РЕГУЛЯЦИЯ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ PPARα, β, γ В
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр «Биоинженерия» Российской академии наук На правах рукописи ЧИСТЯКОВ ДМИТРИЙ ВИКТОРОВИЧ РЕГУЛЯЦИЯ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ PPARα, -β, -γ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В УСЛОВИЯХ ГИПЕРГЛИКЕМИИ. 03.01.03 – Молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Академик РАН, К.Г. Скрябин Москва – 2014 1 Оглавление Список сокращений 5 Введение 6 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 1.1. Врожденный иммунитет как защитная система организма 8 1.1.1. Воспаление как ответ системы врожденного иммунитета 1.1.2. Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма 9 11 1.2.Толл-подобные рецепторы (TLR) как часть системы врожденного иммунитета на молекулярном уровне 12 1.2.1. Строение и локализация Толл-подобных рецепторов 12 1.2.2. Внутриклеточная сигнализация Толл-подобных рецепторов 14 1.2.3. Экзогенные и эндогенные лиганды толл-подобных рецепторов 16 1.2.4. Толл-подобные рецепторы в головном мозге 18 1.3. Ядерные рецепторы PPAR на перекрестке метаболических и регуляторных сигнальных путей. 21 1.3.1. Структурные свойства PPAR и механизмы регуляции ими экспрессии генов 22 1.3.2. Экзогенные и эндогенные лиганды PPAR 24 1.3.3. Роль PPAR в регуляции генов липидного метаболизма 25 1.3.4. Регуляция PPAR на молекулярном уровне 30 1.4. Анализ подходов к изучению регуляции ядерных рецепторов PPARα, β, γ при стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии. 1.4.1. Клеточные модели гипергликемии 31 33 1.4.2. Астроциты как объект исследования врожденного иммунитета в центральной нервной системе 33 1.4.3. Изучение регуляции экспрессии генов с помощью ингибиторов белкового синтеза. Явление супериндукции. 36 1.4.4. Деградация мРНК как один из механизмов регуляции экспрессии 40 1.5. Постановка целей и задач исследования 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41 43 2 2.1. Приборы 43 2.2. Реактивы и препараты 43 2.3. Выделение и культивирование клеточных линий 46 2.3.1. Первичные астроциты крысы 46 2.3.2. Клеточная культура HeLa 47 2.3.3. Клеточная культура С6 48 2.3.4. Оценка пролиферации клеток 48 2.4. Выделение тотальной РНК 49 2.5. Определение экспрессии генов 51 2.6. Иммуноблотинг и электрофорез 53 2.7. Измерение концентрации простагландина (PG) Е2 54 2.8. Измерение ДНК-связывающей активности PPAR 55 2.9. Статистический анализ 57 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 58 3.1. Характеристика воспалительного процесса в условиях гипергликемии на клетках линии HeLa. 58 3.1.1. Влияние LPS на экспрессию генов COX-1 и COX-2 в клетках, культивируемых с высокой концентрацией глюкозы 59 3.1.2. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов COX-1 и COX-261 3.1.3. Влияние LPS на уровень экспрессии генов PPARα, PPARβ и PPARγ 63 3.1.4. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов PPARα, -β и -γ. 64 3.2. Характеристика TLR-стимулированных ответов астроцитов в условиях гипергликемии 69 3.2.1. Морфология и иммуноцитохимия по GFAP для астроцитов культивируемых при разной концентрации глюкозы. 69 3.2.2. Влияние глюкозы на выброс PGE2 и TNFα в астроцитах при активации системы врожденного иммунитета. 71 3.2.3. Изменение экспрессии и ДНК-связывающей активности PPARα, -β, -γ при культивировании астроцитов в условиях гипергликемии. 72 3 3.2.4. Влияние глюкозы на экспрессию трех изоформ PPAR в условиях активации системы врожденного иммунитета. 74 3.2.5. Модуляция LPS-стимулированного воспалительного ответа в астроцитах с помощью MAPK ингибиторов в условиях повышенной концентрации глюкозы в среде культивирования. 77 3.3. Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах. 81 3.3.1. TLR-агонисты подавляют уровень экспрессии PPARα и PPARγ, но увеличивают экспрессию PPARβ 81 3.3.2.Характеристика LPS-стимулированной экспрессии мРНК и белка PPARα, -β, -γ. 86 3.3.3. Скорость распада мРНК PPARα, -β, -γ. замедляется при активации TLR4. 91 3.3.4. Активация p38 и скорость деградации мРНК 93 3.3.5. Модуляция экспрессии и активности PPARα, -β, -γ различными ингибиторами MAPK 3.3.6. Роль p38 в регуляции экспрессии PPARα, -β, -γ. 94 103 3.3.7. Роль циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ. 104 3.3.8. Регуляция СОХ-2 в астроцитах при стимуляции TLR 107 3.3.9. Обобщенная схема регуляции изоформ PPAR в LPS-стимулированных астроцитах. 