005411 Предпосылки к созданию изобретения

005411
Предпосылки к созданию изобретения
Настоящее изобретение относится к новому лиганду и полипептидам, которые являются членами
семейства факторов некроза опухоли. Сокращенно этот новый лиганд обозначается как April, от "A Proliferation Inducing Ligand" (Лиганд, индуцирующий пролиферацию). Эти белки или их рецепторы могут
найти применение в качестве противоопухолевой и/или иммунорегулирующей терапии. Помимо этого,
клетки, трансфицированные генами этих новых лигандов, могут применяться для генной терапии опухолей, аутоиммунных и воспалительных заболеваний или наследственных генетических нарушений, а блокирующие эти белки антитела могут применяться в качестве иммунорегуляторов.
Цитокины, относящиеся к факторам некроза опухоли (TNF), представляют из себя медиаторы защиты и иммунной регуляции организма. Члены этого семейства прикреплены к мембранам, действуя
локально путем прямого контакта клеток, или существуют в форме секретируемых белков, способных
диффундировать к более отдаленным мишеням. Параллельное семейство рецепторов сигнализирует о
наличии этих молекул, что приводит к инициации гибели клеток или пролиферации и дифференцировке
клеток в ткани-мишени. В настоящее время в семейство лигандов и рецепторов TNF входит, по меньшей
мере, 13 установленных пар рецептор-лиганд, включая TNF:TNF-R; LT-α:TNF-R; LT-α/β: LT-β-R;
FasL:Fas; CD40L:CD40; CD30L:CD30; CD27L:CD27; OX40L:OX40 и 4-1BBL:4-1BB; trance/rankL:Light
and Tweak. Последовательности ДНК, кодирующие эти лиганды, идентичны только приблизительно на
25-30% даже в наиболее родственных случаях, хотя родство по аминокислотам составляет около 50%.
Определяющий признак этого семейства цитокиновых рецепторов обнаружен во внеклеточном домене, богатом цистеином, который был первоначально обнаружен путем молекулярного клонирования
двух отличающихся друг от друга рецепторов TNF.i Это семейство генов кодирует гликопротеины, характерные для трансмембранных белков типа I, имеющих внеклеточный домен для связывания с лигандом, единственный мембранный перекрывающий участок и цитоплазматический участок, участвующий
в активировании клеточных функций. Этот участок связывания с лигандом, богатый цистеином, представляет из себя прочно связанный дисульфидным мостиком сердцевинный домен, который, в зависимости от конкретного члена семейства, многократно повторяется. Большинство рецепторов имеют четыре
домена, хотя их может быть всего три или целых шесть.
Белки из семейства лигандов TNF имеют короткую N-концевую последовательность обычно коротких гидрофильных аминокислот, часто содержащую несколько остатков лизина или аргинина, которые,
как предполагают, служат последовательностями, останавливающими передачу. Далее следует трансмембранный участок и внеклеточный участок различной длины, который отделяет С-концевой домен
связывания рецептора от мембраны. Этот участок иногда называют "стеблем". С-концевой участок связывания включает массив белка и часто, но не всегда, сайты гликозилирования. У этих генов нет классической характеристики сигнальных последовательностей мембранных белков типа I, мембранных белков
типа II с С-концевым доменом, лежащим снаружи клетки, и короткого N-концевого участка, который
располагается в цитоплазме. В некоторых случаях, например, TNF и LT-α, расщепление в районе стебля
может наблюдаться на ранних стадиях преобразований белка, и лиганд затем обнаруживается главным
образом в секретированной форме. Большинство лигандов, однако, существует в мембранной форме,
опосредуя локализованное прохождение сигнала.
Структура этих лигандов хорошо известна благодаря кристаллографическим анализам TNF, LT-α и
CD40L. TNF и лимфотоксин-α (Lt-α) оба построены по типу сандвича, состоящего из двух антипараллельных листков со складкой типа β и топологией типа "jelly roll" или "греческий ключ"ii. Среднеквадратичное отклонение между остатками Cα, и β составляет 0,61 С, что предполагает высокую степень идентичности их молекулярного строения. Структурной чертой, установленной в результате молекулярных
исследований CD40L, TNF и LT-α, является их склонность объединяться в олигомерные комплексы.
Олигомерной структуре присуще формирование сайта связывания с рецепторами в месте соединения
между соседними субъединицами, образующими мультивалентный лиганд. По результатам анализа кристаллической структуры было установлено, что четвертичные структуры TNF, CD40L и LT-α существуют в форме тримеров. Многие аминокислоты, сохраняющиеся между различными лигандами, находятся
в последовательностях составляющего основу β-листка. Вероятно, основная структура типа сандвича
сохраняется во всех этих молекулах, поскольку части этих основных последовательностей сохраняются у
различных членов семейства. Четвертичная структура также может поддерживаться, поскольку взаимное
расположение субъединиц, как представляется, остается идентичным.
Члены семейства TNF можно наиболее удачно охарактеризовать как главные переключатели в иммунной системе, контролирующей как выживание, так и дифференцировку клеток. Только TNF и LT-α в
настоящее время считаются секретируемыми цитокинами, в противоположность другим членам семейства TNF, которые преимущественно прикреплены к мембранам. В то время как мембранная форма TNF
хорошо описана и, вероятно, играет уникальные биологические роли, секретируемые TNF функционируют как главный сигнал тревоги для клеток, которые более отдалены от места пускового события. Таким образом, секреция TNF может усиливать процессы, приводящие к хорошо описанным изменениям в
выстилке сосудов и воспалительном состоянии клеток. Напротив, привязанные к мембранам члены этого
-1-
005411
семейства посылают сигналы через рецепторы типа TNF только клеткам, находящимся в прямом контакте. Например, Т-клетки обеспечивают СD40-опосредованную "помощь" только В-клеткам, находящимся
в прямом контакте через известные взаимодействия TCR. Сходные ограничения способности индуцировать гибель клеток в силу контакта клетка-клетка относятся и к хорошо изученной системе Fаs.
Представляется возможным разделение лигандов TNF на три группы по признаку их способности
индуцировать гибель клеток. Во-первых, TNF, лиганд Fas и TRAIL могут эффективно индуцировать гибель клеток многих линий, а их рецепторы, наиболее вероятно, имеют хорошие классические домены
гибели. Предположительно, лиганд к DR-3 (TRAMP/WSL-1) также целиком подпадает под эту категорию. Далее, существуют лиганды, которые запускают более слабый сигнал гибели, который ограничивается несколькими типами клеток, и TWEAK, лиганд CD30, а также LTα1β2 являются примерами этого
класса. Каким образом эта группа может запускать гибель клеток в отсутствие классического домена
гибели представляет из себя интересную проблему и предполагает, что существует особый механизм
более слабого сигнала клеточной гибели. И наконец, существуют члены семейства, которые не могут
эффективно передавать сигнал гибели. Возможно, все эти группы могут обладать антипролиферативным
действием на некоторые типы клеток после индуцирования клеточной дифференцировки, например,
CD40 (Funakoshi et al., 1994).
За последние несколько лет численность семейства TNF резко возросла и охватывает по меньшей
мере 11 разных путей прохождения сигналов, участвующих в регуляции иммунной системы. Широко
распространенная экспрессия TWEAK и TRAIL свидетельствует о существовании еще не открытого
функционального многообразия этого семейства. Этот аспект недавно был освещен особо в связи с открытием двух рецепторов, влияющих на способность вирусов саркомы Рауса и простого герпеса реплицировать, а также в связи с историческими наблюдениями, касающимися того факта, что TNF обладает
противовирусной активностью, а поксвирусы кодируют ловушку рецепторов TNF (Brojatsch et al., 1996;
Montgomery et al., 1996; Smith, 1994; Vassali, 1992). TNF является медиатором септического шока и кахексииiii и участвует в регуляции развития клеток гемопоэза.iv Представляется, что он играет главную
роль в качестве медиатора воспаления и защиты от бактериальных, вирусных и паразитарных инфекцийv,
а также обладает противоопухолевой активностью.vi TNF также участвует в различных аутоиммунных
заболеваниях.vii TNF может вырабатываться несколькими типами клеток, включая макрофаги, фибробласты, Т-клетки и натуральные киллеры.viii TNF связывается с двумя различными рецепторами, каждый из
которых действует через посредство специфичных внутриклеточных сигнальных молекул, что приводит
к проявлению различных эффектов TNF.ix TNF может существовать как в мембраносвязанной форме, так
и в форме растворимого секретируемого цитокина.x
LT-α имеет много общих с TNF свойств, например, связывается с рецепторами TNFxi, но в отличие
от TNF, как представляется, секретируется преимущественно активированными Т-клетками и некоторыми β-лимфобластоидными опухолями.xii Гетеромерный комплекс LT-α и LT-β представляет из себя мембраносвязанный комплекс, который связывается с рецептором LT-β.xiii Система LT (LT и LT-R), как
представляется, участвует в развитии периферических лимфоидных органов, поскольку генетический
разрыв LT-β приводит к дезорганизации Т- и В-клеток в селезенке и их отсутствию в лимфатических
узлах.xiv Система LT-β участвует также в гибели клеток некоторых линий клеток аденокарциномы.xv
Fas-L, другой член семейства TNF, экспрессируется преимущественно активированными Тклетками.xvi Он индуцирует гибель клеток, которые несут его рецептор, включая опухолевые клетки и
клетки, инфицированные ВИЧ, посредством механизма, известного как запрограммированная смерть
клетки, или апоптоз.xvii Помимо этого, дефицит как Fas, так и Fas-L может приводить к лимфопролиферативным нарушениям, что подтверждает роль системы Fas в регуляции иммунных ответов.xviii Система Fas
участвует также в повреждении печени при хроническом инфекционном гепатитеxix и в аутоиммунитете
у ВИЧ-инфицированных пациентов.хх Система Fas участвует также в разрушении Т-клеток у ВИЧинфицированных пациентов.ххi TRAIL, другой член этого семейства, также, как представляется, участвует в гибели широкого ряда трансформированных клеточных линий различного происхождения.ххii
CD40-L, другой член семейства TNF, экспрессируется Т-клетками и индуцирует регуляцию Вклеток, несущих CD40.xxiii Помимо этого, изменения в гене CD40-L приводят к заболеванию, известному
как Х-связанный гипер-IgM синдром.xxiv Система CD40-L также участвует в различных аутоиммунных
заболеванияхxxv, a CD40-L, как известно, обладает противовирусными свойствами.xxvi Несмотря на то, что
система CD40-L участвует в спасении апоптотических В-клеток,xxvii в неиммунных клетках он индуцирует апоптоз.xxviii Многие дополнительные лимфоцитарные члены семейства TNF также участвуют в костимуляции.xxix
В общем, члены семейства TNF играют фундаментальные регуляторные роли при контролировании
иммунной системы и активировании систем экстренной защиты хозяина. Признавая имеющийся в настоящее время прогресс в манипулировании членами семейства TNF с точки зрения терапевтических
преимуществ, считают весьма вероятным, что члены этого семейства могут предоставить уникальное
средство борьбы с болезнями. Некоторые из лигандов из этого семейства могут прямо индуцировать
апоптотическую гибель многих трансформированных клеток, например, LT, TNF, лиганд Fas и TRIAL
-2-
005411
(Nagata, 1997). Активация рецепторов Fas и, возможно, TNF и CD30, может индуцировать гибель нетрансформированных лимфоцитов, что может выполнять определенную иммунорегулирующую функцию (Amakava et al., 1996; Nagata, 1997; Sytwu et al., 1996; Zheng et al., 1995). В целом, процесс гибели
запускает агрегация доменов гибели, которые располагаются на рецепторах TNF со стороны цитоплазмы. Домен смерти координирует согласованное действие различных преобразователей сигнала, что приводит к активации каскада каспазы (Nagata, 1997). У некоторых рецепторов нет классических доменов
гибели, например, рецептор LTb и CD30 (Browning et al., 1996; Lee et al., 1996) еще могут индуцировать
клеточную гибель, хотя и в более слабой степени. Возможно, эти рецепторы работают, прежде всего, для
индуцирования дифференцировки клеток, а гибель является аберрантным последствием в некоторых
трансформированных клеточных линиях, хотя эта картина неясна, поскольку исследования на мышах, не
имеющих CD30, предполагают роль клеточной гибели в отрицательной селекции в тимусе (Amakawa et
al., 1996). Наоборот, для выживания клеток необходимо прохождение сигнала через другие пути, такие
как CD40. Таким образом, существует потребность идентифицировать и изучить свойства других молекул, являющихся членами семейства TNF, для того, чтобы получить дополнительное средство для контроля заболеваний и управления иммунной системой.
