фракции: две легкие – < 1.4 (ЛФ-1) и 1.4-2.2 г/см3 (ЛФ-2) и тяжелая – > 2.2 г/см3 (ТФ).
В ходе денсиметрического разделения субстратов установлено, что наибольшим по массе
компонентом исследуемых систем является ТФ. В процессе трансформации РО в суглинке и
песке массовая доля ЛФ-1 постепенно снижается. Доля ЛФ-2 практически не изменяется.
Содержание углерода в ЛФ-2 суглинистого субстрата постепенно увеличивается с увеличением
длительности инкубации. Содержание С и N в ТФ низкое.
Анализ ИКФ-спектров указывает на более сильную координацию гумусовых веществ (ГВ)
фракции > 2.2 г/см3 с минеральной матрицей. Более высокая относительная ароматичность ОВ
тяжелой фракции, наряду с очень низким содержанием органического углерода в ней, повидимому, является следствием аккумуляции наиболее устойчивых ароматических соединений
углерода, принадлежащих гуминовым кислотам. Можно предположить, что ГВ тяжелой
фракции находятся в виде прерывистых пленок, сформированных на наиболее активных
участках поверхности. Образование минералоорганических комплексов в ЛФ-2 суглинистого
субстрата обусловлено, главным образом, содержанием в ней высокодисперсных глинистых
минералов. Достаточно высокая концентрация углерода в ЛФ-2 при её меньшей массовой доле
по сравнению с ТФ указывает на формирование в ней не только поверхностных адсорбционных
минералоорганических комплексов, но и коагулятов комплексно-гетерополярных солей ГВ, не
связанных прочными химическими связями с минеральной матрицей.
ОЦЕНКА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ г. САРАТОВА
Меркулова М.Ю.
Саратовский государственный технический университет им. Гагарина Ю.А., Саратов
(Россия)
merkulik90@mail.ru
Загрязнение почв различными поллютантами нарушает стабильное функционирование
экосистемы: меняются физико-химические параметры почвы, активность основных ферментов,
участвующих в важных биологических процессах, нарушается соотношение основных
биогенных элементов в почве. В связи с этим изучение биохимических процессов,
протекающих в загрязненных почвах, представляет несомненный интерес.
Целью данной работы было изучение ферментативной активности урбаноземов на примере
г. Саратова.
Объектом исследования являлись городские почвы и почвы фоновой территории. Отбор
проб проводили в июне 2010-2011 гг. в наиболее напряженных участках городской территории:
вдоль железнодорожного полотна, на пересечении главных автомагистралей, поблизости от
промышленных предприятий, в селитебных районах старой и новой застройки (21 точка
пробоотбора). В качестве контроля использовали пробы почвы лесопарковой территории дома
отдыха «Ударник», находящегося в 3 км от г. Саратова.
Для определения активности ферментов готовили воздушно-сухие образцы почвы и
исследовали содержание каталазы, дегидрогеназы, уреазы, фосфатазы, инвертазы по методу
Ф.Х. Хазиева (Хазиев,2005, Методы почвенной энзимологии, 252с.).
Во всех пробах почв, собранных на территории г. Саратова, отмечена низкая активность
каталазы. Минимальное значение зафиксированы в пробах, собранных во дворах и на
пустырях, где отмечено сильное уплотнение почвенного покрова вследствие вытаптывания
(0,2-0,7 мл О2/1 г почвы за 1 мин). Во всех почвенных пробах, собранных на территории г.
211
Почвоведение и биогеохимия
Саратова отмечен критический уровень содержания дегидрогеназы, что может
свидетельствовать о высокой степени загрязнения их различными поллютантами. Активность
фосфатазы в исследованных почвах в основном характеризовалась как низкая (0,03 мг
фенолфталеина/г почвы за 1 ч – селитебные зоны города) и средняя (0,45 мг фенолфталеина/г
почвы за 1 ч – в парках и скверах города). Изменение активности уреазы в городских почвах по
сравнению с контролем было установлено в нескольких пробах почв, собранных на улицах
города с невысокой степенью антропогенной нагрузки. Инвертазная активность исследованных
почв характеризовалась как слабая. Пределы колебания активности данного фермента в почвах
г. Саратова составили от 0,3 (автомагистрали в центре города) до 3,8 мг глюкозы в 1 г почвы за
24 ч (фоновая территория).
Полученные данные по оценке активности ферментов в почвах г. Саратова показали
низкий уровень содержания изучаемых ферментов особенно на участках с интенсивной
антропогенной нагрузкой: вблизи промышленных предприятий, автомагистралей и
железнодорожного полотна. Снижение ферментативной активности свидетельствует об
ингибировании почвенной микрофлоры, а следовательно и о слабой степени самоочищения.
ИСТОРИЯ ФОРМИРОВАНИЯ И СОВРЕМЕННОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ
СЕВЕРНЫХ ПОДТИПОВ ЧЕРНОЗЕМОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ
ПАЛЕОКРИОГЕНЕЗА
Овчинников А.Ю.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физикохимических и биологических проблем почвоведения
Научным коллективом было проведено исследование в ареале северных подтипов
черноземов в Тульской области. В результате проведенного исследования выяснилось, что:
1. Цикличность процессов лито-, крио- и педогенеза проявляется как во времени, так и в
пространстве.
2. На формирование и функционирование современных черноземов, влияют
разновозрастные явления палеокриогенеза.
3. Каждому из элементов палеокриогенного микрорельефа соответствует свой тип профиля,
определяемый наличием или отсутствием определенных генетических горизонтов, формой и
степенью выраженности отдельных морфологических признаков, изменчивостью физикохимических и физических свойств.
4. Позднеплейстоценовые покровные лессовидные суглинки и погребенные почвы центра
Восточно-Европейской равнины представляют собой циклически построенную толщу.
5. Многочисленные и разнообразные реликтовые криогенные явления участвуют в
дифференциации почвенного покрова.
Работа выполнена по проекту РФФИ № 11-04-00354.
НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ПОДЩЕЛАЧИВАНИЕ ЧЕРНОЗЕМА
ВЫЩЕЛОЧЕННОГО ПОД ЛЕКАРСТВЕННЫМИ РАСТЕНИЯМИ
Парамонов А.Ю., Свистова И.Д.
Воронежский государственный педагогический университет, Воронеж (Россия)
andrey-2008@freemail.ru
Известно, что лекарственные растения накапливают биологически-активные вещества. К
ним относятся гликозиды, флавоноиды, эфирные масла, сапонины, дубильные вещества,
кумарины, алкалоиды. Вторичные метаболиты влияют на жизнедеятельность самих растений и
обеспечивают их лечебное действие. По нашему предположению, вторичные метаболиты
лекарственных растений в составе корневых экссудатов могут оказывать влияние также и на
свойства почвы. Целью работы было изучение влияние вторичных метаболитов лекарственных
растений на ППК чернозема. Изучали влияние 20 видов лекарственных растений 11 семейств.
212
Почвоведение и биогеохимия
Нами впервые обнаружено, что лекарственные растения различных семейств в трехлетней
монокультуре вызвали подщелачивание почвы в разной степени. Происходило снижение как
актуальной, так и обменной и гидролитической кислотности почвы. В почве под растениями
семейств Камнеломковые, Зонтичные, Барбарисовые, Гречишные повышение рН водн.
составляло 0,3-0,6 ед.; под растениями семейств Губоцветные, Розовые и Астровые рост рН
варьировал от 0,6 до 0,9 ед.; наибольшее подщелачивание почвенного раствора наблюдались
под растениями семейств Валериановые, Бурачниковые и Рутовые - до 0,9-1,1 ед. Динамика
обменной кислотности была аналогичной, но подщелачивание выражено несколько сильнее.
Показатель гидролитической кислотности чернозема снижался на 0,2-0,5 мг-экв./100 г под
отдельными семействами лекарственных растений.
По нашему мнению, этот эффект определяется тем, что биологически-активные вещества
растений фенольной природы активно выделяются в почву в составе корневых экссудатов. В
водном растворе они диссоциируют с образованием фенильных анионов. В результате
анионного обмена происходит «выдавливание» фенильными анионами гидроксильных ионов
из ППК. Нарушения ППК более выражены под растениями семейств Губоцветные и
Валериановые.
Таким образом, впервые было обнаружено неспецифическое подщелачивание почвы
чернозема выщелоченного под лекарственными растениями разных семейств, обусловленное
синтезом и активной прижизненной экскрецией в почву вторичных метаболитов фенольной
природы. По-видимому, эти нарушения кислотного режима могут вызывать нарушения
численности и состава микробного сообщества почвы. Данные могут быть полезны для
разработки севооборотов лекарственных растений.
МИКРОБНОЕ СООБЩЕСТВО ЧЕРНОЗЕМА ВЫЩЕЛОЧЕННОГО ПРИ
ВОЗДЕЛЫВАНИИ КУКУРУЗЫ (ZEA MAYS) В КАЧЕСТВЕ МОНОКУЛЬТУРЫ
Романычева А.А.
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва (Россия)
kai-ren@yandex.ru
Уникальность кукурузы состоит в высокой потенциальной урожайности и устойчивости к
бессменному возделыванию. Целью нашего исследования являлось изучение почвенных
микробоценозов двух участков чернозема выщелоченного (Воронежская обл.): 50-летних
черного пара и монокультуры кукурузы, продуктивность которой за этот период не снизилась.
Состав микробного сообщества определяли молекулярным методом газовой хроматографии –
масс-спектрометрии по микробным маркерам (жирным кислотам, альдегидам и
гидроксикислотам). Агрохимические характеристики определяли стандартными методами и на
C/N анализаторе. Содержание гумуса в слоях 0-20 см составило: 5,6%, Nобщ 0,3%, подвижного
P2O5 9,9-12,5мг/100г, подвижного K2O 10,3-11,6 мг/100 г, pHkcl 5,5.
Реконструировано 43 бактериальных вида, относящихся к 32 родам. В образцах почвы при
возделывании кукурузы отмечено снижение числа видов микроорганизмов вниз по почвенному
профилю: 37–33–33, в условиях черного пара их количество существенно не изменялось: 36–
37–37 видов (на глубине 0-10, 10-20, 30-40 см, соответственно). Индекс биоразнообразия
Шеннона на обоих участках был высокий: для монокультуры кукурузы 5,1–5,3–5,6; для
черного пара 6,7–4,8–5,6 (на вышеперечисленных глубинах, соответственно). Общая
численность микроорганизмов для слоя почвы 0-10 см под монокультурой кукурузы и в почве
парующего участка почти не отличалась (3,6 и 3,4 кл/г×107, соответственно). Вниз по
почвенному профилю микробная численность в почве парующего участка возрастала на один –
два порядка (2,9 кл/г×108 и 4,9 кл/г×109), в то время как в условиях возделывания кукурузы
данный показатель существенно не изменялся (4-5 кл/г×107).
В исследуемых почвах обоих участков доминировала устойчивая аэробно-анаэробная
ассоциация Rhodococcus spp.– Propionibacterium spp. В целом, микробные сообщества
исследуемых участков чернозема близки по видовому составу. По сравнению с черным паром,
в микробоценозе почвы при возделывании кукурузы было отмечено меньшее число
бактериальных видов и количество доминантов, с глубиной разница увеличивалась.
213
Почвоведение и биогеохимия
Существенное влияние, по-видимому, оказал характер ризодепозитов кукурузы, возделываемой
как монокультура, и фитоценоза черного пара при 50-ти летней сельскохозяйственной
практике.
ИЗМЕНЕНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА НА АРХЕОЛОГИЧЕСКИХ
ПАМЯТНИКАХ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ*
Сафарова Л.Р., Якимов А.С.
Институт криосферы Земли СО РАН, Тюмень (Россия)
luizasaf@mail.ru
При проведении полевых исследований на поселениях были заложены почвенные разрезы
на основных элементах планиграфии (местах древних жилищ, межжилищных пространствах,
зольниках). Кроме этого проведены исследования недавно заброшенных сельскохозяйственных
объектов (ферма, дойка, двор перед коровником, заброшенное село), которые являлись
эталонами при сравнительном анализе данных. Определение химического состава образцов
выполнено методом рентгенфлуоресцентной спектроскопия с применением спектрометра
«Спектроскан МАКС – GV», с последующей интерпретацией данных**.
Нами были проанализированы данные по 11 основным элементам, которые разделены
нами на две группы: первая группа – элементы, чья концентрация с глубиной уменьшается
(Na2O, MgO, P2O5, S, CaO, MnO) и вторая группа – где, напротив, с глубиной наблюдается
увеличение концентрации (Al2O3, SiO2, K2O, TiO2, Fe2O3). Было установлено, что в жилищных
впадинах и зольниках в нижней части культурных слоёв наблюдаются максимальные
концентрации элементов, особенно фосфора и кальция. Следует отметить, что фосфор является
биофильным элементом и его поступление в почву связано, как правило, с органическими
остатками.
На поселениях это может быть связано с поступлением костного материала. В
межжилищных пространствах основная аккумуляция элементов приурочена к верхней части
почвенных профилей. В тоже время в современных почвах в окрестностях памятников
концентрации элементов по профилям равномерные и не превышают фоновых значений. Мы
считаем, что наибольшая трансформация на поселениях была в местах нахождения жилищ и
зольников (свалок). В межжилищных пространствах степень трансформации была слабой, в
редких случаях средней степени.
На памятниках бронзового века отмечаются высокие концентрации биофильных и
биогенных элементов в культурных слоях, а также сильная и средняя степень трансформации
почвенного покрова. Учитывая эти данные, а также представления археологов о культурах
этого времени можно говорить о преобладании скотоводства в общей структуре хозяйства. По
всей вероятности, скот содержался на территории поселений. Среди изученных эталонов
похожая ситуация наблюдалась на ферме, где скот содержался круглогодично.
*Работа выполнена по программе Президиума РАН №16.9. «Эволюция природных
факторов опустынивания в позднем кайнозое Северной и Центральной Азии по материалам
изучения субаэральных образований»; гранту Лаврентьевского конкурса молодежных проектов
СО РАН «Изменение климата в лесостепной полосе Западной Сибири и его влияние на
цикличность систем землепользования древнего населения за последние 4000 лет».
**Рентгенфлуоресцентная спектроскопия выполнена в лаборатории геохимии и
минералогии почв Института физико-химических и биологических проблем почвоведения
РАН, г. Пущино.
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В СИСТЕМЕ ПОЧВА-РАСТЕНИЯ В
УСЛОВИЯХ ВОЛЖСКО-КАМСКОГО ЗАПОВЕДНИКА
Сибгатуллина М.Ш., Александрова А.Б.
ГБУ Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики
Татарстан, Казань (Россия)
214
Почвоведение и биогеохимия
sibmad@list.ru
В работе изучено содержание микроэлементов (МЭ) Mn, Fe, Zn, Cu, Cr, Co, Ni, Cd, Pb и
основные особенности их распределения в биогеохимической цепи почвы – травянистые
растения в хвойных и хвойно-широколиственных фитоценозах Волжско-Камского
заповедника. Дерново-подзолистые легкосуглинистые глубоко и сверхглубокоосветленные
почвы заповедника формируются на аллювиально-делювиальных супесчаных отложениях и
характеризуются элювиально-иллювиальной дифференциацией МЭ в профиле. Дерновоподзолистые супесчаные и песчаные мелко и неглубокоосветленные почвы формируются на
рыхлых песчаных отложениях и отличаются менее выраженным элювиально-иллювиальным
распределением МЭ в профиле.
В дерново-подзолистых почвах заповедника содержание изученных МЭ не превышает
региональный кларк МЭ для почв Татарстана и варьирует в диапазоне (мг/кг): Mn 140-639, Fe
2144-5071, Zn 9.5-46, Cu 2.8-8.2, Ni 3.0-11, Pb 2.7-8.1, Cd 0.1-0.4, Cr 4.3-7.7, Co 3.2-23. Почвы на
эоловых отложениях отличаются низким уровнем обеспеченности мобильными формами Zn и
Cu, на аллювиально-делювиальных – низкой обеспеченностью подвижными формами Cu и
повышенным содержанием подвижных форм Mn. Содержание валовых форм Mn, Fe, Zn, Ni, Pb,
Cr, Co и Cu, а также подвижных форм Mn, Zn, Ni, Cd и Cr значительно выше (p<0.05) в почвах
на аллювиально-делювиальных отложениях вследствие их более высокой сорбционной емкости
по сравнению с почвами на эоловых отложениях.
Содержание МЭ в травянистых растениях обнаружено в концентрациях (мг/кг): Mn 68-190,
Fe 113-149, Zn 20-49, Cu 3.6-7.3, Ni 1.3-3.9, Pb 0.95-2.2, Cd 0.07-0.33, Cr 0.21-0.59, Co 0.21-0.47.
На избирательность аккумуляции МЭ растениями влияют литологические особенности
дерново-подзолистых почв заповедника. Растения на почвах эоловых отложений отличаются
более высоким содержанием Mn и Cu, но меньшим содержанием Fe и Zn, чем растения на
почвах аллювиально-делювиальных отложений. По величине биогеохимической активности
(БХА) исследованные растения были расположены в следующий ряд: черника > Pleurozium>
Sphagnum > костяника > орляк > ландыш > пролесник > копытень ≥ сныть > щитовник ≥ осока
> кочедыжник. БХА растений наиболее сильно проявляется на почвах, сформированных
эоловыми отложениями, вследствие их низкой обеспеченности доступными для поглощения
формами МЭ и легким гранулометрическим составом.
СНИЖАЕТСЯ ЛИ ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОЧВЕННОГО ДЫХАНИЯ ПРИ
ПРИБЛИЖЕНИИ К МЕДЕПЛАВИЛЬНОМУ ЗАВОДУ?
Сморкалов И.А., Воробейчик Е.Л.
Институт экологии растений и животных УрО РАН, Екатеринбург (Россия)
vo_la_kroms@mail.ru
Почвенное дыхание широко используется как интегральная характеристика
функционального состояния почвенной биоты. Из многих работ, посвященных влиянию
загрязнения на дыхание, лишь в единичных оценивают эмиссию CO2 in situ; при этом
обнаружено как снижение ее интенсивности, так и отсутствие изменений. Противоречивость
немногочисленных данных обуславливает необходимость накопления большего объема
информации о влиянии загрязнения на почвенное дыхание в природных условиях. Цель работы
– охарактеризовать изменение интенсивности эмиссии CO2 с поверхности почвы в двух
градиентах промышленного загрязнения.
Работы проведены в июле–августе 2010–2011 гг. возле двух крупных предприятий Урала –
Среднеуральского (СУМЗ) и Карабашского (КМЗ) медеплавильных заводов В обоих районах
выражены фоновая (20–30 км от завода), буферная (4–15 км) и импактная (до 2–5 км) зоны,
характеризующие последовательные стадии техногенной дигрессии лесов. В каждом градиенте
выбрали по 10 участков (по 3 пробные площади на участок, по 5 (2010 г.) и 15 (2011 г.)
измерений дыхания на площадку). Скорость потока СО2 измеряли закрытым динамическим
камерным методом (респирометр SR1LP, Qubit Systems, Канада). Всего выполнено 1195
измерений.
215
Почвоведение и биогеохимия
Диапазон интенсивности дыхания (мг СО2/м2*ч) в градиентах был широк: в районе СУМЗа
– 350–950 (2010 г.) и 400–1500 (2011 г.), КМЗ – 60–1150 (2010 г.) и 10–1500 (2011 г.).
Оказалось, что загрязнение слабо влияет на почвенное дыхание: его резкое снижение
наблюдается только на участке техногенной пустоши в районе КМЗ), тогда как на остальной
территории оно почти не выходит за границы естественного варьирования. В 2010 г. не было
обнаружено связи дыхания ни с расстоянием до завода, ни с концентрациями металлов в
подстилке; в 2011 г. была выявлена слабая связь, но средняя величина дыхания в импактной
зоне обоих районов (при исключении пустоши) оказалась лишь в 1.5–1.8 раза ниже по
сравнению с фоновой. Разница между фоновой и импактной зонами свелась к тому, что в
последнем случае отсутствуют высокие значения интенсивности дыхания, которые, наряду с
низкими, регистрируются в фоновой зоне.
Характер влияния загрязнения на почвенное дыхание в обоих районах оказался сходным,
хотя они различаются и по климатическим условиям, и по характеру растительности.
Таким образом, почвенное дыхание – достаточно консервативная функциональная
экосистемная характеристика, в значительной степени инвариантная к структурным
изменениям биоты, вызванным токсической нагрузкой. Относительную стабильность
почвенного дыхания в градиенте промышленного загрязнения мы рассматриваем как
подтверждение гипотезы о функциональной избыточности биотических сообществ.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект 11-05-01218), Президиума РАН (проект
12-П-4-1057) и Инновационного гранта Президиума УрО РАН (молодежный проект 11-4-ИП345).
ПРИМЕНЕНИЕ КОРРЕЛЯЦИОННО-РЕГРЕССИОННОГО АНАЛИЗА К
ИССЛЕДОВАНИЮ Pb В ПОЧВЕ
Тагунова Е.О.
Днепропетровский национальный университет им. О. Гончара, Днепропетровск
(Украина)
zapisky@bk.ru
Исследование микроэлементного состава почвы как итогового компонента наземного
биогеоценоза является важной задачей экологического и природоохранного характера. Как
известно, микроэлементы (следовые элементы) в ультрамикроколичествах необходимы для
нормального развития и функционирования всех живых существ, однако их чрезмерное
накопление в организме может привести к существенным негативным последствиям.
Естественным источником поступления следовых элементов в биообъекты является почва, что
обуславливает необходимость ее объективного и оперативного микроэлементного анализа.
Одним из подходов к оценке содержания следовых элементов в почве является
использование корреляционно-регрессионного анализа зависимости ее микроэлементного
состава от физико-химических свойств. Результаты исследования приведем на примере одного
из приоритетных поллютантов, тяжелого металла первого класса опасности – Pb в черноземе
обыкновенном карбонатном, малогумусном, среднесуглинистом на лессах.
Были вычислены коэффициенты корреляции между содержанием подвижных форм Pb в
почве и ее кислотностью, сухим остатком водной вытяжки, фракцией физической глины,
гумусом, гигроскопической влажностью, общей пористостью и твердостью. Определение
свойств чернозема обыкновенного проводилось по общепринятым в практике почвоведения
методикам, содержание подвижных форм Pb анализировалось методом атомно-абсорбционной
спектрофотометрии, экстрагент – аммонийно-ацетатный буфер, pH = 4,8. Уровень значимости
0,05.
Наибольшая по силе корреляционная связь с концентрацией подвижных форм Pb в
черноземе обыкновенном характерна для содержания в нем фракции физической глины
(коэффициент корреляции r = -0,70, связь характеризуется как сильная обратная). Средняя
обратная корреляционная связь содержания подвижного Pbзафиксирована с общей
пористостью почвы (r = -0,65), умеренная обратная связь – с кислотностью водной вытяжки (r
= -0,34). Слабая положительная корреляционная связь предмета исследования отмечена с
216
Почвоведение и биогеохимия
твердостью почвы (r = 0,27) и сухим остатком водной вытяжки (r = 0,26), слабая отрицательная
– с содержанием гумуса (r= -0,28) и гигроскопической влажностью (r = -0,25).
С целью выявления приоритетного факторного признака были рассчитаны частные
коэффициенты корреляции содержания подвижного Pb в черноземе обыкновенном и
почвенных свойств, охарактеризовавшихся наиболее высокими значениями парных
коэффициентов корреляции. Результаты анализа подтвердили ведущую роль фракции
физической глины для содержания подвижных форм Pb в почве. Аналитическое описание
зависимости между данными признаками представлено нами в виде уравнения линейной
регрессии y = -0,02x + 1,81, где x – содержание фракции физической глины, y – концентрация
подвижного Pb в черноземе обыкновенном.
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СЕВЕРОТАЕЖНЫХ ТОРФЯНИСТОПОДЗОЛИСТО-ГЛЕЕВАТЫХ ПОЧВ (НА СУПЕСЧАНЫХ ПОРОДАХ,
ПОДСТИЛАЕМЫХ СУГЛИНКАМИ) ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРО-ВОСТОКА
Холопов Ю.В.
Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар (Россия)
Vegalyn@mail.ru
Исследования выполнены в подзоне северной тайги Европейского Северо-Востока (в
пределах Республики Коми). Характеристика рассматриваемых почв дается на базе двух
разрезов: Разрез Р-3-Х.( 64° 51' с. ш. 57° 37' в. д.) Северная тайга, среднегодовая температура
воздуха минус 1.05 ◦С[1]. Разрез Р-4-Х. (66° 39' с.ш. 62° 30' в.д.) Крайнесеверная тайга,
среднегодовая температура воздуха минус 5◦ С[1]. Описываемые почвы формируются на
северном пределе таежной зоны в условиях слабодренированных местообитаний. По
температурному режиму это сезонно-мерзлотные почвы полугидроморфного ряда, водный
режим промывной с периодическим застойным увлажнением[1]. Генетические признаки
торфянисто-подзолисто-глееватых почв на супесях, подстилаемых суглинками северной тайги
(Р-3-Х) и крайнесеверной тайги (Р-4-Х) близки. Они обладают высокой кислотностью,
выщелочены от обменных оснований, оглеены по всему профилю. В этих почвах развита
нисходящая миграция ненасыщенных органических кислот и органо-минеральных
комплексных соединений с оксалато-растворимыми оксидами железа и алюминия.
Рассматриваемые почвы бедны гумусом, содержание его по профилю не превышает 1%.
Данные реологических исследований указывают на некоторые изменения свойств коллойдной
структуры почв к северу. В крайнесеверной тайге (Р-4-Х) в горизонте A2hg появляются
признаки тиксотропии. В северной тайге данный признак отсутствует. Различия исследуемых
почв в способности к структурообразованию, вероятно, зависят от степени выноса илистых и
коллойдных частиц в процессе эллювиально-глеевого почвообразования, а также от природы
частиц (наличие реакционно-способных групп, взаимодействия частиц друг с другом)[3].
Таким образом, северотаежным торфянисто-подзолисто-глееватым почвам на супесях,
подстилаемых суглинками, характерно развитие подзолисто-элювиального и глеевого
процессов по всему профилю. Морфо-генетической особенностью исследуемых почв является
формирование подзолисто-глеевого элювиально-гумусового гидрофильного горизонта A2hg. В
крайнесеверной тайге горизонт A2hg имеет тиксотропные свойства, являющееся, вероятно,
актуальной генетической особенностью данных почв. ЛИТЕРАТУРА 1. Атлас Коми АССР,
1964. 2. Лиштван И.И., Круглицкий Н.Н., Третинник В.Ю. Физико-химическая механика
гуминовых веществ. Мн., «Наука и техника», 1976, 264 с.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СОВРЕМЕННОЙ И ПОГРЕБЕННОЙ
КАШТАНОВЫХ ПОЧВ
Чернышева Е.В.
Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино
(Россия)
217
Почвоведение и биогеохимия
chernysheva1988@gmail.com
В образцах современной каштановой почвы и палеопочвы, погребенной под
оборонительным валом Анны Иоанновны (1718-1720 гг.) определяли биомассу
микроорганизмов, дающих респираторный отклик на внесение глюкозы методом субстратиндуцированного дыхания, биомассу бактерий методом люминесцентной микроскопии и
биомассу и структуру микроскопических грибов прямым счетом на мембранных фильтрах с
использованием красителя дианилового голубого, позволяющего дифференцировать
темноокрашенный и светлоокрашенный мицелий. Биомассу микроорганизмов рассчитывали с
учетом содержания углерода в клетках равным 40%.
В исследуемых почвах максимальная активная микробная биомасса была отмечена в
современной каштановой почве, где она составляла 283 мкг C/г почвы. В нижележащих
горизонтах значения этого показателя были на порядок ниже. Так, в горизонте В1 активная
микробная биомасса составляла 34 мкг C/г почвы, а в горизонте В2 – 30 мкг С/г почвы.
В погребенной каштановой почве величина активной микробной биомассы была
значительно ниже, чем в современной, и изменение этого показателя по профилю палеопочвы
было выражено менее ярко. Активная микробная биомасса здесь варьировала в пределах от 22
мкг С/г почвы в горизонте А1 до 8 мкг С/г в горизонте В2. Таким образом, за 300 лет
пребывания в погребенном состоянии активность микроорганизмов уменьшилась в 13 раз в
горизонте А1, и лишь в 2 и 4 раза в горизонтах В1 и В2 соответственно.
Наибольшая биомасса бактерий была отмечена в погребенной почве, где она варьировала в
пределах от 260 мкг С/г почвы в горизонте А1 до 356 мкг С/г в горизонте В2. В современной
почве значения этого показателя были несколько меньше. Так, в горизонте А1 она составляла
211 мкг С/г почвы, а в нижележащих горизонтах около 290 мкг С/г почвы.
По содержанию микроскопических грибов, современная и погребенная почвы различались
несущественно. В горизонте А1 современной почвы биомасса мицелия составляла 51 мкг С/г
почвы, а в этом же горизонте погребенной почвы – 39 мкг С/г. В иллювиальной части профиля
современной и погребенной почвы биомасса мицелия была несколько выше: 52 и 41 мкг С/г
соответственно. В горизонте В2 различия в биомассе грибного мицелия не выявлены; и в том, и
другом случае биомасса не превышала 25 мкг С/г почвы.
В результате пребывания в погребенном состоянии произошло изменение структуры
грибного мицелия, в первую очередь это отразилось на биомассе светлоокрашенных гиф. Так, в
погребенной почве доля светлоокрашенного мицелия составляла не более 27%, тогда как в
современной почве наблюдалось возрастание его доли до 60%.
ИЗМЕНЕНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЧВЫ,
ЗАГРЯЗНЁННОЙ ОТРАБОТАННЫМ МОТОРНЫМ МАСЛОМ
Яценко В.С., Стрижакова Е.Р.
Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино
(Россия)
vika20388@mail.ru
Одними из приоритетных загрязнителей почв являются нефтепродукты и в частности
отработанное моторное масло (ОММ). Загрязнение почв ОММ происходит на станциях
техобслуживания, вокруг АЗС, вдоль автодорог. Пропитывая почву, ОММ изменяет её
физические и химические свойства, ухудшает доступ кислорода, питательных веществ и влаги
растениям, повышает её токсичность. Ранее было показано, что внесение сорбентов, в
частности активированного угля, может существенно ускорить рекультивацию почв, сильно
загрязнённых некоторыми органическими химикатами, а также улучшить их физические и
биологические свойства (Васильева и др., 1996, 2006).
Целью исследований было изучить действия ОММ и некоторых сорбентов на физические и
биологические свойства почвы, изучить изменение этих характеристик почвы в ходе её
рекультивации. Исследования проводили в условиях микрополевого эксперимента на серой
лесной почве. Очистку почвы, загрязненной 5% ОММ, проводили методом агрокультивации.
Изучали действие гранулированного активированного угля марки ГАУ ВСК (г. Дзержинск) и
218
Почвоведение и биогеохимия
препарата «Спилсорб» (пр-во Канады). Помимо сорбентов в почву вносили ассоциацию
микроорганизмов родовRhodococcus и Pseudomonas, способных расти на УВН в качестве
единственного источника углерода и энергии (выделена в лаб. А.М. Боронина, ИБФМ РАН). В
ходе эксперимента периодически определяли содержание УВН в почве, рН, NPK, удельную
плотность и предельную полевую влагоёмкость (ППВ), фито- и биотоксичность почвы.
Исследования показали, что разложение ОММ протекает постадийно, и в конце 1-го сезона
в почве остается трудно разлагаемый остаток, составляющий 30-35% от суммы углеводородов.
При этом разложение ОММ сопровождается накоплением окисленных соединений, которые
создают повышенную токсичность. Внесение биопрепарата ускоряет детоксикацию почвы не
более, чем на 5%. Лишь в присутствии ГАУ концентрация доступных токсикантов заметно
снижается вследствие их ускоренной биодеградации и/или сорбции, что способствует резкому
снижению фито- и биотоксичности почвы. Это обеспечило более благоприятные условия для
роста растений в очищенной почве, в то время как в почве без ГАУ наблюдалось сильное
угнетение роста растений клевера. Внесение Спилсорба в загрязнённую почву сопровождалось
значительным её подкислением (до рН 5,0) вследствие разложения волокон самого сорбента и
накопления органических кислот.
Установлено, что в почве загрязнённой ОММ резко снижается влагоёмкость почвы и
увеличивается её плотность. Внесение ГАУ, как в чистую, так и загрязнённую почву, приводит
к снижению удельной плотности и увеличению влагоёмкости почвы, что положительно
сказывается на процессах её самоочищения. Почва хорошо аэрируется, в ней создаются
благоприятные условия для накопления микробной биомассы, участвующей в разложении
углеводородов нефти. Применять Спилсорб следует осторожно, так как его использование
может привести к негативным последствиям для почвы.
219
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
СЕКЦИЯ «Приборы и методы для биологии,
биотехнологии и медицины»
БЕСКЛЕТОЧНАЯ ТКАНЕВАЯ ПОРИСТАЯ МАТРИЦА НА ОСНОВЕ
ХИТОЗАНА
Семенов П.С., Майоров С.А.
ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный университет», Волгоград (Россия)
medbiolab@gmail.com
Широкое развитие технологий использующих биологические полимеры и в частности
биоинженерия, стимулируют к поиску новых методов позволяющих создавать 3D скаффолды
пригодные к применению не только для экспериментального моделирования in vivo и in vitro
процессов биосовместимости и биодеградации полимеров, но и для реального использования в
медицине и ветеринарии. Одним из основных критериев качества изготовления матрицы
является аппаратное обеспечение. Не смотря на кажущуюся простоту изготовления объемных
скаффолдов, именно данное обстоятельство делает процесс их производства малодоступным в
отечественной биоинженерной технологии.
Хитозан является производным хитина, широко распространенного в природе
полисахарида, синтезируемого низшими животными и грибами, у которых он входит в состав
наружного скелета и клеточных стенок. Хитозан представляет собой полимер, мономерами
которого являются случайно-связанные β-(1-4) D-глюкозаминовые звенья и N-ацетил-Dглюкозамин. Сегодня хитозан, благодаря высокой биосовместимости и способности к
биодеградации, находит широкое применение в биомедицине, в том числе – для биоинженерии
тканевых матриксов.
Используемый в настоящее время метод лиофильной сушки лимитирует форму и размер
биоконструкции и ограничивает воспроизводимость физико-химических свойств получаемых
скаффолдов. Исходя из вышеизложенных проблем, нами был разработан качественно новый
метод создания бесклеточных тканевых матриц на основе хитозана.
Осаждение растворенного хитозана при подборе режима, давало частицы размером 50 –
100 мкм, которые после извлечения из раствора, подвергали формованию и сушке методом
замораживания - оттаивания в переменах температур -20 - + 20 °С, с постоянной механической
эвакуацией отходящей жидкости и конденсата. Для окончательного осушения до
кондиционной влажности готовой матрицы, предназначенной для использования, последнюю
промывали в двух порциях 70 ° этанола и помещали на хранение в свежий 70 ° этанол. Перед
применением матрицы для манипуляций с культурами клеток ее промывали в двух сменах
стерильной культуральной среды, при моделировании in vivo в стерильном физиологическом
растворе или аналогичной жидкости. Вышеизложенный краткий протокол позволял в короткие
сроки получать 3D пористый скаффолд на основе хитозана, с хорошо прогонозируемыми
параметрами.
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ БИОДЕГРАДАБЕЛЬНЫХ
ПЛАСТМАСС
Алексеенко З.И.
Национальный университет пищевых технологий, Киев (Украина)
bublic2@i.ua
Трудности утилизации пластмасс нефтяного происхождения делают их использование
нежелательным. Природные механизмы саморегуляции не могут решить проблему накопления
чужеродных загрязняющих веществ. Это подтолкнуло многие страны начать разработку
технологий получения биодеградабельных пластмасс. Создание экологически безопасных
продуктов, таких как биопластик, является первым шагом к преодолению проблемы
загрязнения окружающей среды пластиковыми отходами. Поэтому, целью нашей работы был
220
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
анализ новых перспективных разработок в области получения биодеградабельных полимерных
материалов и их сравнение.
Альтернатив пластиковой упаковке пока не найдена, потому что она дешевая, практичная и
простая в производстве. Одним из вариантов достижения компромисса между потребителями,
экологами и предприятиями может стать использование в производстве пластиковой упаковки
добавок, обеспечивающих разложение пластмасс.
Другой альтернативой пластикам химического происхождения является использование
биопластиков.
Различные
механизмы
разложения
позволили
классифицировать
биодеградабельные пластики на три группы: фото-, полубио- и полностью биодеградабельные.
Перспективными продуцентами ПГА являются рекомбинантные бактерии (Escherichia coli,
Pseudomonas putida, Ralstonia eutropha, Sphingobacterium sp. ATM и др.) и генетически
модифицированные растения. Перспективным также является использование дешевых и
продуктивных субстратов для выращивания рекомбинантных бактерий-продуцентов ПГА.
Сравнивая свойства биопластиков и традиционных пластмасс с добавлением
биодегадирующих веществ, нужно отметить, что обычные пластики с добавками дешевы,
сохраняют все свойства обычных пластмасс, не требуют особенных условий внешней среды
для разложения. Биодеградабельные пластики значительно дороже, имеют низкие барьерные
свойства, требуют особенных условий внешней среды для разложения, хрупкие.