114 4. ВЫВОДЫ 118 5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119 4 Список сокращений LPS – Липополисахарид клеточной стенки бактерий MAPK - митоген-активируемая протеинкиназа ERK - киназа, регулируемая внеклеточными сигналами JNK - c-Jun-N-терминальная киназа FGL - флагеллин PGN - пептидогликан PPAR – рецеторы активаторов пролиферации пероксисом TLR – Толл-подобный рецептор PG – простагландин TNFα, - фактор некроза опухоли IL – интерлейкин DAMP - Молекулярный паттерн , ассоциированная с повреждениями PAMP - патоген-ассоциированный молекулярный паттерн GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок COX - циклооксигеназа 5 Введение В последнее десятилетие значительно повысился интерес к исследованиям системы врожденного иммунитета, поскольку стало понятно, что нарушения механизмов неспецифической защиты организма имеют отношение не только к клеткам иммунной системы, но и ко всем другим клеткам организма. Активация врожденного иммунитета сопровождается развитием воспалительных процессов и, как следствие, участвует в патогенезе системных заболеваний с воспалительной компонентой. К таким заболеваниям относят диабет 2 типа, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания и другие. Более того, у пациентов с гипергликемией и гиперлипидемией наблюдаются нарушения в протекании воспалительных процессов, что указывает на взаимосвязь метаболизма, потребления энергии и системы врожденного иммунитета. Ядерные рецепторы PPAR (дословный перевод «рецепторы активации пролиферации пероксисом») относят к факторам транскрипции, которые регулируют пересечение воспалительных процессов и энергетического метаболизма. Существует три изоформы этих рецепторов α, β, γ, которые имеют структурное сходство, ряд общих агонистов, но кодируются разными генами. Синтетические специфические агонисты PPARα и PPARγ используют для лечения гипергликемии и гиперлипидемии, а также исследуются как потециальные противовоспалительные препараты. Агонисты PPARβ считаются перспективными для лечения ожирения и нарушений механизмов восстановления и регенерации тканей. Терапевтическая привлекательность использования агонистов привела к значительному количеству исследований PPAR на молекулярном уровне. Однако, основное внимание уделено характеристике действия агонистов и активируемых ими рецепторов на различные клеточные ответы, в то время как регуляция самих рецепторов PPAR изучена относительно мало. В то же время, понимание молекулярных механизмов регуляции этих рецепторов может дать ключ к управлению 6 процессов на пересечении метаболических, энергетических и воспалительных процессов. Традиционно изучают изоформы PPAR на разных клеточных объектах. Однако в исследованиях последних лет было показано, что при разворачивании клеточных ответов на различные стимулы изоформы PPAR вступают на регуляторном уровне во взаимодействие между собой. Поэтому в данной работе выбраны для исследования типы клеток, на которых экспрессированы все три изоформы (линии клеток человека HeLa, глиомы крысы С6, первичные астроциты крысы). Изучение воспалительных процессов в центральной нервной системе, которая защищена от проникновения «чужеродных» стимулов представляет особый интерес. Исследования последних десятилетий показывают, что на клеточном уровне воспалительные процессы характерны для различных заболевания мозга, в том числе рассеянный склероз, вторичные травмы, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Важную роль при этом играют глиальные клетки мозга - астроциты и микроглия. Если микроглию по своим основным функциям можно отнести к клеткам иммунной системы, то основная роль астроцитов заключается в энергетическом, метаболическом и сигнальном сопровождении функций нейронов. Понимание молекулярного механизма регуляции PPAR на астроцитах при активации врожденного иммунитета является актуальной задачей современных исследований в нейробиологии. Активация системы врожденного иммунитета происходит через рецепторы различных классов, наиболее изученным из которых являются толл-подобные рецепторы (TLR), расположенные на плазматической и внутриклеточных мембранах большинства клеток. В данной работе фокус исследований на взаимосвязи TLR, локализованных на плазматических мембранах (типы TLR2, TLR4, TLR5) и трех изоформ PPAR – PPARα, PPARβ, PPARγ. Целью работы являлось установление механизмов регуляции ядерных рецепторов трех изоформ при стимуляции указанных TLR. Исследования 7 молекулярных процессов проводили на клеточных моделях. Условия гипергликемии создавали адаптацией клеток к повышенному содержанию глюкозы, т.е на клеточном уровне. Такой подход позволил построить общую схему регуляции PPAR с учетом регуляции на пост-транскрипционном уровне и оценить возможность направленного управления процессом с использованием ингибиторов митогенактивированных протеинкиназ (MAPK). 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Врожденный иммунитет как защитная система организма В классическом представлении иммунитет — это сопротивляемость организма к инфекциям и инвазиям чужеродных организмов, обладающих антигенными свойствами. Традиционно в иммунной системе выделяют врожденную и приобретенную компоненту. Приобретенный специфический иммунитет реализуется В и Т лимфоцитами. Эти клетки снабжены специальными рецепторами, распознающими антигены, с помощью которых осуществляется процесс распознавания, своего антигена от чужого. Затем, при необходимости, включаются иммуноглобулинов. После механизмы этого продукции ответа остается антител — специфическая иммунологическая память, которая позволяет намного быстрее среагировать при повторном попадании в организм уже ―знакомого‖ антигена. Хотя приобретенный иммунитет обладает крайне высокой специфичностью и эффективностью в борьбе с чужеродными организмами, с момента поражения организма проходит от трех до пяти дней до момента эффективного