ТИМУС

Иммунопатология, аллергология, инфектология
Immunopathology, allergology, infectology
2012, №3:8186
ТИМУС
УДК 612.438:612.398.192:612.66
Динамика экспресии вазоактивного интестинального полипептида в
тимусе плодов и новорожденных человека
А.В. Сокол, В.В. Руденок
Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь
Dynamic expression of vasoactive intestinal polypeptide in the thymus of human
fetuses and newborns
A.V. Sokal, V.V. Roudenok
Belarusian State Medical University, Belarus
Аннотация
Summary
Методом непрямой иммуногистохимии исследовано рас
пределение вазоактивного интестинального полипептида
(ВИП) в тимусе человека. Выявлены ВИПреактивные
клеточные и волокнистые структуры. Показатель эксп
рессии ВИП составлял 8,6±0,74%. Экспрессия вазоактив
ного интестинального полипептида в клеточных популя
циях, нервных волокнах и тельцах Гассаля свидетельству
ет о сохранении иммунной и нейроэндокринной функ
ций тимуса на фоне его возрастной инволюции.
By the method of indirect immunohistochemistry was
investigated the distribution of vasoactive intestinal
polypeptide (VIP) in the human thymus. In the thymus we
revealed VIP cellular and fibrous structures. The index of
expression of VIP was 8,6 ± 0,74%. Expression of vasoactive
intestinal polypeptide in the cell populations, nerve fibers and
Hassall corpuscles indicates persistent immune and
neuroendocrine function of thymus against the background
of age involution.
Ключевые слова
Key words
Тимус человека, нейропептиды, вазоактивный интести
нальный полипептид, экспрессия, регуляция функций
Human thymus, neuropeptides, vasoactive intestinal
polypeptide, expression, regulation of function.
Физиология тимуса центрального органа
иммунопоэза, представляет собой комплекс
сложных, многоступенчатых и на сегодняшний
день все еще недостаточно изученных процес
сов. Известно, что межклеточные взаимодей
ствия как в самом тимусе, так и в других регу
ляторных системах – нервной и эндокринной,
осуществляются с участием различных сиг
нальных молекул, среди которых немаловажное
значение придается нейропептидам [1].
Нейропептиды относятся к одной из са
мых многочисленных групп регуляторных
субстанций, влияющих на метаболизм и обна
руживаемых в нервной, иммунной и эндокрин
ной системах человека и млекопитающих. На
ряду с типичными признаками нейромедиато
ров, регуляторные пептиды отличаются от клас
сических нейротрансмиттеров вегетативной не
рвной системы – ацетилхолина и норадренали
на молекулярной массой, механизмами синте
за, депонирования, высвобождения, расщепле
ния, а также длительностью физиологических
эффектов в органахмишенях. Современными
молекулярнобиологическими и иммуногисто
химическими методами с применением моно и
поликлональных антител к нейропептидам и
ключевым ферментам их синтеза установлено,
что иммунокомпетентные клетки являются ис
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°3
81
А.В. Сокол, В.В. Руденок
точником синтеза и экспрессии более 30 нейро
эндокринных медиаторов [2]; в том числе вазо
активного интестинального полипептида [3].
Впервые идентифицированный как кишеч
ный пептидвазодилататор, вазоактивный инте
стинальный полипептид (ВИП) содержит 29
аминокислотных остатков и относится к глю
кагонсекретиновому семейству полипептидов
[4]. Иммунореактивные к ВИП нервные клетки
и волокна выявлены в центральной и перифе
рической нервной системе [5,6,7]. Вазоактив
ный интестинальный полипептид также опре
деляется в органах сердечнососудистой, респи
раторной, иммунной, мочеполовой, эндокрин
ной и пищеварительной систем человека и мле
копитающих [8]. Многочисленные молекуляр
нобиологические, физиологические и фарма
кологические исследования, проведенные в ус
ловиях in vitro показали, что вазоактивный ин
тестинальный полипетид обладает нейропро
текторными и трофическими свойствами, регу
лирует рост, дифференцировку и физиологи
ческую активность нейронов [9]. Кроме того
ВИП является потенциальным вазодилатато
ром, вызывая атропинрезистентное расшире
ние кровеносных сосудов.[10,11].