Проанализировав данные о свойствах биодеградабельных полимеров и пластмасс с
добавлением добавки d2w, можно подумать, что эта добавка решает проблему утилизации
пластиковых отходов, ведь она эффективна и приводит к незначительному (на 4-5%)
удорожанию продукции, в то время как использование биопластиков ведёт к удорожанию в 5-6
раз. Но это впечатление ошибочно. Добавка d2w может быть использована для деградации уже
накопленных пластиковых отходов путём их повторной переработки с добавлением d2w. Эта
добавка может лишь отсрочить использование биопластиков, ведь её добавляют в полимеры
нефтяного происхождения, а нефть – невозобновляемый ресурс Земли и её количество
уменьшается. Когда запасы нефти исчерпаются, проблема упаковочных материалов появится
снова и единственным путем её решения будет использование пластиков на основе
возобновляемых видов биологического сырья, т.е. биопластиков. Соответственно, разработка
эффективных технологий их производства абсолютно необходима.
ДОПЛЕРОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД РЕГИСТРАЦИИ СЕРДЕЧНЫХ РИТМОВ
ПЛОДА
Гомов Е.Е.1,2, Казанцев А.П.1
Институт биологического приборостроения РАН; Пущинский государственный
университет, Пущино (Россия)
Общепризнанным инструментальным методом диагностики заболеваний внутриутробного
плода является кардиотокография, в основе которой лежит анализ вариабельности частоты
сердечных сокращений плода (ЧССП), иначе, вариабельности его сердечного ритма. Для
записи ритмограмм в настоящее время используются ультразвуковые приборы на эффекте
Доплера. Ультразвуковые (2÷3 МГц) волны низкой мощности, излучаемые зондом прибора,
отражаясь от сокращающегося сердца плода, меняют свою длину, и переносят, таким образом,
информацию о динамике сокращения. Выходной сигнал зонда – доплерограмма, представляет
собой модулированные по амплитуде и частоте гармонические колебания. Их переменная
амплитуда передает мгновенные изменения объема сердца, а переменная частота в основном
отражает мгновенную проекцию суммарного вектора скоростей потоков крови.
Амплитудная огибающая доплерограммы подвержена искажениям, часто проявляющимся
при движении плода или смещении зонда. Нами показано, что устойчивое к возмущениям и
искажениям амплитуды детектирование ритма получается после частотной демодуляции
доплерограммы. Выделение низкочастотного сигнала ритма из доплерограммы выполнялось
численным методом с промежуточным преобразованием в синфазную и квадратурную
составляющие ее комплексной огибающей.
221
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
Ритмограмма,
получаемая
из
доплерограммы,
является
последовательностью
«мгновенных» значений ЧССП для дискретных моментов времени. ЧССП вычисляется на
представительном ряде отсчетов низкочастотного сигнала ритма. Шаг дискретного времени
задает сдвиг начала очередного ряда. Разработан адаптивный алгоритм вычисления мгновенной
ЧССП по ряду частот спектра мощности сигнала ритма после дискретного преобразования
Фурье. Используется метод авторегрессии, повышающий точность измерения ЧССП и
обеспечивающий интерполяцию ритмограммы при кратковременной потере сигнала.
ЧИСЛЕННОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ В
ЗАДАЧАХ ФИЗИОТЕРАПИИ
Готовский М.Ю., Перов С.Ю.
ООО ЦИМС ИМЕДИС, Москва (Россия)
gm@imedis.ru
В современной медицинской практике широко применяются все доступные формы
электромагнитной энергии – от статического электричества до сверхвысокочастотных
электромагнитных полей. Каждая диапазон обладает разнообразными терапевтическими
эффектами, связанными не только с частотой воздействия, но и с интенсивностью. Однако, в
последние десятилетие акцент применения электромагнитной энергии в физиотерапии
сместился в сторону использоваться низкочастотных электрических и магнитных полей. В
настоящее времени установлен единственный механизм взаимодействия низкочастотных
электрических и магнитных полей с биологическими объектами – возникновение на
поверхности и в глубине тела индуцированных (наведенных) токов, которые и являются
основными дозиметрическими параметрами, определяющими биологический эффект
воздействия.
К сожалению, в большинстве случаев низкочастотная терапия основана на субъективных
биологических ответах, что вносит сложность в оценке терапевтического действия. Данную
проблему можно решить, численным моделированием условий воздействия и объектов
облучения, включая гетерогенную структуру биологического тела. Именно неоднородность
тела с учетом специфических диэлектрических свойств тканей вызывает разные
индуцированные токи в органах. В связи с этим целью настоящей работы является
теоретическая оценка индуцированных в моделях (фантомах) некоторых тканей токов при
воздействии низкочастотными магнитными полями токов.
В качестве источника переменного магнитного поля использовался индуктор-соленоид
аппарата для экзогенной биорезонансной терапии «МИНИ-ЭКСПЕРТ-Т». Для создания и
решения числовых моделей использовалась программе SEMCAD X (SPEAG, Швейцария).
Величина индукции магнитного поля при моделировании составляла 2 мТл, при этом
использовались частоты 9,4 Гц, 20 Гц, 100 Гц, 250 Гц, 465 Гц, 600 Гц и 800 Гц. В моделях
индуктор-соленоид располагался непосредственно на поверхности плоскостного фантома.
Анализ величин и структур распределения индуцированных токов в гомогенных и
гетерогенных фантомах мышечной, жировой и костной тканях числовых моделей показал их
зависимость от диэлектрических параметров тканей, а также от характера их дисперсии в
исследованном диапазоне частот.
Максимальная дисперсия наблюдается у мышечной ткани, затем следует жировая и
костная ткани. Также характером формирования индуцированных токов является и
проводимость тканей, которая определяется содержанием в них воды. Таким образом,
максимальная проводимость у мышечной ткани, меньшая у жировой ткани и самая низкая у
костной ткани. Все эти зависимости определяют характер и величину индуцированных в
исследованных моделях тканей токов, которые являются важным фактором в формировании
биологических эффектов действия переменного магнитного поля низкой частоты, как и
показано в проведенных нами исследованиях.
222
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК С
АНТИТЕЛАМИ ПРИ ПОМОЩИ РЕЗОНАТОРА С ПОПЕРЕЧНЫМ
ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ПОЛЕМ
Гулий О.И., Зайцев Б.Д., Кузнецова И.Е., Шихабудинов А.М., Матора Л.Ю.,
Макарихина С.С., Караваева О.А., Игнатов О.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и
физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов; Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Институт радиотехники и электроники им. В.А.
Котельникова РАН, Москва (Россия)
guliy_olga@mail.ru
Изучено взаимодействие поликлональных антител с микробными клетками Azospirillum
brasilense Sp7 с помощью резонатора с поперечным электрическим полем. Для этого были
получены специфические поликлональные кроличьи антитела на эпитопы О-антигенов штамма
Azospirillum brasilense Sp7 и показана возможность их применения для детекции микробных
клеток с помощью пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем.
Установлено, что частотные зависимости реальной и мнимой частей электрического импеданса
такого резонатора, нагруженного суспензией клеток A. brasilense Sp7 с антителами,
значительно отличаются от зависимостей резонатора с контрольной суспензией клеток без
антител. Показано, что полученные антитела взаимодействуют с клетками азоспириллы,
причем скопление маркера происходит по всей поверхности клетки. Найден предел
возможного определения микробных клеток при их взаимодействии с антителами, который
составляет 104 кл/мл. Установлено, что детекция клеток A. brasilense Sp7 с помощью антител
возможна в присутствии посторонних культур.Представленные результаты демонстрируют
возможность регистрации взаимодействия микробных клеток с антителами и разработки
биологического датчика для количественной детекции микробных клеток.
Работа была поддержана грантом РФФИ №09-02-12442-офи_м.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСТРАКЦИИ ЙОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Дьяконов А.Н., Чашина В.Л., Бахолдина Л.А., Чухно А.С.
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия, СанктПетербург (Россия)
Andrey_Dyakonov@mail.ru
По содержанию йода можно установить количество тиреоидных гормонов в крови. Это
необходимо для своевременной диагностики заболеваний щитовидной железы, о состоянии
которой можно судить по количеству трийодтиронина и тироксина в крови.
Целью данной работы являлась разработка подходящей методики экстракции йода. Для
этого нами был проведён ряд опытов, а именно: однократная и многократная экстракции йода
из водного раствора с использованием четыреххлористого углерода в качестве экстрагента. В
ходе исследований было выяснено, что четыреххлористый углерод образует азеотропную смесь
с водой, поэтому был рассмотрен ещё один экстрагент, не образующий азеотропа с водой в
нормальных условиях – пентан. Для получения достоверных и воспроизводимых результатов
были подобраны оптимальные объемы экстрагента: 18 мл для однократной экстракции и
порции по 6 мл для трехкратной экстракции. Для обработки экспериментальных данных мы
выбрали методику, основанную на фотоколориметрическом методе контроля содержания йода
в растворе исходя из того, что йод особенно сильно поглощает свет с длиной волны 490 нм.
Экспериментально удобно измерять оптические плотности экстрактов Аэ, поскольку
концентрация йода в экстракте выше, чем в рафинате. Использование именно этой методики
дало нам возможность рассчитать коэффициент распределения и долю извлеченного вещества
непосредственно по полученному в ходе исследований графику.
223
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
По результатам поведенной работы было установлено, что при трехкратной экстракции
коэффициент распределения и доля извлеченного вещества выше, чем при однократной и
составляют соответственно при однократной экстракции 16,6 и 0,856 для четыреххлористого
углерода и 10,62 и 0,79 для пентана, а при многократной экстракции 17,0 и 0,96 для
четыреххлористого углерода и 37,2 и 0,99 для пентана. Полученные результаты наглядно
иллюстрируют, что использование трехкратной экстракции йода пентаном - наиболее точный и
воспроизводимый метод, который можно применять для определения содержания тиреоидных
гормонов в крови и диагностики отклонений в работе щитовидной железы.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВРЕМЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТИ МАГНИТНЫХ СВОЙСТВ
ЭРИТРОЦИТОВ В РАЗЛИЧНЫХ СРЕДАХ
Жолудь А.М.
Институт тепло- и массообмена им. А.В. Лыкова НАН Беларуси, Минск (Беларусь)
zholud.anton@gmail.com
В прошлом неоднократно предпринимались попытки осуществить характеризацию и
разделение клеток с использованием различий в их собственных магнитных свойствах , данная
проблема и в настоящее время привлекает значительный интерес. Определение магнитных
свойств клеток использует косвенный методы , основанные на определении характеристик
зарегистрированного на видео движения клеток в жидкости под действием высокоградиентного
магнитного поля.
В Институте тепло-и массообмена НАН Беларуси разработан новый автоматизированный
метод, основанный на видеорегистрации протяженных двумерных траекторий большого числа
клеток, движущихся в плоском щелевом канале под действием скрещенных гравитационной и
магнитной сил. Подгонка зарегистрированной траектории теоретической кривой позволяет
определить синтетическую магнитную характеристику клетки – относительную удельную
магнитную восприимчивость, определяемую соотношением
κ = ( χ – χfl ) /( ρ – ρfl )
Здесь χ – магнитная восприимчивость клеток, χfl – магнитная восприимчивость среды, ρ –
плотность клетки, ρfl – плотность среды.
В докладе представлены результаты предварительного этапа исследований, имеющих
целью выявить возможную связь магнитных свойств клеток крови с различными
заболеваниями. Очевидно, что для таких исследований необходимо обеспечить стабильность
магнитных свойств образца клеточной суспензии в течение определенного времени, что
означает подбор подходящей несущей среды. Нами изучена стабильность магнитных свойств
клеток крови человека в различных стандартных физиологических растворах, таких как раствор
Хэнкса и фосфатно-солевой буфер, широко применяемый в лабораторной практике.
Обнаружено существенное изменение магнитных свойств клеток (фактически – эритроцитов) в
процессе хранения в комнатных условиях, что следует связать с дезоксигенацией эритроцитов.
Так в растворе Хэнкса среднее значение изменилось в течение 2 часов от 4.50 ·10-8 см3/г до
63.63·10-8 см3/г.
Путем специальной модификации фосфатно-солевого буфера удалость добиться
длительной (не менее 2 часов) стабильности магнитных свойств клеток. Исследования
продемострировали, в частности, высокую чувствительность метода к изменениям состояния
клеток.
ГОЛОГАФИЧЕСКИЙ ФЕМТОСЕКУНДНЫЙ ЛАЗЕРНЫЙ МАНИПУЛЯТОРСКАЛЬПЕЛЬ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ
Залесский А.Д., Барбашов Ю.В., Саркисов О.М., Щахбазян А.К.
МФТИ (ГУ), Долгопрудный; ИХФ РАН, Москва; ИТЭБ РАН, Пущино (Россия)
aleksandr.zalesskij@phystech.edu
224
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
Оптическое манипулирование - перспективный метод исследований, обладающий
колоссальным спектром применений в т биологии. Данная работа посвящена созданию
голографического лазерного манипулятора и «скальпеля» с применением фемтосекундного и
непрерывного лазеров. Излучение непрерывного лазера используется для осуществления
оптического захвата и манипулирования, а при помощи фемтосекундного лазерного излучения
выполняется активное физико-химическое воздействие на объекты изучения(клетки, скопления
клеток, биоплёнки, и пр.). Использование фемтосекундных импульсов для реализации
оптического скальпеля даёт следующее важное преимущество: даже при сравнительно малых
энергиях импульса (порядка 1 нДж) высокая пиковая интенсивность фемтосекундных
импульсов позволяет с успехом использовать их как «наноскальпель» - осуществлять
высоколокализированное воздействие, что открывает возможности для развития нанохирургии.
На базе разработанной установки разрабатывается технология терапевтического
клонирования, целью которого является получение индивидуальных эмбриональных стволовых
клеток.Эксперименты проводятся на мышиных эмбрионах и ооцитах. Выполнены
эксперименты по микрохирургическому воздействию на блестящую оболочку эмбриональных
клеток, находящихся на различных стадиях развития. Найдены параметры воздействия
необходимые для локального разрушения блестящей оболочки эмбриональных клеток.
Дальнейшее инкубирование и контроль развития облучённых клеток показал, что такое
воздействие не сказывается на жизнеспособности эмбрионов.Выполнены эксперименты,
включающие в себя три этапа разрабатываемой нами методики неинвазивного клонирования:
1) микрохирургия блестящей оболочки донорской яйцеклетки (ооцита); 2) оптической захват и
манипулирование соматической клеткой (фибробласты, кумулюсные клетки), привидение её в
контакт с ооцитом; 3) лазерное слияние соматической клетки и ооцита.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ДЕЗИНФЕКЦИОННОГО
СРЕДСТВА «ДЕАРГЕН-200» НА ОСНОВЕ НАНОСЕРЕБРА
Ивашута В.А., Антонюк М.Н.
Национальный университет пищевых технологий, Киев (Украина)
ivashutaviktoria@ukr.net
Для предотвращения наличия нежелательной микрофлоры применяют химические
вещества - дезинфекционные средства (ДС). Новейшие разработки в области дезинфектологии
связаны с использованием нанотехнологий, в том числе и наносеребра, антимикробная
активность которого хорошо изучена.
При разработке новых ДС первым критерием специализированной оценки препаратов
является определение специфической активности, т.е. способности средства вызывать
специфический
обеззараживающий
эффект
против
микроорганизмов
различных
таксономических групп. Целью данной работы было определение влияния ДС на основе
наносеребра на различные тест-культуры микроорганизмов.
На базе Государственного учреждения «Институт гигиены и медицинской экологии им.
А.Н. Марзеева» НАМН Украины было проведено исследование специфической активности
нового препарата «Деарген-200», (производитель ООО ПКФ «ВЕЛЕС», Россия) с
концентрацией серебра 200 мг/л. В работе использовали суспензионный метод и
количественный тест на поверхностях. Нейтрализацию действия препарата проводили с
помощью 0,1% раствора натрия сульфида. Тест-штаммами служили культурыStaphylococcus
aureus АТСС 6583, Escherichia coli АТСС 25922,Candida albicans АТСС 885653, Bacillus cereus
(споры) АТСС 8035, Фаг MS2 (E. Coli Hfr). Длительность экспозиции составляла 2 и 4 часа.
Микроорганизмы выращивали на таких питательных средах: агаризованная среда Сабуро (для
грибов), мясо-пептонный агар (для культивирования бактерий). Исследование ДС «Деарген200» проводили с использованием рабочих растворов концентрацией 0,02; 0,20; 2,00 мг/л.
На основании проведенных исследований с помощью суспензионного метода, установлено,
что «Деарген-200» обладает 100% бактерицидной и фунгицидной активностью при
концентрациях 0,02 и 0,20 мг/л. При этом, рабочие растворы ДС оказались не эффективными
против спор Bacillus cereus. То есть, 100% спороцидного действия «Деарген-200» не выявлено.
225
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
Экспериментальные данные свидетельствуют, что рабочие растворы ДС «Деарген-200»
проявляли 100% вирулицидное действие. При определении специфической активности
методом смывов с поверхностей показано, что ДС характеризуется 100% дезинфицирующим
действием по отношению к бактериям и дрожжам при применении данного препарата в
концентрации 0,2 мг/л рабочего раствора в течение 2 и 4 часов экспозиции.
В результате исследований установлено, что ДС «Деарген-200» обладает высокой
эффективностью по отношению к бактериям, грибам и вирусам, т.е. данный препарат можно
рекомендовать для использования с целью дезинфекции. Также данные свидетельствуют о
перспективности дальнейшей разработки технологии получения ДС на основе наночастичек
серебра.
БИОТЕСТИРОВАНИЕ В ОЦЕНКЕ ТОКСИЧНОСТИ НОВЫХ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Исаева С.В., Горшенина Н.С., Губина Т.И., Щекина М.П., Клочкова И.Н.
Саратовский государственный технический университет им. Гагарина Ю.А.;
Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов (Россия)
Lanka-is@mail.ru
В последние годы выявлена высокая биологическая активность различных O, N, Sгетеросодержащих соединений, на их основе синтезированы эффективные антибактериальные,
антигрибковые, противоопухолевые и другие препараты. Представляет научный и
практический интерес исследовать возможность их применения в качестве средств защиты
растений, т.е. пестицидов. Для этого, прежде всего, необходимо определить спектр их
биологического действия и экологическую безопасность.
Целью данной работы явилось изучение действия новых О-, N-, S- содержащих
гетероциклических соединений на биологические тест-объекты – растения (пшеница сорта
«Алейская» (Triticum durum Desf), горох сорта «Глориоза» (Pisum sativum), кресс-салат
(Lepidium sativum), дафнии Daphnia magna).
На примере трех тест-объектов: Paramecium caudatum, Daphnia magna и Scenedesmus
quadricauda установлено, что 1% водный раствор DМSO не оказывает отрицательного влияния
на используемые в работе биообъекты, что позволяет применять водный в качестве
растворителя O-,N-,S-содержащих гетероциклических соединений в опытах на биообъектах.
Проведены эксперименты по изучению биологической активности шести O,N- и Sсодержащих гетероциклических соединений. Из соединений акридонового ряда изучено
действие акридон-2-сульфокислоты (АСК) на рост однодольных и двудольных растений
(пшеницы и гороха). Показано, что данное соединение оказывает ростостимулирующее
действие по отношению к перечисленным культурам. Установлено, что у однодольных
растений АСК стимулирует зону растяжения корней, а у двудольных – зону меристематических
клеток.
Апробированы пять O,N- и S-содержащих гетероциклических соединений различного
строения. Изучено их росторегулирующее действие на примере кресс-салата, пшеницы, гороха
и кукурузы. Определено действие следующих концентраций веществ (3·10-2, 3·10-3, 3·10-4, 3·105
, 3·10-6, 3·10-7, 3·10-8, 3·10-9, 3·10-10, 3·10-11 г/л) на прорастание семян. Изучались следующие
характеристики: всхожесть семян, длина корня и стебля проростков семян. Для некоторых
соединений получен волнообразный характер их концентрационной зависимости, т.е. при
определенных концентрациях они могут ингибировать или стимулировать рост растения.
Другие соединения при большинстве концентраций оказывают стимулирующее действие.
Исследована биологическая активность веществ в отношении дафний и установлено, что
три соединения оказывают в концентрациях 10-2-10-6 г/л токсическое действие, а два
соединения являются не токсичными во всех изученных концентрациях.
Полученные данные свидетельствуют о перспективности исследования в этой области, т.к.
варьируя концентрации веществ, можно изменять их рострегулируемую активность.
226
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
ОПТИМИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ СКРИНИНГА
ВЕЩЕСТВ И БИОМАТЕРИАЛОВ НА АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ
Кавеленова С.М., Шушкова И.Г.
Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоград (Россия)
Sofiakavelenova@gmail.com
Сегодня антиоксиданты (АО) применяются в различных сферах деятельности человека, в
том числе в медицине, промышленности и биотехнологии. Первичный скрининг на наличие
антиоксидантной активности (АОА) проводится с помощью химических тест-систем. Несмотря
на то, что существует множество подобных тестов, к настоящему времени отсутствует единая
унифицированная методика обнаружения АОА. Многие из существующих протоколов
позволяют тестировать либо гидрофильные, либо гидрофобные соединения. В различных
условиях величины АОА сложно сравнимы для гидрофильных и гидрофобных соединений.
Отдельную проблему представляет скрининг нерастворимых в воде полимеров природного
происхождения, имеющих перспективы при поиске новых биологически активных соединений.
В связи с этим, целью данной работы была разработка протокола для быстрого и
воспроизводимого определения АОА гидрофильных и гидрофобных соединений при
идентичных условиях реакции. За основу был взят метод определения АОА по обесцвечиванию
АБТС-радикала. В качестве эталонных АО использовали гидрофобных (кверцитин и морин) и
гидрофильных (галловая и аскорбиновая кислоты) соединений. В качестве растворителей для
аналитов были использованы вода, этанол и диметилсульфоксид (ДМСО). В качестве
растворителя для АБТС- радикала использовали дистиллированную воду и ДМСО. Было
показано, что природа растворителя (вода или ДМСО) не влияла значимо на величины
различных показателей, традиционно используемых для характеристики АОА, при
тестировании гидрофильных соединений с водным раствором АБТС-радикала. Гидрофобные
АО также показали сходную эффективность в тесте обесцвечивания водного раствора АБТСрадикала вне зависимости от использованного растворителя (этанол или ДМСО). Иная
ситуация наблюдалась при растворении АБТС-радикала в ДМСО. Если эффективность
гидрофильных эталонных АО была сходной с определявшейся в водном варианте теста, то для
кверцетина и морина растворение АБТС-радикала в ДМСО существенно повышала величины
их АОА. На основании полученных результатов были оптимизированы протоколы определения
АОА по степени обесцвечивания АБТС-радикала при использовании ДМСО как растворителя
аналитов и как основы аналитической системы. Используя разработанные протоколы, провели
исследование ряда новых синтетических природных АО, включая полимерные хромогенные
комплексы, выделенные из Inonotus obliquus. Таким образом, показано, что разработанную
модификацию метода обесцвечивания АБТС-радикала можно использовать для определения
АОА гидрофильных и гидрофобных веществ в сходных условиях.
ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА МОДЕЛЕЙ, АЛГОРИТМОВ И МЕТОДИК
ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА БИОМЕТРИЧЕСКИХ СИГНАЛОВ: НА
ПРИМЕРЕ ОБРАБОТКИ КАРДИОСИГНАЛА
Казаков Д.В.
Национальный исследовательский университет «МИЭТ», Москва (Россия)
dmitry@kazakov.eu
Основной задачей анализа кардиосигнала является выявление значимых признаков, по
которым можно определить состояние сердечнососудистой системы (ССС).
Цель исследования – разработка модели, методик и алгоритмов для автоматического
анализа кардиосигнала, обеспечивающая достоверность результатов исследования.
Итогом проведенного исследования стали следующие научные и практические результаты:
– разработана квазипериодическая двухкомпонентная динамическая модель для синтеза
кардиосигнала с использованием временных рядов и метода Рунге-Кутты четвёртого порядка;
– разработан алгоритм выделения желудочковых комплексов на основе дискретного
вейвлет-преобразования и пороговой обработки шумоподавления;
227
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
– разработаны методика и алгоритм исследования кардиосигнала на основе вейвлетпреобразования и фрактального анализа с применением параллельной архитектуры NVIDIA
CUDA;
– разработаны методика и алгоритм анализа кардиосигнала на основе исследования
вариабельности сердечного ритма и расчета коэффициентов Р.М. Баевского;
– разработаны методика и алгоритм обнаружения аритмий сердца с применением
дискретного вейвлет-преобразования;
– разработаны программные комплексы для исследования и моделирования кардиосигнала.
Программный комплекс для моделирования кардиосигнала может использоваться в
учебно-научной практике для оценки различных методов обработки кардиосигнала.
Программный комплекс для исследования кардиосигнала может использоваться в
клинической практике для диагностики различных заболеваний ССС.
Во время исследования были получены 15 международных сертификатов в области
администрирования и разработки программного обеспечения:
1. Microsoft Trainer MCT 2010;
2. Sun Certified Java Programmer 6;
3. Microsoft Certified IT Professional Server Administrator;
4. Microsoft Certified Technology Specialist Windows Server 2008 Active Directory,
Configuration;
5. Microsoft Certified Technology Specialist Windows Server 2008 Network Infrastructure,
Configuration;
6. Microsoft Certified Technology Specialist Windows 7, Configuration;
7. Microsoft Certified Technology Specialist (.NET Framework 3.5, ASP.NET Applications);
8. Microsoft Certified IT Professional Business Intelligence Developer 2008;
9. Microsoft Certified Technology Specialist SQL Server 2008, Business Intelligence
Development and Maintenance;
10. Microsoft Certified IT Professional Database Administrator 2008;
11. Microsoft Certified Technology Specialist SQL Server 2008, Implementation and
Maintenance;
12. Microsoft Certified IT Professional Database Developer 2008;
13. Microsoft Certified Technology Specialist SQL Server 2008, Database Development;
14. Microsoft Certified Professional Developer Web Developer;
15. Microsoft Certified Technology Specialist (Net Framework 2.0, Web Applications).
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПЕЧАТНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ ДЛЯ АНАЛИЗА
ГЛЮКОЗЫ
Каманин С. С., Арляпов В. А., Алферов В. А.
Тульский государственный университет, Тула (Россия)
s.s.kamanin@gmail.com
В настоящее время всё большее внимание придаётся разработке экспрессных методов,
характеризующихся высокой доступностью, и вместе с тем обладающих достаточными
уровнями чувствительности и избирательности. Наиболее яркими представителями подобных
аналитических систем являются биосенсоры.
Перспективным направлением в развитии биосенсорных технологий является
использование электродов, приготовленных методом трафаретной печати. Преимущество
рассматриваемой технологии состоит в миниатюрности создаваемых датчиков, их
многофункциональности, низкой стоимости и возможности массового производства.
Целью данной работы была разработка модифицированных печатных электродов с
берлинской лазурью в качестве медиатора, и иммобилизованным ферментом глюкозооксидазой
(ГО) для определения глюкозы.
В результате выполнения работы были разработаны модифицированные электроды с
ферментом, иммобилизованным в золь-гель тетраэтоксисилана (ТЭОС) с поливиниловым
спиртом (ПВС) и в агаровый гель для анализа низких концентраций глюкозы в пробах.
228
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
Диапазон определяемых концентраций для модифицированного электрода на основе ГО,
иммобилизованной в матрицу золь-гель (ТЭОС) с ПВС составил 1,0 - 5,9 мкмоль/л, а для
модифицированного электрода на основе ГО, в агаровом геле – 3,6 - 6,3 мкмоль/л. Таким
образом, полученные электроды позволяют определять количества глюкозы в 500 раз меньшие,
чем с использованием биосенсора на основе кислородного электрода и в 1000 раз меньшие, чем
способны определять коммерческие глюкометры на основе печатных электродов.
Проведен анализ образцов вин и бродильной массы с использованием разработанных
модифицированных электродов. Полученные значения совпадают со значениями, полученными
референтным методом анализа (титриметрический метод) с учетом доверительных интервалов.
БЛАГОДАРНОСТИ:
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009-2013 годы, госконтракт № 16.740.11.0766.
КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА ГАЗОФАЗНОЙ
ЭЛЕКТРОНЕЙТРАЛИЗАЦИИ БЕЛКОВЫХ МАКРОИОНОВ
Канев И.Л., Глякина А.В., Балабаев Н.К., Морозов В.Н.
ИТЭБ РАН, ИМПБ РАН, Пущино (Россия)
4kanev@gmail.com
Наноаэрозоли биологически-активных веществ являются перспективной формой введения
в организм лекарств и вакцин, однако перевод в аэрозольную форму сложных молекул, таких
как белки, затруднен ввиду их чувствительности к физическим воздействиям, связанным с
процессами генерации аэрозолей. Недавно предложена технология генерации аэрозолей
нанометровых размеров, основанная на электрораспылении раствора вещества с последующей
нейтрализацией получаемого заряженного аэрозоля в газовой фазе облаком противоионов,
также генерируемого методом электрораспыления. Для оценки возможного повреждения
белковых молекул при данном способе создания наноаэрозолей проведено компьютерное
моделирование столкновения белковых макроинов с разными зарядами и разной степенью
гидратации в газовой фазе с небольшими противоионами.
Исследование проводили методом молекулярной динамики с использованием программы
PUMA. Для оценки интенсивности физического воздействия на молекулу белка кинетическая
энергия атомов белка пересчитывалась в аналог температуры. Моделировалось столкновение
положительно заряженной молекулы лизоцима яичного белка с неорганическими нитрат и
гидроксид-анионами. Показано, что при столкновении противоиона с безводной положительно
заряженной глобулой лизоцима выделяется энергия в несколько электрон-вольт, за счет чего
происходит локальное нагревание вблизи места удара противоиона о поверхность глобулы до
температуры более 1000 К, которое далее рассеивается по всей молекуле белка за 1 - 5
пикосекунд . В том случае, если белковая глобула гидратирована (300 молекул воды), а
противоион окружен 10 молекулами воды, картина локального нагрева при соударении
меняется: теперь в столкновении участвуют атомы, в основном, гидратной оболочки, а не
белковой глобулы, и молекулы воды в области контакта ионов поглощают и диссипируют
энергию, что приводит к снижению локального нагревания в 2 раза.
Таким образом, присутствие водной оболочки на ионах способно защитить биологические
молекулы от повреждений при газофазной электронейтрализации, участвуя в распределении
энергии столкновения ионов. Это делает принципиально возможным использование
технологии электрораспыления для создания аэрозолей из лекарств и вакцин.
229
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БИОМАТЕРИАЛОВ
КСЕНОГЕННОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПОСЛЕ ХИМИКОФЕРМЕНТАТИВНОЙ ОБРАБОТКИ
Гамзин С.С., Кручинина А.Д., Венедиктов А.А., Живаева Л.В.
Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского, Пенза
(Россия)
a.d.kruchinina@mail.ru
Изделия медицинского назначения из биоматериалов ксеногенного происхождения
получили широкое распространение в реконструктивной и восстановительной хирургии. В
силу своих прочностных и эластических характеристик наиболее используемыми в хирургии
соединительнотканными структурами стали перикард, глиссонова капсула печени, твердая
мозговая оболочка. Имплантат из биоматериала должен быть биосовместимым и
неиммуногенным. Большинство модификаций ксеноматериала с целью создания имплантата с
такими характеристиками сводится к процедуре обработки сшивающим агентом. Самым
распространенным сшивающим агентом, используемым для получения материалов,
применяемых в биопротезировании, является глутаровый альдегид.
Обработка биоматериалов глутаровым альдегидом ведет к изменению физикомеханических параметров биоткани. Сшитый коллаген деградирует медленнее, имеет низкую
антигенность, является стойким к бактериальной и грибковой инфекции и разрушению.
Изучение прочностных характеристик материала, сшитого глутаровым альдегидом имеет
большое значение в подготовке биоматериалов для протезирования.
В настоящее время общепринятым материалом для реконструктивной и восстановительной
хирургии
является
модифицированный
говяжий
ксеноперикард.
Исследование
соединительнотканных структур иного происхождения (свиной ксеноперикард) позволит
расширить области применения ксеногенных пластических материалов.
Целью настоящей экспериментальной работы является изучение физико-механических
свойств (модуль упругости, предельное напряжение разрыва при одноосном растяжении)
модифицированных говяжьего и свиного ксеноперикардов.
Работа выполнена на образцах биоматериалов, обработанных по методике химикоферментативной обработки биологической ткани (патент РФ №2197818 «Способ подготовки
ткани для ксенопротезирования»).
Говяжий ксеноперикард уже через 2 недели выдержки в глутаровом альдегиде
обнаруживает увеличение модуля упругости в 1,24 раза. На физико-механические свойства
свиного ксеноперикарда обработка существенного влияния не оказала. Значение предельного
напряжения разрыва при одноосном растяжении обработанного говяжьего ксеноперикарда
снижается в 1,54 раза по сравнению с нативной тканью. Аналогичная тенденция наблюдается в
случае свиного ксеноперикарда. По-видимому, клетки, расположенные между волокнами также
создают дополнительные сшивки, что увеличивает прочностные характеристики нативного
материала. В результате удаления клеток прочность падает, обработка глутаровым альдегидом
вызывает возникновение трехмерной пространственной структуры, которая увеличивает
прочностные характеристики материала, а также препятствует проникновению клеток во
внутренние слои биопротеза.
Полученные данные демонстрируют высокие прочностные характеристики исследуемых
биоматериалов, а значит пригодность для целей реконструктивной и восстановительной
хирургии.
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА НАТРИЙ-ЙОДИДНОГО СИМПОРТЕРА ПОД
КОНТРОЛЕМ РАЗЛИЧНЫХ ПРОМОТОРОВ В КЛЕТКАХ МЕЛАНОМЫ
Кузьмич А.И., Копанцев Е.П., Виноградова Т.В.
ИБХ РАН, Москва (Россия)
akrubik@gmail.com
230
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
Генотерапия является одним из перспективных направлений в создании
противоопухолевых препаратов. При разработке генотерапевтических противоопухолевых
препаратов важно добиться экспрессии терапевтических генов, ограниченной опухолевыми
клетками. В связи с этим существует проблема детекции продуктов терапевтических генов в
рамках всего модельного организма.
Hатрий-йодидный симпортер (NIS) – трансмембранный белок, осуществляющий перенос
йодид-ионов внутрь клеток. Ранее было показано, что доставка гена NIS в клетки различного
происхождения обеспечивает эффективное концентрирование йодид-ионов, использование
радиоактивных изотопов йода позволяет детектировать NIS-синтезирующие клетки в
организме лабораторных животных любого размера. Представляется перспективным
разработка генетической системы на основе гена NIS, позволяющей определять локализацию
клеток, получивших и экспрессирующих гены в составе генотерапевтического агента.
Нами была клонирована кДНК гена rNIS из щитовидной железы серой крысы. На базе
полученной последовательности были получены экспрессионные конструкции, содержащие
последовательность rNISпод контролем различных эукариотических промоторов: сильного
конститутивного
промотора
цитомегаловируса
(pCMV),
меланомоспецифического
регуляторного элемента (3Enh-pMIA), состоящего из трех энхансеров гена тирозиназы мыши и
промотора гена MIA человека, опухолеспецифического промотора гена BIRC5мыши (pmSurv),
опухолеспецифического гибридного промотора (phTERT-CMVmin), состоящего из промотора
гена TERT человека и минимального промотора CMV.
На линиях клеток меланомного происхождения M3 и A375 было показано, что
транзиентная трансфекция экспрессионными конструкциями с геном rNIS приводит к
образованию функционально активного белка. В экспериментах in vitro трансфицированные
геномrNIS клетки поглощали значительно больше радиоактивного йодида (125I) из среды по
сравнению с контрольными клетками. Добавление в среду специфического ингибитора NIS,
перхлората натрия, снижало поглощение радиойодида трансфицированными клетками до
уровня контрольных клеток.
На линиях клеток меланомного происхождения M3 и A375 было проведено сравнение
генетических конструкций, содержащих rNISпод контролем различных промоторов. Было
показано, что трансфекция клеток обеих линий конструкцией, содержащей rNIS под контролем
меланомоспецифического промотора 3Enh-pMIA, обеспечивала высокий уровень активности
симпортера, сопоставимый с уровнем активности, обеспечиваемым конститутивно активным
промотором pCMV. Трансфекция клеток A375 конструкциями с опухолеспецифическими
промоторами pmSurv и phTERT-CMVmin также приводила к высокому уровню активности
симпортера, однако, в клетках M3 эти промоторы обеспечивали низкий уровень активности
симпортера по сравнению с более сильными промоторами 3Enh-pMIA и pCMV.
КОЭФФИЦИЕНТ АКТИВАЦИИ КАК ЭКСПРЕСС-МЕТОД КОНТРОЛЯ
ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЦНС
Кундупьян О.Л., Кундупьян Ю.Л.
Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону (Россия)
diamanta@mail.ru
На сегодняшний день в литературе существуют несколько способов оценки
функционального состояния (ФС) ЦНС. Наиболее простым методом является коэффициент
активации (КА), который отражает характер соотношения мощности ритмов альфа и бета 2,
функционально
связанных
с
динамикой
уровня
активации
мозга.
Целью нашего исследования было изучить прогностическую ценность КА для экспресс оценки
ФС
ЦНС.