Было высказано предположение о том, что определенные члены семейства TNF могут иметь преимущества в качестве терапевтических противоопухолевых агентов, например, в комбинации с IL-2 (cм.,
например, патент США № 5 425 940). Однако, в настоящее время не существует полностью удовлетворительного лечения злокачественных опухолей. Комбинированная химиотерапия широко применяется в
клинике и в исследованиях, например, антиметаболиты, алкилирующие агенты, антибиотики, системные
яды и т.п. Такие лекарственные средства вводят по отдельности или в комбинации, в попытке получить
цитотоксический эффект в отношении злокачественных опухолей и/или сократить или устранить появление клеток, резистентных к лекарствам, а также сократить побочные эффекты.
Сущность изобретения
Соответственно, настоящее изобретение относится к новому полипептиду, называемому APRIL, который практически не имеет одной или более проблем, связанных с ограничениями и недостатками прототипов. Авторы настоящего изобретения открыли новый член семейства цитокинов TNF и определили
аминокислотную последовательность этого белка как у мыши, так и у человека, а также последовательности ДНК, кодирующие эти белки. Заявляемое изобретение может применяться для идентификации
новых диагностических и терапевтических средств для лечения многочисленных заболеваний и состояний, как обсуждается более подробно ниже, а также для получения информации и управления иммунной
системой и ее процессами. Помимо этого, настоящее изобретение может участвовать в индуцировании
клеточной гибели в злокачественных опухолях.
Дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут перечислены в описании
ниже, и частично будут понятны из этого описания или могут изучаться при практическом осуществлении настоящего изобретения. Цели и другие преимущества настоящего изобретения будут реализованы и
достигнуты с помощью композиций и способов, конкретно указанных в описании и формуле изобретения настоящего документа, а также с помощью прилагаемых рисунков.
Таким образом, для достижения этих и других преимуществ, и в соответствии с целью настоящего
изобретения, как это осуществлено и подробно описано в настоящем документе, настоящее изобретение
включает последовательности ДНК, кодирующие APRIL. Конкретно, настоящее изобретение относится к
последовательностям ДНК, кодирующим APRIL человека (SEQ ID NO: 1). Помимо этого, заявленное
изобретение относится к аминокислотным последовательностям этого нового лиганда. Аминокислотная
последовательность APRIL человека описана в SEQ ID NO: 2. Кроме того, авторы настоящего изобретения представили в настоящем документе последовательности ДНК и аминокислот для APRIL мыши, в
SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к последовательностям, которые по меньшей мере на 50% гомологичны последовательностям ДНК, кодирующим С-концевой связывающий рецептор домен этого лиганда, и при гибридизации с
заявленными последовательностями ДНК или их фрагментами, и которые кодируют APRIL, имеющий
последовательность SEQ ID NO: 1, или белок, обладающий аналогичной биологической активностью.
Настоящее изобретение в некоторых вариантах осуществления относится к последовательностям
ДНК, кодирующим APRIL, в которых эти последовательности оперативно связаны с последовательностью контроля экспрессии. Любые последовательности контроля экспрессии пригодны для использования в заявленном изобретении и легко могут быть подобраны специалистом.
Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные ДНК, включающие последовательность,
кодирующую APRIL или его фрагменты, а также хозяев со стабильно интегрированными последовательностями APRIL, внедренными в их геном, или обладающих эписомальными элементами. Любой подходящий хозяин пригоден для использования в заявленном изобретении и легко может быть выбран специалистом без ненужного экспериментирования.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения практически чистых APRIL, которые включают этап культивирования трансформированных хозяев. Еще в
-3-
005411
одних вариантах осуществления настоящее изобретение относится к APRIL, практически не содержащему обычно связанных с ним животных белков.
Настоящее изобретение охватывает лиганды APRIL, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, а также их фрагменты или гомологи. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотные и/или ДНК последовательности могут включать консервативные
вставки, делеции и замещения, как дополнительно определяется ниже, или могут включать фрагменты
указанных последовательностей.
Настоящее изобретение относится в других вариантах осуществления к растворимым конструкциям, включающим APRIL, которые могут применяться для непосредственного запуска опосредованных
APRIL фармакологических событий. Такие события могут иметь терапевтические преимущества при
стимуляции роста, лечении злокачественных и иных опухолей или для управления иммунной системой с
целью лечения заболеваний иммунной природы. Растворимые формы заявленных лигандов могут быть
методами генной инженерии помечены любой легко распознаваемой меткой, что облегчает выявление
рецепторов этих лигандов.
Помимо этого, некоторые варианты осуществления относятся к антителам против APRIL и их применению для лечения злокачественных и иных опухолей или для управления иммунной системой с целью лечения заболеваний иммунной природы.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам генной терапии
с помощью генов APRIL, как описано и заявлено в настоящем документе.
Фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут, необязательно, включать фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, наполнители или другие фармацевтические композиции и
могут вводиться в любой из многочисленных форм или с помощью любого пути, известных специалистам.
Следует понимать, что как приведенное общее описание, так и следующее ниже подробное описание представляют из себя примеры и служат для объяснения заявленного изобретения.
Прилагаемые рисунки включены в это описание для облегчения понимания настоящего изобретения в качестве составной части, иллюстрируют несколько вариантов осуществления настоящего изобретения и вместе с описанием служат для объяснения главных положений настоящего изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. (А) Предсказанная аминокислотная последовательность APRIL человека. Обозначены:
предсказанный трансмембранный участок (ТМ, в рамке), потенциальный N-связанный сайт гликозилирования (звездочка) и N-конец рекомбинантного растворимого APRIL (sAPRIL). (В) Сравнение внеклеточной белковой последовательности APRIL и некоторых членов семейства лигандов TNF. Идентичные
и гомологичные остатки изображены в черном цвете и в заштрихованной рамке, соответственно. TNFa
(фактор некроза опухолей-α), LTa (лимфотоксин-α), FasL (лиганд Fas (CD95)), TRAIL, TWEAK,
TRANCE (лиганд RANK).
Фиг. 2. Экспрессия APRIL (А) Нозерн-блоттинг (2 мкг поли А+ РНК на образец) различных тканей
человека проводился с кДНК APRIL. (В) Экспрессия мРНК APRIL в различных линиях опухолевых клеток: промиелоцитного лейкоза HL 60; HeLa Cell S3; хронического миелолейкоза К562; лимфобластного
лейкоза Molt-4; лимфомы Беркитта Raji; колоректальной аденокарциномы А459; меланомы G361. (С)
Экспрессия мРНК APRIL в четырех различных опухолях (Т) и нормальных тканях (N) человека. Полоса
18S рРНК показывает равную загрузку. (D) Экспрессия мРНК APRIL в первичном раке толстого кишечника человека. Гибридизация in situ обнаружила избыточное присутствие APRIL при раке толстого кишечника человека по сравнению с нормальной тканью толстого кишечника. Срезы опухолевой ткани и
прилегающая к ней нормальная ткань толстого кишечника были подвергнуты гибридизации на античувствительность к 35S-меченной рРНК APRIL и, в качестве контроля, срезы опухолевой ткани толстого кишечника были подвергнуты гибридизации на чувствительность к 35S-меченной рРНК APRIL (отрицательный контроль). Верхние панели представляют микрофотографии в темном поле, а нижние панели
представляют микрофотографии в освещенном поле.
Фиг. 3. APRIL стимулирует рост клеток. (А) Дозозависимое усиление пролиферации Jurkat лейкозных (Т-клеток человека), определенное через 24 ч после добавления растворимого APRIL. Контролями
являются лиганд Fas (FasL), TWEAK и отсутствие лиганда (Контроль) (левая панель, жизнеспособность
клеток; правая панель, инкорпорация 3H-тимидина). (В) Влияние иммунного истощения FLAGмеченного APRIL на рост опухолевых клеток. Пролиферативный эффект FLAG-меченного APRIL нейтрализован анти-FLAG антителами, но не анти-myc антителами. (С) Влияние APRIL на скорость пролиферации Raji (В-клеток лимфомы Беркитта человека), А20 (мышиная В-лимфома), BJAB (В-лимфома
человека), COS (эпителиальные клетки собаки), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека),
HeLa (эпителиоидная карцинома человека) и МЕ260 (меланома человека). (D) Влияние концентрации
сыворотки плода коровы на индуцированную APRIL пролиферацию клеток Jurkat.
Фиг. 4. APRIL ускоряет рост опухоли. (А) Характеристика APRIL-трансфицированных клонов NIH3T3. Уровни FLAG-APRIL в различных клонах анализировали с помощью вестерн-блоттинга с антиFLAG антителами. Стрелка показывает на белок APRIL, этот высокомолекулярный белок выявлен не-4-
005411
специфическим образом. (В) Клоны NIH-3T3, экспрессирующие APRIL, растут быстрее клонов, трансфицированных mock. (С) Повышенный опухолевый рост клонов NIH-3T3, экспрессирующих APRIL.
Клетки NIH-3T3 (1х105 клеток) и трансфектанты APRIL (NIH-AP, 2 различных клона) (1х106 клеток)
инъецировали подкожно бестимусным мышам, и следили за ростом опухоли.
Фиг. 5. Приводятся аминокислотные последовательности APRIL человека и мыши; показана существенная идентичность этих двух белков. Идентичные остатки обозначены точками поверх знаков. Подчеркнутые остатки представляют потенциальный N-связанный сайт гликозилирования. Начальный метионин считается вероятным стартовым сайтом, однако, возможно, что в рамке метионины, расположенные далее в последовательности, могут служить истинным стартовым сайтом, например, в последовательности человека.