Из всех известных к настоящему времени
нейропептидов, которые участвуют в становле
нии как врожденного, так и приобретенного
иммунитета, ВИП наиболее вовлечен в нейро
иммунную регуляцию [7,12,13]. Первым дока
зательством того, что вазоактивный интести
нальный полипептид синтезируется иммуно
компетентыми клетками, явилось обнаружение
ВИПматричной РНК в экстрактах тимуса и
периферических лимфоидных органах млеко
питающих животных и птиц [14]. В лимфоид
ных органах ВИП высвобождается из двух неза
висимых источников: нервных волокон и соб
ственно иммуннокомпетентных клеток, обра
зуя в результате тесную функциональную связь
между нервной и иммунной системами [6,7].
Лимфоциты не только экспрессируют мРНК
вазоактивного интестинального полипептида и
аккумулируют ВИП в цитоплазме, но и выделя
ют его в ответ на различные воспалительные и
митогенные стимулы [15]. Как свидетельствует
анализ литературы, рецепторы к ВИП обнару
жены во многих клетках иммунной системы,
включая макрофаги, дендритные клетки, нейт
рофилы, моноциты, натуральные киллеры, туч
ные клетки, эозинофилы, а также Т и Влим
фоциты [6,7,16,17]. Осуществляя свое биологи
ческое действие на клеткимишени через ВИП
82
1 и ВИП2 рецепторы, вазоактивный интести
нальный полипептид выступает в роли регуля
тора иммунного ответа [6,7]. Эксперименты in
vitro и in vivo показали, что ВИП играет ключе
вую роль в сдвиге баланса Th1 / Th2 в пользу Th2
фенотипа [6,7,12,18]. По некоторым данным
вазоактивный интестинальный полипептид
способствует высвобождению гистамина туч
ными клетками [19]. Отмечено ингибирующее
действие ВИП на продукцию провоспалитель
ных цитокинов: TNFa, ИЛ1b, ИЛ6, ИЛ12
[6,12, 20]. Вазоактивный интестинальный поли
пептид влияет на межтканевую миграцию мак
рофагов, а также вызывает стимуляцию адге
зии и хемотаксиса и ингибирует синтез оксида
азота [6,17]. Важно подчеркнуть, что разные
популяции иммунокомпетентных клеток мо
гут связывать разные подтипы ВИП рецепто
ров, а, следовательно, потенцировать различ
ные реакции [7, 21]. Описано свойство вазоак
тивного интестинального полипептида как эн
догенного противовоспалительного агента. По
лагают, что один из механизмов противовоспа
лительного действия вазоактивного интести
нального полипептида может состоять в редук
ции активности антигенпрезентирующих кле
ток (макрофагов, микроглии) [6,22].
Подавляющее большинство работ касается
изучения иммунореактивности к вазоактивно
му интестинальному полипептиду в централь
ных и периферических органах иммунной сис
темы птиц и млекопитающих животных, а так
же в условиях in vitro; данные об экспрессии
ВИП в иммунной системе человека, в тимусе в
частности, отрывочны, а нередко и противоре
чивы, что свидетельствует об актуальности на
стоящего исследования.
Цель исследования. Изучить экспрессию
вазоaктивного интестинального полипептида в
тимусе человека.
Материал и методы исследования
Объект исследования: аутопсийный матери
ал 34 тимусов человека 2648 лет.