В исследовании принимало участие 92 практически здоровых человека, средний возраст – 25,5
лет. Обследуемым предлагалась ССМР на 4 равновероятных стимула (зрительные и слуховые
воздействия), которые подавались с межстимульным интервалом (МСИ) 2 и 16 с в присутствии
и отсутствии одорантов. Одорант предъявлялся в течение 5 минут открытым способом на
расстоянии 2 см от кончика носа. В исследовании использовали чистые ароматические масла
231
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
розмарина, мелиссы, мирры и мускуса (ООО «Горо», г. Ростов-на-Дону). Выбор и реализация
режимов стимуляции, регистрация ЭЭГ осуществлялись с помощью компьютерного
энцефалографа-анализатора «Энцефалан-131-03». Обработка данных проводилась в
программной среде Matlab. КА вычисляли как соотношение мощности ритмов альфа и бета 2
диапазонов.
Анализ полученных результатов показал, что выполнение ССМР при МСИ 2 и 16 с
сопровождалось более быстрой реакцией правой рукой, по сравнению с левой. Одоранты при
МСИ 2 с увеличивали время реакции (ВР) на зрительные и слуховые стимулы. ССМР
деятельность при 16 с на фоне одорантов сопровождалась снижением ВР для левой руки на
слуховые стимулы. При реализации ССМР наблюдали увеличение КА. В присутствии
одорантов происходило увеличение КА при МСИ 2 с, а при МСИ 16 с одоранты практически не
меняли значение КА. Увеличение КА и ВР в условиях напряженной деятельности (МСИ 2 с)
сопровождалось достоверным снижением доли ошибочных реакций и увеличением доли
правильных реакций. Снижение ВР, а также отсутствие изменений в КА и во ВР
сопровождалось
увеличением
доли
ошибочных
нажатий.
Таким образом, полученные результаты указывают на высокую чувствительность КА к уровню
ФС ЦНС, что позволяет использовать КА в качестве экспресс метода оценки ФС человека.
СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ПРИ
КУЛЬТИВИРОВАНИИ ACINETOBACTER CALCOACETICUS ИМВ В-7241 И
NOCARDIA VACCINII K-8 НА ПРОМЫШЛЕННЫХ ОТХОДАХ
Лабовка И.Л., Андрущенко Я.В., Конон А.Д., Софилканич А.П., Пирог Т.П.
Национальный университет пищевых технологий, Киев (Украина)
ahil.troi@mail.ru
Микробные поверхностно-активные вещества (ПАВ) способны снижать поверхностное и
межфазное натяжение, сорбировать тяжелые металлы, повышать эффективность разложения
нефтяных загрязнений экосистем, проявлять антимикробное и антиадгезивное действие против
патогенных микроорганизмов. Благодаря уникальным свойствам, ПАВ микробного
происхождения могут использоваться в различных отраслях промышленности.
Целесообразность их практического применения зависит от экономической эффективности
производства. Одним из способов удешевления технологий микробных ПАВ является
использование дешевых ростовых субстратов, например, отходов других производств.
Ранее из загрязненных нефтью образцов почвы были выделены нефтеокисляющие
бактерии, идентифицированные как Rhodococcus erythropolis ИМВ Ас-5017, Аcinetobacter
calcoaceticus ИMВ В-7241 иNocardia vaccinii K-8, установлена способность данных штаммов
синтезировать поверхностно-активные вещества на традиционных гидрофильных и
гидрофобных субстратах, а для штамма ИМВ Ас-5017 – на некоторых промышленных отходах.
Цель данной работы – исследовать возможность использования отходов различных
производств в качестве дешевых ростовых субстратов для синтеза ПАВ А. calcoaceticus ИMВ
В-7241 и N. vaccinii K-8.
Жидкие парафины, молочную сыворотку, пережаренное и рафинированное подсолнечное
масло, а также мелассу использовали в качестве источника углерода и энергии. В контрольных
вариантах штамм ИMВ В-7241 культивировали на среде с этанолом, а K-8 – глицерином.
Способность к синтезу ПАВ оценивали по таким показателям как условная концентрация ПАВ
(ПАВ*, безразмерная величина) и индекс эмульгирования культуральной жидкости (Е24,%).
Показано, что А. calcoaceticus ИMВ В-7241 и N. vaccinii K-8 способны синтезировать ПАВ
на всех исследованных субстратах, кроме молочной сыворотки. Установлено, что
максимальные показатели биосинтеза ПАВ были зафиксированы при культивировании А.
calcoaceticus ИMВ В-7241 и N. vaccinii K-8 на маслосодержащих субстратах: повышение
условной концентрации ПАВ в 1,8–2,5 раза по сравнению с показателями на среде с этанолом
или глицерином. При использовании мелассы в качестве источника углерода для штаммов
ИMВ В-7241 и К-8 наблюдали увеличение количества синтезированных ПАВ на 80–196%, а
жидких парафинов – на 40% по сравнению с выращиванием на этанол- и глицеринсодержащих
232
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
средах. Следует отметить, что при культивировании на всех исследуемых субстратах значение
индекса эмульгирования практически не изменялось.
Таким образом, результаты данной работы показывают принципиальную возможность
использования отходов различных производств для синтеза ПАВ А. calcoaceticus ИMВ В-7241
и N. vaccinii K-8.
РАЗРАБОТКА АППАРАТНО-ПРОГРАММНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ
ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИСТЕМЫ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ
КРОВИ
Лапитан Д.Г., Рогаткин Д.А.
Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.
Владимирского, Москва (Россия)
lapitandenis@mail.ru
При комплексной оценке функционального состояния организма достаточно остро стоит
проблема изучения параметров системы микроциркуляции крови, поскольку она является
ключевым звеном в патогенезе многих заболеваний. Существующие неинвазивные оптические
технологии для диагностики микроциркуляторного звена кровообращения, такие как
спектрофотометрия, пульсоксиметрия, оптическая тканевая оксиметрия, а также лазерная
доплеровская флоуметрия (ЛДФ) имеют существенные недостатки, ограничивающие их
применение. Например, лазерные доплеровские системы требуют четкого удержания датчика в
контакте с телом пациента, причем в строго определенном положении, вследствие чего пациент
обычно обследуется лежа (или сидя) без возможности выполнения различных тестовых
физических упражнений. Отдельные одноканальные «карманные» пульсоксиметры не
регистрируют тканевую сатурацию оксигемоглобина в смешанной крови микроциркуляторного
русла, динамику кровенаполнения венозного русла и ряд других важных параметров, поэтому
очень мало информативны. И большинство из указанных приборов имеют непосредственную
связь с компьютером врача в виде электрических проводов, что также не способствует
проведению диагностики ни при выполнении тестовых физических упражнений пациентом, ни
в особых условиях профессиональной деятельности.
В рамках данной работы предлагается создание аппаратно-программного комплекса
(АПК), лишенного этих недостатков. В основу функционирования прибора положен метод
неинвазивной спектрофотометрии и метод накожной термометрии. Прибор представляет из
себя многоканальный АПК с множественными парными каналами пульсоксиметрии,
оптической тканевой оксиметрии и накожной термометрии, что в совокупности позволяет
получать основные сведения о функционировании системы микроциркуляции крови: объемное
кровенаполнение, артериальную и тканевую сатурацию оксигемоглобина, удельное
потребление кислорода, поверхностную кожную температуру, частоту пульса, дыхания и т.д.
Все каналы прибора объединены одним системным портативным микропроцессорным блоком,
носимым на поясе или в кармане пациента. Связь прибора с компьютером врача и передача
данных осуществляются по каналу “bluetooth”. Все это позволяет делать АПК компактным и
носимым на теле пациента, что обеспечивает свободу передвижения обследуемого и
возможность выполнения физических нагрузочных тестов. Применение данного АПК
возможно при обследовании больных с сахарным диабетом, ангиопатией, в спортивной
медицине,
в
диагностике
профессиональных
заболеваний
(вибрационная
болезнь, пневмокониоз, пылевой бронхит), а также в условиях профессиональной
деятельности летчиков, космонавтов и т.д.
На данный момент разрабатываются макет прибора и некоторые методы диагностики
системы микроциркуляции при проведении различных функциональных проб. В дальнейшем
предполагается разработать методическое и метрологическое обеспечение данного АПК, а
также апробировать для него медицинские методики диагностики.
233
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
МЕТОД ОЦЕНКИ АДГЕЗИОННОЙ АКТИВНОСТИ МОНОЦИТОВ КРОВИ И
ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ КОМПОНЕНТОВ
СТРЕПТОКОККА НА ПРОЦЕСС АДГЕЗИИ
Лебедева А.М.
ФГБУ "НИИ Экспериментальной Медицины" СЗО РАМН, Санкт-Петербург (Россия)
aml1987@mail.ru
Мононуклеарные фагоциты играют важную роль в регуляции развития воспаления и
иммунного ответа. Выступая в качестве первой линии защиты организма от разнообразных
инфекционных агентов, мононуклеарные фагоциты сами становятся их мишенями, что
приводит к изменению их функций. Мобилизация лейкоцитов из кровяного русла начинается с
их адгезии к эндотелию, вмешательство бактерий и их компонентов в этот процесс может
существенно изменять эффективность иммунной защиты. До сих пор не существует
доступного метода, пригодного для количественной оценки адгезионной активности
лейкоцитов крови в условиях, приближенных к условиям организма. Целью настоящего
исследования явилась разработка модельной системы, пригодной для оценки адгезионной и
миграционной активности лейкоцитов крови человека. Материалы и методы. Объектами
исследования являлись эндотелиальные клетки человека перевиваемой линии EA.hy 926 и
мононуклеарные клетки, выделенные из крови здоровых доноров методом фракционирования
на
градиенте
плотности.
В
работе
использовался супернатант
разрушенных
ультразвукомStreptococcus pyogenes (СРС) серологической группы А типа М22. Количество
адгезировавших клеток и уровень экспрессии поверхностных молекул оценивали методом
проточной цитометрии после обработки мононуклеарных клеток мечеными моноклональными
антителами. Результаты исследования показали, что в присутствии СРС адгезия моноцитов
(CD14+ клеток) к эндотелиальным клеткам была достоверно выше по сравнению с адгезией
клеток в культуральной среде (контроль). После 4-часовой преинкубации эндотелиальных
клеток с СРС наблюдалось усиление интенсивности адгезии к ним моноцитов по сравнению с
контролем. Напротив, 24-часовая преинкубация эндотелиальных клеток с СРС приводила к
снижению интенсивности адгезии моноцитов к эндотелию по сравнению с адгезией клеток в
культуральной среде. Нами не было выявлено достоверных изменений уровней экспрессии
молекул CD11b, CD14, CD54, CD73 на поверхности моноцитов после часовой и 4-часовой
преинкубации моноцитов с СРС. Показана пригодность разработанного метода для оценки
адгезионной активности лейкоцитов крови и ее изменений под влиянием бактериальных
компонентов. Внедрение разработанного метода в практику лабораторий иммунодиагностики
позволит проводить количественную оценку активности адгезии лейкоцитов крови, что
значительно расширит возможности лабораторной иммунологической диагностики при
инфекционных и других заболеваниях.
РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОГАЗА И ГЕНЕРАЦИИ ИЗ
НЕГО ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ЭНЕРГИИ
1
Максимов А.С. , Чухарев В.Ф.2, Липилин А.С.3, Иларионов С.А.1, Доросев С.М.2,
Никонов А.В.3, Валенцев А.В.3, Липилина В.А.3
1
Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь;
2
ФГУП «РФЯЦ ВНИИТФ им. акад. Е.И. Забабахина, Снежинск; 3Учреждение
Российской академии наук ИЭФ УрО РАН, Екатеринбург (Россия)
htb03_starosta@rambler.ru
Биогаз, образующийся в результате анаэробного брожения органических отходов, является
ценным, экологически чистым возобновляемым видом топлива.
Самым универсальным видом энергии, который легко конвертируется во все прочие,
является электрическая энергия но традиционный способ использования биогаза, в качестве
топлива в системах когенерации, построенных на базе двигателей внутреннего сгорания (ДВС),
обладает достаточно низким КПД. Также, немаловажен и тот факт, что содержание метана в
234
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
биогазе может варьироваться, что негативно сказывается на функционировании ДВС, а при
содержаниях метана в биогазе менее 50 об% делает его работу невозможной. Теоретически,
этих недостатков лишены системы генерации электрической энергии построенные на базе
твёрдооксидных топливных элементов (ТОТЭ). В настоящее время во всём мире ведутся
активные разработки систем генерации электрической энергии на базе ТОТЭ.
Таким образом, очень интересным с практической точки зрения способом использования
биогаза можно считать конверсию его в синтез-газ который используется как топливо в
батареях ТОТЭ.
Для получения количества биогаза достаточного, для функционирования системы
генерации электрической энергии на ТОТЭ, а также исследования процессов образования
биогаза применялась экспериментальная лабораторная биогазовая установка оригинальной
конструкции. Система функционировала следующим образом: исходный субстрат загружался в
реактор – метантенк, где протекали процессы разложения субстрата и образования биогаза.
Метантенк представлял собой мягкую многослойную оболочную конструкцию объёмом 30 л.
Газгольдер объёмом 25 л. использовался для промежуточного накопления биогаза. Для
поддержания в реакторе – метантенке постоянной температуры 35С0 использовалась система
термостатирования состоящая из жидкостного термостата, гибкого теплообменника,
помещенного внутрь реактора и цифрового измерителя – регулятора
Образующийся биогаз отводился из реактора в газгольдер и далее в систему очистки
биогаза, состоящую из, каскада барботажных абсорберов, заполненных 2%-ным раствором
ацетата кадмия. Биогаз после очистки поступал в каталитический конвертор метана,
разработанный в Институте катализа СО РАН и изготовленный в РФЯЦ-ВНИИТФ, где
преобразовывался в синтез газ, который подавался в исследовательскую ячейку ТОТЭ,
изготовленную в ИЭФ УрО РАН.
Максимальная удельная электрическая мощность демонстрационного установки при
рабочей температуре ТОТЭ 950ОС, испытанная во ВНИИТФ составила Руд=135 мВт/см2 при
расходе биогаза 120 нл/час.
При проведении экспериментов в качестве субстрата использовался фильтрат навозных
стоков фермы КРС агрофирмы «Русь» влажностью 93%. Среднее содержание метана в биогазе
составило 58%.
Испытания подтвердили, что полученный таким образом биогаз, является достаточно
хорошим топливом для генерирования электрической энергии с использованием
твердооксидных топливных элементов.
ВОДОРАСТВОРИМЫЕ НАНОФИЛЬТРЫ ИЗ ПОЛИВИНИЛПИРРОЛИДОНА,
ПОЛУЧАЕМЫЕ ЭЛЕКТРОФОРМОВАНИЕМ С ПОСЛЕДУЮЩЕЙ
НЕЙТРАЛИЗАЦИЕЙ В ГАЗОВОЙ ФАЗЕ
Михеев А.Ю., Морозов В.Н.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН, Пущино (Россия)
2miheev@gmail.com
В лаборатории разрабатывается новый метод сбора аэрозолей с помощью
водорастворимых нанофильтров. В отличие от других известных методов сбора аэрозолей
(циклоны, импакторы) нанофильтры позволяют собирать не только микро- но и наноаэрозольные частицы и требуют значительно меньшей энергии. Для изготовления
нанофильтров из водорастворимого инертного полимера (поливинилпирролидона, ПВП)
используется модифицированная технология электропрядения, отличающаяся тем, что
нейтрализация нановолокон осуществляется непосредственно в воздушной среде, что
позволяет производить весьма равномерные наноматы из минимального количества
полимерного материала.
В данной работе разработана серия методов для измерения основных физических
характеристик нанофильтров, изготовленных электропрядением спиртовых растворов ПВП.
Показано, что толщина нанофильтра, его оптическая плотность и сопротивление потоку
235
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
воздуха через нанофильтр растут линейно со временем электропрядения, в то время как
пропускание нано- и микро-аэрозольных частиц падает экспоненциально. При диаметре
нановолокон около 150 нм ПВП нанофильтры с массовой плотностью 0,2-0,3 мг/см2
задерживают 99-99,9% всех аэрозольных частиц с размером более 0.3 микрон. Измерения
упругого модуля показали, что деформация фильтра в направлении перпендикулярном
плоскости фильтра в значительной степени необратима и связана со сминанием изогнутых
нановолокон. Фильтр проявляет значительно большую жесткость при деформации в плоскости,
приводящей к растяжению нановолокон, Показано, что при прикреплении нанофильтра к сетке
с ячейкой диаметром 0.1 мм, он способен выдержать давление, превышающее 1 атм. Показано,
что наноматы из ПВП сохраняют свою работоспособность при влажности не более 75% и могут
храниться на протяжении нескольких месяцев.
Указанные фильтры предполагается использовать для анализа биологических аэрозолей,
таких как патогены, передающиеся воздушным путем (в установке для экспресс анализа
патогенов, разрабатываемой в рамках Сколковкого проекта), для анализа нано-аэрозольных
вакцин и антибиотиков и для бесконтактного анализа нелетучих биомаркеров (белки, ДНК) в
выдыхаемом воздухе. Последняя технология имеет существенные преимущества перед
бронхоальвеолярным лаважем и методом сбора выдыхаемого конденсата.
ИЗУЧЕНИЕ La3+-ИНДУЦИРОВАННОЙ АГРЕГАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ
ЧЕЛОВЕКА НА ЛАЗЕРНОМ АГРЕГОМЕТРЕ
Поповичева А.Н., Шереметьев Ю.А.
ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и
ортопедии» Минздравсоцразвития России, Нижний Новгород (Россия)
ya.sher@rambler.ru
На лазерном агрегометре ЛА 230-2 НПФ «Биола» изучена агрегационная способность
нормальных и измененных эритроцитов. Агрегация эритроцитов индуцировалась 20, 40, 80,
160, 320 мкМ хлористого лантана. Предварительно прибор калибровали по двум точкам. При
этом светопропускание образца эритроцитарной суспензии принимали за 0%, а
светопропускание буферного раствора - за 100%. Для оценки агрегации в кювету прибора
вносили 0.9 мл 0.5% суспензии эритроцитов и магнитную мешалку. Кювету вставляли в
термостатируемую (37°С) ячейку прибора. Через 30 секунд после начала перемешивания в
кювету добавляли 0.1 мл раствора хлористого лантана (конечная концентрация 20, 40, 80, 160,
320 мкМ). Скорость вращения мешалки составляла 500 об/мин. С целью изменения состояния
мембран эритроциты инкубировали при 370С в течение 24 ч. Суспензию эритроцитов также
хранили при 40С и комнатной температуре в течение 24 ч. Агрегация нормальных эритроцитов
на лазерном агрегометре регистрируется, начиная с концентрации лантана, равной 80 мкМ.
Показаны различия в агрегационной способности нормальных эритроцитов и эритроцитов,
хранящихся в течение 24 ч при комнатной температуре и инкубированных при 370С.
Измененные эритроциты начинают агрегировать при низкой концентрации лантана, равной 20
мкМ. При 40-160 мкМ лантана происходит статистически значимое увеличение агрегационной
способности измененных эритроцитов. Предлагается использовать разработанный на лазерном
агрегометре ЛА 230-2 НПФ «Биола» метод «лантановых агрегатограмм» для оценки состояния
мембран эритроцитов в эксперименте и клинической практике.
АДАПТАЦИЯ МЕТОДА «СУХОЙ КАПЛИ КРОВИ» В ДИАГНОСТИКЕ ВИЧ У
ДЕТЕЙ, РОЖДЕННЫХ ОТ ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ РОДИТЕЛЕЙ
Салихова Д.Р., Джумашова Ж.К., Дзисюк Н.В., Карпенюк Т.А.
ГУ «РЦ СПИД», КазНУ им. аль-Фараби, Алматы (Казахстан)
dania907@mail.ru
Кровь, для обработки по методу сухой капли капиллярной крови (СККК) требуется в
незначительном объеме,что является основополагающим для кровозабора у младенцев. СККК
236
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
легко транспортируется в дальние регионы, не требует особых условий хранения, для
массового применения обходится дешевле. Для тест-систем по определению ВИЧ,
существующих в Казахстане, этот метод пока не адаптирован.
Для проведения опыта цельную кровь детей первого года жизни, рожденных от ВИЧпозитивных матерей и кровь, подготовленную по методу СККК от тех же пациентов,
раскапывали в количестве 50 мкл на фильтровальную бумагу Whatman 903 и высушивали при
комнатной температуре не менее 12 часов. Выявление провирусной ДНК ВИЧ проводили
методом сорбции на силикагеле с использованием диагностического набора «Амплисенс –
ДНК–ВИЧ–FRT». Для отработки метода СККК сравнивались следующие параметры:
количество дисков СККК, время замачивания дисков, объемы лизирующего раствора и
элюирующего буфера, использование гемолитика перед лизисом. Качество выделения ДНК
оценивали по уровню пороговых циклов во время real-time PCR (Сt).
Исследования показали, что наиболее оптимальным количеством для качественного
проведения PCR было 4 диска СККК диаметром 6 мм. Увеличение объемов лизирующего
раствора и буфера для элюции, а так же время замачивания дисков не показывали различий в
пороговых циклах, в связи с чем время экспозиции СККК в лизирующем растворе было
сокращено до 1 часа. Этап отмывки гемолитиком СККК не являлся необходимым при работе и
был нами удален из методики выделения провирусной ДНК ВИЧ.
В целом, значение Сt в случае выделения провирусной ДНК из СККК был больше по
сравнению с выделением из цельной крови и был близок к пороговому значению, указанному в
инструкции к набору. Чувствительность метода определения провирусной ДНК ВИЧ при
тестировании образцов СККК от детей с ВИЧ-позитивным статусом составила 100%.
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПЕРВИЧНОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ЗАХВАТА БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛПС ГИБРИДНЫМИ МАТРИЦАМИ НА
ОСНОВЕ БИОПОЛИМЕРА ХИТОЗАНА.
Фролов Д.М., Лосев А.А.
ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный университет», Волгоград (Россия)
frodm86@yandex.ru
Хорошо известен тот факт, что бактериальные липополисахариды (ЛПС), образующиеся в
норме в кишечнике человека и проникающие оттуда в кровоток, встречаются с хорошо
сбалансированной системой механизмов антиэндотоксиновой защиты. Совершенно иным
образом реагирует организм на ингаляционное проникновение ЛПС. Острые местные реакции
такого воздействия неплохо описаны, а хронические воздействия малых доз изучаются мало,
из-за проблематичности определения содержания ЛПС во вдыхаемом воздухе. Между тем
известно, что с эффектами ЛПС связана высокая распространенность хронических
неспецифических болезней легких у работников парниковых хозяйств, мясокомбинатов и ряда
подобных предприятий, появились сведения о наличии высоких концентраций ЛПС в воздухе
помещений с промышленным кондиционированием. Методы определения содержания ЛПС в
воздушной среде, имеющиеся в настоящее время, не отличаются высокой чувствительностью и
достаточно дорогостоящи.
Целью нашего исследования стало разработать метод первичной оценки эффективности
захвата бактериального ЛПС, взвешенного в воздухе, гибридными матрицами на основе
биополимера хитозана (Хз).
При выборе метода мы опирались на следующие требования: коммерческая доступность
компонентов
аналитической
системы,
трудоемкость
аналитического
протокола,
чувствительность и линейность метода. Исходя из этих требований, мы сделали вывод, что
оптимальным является метод определения связывания бактериальных ЛПС с использованием
анионных красителей. Для решения вопроса о возможности взаимодействия ЛПС и гибридной
матрицы в воздушной среде нами был проведен ряд экспериментов. Исследования
основывались на предположении, что в результате более высокой аффинности ЛПС к Хз, он
способен по конкурентному принципу вытеснить из комплекса [ХЗ-ЛПС] менее аффинный
лиганд. Нами были получены окрашенные карбоциановым красителем хитозановые матрицы,
237
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
отмытые от его избытка центрифугированием в дистиллированной воде. Далее матрицы
контактировали с различными объемами воздуха, увлажненного непирогенной водой
(контроль) и парами, содержащими ЛПС заданной концентрации (опыт). Варьировали также
время контакта с воздушной средой. В качестве контроля использовались матрицы, которые не
подвергались никакому воздействию. После обработки матрицы измельчали и
центрифугировали в фиксированном объеме дистиллированной воды. Затем на
спектрофотометре определяли оптическую плотность опытных и контрольных проб.
Полученные спектрограммы анализировали в области пика поглощения анионного красителя
(от 520 до 550 нм). В результате в каждом случае был количественно определен выход
красителя, вытесненного бактериальным ЛПС.
Таким образом, доказана возможность захвата гибридной матрицей на основе хитозана
бактериальных ЛПС из воздушной среды, в количестве, достаточном для построения на этой
основе (после модификации матрицы и сопряжения с детектирующей системой) биосенсорного
устройства для определения ЛПС.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ЦИРКУЛЯЦИИ МАГНИТНЫХ
НАНОЧАСТИЦ В КРОВОТОКЕ МЫШЕЙ
1,2
Хлебус Э.Ю. , Юрьев М.И.1,3, Никитин М.П.1,2,3, Никитин П.И.3, Деев С.М.2
1
Московский физико-технический институт (ГУ), Долгопрудный; 2Институт
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва;
3
Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва (Россия)
norabread@mail.ru
В настоящее время изучение магнитных наночастиц (МНЧ) представляет большой интерес
для исследователей. Это связано с тем, что МНЧ обладают широким спектром применений в
биологии и медицине. Детекция таких частиц в тканях живого организма может быть
осуществлена с высокой чувствительностью. Также они могут быть нагреты внешним
магнитным полем, что может быть использовано для гипертермии опухолей. Кроме того, МНЧ
можно перемещать с помощью внешних магнитных полей, что позволяет применять их для
адресной доставки лекарственных препаратов, предотвращая системную интоксикацию
организма.
Одним из важнейших параметров, влияющих на потенциальные терапевтические свойства
наночастиц, является время их циркуляции в кровеносной системе.
В работе представлен метод неинвазивного измерения параметров динамики МНЧ в
кровотоке животных. Измерения проводились с помощью магнитного детектора "БиоМаг",
принцип работы которого основан на нелинейном намагничивании частиц в магнитном поле.
Хвост мыши помещался в прибор, после этого в глазной синус животного вводились МНЧ, и
измерялся магнитный сигнал, пропорциональный содержанию МНЧ в кровотоке хвостовых вен
и артерий мыши.
С помощью предложенного метода была исследована динамика циркуляции магнитных
наночастиц размером 350 нм с SiO2-покрытием и магнитных наночастиц размером 35 нм с
цитратным покрытием. Для разных концентраций вводимых частиц были определены времена
полувыведения МНЧ из кровотока мыши. Кроме того, было проведено сравнение действия
различных типов анестезии на скорость циркуляции частиц в кровотоке.
Результаты, полученные с применением представленного метода, вызывают большой
интерес для дальнейших биомедицинских исследований, в особенности в разработке методов
лечения и диагностики социально-значимых заболеваний, таких как рак, инсульт и
атеросклероз.
238
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
ЗАВИСИМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИКАРБОНИЛЬНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ И ИХ АМИНОПРОИЗВОДНЫХ ОТ ДИСПЕРСНОГО
СОСТОЯНИЯ РАСТВОРА
Черний Ю.В., Бурыгин Г.Л., Зинина Е.А.
Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского; Институт
биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов (Россия)
chernij_yuliya@rambler.ru
Целью настоящей работы явилось расширение диапазона биологических испытаний для
представителей ряда полизамещенных кетонов и циклогександикарбоксилатов, содержащих
различные функциональные заместители, в том числе одновременно ацетильную и
этоксикарбонильную функции. В качестве объектов испытаний были взяты также продукты
превращения указанных соединений под действием аминирующих агентов и окислителей –
енамины с адамантильным радикалом и замещенный дигидрофуранон, содержащий
сложноэфирную и карбоксильную группы. Водные растворы некоторых представителей
указанных соединений, полученные с применением различного типа растворителей, впервые
были изучены в тестах на подавление роста бактериальных и животных клеток, а также
ингибирование прорастания семян растений. Также получены миниантитела, пригодные для
детекции
исследуемых
водных
растворов
2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метил-3фенилциклогексанона (1) и 3-(4-гидрокси-3-метоксибензилиден)пентан-2,4-диона в сложных
биологических средах.
Тест на наличие биологической активности по отношению к растениям выявил, что
большинство исследуемых соединений в высоких концентрациях влияет на процент
прорастания и развитие семян кресс-салата. Соединение (1) ингибирует прорастание и развитие
семян пшеницы, кукурузы и кресс-салата в диапазоне концентраций 50-500 мкг/мл.
В тестах по определению влияния исследуемых соединений на рост бактериальных
культур (Escherichia coli XL-1, Pseudomonas fluorescens 38a, Staphylococcus aureus 209P,
Bacillus subtilis 6633) было выявлено подавление роста бактерий E. coli XL-1 водным раствором
соединения (1) после 48 часов инкубирования. Обнаружено, что при растворении вещества в
диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 500 мкг/мл антимикробная активность
отсутствует.
Влияние на дыхательную активность человеческих раковых клеток HeLa определяли по
МТТ методике. При инкубации клеток в течение 20 часов в среде, содержащей 200 мкг/мл
соединений для вещества (1) показано угнетение дыхательной активности примерно в 2 раза и
почти полное ее отсутствие для клеток, инкубированных с веществами: диэтил 2-(3нитрофенил)-4-гидрокси-4-метил-6-оксоциклогексан-1,3-дикарбоксилат
(2),
диэтил
4адамантилметиленамино-6-гидрокси-6-метил-2-фенилциклогекс-3-ен-1,3-дикарбоксилат,
диэтил 4-адамантилметиленамино-6-гидрокси-6-метил-2-(4-метоксифенил)-циклогекс-3-ен-1,3дикарбоксилат,
диэтил
4-адамантилметиленамино-6-гидрокси-6-метил-2-(3-нитрофенил)циклогекс-3-ен-1,3-дикарбоксилат.
Исследованы
водные
растворы
соединений
2-фенил-4-гидрокси-4-метил-6оксоциклогексан-1,3-дикарбоксилат,
2-(3-(этоксикарбонил)-2-метил-5-оксо-4фенилтетрагидрофуран-2-ил) уксусная кислота и (2), полученные предварительным
растворением в ДМСО с использованием тритон X-100 (соотношение 2:1). Показано
повышение растворимости данных соединений, а также выявлено значительное усиление
антимикробного эффекта в диапазоне концентраций 62.5 – 500 мкг/мл.
РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ФОРМ РОДА CERASUS
MILL К КОККОМИКОЗУ. ПО БИОХИМИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ
Шестакова В.В., Кузнецова А.П.
Государственное научное учреждение Северо-Кавказский зональный научноисследовательский институт садоводства и виноградарства Россельхозакадемии,
Краснодар (Россия)
239
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
shestakova-vv@mail.ru
Одним из главных биотитческих стрессоров рода Сerasus Мill. на юге России является
коккомикоз (Coccomyces hiemalis Higgins,Blumeriella jaapii (Rehm) Arx), поэтому проведение
физиолого-биохимических исследований по изучению механизмов устойчивости к этому
заболеванию является актуальным для разработки ускоренных методов оценки. При
разделении по трем категориям устойчивости: сильная поражаемость, устойчивость,
иммунность были использованы биохимические данные по модельным сортам. Результаты
дисперсионного анализа показали, что доля влияния фактора «поражаемость» в общей
изменчивости очень сильно варьирует, и разрешающей способности дисперсионного анализа
не достаточно для идентификации степени поражаемости коккомикозом по изучаемым
биохимическим признакам, поэтому был использован дискриминантный анализ. Учитывая
существенные различия данных за разные годы исследования, данные рассматривались за
каждый год отдельно. В каждом году исследований наблюдалось идеальное расположение
сортов по поражаемости в пространстве дискриминантных функций. Полученные данные
подтверждают правильность выбранного направления по разработке экспресс-метода. Работа
выполнена при поддержке гранта РФФИ р_юг_ц №11-04-96551.
МОНОДИСПЕРСНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ КАТИОННЫЕ ЧАСТИЦЫ: СИНТЕЗ И
ПРИМЕНЕНИЕ В БИОТЕХНОЛОГИИ
2
Широкова И.Ю. , Панкова Г.А.1, Меньшикова А.Ю.1, Шевченко Н.Н.1, Кучук
В.И.2
1
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
высокомолекулярных соединений Российской академии наук; 2ГБОУ ВПО «СанктПетербургская государственная химико-фармацевтическая академия», СанктПетербург (Россия)
shirokova1107@gmail.com
Разработка методов синтеза монодисперсных полимерных частиц разнообразной
функциональности актуальна для получения носителей биолигандов и способных к самосборке
частиц для применения в био- и нанотехнологиях.
С целью введения алифатических аминогрупп в поверхностный слой полимерных частиц
исследован метод эмульсионной сополимеризации стирола (Ст) с N-винилформамидом (ВФА),
в том числе в присутствии сшивающего агента – диметакрилата этиленгликоля, буферной соли
– дигидрофосфата калия. Варьирование соотношения сомономеров, концентрации
радикального азоинициатора с имидозолиновыми группами – 2-азобис[2-(имидазолинил2)пропана] (АИП), а также температуры реакционной смеси позволило получить серию
монодисперсных частиц диаметром 200–1000 нм при среднеквадратичном отклонении менее
5%. Условия полимеризации и последующий гидролиз поверхности частиц существенно
влияют на знак и величину их ζ-потенциала и его зависимость от состава дисперсионной среды.
Протонирование имидозолиновых, а также алифатических аминогрупп, образующихся при
гидролизе звеньев ВФА, обусловливает положительный заряд поверхности. Отрицательный
заряд обеспечивают карбоксильные группы, формирующиеся при гидролизе концевых звеньев
инициатора в процессе сополимеризации при высокой температуре, а также при последующей
обработке частиц в кислой среде. В результате, полученные частицы агрегативно устойчивы в
широком диапазоне рН, а их функциональные группы позволяют ковалентно связывать
биолиганды и люминофоры. Исследована хемосорбция изотиоционта на поверхность
синтезированных катионных частиц, а также прослежено влияние модификации частиц
люминофором на последующее связывание модельного биолиганда (бычий сывороточный
альбумин). Показано, что такие модифицированные частицы могут быть успешно применены в
качестве флуоресцентных носителей распознающих биолигандов при проведении
иммуноанализа методом поточной флуориметрии.
240
Приборы и методы для биологии, биотехнологии и медицины
ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОЗИТНЫХ МАТРИКСОВ ИЗ ПГА ДЛЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
Шумилова А.А., Шишацкая Е.И.
Сибирский федеральный университет; Институт биофизики СО РАН, Красноярск
(Россия)
shumilova.ann@mail.ru
Получение матриксов для задач тканевой и клеточной инженерии в настоящее время,
является одним из наиболее перспективных направлений в биомедицине. Для конструирования
объемных матриксов были взяты образцы гомогенного полимера 3-гидроксимасляной кислоты
(П-3-ГБ) и двухкомпонентного сополимеры 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата П(3ГБ/3-ГВ). Композитные матриксы коллаген–ПГБ готовили методом пропитки коллагеновой
губки полимерными растворами полимера в хлороформе различной плотности (1, 3 и 5%).Для
оценки биосовместимости измеряли свойства поверхности, суммарную пористость и
влагопоглощение. Установлено, что наибольший показатель (0,65 ± 0,12 См3/г) суммарной
пористости и влагопоглощения(79,8 ± 0,25%). имела коллагеновая губка, пропитанная 1%
раствором полимера. Функциональные свойства матриксов исследованы в культуре
фибробластов мыши линии NIH 3T3. В целом, выполненные исследования показали
возможность получения композитов, пригодных для выращивания клеток из объемных
пористых ПГА/коллаген матриксов.
241
Прикладная биотехнология
СЕКЦИЯ «Прикладная биотехнология»
РАЗРАБОТКА СОРБЦИОННО-БИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ОЧИСТКИ
ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЁННЫХ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ
Авилова А.В., Яценко В.С., Семенюк Н.Н.
ИФХиБПП РАН, Пущино (Россия)
edel08@mail.ru
В связи с ростом уровня загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами, разработка
эффективных методов их очистки весьма актуальна. Известно, что почвы, загрязнённые
углеводородами нефти (УВН), становятся высокотоксичными для почвенной биоты и растений,
что замедляет процессы их рекультивации. Было установлено, что внесение активированного
угля может существенно ускорить процесс биоремедиации сильно загрязнённых почв за счёт
снижения их токсичности (Васильева и др., 2006). Целью данной работы было изучить влияние
сорбентов и микроорганизмов-деструкторов углеводородов на скорость рекультивации почвы,
загрязненной нефтью, отработанным моторным маслом (ОММ) и дизельным топливом (ДТ).