Подробное описание
Ниже подробно рассматриваются предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Настоящее изобретение относится к последовательностям ДНК, которые кодируют APRIL человека или мыши, его фрагменты и гомологи, и к экспрессии этих последовательностей ДНК хозяином,
трансформированным с их помощью. Настоящее изобретение относится к применению этих последовательностей ДНК и пептидам, которые ими кодируются. Помимо этого, настоящее изобретение охватывает аминокислотные последовательности APRIL или его фрагментов у человека и мыши, а также фармацевтические композиции, включающие их или полученные из них. Настоящее изобретение относится к
способам стимуляции клеточного роста с помощью APRIL или, альтернативно, к способам ингибирования опухолеобразования с помощью антител против APRIL или рецепторов APRIL.
А. Определения.
Термин "гомологичная" используется в настоящем документе для обозначения сходства между последовательностями сравниваемых молекул. Если позиция в двух сравниваемых последовательностях
занимает один и тот же основный или аминокислотный мономер, например, если позиция в каждой из
двух молекул ДНК занята аденином, то эти молекулы являются гомологичными по этой позиции. Процент гомологичности двух последовательностей представляет из себя функцию от числа пар или гомологичных позиций, общих для двух последовательностей, разделенного на число сравниваемых позиций х
100. Например, если 6 из 10 позиций в двух последовательностях парные или гомологичные, то эти две
последовательности гомологичны на 60%. Например, последовательности ДНК ATTGCC и TATGGC
гомологичны на 50%. Обычно сравнение производят при выравнивании двух последовательностей, чтобы получить максимальную гомологичность.
Используемый в настоящем документе термин "злокачественная опухоль" относится к любому неопластическому процессу, включая такие заболевания клеток как, например, рак почки, саркома Калоши,
хронический лейкоз, рак молочной железы, саркома, рак яичников, рак прямой кишки, рак горла, меланома, рак толстого кишечника, рак мочевого пузыря, мастоцитома, рак легкого, аденокарцинома молочной железы, плоскоклеточный рак глотки и гастроинтестинальный рак или рак желудка. Предпочтительно, злокачественная опухоль представляет лейкоз, мастоцитому, меланому, лимфому, аденокарциному
молочной железы и плоскоклеточный рак глотки.
"Очищенный препарат" или "практически чистый препарат" полипептида в настоящем документе
означает полипептид, который был отделен от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми он обычно встречается. Предпочтительно, полипептид также отделен и от других веществ, например,
антител, матриц и т.п., которые применяются при его очистке.
"Трансформированный хозяин" в настоящем документе обозначает любого хозяина со стабильно
интегрированной последовательностью, т.е., последовательностью, кодирующей APRIL, внедренной в
его геном.
"Лечение" в настоящем документе означает любое лечебное воздействие, например, введение терапевтического агента или вещества, например, лекарственного средства.
"Практически чистая нуклеиновая кислота", например, практически чистая ДНК, представляет из
себя нуклеиновую кислоту, обладающую одним из двух следующих качеств или ими обоими: (1) не соприкасается непосредственно с одной или обеими последовательностями, например, кодирующими последовательностями, с которыми она непосредственно соприкасается (т.е., одна на конце 5’ и одна на
конце 3') в естественном геноме организма, из которого эта нуклеиновая кислота получена; (2) практически не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, с которой она встречается в организме, из
которого эта нуклеиновая кислота получена. Этот термин включает, например, рекомбинантную ДНК,
которую инкорпорируют в вектор, например, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в
геномную ДНК прокариота или эукариота, или которая существует в виде отдельной молекулы (например, фрагмент кДНК или геномной ДНК, полученные с помощью ПЦР или методики рестрикции эндонуклеазы), не зависимой от других последовательностей ДНК. Практически чистая ДНК включает также
рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего APRIL.
Термин "пептиды", "белки" и "полипептиды" в настоящем документе используются взаимозаменяемым образом.
-5-
005411
"Биологически активный" в настоящем документе означает имеющий in vivo или in vitro активность, которая может осуществляться прямо или косвенно. Биологически активные фрагменты APRIL
могут иметь, например, 70% гомологичность по аминокислотному составу с активным сайтом APRIL,
более предпочтительно, по меньшей мере 80%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90% гомологичность. Идентичность или гомологичность применительно к APRIL, как определено в настоящем
документе, представляет из себя процентную долю аминокислотных остатков в последовательностикандидате, которые идентичны этим остаткам в APRIL SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.
"Лиганд" в настоящем документе целиком относится к APRIL. Практика настоящего изобретения
применяет, если не указано иное, обычные методики клеточной биологии, клеточных культур, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые
находятся в компетенции специалистов в этих областях. Такие методики описаны в научной литературе.
Введение.
APRIL, новый член семейства TNF, подробно описан в настоящем документе. Авторы настоящего
изобретения установили, что транскрипция APRIL в нормальных тканях находится на низком уровне, в
то время как в нескольких линиях опухолевых клеток, а также раковых опухолях толстого кишечника,
метастатических лимфомах и опухолях щитовидной железы находят высокие уровни мРНК. In vitro добавление рекомбинантного APRIL стимулирует пролиферацию различных клеточных линий. Более того,
трансфекция APRIL в клетки NIH-3T3 резко ускоряет рост опухоли у бестимусных мышей при сравнении с трансфектантами mock. Экспрессия и стимулирующий рост эффект APRIL в отношении опухолевых клеток in vitro и in vivo предполагают, что APRIL участвует в опухолеобразовании.
APRIL, как представляется, является уникальным среди членов семейства TNF, поскольку он экспрессируется в опухолевых клетках в избыточном количестве и стимулирует рост многих различных
линий опухолевых клеток, что свидетельствует о его очевидной роли в опухолеобразовании; антагонистические антитела против APRIL или рецепторов APRIL могут создать новые подходы к лечению рака.
В. Последовательности ДНК по настоящему изобретению.
Как описано в настоящем документе, одним из аспектов настоящего изобретения является практически чистая нуклеиновая кислота, которая включает нуклеотидную последовательность, кодирующую
APRIL, такая как ДНК, описанная в последовательности SEQ ID NO: 1, и/или эквиваленты таких нуклеиновых кислот. Используемый в настоящем документе термин "нуклеиновая кислота" может включать
фрагменты и эквиваленты, такие как, например, последовательности, кодирующие функционально эквивалентные пептиды. Эквивалентные последовательности нуклеотидов могут включать последовательности, которые отличаются по одному или более нуклеотидных заместителей, добавлений или делеций,
такие как аллельные варианты, мутации и т.п. и включают последовательности, которые отличаются от
нуклеотидной последовательности, кодирующей APRIL, которая представлена последовательностью
SEQ ID NO: 1, в силу вырожденности генетического кода.
Настоящее изобретение будет описано преимущественно относительно последовательностей человека, хотя опытный специалист поймет, что последовательности мыши или последовательности, кодирующие APRIL, других видов животных, обладающих высокой степенью гомологичности в отношении
человека, также попадают в объем настоящего изобретения. Как представляется, человеческие белки
обладают всеми характеристиками семейства TNF, т.е. организацией мембранного белка типа II и сохранением основных мотивов последовательностей, участвующих в укладке белка в свойственную TNF антипараллельную структуру, состоящую из β-листков.
Последовательности по настоящему изобретению могут использоваться для изготовления серий
ДНК-зондов, которые пригодны для скрининга различных коллекций нативных и синтетических ДНК на
предмет наличия последовательностей ДНК, которые являются близкородственными к APRIL или его
фрагментам или производным. Опытный специалист поймет, что упоминание APRIL в настоящем документе относится также к его биологически активным производным, фрагментам или гомологам.
Последовательности ДНК по настоящему изобретению, кодирующие APRIL, могут применяться
для изготовления заявленных пептидов путем экспрессии их в различных прокариотических и эукариотических хозяевах, трансформированных ими. Эти пептиды могут применяться в качестве противоопухолевых и иммунорегулирующих агентов. В общем, этот процесс включает этапы культивирования хозяина, трансформированного молекулой ДНК, содержащей последовательность, кодирующую APRIL,
оперативно связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию.
Последовательности ДНК и молекулы рекомбинантной ДНК по настоящему изобретению могут
экспрессироваться с использованием большого разнообразия комбинаций хозяин/вектор. Например,
подходящие векторы могут состоять из сегментов хромосомных, нехромосомных или синтетических
последовательностей ДНК. Экспрессирующие векторы по настоящему изобретению характеризуются по
меньшей мере одной последовательностью, контролирующей экспрессию, которая может быть оперативно связана с последовательностью ДНК APRIL, вставленной в вектор, с целью контроля и регуляции
экспрессии последовательности ДНК.
Помимо этого, в каждом экспрессирующем векторе могут быть выбраны различные сайты для
вставки в последовательность по настоящему изобретению. Эти сайты обычно определяются путем рест-6-
005411
рикции эндонуклеазой, которая их разрезает, и эти сайты и эндонуклеазы также известны специалистам.
Следует, разумеется, понимать, что экпрессирующий вектор, пригодный для настоящего изобретения, не
нуждается в сайте рестрикции эндонуклеазы для вставки в желаемый фрагмент ДНК. Вместо этого вектор может быть клонирован в этот фрагмент альтернативными средствами. Экспрессирующий вектор и,
в частности, сайт, выбранный в нем для вставки выбранного фрагмента ДНК, и его оперативное связывание с последовательностью контроля экспрессии, определяются множеством факторов. Эти факторы
включают, но не ограничиваются, размер белка, который будет экспрессироваться, чувствительность
желаемого белка к протеолитическому расщеплению ферментами клеток хозяина, количество сайтов,
чувствительных к определенному ферменту рестрикции, контаминацию или связывание белка, который
будет экспрессироваться, с белками клеток хозяина, которые, может оказаться, трудно будет удалить во
время очистки. Дополнительные факторы, которые могут приниматься во внимание, включают характеристики экспрессии, такие как расположение стартового и стоп-кодона относительно векторных последовательностей, и другие факторы, которые известны опытным специалистам. Выбор вектора и места
вставки для заявленных последовательностей ДНК определяются оптимальным балансом этих факторов;
при этом не каждый выбор будет эффективным для желаемого применения. Однако для специалиста является обычной практикой анализ этих параметров и выбор подходящей системы в зависимости от конкретного применения.
Специалист может легко осуществлять подходящие модификации последовательностей контроля
экспрессии для получения более высоких уровней экспрессии белка, т.е., замены кодонов или выбор кодонов для конкретных аминокислот, которые предпочтительно используются конкретными организмами,
для минимизации протеолиза или изменения композиции гликозилирования. Подобно этому, цистеины
можно заменять на другие аминокислоты для упрощения выработки, повторной укладки или проблем
стабильности.
Таким образом, не все комбинации хозяин/экспрессирующий вектор функционируют с одинаковой
эффективностью при экспрессировании последовательностей ДНК по настоящему изобретению. Однако
конкретный выбор комбинации хозяин/экспрессирующий вектор может осуществляться специалистом.
Факторы, которые должны быть приняты во внимание, включают, например, совместимость хозяина и
вектора, токсичность белков, кодируемых последовательностью ДНК, для хозяина, простоту восстановления желаемого белка, характеристики экспрессии последовательностей ДНК и последовательностей
контроля экспрессии, оперативно связанных с ними, биологическую безопасность, стоимость, а также
укладку, форму иди другие постэкспрессионные модификации желаемого белка.