В работе применялась разновидность непря
мого иммуногистохимического метода – имму
нофлуоресцентный метод исследования. Фик
сация материала проводилась в универсальном
растворе для иммуногистохимических исследо
ваний морфологического материала: 2% ра
створе Замбони, включающем параформальде
гид, пикриновую кислоту, одно и двухзаме
щенный фосфаты натрия (рН 7.4). После фик
сации фрагменты тимуса последовательно про
Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°3
Тимус: Динамика экспресии вазоактивного интестинального полипептида в тимусе плодов и новорожденных человека
мывались в 0.1М фосфатном буфере (рН 7.4),
50% этиловом спирте, 0.1 М фосфатном бу
фере (рН 7.4), 20% растворе сахарозы. В пос
леднем растворе образцы ткани находились в
течение 12 часов при температуре 4оС. Серий
ные срезы толщиной 810мкм были приго
товлены из замороженных в 0,9% физиологи
ческом растворе фрагментов тимуса с помо
щью автоматического замораживающего
микротома фирмы «Leica» при температуре 22 оС, смонтированы на покрытых желатином
(2% раствор) предметных стеклах и высуше
ны при комнатной температуре (1820 оС) в
течение 30 минут. Перед проведением иммуно
гистохимических реакций предметные стекла
извлекались из холодильника и подвергались
просушке в открытом помещении при темпе
ратуре 1820оС в течение 30 минут. Затем срезы
дважды промывались в 0.1 М фосфатном буфе
ре (pH 7.4) в течение 20 минут, после чего на
них наносился 10% раствор нормальной козь
ей сыворотки (Dakopatts; X907). Обработан
ные сывороткой препараты помещались в
темную увлажненную камеру на 30 минут.
После удаления сыворотки срезы обрабатыва
лись сывороткой, содержащей поликлональ
ные антитела к вазоактивному интестиналь
ному полипептиду (ВИП, 1:400, VA 1285,
Affinity). Извлеченные из темной увлажненной
камеры по истечении срока инкубации пре
параты дважды по 10 минут промывались в
кюветах с фосфатным буфером (pH 7.4).
После удаления первичных антител срезы об
рабатывались сывороткой, содержащей конъ
югированные с флуорофорами: Cy3 (СуЗтм
GARIgG, 30254, Jackson) вторичные антитела в
разведении 1:100, и затем помещались на 2 часа
в темную увлажненную камеру. После удаления
сыворотки и двукратного промывания в фос
фатном буфере (pH 7.4) срезы заключались в
смесь глицерин/фосфатный буфер (3:1) под по
кровные стекла. Оценка результатов проводи
лась на универсальном фотомикроскопе
Axiophot (“Zeiss”, Германия) с комбинациями
фильтров для Су3 индуцированной иммуно
флуоресценции. Интенсивность иммуногис
тохимической реакции определялась как сла
бая, средняя и сильная. В каждом случае ана
лизировали 10 полей зрения при увеличении
400х. Определялся показатель экспрессии ва
зоактивного интестинального полипептида,
который представлял собой отношение ВИП
иммунореактивных структур к общему ко
личеству клеток в поле зрения, выраженный в
процентах. Статистическую обработку полу
ченных результатов проводили с применением
пакета прикладных программ «STATISTICA»
(Version 6index, Statsoft Inc.).
Результаты и обсуждение
В исследованном тимусе выявлены клеточ
ные и волокнистые структуры, реагирующие с
антителами к вазоактивному интестинальному
полипептиду. Показатель экспрессии ВИП со
ставлял 8,6±0,74%. Различной выраженности
иммунореактивность вазоактивного интести
нального полипептида определялась в эпители
альных клетках, дендритных клетках, тимичес
ких тельцах, а также в нервных волокнах (рис.
1). На срезах вилочковой железы ВИПИР кле
точные структуры, как правило, располагались
одиночно, реже формировали небольшие груп
пы. В состав таких групп входили одинаковые
по величине ВИПиммунореактивные образо
вания или клетки разных размеров. Иммуноре
активные к вазоактивному интестинальному
полипептиду нервные волокна определялись в
капсуле, паренхиме и по ходу сосудов органа.