Лабораторные и микрополевые эксперименты проводили на 3-х типах почв (серая лесная,
аллювиальная луговая, чернозём), загрязненных ДТ (5, 10, 15%), ОММ (5%) или нефтью
(4,5%). Биологическую очистку почвы проводили методом агрокультивации путём
известкования кислых почв, внесения минеральных удобрений, регулярного увлажнения и
периодического перемешивания почвы. В некоторых вариантах в почву вносили сорбенты и
биопрепараты (в комплексе или отдельно). Сравнивали влияние гранулированного
активированного угля ГАУ ВСК и продукта переработки торфа «Спилсорб». Углеводородоразрушающими микроорганизмами явились ассоциация штаммов родов Rhodococcus и
Pseudomonas(лаб. член-корр. А.М. Боронина, ИБФМ РАН) или коммерческий биопрепарата
«Родер» (МГУ им М. В. Ломоносова). В середине 1-го или начале 2-го сезонов, в зависимости
от эксперимента, почву засевали клевером или люцерной. Почву периодически анализировали
на суммарное содержание УВН методом ИК-спектроскопии и ГЖХ, а также определяли рН
почвы и содержание NPK. Периодически определяли фитотоксичность почвы экспрессметодом - по всхожести семян клевера белого. В конце экспериментов определяли и степень
очистки почвы с помощью сертифицированных методов оценки интегральной токсичности
почвы: фитотесты на пшенице и биотесты на гидробионтах.
Исследования показали, что в течение одного сезона содержание УВН можно снизить на
75-95%, в зависимости от загрязнителя и условий проведения рекультивации. При этом в конце
первого периода в почве обычно сохраняется заметная фито- и биотоксичность, обусловленная
накоплением окисленных производных УВН. Поэтому для снижения содержания УВН до ОДК
(0,1-0,5%), как правило, требуется не менее 2-х сезонов. Установлено, что процесс
рекультивации можно несколько ускорить за счет внесения биопрепарата, но наиболее
значимое влияние оказывают сорбенты, в особенности ГАУ. При высоком уровне загрязнения,
а также в слабогумусированных почвах (старопахотная серая лесная и аллювиальная луговая)
внесение сорбента играло решающую роль. Внесение оптимальных доз и форм ГАУ
обеспечивает резкое снижение био- и фитотоксичности почвы, что создает благоприятные
условия для проведения сначала микробиологической очистки почвы и для последующего
этапа фиторемедиации.
ПУТИ СОЗДАНИЯ НОВЫХ МИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ
НИВЕЛИРОВАНИЯ ДЕЙСТВИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НА ОКРУЖАЮЩУЮ
СРЕДУ
Акимбеков Н.Ш, Абдиева Г.Ж., Кайырманова Г.К.
Казахский национальный университет им.аль-Фараби
nuraly99@mail.ru
242
Прикладная биотехнология
На современном этапе развития технологии нефтедобычи при эксплуатации нефтяных
месторождений образуются большие объемы отходов, значительную долю которых составляют
нефтяные шламы и буровые химреагенты, являющиеся источником длительного загрязнения
атмосферы, почвы, грунтовых и поверхностных вод.
Известные способы очистки и утилизации нефтяных и буровых отходов - механические,
химические и физические – не всегда эффективны. В последние годы интенсивно развиваются
биотехнологические методы, основанные на использовании тщательно подобранной
ассоциации активных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных
непосредственно из почв очищаемого региона. Значимость такого подхода при работе в зоне, с
которой связаны наши исследования – месторождение «Жанажол» на Западе Казахстана,
диктуется тем, что, во-первых, углеводородный состав загрязнений заметно разнороден, а вовторых, резко континентальным климатом и аридными условиями этого региона.
Известно, что эффективность микробных клеток повышается после прикрепленных их к
твердым носителям (цеолит, солома, опилки, рисовая шелуха), так как, благодаря подложке,
иммобилизованные микроорганизмы, в определенной мере, защищены от действия токсичных
агентов, способны длительное время сохранять биохимическую активность и устойчивость к
экстремальным факторам среды.
Создание новых иммобилизованных биопрепаратов для нивелирования влияния отходов
нефтедобычи полигонов-накопителей, функционирующих в аридных условиях, на основе
аборигенных микробных культур, выделенных непосредственно из замазученных грунтов,
представляется актуальным.
Нами из нефтезагрязненной почвы было выделено 7 штаммов бактерий,
идентифицированных как Р. mendocina H3, P.pseudoalсaligenes H7, P. stutzeri H10, P. alсaligenes
H15, P.pseudoalсaligenes H16, P. mallei 36 К и Micrococcus luteus 37 К. Установлено, что
выделенные нами культуры проявляют субстратную специфичность относительно окисления
различных органических соединений. Для повышения эффективности биопрепаратов путем
создания высокой концентрации клеток микроорганизмов-деструкторов можно использовать
методику закрепления их на поверхности различных носителей.
Таким образом, нами среди бактерий родов Pseudomonas иMicrococcus выявлены активные
нефтедеструкторы, что позволяет рекомендовать эти штаммы как в свободном, так и
иммобилизованном виде для включения в состав препаратов - биодеструкторов нефти и
нефтепродуктов.
ПОЛУЧЕННЫЙ В РАСТЕНИЯХ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ
ИЗ ЭПИТОПОВ ВИРУСА ЯЩУРА, КАК ОСНОВА АЛЬТЕРНАТИВНОЙ
ВАКЦИНЫ
Андрианова Е.П., Эльдаров М.А.,Фолимонов А.С.
Центр "Биоинженерия" РАН
andrianovakatya@gmail.com
Вспышки ящура наносят большой экономический ущерб промышленности и сельскому
хозяйству многих стран мира. Основным способом контроля возникновения вспышек
заболевания ящуром в настоящее время является вакцинация сельскохозяйственных животных
вакцинами на основе инактивированного вируса. Но, не смотря на высокую эффективность
таких вакцин, они имеют множество недостатков, к которым относится, например,
необходимость использования специальных лабораторий для их получения, сложность
достоверного диагностического различия вакцинированного животного от заболевшего.
В настоящее время перспективной и представляющей большой интерес для
биотехнологических компаний системой получения вакцинных белков является растение.
Производство рекомбинантных белков в растениях стало возможной альтернативой
традиционным продуцентам – бактериям и культурам животных клеток. Растения имеют много
преимуществ перед другими системами получения белка особенно в плане практичности,
экономичности и безопасности. Для роста растений требуется только почва, вода, свет и
243
Прикладная биотехнология
небольшое количество минеральных удобрений, поэтому стоимость их выращивания часто
оказывается ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей или животных.
Мы изучаем возможность получения рекомбинантного белка, содержащего набор наиболее
иммуногенных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи, в растениях.
Вакцинация таким полиэпитопным белком, содержащим комбинацию В- и Т-клеточных
эпитопов вируса, может приводить к усилению иммунного ответа у животных и
способствовать более эффективной защите от заболевания.
С целью получения такого белка в растениях был сконструирован синтетический ген,
кодирующий фрагменты структурных (VP1, VP4) и неструктурных (2C, 3D) белков вируса
ящура изолята О/Тайвань/99. Для того чтобы повысить эффективность экспрессии
полиэпитопного белка кодоновый состав его последовательности был оптимизирован для
экспрессии в растениях рода Nicotiana. Во избежание потенциальных проблем сворачивания
белка эпитопы были разделены «гибкими» глицин-богатыми линкерами. В последовательность
рекомбинантного белка была включена последовательность шести аминокислотных остатков
гистидина для возможности аффинной очистки белка.
Для получения полиэпитопного белка использовали растения N. benthamiana, где белок
экспрессировали с помощью модифицированного Х-вируса картофеля и агробактериальной
инокуляции.
Очищенный полиэпитопный белок, полученный в растениях, использовали для
однократной иммунизации морских свинок с последующим заражением животных вирусом.
Все иммунизированные таким белком лабораторные животные были полностью защищены от
заболевания, а в сыворотках крови животных присутствовали антитела к вирусу ящура
серотипа О.
Полученные результаты дают основания полагать, что на основе полиэпитопного белка,
получаемого в растениях, может быть создана эффективная вакцина против вируса ящура.
ВЛИЯНИЕ рН НА СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ПРИ
КУЛЬТИВИРОВАНИИ ACINETOBACTER CALCOACETICUS ИМВ В-7241 НА
ЭТАНОЛЕ
Антонюк С.И., Конон А.Д. , Парфенюк С.А., Шевчук Т.А., Пирог Т.П.
Национальный университет пищевых технологий
konona@meta.ua
В предыдущих исследованиях было показано, что селекционированный нами штамм
Acinetobacter calcoaceticus ИМВ В-7241 синтезирует поверхностно-активные вещества,
являющиеся комплексом нейтральных, амино- и гликолипидов, при культивировании на
этаноле, однако, в отличие от выращивания, например, на жидких парафинах, рН к концу
процесса снижалось до 4−4,5. Из литературы известно, что для большинства микробных
продуцентов оптимальным для синтеза ПАВ является рН, близкое к нейтральному.
Исключением являются дрожжи рода Candida, для которых максимальный синтез ПАВ
гликолипидной природы наблюдается при рН 5,3−5,7.
Цель настоящей работы – исследовать зависимость синтеза поверхностно-активных
веществ А. calcoaceticus ИМВ В-7241 от рН.
При культивировании A. calcoaceticus ИМВ В-7241 на среде с этанолом в зависимости от
начального рН среды его значение снижалось до 4,7−5,2 уже на вторые сутки. Дальнейшее
поддержание рН на уровне 5,0−8,0 осуществляли периодическим подщелачиванием
культуральной жидкости растворами КОН и NaOH. Показано, что концентрация
синтезированных ПАВ, а также ПАВ-синтезирующая способность повышались до 3,0−3,1 г/л и
2,4−2,6 г ПАВ/г биомассы соответственно при поддержании рН на уровне 6,0−7,0 раствором
КОН, что в 1,6−1,8 раза больше, чем без регуляции рН. При нейтрализации культуральной
жидкости раствором NaOH показатели синтеза ПАВ были в 1,2−1,3 раза ниже по сравнению с
использованием для этой цели КОН.
Дальнейшие эксперименты показали, что катионы натрия являются ингибиторами
активности ферментов биосинтеза поверхностно-активных глико- (фосфоенолпируват-(ФЕП)-
244
Прикладная биотехнология
синтетаза) и аминолипидов (НАДФ+-зависимая глутамат-дегидрогеназа) у A.calcoaceticus ИМВ
В-7241. Так, при наличии в реакционной смеси 50 мМ Na+ активность ФЕП-синтетазы и
глутаматдегидрогеназы снижалась в 1,8 и 5 раз соответственно. Отметим, что в присутствии
катионов натрия наблюдали также снижение почти в 2 раза активности ФЕП-карбоксилазы –
фермента анаплеротической реакции, восполняющей пул С4-дикарбоновых кислот (наряду с
глиоксилатным циклом) у штамма В-7241, растущего на этаноле.
На следующем этапе определяли качественный состав поверхностно-активных липидов,
синтезируемых при различных значениях рН среды культивирования A. calcoaceticus ИМВ В7241. Использование NaOH в качестве титрующего агента для поддержания рН на заданном
уровне в процессе выращивания штамма ИМВ В-7241 сопровождалось снижением спектра
образуемых нейтральных, глико- и фосфолипидов по сравнению с применением для
титрования раствора КОН.
Полученные результаты следует учитывать при разработке биотехнологии поверхностноактивных веществ, в частности, при выборе титрующего агента.
МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ СОВРЕМЕННЫХ
ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ СОРТОВ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В КУЛЬТУРЕ IN
VITRO
Гончарук А.Н., Бавол А.В., Зинченко М.А.
Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины
bavol1@rambler.ru
Получение морфогенного каллуса и последующая регенерация растений являются
важными и неотъемлемыми этапами биотехнологий пшеницы. При этом, для пшеницы до сих
пор актуальной остается проблема реализации морфогенетического потенциала
культивируемых клеток и разработка путей его повышения. Как известно, одним из решающих
факторов, определяющих успех в решении этой проблемы, является генотип сортов. Поэтому
поиск генотипов, которые объединяют в себе ценные для дальнейшей селекции признаки с
высоким морфогенным потенциалом, является важной задачей. В связи с этим, целью нашей
работы было изучение особенностей процессов каллусогенеза и регенерации побегов в
культуре in vitro современных высокопродуктивных сортов озимой пшеницы украинской
селекции.
Материалом исследования были 14 высокоурожайных сортов озимой пшеницы среди
которых: Смуглянка, Володарка, Достаток, Золотоколоса, Колумбия, Славна, Фаворитка,
Чорнява, Богдана, Винничанка, Подолянка, Переяславка, Снигурка, Ятрань 60. Все они
получены в отделе генетического улучшения растений ИФРГ НАН Украины.
В качестве эксплантов использовали апикальные меристемы побегов 3-х суточных
стерильных проростков. Культуру каллусных тканей получали на среде МС, которая
дополнительно содержала 2мг/л 2,4-Д. Экспланты культивировали при 26°С в темноте две
недели, после этого их переносили на свет (при 16-ти часовом фотопериоде) на протяжении
ещё двух недель. Образовавшиеся каллусы для регенерации переносили на среду МС,
дополненную 1мг/л БАП, 0,5 мг/л ИУК и 10 мг/л AgNO3. Частоту индукции каллуса и
регенерации растений (в%) выражали как отношение числа эксплантов, которые образовали
каллус или растения-регенеранты, к общему числу эксплантов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что все изучавшиеся сорта пшеницы в
культуре in vitro характеризуются высокой способностью к индукции каллуса, которая
варьирует от 68,6±3,4% (Достаток) до 99,1±0,9% (Подолянка). Все исследуемые генотипы
оказались способными образовывали морфогенный каллус, хотя и с различной частотой.
Наибольшей частотой образования морфогенного каллуса характеризовались сорта Ятрань 60 и
Подолянка – 87,8% и 86,1% соответственно. Наименьшей частотой образования морфогенного
каллуса характеризовались сорта: Снигурка, Винничанка, Колумбия – от 33 до 46%.
Наибольшей частотой регенерации характеризовались сорта Подолянка, Володарка и Ятрань
60. Частота образования побегов у этих сортов в культуре in vitro колебалась от 25 до 43%.
Наименьшей регенерационной способность характеризовались сорта Переяславка и Смуглянка,
245
Прикладная биотехнология
она не превышала 10%. Полученные растения-регенеранты характеризовались нормальным
развитием, которое проходило аналогично развитию донорных растений в условиях in vivo.
Сорта Подолянка, Володарка и Ятрань 60 наиболее целесообразно использовать для улучшения
существующих сортов пшеницы при помощи биотехнологических методов.
ИНТЕИН-ОПОСРЕДОВАННОЕ ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО
АНАЛОГА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ФРАГМЕНТА ТУМСТАТИНА ЭФФЕКТИВНОГО ПРИРОДНОГО ИНГИБИТОРА АНГИОГЕНЕЗА
Бейрахова К.А., Есипов Р.С.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
kbey@yandex.ru
Тумстатин (28 кДа), образующийся при протеолизе цепи α3 коллагена IV типа
матриксными металлопротеиназами, является сильным эндогенным ингибитором ангиогенеза.
Тумстатин связывается с интегрином αvβ3 на поверхности эндотелиальных клеток и
специфически ингибирует белковый синтез в этих клетках. Было показано, что участок Leu69Ser95 является функциональным фрагментом, определяющим антиангиогенную активность
тумстатина. Ранее нами был предложен способ получения рекомбинантного фрагмента
тумстатина (69-95) в составе гибридного белка с тиоредоксином и сайтом расщепления
протеиназы вируса гравировки табака. Мы продемонстрировали биологическую активность
этого пептида на моделях ангиогенеза in vivo и in vitro. С целью оптимизации и снижения
себестоимости биосинтеза рекомбинантного пептида для дальнейших биологических и
предклинических испытаний нами была разработана альтернативная схема выделения и
очистки пептида на основе интеиновой системы. Пептид получали в составе гибридного белка
с
мини-интеином
Ssp
DnaB
из
Synechocystis
sp.
Расщепление такого полипептида происходит автокаталитически в слабокислой среде
и не требует применения сайт-специфических эндопротеиназ или химических
реагентов. Гибридный белок синтезировался в бактериальных клетках в нерастворимой форме
в виде телец включения. Тельца включения отмывали, белок солюбилизировали и проводили
реакцию автокаталитического расщепления в оптимизированных условиях (pH раствора 6.5,
концентрация белка 0,5 мг/мл). Эффективность реакции расщепления была не ниже 70%.
Целевой пептид затем очищали с помощью ультрафильтрации и обращённо-фазовой
высокоэффективной жидкостной хроматографии. Выход пептида составил 20 мг с 1 л
культуральной среды.
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM SP245 НА РОСТ МЕРИКЛОНОВ
КАРТОФЕЛЯ И ХРИЗАНТЕМЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Букарев Р. В.1,Ткаченко О.В.2, Бойкова Н.В.2,Евсеева Н.В.3, Бурыгин Г.Л.3,
Дмитриенко В.В.3, Попова И.А.3
1
Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского; 2Саратовский
государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова; 3Институт биохимии и
физиологии растений и микроорганизмов РАН
bukarev_r@mail.ru
Бактерии рода Azospirillum являются одним из широко исследуемых и перспективных
объектов в изучении явления растительно-микробной ассоциативности. Установлено их
положительное влияние на рост, развитие и повышение устойчивости к фитопатогенам
растений. Целью исследования является изучение влияния бактерий Azospirillum brasilense
Sp245 на рост микроклонов картофеля и хризантемы в условиях in vitro и на адаптацию
растений к условиямin vivo.
246
Прикладная биотехнология
Растения картофеля сорта Кондор и хризантемы сорта Белый шар, культивируемые на
среде МС in vitro, инокулировали бактериями штамма A. brasilense Sp245 в концентрации 106
кл/мл. Определяли изменение морфологических параметров растений в процессе
культивирования in vitro и в почве in vivo. Изучали характер распределения численности
бактерий на
корнях растений методами иммунофлуоресцентной микроскопии,
иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием специфических антител к клеткам
A.brasilense Sp245 и определения колониеобразующих единиц (КОЕ).
Установлено положительное влияние бактерий на все исследуемые морфологические
параметры микроклонов хризантемы, как в условиях in vitro, так и при адаптации растений in
vivo, а также на увеличение коэффициента размножения микроклонов картофеля invitro. С
использованием иммунофлюоресцентной микроскопии установлено, что бактерии
локализуются в области кончика корня и в зоне корневых волосков. По данным ИФА
концентрация бактерий в питательной среде, где культивировались растения хризантемы и
картофеля in vitro, на 20-е сутки культивирования составила 107 кл/мл, а на корнях растений –
106 кл/см2. В экспериментах in vivo по выявлению азоспирилл на корнях картофеля и
хризантемы были обнаружены колонии A. brasilense Sp245 после высева корневых экстрактов
на плотную питательную среду.
Дальнейшие исследования актуальны в направлении стандартизации создания
ассоциативного симбиоза растений с ростстимулирующими бактериями, в частности с
азоспириллами, в целях совершенствования технологии микроклонального размножения
растений in vitro.
УСЛОВИЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ КАЛЛИЗИИ
ДУШИСТОЙ И ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ
Булатова А.А.
Белорусский государственный университет, Минск (Беларусь)
Bulatovan84@mail.ru
В настоящее время большой интерес для исследования представляет Каллизия душистая
(Callisia fragrans Wood.) илиЗолотой ус – растение из семейства Коммелиновых. В листьях и
стеблях каллизии душистой обнаружены фенольные и тритерпеновые соединения, простые и
сложные сахара, аминокислоты, органические кислоты, витамины и микроэлементы. Настои и
отвары побегов каллизии душистой используют в народной медицине в качестве
иммуномодулирующего средства для лечения самых разнообразных заболеваний от ОРВИ до
злокачественных опухолей.
В нашей работе объектом исследования служили листья каллизии душистой. Ранее, нами
успешна была проведена стерилизация стеблевых побегов и получена стабильная каллусная и
суспензионная культуры. Поверхностную стерилизацию листовых эксплантов проводили
обработкой 70% этиловым спиртом в течение 5 минут, 2% перманганатом калия – 15 минут. В
качестве основного стерилизующего агента использовали дезинфицирующее средство
«Доместос», включающее в свой состав гипохлорит натрия. В растворе «Доместос» в трех
вариантах разведения (1:1; 1:2; 1:3) экспланты выдерживали 30 минут. По окончании
стерилизации промывали стерильной водой 3 раза по 10 минут, затем разрезали на фрагменты
по 5 мм и переносили на 2 варианта агаризованных питательных сред с минеральной основой
среды Мурасиге и Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы и гормонов: в І варианте – 0,1 мг/л
кинетина и 1мг/л 2,4 – Д, во II варианте – 0,1 мг/л кинетина и 0,5 мг/л 2,4 – Д. Экспланты
культивировались в термостате в темноте при температуре 24±1 ºC.
В результате проведенной стерилизации, было выявлено, что при обработке «Доместосом»
в разведениях дистиллированной водой 1:1 и 1:2 процент жизнеспособных эксплантов составил
60% и 80% соответственно от общего количества, при разведение 1:3 показатель был
максимальным и составил 100%. При этом микробного и грибного заражений не наблюдалось.
Начало каллусообразования на различных средах совпадало и приходилось на 18 сутки. Однако
на среде, содержащей 1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина наблюдался сильный ризогенез (на 90%
247
Прикладная биотехнология
эксплантов). На среде, содержащей 0,5 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина ризогенез был минимален
– 10%.
Анализ полученных результатов позволяет заключить, что наиболее эффективной является
процедура стерилизация с использованием «Доместоса» в разведениях дистиллированной
водой 1:3. Установлен оптимальный состав питательной среды для инициации каллусогенеза, в
которой концентрации гормонов 2,4-Д и кинетина - 0,5 мг/л и 0,1 мг/л соответственно.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ
Ветошкина Д.В.1, Захарченко Н.С.2, Лебедева А.А.2, Пиголева С.В.2, Тарасова
П.В.1, Чепурнова М.А.1, Бурьянов Я.И.2
1
ТулГУ, Тула (Россия) 2ФИБХ РАН, Пущино (Россия)
darja-vetoshkina@rambler.ru
При выращивании и хранении сельскохозяйственной продукции стоят задачи защиты ее от
микробных фитопатогенов, приносящих большой урон урожаю. Целью работы было получение
растений рапса и томата с повышенной биобезопасностью и устойчивостью к фитопатогенным
микроорганизмам за счет экспрессии искусственного гена антимикробного пептида цекропина
Р1. Настоящее поколение трансгенных растений содержит селективные маркерные гены
устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Полученные с их помощью растения
представляют потенциальную биологическую опасность, связанную с возможностью их
неконтролируемого переноса другим растениям и микроорганизмам. В работе сконструирован
вектор, содержащий ген цекропина Р1, без селективных генов устойчивости к антибиотикам и
гербицидам. Разработаны методы отбора растений, основанные на анализе антибиотической
активности экстрактов трансгенных растений и иммунохимической детекции пептида в
растительных экстрактах. Проведено молекулярно-генетическое и физиолого-биохимическое
исследование полученных безмаркерных растений, включая анализ содержания цекропина Р1 в
растениях, анализ общего содержания белка, анализ фотосинтетической активности растений,
антиоксидантной защитной системы и тестирование их устойчивости к фитопатогенам.
Таким образом, показана принципиальная возможность проведения трансформации
растений без помощи дополнительных селективных или репортерных генов и получения
растений без этого опасного "генетического мусора". С целью анализа экологической
безопасности полученных растений исследована их способность сохранять ассоциативную
связь с полезными микроорганизмами. Полученные биобезопасные растения могут
представлять интерес для сельского хозяйства.
Работа поддержана грантами РФФИ № 11-04-00037, № 11-08-00413, № 12-08-00131, № 1204-01202 и №12-08-90015 Бел_а.
ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА
КСИЛОГЛЮКАНАЗЫ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ОСИНЫ
Видягина Е.О.1,2, Ковалицкая Ю.А.2, Салмова М.А.1,2, Логинов Д.С.3, Королева
О.В.3, Шестибратов К.А.2
1
ПущГЕНИ; 2ФИБХ РАН; 3ИНБИ РАН
vidjagina@mail.ru
Ксилоглюканы являются основными полисахаридами гемицеллюлозы, которые в
значительной степени определяют механические характеристики клеточных стенок. Разделение
микрофибрилл при росте растения обеспечивают ферменты - ксилоглюканазы. В этой связи,
есть основания полагать, что суперэкспрессия ксилоглюканаз, действующих на ксилогликан,
может оказывать существенное влияние на рост и развитие растений. Для доказательства этого
предположения нами выбран подход создания трансгенных растений осины с конститутивной
экспрессией рекомбинантной ксилоглюканазы.
248
Прикладная биотехнология
Генетическую трансформацию осины проводили с использованием растительного
материала in vitro генотипа Pt. Для проведения агробактериального переноса использовали
штамм бактерий, несущий бинарный вектор pBI-Xeg. В Т-ДНК вектора находился химерный
ген sp-Xeg под транскрипционным контролем 35S промотора и нопалинсинтетазного
терминатора. В результате, впервые были получены 14 линий растений осины с экспрессией
рекомбинантного гена ксилоглюконазы из гриба Penicillium canescens и охарактеризованы
некоторые их свойства. Конститутивная экспрессия гена sp-Xeg на уровне транскрипции
подтверждена методом ОТ-ПЦР. Анализ белковых экстрактов из листьев тепличных растений и
микропобегов in vitro показал повышение ксилоглюканазной активности у трансгенных линий.
В случае экстрактов из листьев максимальное повышение активности составило 1,6 (клон
PtXVXeg1b), а микропобегов in vitro – 2,1 (клон PtXVXeg1c). У трансгенных растений
отмечено также снижение удельного содержания пентозанов в древесине. В контрольных
растениях (генотип Pt) оно составляло 148 мг/г сухого веса, тогда как в исследуемых клонах
(PtXVXeg1a, PtXVXeg1b, PtXVXeg1c) варьировало в диапазоне от 100 до 140 мг/г сухого веса.
Максимальное снижение (на 31%) содержания пентозанов зафиксировано в линии PtXVXeg1с,
оно составляло 102,1 ±1,5 мг/г сухого веса. Сравнительный анализ морфологии листьев
трансгенных клонов осины позволил обнаружить неожиданный эффект генаsp-Xeg. Анализ
морфологии листьев выявил увеличениие длины черешка и сокращение длины главной жилки у
трансгенных линий. Отношение длины черешка к длине главной жилки у растений
контрольной группы равнялось 0,49, тогда как у трансгенных растений оно варьировало от 0,51
до 0,66. Достоверное увеличение данного критерия отмечено у 12 линий из 14.
Полученные результаты служат основанием для дальнейшего изучения свойств
трансгенных линий Xeg. Нами планируется определить содержание целлюлозы и лигнинов в
древесине данных растений, а также выявить возможные изменения в экспрессии нативных
белков.
ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ
ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИМИ МИКРОРГАНИЗМАМИ
Виноградова О.Н.
Сибирский федеральный университет
olgav88@mail.ru
Белок является наиболее дефицитным компонентом питания человека, и мировая
потребность в белке в настоящее время удовлетворяется не полностью. Актуальным
направлением является привлечение альтернативных сбалансированных источников пищевого
белка, одним из которых является белок микроорганизмов.
Перспективность
водородокисляющих
бактерий
по
сравнению
с
другими
разрабатываемыми продуцентами белка определяется высоким содержанием полноценного
белка (до 60 – 70%).
Объект исследования водородные бактерии Alcaligenes eutrophus Z1 и Ralstonia eutropha
B5786, СО-резистентный штамм карбоксидобактерий Seliberia carboxydohydrogena Z1062.
Культивирование бактерий проводили с использованием автоматизированного
ферментационного комплекса BioFlo 110, «New Brunswic» (США). В качестве источника
углерода и энергии использовали смесь газов (СО2, Н2, О2) с соотношением компонентов 1:2:7
по объему.
Анализировали общее содержание белка в биомассе, его фракционный и аминокислотный
состав, перевариваемость протеолитическими ферментами in vitro.
Аминокислотный состав белков определяли на автоматическом анализаторе KLA-38
фирмы «Хитачи» (Япония). Разделение белков на фракции и изучение их фракционного состава
выполняли в щелочных и солевых растворах. Атакуемость белковых фракций определяли по
методу Покровского-Ертанова с использованием протеолитических ферментов.
Исследованные белки богаты незаменимыми аминокислотами (содержание их в общей
фракции до 40%). Сумма незаменимых аминокислот у всех изученных штаммов превышала
249
Прикладная биотехнология
содержание незаменимых аминокислот в зерне (более чем на 10%) и была близка к данному
показателю у казеина.
Бактериальные белки по фракционному составу существенно отличаются от традиционных
белков. В отличие от мяса, для которого до 80% приходится на фракции I и II (наиболее
доступные пищеварительным ферментам), в белках водородокисляющих бактерий только 50%
белков представлена I и II.
Показано, что белки водородокисляющих микроорганизмов по ряду основных показателей,
характеризующих биологическую ценность, занимают промежуточное положение между
белками животного и растительного происхождения. Высокое общее содержание белка в
биомассе,
полноценный
аминокислотный
состав
и
доступность
воздействию
протеолитическими
ферментами
позволяют
рассматривать
водородокисляющие
микроорганизмы в качестве потенциального источника белка.
Работа выполнена при поддержке проекта, инициированного правительством России
(Указ № 220 от 09.04.2010) для государственной поддержки научных исследований,
проводимых под руководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях
высшего профессионального образования (Соглашение № 11. G34.31.0013) и Программы
Президента России для молодых докторов наук (грант № МД-3112.2012.4).
ПОЛУЧЕНИЕ ЦИСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ ПОМОЩИ ТРАНСФОРМАЦИИ
ЯБЛОНИ ВЕКТОРОМ PMF1
Власова А.А.1, Тимербаев В.Р.2, Долгов С.В.1,2
1
Мичуринский государственный аграрный университет; 2Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Филиал Института биоорганической химии им. акад.
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино (Россия)
anutik.vlasowa@yandex.ru
Одним из основных опасений, связанных с использованием продуктов, содержащих ГМО,
является применение генов устойчивости к антибиотикам, которые используются для селекции
трансгенных растений при генетической трансформации. Необходимость таких селективных
генов в дальнейшем теряется, однако эти последовательности ДНК навсегда остаются в геноме
отобранных таким образом растений. Предполагается, что эти гены устойчивости могут
передаваться эндогенной микрофлоре, в том числе патогенной, в результате чего микробы
могут приобрести резистентность к данному антибиотику. Несмотря на то, что вероятность
такого события ничтожно мала, а используемые для селекции антибиотики давно не
применяются в медицине для лечения, опасения в обществе остаются, поэтому применение
технологий получения растений, свободных от селективных генов приобретает все большую
актуальность.
Наиболее современным и перспективным подходом получения растений без маркеров
является применение генетических конструкций, которые после отбора растений на
селективной среде позволяют после соответствующей обработки элиминировать ненужный
фрагмент ДНК. Эти системы создаются с применением индуцибельных сайт-специфических
рекомбиназ. После отбора трансформантов химическая активация рекомбиназы приводит к
элиминации ненужной части Т-ДНК из растительного генома.
Цисгенные растения - это генетически модифицированные растения с натуральным геном,
взятым от растения донора, которое может скрещиваться с растением-реципиентом. Такой ген
включает интроны, фланкирован натуральными промотором и терминатором в нормальной
ориентации, т.е. другими словами, абсолютно ничем не отличается от природного гена.
Целью работы было подобрать условия и провести эксперименты по генетической
трансформации яблони (Malus domestica L.) сорта «Мелба» с использованием Agrobacterium
tumefaciens. В нашей лаборатории были созданы конструкции с использованием
плодоспецифичных промоторов томата Elip и E8 в векторе pMF1, который обеспечивает
удаление маркерных генов путем индуцибельной сайт-специфической рекомбинации и
содержит ген npt11 для селекции на канамицине. На первом этапе нашей работы был получен
250
Прикладная биотехнология
стерильный растительный материал и объект введен в культуру in vitro. Сейчас проводятся
трансформации листовых эксплантов яблони полученными векторными конструкциями.
ИНДУКЦИЯ КЛУБНЕОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
КАРТОФЕЛЯ IN VITRO
Гизатуллина А.Т., Сташевски З.
ГНУ Татарский научно-исследовальский институт сельского хозяйства
Россельхозакадемии
gizatyllina.a@mail.ru
Микроклубни (или клубни in vitro) являются миниатюрным клубнями картофеля,
получаемыми в асептических условиях на микрорастениях in vitro. Они широко используются
для научно-исследовательской работы и при ведении селекции и семеноводства картофеля.
Основной целью наших исследований является подбор универсального состава
питательной среды и условий культивирования, позволяющие индуцировать образование
миниклубней из генетически разнородного селекционного материала картофеля.
Объектом исследования служили гибридные семена и микрорастения комбинации
Виктория х 50-03, Нора х 50-03, Тениз х 50-03 и 95-26-2 х Инноватор, полученных в
лаборатории селекции картофеля ГНУ ТатНИИСХ.
Индукцию микроклубней на гибридных микрорастениях картофеля изучали на 5 видах
питательных сред, 2-х режимов освещения (полное отсутствие освещения (MК…D) и 16 ч
световой фотопериод (2000 люкс) (MК…L)), и 2-х видов эксплантов одно- и многоузловые
(МВS…D и MBM…D). Температура культивирования + 18-20°С. Эксперимент включал
следующие варианты питательные среды MК: (1) MКD и MКL с высоким содержанием
сахарозы (8%), (2) MKS2D и MKS2L на фоне высокой концентрации сахарозы (8%) был
добавлен кинетин (2,5 мг/л), (3) MKS3D и MKS3L на фоне промежуточной концентрации
сахарозы (5%) был добавлен кинетин (0,5 мг/л), (4) МВS1D и MBM1D на фоне высокой
концентрацией сахарозы (7%) с добавлением ВАР (6 мг/л), (5) МВS2D и MBM2D на фоне
промежуточной концентрации сахарозы (5%) с добавлением ВАР (5 мг/л).
Во время эксперимента оценивались количество продуктивных растений, сроки
формирования, количество и вес микроклубней. В результате наших исследований доля
продуктивных растений, сформировавших микроклубни, варьировала в пределах от 14 до
100%. В независимости от состава питательной среды, большой разброс и низкое количество
продуктивных растений (39±21%) выявлено в условиях 16-часового освещения. Наиболее
эффективно индукция микроклубней из микрорастений гибридов картофеля проходила на
среде MB1MD (87%) и MKS2D (77%).
Средняя продолжительность клубнеобразования in vitro колебалась в широких пределах от
29 до 92 дней. Формирование микроклубней начиналось с 10 дня в условиях темноты и на 15
день в условиях стандартного освещения. По вариантам опыта наименьшая продолжительность
индукции клубнеобразования показана при инкубации микрорастений картофеля на среде
MВ1D и MB2D (29-44 дня).
На среднее количество микроклубней в проведенном нами эксперименте ни состав
питательной среды, ни генотип растений, ни вид экспланта не имел решающего влияния.
Внутри комбинации показано большое варьирование по массе клубня (0,02-0,21 г). Среднее
значение веса микроклубней по вариантам опыта отличалось незначительно. Максимального
единообразия по размеру и весу клубней (0,41±0,04 см и 0,05±0,01 г) удалось добиться в случае
инкубации многоузловых черенков на питательных средах, содержащих BAP.
РАЗМНОЖЕНИЕ И ВЫРАЩИВАНИЕ АПОМИКТИЧЕСКИХ ФОРМ ТАБАКА
МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ - IN VITRO
Глюдзык М.Ю.
Закарпатский Институт АПП УААН
251
Прикладная биотехнология
monika33022@mail.ru
На сегодняшний день перспективным и экономически выгодным методом массового
размножения растений является метод культуры изолированных тканей - in vitro, широко
применяется для семенного и клонального микроразмножения.
Клональное микроразмножения - это массовое бесполое размножение растений в культуре
тканей и клеток, в результате которого мы получаем растения генетически идентичны
материнской особи. Исходным материалом для данного метода размножения является
апикальные и латеральные меристемы, молодые листья, элементы цветка, луковиц или
клубнелуковиц. Благодаря этому методу могут быть размножены и оздоровлены большое
количество растений как открытой, так и закрытой почвы.
Применение этого метода позволяет решить проблему оздоровления растений от вирусных
инфекций и бактериальных болезней, а также массово размножить новые гибриды, медленно
растущие растения, редкие и исчезающие виды, занесенные в Красную книгу.
Меристемный посадочный материал, оздоровлен и размножен в лабораторных условиях,
отличается от обычного и имеет преимущества: генетическая идентичность материнском
растении; оздоровление от вирусных, бактериальных и грибковых инфекций, высокая
способность саженцев до приживаемости (95-100%) однородность развития растений,
повышение урожайности в 3-4 раза; растения раньше вступают в стадию цветения, что
позволяет снизить затраты на выращивание и себестоимость урожая , повышенная
морозостойкость, устойчивость к основным болезням и паразитам.
Объектом исследования был Nicotiana tabacum L., сорт Бравый 200 А.
Цель нашего исследования заключалась в разработке технологии метода культуры
изолированных тканей - микроклонального размножения табака, получение морфологически
однородного высадочного материала и дальнейшая постасептичная адаптация. Семена
выращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, в каждую из которых высевали по 40
семян и наливали по 10 мл дистиллированной воды при температуре 20 - 240С.
После появления проростков на 8 сутки от начала проращивания размножали растения
побегами, апикальной меристемы и пазушными почками в среде Мурасиге-Скуга с
добавлением различных микроэлементов, в частности ауксина (где формировалось тонкой,
прямостоячий стебель высотой 5-8 см) и цитокинина (наблюдалось боковое ветвление,
образовывалось несколько толстых стеблей размером 4-7 см).