APRIL, вырабатываемый хозяевами, трансформированными последовательностями по настоящему
изобретению, а также нативный APRIL, очищенный по способу настоящего изобретения, или изготовленный по заявленным последовательностям аминокислот, пригодны для множества композиций и способов для противоракового, противоопухолевого и иммунорегулирующего применения. Они пригодны
также для лечения и способов применения при других заболеваниях.
Настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, описанным в настоящем документе, для экспрессии APRIL в условиях патологии, т.е., при проведении генной терапии. Помимо этого, APRIL может экспрессироваться в опухолевых клетках под управлением промоторов, подходящих
для такого применения. Такая экспрессия может усилить противоопухолевый иммунный ответ или непосредственно воздействовать на выживание опухоли. APRIL также, вероятно, воздействует на выживание
пересаженного органа путем изменения местного иммунного ответа. В этом случае сам трансплантат или
окружающие его клетки следует модифицировать геном, полученным с помощью генной инженерии,
который кодирует APRIL.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей любой APRIL, в "антисмысловой" терапии. Используемый в настоящем документе термин "антисмысловая" терапия относится к введению или выработке in situ олигонуклеотидов или их
производных, которые специфичным образом гибридизуются в условиях клетки с клеточной мРНК и/или
ДНК, кодирующей нужную последовательность APRIL, так, чтобы подавлять экспрессию кодируемого
белка, т.е., путем ингибирования транскрипции и/или трансляции. Связывание может происходить на
основе обычной комплементарности пар, или, например, в случае связывания с двойной ДНК, через специфичные взаимодействия в большой бороздке двойной спирали. В целом, "антисмысловая" терапия
относится к ряду методик, которые обычно применяются в данной области, и включает любую терапию,
которая основывается на специфичном связывании с олигонуклеотидными последовательностями.
Антисмысловая конструкция по настоящему изобретению может доставляться, например, в качестве экспрессирующей плазмиды, которая, будучи транскрибированной в клетке, производит РНК, которая
является комплементарной по отношению, по меньшей мере, к части клеточной мРНК, которая кодирует
APRIL. Альтернативно, антисмысловая конструкция может представлять из себя олигонуклеотидный
зонд, который вырабатывается ex vivo. Такие олигонуклеотидные зонды предпочтительно представляют
из себя модифицированные олигонуклеотиды, которые являются устойчивыми к эндогенным нуклеазам
и, следовательно, стабильными in vivo. Примерами молекул нуклеиновых кислот для применения в антисмысловых олигонуклеотидах являются фосфорамидаты, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги
-7-
005411
ДНК (см., например, 5 176 996, 5 264 564 и 5 256 775) . Помимо этого, обзоры главных подходов к конструированию олигомеров, пригодных для антисмысловой терапии, составлены Van Der Krol et al., (1988)
Biotechniques 6:958-976, и Stein et al., (1988) Cancer Res. 48: 2659-2668, которые включены в настоящий
документ в качестве ссылки.
С. APRIL и его аминокислотные последовательности.
APRIL, как обсуждалось выше, является членом семейства TNF. Этот белок, а также фрагменты
или гомологи APRIL, могут иметь широкое терапевтическое и диагностическое применение, как обсуждается более подробно ниже.
Несмотря на то, что точная трехмерная структура APRIL неизвестна, предсказывают, что как член
семейства TNF он может иметь определенные структурные характеристики, общие с другими челнами
этого семейства.
Сравнение заявленной последовательности APRIL с другими членами семейства TNF человека обнаруживает значительное структурное сходство. Все эти белки имеют несколько участков консервативности последовательности во внеклеточном домене. Гомологичность всей последовательности внеклеточного домена APRIL демонстрирует наивысшую гомологичность с FasL (21% идентичности по аминокислотам), TNFα (20%), LT-α (18%), далее следуют TRAIL, TWEAK и TRANCE (15%). Фиг. 1В.
Новые полипептиды по настоящему изобретению специфично взаимодействуют с рецептором, который до сих пор не идентифицирован. Однако пептиды и способы, описанные в настоящем документе,
делают возможной идентификацию рецепторов, которые специфично взаимодействуют с APRIL или его
фрагментами.
Заявленное изобретение в некоторых вариантах практического осуществления включает пептиды,
полученные из APRIL, которые обладают способностью связываться с его рецепторами. Фрагменты
APRIL можно изготовить несколькими способами, например, с помощью рекомбинантных методик,
ПЦР, протеолитического расщепления или химического синтеза. Внутренние или терминальные фрагменты полипептида можно построить путем удаления одного или более нуклеотидов с одного конца или
обоих концов нуклеиновой кислоты, которая кодирует этот полипептид. Экспрессия мутантной ДНК
обеспечивает полипептидные фрагменты.
Полипептидные фрагменты можно также химически синтезировать с помощью известных методик,
таких как обычный твердофазный f-moc или t-boc химический синтез Merrifield. Например, пептиды и
последовательности ДНК по настоящему изобретению можно произвольно разделить на фрагменты
нужной длины без перекрывания фрагментов или разделить на перекрывающиеся фрагменты нужной
длины. Способы, подобные этим, описаны более подробно ниже.
D. Получение растворимых форм APRIL.
Растворимые формы APRIL часто могут эффективно сигнализировать и, следовательно, могут вводиться в качестве лекарства, которое имитирует естественную форму мембран. Возможно естественное
секретирование заявленного APRIL в качестве растворимых цитокинов, однако, если этого не происходит, можно повторно преобразовать ген методами генной инженерии для того, чтобы получить секрецию. Для создания растворимой секретируемой формы APRIL следует на уровне ДНК удалить Nконцевые трансмембранные участки и определенную часть стебля и заменить их последовательностью
лидера типа I или, альтернативно, типа II, что сделает возможным эффективное протеолитическое расщепление в выбранной экспрессирующей системе. Опытный специалист может изменять количество
оставшегося в конструкции, экспрессирующей секрецию, стеблевого участка, чтобы оптимизировать как
свойства связывания с рецепторами, так и эффективности секреции. Например, могут быть изготовлены
конструкции, содержащие стебли всех возможных размеров, т.е., N-концевые усеченные формы, таким
образом, что получатся белки, величиной с 81 аминокислоты до 139 аминокислот. Оптимальную длину
стеблевой последовательности можно получить благодаря этому типу анализа.
Е. Выработка антител, реагирующих с APRIL.
Настоящее изобретение также включает антитела, которые специфично реагируют с APRIL или его
рецептором. Антибелковую/антипептидную антисыворотку или моноклональные антитела можно получить
с помощью стандартных методик (см., например, antibodies: A Laboratory Manual, издание Harlow and
Lane (Cold Spring Harbor Press:1988). Млекопитающие, такие как мышь, хомячок или кролик, могут быть
иммунизированы иммуногенной формой пептида. Методики сообщения белку или пептиду иммуногенности включают их конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные специалистам.
Иммуногенную часть APRIL или его рецептора можно вводить в присутствии адъюванта. Развитие
иммунизации можно отслеживать путем выявления титров антител в плазме или сыворотке крови. Стандартный анализ ELISA или другие иммунологические анализы можно применять с использованием иммуногена как антигена для оценки уровней антител.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые антитела
являются иммуноспецифичными по отношению к антигенным детерминантам APRIL или его рецептора,
например, антигенным детерминантам полипептида, описываемого SEQ ID NO: 2, или его близкородственного человеческого или другого млекопитающего гомолога (например, 70, 80 или 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95% гомологичности). В еще одном предпочтительном варианте осуще-8-
005411
ствления настоящего изобретения анти-APRIL или антитела против рецепторов APRIL практически не
реагируют перекрестно (т.е., реагируют специфично) с белком, который, например, менее чем на 80%
гомологичен SEQ ID NO: 2; предпочтительно, менее чем на 90% гомологичен SEQ ID NO: 2; и, наиболее
предпочтительно, менее чем на 95% гомологичен SEQ ID NO: 2. Под выражением "практически не реагируют перекрестно" подразумевается, что антитело обладает связывающей аффинностью по отношению
к негомологичному белку, которая составляет менее 10%, более предпочтительно, менее 5%, и, даже более предпочтительно, менее 1%, от связывающей аффинности белка, описываемого SEQ ID NO: 2.
Термин "антитело" в настоящем документе включает также его фрагменты, которые также специфично реагируют с APRIL или его рецептором. Антитела могут быть фрагментированы с помощью
обычных методик, а фрагменты могут быть подвергнуты скринингу на пригодность теми же способами,
которые описаны выше для интактных антител. Например, F(ab)2 фрагменты могут быть получены путем
обработки антитела пепсином. Полученный F(ab')2 фрагмент можно обработать с целью устранения дисульфидных мостиков и получения Fab' фрагментов. Антитела по настоящему изобретению также включают биоспецифичные и химерные молекулы, обладающие анти-APRIL активностью и активностью
против рецепторов APRIL. Таким образом, как моноклональные, так и поликлональные антитела (Аb)
против APRIL и его рецептора и фрагменты антител, такие как Fab' и F(ab')2, можно применять для блокирования действия APRIL и его соответствующего рецептора.
Различные формы антител также можно получить с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК. (Winter and Milstein, Nature 349:293-299 (1991); включено в настоящий документ в качестве
ссылки). Например, можно сконструировать химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен
из антитела животного присоединен к константному домену антитела человека (например, Cabilly et al.,
патент США № 4 816 567, включенный в настоящий документ в качестве ссылки). Химерные антитела
могут редуцировать наблюдающиеся иммуногенные реакции, вызванные животными антителами при их
использовании для лечения человека.
Помимо этого, могут быть синтезированы рекомбинантные "гуманизированные антитела", которые
распознают APRIL или его рецептор. Гуманизированные антитела представляют из себя химеры, включающие преимущественно последовательности человеческого IgG, в которые вставлены участки, ответственные за специфичное связывание с антигенами. Животных иммунизируют желаемым антигеном,
выделяют соответствующие антитела и часть последовательностей вариабельного участка, ответственных за специфичное связывание с антигеном, удаляют. Антигенсвязывающие участки животного происхождения затем клонируют на подходящую позицию в генах антител человека, в которые антигенсвязывающие участки удалены. Гуманизированные антитела сводят к минимуму использование гетерологичных (т.е., межвидовых) последовательностей в человеческих антителах, и поэтому с меньшей долей вероятности вызывают иммунные реакции у субъекта, подвергаемого лечению.
Конструирование различных классов рекомбинантных антител может также осуществляться путем
изготовления химерных или гуманизированных антител, включающих вариабельные домены и человеческие константные домены (СН1, СН2, СН3), выделенные из различных классов иммуноглобулинов. Например, антитела с повышенными валентностями антигенсвязывающего участка могут быть получены
путем клонирования антигенсвязывающего участка в векторы, несущие цепь константных участков человека. (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177:1439-1450 (1993), включено в настоящий документ в качестве ссылки).