Интенсивность иммуногистохимической реак
ции к вазоактивному интестинальному поли
пептиду варьировала. Наибольшую интенсив
ность иммуногистохимической реакции прояв
ляли крупные и средние ВИПИР клетки. В раз
личных областях одного среза вилочковой же
лезы количество иммунореактивных к вазоак
тивному интестинальному полипептиду струк
тур также отличалось. Большинство иммуно
реактивных к вазоактивному интестинально
му полипептиду клеток тимуса составляли
эпителиальные клетки телец Гассаля (рис.1).
Как правило, иммунореактивность вазоак
тивного интестинального полипептида эпите
лиоциты тимических телец средней величины.
В непосредственной близости с тельцами Гас
саля отмечались ВИПИР нервные волокна.
Они имели извитой ход и небольшие варикоз
ные утолщения. Вазоактивный интестиналь
ный полипептид в тимических тельцах не
имел четких закономерностей в распределении.
Рядом с ВИП тимическими тельцами просле
живались кровеносные сосуды.
Сравнивая полученные результаты с данны
ми нашего предыдущего исследования экспрес
сии ВИП в тимусе плодов и детей [23], следует
отметить, что в онтогенезе человека вазоактив
ный интестинальный полипептид в тимусе дос
товерно снижается: максимального значения
показатель экспрессии ВИП (26,2 ± 1,83 %) до
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°3
83
А.В. Сокол, В.В. Руденок
Рис. 1. Экспрессия вазоактивного интестинального полипептида в клеточных структурах, тельце Гассаля и
нервных волокнах тимуса. Непрямой иммунофлуоресцентный метод. Ув.: 400.
стигает в тимусе плодов, минимального.
(8,6±0,74%) – в тимусе взрослых. Вазоактивный
интестинальный полипептид может выступать
в роли трофического фактора, изменять кле
точный метаболизм, стимулировать митоти
ческую активность клеток, а также участвовать
в формировании фенотипа клеток иммунной
системы, модифицируя синтез других биоло
гически активных субстанций в развиваю
щихся клетках [5,7]. Можно полагать, что эк
спрессия вазоактивного интестинального поли
пептида является характерным признаком раз
вивающихся и дифференцирующихся клеток
тимуса человека, что подтверждается досто
верно (Р<0,001) большим значением показа
теля экспрессии ВИП в тимусе плодов 26,2 ±
1,83 % и новорожденных 16,4±1,16%
(Р<0,001), по сравнению с показателем эксп
рессии ВИП в тимусе взрослых 8,6±0,74%.
Несмотря на достоверное снижение в тимусе
взрослых показателя экспрессии вазоактив
ного интестинального полипептида по срав
нению с аналогичным показателем в тимусе
плодов и детей, ВИП в тельцах Гассаля у
взрослых сохраняется на высоком уровне. С
учетом данных литературы, свидетельствую
щих о гормонпродуцирующей способности
тимических телец [24]; мы полагаем, что синтез
вазоактивного интестинального полипептида в
тимических тельцах является компенсаторным
ответом организма человека на уменьшение
функционально активной паренхимы органа
вследствие возрастной инволюции.