На 8 сутки онтогенеза наблюдали формирование листьев проросших растений, на 13 сутки
- появление 5-8 настоящих листьев. Процент приживаемости Nicotiana tabacum L. составил
примерно 90% от общего количества выращиваемых растений.
Клональное микроразмножения открывает широкие возможности для быстрого
воспроизводства ценных апомиктических форм.
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ЭКСТРАГИРОВАНИЯ НА СВОЙСТВА
МЕЛАНИНОПОДОБНЫХ СОЕДИНЕНИЙ INONOTUS OBLIQUUS
Грачева Н.В., Кавеленова С.М.
Волгоградский государственный технический университет, Волгоградский
государственный медицинский университет
gracheva.tasha@yandex.ru
В настоящее время широко используются продукты переработки лигнина с целью создания
на их основе новых материалов. Получение таких продуктов возможно как химической
модификацией лигнина, так и его переработкой с помощью живых организмов. Среди
организмов, метаболизирующих лигнин, особый интерес представляет гриб Inonotus obliquus.
Он в процессе жизнедеятельности продуцирует из лигнина меланиноподобные соединения
(МС). Одно из направлений получения МС из Inonotus obliquus - его биотехнологическое
культивирование. При этом основной проблемой является выделение МС с высоким выходом.
Цель данной работы оценить влияние условий экстрагирования на выход МС и их свойства.
Показано, что при эктрагировании в условиях наложения электрического поля выход МС
увеличивается. Оптимальными условиями, обеспечивающими выход МС 89,4-90,2%, являются
252
Прикладная биотехнология
напряженность электрического поля 8,8 В/см, температура процесса 60-61о С, массовое
соотношение сырье –экстрагент 1:17, размер частиц сырья 250 мкм, продолжительности
процесса 3 часа. При повышении напряженности электрического поля выше 8,8 В/см
происходит снижение выхода МС, что обусловлено формированием отличной коллоидной
системы и, возможно, деструктивными изменениями самого МС. Показано, что
металлсвязывающая способность МС экстракта, полученного без наложения электрического
поля при продолжительности процесса 12 часов, увеличивается в ряду Fe2+ < Fe3+ < Cu2+ < Pb2+
< Cd2+. Выявлено, что металлсвязывающая способность МС экстракта, полученного в
электрическом поле в оптимальных условиях, характеризуется более высокими значениями и
увеличивается в ряду Fe2+< Cu2+< Fe3+ < Pb2+ < Cd2+. Антиоксидантную активность (АОА)
веществ исследовали методом обесцвечивания АБТС-радикала. Исследуемые МС растворяли в
диметилсульфоксиде (ДМСО). Анализ проводили как в водной среде, так и в среде ДМСО.
АОА МС, полученных разными способами, существенно не различалась. При этом АОА обоих
препаратов МС, определенная в среде ДМСО, значительно выше, чем определенная в водной
среде. Таким образом, экстрагирование в условиях наложения электрического поля является
перспективным подходом для извлечения МС из клеточной массы Inonotus obliquus.
ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ СОРТОВ И ГИБРИДОВ ТВЕРДОЙ ПШЕНИЦЫ К
АНДРОГЕНЕЗУ IN VITRO
Замбриборщ И.С., Доброва А.А.
Южный биотехнологический центр в растениеводстве НААНУ, Одесса (Украина)
dobrovaann@gmail.com
Получение дигаплоидов твёрдой пшеницы является одним из распространенных
биотехнологических методов, и находит широкое применение в разных селекционных
программах, обеспечивая значительное сокращение продолжительности процесса создания
новых линий. Первым этапом в получении удвоенных гаплоидов является индукция
новообразований в культуре пыльников in vitro.
Целью работы было исследование способности к индукции новообразований в культуре
изолированных пыльников 20 сортов и 14 гибридов твердой пшеницы украинской и
зарубежной селекции.
Для индукции новообразований изолированные пыльники (микроспоры которых находятся
в средней стадии развития пыльцевого зерна), эксплантировали на питательные среды BAD-1 и
190-2. На индукцию новообразований влияет как генотип донорного материала, так и условия
культивирования. Установлено, что среда BAD-1 является более эффективной для индукции
новообразований. И сорта и гибриды демонстрировали на ней высокий процент
новообразований, в сравнении с результатами, полученными на среде 190-2. Средний процент
новообразований на среде BAD-1 – 6,25%, тогда как на среде 190-2 он составил 2,43%. Более
высокая эффективность среды BAD-1 была подтверждена статистической обработкой данных,
а именно U-критерием Манна-Уитни и методом Вильсона при уровне значимости р≤0,01.
Индукция новообразований отмечена у всех исследованных генотипов. Высокий процент
индукции новообразований характерен для гибридов сорта Arighor (6,36 – 14,36%). Среди
сортов наиболее высокий процент индукции новообразований характерен для сорта
Харьковская 37 (22,37%). Средний процент новообразований для сортов составил 4,76%, для
гибридов – 8,36%. Более высокая индукционная способность характерна для гибридов по
сравнению с сортами, что является статистически достоверным при уровне значимости 0,05.
253
Прикладная биотехнология
КОНСТИТУТИВНАЯ ЭКСПРЕССИЯ H+-АТФАЗЫ S. CEREVISIAE В ШТАММЕ
ACREMONIUM CHRYSOGENUM - ПРОДУЦЕНТЕ ЦЕФАЛОСПОРИНА С:
ВЛИЯНИЕ НА ВЫХОД ЦЕФАЛОСПОРИНА И ЕГО ИНТЕРМЕДИАТОВ,
БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ
Думина М.В.1, Жгун А.А.1, Валиахметов А.Я.2, Домрачева А.Г.1, Новак М.И.1,
Эльдаров М.А.1, Бартошевич Ю.Э.1
1Федеральное государственное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской
академии наук; 2Федеральное государственное учреждение науки Институт биохимии
и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук
DuminaMaria@gmail.com
Цефалоспорины - обширный класс антибиотиков с мощным бактерицидным действием,
низкой токсичностью, широким терапевтическим диапазоном. Исходным субстратом для
получения полусинтетических цефалоспоринов является цефалоспорин С (цефС),
продуцируемый аскомицетом A.chrysogenum. Ранее нами было показано, что полученный в
результате многоступенчатого мутагенеза и селекции высокопродуктивный штамм
A.chrysogenum - продуцент цефС обладает определенным дефектом по синтезу Н+-АТФазы
плазмалеммы (ПМ) – основного белка, отвечающего за формирование электрохимического
градиента протонов, энергизующего все процессы транспорта метаболитов посредством
Н+/симпортного или Н+/антипортного механизмов. Для возможной коррекции этого дефекта мы
предприняли попытку конститутивной экспрессии гетерологичной Н+-АТФазы дрожжейсахаромицетов в виде ее N-концевого гибрида c желтым флуоресцентным белком в
высокопродуктивном штамме A.chrysogenum – продуценте цефС.
Первоначально корректность функционирования и мембранной топологии гибридного
PMA1-YFP белка была показана с помощью гомологичной экспрессии в штаммах S.cerevisiae
SY4, YPH857, где PMA1, слитый с последовательностью желтого флуоресцентного белка, был
поставлен под контроль термоиндуцибельного 2HSE промотора из S.cerevisiae.
Перенос кассеты для гетерологичной экспрессии PMA1, где PMA1-YFP был поставлен под
контроль конститутивного gpdA промотора изA. nidulans, был осуществлен методом
агробактериальной трансформации путем кокультивирования A.tumefaciens AGL0 и
высокопродуктивного штамма A.chrysogenum 26/8. Исследование полученных рекомбинантных
клонов показало хромосомную интеграцию PMA1-YFP.
Экспрессируемый PMA1-YFP в A.chrysogenum 26/8 в опытах по флуоресценции показал
мембранную топологию. Белок является функционально активным, характеризуется
выраженным эффектом глюкозной активации, не наблюдаемым для РМА из A.chrysogenum.
Для полученных клонов было выявлено существенное снижение внутриклеточного содержания
АТФ в 1,5-2 раза по отношению к контрольному штамму A.chrysogenum. Оценка уровня
продукции цефалоспорина С клонами A.chrysogenum 26/8_PMA1-YFP по его удельной
активности в культуральной жидкости, а также профилю ВЭЖХ хроматограммы выявила
наличие трех групп клонов: с уровнем биосинтеза сопоставимым с контролем; сниженным до
10 раз при одновременном повышении содержания в культуральной жидкости промежуточных
соединений; а также перспективной группы, характеризующейся достаточно высоким
содержанием как цефалоспорина С, так и предшественников конечного продукта биосинтеза.
ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОДОРОДА ШТАММАМИ
RHODOBACTER SPHAEROIDES С РЕДУЦИРОВАННОЙ
СВЕТОCОБИРАЮЩЕЙ АНТЕННОЙ
Ельцова З.А., Цыганков А.А
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
фундаментальных проблем биологии РАН
z.eltsova@gmail.com
254
Прикладная биотехнология
На современном уровне развития промышленности и технологий все чаще появляется
необходимость в более энергоемких и экологически чистых источниках энергии. Этим
требованиям к источнику энергии отвечает водород. При этом наиболее экологичным способом
его получения является микробиологическое образование водорода. Одним из таких способов
является выделение водорода пурпурными несерными бактериями на свету в условиях
недостатка азота. К сожалению, скорости процесса недостаточны для его внедрения в практику
уже сегодня. Возможны два пути повышения скорости процесса: увеличение скорости
выделения водорода одной клеткой и увеличение количества клеток в единице объема. Вместе
с тем увеличение количества фотосинтезирующих клеток в единице объема при концентрации
выше 2-3 г/л приводит к самозатенению культур и их переходу из лимитирования азотом к
лимитированию светом, что снижает скорость выделения водорода.
Нами изучалась возможность повышения предельной концентрации клеток в реакторе без
светолимитирования с помощью мутантов с пониженным содержанием бактериохлорофилла и
других пигментов.
Штамм Rhodobacter sphaeroides pRK puf DD13 не имеет генов белков периферийной
антенны и комплементирован плазмидой с локализованными на ней генами белков
реакционного центра и коровой антенны. В качестве контрольного штамма использовалиpRK
puf ∆LM1, который имеет гены, кодирующие белки периферийной антенны, и
комплементирован той же плазмидой, что и pRK puf DD13. Оказалось, что оба штамма при
росте в фотогетеротрофных условиях являются нестабильными. Поэтому сравнение скоростей
выделения водорода этими штаммами при низкой и высокой концентрации клеток проводили в
краткосрочных экспериментах. Показано, что максимальная скорость выделения водорода pRK
puf DD13составляла 145 мл ч-1 л-1 реактора, тогда как у контрольного штамма это значение
составляло 59 мл ч-1 л-1.
Для выявления преимуществ штамма с пониженным содержанием пигментов в
непрерывных условиях использовали штамм DBCΩ. В качестве контрольного использовали
родительский штамм ATCC 2.4.1. Показано, что при высокой концентрации клеток для
штаммаDBCΩ интенсивность света 2000 Вт*м-2 не является насыщающей. Штаммы являются
значительно более устойчивыми в непрерывной культуре и могут быть использованы для
сравнительного анализа скорости выделения водорода при выращивании в условиях хемостата.
Исследования были проведены при поддержке РФФИ 08-08-12196 и Программы
фундаментальных исследований РАН №19 – Химические аспекты энергетики.
ВЛИЯНИЕ ГЛЮКОЗЫ И РАСТИТЕЛЬНОГО МАСЛА НА СИНТЕЗ
ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ NOCARDIA VACCINII K-8 НА
ГЛИЦЕРИНЕ
Хомяк Д.И., Конон А.Д., Кудря Н.В., Пирог Т.П.
НУХТ
Khomdan@ukr.net
Поверхностно-активные вещества (ПАВ) микробного происхождения в течение последних
лет привлекают внимание многих ученых благодаря своим уникальным физико-химическим
свойствам и биодеградабельности. Потенциальным субстратом для получения ПАВ является
глицерин, образующийся при производства биодизеля в качестве побочного продукта.
Использование глицерина в технологиях микробного синтеза решит проблему его утилизации и
значительно снизит стоимость ПАВ, а также позволит существенно повысить рентабельность
производства биодизеля.
В предыдущих исследованиях выделен штамм нефтеокисляющих бактерий,
идентифицированный как Nocardia vaccinii K-8, установлена его способность к синтезу ПАВ
при росте на очищенном глицерине, определены условия культивирования штамма К-8,
обеспечивающие максимальный синтез поверхностно-активных веществ, а также установлен
их химический состав (комплекс нейтральных, глико- и аминолипидов).
255
Прикладная биотехнология
Цель данной работы – исследование возможности синтеза ПАВN. vaccinii К-8 на
техническом глицерине в присутствии экзогенных предшественников биосинтеза углеводной и
липидной природы.
На первом этапе исследовали возможность использования технического глицерина в
качестве субстрата для биосинтеза ПАВ. Глицериновая фракция, образующаяся в процессе
производства биодизеля, кроме глицерина содержит воду, соли и другие органические
соединения, причем содержание каждого компонента колеблется в широких пределах в
зависимости от типа используемого сырья.
Результаты исследований показали, что при культивировании на модифицированном
техническом глицерине (NaCl или KCl – 2,5 г/л, метанол или этанол – 0,3%) не только не
подавляется рост бактерий, но и наблюдается повышение показателей синтеза ПАВ на 20–68%
по сравнению с культивированием на очищеном глицерине, что делает возможным
использование техничного глицерина как субстрата в данной технологии.
На следующем этапе исследовали возможность интенсификации биосинтеза ПАВ при
внесении экзогенных предшественников, которые, согласно нашим предположениям, будут
специфически включаться в метаболизм и способствовать повышению выхода целевого
продукта. Исходя из химической природы ПАВ N. vacciniiК-8, в качестве предшественников
использовали глюкозу и подсолнечное масло. Установлено, что внесение 0,05% глюкозы и
0,1% масла в начале стационарной фазы роста сопровождалось повышением уровня биосинтеза
ПАВ на 44% и 50% соответственно, в сравнении с культивированием на техническом
глицерине без предшественников.
Полученные результаты показывают возможность интенсификации синтеза ПАВ N.
vaccinii К-8 на техническом глицерине в присутствии экзогенных предшественников
углеводной и липидной природы и являются основой для разработки технологии микробных
поверхностно-активных веществ.
ПОЛУЧЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫХ ЛАКТОНОВ
SAUSSUREA PORCII DEGEN
Ивасюк С. Н., Чебан Л.М.
Черновицкий национальный университет им. Ю. Федьковича, Черновцы (Украина)
svetaivasuk@yandex.ru
Сесквитерпеновые лактоны – кислородсодержащие производные сесквитерпеноидов,
синтезирующиеся преимущественно растениями рода Saussurea DC. (Asteraceae).
Представитель флоры Буковинских Карпат, который находится под угрозой исчезновения и
имеет статус «CR» - Saussurea porcii Degen – на сегодня остается практически
неисследованным на предмет наличия сесквитерпеновых лактонов. Поэтому целью данной
работы было получение индивидуальных фракций сесквитерпеновых лактонов из сырья
дикорастущих S.porcii.
Для анализа сесквитерпеновые лактоны из листьев дикорастущих S. porcii извлекали
хлороформом. Наличие данных веществ в образцах подтверждали с помощью ИКспектроскопии в области 1400-1800 см-1. Исследование суммы сесквилактонов проводили
методом тонкослойной хроматографии на пластинках “Silufol – UV-254”, восходящим
способом в системе растворителей петролейный эфир : этилацетат (9 : 1), а идентификацию
отдельных компонентов – 1% ванилином в 20% Н2SO4. Индивидуальные вещества получали
методом препаративной хроматографии в тонком слое сорбента, извлеченные фракции
экстрагировали бензолом. Количественное определение сесквитепеновых лактонов проводили
спектрофотометрически с n-диметилбензальдегидом.
При спектральной оценке сырья листьев дикорастущих S. porciiпоказано присутствие в их
составе сесквитерпеновых лактонов, в молекулах которых имеются двойные связи в
сопряжении: α-метилен-γ-лактонный цикл. Установлено, что листья исследуемых растений
характеризируются повышенной (6,1%) способностью синтезировать сесквитерпеновые
лактоны.
256
Прикладная биотехнология
Методом препаративной хроматографии нам удалось получить 9 индивидуальных
сесквитерепновых лактонов, которые на хроматограмах окрашивались в фиолетовый цвет.
Количество компонентов, характеризирующиеся максимальной интенсивностью окрашивания
(Rf 0,36 и 0,95), составляет 1,24 и 1,05 мг/г сухого сырья соответственно, что составляет
приблизительно 16 – 18% от общей суммы сесквилактонов в листьях S. porcii.
Предварительные исследования биологической активности веществ с Rf 0,36 и 0,95 показали их
возможное антимикробное действие относительно B.subtilis, L. bulgfricum, S. flava, S. cerevisiae,
в концентрациях 75 мг/мл сухого остатка.
DEM-ТЕХНОЛОГИЯ ДЛЯ РАСТЕНИЕВОДСТВА И ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ
НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ
Казаков А.В., Злотников К.М., Казакова М.Л., Злотников А.К.
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
andreynkaz@rambler.ru
Предлагаемая DEM (Domestic Effective Microorganisms) технология основана на
использовании «домашних», местных обитающих на растениях микроорганизмах.
Приготовление DEM препарата: в емкость помещают измельченную массу травы, препарат
Альбит (1 мл/л объема емкости), доливают воду до верха, перемешивают, кладут гнет.
Выдерживают 3 – 5 суток при 15 – 30ºС. Критерий готовности препарата – появление
характерного кисловатого запаха. Жидкость отделяют от растительной массы – это и есть DEM
культура, титр бактерий в ней 107 – 108 КОЕ/мл, pH 4 – 5. Растительную массу используют в
приготовлении компоста, при перекопке почвы и посадке растений. Жидкую DEM культуру
используют для полива и опрыскивания растений, обработки семян и почвы перед посадкой,
или для инокуляции следующей емкости с растительной массой. За летний сезоны 2010 –
2011гг. было приготовлено 12 DEM культур и из каждого образца делали посев на
агаризованные среды для определения микробного состава и титра бактерий. Было
установлено, что во всех DEM культурах превалируют лактобактерии, Было отобрано и
изучено 64 штамма этих бактерий. Некоторые штаммы оказались с интересными для практики
свойствами: способность к угнетению роста дрожжей и фитопатогенных грибов (штамм
Lactobacillus brevis); способность к мацерации растительных тканей (штамм Leuconostoc
citreum).
Опыт по очистке почвы от нефтяного загрязнения с использованием DEM культуры
проводили в полевых условиях с использованием пластиковых цилиндров на 1 л почвы.
Нагрузка нефти: от 50 до 150 мл на цилиндр. В цилиндры контрольного ряда добавляли по 100
мл воды, в цилиндры опытного ряда – 100 мл DEM культуры. Повторные обработки проводили
через 7 и 14 суток. Через 2 месяца опытные и контрольные образцы почв анализировали на
способность в к фиторемедиации по тесту всхожести семян ячменя (по 50 зерен на цилиндр,
анализ всхожести проводили через 3 недели). В опытных вариантах всхожесть семян была в 5 –
10 раз выше, чем в контрольных. Это наглядно демонстрировало способность DEM культур к
разложению нефти.
Опыты по влиянию на урожай с/х растений проводили в сезоны 2010 – 2011 гг. на
нескольких культурах: томаты, перец, тыква, картофель. Во всех случаях при использовании
DEM технологии наблюдалось значительное повышение урожая, от 70 до 100%.
Разработанная DEM технология может быть иcпользована в практике растениеводства и
очистке загрязненных нефтью почв.
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
ПРИ УТИЛИЗАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ
Кияшко С.А., Антонюк М.Н.
Национальный университет пищевых технологий
svetlanakiyashko@ukr.net
257
Прикладная биотехнология
Проблема утилизации промышленных отходов актуальна во всем мире. Преимуществом
биотехнологических способов очистки окружающей среды является то, что биологический
материал включается в трофические цепи питания, естественный круговорот веществ без
образования отходов.
Основными деструкторами резины, пластиков, целлюлозы и других полимерных
соединений в окислительных условиях можно считать микроскопические грибы родов
Aspergillus, Penicillium, Тrichoderma, Fusarium, а также бактерий родов Pseudomonas,
Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter. Учеными было выделено целый ряд бактерий, которые
утилизируют алкилбензосульфаты: Alcaligenes baecalis, A.metacaligenes, Aerobacter aerogenes,
Escherichia coli, E. freundii, Pseudomonas sp. В сточных водах обнаружено бактерии родов
Кlebsiella, Achromobacter, Flavobacterium, Micrococcus, способны окислять синтетические
детергенты.
Наиболее удобным методом очистки загрязненных грунтов является создание специальных
установок биокомпостирования. Для биологической очистки грунта и воды, а также сточных
вод от загрязнений нефтью и нефтепродуктами используют препараты, в состав которых
входят культуры микроорганизмов Acinetobactercalcoaceticus, Bacillus megaterium, Gordonia
rubropertinctus, Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus erythropolis, R. maris. Наиболее интенсивно
разрушают фенолы представители родов Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus. Базидиомицет
Phanerochaete chrysosporium способен в аэробных условиях разрушать широкий спектр
ксенобиотиков, в том числе DDT, бензопирен, полихлорированные бифенилы, разнообразные
красители. Обнаружено нечувствительные штаммы бактерий рода Pseudomonas к отмеченным
гербицидам.
Отходы
предприятий
пищевой,
винодельной,
спиртовой,
перерабатывающей
промышленностей являются дешевой сырьевой базой для биотехнологии.
Следовательно, расширение знаний о свойствах микроорганизмов позволит увеличить
перспективу их использования в переработке промышленных отходов, а также позволит
качественно улучшить состояние окружающей среды.
КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ФАКТОРА
СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ IX ЧЕЛОВЕКА, ПОЛУЧЕННЫЕ ПРИ ПОМОЩИ
БИЦИСТРОННОГО ПЛАЗМИДНОГО ВЕКТОРА P1.1
Ковнир С.В., Орлова Н.А., Усакин Л.А., Воробьев И.И.
Институт биоорганической химии РАН, Москва (Россия)
kovnir.serge@gmail.com
Фактор свертывания крови IX человека (FIX) является основой заместительной терапии
гемофилии B. Наиболее распространенной стратегией получения рекомбинантных
терапевтических белков, требующих множественных посттрансляционных модификаций для
выделения в физиологически активной форме, является использование высокопродуктивных
стабильно трансфецированных моноклональных производных клеточной линии эпителия
яичника китайского хомячка CHO. Известно, что использованный в данной работе промотор и
фланкирующие нетранслируемые области гена фактора элонгации трансляции 1-α китайского
хомячка (CHEF-1) создают благоприятный контекст для целевого гетерологичного гена и
значительно устойчивее к инактивации метилированием при интеграции в геном CHO.
Результаты. Бицистронный плазмидный вектор p1.1, включающий CHEF-1 и селекционный
маркер дигидрофолатредуктазу (DHFR) был использован для экспрессии кДНК FIX в клетках
CHO, изначально нокаутированных по dhfr (-/-). Для получения поликлональной популяции
стабильно трансфецированных клеток с максимальным уровнем секреции фактора IX
использовали добавление ингибитора DHFR метотрексата (MTX) в селективную
культуральную среду, не содержащую нуклеотидных добавок. Примененялось три варианта
селективного давления 50, 100 и 200 nM MTX. Было установлено, что уровень секреции
фактора IX стабильной культурой плотностью 1,2млн.клт/мл возрастает при увеличении
концентрации метотрексата как 0.137± 0.008 МЕ/мл, 0.210± 0.010 МЕ/мл, 0.366 ± 0.049 МЕ/мл
соответственно. При этом время получения стабильной поликлональной культуры остается
258
Прикладная биотехнология
практически неизменным (30, 29 и 27 дней для 50, 100 и 200 nM MTX). При генерации
моноклональных линий методом предельных разведений из поликлональной популяции было
обнаружено, что отсутствует субпопуляция не экспрессирующая целевого гена , а
высокопродуктивные клоны составляют более 10% от общего количества проскринированных
клональных линий. Удельная продуктивность наилучшей линии при стабилизации в
суспензионных условиях составила 0.597 мкМЕ/клт/день (2,95 пг/клт/день) при предельной
концентрации FIX 2,46МЕ/мл в плотной культуре 1,2млн.клт/мл, что более чем в 6 раз
превзошло показатели поликлонального клеточного пула. При этом средняя копийнность
гетерологической вставки в геном для поликлональной популяции составила 19.96± 3.55 и
оказалась выше, чем у наилучшей моноклональной линии (13.69± 6.63 определено по гену dhfr
и нормировано по гену актина).
Выводы. Высокопродуктивные линии-продуценты фактора IX могут быть получены без
проведения стадий амплификации целевого гена, при использовании плазмидного вектора p1.1,
содержащего фрагменты гена фактора элонгации трансляции 1-α китайского хомячка.
ИНТЕНСИФИКАЦИЯ СИНТЕЗА ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
ACINETOBACTER CALCOACETICUS ИМВ В-7241 В ПРИСУТСТВИИ ЦИТРАТА
И ФУМАРАТА
Конон А.Д., Антонюк С.И., Парфенюк С.А., Пирог Т.П.
Национальный университет пищевых технологий
Stasse4ka@rambler.ru
Поверхностно-активные вещества (ПАВ) широко используются в различных отраслях
промышленности, в связи с чем спрос на синтетические ПАВ постоянно растет. Вместе с тем
темпы развития биотехнологии на современном этапе и повышение внимания к сохранению
окружающей среды обусловили большой интерес исследователей к микробным ПАВ как
альтернативе химическим аналогам.
Ранее было показано, что Acinetobacter calcoaceticus ИМВ В-7241, выделенный нами из
загрязненных нефтью образцов почвы, образует низкомолекулярные поверхностно-активные
вещества при росте на гидрофобных и гидрофильных субстратах. Внесение в конце
экспоненциальной фазы роста штамма ИМВ В-7241 на среде с этанолом (2%) 0,01% цитрата
(регулятор синтеза липидов) и 0,01% фумарата (С4-дикарбоновая кислота, предшественник
глюконеогенеза) сопровождалось увеличением количества образуемых ПАВ, однако уже на
вторые сутки наблюдали снижение рН культуральной жидкости до 5,5–5,7, а к концу процесса
– до 4,5–5,0. Поскольку у большинства бактерий соли органических кислот транспортируются
в клетки вместе с протоном и оптимальным для этого является нейтральное значение рН, мы
предположили, что нейтрализация культуральной жидкости в процессе роста у A. calcoaceticus
ИМВ В-7241 (а также перед внесением органических кислот) будет сопровождаться
повышением синтеза ПАВ.
В связи с изложенным выше цель настоящей работы – исследовать влияние рН на синтез
ПАВ А. calcoaceticus ИМВ В-7241 на этаноле при наличии цитрата и фумарата.
В процессе культивирования рН культуральной жидкости поддерживали на нейтральном
уровне подщелачиванием 1 н КОН (NaOH).
Показано, что поддержание рН на нейтральном уровне сопровождалось повышением
концентрации синтезированных ПАВ и ПАВ-синтезирующей способности по сравнению с
показателями процесса без регуляции рН. Отметим, что максимальная интенсификация синтеза
ПАВ (концентрация ПАВ 6,0 г/л, ПАВ-синтезирующая способность 6,2 г ПАВ/г биомассы)
наблюдалась при использовании раствора КОН для поддержания рН на уровне 7,0.
Нейтрализация культуральной жидкости раствором едкого натра сопровождалась снижением
количества синтезированных ПАВ и ПАВ-синтезирующей способности на 10−12% по
сравнению с показателями, полученными при регуляции рН с помощью КОН.
Следует отметить, что при изучении влияния фумарата и цитрата на синтез ПАВ штаммом
ИМВ В-7241 органические кислоты вносили в среду с этанолом в виде натриевых солей.
259
Прикладная биотехнология
Вполне вероятно, что замена их на калиевые соли может сопровождаться увеличением синтеза
ПАВ. Выяснению этих вопросов будут посвящены наши дальнейшие исследования.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлена возможность
повышения синтеза ПАВ А. calcoaceticus ИМВ В-7241 на этаноле при поддержании рН на
нейтральном уровне с помощью КОН и внесении в конце экспоненциальной фазы роста
фумарата и цитрата в концентрации 0,01%.
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ
РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА ROSACEAE
Корня Т.М.1, Салмова М.А.2, Сорокин А.А.3, Соколов Ю.П.3, Семенова Л.Г.3
Шестибратов К.А.2
1
Южный биотехнологический центр в растениеводстве НААН Украины; 2Филиал
Учреждения Российской Академии наук Института биоорганической химии им. М.М.
Очинникова и Ю.А. Шемякина; 3Всероссийский институт растениеводства им. Н.И.
Вавилова
odonata@mail.ru
При разработке методов ДНК-паспортизации плодово-ягодных культур, равно как и в
проведении судебной экспертизы, значимым остается вопрос качества выделенной ДНК.
Существующие методики выделения ДНК способны удовлетворить различные
исследовательские задачи. Тем не менее, актуальным остается вопрос об унификации способов
выделения ДНК для растительных тканей различного происхождения среди представителей
семейства Rosaceae, у которых получение свободных примесей фенолов и полисахаридов
препаратов все еще затруднительно.
В качестве материала использовали растительные ткани земляники, малины и ежевики
различного происхождения: листья, почки, молодые стебли, древесина (с корой), растения in
vitro.
Метод выделения ДНК с использованием СТАВ был выбран в качестве основного. С целью
уменьшения примесей фенолов в растворе ДНК этап лизиса клеток проводили без инкубации
при 65°С. Также, применяли многократную промывку 70% спиртом растертой растительной
ткани и уже полученного осадка ДНК с его переосаждением. Выделение ДНК проводили также
с использованием TRIzol Reagent.
В результате было показано, что стандартный метод выделения ДНК с помощью СТАВбуфера, не является эффективным. Качество получаемой ДНК зависело от метода выделения,
типа ткани (листья/стебли/почки), её обводнённости (высушенные/свежие ткани), а также видои сортоспецифичности образцов. Особо проблемным оказалось выделение ДНК из
одревесневших тканей, в частности ежевики, где выход ДНК был наименьшим, а качество
полученного препарата низкое, из-за содержания в стеблях ежевики дубильных и красящих
веществ – пигментов и фенолов.
Оптимальным для получения более качественных препаратов ДНК из всех исследуемых
типов тканей, стал приём предварительной многократной (до 5 раз) промывки
гомогенизированной ткани 70% спиртом до состояния её обесцвечивания и получения белого
порошкообразного гомогенизата с последующим применением стандартного СТАВ-метода
выделения ДНК.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНАЛОГОВ ПРИРОДНЫХ
ИНГИБИТОРОВ ТРОМБИНА ПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗ КРОВОСОСУЩИХ
ОРГАНИЗМОВ
Костромина М.А., Есипов Р.С.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Российской академии наук
260
Прикладная биотехнология
kostromasha@mail.ru
Эволюционно сложившийся у кровососущих организмов (насекомых, червей,
млекопитающих) паразитический способ питания кровью хладнокровных и теплокровных
животных и человека требует активного вмешательства в гемостаз организма хозяина. Секреты
гематофагов содержат сложную комбинацию из высокоспецифических биологически активных
веществ, действие которых направлено на подавление возможных физиологических ответных
реакций. Среди них обнаружено большое количество антитромботических пептидов с
различной структурной организацией и механизмом ингибирования тромбина. Учитывая
широкое распространение заболеваний, связанных с нарушением свертываемости крови,
исследование этих природных антикоагулянтов имеет значительное прикладное значение.
Целью данной работы было создание рекомбинантных аналогов ингибиторов тромбина
прямого действия: гаемадина из почвенной пиявки Haemadipsa sylvestris, анофелина из
молярийного комара Anopheles albimanus и вариегина из иксодового клеща Amblyomma
variegatum. Была разработана единая схема получения этих пептидов в составе интеинсодержащих гибридных белков, способных к автокаталитическому расщеплению с
освобождением целевого продукта. В качестве белка-носителя для анофелина и гаемадина был
использован мини-интеин DnaB из Synechocystis sp., а для вариегина – мини-интеин GyrA из
Mycobacterium xenopi. Расщепление гибридных белков SspDnaB-Ano и SspDnaB-Hae было рНзависимым, а расщепление белка Var-MxeGyrA происходило в присутствии тиольного
реагента. Разработанные методики включали этапы: выделение гибридных белков их
клеточной биомассы, стадию рН- или тиол-зависимого расщепления и последующую
хроматографическую очистку целевых пептидов.
Полученные пептиды являются высокоэффективными бивалентными конкурентными
ингибиторами тромбина прямого действия, что было подтверждено при исследовании их
антитромботической активности in vitro. Высокая селективность и ингибирующая способность
делает эти пептиды перспективными антикоагулянтными препаратами, наравне с уже широко
используемыми аналогами гирудина-1 из секрета слюнных желез медицинской пиявки Hurido
medicinalis (дипетарудином, рефлуданом и бивалирудином).
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКИ
МОДИФИЦИРОВАННЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК,
ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ЦИТОЗИНДЕАМИНАЗУ И TRAIL, IN VITRO
Красикова Л.С.1,2,3, Далина А.А.1, Каршиева С. Ш.1, Белявский А.В.1, Винокуров
М.Г.2,3
1
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарта РАН; 2Институт биофизики
клетки РАН; 3Пущинский государственый естественно-научный институт
wind-silfa11@mail.ru
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) благодаря своей способности мигрировать к
опухоли являются удобным инструментом для доставки противоопухолевых агентов. Цель
исследования заключалась в оценке противоопухолевой активности МСК, несущих
конструкции, содержащие терапевтические гены, в отношении клеток рака легких человека
A549 и мыши LLC и клеток меланомы мыши B16. В качестве противоопухолевых агентов
использованы фермент цитозиндеаминаза и TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) мыши
и человека. Цитозиндеаминаза – фермент, превращающий нетоксичный субстрат 5фторцитозин (5-ФЦ) в пиримидиновый аналог 5-фторурацил (5-ФУ), обладающий
цитостатическим действием и вызывающим гибель раковых клеток. Молекула TRAIL,
связываясь на клеточной поверхности с рецепторами DR4 и DR5, активирует каскад реакций,
приводящий к избирательному апоптозу клеток ряда злокачественных опухолей, имеющих
повышенный уровень этих рецепторов.
Противоопухолевая активность генетически модифицированных МСК мыши оценивалась
в системе ко-культивирования с раковыми клетками трех линий: аденокарциномы легких
Льюис мыши LLC, меланомы мыши В16 и немелкоклеточного рака легкого человека А549.
261
Прикладная биотехнология
Предварительно в МСК мыши вводили конструкции, содержащие гены терапевтических
агентов, с помощью электропорации (электропоратор BioRad) соответствующими плазмидами
в стандартных кюветах с межэлектродным расстоянием 1 мм. Через 24 часа поверх МСК
высевали предварительно меченные Cell Tracker™ CM-DiI (Invitrogen) опухолевые клетки
(клетки окрашивали в течение 40 мин при 37○С, концентрация красителя 1,5 мкг/мл).
Противоопухолевый эффект анализировали спустя двое суток ко-культивирования. Для этого
клетки инкубировали с CaspACE™ FITC-VAD-FMK In Situ Marker (20 мин при комнатной
температуре, концентрация реагента 5 мкМ), после чего клетки снимали трипсином. Измеряли
интенсивность флуоресценции в FL1 (FITC-VAD-FMK) и FL3 (CM-DiI) каналах. Оценивали
долю апоптотических раковых клеток (CM-DiI+/FITC-VAD-FMK+) от общего числа раковых
клеток (CM-DiI+/FITC-VAD-FMK-).
Было показано, что МСК, экспрессирующие цитозиндеаминазу, TRAIL мыши и человека
обладают противоопухолевой активностью, которая, по крайней мере, в системе in vitro,
характеризуется существенной специфичностью по отношению к выбранным моделям
опухолей. В частности, МСК, экспрессирующие цитозиндеаминазу, были наиболее
эффективны против аденокарциномы легких Льюис LLC, а МСК, экспрессирующие TRAIL
мыши – против меланомы мыши В16. Исследования продолжаются.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА ЭТАПЕ ВВЕДЕНИЯ В
КУЛЬТУРУ IN VITRO ТЕХНИЧЕСКИХ СОРТОВ ВИНОГРАДА КРИСТАЛЛ И
МАРШАЛЛ ФОШ
Красинская Т.А.
РУП «Институт плодоводства», пос. Самохваловичи (Беларусь)
krasinskaya@tut.by
В связи с переходом промышленного плодоводства на сертифицированную основу
посадочного материала, важными являются вопросы производства большого количества
оздоровленных растений винограда за короткие сроки. Процессы морфогенеза винограда в
культуре in vitro характеризуются высокой видовой специфичностью, поэтому разработанная
для одного сорта методика не всегда может быть эффективной для другого.
Цель исследования – получить стерильную культуру жизнеспособных эксплантов
технических сортов винограда (Vitis L.) Кристалл и Маршалл Фош.
Задачи исследований:
- подобрать оптимальный тип экспланта растений винограда для введения в культуру in
vitro;
- подобрать оптимальный гормональный состав питательных сред для каждого из сортов.