Помимо этого, можно использовать стандартные методики рекомбинантной ДНК для изменения
связывающего аффинитета рекомбинантных антител по отношению к их антигенам путем изменения
аминокислотных остатков поблизости от антигенсвяэывающих участков. Антигенсвязывающий аффинитет гуманизированного антитела может быть повышен посредством мутагенеза на основе молекулярного
моделирования. (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:10029-33 (1989); включено в настоящий документ в
качестве ссылки).
F. Получение аналогов: изготовление измененных ДНК- и пептидных последовательностей.
Аналоги APRIL могут отличаться от нативных лигандов по аминокислотной последовательности
или по другим факторам, которые не касаются последовательностей, или и таким и другим образом сразу. Модификации, которые не касаются последовательностей, включают получение производных APRIL
in vivo и in vitro. Модификации, которые не касаются последовательностей, включают, но не ограничиваются, изменения в ацетилировании, метилировании, фосфорилировании, карбоксилировании или гликозилировании.
Предпочтительные аналоги включают APRIL или его биологически активные фрагменты, у которых последовательности отличаются от SEQ ID NO: 2, по одному или более консервативных аминокислотных замещений, или по одному или более неконсервативных аминокислотных замещений, делеций
или вставок, которые не препятствуют биологической активности APRIL. Консервативные замещения
обычно включают замещение одной аминокислоты на другую, обладающую сходными свойствами, например, замещения в пределах следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.
-9-
005411
Консервативные замены аминокислот
- 10 -
005411
Применение методики мутагенеза включает ПЦР-мутагенез и сатурационный мутагенез, как обсуждается более подробно ниже. Библиотеку неспецифических вариантов аминокислотных последовательностей также можно получить путем синтеза ряда вырожденных олигонуклеотидных последовательностей.
ПЦР-мутагенез.
При ПЦР-мутагенезе для интродукции несцецифических мутаций в клонированный фрагмент ДНК
можно использовать сниженную привязанность Taq-полимеразы (Leung et al., 1989, Technique 1:11-15).
Это очень мощный и относительно быстрый способ интродукции неспецифических мутаций. Участок
ДНК, который должен быть мутирован, можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) при условиях, снижающих привязанность синтеза ДНК Taq ДНК-полимеразой, например, с
помощью использования соотношения дГТФ/дАТФ, равное пяти, и добавления Мn2* к ПЦР-реакции.
Пул амплифицированных фрагментов ДНК может быть вставлен в подходящие клонирующие векторы
для обеспечения библиотек неспецифических мутантов.
Сатурационный мутагенез.
Сатурационный мутагенез позволяет осуществить быструю интродукцию большого числа замещений единственных оснований в клонированные фрагменты ДНК (Mayers et al., 1985, Science 229:242).
Эта методика включает генерацию мутаций, например, с помощью химической обработки или облучения
одноцепочечной ДНК in vitro и синтеза комплементарной цепи ДНК. Частоту мутаций можно менять
путем модулирования интенсивности обработки, и можно получить практически все возможные замещения оснований. Поскольку эта процедура не включает генетический отбор мутантных фрагментов, можно получить как нейтральные замещения, так и белок, изготовленный путем неспецифического мутагенеза ДНК. Распределение точечных мутаций не смещается в сторону консервативных элементов последовательности.
Вырожденные олигонуклеотиды.
Библиотеку гомологов также можно создать из ряда последовательностей вырожденных олигонуклеотидов. Химический синтез вырожденных последовательностей может осуществляться с помощью
автоматического синтезатора ДНК, а синтетические гены затем сшивают с подходящим экспрессирующим вектором. Синтез вырожденных олигонуклеотидов известен специалистам.ххх Такие методики применяются в направленной эволюции других белков.хххi
Неспецифический или направленный мутагенеэ можно использовать для создания конкретных последовательностей или мутаций в конкретных участках. Эти методики можно использовать для создания
вариантов, которые включают, например, делеции, вставки или замещения остатков в известной аминокислотной последовательности белка. Сайты для мутаций могут быть модифицированы индивидуально
или сериями, например, (1) путем замещения сначала консервативными аминокислотами, а затем более
радикальными вариантами, в зависимости от достигнутых результатов, (2) путем удаления нужного остатка или (3) путем вставки остатков того же или другого класса по соседству с локализованным сайтом
или путем комбинаций вариантов 1-3.
Аланин-сканирующий мутагенез.
Аланин-сканирующий мутагенез является полезным способом идентификации определенных остатков или участков нужного белка, которые являются предпочтительными расположениями или доменами мутагенеза, Cunninqham and Wells (Science 244:1081-1085, 1989), включено в настоящий документ в
качестве ссылки. При аланин-сканировании остаток или группа нужных остатков идентифицируют (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) и заменяют на нейтральные или отрицательно заряженные аминокислоты (наиболее предпочтительно, аланин или полиаланин). Замена аминокислот может влиять на взаимодействие аминокислот с окружающей водной средой внутри или снаружи
клетки. Те домены, которые демонстрируют функциональную чувствительность к замещениям, затем
могут быть выделены путем интродукции дальнейших или других вариантов на или вместо сайтов замещения. Таким образом, поскольку сайт для интродукции изменения аминокислотной последовательности
предопределен, сам по себе характер мутации не нуждается в предопределении. Например, для оптимизации осуществления мутации в данном участке, аланин-сканирование или неспецифический мутагенез
могут проводиться на нужном кодоне или участке, а экспрессированные варианты субъединиц нужного
белка подвергаются скринингу на предмет оптимального сочетания нужной активности.
Олигонуклеотид-опосредованный мутагенез.
Олигонуклеотид-опосредованный мутагенез является применимой методикой получения вариантов
ДНК с замещением, делецией и вставкой, см., например, Adelman et al. (DNA 2:183, 1983), включено в
настоящий документ в качестве ссылки. Кратко, нужную ДНК можно изменить путем гибридизации олигонуклеотида, кодирующего мутацию, до ДНК-матрицы, которая представляет из себя одноцепочечную
форму плазмиды или бактериофага, содержащих неизмененную или нативную последовательность ДНК
нужного белка. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза полной второй комплементарной цепи матрицы, которая, следовательно, будет включать олигонуклеотидный праймер и будет
кодировать выбранное изменение в ДНК нужного белка. Обычно используются олигонуклеотиды длиной по меньшей мере в 25 нуклеотидов. Оптимальный олигонуклеотид будет иметь от 12 до 15 нуклеотидов, которые являются полностью комплементарными матрице по обе стороны нуклеотида (нуклеоти- 11 -
005411
дов), кодирующего мутацию. Это гарантирует, что олигонуклеотид будет должным образом гибридизован с матричной молекулой одноцепочечной ДНК. Такие олигонуклеотиды легко синтезируются с помощью известных методик, таких как описанные Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765[1978],
включено в настоящий документ в качестве ссылки.
Кассетный мутагенез.
Другой способ получения вариантов, кассетный мутагенез, основан на методике, описанной Wells
et al. (Gene, 34:315[1985]), включено в настоящий документ в качестве ссылки. Исходным материалом
может служить плазмида (или другой вектор), которая включает ДНК субъединицы белка, которую желательно мутировать. Кодон (кодоны) в ДНК субъединицы белка, который желательно мутировать,
идентифицируют. Должен быть уникальный сайт рестрикции эндонуклеазы на каждой стороне выделенного сайта (сайтов) мутации. Если таких сайтов рестрикции не существует, их можно создать с помощью
вышеописанного способа олигонуклеотид-опосредованного мутагенеза для внедрения в подходящие
места желаемой ДНК субъединицы белка. После интродукции сайтов рестрикции в плазмиду ее разрезают в местах этих сайтов для выравнивания. Двухцепочечный олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между сайтами рестрикции, но содержащую нужную мутацию (мутации), синтезируют с
помощью стандартных методик. Две цепи синтезируют по отдельности, а затем гибридизуют обычным
способом. Этот двухцепочечный олигонуклеотид называют кассетой. В этой кассете имеются 3'- и 5'концы, которые сравнимы с концами выровненной плазмиды, таким образом, что ее можно непосредственно сшить с плазмидой. Теперь эта плазмида содержит мутантную последовательность ДНК белковой
субъединицы.
Комбинаторный мутагенез.
Комбинаторный мутагенез также можно использовать для генерации мутантов. Например, аминокислотные последовательности для группы гомологов или других родственных белков выравнивают,
предпочтительно, для того, чтобы способствовать наибольшей возможной гомологичности. Все аминокислоты, которые появляются на данной позиции выровненных последовательностей, могут отбираться
для создания вырожденного ряда комбинаторных последовательностей. Неоднородная библиотека вариантов создается путем комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновой кислоты и кодируется с помощью библиотеки разнообразных генов. Например, смесь синтетических олигонуклеотидов может
ферментативно сшиваться с генными последовательностями, такими как вырожденный ряд потенциальных последовательностей, которые экспрессируются как отдельные пептиды, или, альтернативно, как
ряд более крупных слитых белков, содержащих ряд вырожденных последовательностей.
Специалистам известно множество методик, позволяющих производить скрининг генерированных
мутантных генных продуктов. Методики скрининга больших генных библиотек часто включают клонирование генной библиотеки в способные реплицироваться экспрессирующие векторы, трансформирование подходящих клеток с помощью полученной библиотеки векторов и экспрессирование генов при условиях, в которых выявление нужной активности, например, в данном случае, связывания с APRIL или
его рецептором, облегчает относительно простое выделение вектора, кодирующего ген, чей продукт выявлялся. Каждая из методик, описанных ниже, позволяет проводить анализ для скрининга больших количеств созданных последовательностей с высокой пропускной способностью, например, с помощью
методики неспецифического мутагенеза.
Настоящее изобретение предусматривает также редуцирование связывающих белок доменов заявленных полипептидов или их рецепторов, для получения миметиков, например, пептидных или непептидных агентов. Пептидные миметики способны разрывать связывание APRIL с его рецептором. Главные остатки APRIL, участвующие в молекулярном распознавании рецепторного полипептида или расположенного далее внутриклеточного белка, можно определить и использовать для создания пептидомиметиков APRIL или его рецепторов, которые конкурентно или неконкурентно ингибируют связывание
APRIL с его рецептором. (См., например, "Peptide inhibitors of human papilloma virus protein binding to
retinoblastoma gene protein". Европейские патентные заявки ЕР-412 762А и ЕР-В31 080А, включенные в
настоящий документ в качестве ссылок).
Делая возможным получение доступного очищенного и рекомбинантного APRIL, настоящее изобретение предусматривает анализы, которые могут использоваться для скрининга потенциальных лекарственных средств, которые являются агонистами или антагонистами нормальной клеточной функции, в
данном случае, APRIL или его рецептора. В одном варианте осуществления настоящего изобретения этот
анализ оценивает способность соединения модулировать связывание APRIL и его рецептора. Подходящими являются многие форматы анализа и, в свете настоящих изобретений, они будут очевидными для
специалистов в данной области знания.