84
Вазоактивный интестинальный полипептид
оказывает влияние на дифференцировку, созре
вание и пролиферацию тимоцитов, а также
способен индуцировать апоптоз CD4+CD8+
субпопуляции Тлимфоцитов. Действительно, в
процессе иммунного ответа иммунокомпетен
тные клетки и макрофаги под действием цито
кинов способны продуцировать оксид азота,
который в свою очередь является одним из
ключевых активаторов апоптоза [6,13]. Угне
тая синтез оксида азота, вазоактивный интести
нальный полипептид может выполнять протек
торную функцию, ингибируя программиро
ванную гибель клеток. Однако это важное про
текторное свойство ВИП может иметь и нега
тивные для организма человека последствия подавляя гибель аутореактивных клеток вазо
активный интестинальный полипептид спосо
бен инициировать развитие аутоиммунных за
болеваний, таких как аутоиммунный тиреои
дит, миастения, сахарный диабет 1го типа и
других [25]. Снижение ВИП в тимусе взрослого
человека по сравнению с тимусом плодов и но
ворожденных с одинаковой вероятностью мо
жет происходить как за счет уменьшения числа
ВИПИР клеток вследствие их гибели, так и по
причине снижения активности мРНК вазоак
тивного интестинального полипептида в живых
клетках. Вазоактивный интестинальный поли
пептид обладает способностью стимулировать
митотическую активность клеток, повышать
выживание клеток в культуре и способствовать
их селекции. Нейропептид может выступать в
Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°3
Тимус: Динамика экспресии вазоактивного интестинального полипептида в тимусе плодов и новорожденных человека
роли трофического фактора или изменять кле
точный метаболизм, а также участвовать в
формировании дефинитивного фенотипа, мо
дифицируя синтез других биологически актив
ных субстанций в развивающихся клетках
[5,7,12]. Установлено, что ВИП может ингиби
ровать синтез цитокинов (TNFa, ИЛ1І, ИЛ6,
ИЛ12); повышать продукцию ИЛ10; ингиби
ровать экспрессию и способствовать высво
бождению провоспалительных хемокинов; под
держивать долгосрочное выживание Th2 кле
ток; а также снижать фагоцитарную актив
ность макрофагов [6,7,13,15]. Между тем,
нельзя исключить и факт участия вазоактивно
го интестинального полипептида в регуляции
сосудистой системы тимуса, что подтверждает
ся наличием ВИПИР извитых нервных воло
кон с варикозными утолщениями по ходу сосу
дов органа. Как и кальцитонин генродствен
ный пептид, ВИП является потенциальным ва
зодилататором [10,11]. Вызывая расширение
сосудов, вазоактивный интестинальный поли
пептид может опосредовано влиять на транс
порт зрелых Тклеток из тимуса в периферичес
кие органы иммунной системы.
Заключение
Таким образом, полученные данные свиде
тельствуют о наличии вазоактивного интести
нального полипептида в тимусе человека. Экс
прессия ВИП в клеточных структурах, нервных
волокнах и тельцах Гассаля свидетельствует о
сохранении иммунной и нейроэндокринной
функций тимуса на фоне его возрастной инво
люции. Перспективным направлением исследо
ваний может стать дальнейшее изучение биоло
гических свойств вазоактивного интестиналь
ного полипептида в центральных и перифери
ческих органах иммунной системы человека, в
том числе и роли возрастных конформацион
ных перестроек нейропептида в норме и пато
логии. Не исключено, что изомеры ВИП обла
дают неодинаковыми функциями в различных
клеточных популяциях и нервных волокнах ти
муса, включая подавление апоптоза и индук
цию аутоиммунных заболеваний.
Литература
1. Blalock JE. The immune system as the sixth sense. J Intern
Med 2005;257:126–38.
2. Wilson S. Mirelle D. Neuroendocrine Control of Thymus
Physiology. Endocrine Reviews 21(4): 412–443.
3. Henning RJ. Sawmiller DR. Vasoactive intestinal peptide:
cardiovascular effects. Cardiovasc Res. 2001; 49:27–37.
4. Said SI. Vasoactive intestinal peptide. J Endocrinol Invest
1986; 9:191–200.
12. Vetrini F, BrunettiPierri N. Vasoactive intestinal peptide
increases hepatic transduction and reduces innate immune
response following administration of helperdependent. Ng
PMol Ther. 2010; 18(7):133945.
13. Fraccaroli L, Alfieri J, Larocca L, Calafat M, Roca V,
Lombardi E, Ramhorst R, Leirуs CP.Br J Pharmacol. 2009
Jan;156(1):11626. VIP modulates the proinflammatory
maternal response, inducing tolerance to trophoblast cells.
5. De la Fuente M, Delgado M. VIP modulation of immune
cell functions. Adv Neuroimmunol 1996; 6:75–91.
14. Cutz E, Chan W, Track NS, Goth A, and Said SI (1978)
Release of vasoactive intestinal polypeptide in mast cells by
histamine liberators. Nature (Lond) 275: 661–662.