Отбор материала и введение в стерильную культуру проводили в конце июня, в фазу
активного роста растений. В качестве эксплантов использовали молодые пасынки и узловые
сегменты, содержащие 2-3 пазушные почки, средней зоны активнорастущих побегов.
Стерилизацию проводили по схеме: обработка 0,2% бенлатом (30 мин); обработка 70%-ным
этанолом (1 мин); промывка стерильной водой; обработка 30% H2O2 (5 мин); промывка
стерильной водой (3 раза). Для введения в культуру in vitro использовали две среды:
модифицированную среду Мурасиге-Скуга (MS) и среду С2D, описанную Chee et al. (1984),
содержащие 6-бензиладенин (6-БА) в концентрации 1,1 мг/л и 0,09 мг/л α-нафтилуксусной
кислоты. Условия культивирования: освещение 2,5-3 тыс. люкс, температура – +21-23ºС,
фотопериод 16/8 часов Анализ эффективности питательных сред на этапе введения в культуру
in vitro проводили после четырех недель культивирования эксплантов.
Изучаемые показатели: доля жизнеспособных эксплантов (%), способных к дальнейшему
размножению в стерильных условиях, доля некротизированных эксплантов (%), доля
эксплантов, из которых развивался каллус (%).
В результате исследований отмечено, что в период активного роста растений винограда
сортов Кристалл и Маршалл Фош в качестве эксплантов лучше использовать узловые
сегменты, из которых развивается 86,7% жизнеспособных растений, пригодных к дальнейшему
культивированию. Из пасынков развивалось 66,7% растений, потери которых заключались в их
262
Прикладная биотехнология
некротизации (33,3%). Вероятно стерилизующий агент – 30% H2O2 экспозицией 5 мин оказался
фитотоксичным для активнорастущих зеленых пасынков, вызвав некроз эксплантов. На среде
MS доля жизнеспособных эксплантов составила 88,8%, что выше по сравнению со средой С2D
(64,6%).
ИССЛЕДОВАНИЕ АНГИОГЕННЫХ СВОЙСТВ ПЕПТИДА AcSDKP IN VITRO
Куревлев С.В., Руденко Н.В., Удовиченко И.П.
Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН, Пущино (Россия); Пущинский государственный естественнонаучный институт, Пущино (Россия)
kurevlevserg@mail.ru
Ключевые слова: пептид AcSDKP, ангиогенез in vitro, клетки AE.hy926
Ишемические болезни, вызываемые нарушениями кровоснабжения в тканях, являются
причиной инфаркта миокарда, инсульта и отека конечностей. Подход, разрабатываемый нами,
основан на исследовании способов управления ангиогенезом с помощью ангиостимуляторов
пептидной и белковой природы и направлен на создание лекарственных препаратов, способных
стимулировать рост новых сосудов, таким образом, восстанавливая кровообращение и
ликвидируя болезнь.
Целью проекта является разработка основ стимулирования ангиогенеза с использованием
пептида AcSDKP.
Гематопоэтический пептид AcSDKP является продуктом протеолиза тимозина β4 (Tβ4)
пролиламинопептидазой и тормозит пролиферацию гематопоэтических стволовых клеток,
участвуя в гомеостазе роста различных типов клеток. Он секретируется костным мозгом,
находясь в плазме и циркулирующих мононуклеарных клетках.
Анигиогенезные свойства пептида AcSDKP исследовались in vitro в культуре клеток
гибридомной линии эпдотелиальных клеток EA.hy926, полученных из венозных
эндотелиальных клеток пуповины человека (HUVEC) и клеток легочной карциномы человека
(A549). Эксперименты по исследованию пептида AcSDKP in vitro включали анализ его
способности образовывать мультиклеточные трубкоподобные структуры, которые формируют
микроваскулярную сеть.
Разработана эффективная система моделирования ангиогенеза in vitro.
Показано, что пептид AcSDKP стимулирует образование аналога капилярной сети in vitro в
культуре клеток AE.hy926, что свидетельствует о его потенциале как ангиостимулятора.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки
Российской Федерации в рамках Федеральных целевых программ «Исследования и разработки
по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на
2007—2013 годы» (ГК № 16.512.11.2066) и «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» (ГК № 14.740.11.0170).
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ФУКОИДАНА ИЗ ЭКСТРАКТА
БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
Куштанов М.К., Леконцева Н.В., Мачулин А.В.
Институт белка РАН
maksim-kushtanov@rambler.ru
В настоящее время биотехнология является одной из ведущих отраслей науки и
промышленности в большинстве развитых стран мира. Это связано с тем, что человечество
нуждается в новых источниках сырья. Использование морских ресурсов, активно
развивающееся в последние десятилетия, может помочь в решении данного вопроса. Среди
всего многообразия веществ, выделяемых из морских обитателей, отдельный интерес
представляют сульфатированные полисахариды бурых водорослей – фукоиданы. Фукоиданы
обладают гепариноподобным, противовирусным и противоопухолевым действием. Наличие
263
Прикладная биотехнология
обильных источников восполнимых ресурсов бурых водорослей, не пригодных в пищу, делают
идею
использования
фукоидана
в
фармацевтической
и
парафармацевтической
промышленности перспективной.
Основной целью нашего исследования является разработка технологии получения
фукоидана на базе опытного биотехнологического производства Института белка РАН.
В качестве объекта нашего исследования нами выбраны два представителя бурых
водорослей– Fucus vesiculosus и Ascophyllum nodosum. Этот выбор был сделан по причине того,
что данные виды обитают на Белом море и расходы на их доставку значительно ниже, чем для
представителей дальневосточных видов бурых водорослей.
Нами был отработан лабораторный технологический регламент по получению фукоидана
из бурых водорослей. Зная примерный состав экстракта из бурых водорослей, мы удалили
наиболее значительные фракции примесных полисахаридов. Эта работа состояла из следующих
этапов: гомогенизация до молекулярного уровня в соляной кислоте (для осаждения альгиновой
кислоты и освобождения молекулярного фукоидана от клеточных структур), ультрафильтрация
супернатанта гомогената (для удаления компонентов с молекулярной массой менее 50кДа),
воздействие озоном (для избавления от фенолов и растительных пигментов).
В результате наших исследований мы получили экстракты с большим содержанием
фукоидана, усовершенствовав способ его выделения, что в дальнейшем позволит разработать
технологию малотоннажного производства фукоидана для использования в фармакологической
и парафармакологической индустрии.
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Лактионов Ю.В., Кожемяков А.П.
ГНУ ВНИИ Сельскохозяйственной микробиологии
Laktionov@pop3.ru
Современное высокоэффективное сельскохозяйственное производство невозможно без
применения удобрений и средств защиты растений. Процесс получения и применения
минеральных азотных удобрений является довольно энергоемким - на него расходуется от 30
до 50% всей энергии, потребляемой в сельскохозяйственном производстве. Альтернативным,
дешевым и безопасным источником азота для сельскохозяйственного производства является
биологический азот. Биологический азот образуется в результате фиксации микроорганизмами
этого элемента из атмосферы за счет работы нитрогеназы.
Для обеспечения эффективного использования природного потенциала микробнорастительного взаимодействия необходимо воспроизводить условия, в которых такое
взаимодействие становится необходимым и возможным. Важнейшим является наличие в почве
«в нужном месте и в нужное время» достаточного количества конкурентоспособных
эффективных штаммов по сравнению с местной микрофлорой бактерий.
Однако, основные проблемы, сдерживающие широкое использование микробных
биопрепаратов в нашей стране, связаны с отсутствием удобных для применения,
технологичных в производстве и недорогих форм биопрепаратов на базе не образующих споры
ризосферных микроорганизмов, культивирование которых и длительное сохранение в живом
виде представляют серьезную технологическую проблему. Микробные препараты - это живые
клетки, которые могут быть адсорбированы на твёрдом носителе или содержаться в жидкости.
Такой препарат позволяет создать высокую концентрацию полезных микроорганизмов (в
грамме препарата должно содержаться не менее 1 млрд. клеток бактерий).
В течение длительного времени самым распространенным твердым носителем
ризобактерий в России являлся торф, но наряду с положительными качествами (длительное
сохранение жизнеспособных бактерий), у торфа есть и существенные недостатки. Это
вариабельность биохимических характеристик, необходимость дорогостоящей гаммастерилизации, большое количество предварительных технологических операций – сушка,
нейтрализация субстрата, его размол и др.
Жидкая форма предпочтительнее как по технологии производства, так и в применении.
Однако жидкие биопрепараты имеют очень короткий срок хранения (10 – 30 суток), что не
264
Прикладная биотехнология
позволяет широко использовать их в сельском хозяйстве. Для получения стабильной жидкой
формы с длительным периодом хранения (сохранение титра жизнеспособных микроорганизмов
в течение года на уровне не менее 1 млрд. клеток в 1 мл препарата) необходимо создание
защитных
композиций
органо-минеральных
соединений,
оптимизация
режимов
культивирования и хранения биопрепаратов, выбор наиболее устойчивых штаммов
микроорганизмов. В настоящее время разработаны методы, обеспечивающие стабилизацию
микроорганизмов и их сохранность в жидкой форме, что обеспечивается использованием
оптимизированных сред при культивировании, введением стабилизирующих компонентов,
выявлением и обеспечением правильных параметров при длительном хранении микробных
биопрепаратов.
ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ К СТРЕССФАКТОРАМ ПРИ ОБРАБОТКЕ СЕМЯН БИОПРЕПАРАТОМ «АЗОЛЕН»
Леонтьева Т.Н., Иванова А.О., Кузина Е.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии
Уфимского научного центра РАН, Уфимский государственный нефтяной технический
университет
tanjusha6@list.ru
Природные регуляторы роста и развития растений являются не только мощным средством
управления онтогенезом растений, но и оказывают влияние на их устойчивость к негативным
внешним факторам. Ранее установлено, что в составе микробиологического удобрения
«Азолен» (штамм бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4) присутствуют, в том числе, вещества
фитогормональной природы. Целью исследования было изучение эффективности
использования биопрепарата «Азолен» для повышения устойчивости растений озимой
пшеницы к таким абиотическим стресс-факторам, как засоление и засуха.
В качестве объекта исследований были взяты семена озимой пшеницы Безенчукская 380.
В работе использовали двухсуточные проростки пшеницы, полученные из семян,
обработанных биопрепаратом «Азолен» (опытный вариант) и дистиллированной водой
(контроль). С целью моделирования условий засоления проростки помещали на 4-6 часов в
среду, содержащую 1,0% NaCl; в опыте с дефицитом влаги – в среду, содержащую 10,0%
полиэтиленгликоля (производитель: «Loba-Chemien-Fischamend», Австрия, молекулярная масса
5000-7000). По истечении указанного времени проростки переносили на среду, содержащую
1,0% сахарозы, и продолжали наблюдение за развитием растений.
В ходе проведенных исследований установлено, что биопрепарат «Азолен» оказывает
ростстимулирующее воздействие на развитие проростков и корней растений озимой пшеницы.
Обработка семян биопрепаратом привела к увеличению длины главного корня на 18,4%,
колеоптиля - на 18,8% по сравнению с контролем.
Установлено, что засоление среды в указанной концентрации приводит к торможению
развития проростков необработанных растений, которое сохранялось также после устранения
воздействия стресса. При этом помещение в среду, содержащую 1,0% хлорида натрия,
растений, инокулированных культурой азотобактера, не оказало заметного влияния на скорость
развития проростков.
При имитации дефицита влаги в среде установлено, что данный стресс-фактор оказывает
негативное воздействие, как на контрольные, так и на инокулированные растения. Но
обработанные биопрепаратом «Азолен» растения пшеницы значительно быстрее
восстанавливались после перенесенного стресса, тогда как в контрольном варианте через 48
часов после начала опыта рост главного корня был еще заторможен.
Таким образом, выявлено, что биопрепарат «Азолен» повышает устойчивость озимой
пшеницы к абиотическим стрессам, что в свою очередь способствует высокой продуктивности
растений в неблагоприятных условиях внешней среды.
265
Прикладная биотехнология
ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА СВЕРХПРОДУЦЕНТА ДЛЯ БИОТРАНСФОРМАЦИИ
КЕРАТИНСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ
Линник А.И.
ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»
blackann@list.ru
В Российской Федерации с ростом уровня доходов населения возрастает потребление мяса,
а мясоперерабатывающая промышленность дает огромное количество органических отходов.
Отходы, полученные после переработки птицы составляют 45% от массы птицы. Среди всех
отходов потрошения птицы наибольший интерес представляет перопуховое сырье, в котором
содержится около 65% кормового белка, поэтому решение проблемы перевода кератина пера в
усвояемую форму имеет первоочередное значение, как с позиции мобилизации резервов
животного белка, так и с точки зрения охраны окружающей среды
Существующие как отечественные, так и зарубежные технологии переработки отходов
птицеперерабатывающей промышленности позволяют получать из таких отходов кормовую
муку. Однако такая мука характеризуется низким содержанием усвояемого белка
(перевариваемость белка от 25 до 40%), при этом 60-75% белка теряется из сферы кормового
производства из-за жесткого температурного многочасового процесса обработки.Лишь
незначительная доля отходов перерабатывается, остальная масса пера не перерабатывается,
сжигается либо захоронятся, тем самым наносит вред окружающей среде.
В связи с этим необходимо разрабатывать новые способы переработки отходов животного
происхождения. Данная задача с успехом может быть решена за счет использования
высокоэффективных штаммов сверхпродуцентов кератиназы.
Инновационная технология отличается получением наиболее высокой биоусвояемого
продукта с его низкой стоимостью и высокой длительностью хранения.
Также инновационная технология имеет ряд преимуществ таких как: энергоемкая
технология; незначительная продолжительность процесса; не происходит потери аминокислот,
в том числе незаменимых; кератин переходит в легкоусвояемую форму; себестоимость
комбикорма снижается на 18%; себестоимость мяса птицы снижается на 5.6%.
На данный момент проведен анализ зарубежной и отечественной литературы, патентный
поиск. Проведен анализ отходов птицеперерабатывающей промышленности. Проведена
оптимизация параметров культивирования стандартных микроорганизмов и природного
штамма обладающих кератиназной активность по рН, составу среды и температурным
режимам, что позволило определить и выбрать наиболее активный штамма, для получения
высокоэффективного штамма сверхпродуцента кератинзы.
Полученный природный штамм обладает наибольшей активностью среди не
модифицированных аналогов. Не является патогенным или условнопатогенным как
большенство штаммов обладающих кератиназной активностью. В связи с этим был выбран для
использования в дальнейшей работе. В рамках дальнейшей работы предполагается усилить
экспрессию гена ker выбранного штамма благодаря регулируемому сильному промотору, так
же внести изменения в конструкцию плазмиды, которые позволят регулировать экспрессию, во
избежание самопроизвольной экспрессии.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ЦЕЛЕВЫХ ГЕНОВ И
ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАНСФОРМАЦИИ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
РЕПОРТЕРНОГО ГЕНА β-ГЛЮКУРОНИДАЗЫ
Локтюшов Е.В.1, Захарченко Н.С.2, Рукавцова Е.Б.2, Бурьянов Я.И.2
1
ПущГЕНИ; 2ФИБХ РАН, Пущино (Россия)
loktushov@rambler.ru
Генетическая трансформация растений является перспективным методом защиты растений
от фитопатогенов. Для этого в качестве целевых генов возможно использование генов
антимикробных пептидов. Уровень экспрессии перенесенных генов является важным
показателем повышения устойчивости растений к болезням. Для генетической информации
266
Прикладная биотехнология
растений применяли метод вакуумной агроинфильтрации. В качестве эксплантов использовали
семена табака (Nicotiana tabacum L.). Стерильные семена помещали в культуру агробактерий
A.tumefaciens CBE(pTiBo542), содержащих бинарный вектор pBI121 с репортерным геном βглюкуронидазы (gus) и целевым геном антимикробного пептида бомбинина и проводили
инфильтрацию при вакууме -0.8 атм. После этого семена перекладывали в чашки Петри с
селективной средой МС, содержащей 50 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима.
Эффективность трансформации определялась как отношение количества трансформированных
побегов к общему числу регенерантов. Побеги длиной 2-3 см переносила в широкие
стеклянные пробирки со средой МС, с уменьшенной в два раза концентрацией антибиотиков
(25 мг/л канамицина, 250 мг/л цефотаксима), подращивали и использовали для анализа. Анализ
экспрессии гена gus проводили флуориметрическим и гистохимическим методами. В качестве
контроля были использованы не трансформированные побеги растений. Гистохимический
анализ трансформированных растительных тканей с помощью субстрата 5-бром-4-хлор-3индолилглюкуронид (X-GLUC) позволил выявить зоны тканей, экспрессирующих ген gus.
Проведенный ПЦР анализ ДНК подтвердил трансгенную природу полученных растений.
Эффективность трансформации растений этим методом составила 20%. В полученных
трансгенных растениях флуориметрическим методом определен уровень экспрессии
репортерного
гена
gus
с
использованием
флуоресцирующего
субстрата
4метилумбеллиферона.
Работа поддержана грантами РФФИ № 11-04-00037, № 11-08-00413, № 12-08-00131, № 1204-01202 и №12-08-90015 Бел_а.
ВЛИЯНИЕ БИОПРЕПАРАТА НА РОСТ РАСТЕНИЙ ОГУРЦА
Лукаткин А.А., Астахова И.Ю., Ревин В.В.
Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева
ussr1960@yandex.ru
К настоящему времени достигнуты значительные успехи в области использования
бактерий рода Pseudomonas для стимуляции роста растений и в качестве средства
биологической борьбы с бактериальными и грибными заболеваниями сельскохозяйственных
культур. Это направление, обогатившееся рядом новых подходов, активно развивается в
последние годы. Объективно процесс взаимодействия псевдомонад с растениями происходит за
счёт продуцирования бактериями своих метаболитов в ризосферу и условно разделяется на 2
типа: 1) прямое или непосредственное взаимодействие - стимуляция роста растений за счет
синтеза различных метаболитов, полезных для растений (витамины и коферменты, органические кислоты и аминокислоты, полисахариды и поверхностно-активные вещества, антибиотики
и многие другие биологически активные соединения); 2) опосредованное взаимодействие - за
счет вытеснения и подавления развития почвенных фитопатогенов или микроорга-низмов,
угнетающих рост растений.
При разработке технологии биопрепаратов важно подобрать питательные среды,
обеспечивающие не только максимальный выход биомассы, но и способствующие снижению
себестоимости готового продукта. Перспективным является использование промышленных
отходов. Одним из таких отходов спиртового производства является послеспиртовая барда,
содержащая белки, минеральные соли, остатки полисахаридов. Использование барды как основы питательной среды при выращивании P. aureofaciens позволит удешевить технологию
получения биопрепарата для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.
Для получения препарата жидкую фракцию послеспиртовой барды доводили водным
раствором аммиака до рН 7.0, и стерилизовали. В полученную среду вносили инокулят P.
aureofaciens в количестве 10%. Культивирование проводили в течение 23 ч. при t=28ºС.
Полученным биопрепаратом в концентрациях (1:200, 1:500, без разведения) и водой (контроль)
обрабатывали растения, и следили за развитием растений огурца.
Было показано положительное влияние обработки растений биопрепаратом. Так площадь
листовой пластины растений огурца обработанной препаратом в разведении 1:500, на 40-е
сутки роста превышал на 18% контрольный вариант. Сходный результат был получен и при
267
Прикладная биотехнология
использовании биопрепарата в концентрации 1:200. Использование концентрированного
биопрепарата, не способствовал увеличению площади листовой пластины.
Сходные результаты были получены при исследование влияния обработки растений
биопрепаратом на развитие корневой системы. Так использование биопрепарата в разведении
1:200 способствует увеличению длины корня на 28% по сравнению с контролем.
Полученные результаты показывают возможность использования биопрепарата на основе
жидкой фракции послеспиртовой барды для стимуляции развития растений огурца.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КОМПОНЕТНОВ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ
ЖИДКОСТИ BACILLUS SPP НА BIFIDUMBACTERIUM BIFIDUM
Маслихова А.А., Бубеев А.Т., Цыренов В.Ж.
Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, УланУдэ
nuynik@yandex.ru
В эксперименте исследовали влияние фильтрата культуральной жидкости Bacillus spp на
стимуляцию роста кисломолочных бактерий Bifidobacterium bifidum. Для изучения
использовали суточную культуру Bacillus spp. Выбор условия образования стимуляторов роста
молочнокислых бактерий, в частности Bifidobacterium bifidum, обусловлен проведенными ранее
экспериментами, которые показали положительное влияние на их развитие.
Для исследования стимулирующего действия внеклеточных метаболитов культуры Bacillus
spp вносили ее суточную культуральную жидкость с содержанием сухих веществ 1,2% в
обезжиренное молоко с культурой Bifidobacterium bifidum. Стимулирующие действие
культуральной жидкости наблюдали по методу Мак-Креди до образования характерного
сгустка обезжиренного молока. В пробирки с обезжиренным молоком вносили строго
измеренный объем из различных разведений культуры молочнокислых бактерий
Bifidobacterium bifidum. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался
или отсутствовал рост, рассчитывали наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл
исследуемого субстрата. В качестве контроля служила культура молочнокислых бактерий
Bifidobacterium bifidum без внесения культуральной жидкости. Культуру B. bifidum
инкубировали при температуре 37°С в течение 7 суток на обезжиренном молоке.
Показано, что внесение культуральной жидкости Bacillus spp с содержанием сухих веществ
1,2% стимулирует рост молочнокислых бактерий Bifidobacterium bifidum и составляет
11*1023КОЕ/мл с максимум пика на 3 часа и снижение концентрации лактозы с 35 до 15 мкг.
Резкое увеличение содержания клеток Bifidobacterium bifidum можно объяснить
стимулирующим действием внеклеточных компонентов культуры Bacillus spp.
ИММУНОЦИТОХИМИЯ МАЖОРНЫХ КОМПОНЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО
МАТРИКСА ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА РАЗНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Миленина О.А.1, Ермакова И.И.2, Воронкина И.В.2
1
СПБГТИ (ТУ), Кафедра молекулярной биотехнологии; 2Отдел клеточных культур
института цитологии РАН
ollimils@gmail.com
Серьезной медико-биологической проблемой, возникающей при заживлении глубоких ран,
является образование рубцов, нарушающих структуру и функции ткани. В литературе имеются
данные о безрубцовом заживлении ран на коже эмбриона. Одной из причин безрубцового
заживления может быть разный состав внеклеточного матрикса (ВКМ) тканей эмбриона и
взрослого организма. Мажорными компонентами ВКМ являются белки, гликозаминогликаны
(ГАГ) и протеогликаны (ПГ), а основными продуцентами ВКМ служат фибробласты.
Дермальные фибробласты играют важную роль в восстановлении кожи после повреждения,
268
Прикладная биотехнология
активно синтезируя компоненты ВКМ и ростовые факторы. Выявление различий в составе
ВКМ, синтезируемого фибробластами нормальной и рубцовой кожи взрослого организма и
кожи эмбриона, поможет понять механизмы безрубцового заживления ран.
Цель данной работы состояла в том, чтобы охарактеризовать фибробласты 3-х типов – из
нормальной кожи, из рубцовой ткани взрослого организма и из кожи эмбриона – с помощью
иммуноцитохимической окраски мажорных компонентов синтезируемого ими ВКМ.
Дермальные фибробласты различного происхождения культивировали в течение 14 суток на
покровных стеклах. Проводили окрашивание 3 мажорных белков, 2 ГАГ и 2 ПГ ВКМ в
интактном клеточном слое. Результаты окрашивания визуализировали с помощью
конфокальной микроскопии. Визуальная оценка снимков позволила выявить качественные
различия и сходства в окраске компонентов ВКМ. Так, белки ВКМ (коллаген I типа,
фибронектин, ламинин) образуют вытянутые упорядоченные структуры в соответствии со
свойством этих молекул агрегировать и формировать фибриллы. Гиалуроновая кислота и ПГ
(декорин и версикан) распределены в культуре фибробластов в виде пятен и точек и имеют
преимущественно околоклеточную локализацию. При количественном сравнении компонентов
ВКМ, синтезируемого фибробластами разных типов, можно отметить следующие особенности.
Коллагена I типа и фибронектина достоверно больше в ВКМ эмбриональных и рубцовых
фибробластов по сравнению с нормальными. Наибольшее содержание ламинина наблюдается в
ВКМ эмбриональных клеток. ГАГ (гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата) примерно в
2 раза больше в матриксе рубцовых фибробластов по сравнению с нормальными.
Интенсивность окраски ПГ достоверно не отличается для фибробластов трех типов. В целом,
результаты проведенных опытов свидетельствуют о том, что эмбриональные и рубцовые
фибробласты более синтетически активны, чем нормальные фибробласты.
Работа выполнена на базе Учреждения Российской академии наук Института цитологии
РАН, где в настоящее время разрабатываются технологии производства дермальных
эквивалентов на основе коллагена или фибрина с заключенными в него дермальными
фибробластами. Сравнительный анализ состава ВКМ фибробластов различного происхождения
необходим для уточнения состава создаваемых на их основе клеточных продуктов.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНА RECA ESCHERICHIA COLI ДЛЯ ИНДУКЦИИ
КРОССИНГОВЕРА МЕЖДУ ГОМОЛОГИЧНЫМИ И ГОМЕОЛОГИЧНЫМИ
ХРОМОСОМАМИ ТОМАТОВ
Милюкова Н.А., Комахина В.В., Шишкина А.А., Комахин Р.А.
ГНУ ВНИИСБ РАСХН; РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева
milyukovan@gmail.com
Основным процессом, приводящим к генетической изменчивости у потомства гибридов,
является мейотическая рекомбинация ДНК, а именно перераспределение отдельных хромосом
и кроссинговер. Кроссинговер необходим для правильной сегрегации гомологичных хромосом
и находится под контролем специфических генов, некоторые из которых гомологичны у разных
групп организмов. Изучение генетических основ механизма рекомбинации делает возможным
следующий этап исследований – разработку методов индукции мейотической рекомбинации.
Возможность индукции генетической рекомбинации показана на Arabidopsis thaliana и ряде
других модельных объектов. Ранее было доказано, что экспрессия гена recA в соматических
клетках растений табака повышала количество сестринских хроматидных обменов. Это
позволило нам предположить, что экспрессия recA в клетках растений также может изменить
число и распределение обменов между гомологичными хромосомами в профазе мейоза. В
настоящем исследовании ген рекомбиназы RecA E. coli был использован для индукции
мейотической рекомбинации, увеличения доли рекомбинантных и интрогресссивных
генотипов в потомстве гибридов. Для этого нами были созданы трансгенные растения
культурного томата, экспрессирующие recA, с использованием которых были получены
трансгенные гибриды томата F1-RecA, а также их нетрансгенные аналоги. Сравнительный
анализ частоты мейотической рекомбинации выявил, что у гибридов F1-RecA между
маркерными генами второй хромосомы rf в 1,2-1,5 раза выше и доля рекомбинантных
269
Прикладная биотехнология
генотипов в их потомстве в 1,5 раза больше, чем у нетрансгенных гибридов томата. На основе
полученных данных нами была выдвинута гипотеза, что трансгенные растения томата,
экспрессирующие генrecA E. coli, могут быть использованы для индукции мейотической
рекомбинации не только между гомологичными, но и между гомеологичными хромосомами
растений. Для ее проверки были получены межвидовые трансгенные F1 гибриды томатов
(S.lycopersicum х S. lycopersicum var. cerasiforme) и F1 (S. lycopersicumх S. cheesmaniae),
экспрессирующие ген recA, а также их нетрансгенные аналоги. Для сравнительного анализа
частоты мейотической рекомбинации у межвидовых трансгенных и нетрансгенных гибридов
томатов получены 25000 семян растений F2. В настоящее время проводится их выращивание и
анализ.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Президента Российской
Федерации МК-244.2011.4.
БИОАНОД ТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА НА ОСНОВЕ
ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS
Минайчева П.Р., Алферов С.В.
Тульский государственный университет
polina.minaycheva@gmail.com
Биотопливный элемент (БТЭ) – это устройство, в котором осуществляется превращение
химической энергии различных веществ (например, углеводов, спиртов) в электричество в
процессе биокаталитического окисления. Интерес к разработке альтернативных источников
энергии связан с грядущим глобальным истощением на Земле источником полезных
ископаемых, являющихся традиционными ресурсами для получения электроэнергии.
Одной из перспективных задач, направленных на увеличение долговременной работы и
энергетических характеристик БТЭ является иммобилизация биокатализатора на поверхности
анода. В качестве матриц для иммобилизации клеток бактерий или ферментов используются
поливиниловый спирт, агарозы, полиакриламид, альгинаты кальция и стронция, золь-гель
матрицы и матрицы из углеродных наночастиц. Иммобилизация биоматериала на поверхности
электрода является необходимым условием при разработке биоанодов многократного
применения, что позволит создать на их основе биотопливные элементы непрерывного
(проточного) типа.
Целью данной работы являлась иммобилизация бактерий Gluconobacter oxydans в
химически модифицированный поливиниловый спирт (ПВС) на активированных графитовых
электродах для их использования в макете биотопливного элемента.
Установлено, что иммобилизация бактерий Gluconobacter oxydans в химически
модифицированный ПВС на активированной поверхности графитового электрода позволяет
повысить величину генерируемого потенциала в 2 раза по сравнению с использованием
суспензии клеток Gluconobacter oxydans в анолите. Оценка мощностных характеристик
полученного макета биотопливного элемента показала, что пик мощности (50 нВт),
генерируемой БТЭ, наблюдается при приложенном внешнем сопротивлении 150 кОм.
Долговременной стабильность биоанода с иммобилизованными бактериямиGluconobacter
oxydans составила 7 суток, падение генерируемого потенциала на 8-ой день в среднем
составило 50% , что может быть обусловлено вымыванием клеток бактерий из пленки
химически модифицированного ПВС.
Таким образом, иммобилизация бактерий Gluconobacter oxydans в химически
модифицированный поливиниловый спирт позволяет получать биоаноды многократного
использования для биотопливных элементов проточного типа.
270
Прикладная биотехнология
НОВЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РОДА AGROMYCES, РАЗЛАГАЮЩИЙ
РАЗЛИЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ УГЛЕРОДА
Мухаматдьярова С.Р., Коршунова Т.Ю., Логинов О.Н.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии
Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия
Svetrm@gmail.com
В последнее время биологический метод очистки окружающей среды от углеводородных
соединений, основанный на применении микроорганизмов-деструкторов, становится
приоритетным при любых масштабах загрязнения. Поэтому поиск и изучение свойств новых
бактерий, способных к биодеградации нефти и нефтепродуктов представляет большой интерес.
Из техногенно загрязненной почвы был выделен бактериальный изолят. Анализ генов 16S
рРНК выявил, что его нуклеотидная последовательность имеет низкий уровень сходства
(97,44%) с таковой для филогенетически близкородственного типового штаммаAgromyces soli
MJ21(T). Новый микроорганизм получил рабочее название Agromyces ufaense.
Целью данной работы являлось описание бактерии по биохимическим и культуральноморфологическим признакам и выявление ее способности к разложению различных
органических соединений. Микроорганизмы культивировали на жидкой среде Раймонда без
пептона при аэрации, 28-30 0С в течение 6 суток. Источником углерода служили различные
соединения углерода, взятые в количестве 1% ( масс).
Agromyces ufaense являются грамположительными, аэробными, неподвижными, не
образующими эндоспор, воздушного мицелия и конидий бактериями. Растут в интервале
температур от +15 до +370С. Каталазоположительны, гидролизуют желатину, не гидролизуют
крахмал, казеин, не образуют липазы, лецитиназы. Не потребляют малонат, цитрат.
Используют в качестве источника углерода углеводы (глюкоза, L-арабиноза, лактоза, мальтоза,
L- рамноза, рафиноза, ксилоза и др.), некоторые спирты (маннит, сорбит). Устойчивы к
линкомицину, канамицину, тетрациклину. Чувствительны к ванкомицину, стрептомицину,
левомицитину, фузидину, бензилпенициллину, неомицину. Утилизируют широкий спектр
органических веществ: хлорпроизводные углеводородов (бутилхлористый, изоамилхлористый,
монохлоруксусная кислота), улеводороды алканового ряда (циклогексан, ундекан, додекан,
тридекан, тетрадекан), ароматические соединения (вторичный бутилбензол), спирты
(аллиловый, пентанол, диэтиленгликоль, триэтиленгликоль), органические кислоты
(изовалериановая, капроновая, изомасляная). В зависимости от используемого источника
углерода образуют колонии, отличающиеся размерами и окраской.
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ДРОТАВЕРИНА ГИДРОХЛОРИДА
Мухутдинова А.Н., Рычкова М.И., Ившина И.Б
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и
генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
AnnaMukhutdinova@ya.ru
В последнее время остро обозначилась экологическая проблема, связанная с присутствием
и аккумуляцией фармполлютантов в окружающей среде. Фармацевтические вещества и их
метаболиты обнаруживаются в поверхностных, подземных, сточных и даже питьевых водах.
Высокая стабильность фармполлютантов, необычность структуры и выраженная биологическая
активность могут стать причиной непредсказуемых экологических нарушений. Основу многих
лекарственных средств составляют азотсодержащие гетероциклические соединения. Среди
фармпрепаратов данной группы широкое применение в России находит дротаверина
гидрохлорид (C24Н31NO4, CAS: 985-12-6).
Среди микроорганизмов, участвующих в процессах самоочищения водных и почвенных
экосистем, особое место занимают актинобактерии рода Rhodococcus.
Цель настоящей работы – исследование способности родококков к биодеструкции
дротаверина гидрохлорида.
271
Прикладная биотехнология
В работе использовали штаммы родококков из Региональной профилированной коллекции
алканотрофных микроорганизмов (www.iegm.ru/iegmcol/strains). Определение минимальных
подавляющих концентраций (МПК) исследуемого вещества проводили методом серийных
разведений. Родококки выращивали в минеральной среде RS при 28°С. Посевная доза
составляла 6,0 х107клеток/мл, выращенных на мясопептонном агаре в течение 3-х сут.
Дротаверин использовали в виде фармацевтической субстанции (Ирбитский химикофармацевтический завод, Россия) в концентрации 0,002%. В отдельных экспериментах
дротаверин вносили дробно (1:9) через 2 сут, в качестве дополнительного ростового субстрата
использовали глюкозу (0,5%). Контролем служил стерильный раствор дротаверина в
минеральной среде RS без внесения родококков. Содержание дротаверина определяли методом
ВЭЖХ с использованием хроматографа «LC Prominence» («Shimadzu», Япония).
Выраженной устойчивостью по отношению к дротаверину характеризовались штаммы,
принадлежащие к R. erythropolis, R.rhodochrous, R. ruber (МПК≥200 мг/л). Продолжительность
процесса биодеградации при разовом внесении дротаверина клетками R.rhodochrous ИЭГМ 647
составляла 110 сут, при этом к концу эксперимента клетки утрачивали свою жизнеспособность.
Использование родококков в условиях дробного внесения дротаверина сокращало
продолжительность процесса до 90 сут. Наиболее интенсивная убыль дротаверина наблюдалась
в течение первых 30 сут. Использование глюкозы способствовало полному разложению
дротаверина в течение 53 сут. Полученные данные свидетельствуют об устойчивости молекулы
дротаверина, разложение которого даже в низких (0,002%) концентрациях протекало крайне
медленно (от 53 до 110 сут).
Работа поддержана грантом Программы фундаментальных исследований Президиума РАН
«Живая природа: современное состояние и проблемы развития» (№ 12-П-4-1044).
ШТАММ ДЕСТРУКТОР ТРИЭТИЛАМИНА BACILLUS SP. RT2
Самсонова А.С., Нагорный Р.К.
Институт микробиологии НАН, Минск (Беларусь)
roman19031988@mail.ru
Выделение микроорганизмов-деструкторов проводили методом накопительных культур с
использованием дерново-подзолистой почвы, искусственно загрязненной триэтиламина (ТЭА)
и активного ила очистных сооружений предприятий органического синтеза. Из 49 выделенных
в чистую культуру микроорганизмов-деструкторов отобран штамм, обильно растущий на
минеральной среде с добавлением ТЭА в качестве единственного источника углерода в
концентрации 1г/л. Анализ физиолого-биохимических свойств данного микроорганизма дает
основание отнести его к роду Bacillus.
Изучение деструктивной активности в стационарных условиях показало, что культура
способна активно утилизировать ТЭА в процессе своей жизнедеятельности, используя его в
качестве единственного источника углерода. Эффективность деструкции ТЭА максимальна при
нейтральных значениях рН. 100% утилизация токсиканта в концентрации 0,5, 1 и 3 г/л
культурой Bacillus sp. RT2происходит через 48, 72 и 240 часов соответственно.
Экспериментально установлено, что клетки штамма RT2 образуют на поверхности
носителя сплошную бактериальную пленку, проявляя высокие иммобилизационные свойства.
Максимальное количество биомассы на носителях достигалась через 48 часов
культивирования. При адгезии на полипропиленовом и капроновом волокне накопление
биомассы составило 49 и 38 мг сухого вещества на 1г носителя соответственно.
Высокие технологические характеристики штамма Bacillus sp. RT2 – деструктивная и
иммобилизационная активность, выявленные в стационарных условиях, дают основание
рекомендовать его к использованию в очистке производственного стока, загрязненного ТЭА.