Во многих программах скрининга лекарственных средств, которые испытывают библиотеки соединений и нативных экстрактов, желательны анализы с высокой пропускной способностью, чтобы за определенный период времени пропускать через анализ максимальное количество соединений. Анализы, которые проводятся в бесклеточных системах, такие, которые могут проводиться с очищенными или полуочищенными белками, часто являются предпочтительными в качестве "первичного" отбора, поскольку
они позволяют осуществлять быструю постановку и относительно простое выявление изменения в моле- 12 -
005411
кулярной мишени, которая опосредуется испытуемым соединением. Помимо этого, в системе in vitro
обычно можно игнорировать эффекты клеточной токсичности и/или биодоступности испытуемого соединения; вместо этого анализ фокусируется, прежде всего, на воздействии лекарственного средства на
молекулярную мишень, что может проявляться в изменении связывающего аффинитета с другими белками или в изменении ферментативных свойств молекулярной мишени.
Выделение рецептора, связывающегося с APRIL.
Лиганды семейства TMF можно использовать для идентификации и клонирования рецепторов. Используя описанные последовательности APRIL, можно слить 5'-конец внеклеточного домена, который
составляет связывающую рецептор последовательность, с маркером или меченой последовательностью,
а затем добавить лидерную последовательность, которая будет вызывать секрецию APRIL в любом количестве экспрессирующих систем. Один пример этой методики описан Browning et al., (1996) (JBC 271,
8618-8626), где лиганд LT-β секретировался в такой форме. Лидерную последовательность VCAM
сдваивали в короткую myc-пептидную метку, после чего следовал внеклеточный домен LT-β. Для получения секреции нормальной мембраносвязанной молекулы LT-β использовали последовательность
VCAM. Секретированный белок сохранял mус-метку на N-конце, что не нарушало способности связываться с рецептором. Такой секретированный белок может экспрессироваться как временно трансфицированными клетками Cos, так и сходной системой, например, векторами, полученными из EBNA, системой клетка насекомого/бакуловирус, picchia и т.п. Неочищенный клеточный супернатант можно использовать как источник меченого лиганда.
Клетки, экспрессирующие рецептор, можно идентифицировать путем экспозиции с меченым лигандом. Клетки со связанным лигандом идентифицируют в эксперименте FACS, помечая mус-метку антителом против mус-пептида (9Е10), а затем меченым фикоэритрином (или сходной меткой) антимышиным иммуноглобулином. FACS-положительные клетки легко идентифицируются и служат источником
РНК, кодирующей рецептор. Затем из этой РНК посредством стандартных методик можно изготовить
библиотеку экспрессии и разделить ее на пулы. Пулы клонов трансфицируют в подходящую клеткухозяина и определяют связывание меченого лиганда с клетками, позитивно трансфицированными рецептором, посредством исследования под микроскопом, после мечения связанной mус-пептидной метки
ферментом, меченным антимышиным Ig-реагентом, т.е., антителом, меченным галактозидазой, щелочной фосфатазой или люциферазой. После идентификации позитивного пула его размер уменьшают
вплоть до идентификации кДНК, кодирующей рецептор. Эту процедуру можно выполнять как с мышиным, так и с человеческим APRIL, поскольку они могут более легко привести к рецептору.
G. Способы лечения и фармацевтические композиции.
Способы по настоящему изобретению для лечения злокачественной опухоли включают введение
пациенту, предпочтительно, млекопитающему, такому как собака, кошка или человек, эффективного
количества заявленной композиции, включающей блокирующий агент, способный препятствовать связыванию APRIL и его рецептора. Такие блокирующие агенты включают, но не ограничиваются, растворимый APRIL, анти-APRIL антитела, антитела против рецепторов APRIL или их биологически активные
фрагменты. Помимо этого, можно изготовить ингибирующую форму APRIL путем мутирования APRIL,
который в то же время будет обладать способностью блокировать связь между APRIL и его рецептором.
Блокирующие агенты могут предпочтительно включать слитый белок рецептор-IG, который можно построить с помощью способов, известных опытным специалистам.
Способы по настоящему изобретению пригодны для лечения всех злокачественных опухолей,
включая, но не ограничиваясь, такие заболевания клеток как, например, рак почки, саркома Капоши,
хронический лейкоз, рак молочной железы, саркома, рак яичников, рак прямой кишки, рак горла, меланома, рак толстого кишечника, рак мочевого пузыря, мастоцитома, рак легкого, аденокарцинома молочной железы, плоскоклеточный рак глотки и гастроинтестинальный рак или рак желудка. Помимо этого,
такие блокирующие агенты пригодны для лечения пролиферативных состояний, которые не считаются
опухолями, т.е., клеточной гиперпролиферации (гиперплазии), такой как, например, склеродерма, образование паннусов при ревматоидном артрите, послеоперационные рубцы и фиброз легких, печени и матки.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать терапевтически эффективное количество APRIL или его рецептора или их фрагменты или миметики, и, необязательно, могут включать фармацевтически приемлемые носители. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам лечения рака и способам стимулирования или, в определенных случаях, ингибирования
иммунной системы или ее частей, путем введения фармацевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемых солей или производных. Следует, разумеется, понимать, что композиции и способы по настоящему изобретению можно применять в
комбинации с другими лекарственными средствами при различных видах лечения.
Эти композиции могут составляться для различных путей введения, включая системное, местное
или локализованное введение. Для системного введения предпочтительна инъекция, включая внутримышечное, внутривенное, интраперитонеальное и подкожное введение. Для инъекции композиции по
настоящему изобретению могут составляться в форме жидких растворов, предпочтительно, в физиологи- 13 -
005411
чески совместимых буферах, таких как раствор Хенкса или раствор Рингера. Помимо этого, эти композиции могут составляться в твердой форме и, необязательно, повторно растворяться или суспендироваться непосредственно перед употреблением. Лиофилизированные формы также включены в настоящее
изобретение.
Эти композиции могут вводиться перорально или с помощью чресслизистых или чрескожных
средств. Для чресслизистого или чрескожного введения в композицию включаются пенетранты, соответствующие барьерам, через которые они должны проникать. Такие пенетранты известны и включают, например, для чресслизистого введения, желчные соли, производные фусидовой кислоты и детергенты.
Чресслизистое введение может осуществляться с помощью назальных аэрозолей или с помощью суппозиториев. Для перорального введения композиции составляются в виде традиционных форм для перорального введения, таких как капсулы, таблетки и тоники. Для местного введения композиции по настоящему изобретению составляются в виде мазей, гелей или кремов, согласно известным способам.
Дозы и схемы введения будут зависеть от типа злокачественной опухоли, пациента и его анамнеза.
Это количество должно быть эффективным с точки зрения лечения, подавления или изменения прогрессирования злокачественной опухоли. Дозы могут быть однократными или множественными. Если используются множественные дозы, что предпочтительно, частота введения будет зависеть, например, от
типа хозяина и типа злокачественной опухоли, размера доз и т.п. При некоторых типах злокачественных
опухолей или опухолевых линий, будет эффективно ежедневное введение, в то время как при других
будет эффективным введение через день или через два дня на третий. Количество активного соединения,
вводимое за один раз и за весь курс лечения, будет зависеть от многих факторов. Например, от возраста и
веса пациента, тяжести и течения болезни, которую лечат, способа и формы введения и оценки лечащего
врача. Однако эффективная доза может составлять в пределах приблизительно от 0,005 до 5 мг/кг в день,
предпочтительно, приблизительно от 0,05 до 0,5 мг/кг в день. Размер дозы, которая будет наиболее эффективной, будет таким, который обеспечит отсутствие появления опухоли или полный регресс опухоли
и при этом не будет токсичной для пациента. Опытному специалисту будет понятно, что полезными могут оказаться также и более низкие и более высокие дозы.
Генные конструкции по настоящему изобретению могут также использоваться как часть схемы
генной терапии, для доставки нуклеиновых кислот, кодирующих как агонистическую, так и антагонистическую формы APRIL.
Экспрессирующие конструкции APRIL могут вводиться в любом биологически эффективном носителе, например, любом составе или композиции, способном эффективно доставлять ген APRIL клеткам
in vivo. Подходы включают вставку гена в вирусные векторы, которые могут трансфицировать клетку
непосредственно, или доставку плазмидной ДНК с помощью, например, липосом или внутриклеточных
носителей, а также прямую инъекцию генной конструкции. Предпочтительными являются способы переноса с помощью вирусных векторов.
Фармацевтический препарат конструкции для генной терапии может состоять, главным образом, из
системы доставки гена в приемлемом разбавителе, или может включать матрикс с замедленным высвобождением, в котором заключен носитель для доставки гена. Альтернативно, если полная система доставки гена может быть выработана в интактном виде из рекомбинантных клеток, например, ретровирусными векторами, фармацевтический препарат может включать одну или более клеток, которые вырабатывают систему доставки гена.
Помимо применения в терапии, олигомеры по настоящему изобретению можно использовать в качестве диагностических реагентов для выявления наличия или отсутствия нужной ДНК, РНК или аминокислотных последовательностей, с которыми они специфично связываются. В других аспектах заявленное изобретение может применяться для оценки химического агента на способность взаимодействовать,
например, связываться или физически ассоциировать с APRIL или его фрагментом. Этот способ включает контактирование химического агента с APRIL и оценку способности химического агента взаимодействовать с APRIL. Помимо этого, APRIL можно использовать в способах оценки нативного APRIL или
рецепторов APRIL, а также для оценки химических агентов, которые ассоциируют или связываются с
рецепторами APRIL. Может быть желательным применение меченых версий APRIL для облегчения выявления связывания APRIL с его рецептором или рецептор-позитивных клеток, например, с целью скрининга агентов, которые блокируют взаимодействие лиганд APRIL - рецептор APRIL. Помимо этого,
можно использовать клеточные линии, трансфицированные APRIL, которые имеют повышенные скорости роста, как основу для скрининга для молекул, которые блокируют активность APRIL.
В определенных аспектах заявленное изобретение относится к способу оценки химического агента
на способность модулировать взаимодействие между APRIL и соответствующим ему рецептором. Этот
способ включает комбинирование рецептора для APRIL и APRIL при условиях, когда эта пара может
взаимодействовать, добавление химического агента, который подлежит оценке, и выявление формирования или диссоциации комплексов. Эти модулирующие агенты далее могут быть оценены in vitro, например, путем тестирования их активности в бесклеточной системе, а затем, необязательно, путем введения
этого соединения в клетку или животному и оценки эффекта.
- 14 -
005411
I. Примеры.
Пример 1.
При анализе APRIL с помощью нозерн-блоттинга было установлено, что экспрессия APRIL является слабой и ограничивается только немногими типами тканей (фиг. 2А). Два транскрипта величиной 2,1
т.п.н. и 2,4 т.п.н. были обнаружены в предстательной железе, в то время как в ЛПК обнаружили более
короткий транскрипт величиной 1,8 т.п.н. Анализ нозерн-блот выполнялся с использованием Human
Multiple Tissue Northern Blots I and II (Clontech #7760-1 and 7759-1). Human Cancer Cell Line MTN Blot
Clontech #7757-1) и Human Tumor Panel Blot V (Invitrogen D3500-01). Мембраны инкубировали в гибридизационном растворе ExpressHyb (Clontech #8015-1) в течение по меньшей мере 1 ч при 62°С. Неспецифически праймированный кДНК зонд (Boehringer Mannheim) был синтезирован с использованием кДНК,
соответствующей внеклеточному домену APRIL, в качестве матрицы. Денатурированный нагреванием
кДНК зонд добавляли в количестве 1,5х106 имп./мин/мл в свежий раствор ExpressHyb. Мембрану подвергали гибридизации в течение 12-24 ч при 62°С, промывали три раза в 2 х ХЦН (смесь хлорида и цитрата натрия), содержавшем 0,05% ДСН (додецилсульфат натрия) и подвергали действию температуры 70°С. При анализе APRIL с помощью нозерн-блоттинга было установлено, что экспрессия APRIL является слабой и ограничивается только немногими типами тканей. Два транскрипта величиной 2,1 т.п.н. и
2,4 т.п.н. были обнаружены в предстательной железе, в то время как в ЛПК обнаружили более короткий
транскрипт величиной 1,8 т.п.н.