6. Delgado M. Pozo D. The Significance of Vasoactive
Intestinal Peptide in Immunomodulation. Pharmacol Rev
2004; 56:249–290.
15. Martinez C, Delgado M, Abad C, Gomariz RP, Ganea D, and
Leceta J (1999) Regulation of VIP production and secretion by
murine lymphocytes. J Neuroimmunol 93:126–138.
7. Pozo D. Delgado M. The many faces of VIP in
neuroimmunology: a cytokine rather a neuropeptide? FASEB
J 2004; 18(12):13251334.
16. Gomariz RP. Martinez C. Immunology of VIP: a review and
therapeutical perspectives. Curr Pharm Design 2001; 7:89–111.
8. Lundberg P. Lerner UH. Expression and regulatory role of
receptors for vasoactive intestinal peptide in bone cells. Microsc
Res. Tech. 2002; 58:98–103.
9. Delgado M. Ganea D. Vasoactive intestinal peptide prevents
activated microgliainduced neurodegeneration under
inflammatory conditions: potential therapeutic role on brain
trauma. FASEB J 2003; 17:1922–1924.
10. Graf AH. Hutter W. Hacker GW. Steiner H. Anderson V,
Staudach A. et al. Localization and distribution of vasoactive
neuropeptides in the human placenta. Placenta 1996;17:413–
21.
11. Paulus WJ. Paracrine coronary endothelial modulation of
diastolic left ventricular function in man: implications for
diastolic heart failure. J Card Fail 1996;2(Suppl 4):S155–64.
17. Martinez C. Delgado M. et al. Vasoactive intestinal peptide
and pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide modulate
endotoxininduced IL6 production by murine peritoneal
macrophages. J Leukoc Biol 1998; 63:591–601.
18. Ganea D. Rodriguez R. Vasoactive intestinal peptide and
pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide: players in
innate and adaptive immunity. Cell Mol Biol 2003; 49:127–
142.
19. Odum L. Petersen LJ. Skov PS. and Ebskov LB (1998)
Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) is
localized in human dermal neurons and causes histamine release
from skin mast cells. Inflamm Res 47:488–492.
20. Szliter EA. Lighvani S. Barret RP. Hazlett LD. Vasoactive
intestinal peptide balances pro and antiinflammatory cytokines
in the Pseudomonas aeruginosainfected cornea and protects
against corneal protection. J Immunol 2007;178:1105–14.
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2012 N°3
85
А.В. Сокол, В.В. Руденок
21. Pozo D. GonzalezRey E. et al. Tuning immune tolerance
with vasoactive intestinal peptide: a new therapeutic
approach for immune disorders. Peptides. 2007 September ;
28(9): 1833–1846
22. Delgado M, MunozEl1ґas EJ, Gomariz RP, and Ganea D
(1999g) Vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate
cyclaseactivating polypeptide prevent inducible nitric oxide
synthase transcription in macrophages by inhibiting NFkB
and IFN regulatory factor 1 activation. J Immunol
162:4685–4696
23. Сокол А.В. Руденок В.В. Динамика экспрессии вазоак
тивного интестинального полипептида в тимусе челове
ка. Военная медицина. 2012 (2) С. 110112
24. Zaitseva M. Kawamura, et al. Stromalderived factor 1 expression
in the human thymus J. Immunol 2002; 168, 2609–2617.
25. Roudenok V. Nikitski A. Sokol A. Alteration of vasoactive
intestinal polypeptide, substance P and heuropeptide Y expression in
the human thymus after chronic thyroiditis. The 6th International
Symposium of Nagasaki University Glabal COE “Glоbal strategic
Center for Radiation Health Risk Control”. 2011. – P. 103104.
Сведения об авторах:
Руденок В.В. Адрес: Белорусский государственный медицинский университет, кафедра нормальной анатомии, пр. Дзержинского, 83, 220116, Минск,
Беларусь. E(mail: roudenok@bsmu.by
Поступила 12.07.2012 г.
86
Immunopathology, Allergology, Infectology 2012 N°3