272
Прикладная биотехнология
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАТРИКСОВ ДЛЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, ИЗГОТОВЛЕННЫХ ИЗ
ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ РАЗНОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА
Николаева Е.Д., Шишацкая Е.И.
Институт биофизики СО РАН; Институт фундаментальной биологии и биотехнологии,
Сибирский федеральный университет, Красноярск
nikolaeva-lena@mail.ru
В настоящее время для создания клеточных матриксов исследуются разные
высокомолекулярные материалы. Требования к таким материалам, помимо прочности и
легкости переработки, включает биодеградируемость и биосовместимость, способность
стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток. Среди подобных материалов особо
выделяют полигидроксиалканоаты (ПГА) – термопластичные, биодеградируемые и
биосовместимые полиэфиры бактериального происхождения. ПГА обладают рядом полезных
свойств, что делает возможным их применение в технологиях клеточной и тканевой инженерии
для регенерации поврежденных кожных покровов, закрытия дефектов мягких и костных
тканей, изготовления имплантатов кровеносных сосудов и клапанов сердца и др. В зависимости
от мономерного состава ПГА обладают разными физико-механическими свойствами.
Цель работы – конструирование и сравнительное исследование свойств матриксов из ПГА
различного химического состава для культивирование клеток.
Материалы и методы: использована серия образцов ПГА высокой степени очистки,
полученных в Институте биофизики СО РАН: гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты
(П3ГБ), сополимеры 3-гидроксибутирата с 3-гидроксивалератом (П3ГБ/3ГВ), 3гидроксигексаноатом(П3ГБ/3ГГ), с 4-гидроксибутиратом (П3ГБ/4ГБ). Состав и структуру
полимеров определяли газовой хроматографией, рентгеноструктурным анализом,
гельпроникающей хроматографией, термические свойства – методом ДСК. Матриксы в виде
пленок получены методом отлива из растворов ПГА с последующим испарением растворителя.
Микроструктуру матриксов определяли с применением РЭМ, АСМ, энергетические
характеристики поверхности рассчитывали на основе величин контактных краевых углов
смачивания. Адгезионные свойства матриксов и пролиферативный потенциал клеток
определяли на примере фибробластов линии NIH 3T3. Культивирование проводили в течение 7
дней. Для подсчета прикрепленных клеток к матриксам и анализа их морфологии проводили
окрашивание азур-эозином или DAPI. Пролиферацию клеток определяли с помощью МТТтеста.
Анализ микроструктуры матриксов, изготовленных из ПГА разного состава, показал, что
наиболее ровная поверхность у сополимеров П3ГБ/3ГВ, наиболее рельефная – у сополимеров
П3ГБ/3ГГ. Показано, что матриксы из сополимерных ПГА более гидрофильны и поэтому
предпочтительнее для культивирования клеток. Все представленные типы ПГА поддерживали
адгезию и пролиферацию клеток, при этом на всех матриксах фибробласты сохраняли
морфологию, типичную для активного состояния клеток на протяжении всего эксперимента.
Результаты работы показали, что все исследованные типы ПГА могут быть использованы для
конструирования опорных клеточных матриксов.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ по поддержке
молодых ученых-докторов наук (МД-3112.2012.4).
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА,
СИНТЕЗИРУЕМОГО ФИБРОБЛАСТАМИ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Носик А.Г., Воронкина И.В., Юдинцева Н.М.
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии
Российской академии наук
kyrnosik276@yandex.ru
273
Прикладная биотехнология
Изучение внеклеточного матрикса и его компонентов является в настоящее время одним из
наиболее важных направлений для биохимии и клеточной биологии. Заместительная тканевая
терапия развилась из изучения процессов, происходящих при регенерации тканей и органов.
Уже существуют заместители некоторых тканей, проходящие клинические испытания или уже
применяемые на практике. В Институте цитологии РАН созданы дермальные кожные
эквиваленты уже используемые в клинике, а так же разрабатываются технологии
культивирования клеток кожи человека на различных субстратах, в том числе и белках
внеклеточного матрикса. Различия в соотношении компонентов внеклеточного матрикса и их
организации приводят к получению разных вариантов тканевых заместителей.
Целью данной работы было изучение различий в составе внеклеточного матрикса,
синтезируемого фибробластами, выделенными из нормальной, рубцовой и эмбриональной
тканей. Для достижения поставленной цели были подобраны оптимальные условия для
выделения внеклеточного матрикса путем ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте
плотности полифазной системы перфторан – сахароза – питательная среда. Мы полагаем, что
такая система приближает нас к возможности воссоздать условия, подобные нативным. После
чего был выделен внеклеточный матрикс синтезируемый фибробластами нормальной,
эмбриональной, рубцовой кожи при культивировании клеток на пластике и на перфторане
(твердом и жидком субстрате) и проведен сравнительный анализ белков внеклеточного
матрикса.
При количественном сравнении компонентов внеклеточного матрикса, синтезируемого
фибробластами разных типов, можно отметить следующие особенности. Внеклеточный
матрикс рубцовой ткани содержит меньше различных белковых компонентов по сравнению с
матриксами нормальных и эмбриональных кожных фибробластов. Этот факт подтверждают
литературные данные о специализированных функциях фибробластов в месте повреждения и
их участие в восстановлении целостности кожных покровов путем синтеза значительного
количества фибриллярных белков, главным образом, коллагена I, и создании весьма
специфической рубцовой ткани. В процессе образования рубца происходит переключение
программы фибробластов на синтез только основных секретируемых белков и уменьшении их
разнообразия, что подтверждают наши данные.
Представленные в работе результаты позволяют весьма высоко оценить потенциал
разработанной методики выделения для сравнительного анализа белков внеклеточного
матрикса. Результаты дальнейшей работы предполагается использовать для разработки новых
вариантов клеточных продуктов, предназначенных для использования в клинической практике.
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА ЭТАПОЛАНА, СИНТЕЗИРОВАННОГО НА СМЕСИ СУБСТРАТОВ
Олефиренко Ю.Ю., Пирог Т.П.
Национальный университет пищевых технологий
yulia_olefirenko@ukr.net
Этаполан – комплексный микробный экзополисахарид (ЭПС) (продуцент – Acinetobacter
sp. ИМВ B-7005), реологические свойства которого определяются содержанием в нем
ацилированного компонента и жирных кислот.
Недостатком разработанных ранее технологий получения этаполана на смеси
энергетически дефицитных (ацетат и меласса) и энергетически неравноценных (фумарат и
меласса) субстратов является повышение рН (до 9,0–9,8) в процессе культивирования
продуцента. При таком рН синтезируется низкоацилированный этаполан, растворы которого не
обладают необходимыми для практического использования реологическими свойствами.
Цель работы – исследование влияния экзогенных жирных кислот на реологические
свойства этаполана, синтезированного на смеси ростовых субстратов.
Культивирование Acinetobacter sp. ИМВ B-7005 осуществляли на среде с ацетатом натрия
(1,1%) и мелассой (0,75%), а также с фумаратом натрия (0,18%) и мелассой (0,5%). В начале
процесса, в экспоненциальной и стационарной фазе роста продуцента в среду дополнительно
вносили предшественники биосинтеза (подсолнечное масло и олеиновую кислоту) в
274
Прикладная биотехнология
концентрации 0,1 – 0,5%. Реологические свойства 0,05% растворов этаполана оценивали по
изменению вязкости в присутствии 0,1 М КСl и в системе Сu2+-глицин, что является
характерным именно для данного ЭПС и определяет его практическое значение.
Показано, что независимо от момента внесения подсолнечного масла и олеиновой кислоты
в среду с ацетатом и мелассой наблюдали повышение вязкости 0,05% растворов этаполана в 1,1
– 2 раза в присутствии 0,1 М КCl и в системе Сu2+-глицин по сравнению с реологическими
свойствами полисахарида, полученного на среде без предшественников. Внесение 0,1 – 0,3%
подсолнечного масла в среду с фумаратом и мелассой в стационарной фазе роста продуцента
сопровождалось повышением в 1,1 – 1,9 раза вязкости 0,05% растворов этаполана в
присутствии KCl и в системе Cu2+-глицин по сравнению с реологическими свойствами
этаполана, синтезированного на среде без масла.
Независимо от количества и момента внесения олеиновой кислоты в среду с фумаратом и
мелассой наблюдали повышение вязкости 0,05% растворов этаполана в 1,4 – 3,9 раза в
присутствии 0,1 М КCl по сравнению с вязкостью после культивирования штамма на среде без
внесения жирной кислоты.
Полученные данные являются основой для усовершенствования технологий микробного
полисахарида этаполана на смеси ростовых субстратах.
СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ACINETOBACTER
CALCOACETICUS К-4 НА НЕУГЛЕВОДНЫХ СУБСТРАТАХ В ПРИСУТСТВИИ
Cu2+
Парфенюк С.А., Конон А.Д., Антонюк С.И., Шевчук Т.А., Пирог Т.П.
Национальный университет пищевых технологий
parfenyuks@meta.ua
В предыдущих исследованиях нами были установлены условия культивирования
Acinetobacter calcoaceticus К-4 на этаноле, обеспечивающие максимальные показатели синтеза
поверхностно-активных веществ (ПАВ), а также разработаны подходы по интенсификации их
биосинтеза. Из литературы известно, что микробные ПАВ способны образовывать комплексы с
токсичными металлами, благодаря чему защищают клетки продуцента от их действия.
Цель работы – исследовать влияние Cu2+ на синтез ПАВ A. calcoaceticus К-4 при
культивировании на гидрофильных (этанол) и гидрофобных (н-гексадекан, жидкие парафины)
субстратах.
Показано, что внесение 0,5 мМ Cu2+ в экспоненциальной фазе роста штамма К-4 на всех
исследованных субстратах сопровождалось увеличением концентрации ПАВ на 50–60% по
сравнению с показателем на среде без катионов меди. Максимальное повышение (на 140%)
количества синтезированных ПАВ было зафиксировано при внесении 0,1 мМ Cu2+ в
экспоненциальной фазе роста штамма К-4 на среде с жидкими парафинами. Пересев бактерий
A. calcoaceticus К-4, выращенных на всех субстратах в присутствии Cu2+, на среду без катионов
меди сопровождался существенным повышением показателя синтеза ПАВ (максимально в 2,1–
3,5 раза) по сравнению с использованием аналогичного инокулята, полученного на среде без
Cu2+.
Известно, что в ответ на неблагоприятные факторы внешней среды у многих
микроорганизмов наблюдается увеличение синтеза протекторных соединений. Вполне
вероятно, что повышение синтеза ПАВ у штамма К-4 в присутствии Cu2+ обусловлено
функционированием подобного адаптационного механизма.
Другим механизмом, обусловливающим повышение синтеза ПАВ штаммом К-4 в
присутствии Cu2+, является активация катионами меди алкангидроксилазы АлкБ типа – первого
фермента катаболизма гидрофобных субстратов. Эксперименты показали, что в присутствии
0,01 и 0,05 мМ Cu2+ алкангидроксилазная активность штамма К-4 повышалась в 3 раза.
Поскольку увеличение синтеза ПАВ наблюдалось и при внесении Cu2+ в
этанолсодержащую среду, мы предположили, что катионы меди могут также являться
активаторами ключевых ферментов С2-метаболизма и биосинтеза ПАВ. Показано, что в
присутствии Cu2+ в реакционной смеси наблюдается увеличение активности как 4-нитрозо-N,N-
275
Прикладная биотехнология
диметиланилин(НДМА)-зависимой алкогольдегидрогеназы, так и ферментов биосинтеза
поверхностно-активных глико- (фосфоенолпируват(ФЕП)-синтетаза) и аминолипидов (НАДФ+зависимая глутаматдегидрогеназа).
Полученные результаты могут быть основой для усовершенствования биотехнологий
микробных ПАВ.
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ МЕТОБОЛИТОВ
ACINETOBACTER CALCOACETICUS ИMB B-7241, RHODOCOCCUS
ERYTHROPOLIS ИMB Ac-5017, NOCARDIA VACCINII K-8 ПО ОТНОШЕНИЮ К
ФИТОПАТОГЕННЫМ БАКТЕРИЯМ
Покора К.А., Чеботарева К.В., Конон А.Д., Софилканич А.П., Пирог Т.П.
Национальный университет пищевых технологий, Киев (Украина)
khrystya91@ukr.net
Актуальной на сегодняшний день является борьба с бактериозами сельскохозяйственных
культур, следствием которых являются значительные потери урожая в Украине. Поскольку
применение антибиотиков в сельском хозяйстве ограничено из-за приобретения
микроорганизмами резистентности, необходимым является поиск альтернативных способов
борьбы с фитопатогенными бактериями. Микробные поверхностно-активные вещества (ПАВ)
могут быть перспективными антимикробными агентами, так как обладают широким спектром
биологического действия (антибактериальное, противовирусное, антиадгезивное).
Целью данной работы было исследование влияния на некоторые фитопатогенные бактерии
препаратов внеклеточных метаболитов Acinetobacter calcoaceticus ИMB B-7241, Rhodococcus
erythropolis ИMB Ac-5017 и Nocardia vaccinii K-8. Штаммы-продуценты выделенные из
загрязненных нефтью образцов почвы. В предыдущих исследованиях установлена их
способность к синтезу ПАВ на гидрофобных и гидрофильных субстратах.
Как тест-культуры использовали Pseudomonas syringae 8511, Pseudomonas corrugate 9070,
Pseudomonas savantanoi pv. glicinea 8571, Pseudomonas syringae pv. coronafaciens 9129,
Pseudomonas syringae pv. atroglaciens, Xantomonas translucens 7696, Xantomonas vesicatoria 7790,
Pectobacterium carotovorum 8982, которые были любезно представлены сотрудниками отдела
фитопатогенных бактерий Института микробиологии и вирусологии НАН Украины.
В исследованиях использовали такие препараты: препарат 1 – супернатант культуральной
жидкости; препарат 2 – раствор ПАВ, выделенный из препарата 1 экстракцией смесью Фолча
(метанол : хлороформ, 2 : 1); препарат 3 – водная фаза после экстракции ПАВ смесью Фолча.
Установлено, что при внесении в суспензию всех исследуемых культур препарата 2
(концентрация ПАВ А. сalcoaceticus ИMB B-7241 – 0,15 мг/мл, R. erythropolis ИMB Ac-5017 –
0,4 мг/мл, N. vaccinii K-8 – 0,85 мг/мл) выживание клеток составляло не более 10%. Под
дейстивием препарата 1 штаммов ИMB Ac-5017 и ИMB B-7241 наблюдали стимуляцию роста
бактерий, что может быть обусловлено наличием других, отличных от ПАВ биологическиактивных веществ. Отметим, что препарат 3 штамма К-8 оказался наиболее эффективным: в его
присутствие количество клеток снижалось на 97–100%. Мы предполагаем, что после
экстракции ПАВ в водной фазе остаются другие антимикробные вещества не обладающие
поверхностно-активными свойствами.
Таким образом, препараты внеклеточных метаболитов ИMB B-7241, ИMB Ac-5017, K-8
могут быть использованы для получения экологически-безопасных антимикробных средств для
борьбы с фитопатогенными бактериями.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВЫХ МИНИАНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫВЛЕНИЯ
БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLIM В ПРИРОДНЫХ СРЕДАХ
Попова И.А., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю.
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и
микроорганизмов РАН, Саратов
276
Прикладная биотехнология
iridecol@mail.ru
В последние годы в иммунохимии активно используются фаговые миниантитела,
представляющие собой частицы, несущие на поверхности высоковариабельные белки. Они
обладают некоторыми преимуществами перед обычными Ат: отсутствие использования
лабораторных животных, простота в получении, низкая себестоимость, возможность получения
миниАт за короткое время.
Целью работы являлось получение специфических миниАт к поверхностным
бактериальным антигенам четырёх модельных штаммов азоспирилл и использование
полученных миниАт для выявления данных микроорганизмов на корнях растений.
В работе были использованы следующие штаммы бактерий -Azospirillum brasilense Sp245,
Sp7, SK 048 и Azospirillum irakense KBC-1, а так же штамм Escherichia coli XL-1 Blue для
продукции мини Ат.
Для селекции специфических миниантител был использован фаговый дисплей, состоящий
из вирусных частиц бактериофага М13, несущих помимо рецепторных белков (pIII) несколько
копий специфических высоковариабельных антигенсвязывающих белков. Было проведено по 3
раунда селекции бактериофагов М13, к клеткам A. brasilense Sp245, Sp7, SK048 и A. irakense
KBC-1.
Полученные миниАт были проверены на способность выявлять клетки азоспирилл в
иммуноферментном анализе и в дальнейшем использованы для выявления исследуемых
штаммов на поверхности корней растений с помощью флюоресцеин-меченных Ат.
ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА СЛАДКОГО БЕЛКА ТАУМАТИНА II ИЗ
THAUMATOCOCCUS DANIELLII В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА
Пушин А.С., Фирсов А.П., Долгов С.В.
Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки института
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Российской академии наук
aspushin@rambler.ru
Сладкий белок тауматин II впервые выделен из плодов западноафриканского растения
Thaumatococcus daniellii Benth. Тауматин синтезируется в виде предшественника
(препротауматина), который содержит N-концевой гидрофобный сигнальный пептид,
состоящий из 22 а.к. остатков и С-концевой пептид, состоящий из 6 а.к. остатков. Целью наших
исследований было изучить влияние удаления N- и С-сигнальных последовательностей
препротауматина на характер экспрессии тауматина в трансгенных растениях табака. Для этого
были синтезированы несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующие разные
формы тауматина: форму с удаленным С-концевым сигнальным пептидом; форму с
удаленными N- и С-сигнальными пептидами; форму с удаленным N-концевым сигнальным
пептидом. В качестве контроля использовали ген, кодирующий препротауматин - форму,
содержащую оба сигнальных пептида. Все нуклеотидные последовательности клонировали в
бинарный вектор рВI121 вместо гена uidA. Полученные векторы переносили в
агробактериальный штамм СВЕ21 для трансформации растений табака. Отобранные
трансгенные линии табака использовали для анализа. Анализ экспрессии гена тауматина при
помощи иммуноблотинга с применением поликлональных антител, специфичных к тауматину,
показал следующие результаты. При наличии N- и С-сигнальных последовательностей
тауматин накапливался внутриклеточно (предположительно в вакуолях) и соответствовал по
подвижности зрелому белку, что свидетельствует о прохождении процессинга. Удаление Сконцевого гексапептида, привело к секреции тауматина в межклеточное пространство, при
этом процессинг проходил корректно. Уровень накопления тауматина в листьях трансгенного
табака определяли по ELISA. В растениях, содержащих форму тауматина с N- и C- сигналами,
количество тауматина доходило до 0,57% от общего растворимого белка. В растениях, у
которых тауматин был с удаленным С-концевым сигналом, количество доходило до 0,43%.
Органолептический анализ показал, что синтезированный тауматин обладал сладким вкусом.
Это свидетельствует о сохранении нативной конформации тауматина при накоплении как
277
Прикладная биотехнология
внутриклеточно, так и в апопласте. Удаление обоих сигнальных пептидов или толькоNконцевого существенно снижало уровень накопления тауматина в табаке. В этих растения
тауматин практически не определялся (менее 0,0001% от общего растворимого белка).
ПРИМЕНЕНИЕ ЭМИСТИМА С ПРИ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА
IN VITRO К НЕСТЕРИЛЬНЫМ УСЛОВИЯМ
Ребров А.Н.
ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко
rebrov_anton@mail.ru
Механизм активации иммунитета у растений при помощи Эмистима С (Эм) в настоящее
время изучен достаточно полно, показано его положительное действие на многих культурах.
Однако недостаточно изучено его применение на многолетних культурах. Известно, что его
эффективность зависит от времени обработки (фазы развития растений), концентрации
препарата, продолжительности периода иммунизации и вероятности ослабления растений
после его окончания. При этом различные сорта одного и того же вида растений часто поразному реагируют на обработку Эм.
В связи с вышесказанным изучали совместное применение различных концентраций Эм
(10-8;10-10 и 10-12) с препаратами ИУК – 0,2 мг/л и Лигногумат калийный (Лг) – 500,0 мг/л. С
целью выявить оптимальную концентрацию Эм, а также продолжительность его влияния на
растения. Установлена эффективность применения Эм. При этом оптимальным способом
применения был полив, который более эффективно было проводить не сразу, а через неделю
после высадки растений в нестерильные условия, после того как корневая система начнет
активно развиваться. Исследование проводили на сорте Фиолетовый ранний, обработку
проводили однократно.
Применение Эм способствовало улучшению ростовых процессов при доращивании
растений, которое проявлялось уже на 30 сут. после обработки. Оптимальные концентрации Эм
при сочетании его с ИУК и Лг отличались. Так в вариантах, где Эм применяли совместно с
ИУК наилучшее развитие растений было установлено при использовании концентрации 10-8%,
а вариантах с Лг оптимальная концентрация Эм была ниже 10-12%. В дальнейшем еще в
течении 30 сут. доращивания отмечали эту же тенденцию. Однако при учете в открытом грунте
в конце первой вегетации (через 180 дней после обработки) в этих вариантах отмечали
тенденцию снижения длины побега относительно других вариантов с Эм. Лучшие показатели
были в контроле, где применяли Лг без Эм. В дальнейшем при учете на второй и третий годы
вегетации не было выявлено существенных различий между вариантами, отмечали лишь
тенденцию снижения показателей развития в вариантах – Эм 10-12% который применяли
совместно как с Лг, так и совместно с ИУК.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ FUSARIUM GRAMINEARUM ШТАММОВ
K-90 И ПК-3 В КУЛЬТУРЕ IN VITRO KALANCHOE BLOSSFELDIANA POELLN
СамойленкоТ.В., Замбриборщ И.С., Доброва А.А., Корня Т.М., Бабаянц О.В
ОНУ им. И.И. Мечникова, Южный биотехнологический центр в растениеводстве
НААНУ, Одесса (Украина)
nfyz-samoilenko@rambler.ru
Род Fusarium представляет обширную биологически неоднородную группу несовершенных
грибов. Некоторые виды рода Fusarium способны продуцировать целый ряд биологически
активных веществ, в том числе гибберелловую кислоту (ГК), которую сегодня широко
применяют в клональном микроразмножении in vitro как регулятор роста растений. В этой
связи представляет интерес использование метаболитов фузариевых грибов как стимуляторов
роста растений в культуре in vitro, что и стало целью работы.
В качестве модельного объекта в культуре in vitro использовали гиббереллочувствительное
растение Kalanchoe blossfeldiana Poelln. Контролем послужили варианты с концентрацией
278
Прикладная биотехнология
чистого препарата фитогормона ГК в концентрациях 0; 0,2; 0,5 и 1 мг/л. В опытных вариантах
ГК заменили ФКЖ K-90 и ПК-3, в которых была определена концентрация ГК (37,0±1,52
мкг/мл и 37,5±0,1 мкг/мл соответственно).Kalanchoe культивировали в течение 40 суток, после
чего оценивали следующие параметры: высоту растений, длину корневой системы, количество
корней, площадь листовой пластинки. Обработку данных проводили методом однофакторного
дисперсионного анализа и с помощью критерия Манна-Уитни.
ГК в концентрациях 0,5 мг/л и 1 мг/л оказывала стимулирующее влияние на высоту
растений и длину корневой системы, однако происходило уменьшение площади листовой
пластинки и количества корней. ФКЖ обоих штаммов являются более эффективными
стимуляторами по сравнению с ГК. Наиболее сильное влияние на высоту растений имеет ФКЖ
ПК-3 (=0,5 мг/л ГК). Среднее значение высоты растений на этом варианте - 24,7 мм, (при
аналогичных концентрациях ФКЖ К-90 - 19,97 мм и ГК - 14,2 мм). Однако растения на
варианте с ФКЖ К-90 (=ГК 0,5мг/л) достоверно отличались большими площадью листовой
пластинки и количеством корней.
По полученным данным использование чистых препаратов ГК в культуре in vitro менее
эффективно, чем использование ФКЖ. Результаты показали, что среди исследованных
штаммов, наиболее эффективным биостимулятором в культуре in vitro был ФКЖ штамма К-90.
ПОДБОР ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ PENICILLIUM
SP. ESF 21P - ПРОДУЦЕНТА ПРАВАСТАТИНА
Сейдаметова Э.А.1, Салихон Дж.2, Заинол Н.2, Конвей П.3
1
Институт микробиологии АН РУз (Узбекистан); 2University Malaysia Pahang
(Malaysia); 3BAS, Cambridge (UK)
emine_uzbekistan@mail.ru
Правастатин относится к натуральным статинам, понижающим уровень холестерина в
крови путем ингибирования 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы. В настоящее
время данный статин производится путем ферментаций. Для экономической рентабельности
промышленного производства правастатина одним из ключевых факторов является подбор
доступных и относительно недорогих питательных сред, обеспечивающих хорошее развитие
культуры-продуцента и высокий уровень накопления ценного биотехнологического продукта.
С целью подбора оптимальной питательной среды для культивирования отобранного нами
в результате скрининга продуцента правастатина Penicillium sp. ESF 21P был испытан ряд сред,
содержащих помимо глюкозы, также такие компоненты, как глицерин, лактоза, мальтоза,
пептон, соевая мука и дрожжевой экстракт. Количественный анализ синтезируемого статина
был проведен методом ВЭЖХ в системе ацетонитрил:0,1% фосфорная кислота (60:40) на
колонке Zorbax Eclipse Plus C-18 с использованием в качестве стандарта правастатина (Sigma,
США).
В результате проведенных исследований было установлено, что уровень биосинтеза
правастатина данной культурой варьирует в значительных пределах на средах различного
состава. Так, наименьший выход статина наблюдался на среде с глюкозой и дрожжевым
экстрактом. Оптимальной средой, обеспечивающей хорошее развитие штамма Penicillium sp.
ESF 21P и высокий уровень накопления правастатина, оказалась среда, содержащая в качестве
основных компонентов глюкозу, глицерин и пептон. На этой среде культура синтезировала
до197 мг/л правастатина.
Исследования проводились по гранту GRS090334.
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ И ФУНГИСТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ ЭКСТРАКТОВ ДИКОРАСТУЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ
ЯКУТИИ
Сивцева С.В.
Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова
279
Прикладная биотехнология
Lilya_Sivtseva@mail.ru
Актуальность исследования. Использование лекарственных растительных средств
возрастает в во всем мире. По данным ВОЗ, приблизительно 80% мирового населения в
настоящее время использует травяные лекарственные средства непосредственно в чаи или с
водой, молоком и алкоголем. Разработка натуральных средств из дикорастущих видов
растений, произрастающих в экологически чистых фитоценозах Якутии, и оценка их
биологической активности представляет инновационные исследования возможного их
применения в качестве профилактических средств заболеваний человека, характеризующихся
общим понижением иммунного статуса организма.
Целью работы является исследование экстрактов дикорастущих видов растений Якутии на
наличие антибактериальной и фунгистической активности. Задачи работы: выбор
оптимального метода для получения экстрактов из сухой фитомассы объектов исследования;
получение водных, спиртовых и водно-спиртовых экстрактов из фитомассы объектов
исследования; оценка антибактериальной и фунгистической активности полученных
экстрактов. Материалы и методы исследования.
Материал исследования был собран в течение полевого сезона на территории фитоценозов
Центральной и Северо-Восточной Якутии. Объектами исследования были выбраны
дикорастущие виды растений: Pinus pumila (Pall.) Regel, Ribes alpinum L., Thymus bitominosus
Klok., Artemisia jacutica Drob., Veronica incana L. После обзора литературных источников были
выбраны классические методы получения экстрактов растений: водная, спиртовая, водноспиртовая экстракции. Полученные спиртовые экстракты для удаления примесей пропускали
через роторно-пленочный испаритель. Оценка антибактериальной и фунгистической
активности экстрактов растений проводили на основе метода лунок (на твердой агаровой среде)
и по воздействию на рост микроорганизмов в жидкой среде (на основе диско-диффузионного
метода с модификацией). В качестве тест-культур были использованы бактерии, грибы и
дрожжи.
Результаты исследования. Оценка антибактериальной и фунгистической активности
экстрактов методом лунок показала следующее. Спиртовые экстракты (73-75%) обладают
высокой ингибирующей активностью в отношении с использованными видами
микроорганизмов, но в различной степени (с зоной подавления роста в 0,1-3 см). Водноспиртовые экстракты (40%) проявили низкую антибактериальную активность (зона
торможения роста всех использованных микроорганизмов (бактерий и грибов) равна 0,1-0,3
мм). Водные экстракты всех использованных видов растений проявили низкую
антибактериальную активность (зона торможения роста всех использованных микроорганизмов
(бактерий и грибов) равна 0,1-0,2 мм).
Полученные данные могут составить основу для разработки альтернативных средств
профилактики определенных заболеваний человека на основе биологически активных
экстрактов из дикорастущих растений Якутии.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ АЦЕТОНА И
БУТАНОЛА СРЕДИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА CLOSTRIDIUM
Скроцкая О.И., Гаврыш Я.В., Скроцкий С.А.
Национальный университет пищевых технологий, Национальный университет
пищевых технологий, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного
НАН Украины
Skrotska@yandex.ru
Нынешнее увеличение цен на нефть, продукты переработки которой являются основным
сырьем для производства ацетона и бутанола, требует перехода на более дешевые источники
получения химических соединений. Именно таким является производство ацетона и бутанола
на отходах пищевой промышленности с использованием ацетоно-бутиловых бактерий(АББ),
которые принадлежат к роду Clostridium.
Целью данной работы было изучение интенсивности накопления ацетона и бутанола АББ в
зависимости от состава питательной среды. Ряд АББ были выделены нами ранее из различных
280
Прикладная биотехнология
образцов почвы, отобранных из болотистой местности города Киева и пригородных районов,
ила озер и рек, активного ила очистных сооружений, гноя крупного рогатого скота и куриного
помета.
Предварительный отбор АББ проводили визуально по следующим критериям: выделение
углекислого газа, разжижения среды и общее освещение среды. Вторичный отбор АББ
проводили при наличии ацетона и бутанола в среде культивирования. Количество
синтезированного ацетона АББ определяли йодометрическим методом. Для определения
бутилового спирта использовали метод окисления бутанола, этанола и ацетона разработанный
Б.М. Нахмановичем, который основывается на окислении спиртов и ацетона бихроматом калия
в присутствии серной кислоты при двух разных за степенью жесткости условиях.
Наиболее активные продуценты ацетона и бутанола были выделены из торфа и полевой
почвы и продуцировали ацетон и бутанол в количестве 3,6 – 3,9 и 7,3 – 8,2 г/л соответственно,
продуценты ацетона выделены из куриного помета и ила озера Супой продуцировали ацетон и
бутанол на 25% меньше. Другие выделенные штаммы АББ синтезировали растворители в еще
меньших количествах (от 1,0 до 2,7 и от 1,8 до 5,6 г/л ацетона и бутанола соответственно). В
результате проведенных исследований было изолировано 8 активных штаммов ацетонобутиловых бактерий.
Для культивирования АББ использовали следующие зерновые заторы (7%) ячменный,
ржаной, овсяный, кукурузный и пшеничный; также для сравнения использовали среду
Рушмана, которая является классической естественной средой для выращивания АББ. В ходе
проведенных исследований получены следующие результаты: наибольшее количество ацетона
(5,2 г/л) и бутанола (10,8 г/л) синтезировалось при выращивании АББ на кукурузном заторе,
при этом на среде Рушмана ацетона и бутанола образовывалось на 23 и 26% меньше
соответственно; на пшеничном заторе – 4,8 и 9,4 г/л; овсяном – 4,5 и 9,1 г/л; ячменном – 4,3 и
8,3 г/л; ржаном – 4,9 и 9,3 г/л ацетона и бутанола соответственно. При этом общая
длительность брожения на кукурузном заторе была на 7 часов меньше, чем на среде Рушмана и
составляла 47 часов, на ячменном – 55 часов, ржаном – 49 часов, овсяном и пшеничном – 51 и
52,5 часов соответственно.
Таким образом, исследуемые бактерии рода Clostridium являются перспективными для
дальнейшего изучения и оптимизации условий их культивирования для увеличения выхода
ацетона и бутанола.
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА АНТИМИКРОБНОГО БЕЛКА ЭСКУЛЕНТИНА В
СОСТАВЕ ГИБРИДНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В
КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI
Совгир Н.В., Потапович М.И., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет, биологический факультет, Минск,
Беларусь
nata506b@mail.ru
Использование классических антибиотиков для борьбы с инфекционными заболеваниями
приводит к появлению мультирезистентных штаммов патогенных бактерий. В настоящее время
во всем мире ведется поиск новых антибактериальных агентов, способных заменить большую
часть существующих антибиотиков. Огромным потенциалом в этом отношении обладают
катионные антимикробные пептиды (АМП), к которым относится и белок эскулентин-1b,
выделенный из кожных покровов прудовой лягушки (Rana esculenta). Данный белок
характеризуется широким спектром антибактериальной активности и перспективен для
использования в составе комплексных антибактериальных препаратов.
Согласно литературным данным в клетках E. coli существуют специфические механизмы
для деградации эукариотических белков, подобных эскулентину. Ранее нами был клонирован
ген, кодирующий белок эскулентин-1b, в составе вектора для экспрессии pET24b(+) в клетках
E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL. Однако проведенный электрофоретический анализ белков
не выявил накопления целевого продукта. В связи с чем, целесообразным является создание
гибридных генетических последовательностей, содержащих ген эскулентиа-1b, гетерологичная
281
Прикладная биотехнология
экспрессия которых будет приводить к образованию в бактериальных клетках телец
включения, защищающих белок от деградации. В работе объектом исследования выступали:
аналог эскулентина-1b − белок эскулентин-C (C от англ. «cyclic»), мутантная форма
эскулентина-1b − белок эскулентин-L (C от англ. «linear») и бычий α-интерферон, экспрессия
которого приводит к образованию в клетках E. coli телец включения.
Для изучения особенностей экспрессии пептидов при помощи ПЦР были созданы два
варианта гибридных генетических последовательностей. Первый вариант − результат сшивания
генов эскулентина-C и эскулентина- L на 3’-конце с последовательностью бычьего αинтерферона, второй вариант − результат сшивания гена бычьего α-интерферона на 3’-конце с
последовательностями эскулентина-C и эскулентина-L.
С помощью сконструированных праймеров in vitro амплифицировали гены антимикробных
пептидов. Для синтеза же гена бычьего α-интерферона в качестве матрицы использовали
плазмиду pUC18 со встроенным геном бычьего α-интерферона. Каждую гибридную
генетическую последовательность получали при помощи двух последовательных ПЦР с
использованием в качестве матриц амплифицированных генов пептидов и бычьего αинтерферона, на которых отжигались соответствующие праймеры.
Гибридные генетические последовательности были встроены в плазмиду pUC18 по сайтам
рестриктаз Nde I и Eco RI, отсеквенированы и переклонированы в составе вектора экспрессии
pET24b(+) в клетках E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL. Отбор клонов, несущих вставку,
производили при помощи ПЦР и рестрикционного анализа. В дальнейшем планируются работы
по получению гибридных белков.
ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ АНАТОКСИНА PSEUDOMONAS AERUGINOSA НА
ИММУНОФЕНОТИП, ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОКЭФФЕКТОРОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ
Солдатенкова А.В., Ахматова Н.К., Михайлова Н.А.
ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН
lesic7@yandex.ru
Pseudomonas
aeruginosa
(синегнойная
палочка)
–
оппортунистический,
граммотрицательный микроорганизм, играющий важную роль в инфекционной патологии
человека и животных. Известно, что P. aeruginosa обладает многочисленными факторами
патогенности, важнейшим из которых является экзотоксин А. На сегодняшний день препараты
для профилактики и терапии синегнойной инфекции представляют особый интерес в связи с
высокой антибиотикоустойчивостью P. aeruginosa.
Важным показателем действия бактериальных препаратов являются оценка влияния на
иммунофенотип и функциональную активность клеток эффекторов иммунной системы. Цель
данного исследования - изучить влияние рекомбинантного анатоксина P. aeruginosa на
иммунофенотип лимфоцитов селезенок и продукцию цитокинов в крови в сравнении с
анатоксином синегнойной палочки, полученным традиционным методом (контрольный
препарат).
Мышам внутрибрюшинно вводили рекомбинантный анатоксин в дозе 25мкг или
контрольный препарат в дозе 15 мкг трёхкратно, с интервалом в 2 недели. Через 7 дней после
каждой иммунизации у животных извлекали селезенки для изучения динамики изменения
иммунофенотипа лимфоцитов. Для оценки уровня цитокинов у мышей забирали кровь через 2,
4, 8 и 24 ч после однократного введения препаратов в тех же дозах.
При сравнении цитокинового профиля после введения препаратов отмечено сходство
динамики индукции IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-17 и IFNγ, а также выявлены некоторые различия в
уровнях индукции IL-12, TGFβ, TNFα.
При исследовании уровня экспрессии поверхностных молекул CD3, CD16, CD32, CD4,
CD25, CD8, CD21, MHC II, TLR2, TLR4, TLR9 выявлена схожая динамика активации клеток.
Данные препараты увеличивали численность Т, В, NK, T-reg, γδT клеток.
В результате проведённых исследований показано сходство влияния препаратов
рекомбинантного и полученного традиционным методом анатоксинов на факторы врождённого
282
Прикладная биотехнология
и адаптивного иммунитета, что открывает перспективы для дальнейшего изучения
рекомбинантных препаратов в качестве средств борьбы и профилактики инфекций,
вызываемых синегнойной палочкой.