Более продолжительная экспозиция выявила мРНК APRIL величиной 2,1 т.п.н. в толстой кишке,
селезенке и поджелудочной железе (данные не представлены). Это ограниченное распределение мРНК
APRIL соответствует происхождению клонов кДНК, в настоящее время доступных в базе данных EST.
Из 23 идентифицированных клонов только два были получены из нормальных тканей (беременной матки
и панкреатических островков). Примечательно, что оставшиеся ЕSТ-клоны (21 клон, 91%) были представлены в библиотеках кДНК, выделенных из опухолей и опухолевых клеточных линий (опухоль яичника, 11; опухоль предстательной железы, 3; опухоль Гесслера Вильмса, 1; рак толстого кишечника, 1;
опухоль эндометрия, 1; опухоли паращитовидных желез, 1; опухоль поджелудочной железы, 1; Тклеточная лимфома, 1; клеточная линия, выделенная из аденокарциномы LNCAP, 1). Это навело авторов
изобретения на идею проверить трансформированные клеточные линии на экспрессию мРНК APRIL
(фиг. 2В) и, на самом деле, все клеточные линии интенсивно экспрессировали транскрипт APRIL величиной 2,1 т.п.н.
Наибольшие APRIL-специфичные сигналы были выявлены в колоректальной аденокарциноме
SW480, лимфоме Беркитта Raji и в меланоме G361. Для подтверждения этого открытия авторы настоящего изобретения определили уровни экспрессии мРНК APRIL в нескольких опухолях и сравнили их с
нормальными тканями. мРНК APRIL выявляли в избыточных количествах в карциноме щитовидной железы и в лимфоме, в то время как в соответствующих нормальных тканях обнаруживали лишь слабые
или вовсе никаких сигналов гибридизации (фиг. 2С). В двух других опухолях, анализировавшихся с помощью нозерн-блоттинга (опухоли надпочечников и паращитовидных желез) уровни мРНК APRIL повышены не были. Однако гибридизация in situ установила избыточное количество мРНК APRIL в аденокарциноме толстого кишечника человека по сравнению с нормальной тканью толстого кишечника (фиг.
2D).
С целью изучения возможной активности APRIL авторы настоящего изобретения экспрессировали
растворимый внеклеточный домен APRIL (sAPRIL), в состав которого входят аминокислоты с 110 по
250, в 293 клетках (9). Ген APRIL полной длины амплифицировали из ЕSТ-клона с помощью специфичного прямого 5'-праймера, фланкированного сайтом EcoRI (5'-CCAGCCTCATCTCCTTTCTTGC-3') и обратного 3'-праймера, фланкированного сайтом ХbаI (5'-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3'). Амплифицированный фрагмент разрезали EcoRI/XbaI и клонировали в модифицированную версию pCRIII (Invitrogen), в рамке с N-концевым пептидом Flag (15). Растворимую форму APRIL (sAPRIL) генерировали с
помощью двух праймеров (5'-AAACAGAAGAAGCAGCACTCTG-3') и (5'-TCACAGTTTCACAA
ACCCCAGG-3'), содержавших сайт PstI и XbaI, соответственно, и затем клонировали в модифицированный вектор pCRIII, содержавший как сигнал НА для секреции белка в эукариотических клетках, так и Nконцевой эпитоп Flag (15).
Пример 2.
Широко распространенная экспрессия APRIL в опухолевых клетках и тканях навела авторов изобретения на мысль, что APRIL может быть связан с ростом опухоли, и в связи с этим они инкубировали
различные линии опухолевых клеток с очищенным peкомбинантным sAPRIL, меченным Flag (10).
Эмбриональные клетки человека 293Т, Т-клетки лейкоза Jurkat человека, В-клетки лимфомы Беркитта Raji человека и клеточные линии меланомы выращивали, как описано ранее (16, 17). Другие клеточные линии, упомянутые в этой статье, описаны и хранятся в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection) (Rockville, Maryland). Все клеточные линии культивировали в среде PPMI или DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой.
Меченные Flag версии внеклеточного домена (остатки 103-281) FasL и TRAIL человека (остатки 95281) недавно были описаны (15). Меченный Flag растворимый TWEAK человека (остатки 141-284) вы- 15 -
005411
рабатывался в 293 клетках (P.S. рукопись готовится к печати). Анти-Flag антитела М2 были получены от
компании Kodak International Biotechnologies. Усиление пролиферации клеток Т-лимфомы Jurkat в присутствии APRIL носило дозозависимый характер, что выявлялось по увеличению количества (приблизительно 50%) (11) жизнеспособных клеток через 24 ч после добавления лиганда (фиг. 3А). Пролиферацию
клеток определяли путем инкубации клеток в количестве 30 000 на лунку в 100 мкл среды с указанными
концентрациями рекомбинантного APRIL, TWEAK, TRAIL, FasL и определения количества жизнеспособных клеток с помощью анализа пролиферации Celltiter 96 AQ (Promega) спустя 24 ч, в соответствии с
инструкциями производителя, или путем инкорпорации 3H-тимидина. Для иммунного истощения FlagAPRIL использовали анти-Flag, посаженные на агарозу.
Увеличение пролиферации не зависело от костимулирующих сигналов, таких как анти-СD3 антитела или другие цитокины. Как ожидалось, добавление идентичным образом изготовленного и очищенного
FasL к клеткам Jurkat уменьшало количество жизнеспособных клеток, в то время как TWEAK не оказывал никакого действия. Возросшее количество клеток коррелировало с приращением (40%) инкорпорации 3H-тимидина в обработанные APRIL клетки (фиг. 3А). Иммунное истощение кондиционированной
среды, содержащей APRIL, меченный с помощью Flag, анти-Flag антителами, но не анти-mус антителами, снижало пролиферативный эффект (фиг. 3В), что указывает на то, что пролиферативный эффект был
специфичным и происходил под действием APRIL. Ускоренные темпы пролиферации наблюдались также в некоторых В-лимфомах (Raji человека, мышиных клетках А20, но не BJAB человека) и в клеточных
линиях эпителиального происхождения, таких как COS и HeLa, а также в меланомах (фиг. 3С). В клетках
карциномы молочной железы MCF-7 реакции не наблюдалось. Воздействие на клетки Jurkat было даже
более выраженным, когда содержание фетальной бычьей сыворотки снижали с 10 до 1% (фиг. 3D).
Рекомбинантный sAPRIL образует агрегаты, что может объяснить более высокие концентрации, которые требуются для выявления пролиферативного эффекта sAPRIL. Таким образом, авторы настоящего
изобретения трансфицировали клетки NIH-3T3 человеческим APRIL полной длины (12) и получили несколько экспрессирующих APRIL клонов (фиг. 4А). NIH-3T3 APRIL клоны были установлены с помощью методики трансфекции с фосфатом кальция и APRIL полной длины, меченного FLAG, который содержал экспрессирующий вектор pCRIII. Клеточные белки из приблизительно 2х106 клеток на полосу
разделяли электрофорезом в 12% полиакриламидном геле в присутствии ДСН при редуцирующих условиях и затем переносили на нитроцеллюлозу. Анализ иммунного блоттинга APRIL, меченного Flag, выполняли с использованием крысиных моноклональных анти-Flag антител в количестве 5 мкг/мл (Kodak
International Biotechnologies). Сначала антитела выявляли, используя очищенные по принципу аффинности антипероксидазные конъюгированные ослиные антимышиные антитела (Dianova, Hamburg,
Germany), а затем с помощью реакции хемилюминесценции с использованием системы ECL (Amersham).
Интересно, что трансфектанты APRIL пролиферировали быстрее, чем трансфектанты mock (фиг.
4В). Авторы пришли к заключению, что клетки NIH-3T3, трансфицированные APRIL, также должны
иметь ростовые преимущества in vivo. Когда клетки NIH-3T3 дикого типа или mock-трансфицированные
инъецировали бестимусным мышам, пальпируемые опухоли малого размера появлялись через 5-6 недель
(13). Напротив, два клона клеток NIH-3T3, стабильно трансфицированные APRIL, индуцировали опухоли всего через 3-4 недели. Через 6 недель мышей вынуждены были умерщвлять из-за развития больших
опухолей (фиг. 4С). Фибробласты NIH-3Т3 (American Type Culture Collection, Rockviile, Maryland) и различные трансфектанты (1х105 клеток) суспендировали в 50 мкл физиологического раствора с фосфатным
буфером и инъецировали подкожно в область бока бестимусным мышам BALB/c (Harlan, Zeist, Netherland). Размер опухолей измеряли каждые 3 дня. Мыши подбирались по возрасту (по 3 животных в группе).
Пример 3. Выделение рецептора, связывающегося с APRIL.
Лиганды семейства TNF можно использовать для идентификации и клонирования рецепторов. Используя описанные последовательности APRIL, можно слить 5' конец внеклеточного домена APRIL, который составляет рецептор-связывающую последовательность, с маркером или последовательностьюметкой, а затем добавить лидерную последовательность, которая обеспечит секрецию APRIL в любой из
ряда экспрессирующих систем. Один пример такой технологии описан Browning et al., (1996) (JBC 271,
8618-8626), где лиганд LT-β секретировался в такой форме. Лидерную последовательность VCAM соединяли с короткой пептидной меткой mуc, а затем с внеклеточным доменом LT-β. Последовательность
VCAM используется для получения секреции молекулы LT-β, которая в норме связана с мембраной.
Секретированный белок сохранял метку mуc на N-конце, что не нарушало его способность связываться с
рецептором. Такой секретированный белок может экспрессироваться временно трансфицированными
клетками Cos или подобной системой, например, полученными из EBNA векторами, системой клетка
насекомого/бакуловирус, picchia и т.п. Неочищенный клеточный супернатант можно использовать как
источник меченого лиганда.
Клетки, экспрессирующие рецептор, можно идентифицировать путем экспозиции с меченым лигандом. Клетки со связанным лигандом идентифицируют в эксперименте FACS, помечая mус-метку антителом против mус-пептида (9Е10), а затем фикоэритрином (или сходной меткой), меченным антимы- 16 -
005411
шиным иммуноглобулином. FACS-положительные клетки легко идентифицируются и служат источником РНК, кодирующей рецептор. Затем из этой РНК посредством стандартных методик можно изготовить библиотеку экспрессии и разделить ее на пулы. Пулы клонов трансфицируют в подходящую клеткухозяина и определяют связывание меченого лиганда с клетками, позитивно трансфицированными рецептором, посредством исследования под микроскопом, после мечения связанной mус-пептидной метки
ферментом, меченным антимышиным Ig-реагентом, т.е., антителом, меченным галактозидазой, шелочной фосфатазой или люциферазой. После идентификации позитивного пула его размер уменьшают
вплоть до идентификации кДКК, кодирующей рецептор. Эту процедуру можно выполнять как с мышиным, так и с человеческим APRIL, поскольку они могут более легко привести к рецептору.
Специалисту будет понятно, что можно осуществлять различные модификации и изменения APRIL,
композиций и способов по настоящему изобретению без отступления от идеи или рамок настоящего изобретения. Таким образом, предполагается, что настоящее изобретение включает в себя такие модификации и изменения, при условии, что они подпадают под объем заявленной формулы изобретения и ее эквивалентов.
Библиографические ссылки
i. Smith et al., Science 248, 1019-23 (1990); Kohno et al., PNAS 87, 8331-5 (1990); Loetscher et al., Cell
61, 351-9 (1990); Schall et al., Cell 61, 361-70 (1990).
ii. См. Jones et al., Nature, 338, 225-8 (1989); Eck et al., J. Biol. Chem. 264, 17595-605 (1992).
iii. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992); A. Waage, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their
Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).
iv. G.D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B.
Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 117 (1992).
v. A. Nakane, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler
(Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I.A. Clark et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their
Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 303 (1992); G.E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329
(1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G.H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and
Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 371 (1992).
vi. S. Malik, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler
(Ed.), Raven Press, NY, p 407 (1992).
vii. D. A. Fox, Am. J. Med. 99, 82 (1995).
viii. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol. 51, 597 (1986); G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY,
p. 515 (1992).
ix. L. A. Tartaglia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 9292 (1991); L. A. Tartaglia and D. V. Goeddel,
Immunol. Today. 13, 151 (1992).
x. B. Luettig et al., J. Immunol. 143, 4034 (1989); M. Kriegler et al., Cell 53, 45 (1988).
xi. C. F. Ware et al., in Pathways for Cytolysis. G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds.), Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, p. 175-218 (1995).
xii. N. Paul et al., Ann. Rev. Immunol. 6, 407 (1988).
xiii. P.P. Crowe et al., Science. 264. 707 (1994). (J. Browning et al., Cell. 72, 847 (1993); J. Browning et
al., J. Immunol., 154, 33 (1995)).
xiv. P. De Togni et al., Science 264, 703 (1993); T. A. Banks et al., J. Immunol. 155, 1685 (1995).
xv. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol., 143, 1859 (1989); J. Browning et al., J.Exp.Med., 183, 867
(1996).
xvi. T. Suda et al., J. Immunol., 154, 3806 (1995); T. Suda et al., J. Immunol., 154, 3806 (1995).
xvii. B. C. Trauth et al., Science, 245, 301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp. Med., 169, 1747 (1989); S.
Nagata and P. Goldstein, Science, 267, 1449 (1995) ; M. H. Falk et al., Blood, 79, 3300 (1992).
xviii. F. Rieux-Laucat et al., Science, 268, 1347 (1995); T. Takahashi et al., Cell, 76, 969 (1994); R.
Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356, 314 (1992).
xix. P. R. Galle et al., J. Exp. Med., 182, 1223 (1995).
xx. F. Silvestris et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 75, 197 (1995).
xxi. P. D. Katsikis et al., J. Exp. Med., 181, 2029 (1995); A. D. Badley et al., J. Virol., 70, 199 (1996).
xxii. S. Wiley et al., Immunity. 3, 673 (1995).
xxiii. J. F. Gauchat et al., FEBS Lett., 315, 259 (1993); S. Funakoshi et al., Blood. 83, 2787 (1994).
xxiv. R. C. Alien et al., Science. 259, 990 (1993).
xxv. L. Biancone et al., Kidney-Int. 48, 458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol., 154, 1470 (1995).
xxvi. J. Ruby et al., Nature Medicine. 1, 437 (1995).
xxvii. Z. Wang et al., J. Immunol., 155, 3722 (1995); A. M. Cleary et al., J. Immunol., 155, 3329 (1995).
xxviii. S. Hess and H. Engelman, J. Exp. Med., 183, 159 (1996).
- 17 -
005411
xxix. R. G. Goodwill et al., Cell, 73, 447 (1993);
Goodwin et al., Eur. J. Immunol., 23, 2631 (1993); C. A. Smith et al., Cell, 73, 1349 (1993).
xxx. Cм., например, Narang, S. A. Tetrahedron 39, 3 (1983); Itakura et al. Recombinant DNA. Proc 3rd
Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp 273-289 (1981); Itakura et al.
Annu. Rev. Biochem. 53, 323 (1984); Itakura et al. Science 198, 1056 (1984); Ike et al. Nucleic Acid Res. 11,
477 (1983).
xxxi. Cм., например, Scott et al. Science 249, 386-390 (1990); Roberts et al. PNAS 89, 2429-2433 (1992);
Devlin et al. Science 249, 404-406 (1990); Cwirla et al. PNAS 87, 6378-6382 (1990); a также патенты США
№№ 5223409, 5198346 и 5096815.
33. M. T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D. H. Lynch and S. R. Targan. Divergent induction of apoptosis and
IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF-" and ligation of Fas ligand. J. Immunol. 155:4147-4154, 1995.
34. K. Agematsu, T. Kobata, P.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Mori, K. Sugita, C.
Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B cell IgG and IgM synthesis. Eur. J.
Immunol. 25:2825-2829, 1995.
35. R. Amakawa, A. Hakem, T.M. Kundig, T. Matsuyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A. Wakeham, H.-W.
Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T.W. Mak.
Impaired negative selection of T cells in Hodgkin's disease antigen CD30-deficient mice. Cell 84: 551-562,
1996.
36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hermann, V. Steiner, M. Thome, T. Bomand, M. Hahne, M.
Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R. MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a
novel apoptosis-mediating receptor with sequence homology to tumor necrosis factor receptor 1 and fas (apo1/CD95). Immunity 6: 79-88, 1997.
37. J. Brojatsch, J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Carl, a TNFR-related protein is a
cellular receptor for cytopathic avian leukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell 87:845-855, 1996.
38. J.L. Browning, M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associated 33-kDa glycoprotein
are expresed on the surface of an activated human T cell hybridoma. J. Immunol. 147: 1230-7, 1991.
39. J.L. Browning, K. Miatkowski, D.A. Griffiths, P.R. Bourdon, C. Hession, C.M. Ambrose and W.
Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human
lymphotoxins alpha and beta. J. Biol. Chem. 271: 8618-26, 1996.
40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P.W. Finn and D.L. Perkins. Fas
Modulation of apoptosis during negative selection ofthymocytes. Immunity 5: 617-627, 1996.
41. C.-Y. A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements:
characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol. Sci. 20: 465-470, 1995.
42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouse macrophages of a new 4 kb mRNA
present in hematopoietic tissue which shares a short nucleotide sequence with erythropoietin mRNA. Biochem.
Biophys. Res. Comm. 209: 1076-1081, 1995.
43. A.M. Chinnaiyan, K. O. Rourke, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan, L. Xing, R. Gentz, J. Ni
and V.M. Dixit. Signal transduction by DR3 a death-domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.
Science 274: 990-992, 1996.
44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in
lymphotoxin. Science 264: 703-7, 1994.
45. M.A. DeBenedette, N.R. Chu, K.E. Pollok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S. Kwon and T.H. Watts. Role of
4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M 12 B lymphomas by cAMP. J.
Exp. Med. 181: 985-992, 1995.
46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W.S. Din, P.J. Smolak, R.G. Goodwin and C.A. Smith. Activation
of the lymphotoxin-β receptor by cross-linking induces chemokine production and growth arrest in A375
melanoma cells. J. Immunol. 158: 1756-1762, 1997.
47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Buhlmann and R.J. Noelle. Immune regulation by CD40 and its
ligand gp39. Ann. Rev. Immunol. 14: 591-617, 1996.
48. H.J. Gruss, N. Boiani, D.E. Williams, R.J. Armitage, C.A. Smith and R.G. Goodwin. Pleiotropic effects
of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and lymphoma cell lines. Blood 83: 2045-56, 1994.
49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of
malignant lymphomas. Blood 85: 3378-404, 1995.
50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun, C.J. Grinham, R.Brown and
S.N. Farrow. A death domain-containing receptor that mediates apoptosis. Nature 384: 372-375, 1996.
51. S.Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T cell receptor-dependent cell death of T cell hybridomas mediated
by the CD30 cytoplasmic domain in association with tumor necrosis factor receptor-associated factors. J. Exp.
Med. 183: 669- 674, 1996.
52. R.I. Montgomery, M.S. Wamer, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex virus-1 entry into cells
mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87: 427-436, 1996.
53. S. Nagata. Apoptosis by death factor. Cell 88: 355-365, 1997.
- 18 -
005411
54. R.M. Pitti, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi. Induction of
apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family. J. Biol. Chem, 1996.
55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins:
activation, costimulation, and death. Cell 76: 959-62, 1994.
56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host response to infection. Trends in Microbiol. 3: 8188, 1994.
57. E. Strueber and W. Strober. The T cell-B cell interaction via OX40-OX40L is necessary for the T cell
independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183: 979-989, 1996.
58. H.-K. Sytwu, R.S. Liblau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigeninduced programmed cell death in T cell receptor trangenic mice. Immunity 5: 17-30, 1996.
59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452, 1992.
60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in
mature T cells by tumour necrosis factor. Nature 377: 348-351, 1995.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение антитела, специфично связывающегося с полипептидом индуцирующего пролиферацию лиганда (APRIL) SEQ ID NO: 2 или его растворимым фрагментом и препятствующего связыванию
полипептида лиганда APRIL и полипептида рецептора APRIL, для получения лекарственного препарата
для лечения, подавления или изменения роста опухолевой клетки, лечения злокачественной опухоли или
лечения гиперплазии.
2. Применение по п.1, где указанная опухолевая клетка, указанная злокачественная опухоль или
указанная гиперплазия вызывает экспрессию полипептида лиганда APRIL.
3. Применение по п.1, где указанная опухолевая клетка, указанная злокачественная опухоль или
указанная гиперплазия вызывает экспрессию полипептида рецептора APRIL.
4. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело вводят в сочетании с химиотерапевтическим средством.
5. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело вводят в сочетании с лучевой терапией.
6. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело реактивно по отношению к полипептиду SEQ ID NO: 2 или его фрагменту и где указанное антитело препятствует связыванию указанного полипептида лиганда APRIL и полипептида рецептора APRIL.
7. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело применяют в приготовлении лекарственного препарата для лечения гиперплазии.
8. Применение по п.7, где указанная гиперплазия является следствием ревматоидного артрита.
9. Применение по п.8, где указанная гиперплазия представляет собой паннус.
10. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело применяют в приготовлении лекарственного препарата для лечения роста опухолевой клетки.
11. Применение по любому из пп.1-3, где указанное антитело применяют в приготовлении лекарственного препарата для лечения злокачественной опухоли.
- 19 -
005411
Фиг. 1
Фиг. 2A-C
- 20 -
005411
Фиг. 2D
Фиг. 3
- 21 -
005411
Фиг. 4
Фиг. 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 22 -