ОЗДОРОВЛЕНИЯ КЛОНОВОГО ПОДВОЯ СЛИВЫ ОД 2-3 ОТ ВИРУСА
НЕКРОТИЧЕСКОЙ КОЛЬЦЕВОЙ ПЯТНИСТОСТИ КОСТОЧКОВЫХ (PNRSV)
Соловей О.В., Колбанова Е.В.
РУП «Институт плодоводства»
solovei_ov@tut.by
В связи с тем, что радикальных мер борьбы с вирусами растений в настоящее время не
существует, необходимо обратить внимание на решение таких задач, как фитосанитарный
мониторинг исходных насаждений; сохранение, размножение, а также создание маточных
насаждений растений, свободных от патогенных вирусов.
В результате фитосанитарного мониторинга насаждений косточковых культур,
проведенного в 2011 г., было обнаружено наличие вируса PNRSV (вирус некротической
кольцевой пятнистости косточковых) в трех областях (Витебская, Гродненская и Могилевская)
Беларуси.
Целью исследования было оценить действие салициловой и феруловой кислот в качестве
антивирусного препарата на этапе введения в культуру in vitro. Объектами исследования
являлись растения клонового подвоя сливы ОД 2-3, инфицированные вирусом некротической
кольцевой пятнистости сливы.
На этапе введения в состав питательной среды добавляли 0,2мг/л салициловой кислоты
(MS+0,2S) и 0,2мг/л феруловой кислоты (MS+0,2F). Контролем служила модифицированная
питательная среда MS. Длительность этапа введения была 5 недель.
Для наращивания биомассы растений экспланты клонового подвоя сливы ОД 2-3
пересаживали на модифицированную питательную среду (MS+0,5 6-БА), дополненную
гормонами роста.
После того как растения накопили необходимое количество биомассы, проводили
тестирование эксплантов на наличие вируса некротической кольцевой пятнистости сливы.
Тестирование проводили методом DAS-ELISA.
Максимальный эффект (80%) по оздоровлению эксплантов от Илар-вируса PNRSV
достигался при использовании модифицированной питательной среды MS. Эффективность
оздоровления образцов при использовании фенолкарбоновых кислот была ниже и составила
для среды MS+0,2S – 60% и для среды MS+0,2F – 62,5%.
Салициловая кислота оказывала ингибирующее действие на растения даже после
пересадки их на среду для размножения. У данных растений наблюдалось каллусообразование,
некроз в местах соприкосновения со средой и средняя высота побегов была ниже, чем у
эксплантов выращенных на контрольной среде (MS) и среде с 0,2мг/л феруловой кислоты
(MS+0,2F).
СИНТЕЗ СРЕДНЕЦЕПОЧЕЧНЫХ СОПОЛИМЕРОВ 3 –ГИДРОКСИБУТИРАТА
И 3-ГИДРОКСИГЕКСАНОАТА БАКТЕРИЯМИ RALSTONIA EUTROPHA
Сырвачева Д.А.
Сибирский федеральный университет, Красноярск
Syrvacheva-1989@yandex.ru
Получение более биотехнологичных материалов с широким спектром полезных свойстводно из перспективных направлений современной биотехнологии. В настоящее время работа
ведется в направлении производства не аккумулируемых в природной среде
материалов,которые бы разрушались в естественных условиях без образования токсичных
продуктов и вписывались в биосферные круговоротные циклы.
283
Прикладная биотехнология
Среди известных биоразрушаемых синтетических и природных материалов особое место
занимают полигидроксиалканоаты,содержащие в своем составе 3-гидроксибутират и 3гидроксигексаноат.
Данные сополимеры менее кристалличны,имеют более высокие физико-механические
свойства и скорости биоразрушения.
Цель работы-исследование способности бактерий Ralstonia eutropha В5786 синтезировать в
авто- и гетеротрофных условиях сополимер 3-гидроксибутирата и 3-гигдрогксигексаноата
(поли(3ГБ-со-3ГГ)).Проведено культивирование бактерий на смешанном углеродном
субстрате,содержащем углекислоту и добавки соли гексановой кислоты.В ходе эксперимента в
автотрофную культуру R.eutropha В578,аккумулирующую полимер,вносили добавки
гексановой кислоты.Выход полимера при единовременной подаче был более высоким(50% от
веса сухой биомассы) по сравнению с режимом многократного дозирования(46% от
АСБ).Величина включения 3ГГ составляла 3мол.%.
Используя дробную подачу гексановой кислоты в среду и,увеличивая время
культивирования бактерий,удалось повысить содержание фракции 3ГГ до 6мол.% после первой
добавки гексаноата и до 9мол.%-после второй.При культивировании бактерий в гетеротрофных
условиях с добавлением акриловой кислоты(0.1,0.5 и 1.0г/л),показано,что доля 3ГГ в
сополимере возрастала от 9мол% до 51мол%.При этом происходило снижение урожая
биомассы,однако содержание полимера в клетках не изменялось.
Таким образом,установлено,что,варьируя условия культивирования и концентрацию
акриловой кислоты,возможно получать сополимер поли(3ГБ-со-3ГГ) с содержанием 3ГГ от
3мол% до 50мол%.
ЭКСПРЕССИЯ ПЕПТИДА М2е ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ H5N1 В РАСТЕНИЯХ
РЯСКИ МАЛОЙ (LEMNA MINOR)
1
Тарасенко И.В. , Гиляшова Н.В.2, Фирсов А.П.1, Митюшкина Т.Ю.1, Долгов С.В.1,2
1
ФИБХ РАН; 2Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино
starassenko@rambler.ru
Целью данного исследования было клонирование и анализ экспрессии в растениях ряски
малой
(Lemna
minor)
пептида
М2е
белка
М2
вируса
гриппа
птиц
A/chicken/Kurgan/5/2005(H5N1) для последующей разработки съедобной вакцины.
Последовательность 5’- концевого фрагмента гена М2, включающего пептид М2е, была
синтезирована методом лигирования синтетических олигонуклеотидов, с предварительной
оптимизацией кодонного состава для экспрессии в ряске. Фрагмент был клонирован в
растительном векторе pBI121 в трансляционном слиянии с N-концом β- глюкоронидазы под
контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Полученный вектор, pBIМ130GUS,
был использован для агробактериальной трансформации растений ряски. Гистохимический и
вестерн- блот анализы трансгенных растений серии М130 показали стабильную экспрессию
слитого гена. Количественная оценка синтеза целевого белка, проведенная методом ИФА,
показала уровень в 2-4% (в разных линиях ряски) слитого белка М130GUS от тотального
растительного белка.
В последнее время показана возможность использования субъединицы В рицина - лектина
из клещевины (Ricinus communis) в качестве адьюванта при производстве «съедобных» вакцин
растительной природы. На основе бинарного экспрессионного вектора pBI121 в
трансляционном слиянии были клонированы гены субъединицы В рицина и М130. Далее к
слитому гену рицин В -М130 нами был добавлен сигнальный пептид PR1-белка табака,
определяющий транспорт белков в апопласт. Также к 3’ концу гена М130 был добавлен
фрагмент, кодирующий хитинсвязывающий домен из хитиназы А, что позволит использовать
хитинсодержащие носители для оптимизации количества антигена в растительном экстракте.
Плазмида, обозначенная как pBIRBM130, была использована для трансформации растений
ряски. Было получено 23 линии трансгенных растений. Методом вестерн-блот анализа показан
синтез целевого белка в 5-ти линиях. В настоящее время проводится количественный анализ
целевого фрагмента в трансгенных растениях.
284
Прикладная биотехнология
СЕГРЕГАЦИОННО СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР PHYP
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ
СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ
Усакин Л.А., Орлова Н.А., Ковнир С.В., Воробьев И.И.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН
leousakin@gmail.com
Целью работы являлся дизайн вектора, содержащего генетический элемент hok-sok в
оптимальном положении и ориентации, а также кодирующего минимальный N-концевой
пептид, пригодный для эффективной очистки целевых белков в денатурирующих условиях и
удаления после обработки энетрокиназой. Были исследованы различные варианты
расположения и ориентации элемента hok-sok и было обнаружено, что статистически значимый
стабилизационный эффект достигается при удалении из последовательности вектора
генетического элемента ограничения копийности rop и введении элемента hok-sok между
терминатором гена целевого белка и терминатором гена селекционного маркера, при
одинаковом направлении транскрипции гена селекционного маркера и токсина Hok.
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ПЕРСИКА (PRUNUS PERSICA L.) ПРИ
ПОМОЩИ ВЕКТОРНОЙ СИСТЕМЫ PMF2
Худякова Т.И.1, Тимербаев В.Р.2, Долгов С.В.1,2
1
Пущинский государственный естественно-научный институт; 2Федеральное
государственное бюджетное учреждение науки Филиал Института биоорганической
химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино (Россия)
tatya38@yandex.ru
Плоды косточковых культур обладают высоким пищевым и диетическим значением в
рационе питания человека. Персик (Prunus persica L. Batsch) является одной из наиболее
важных коммерческих косточковых культур и занимает первое место в производстве плодов в
мире. Однако в настоящее время существует большая угроза для культивирования косточковых
плодовых культур. Угрозу представляют вирусные и грибные заболевания. Наиболее опасным
среди вирусных заболеваний является вирус оспы сливы (Plum Pox Virus, PPV), возбудитель
болезни Шарка. PPV поражает все части растения: листья, кору дерева, плоды и косточки,
вызывает преждевременное опадение плодов. Ввиду отсутствия природных доноров
устойчивости одним из наиболее приемлемых выходов из данной ситуации является
использование современных методов генной инженерии, которые дают возможность
значительно ускорить процессы создания устойчивых высокопродуктивных сортов персика.
Более того в настоящее время с помощью методов генной инженерии можно получать
генетически модифицированные растения, не содержащие нежелательной ДНК (например,
гены селективных и репортерных маркеров). А в данном случае это очень важно, так как
косточковые культуры ценятся за возможность их потребления в свежем виде, либо
применения в производстве сухофруктов, консервов, джемов, сиропов, соков.
Одним из основных препятствий использования методов генетической трансформации
является отсутствие эффективных протоколов регенерации из соматических тканей и
генетической трансформации персика. В нашей лаборатории на основе векторной системы pMF
(PRI, Нидерланды) созданы конструкции с репортерным геном зеленого флуоресцентного
белка (GFP) и агробактериальными генами синтеза цитокининов (ipt) для повышения
регенерационной способности трансформированных тканей.
Полученными конструкциями провели агробактериальную трансформацию (Agrobacterium
tumefaciens) листовых эксплантов персика сорта «Nemaguard». В настоящее время получены
каллусные ткани, экспрессирующие белок GFP и успешно пролиферирующие на
285
Прикладная биотехнология
безгормональных средах. Имеющиеся результаты могут служить основанием для разработки
системы эффективной генетической трансформации персика.
НИТРАТРЕДУКТАЗНАЯ И ПЕРОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТИ КАК
ПОКАЗАТЕЛИ ИНТЕНСИВНОСТИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ SAUSSUREA
DISCOLOR (Willd.) DC. В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Чебан Л.Н., Шелифост А.Е.
Черновицкий национальный университет им. Ю. Федьковича (Украина)
larisa.cheban@mail.ru
Одним из наиболее важных факторов минерального питания растений является
обеспечение их потребности в азоте. Необходимые его превращения в растительном организме
обеспечивает прежде всего нитратредуктаза. Неспецифическим ферментом ассимиляции азота
также является пероксидаза, для которой обнаружены нитратвосстанавливающие свойства.
Среди наиболее важных факторов, способных влиять на процессы ассимиляции азота, основное
место занимают цитокинины. В то же время данные, касающиеся данного вопроса, весьма
противоречивы. В связи с этим нами были исследованы показатели нитратредуктазной и
пероксидазной активностей эксплантов S. discolor, культивируемых на средах, отличающихся
содержанием общего азота и цитокинина. Культивирование осуществляли на средах с полным
и половинным содержанием минеральных солей по Мурасиге-Скуга (МС) в присутствии 0,5
или 1 мг/л БАП. Среда МС взята за основу, поскольку является оптимальной для индукции
морфогенеза у большинства двудольных растений. Кроме этого, она наиболее сбалансирована
по присутствию NH4+ и NO3‾.
Нами установлено, что влияние БАП на нитратредуктазную активность зависит от
интенсивности минерального питания, причем одинаковое содержание гормона в среде роста
при условии различного обеспечения минеральными солями вызывало противоположно
направленный эффект. От условий культивирования также зависел и уровень пероксидазной
активности. Минимальные ее значения были выявлены в эксплантах, выращенных на
питательной среде с полным содержанием солей по МС и 0,5 мг/л БАП.
На основе корреляционного анализа нитратредуктазной и пероксидазной активностей было
установлено наличие обратной корреляции при культивировании на средах с полным
содержанием минеральных компонентов среды МС. Максимального размаха она достигает при
культивировании эксплантов в присутствии 0,5 мг/л БАП в питательной среде. Это
свидетельствует о ее наибольшей способности стимулировать ростовые процессы, поскольку
именно при таких условиях роста растения ассимилируют в основном нитратную форму азота.
Полученные результаты согласуются с таковыми морфологических наблюдений, в которых
было установлено необходимость снижения в питательной среде БАП при длительном
культивировании S. discolor до 0,5 мг/л.
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ХИРУРГИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ МЫШЕЙ С
ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ БИОМОДЕЛЕЙ ДЛЯ НАУЧНЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ И ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ
Чернов А.С., Овсепян А.А., Телегин Г.Б.
Филиал федерального государственного бюджетного учреждения науки института
биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
c.h.e.r.n.o.v@rambler.ru
Технология создания животных-биомоделей является одной из наиболее бурно
развивающихся направлений биомедицины в последние 10 лет. В качестве животныхбиомоделей с большим успехом используют трансгенных мышей. Поскольку геном мыши и
человека совпадает на 80%, а 99% генов можно назвать очень похожими, представляется
возможным с помощью технологии трансгенеза, создание биомоделей точно моделирующих
286
Прикладная биотехнология
клинические, морфологические и физиологические симптомы различных генетических
заболеваний человека. В настоящее время создано более 250 линий мышей с
«нокаутированными» генами, моделирующими различные заболевания человека, такие как
болезнь Альцгеймера, Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, болезни обмена
веществ, сердечно-сосудистой системы и др.
Одним из быстрых способов получения трансгенных животных является использование
трансформированных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Данный метод позволяет
осуществлять предварительную селекцию эмбриональных стволовых клеток и получать
трансгенных животных с мутацией любого необходимого исследователю гена.
Впервые в России, была разработана и внедрена в производство технология «Получения
генномодифицированных животных методом инъекции ЭСК в полость бластоцисты» в
условиях SPF (specified pathogen free) питомника Филиала ИБХ с соблюдением всех
международных требований. Формализован производственный процесс, система управления
качеством которого сертифицирована на соответствие требований международной организации
по стандартам ISO 9001:2008. Питомник ФИБХ первый в России, получивший полную
аккредитацию AAALAC International. Получение в SPF условиях генномодифицированных
животных позволяет существенно сократить время от разработки до коммерческого разведения
и использование исследователем новых биологических моделей.
Вторым значимым подходом при создании животных-биомоделей является хирургическая
трансформация. В питомнике лабораторных животных ФИБХ РАН впервые в России был
разработан минимально инвазивный метод моделирования инфаркта миокарда у мышей с
помощью лигирования коронарной артерии сердца или контролируемой электрокоагуляции. В
результате работы был налажен комплекс анестезиологических, микрохирургических и
реанимационных мероприятий, достигнуто снижение послеоперационной летальности
животных с 94,6% до 13,6%. Измерение электрокардиограммы позволило диагностировать
развитие крупноочагового или поверхностного инфаркта миокарда. В результате
гистологических исследований были выявлены очаги некроза в сердечной мышце в 87,5%
случаев. Диагностические данные позволяют говорить о возможности создания адекватной
модели инфаркта миокарда на лабораторных мышах. Дальнейшая отработка и стандартизация
экспериментального инфаркта миокарда позволит применять данную модель к
геномодифицированным линиям мышей, что является важным для поиска эффективных
способов лечения.
СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ ГРИБОВ TRICHODERMA VIRIDE
Чумак Ю.В., Семенов С.Ю.
Национальный исследовательский Томский государственный университет, Томск
(Россия)
Smail__ik@mail.ru
Повышение целлюлолитической активности микробиологических препаратов для
ускорения
биодеградации
пожнивных
остатков
является
актуальной
задачей
сельскохозяйственной биотехнологии. Перспективность селекции биологических агентов
биодеградации целлюлозы с использованием ауксостата подтверждена в последнее время
рядом патентов. Для технического осуществления автоселекционного процесса в непрерывной
культуре микромицетов рода Trichoderma необходимо определить оптимальный состав
питательной среды и, в первую очередь, источник углеродного питания.
В работе представлены данные по исследованию роста T.viride на жидких средах в
периодическом режиме с различными источниками углеродного питания: ватой, сеном,
микрокристаллической целлюлозой. Источники углерода стерилизовали и добавляли в среду
Чапека без сахарозы в мелко нарезанном виде. Контроль изменения численности T.viride
осуществлялся прямым подсчетом конидий в камере Горяева. Скорость роста культуры после
трех последовательных культиваций в течение 120 ч в колбах на качалке определяли высевом
на агаризованный картофельный отвар и измерением диаметра колонии.
287
Прикладная биотехнология
Установлено, что наименьшую длительность лаг-фазы, наибольшие скорость роста в
экспоненциальной фазе и степень утилизации субстрата культура проявляет на среде с сеном,
наименьшую – на среде с ватой.
После трех культиваций указанное соотношение сохраняется и при культивировании
T.viride на плотной среде.
Таким образом, для осуществления непрерывного культивированияT.viride может быть
рекомендована среда на основе лигноцеллюлозного материала.
ГЕНЕРАЦИЯ ЭЛЕКТРОЭНЕРГИИ ГИДРОГЕНАЗНЫМ ЭЛЕКТРОДОМ В
БИОРЕАКТОРЕ С ВОДОРОДВЫДЕЛЯЮЩИМ МИКРОБНЫМ
КОНСОРЦИУМОМ
Шастик Е.С., Зорин Н.А., Цыганков А.А.
ИФПБ РАН
shastikevgeny@gmail.com
С ростом населения и благосостояния в мире остро возникает проблема утилизации
отходов, загрязняющих окружающую среду. Более того, появляется вопрос не только
переработки и обезвреживания промышленных и бытовых отходов, но и использование их как
вторичных ресурсов. Биосинтез водорода из крахмалсодержащих сточных вод с
одновременным его окислением в топливной ячейке для генерации электричества – один из
путей получения возобновляемой энергии из вторичных ресурсов.
Целью данной работы являлось совмещение выделения водорода микробным
консорциумом в гетеротрофных условиях (за счет разложения крахмала) и поглощения Н2
ферментным водородным электродом.
Нами показано, что водородный ферментный электрод на основе гидрогеназы из Thiocapsa
roseopersicina BBS был работоспособен в биореакторе с хемогетеротрофным консорциумом,
разлагающим крахмал, как в режиме датчика водорода, так и в режиме электрокаталитической
генерации тока. После 220 часов работы его активность снижалась не более чем на 20%. При
этом электрод потреблял 1,5% выделяющегося водорода.
Для возрастания доли поглощенного водорода электрод был увеличен в 4 раза и к нему
прикладывалось перенапряжение в 30 мВ, 100 мВ и 150 мВ. Модифицирован биореактор для
культивирования микробного консорциума с гидрогеназным электродом с целью улучшения
массообменных характеристик. Выяснено, что при периодическом культивировании
консорциума крахмал потреблялся практически полностью, среди продуктов брожения
преобладали ацетат и бутират, причем, судя по балансу углерода в субстрате и продуктах, все
основные продукты были учтены. В этом режиме удалось преобразовать до 18%
выделяющегося водорода в электричество. При этом потребление гидрогеназным электродом
водорода не повлияло на соотношение и концентрацию продуктов разложения крахмала.
Изучали также стабильность системы в условиях непрерывной подачи среды в реактор.
Показано, что гидрогеназный электрод сохранял активность в течение 30 дней. Изучено
влияние различных условий на выделение водорода консорциумом как в присутствии
гидрогеназного электрода, так и без него.
Работа поддержана Программой Президиума РАН «Химические аспекты энергетики»
ВЛИЯНИЕ АМИКСИНА НА РЕАЛИЗАЦИЮ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО
ПОТЕНЦИАЛА ЭКСПЛАНТОВ ХМЕЛЯ (HUMULUS LUPULUS L.) IN VITRO
Шепель Л.С.1, Бурячковский Д.В.1, Замбриборщ И.С.2
1
Южноукраинский национальный педагогический университет им. К.Д. Ушинского;
2
Селекционно-генетический институт, Одесса (Украина)
shepel.lyudmila@gmail.com
288
Прикладная биотехнология
Широкое внедрение метода клонального микроразмножения имеет большую актуальность
и значительный спрос для такой культуры как хмель. При этом, особо важным является борьба
с вирусными болезнями, которые передаются при вегетативном размножении растений, что
приводит к значительному ухудшению качества сырья и снижению урожайности культуры. На
сегодняшний день созданы новые противовирусные препараты, которые подавляют развитие
вирусов в организме человека и животных, но неизвестно, каким образом они влияют на
развитие растительных объектов. Одним из таких препаратов является амиксин (тилорон),
имеющий широкий спектр противовирусной активности. Целью нашего исследования являлось
изучение влияния амиксина на реализацию морфогенетического потенциала стебельных
эксплантов хмеля (Humulus lupulus L.) в условиях in vitro.
В качестве исходного материала использовали введенный в культуру маточный материал
хмеля сортов украинской селекции. Для стерилизации эксплантов использовали 70% этиловый
спирт. Культивирование микрочеренков проводили на модифицированном нами варианте
питательной среды Мурасиге и Скуга. К питательной среде добавляли амиксин в
концентрациях 0,02%, 0,05%, 0,1%. В качестве контроля использовали аналогичную
питательную среду, которая не содержала исследуемого вещества. Было установлено, что с
повышением концентрации амиксина в составе питательной среды увеличивался процент
регенерации растений исследуемых сортов. Наиболее большое количество регенерированных
растений у всех исследованных генотипов наблюдалось при культивировании эксплантов на
питательной среде, содержавшей амиксин в концентрации 0,1% . На наш взгляд это может
свидетельствовать о том, что амиксин способен выполнять роль активатора меристематических
зон, из которых, в дальнейшем, регенерируют нормальные растения.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что амиксин в концентрации 0,1% в составе
питательной среды положительно влияет на рост и развитие эксплантов хмеля, значительно
повышает количество регенерантов на один эксплант, а также способствует формированию
нормальных растений, которые в дальнейшем будут адаптированы в почвенной смеси.
ВЛИЯНИЕ РЕДУКЦИИ МИНЕРАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНОЙ
СРЕДЫ НА СОЗРЕВАНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ ЭМБРИОНОВ ЕЛИ
ЕВРОПЕЙСКОЙ PICEA ABIES
Шишкина М.С.1,2, Шестибратов К.А.2
1
Пущинский государственный естественно-научный институт; 2Филиал института
биоорганической химии РАН, Пущино (Россия)
maruna0606@yandex.ru
Соматический
эмбриогенез
является
перспективным
методом
клонального
микроразмножения хвойных деревьев. Из всех известных способов размножения хвойных
соматический эмбриогенез является наиболее рентабельным и производительным подходом.
Цель настоящего исследования: провести оптимизацию условий одной из стадий
соматического эмбриогенеза, а именно стадии созревания соматических эмбрионов ели
европейской. Подбор условий на этой стадии необходим для получения высококачественных
зрелых эмбрионов с высоким коэффициентом конверсии в проростки. Нами исследовано
влияние редукции минерального состава питательной среды на образование и созревание
эмбрионов у эмбриогенных и неэмбриогенных эмбрионально-суспензорных масс (ЭСМ).
Проверялись 4 варианта редукции:
I) на последнем цикле пролиферации (п.пр.) и безгормональной (б/г) стадии перед
созреванием применялась питательная среда без редукции минерального состава;
II) редукция мин. состава пит.ср. в 2р. на б/г стадии;
III) редукция мин.состава пит.ср. в 2р. на п.пр. и б/г стадии;
IV) уменьшение мин.состава в 2р.на п.пр. и в 3р. на б/г стадии.
Для эмбриогенной линии лучшим оказался вариант III. Среднее количество глобулярных
(гл) и торпедовидных (торп) эмбрионов = 14.3 и 3.75 эмбрионов на одну каллусную группу. На
остальных вариантах гл. эмбрионов было в 19-1.7-1.04 р. меньше (для вариантов I,II и IV
соответственно). Количество торп.эмбрионов было меньше в 20-6.7 р. для вариантов II и IV. На
289
Прикладная биотехнология
варианте I не было торп. эмбрионов. Вариант IV также дал хорошие результаты, но степень
перехода эмбрионов от гл. к торп. форме здесь была ниже. Максимальный вторичный рост
ЭСМ наблюдался на варианте I (=4.56 по 5-балльной шкале); на вариантах III и IV его не было.
У неэмбриогенной линии эмбрионы ни на одном из вариантов редукции не образовались. Т.о.
редукция минерального состава среды улучшает эмбриогенность ЭСМ, но при этом не влияет
на первичное появление эмбриогенности у ЭСМ.
С использованием этих результатов был поставлен эксперимент для определения влияния
стадии внесения глутатиона восстановленного (GSH) на степень созревания соматических
эмбрионов. GSH присутствовал в питательной среде на п.пр. и на б/г стадии (вариант I), или
только на п.пр. (II), или только на б/г стадии (III). Вариант I оказался лучшим. Среднее
количество глобулярных и торпедовидных эмбрионов для варианта I =15.23 и 5.56 эмбрионов
на 1каллусную группу. В варианте I образовалось больше глобулярных эмбрионов и выше
коэффициент перехода эмбрионов от глобулярной к торпедовидной форме. На вариантах II III
количество гл. эмбрионов было меньше в 1.6-5.1р. Количество торп. эмбрионов было меньше в
2-6.7р. для вариантов II и III соответственно.
В итоге, редукция минерального состава питательной среды и присутствие GSH на п.пр.
ЭСМ и б/г стадии перед созреванием необходимы, т.к. они увеличивают степень созревания
соматических эмбрионов ели европейской и улучшают их качество.
СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ACINETOBACTER
CALCOACETICUS К-4 И RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS ЕК-1 НА ГЛИЦЕРИНЕ
Шулякова М.А., Мащенко О.Ю., Пирог Т.П., Шевчук Т.А.
Национальный университет пищевых технологий, Институт микробиологии и
вирусологии НАН Украины
mariejanvier@rambler.ru
Интерес к глицерину как субстрату для микробного синтеза обусловлен тем, что в
последние годы в связи с расширением производства биодизеля в мире этот спирт из разряда
«целевых» технологических продуктов перешел в категорию отходов. Одним из
альтернативных путей утилизации этого продукта является его использование в технологиях
микробного синтеза практически ценных продуктов, в том числе поверхностно-активных
веществ (ПАВ).
В предыдущих исследованиях были выделены нефтеокисляющие бактерии,
идентифицированные как Rhodococcus erythropolis ЕК-1 и Acinetobacter calcoaceticus К-4, и
показана способность изолированных штаммов к синтезу ПАВ на гидрофильных и
гидрофобных субстратах. По химической природе ПАВ штамма ЕК-1 являются комплексом
глико-, фосфо- и нейтральных липидов, а штамма К-4 – глико-, амино- и нейтральных липидов.
Цель данной работы – исследовать возможность использования глицерина в качестве
субстрата для получения ПАВ R. erythropolis ЕК-1 и A. calcoaceticus К-4.
Исследование роста и образования ПАВ на среде с глицерином показало, что данные
штаммы способны ассимилировать этот субстрат и синтезировать метаболиты с поверхностноактивными свойствами, однако количество образованных ПАВ было ниже, чем на
традиционных субстратах. В связи с этим целью работы было исследование возможности
интенсификации синтеза ПАВ данными штаммами на среде с глицерином.
Учитывая химический состав ПАВ, мы предположили, что внесение в среду цитрата
натрия (регулятора синтеза липидов) и фумарата натрия (С4-дикарбоновая кислота,
предшественник глюконеогенеза) позволит повысить эффективность процесса их биосинтеза.
Так, было показано, что одновременное внесение цитрата (0,1%) и фумарата (0,2%) в среду с
глицерином сопровождалось повышением показателей синтеза ПАВ R. erythropolis ЕК-1 на
32%, а добавление предшественников биосинтеза в концентрации 0,01% в среду
культивирования A. calcoaceticus К-4 − увеличением количества ПАВ в 2−2,5 раза по
сравнению с выращиванием бактерий на среде без органических кислот.
Для R. erythropolis ЕК-1 замена цитрата натрия на эквимолярную по углероду
концентрацию лимонной кислоты дала возможность повысить количество синтезированных
290
Прикладная биотехнология
ПАВ на 10-15% по сравнению с использованием цитрата натрия. Даже при условии
периодического доведения рН до 8,0 лимонной кислотой после внесения 0,2% фумарата
наблюдали повышение концентрации ПАВ на 30%, 45% и 77% по сравнению с показателями
процесса без регуляции рН, при одновременном внесении фумарата и цитрата натрия и
культивирования бактерий на среде без органических кислот соответственно.
Предложенные подходы могут стать основой для разработки экономически выгодной
промышленной технологии получения ПАВ A. сalcoaceticus К-4 и R. erythropolis ЕК-1, а также
решить проблему утилизации отходов производства биодизеля.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ ПРОТЕКТИВНЫХ АНТИГЕНОВ
VIBRIO CHOLERAE 569В ИНАБА ПОЛУЧЕННЫХ НА РАЗРАБОТАННОМ
БИОРЕАКТОРЕ И ПО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕХНОЛОГИИ
Гаева А.В., Никифоров А.К., Комиссаров А.В., Алешина Ю.А., Киреев М.Н.,
Еремин С.А., Громова О.В., Захарова Т.Л., Ульянов А.Ю.
ФКУЗ Роспотребнадзора, Российский научно-исследовательский противочумный
институт «Микроб», Саратов (Россия)
Ylianov-9@yandex.ru
Ранее авторами было усовершенствовано производство вакцины холерной бивалентной
химической таблетированной за счет внедрения в производственный процесс
сконструированного биореактора и обоснована возможность использования процесса
концентрирования протективных антигенов V. cholerae 569В Инаба методом тангенциальной
ультрафильтрации. Получены серии препаратов, показано их соответствие регламентируемым
требованиям. Представлялось целесообразным более детальное исследование характеристик
полученных образцов.
Изучали свойства сублимационно высушенных препаратов холерогена-анатоксина (ХА) и
(О-АГ), полученных традиционным способом и по разработанной технологии. Проведенные
исследования показали, что такие ферменты как протеаза, фосфолипаза, липаза (твиназа)
отсутствуют в препаратах полученных как традиционным так и разработанным способами. В
обеих образцах была обнаружена лизофосфолипаза. При этом реакция была положительна в 1 и
2 разведениях (соответственно 1 и 0,5 мг/мл) у обоих препаратов. Данные дот-иммуноанализа
свидетельствовали о том, содержание ХА и О-АГ в обоих препаратах было одинаковым и
составляло 1:1280 и 1:380 соответственно. Результаты хроматографического разделения по
величине молекулярной массы препаратов, полученных двумя способами, продемонстрировали
их подобие, при этом с колонки элюировалось три белковых пика. Проведенные исследования
электрофоретической подвижности препаратов свидетельствовали о том, что белковоуглеводные комплексы препаратов тождественны и состоят из компонентов с молекулярной
массой от 12 до 90 кДа. Таким образом, сравнительный анализ иммунохимических, физико- и
биохимических свойств протективных антигенов полученных по традиционной и по
экспериментальной технологиям показал их идентичность.
291
Радиобиология
СЕКЦИЯ «Радиобиология»
ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
ЭЛЕКТРОКАРДИОГРАММЫ КРОЛИКОВ ПРИ СОВМЕСТНОМ
ВОЗДЕЙСТВИИ ШУМА И КОРНЕЙ СОЛОДКИ
Оганисян А.О., Минасян С.М., Оганесяан К.Р.
Ереванский государственный университет, Факультет биологии, Кафедра физиологии
человека и животных, Ереван (Армения)
has.hovhannisyan@mail.ru
Целью настоящей работы является изучение изменения частоты сердечных сокращений
(ЧСС) и вагосимпатического индекса (P/T) при совместном воздействии шума и корней
солодки (КС). Эксперименты проведены на 15 половозрелых кроликах породы шиншила
массой 2,1-2,4 кг, на двух группах. Животных I группы подвергали 20-и дневному воздействию
шума 1000 Гц, 114 дБ звукогенератором 3Г-34 по 2 часа ежедневно, II –й 20-и дневному
комбинированному воздействию шума и КС. Электрокардиограмма регистрировали во II
отведении на одноканальном электрокардиографе “ЭК 2Т-02” модели.
Анализ полученных данных показал, что у животных I группы наблюдался статистически
достоверное учащение ЧСС и на 5-й, 10-й и 20-й дни составляли 13,3%, 11,2% и 10,5%
соответственно. Однако в эти дни понижался P/T на 25,6%, 23,0% и 16,6% по сравнению с
нормой. У кроликов II группы на изучаемые дни наблюдался на 1,3% 1,7% и 1,0%: однако
наблюдалось умеренное понижение данных P/T, составляющие 10,9%, 10,9% и 8,2%, по
сравнению с нормой.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что содержащиеся в корнях солодки
биологически активные вещества препятствуют тахикардического эффекта шума,
обеспечивают уравновешивание активности симпатических и парасимпатических механизмов
регуляции работы сердца, в пользу чего свидетельстуют менее выраженные сдвиги
вагосимпатического индекса.
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ
КРОВИ КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ ПОСЛЕ
ВОЗДЕЙСТВИЯ ФЕМТОСЕКУНДНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ IN VIVO
Абакумова Т.В., Генинг Т.П., Арсланова Д.Р., Воронова О.С., Генинг С.О.,
Светухин В.В.
Ульяновский государственный университет, Ульяновск (Россия)
taty-abakumova@yandex.ru
Участие нейтрофильных гранулоцитов (НГ) в механизмах канцерогенеза считается
установленным. Одним из ведущих направлений современной онкогинекологии является поиск
способов избирательного воздействия на отдельные этапы развития иммунного ответа.
Показано, что модуляция иммунных реакций организма возможна при воздействии на него
лазерного излучения. В настоящее время широко изучено влияние низкоинтенсивного
лазерного излучения. Облучение in vitro суспензии НГ вызывает прайминг клеток и увеличение
продукции ими активных форм кислорода. Используемый нами в эксперименте
фемтосекундный волоконный эрбиевый лазер, являющийся совместной уникальной
разработкой Научного центра волоконной оптики РАН и Ульяновского государственного
университета, имеет низкую средняя мощность — 1,26 ± 2%мВт; при пиковой мощности —
6кВт; длительность импульса — 100·10-15; длина волны — 1,55 мкм.
Целью исследования явилась оценка функционального состояния НГ крови крыс с
экспериментальным РЯ после воздействия фемтосекундного лазерного излучения (ФСЛИ) in
vivo.
Объектом исследования явились НГ крови крыс с асцитной опухолью яичника (АОЯ) (банк
штаммов РОНЦ им Н.Н.Блохина (г.Москва). Крысы интактные и с АОЯ подвергались
292
Радиобиология
воздействию ФСЛИ с интенсивностью потока энергии при облучении трехкратно - 0,079
Дж/см2, и пятикратно - 0,132 Дж/см2. Цитохимически изучали фагоцитарное число (ФЧ, у.е.) и
фагоцитарный индекс (ФИ,%), а также активность миелопероксидазы (МПО), щелочной
фосфатазы (ЩФ), уровень катионных белков (КБ) и долю активных нейтрофилов в спонтанном
варианте НСТ-теста. Результаты выражали в виде среднего цитохимического коэффициента
(СЦК). Достоверность отличий оценивали по U-критерию Манна-Уитни (р≤0,05).
В результате проведенных исследований установлено, что уровень КБ, а также активность
ЩФ во всех экспериментальных группах изменялись в пределах коридора нормы. Уровень
МПО статистически значимо снижался в НГ животных с АОЯ после трехкратного облучения и
составил 1,3±0,21 СЦК против 2,0±0,15 СЦК в контроле. Количество НГ, активных в НСТ-тесте
резко и значимо возрастало у все облученных животных и составляло 81,5±4,5 СЦК у интакных
облученных, 72,7±1,90 СЦК у облученных животных с АОЯ против 7,3±1,59 СЦК у интакных
необлученных животных.
ФИ резко снижался у животных с АОЯ по сравнению с интактными животными составляя
42,7± 5,85% против 70,3±1,45% в контроле. При облучении животных с АОЯ статистически
значимое увеличение ФИ имело место после пятикратного ФСЛИ и составил 55,0±1,88%
против 42,7±5,85% у необлученных.
Таким образом, полученные данные позволяют предполагать возможность праймирования
НГ периферической крови как в норме так и у животных с АОЯ при воздействии ФСЛИ при
плотностях потока энергии - 0,079 Дж/см2 и 0,132 Дж/см2.
Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной Росс