включения иммунного ответа. В связи с этим, особую актуальность приобретают механизмы врожденного иммунитета, которые активизируются сразу после инфицирования, и запускают процессы подавления болезнетворных агентов. Эти защитные механизмы включают различные 8 антимикробные пептиды, фагоциты, альтернативный путь комплемента и многие другие [1]. На уровне клетки до недавнего времени врожденный иммунитет рассматривался как неспецифические иммунные реакции, вызванные клетками-фагоцитами (макрофаги, нейтрофилы), которые захватывают и лизируют микробиологические патогены. Однако, в настоящее время показано, что на молекулярном уровне система врожденного иммунитета существует во всех типах клеток, она играет роль не только при попадании чужеродного организма, но и при нарушениях нормального функционирования организма по «внутренним» причинам, такими как тепловой шок, гибель клеток, воздействие различных химических веществ и другими стимулами, не связанными с иммунной системой в еѐ «классическом» описании. Нарушения системы врожденного иммунитета сопровождают ряд патологических состояний. В настоящее время исследования системы врожденного иммунитета стали фокусом многих исследований (см, например, обзоры [1,2]). Понимание молекулярного механизма функционирования этой системы связывают с лечением, так называемых системных заболеваний, таких как атеросклероз, диабет 2 типа, инсульт, хронические респираторные заболевания, некоторые формы рака и другие [3–5]. Для всех этих заболеваний характерны протекание воспалительных процессов, которые на молекулярном уровне являются проявлениями изменений в системе врожденного иммунитета. 1.1.1. Воспаление как ответ системы врожденного иммунитета Врожденный иммунитет проявляется при развитии воспаления. На уровне ткани, острое воспаление характеризуется покраснением, увеличением температуры, болью и отеком, что является результатом местной иммунной реакции. Воспалительный процесс сам по себе является эволюционно выработанной защитной реакцией организма. Активируются процессы, удаляющие воздействие на стимул. Включаются процессы, восстанавливающие 9 поврежденные ткани. На молекулярном уровне выделяют стадию инициации, развития и завершения воспалительного ответа (Рис. 1.1.). Рис.1.1. Развитие воспалительного ответа во времени На стадии инициации стимул связывается с рецептором и запускает внутриклеточные сигнальные процессы, которые приводят к высвобождению провоспалительных молекул различного типа. Эти молекулы – цитокины, хемокины, другие белки, а также низкомолекулярные вещества, в первую очередь, простагландины (PG) и NO [6,7]. Задача этой стадии – усилить ответ, мобилизовать защитные ресурсы организма. Одновременно или через некоторое время (это остается нерешенным вопросом в настоящее время) появляются и антивоспалительные вещества, которые уменьшают интенсивность ответа и ограничивают продолжительность стадии инициации [8,9]. Восстановление системы до исходного состояния происходит на стадии разрешения ответа. Раньше представляли, что завершение воспаления – это пассивный процесс, однако в настоящее время регуляцию этой стадии считают ключом к терапии системных заболеваний [8,10]. Избыточная реакция организма (клетки) на стадии инициации приводит к гибели организма (например, сепсис), нарушения стадии восстановления приводит к возникновению хронических воспалительных 10 процессов, которые и составляют «воспалительную компоненту» многих системных заболеваний. Особый интерес представляет воспаление в центральной нервной системе (ЦНС). Ранее этому вопросу уделялось недостаточно внимания, поскольку ЦНС хорошо защищена от проникновения «чужеродных» стимулов. В исследованиях последних десятилетий показано, что воспалительные процессы характерны для различных заболеваний мозга, таких как рассеянный склероз, вирус- ассоциированная деменция иммунодефицита человека, вторичные травмы, болезни Альцгеймера и Паркинсона (смотри обзоры [10,11]. Исследования показывает, что ингибирование воспалительных процессов является одним из наиболее важных механизмов в предотвращении повреждения мозга в ходе развития нейродегенеративных процессов [10,12]. 1.1.2. Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма Из того факта, что система врожденного иммунитета отвечает на различные изменения в окружающей среде (как внешней, так и внутренней, как относительно организма, так и относительно отдельных клеток), логично вытекает предположение, что изменения в метаболизме, структурном или энергетическом, тоже должны быть связаны с системой врожденного иммунитета. Действительно, в настоящее время возникло ясное понимание, что болезни с нарушением метаболизма, такие как диабет 2 типа, ожирение, гипергликемия, вызывают нарушение воспалительного ответа [4,13]. Известно, что ожирение приводит к слабой активации систем воспалительного ответа, и развитию хронических воспалительных процессов в организме, и в первую очередь это связывают с нарушениями в регуляции системы TLR, как на уровне организма, так и на уровне клеток. [14–16]. Гипергликемия, т.е. повышение уровня глюкозы в крови, характерно для многих нарушений гомеостаза, в первую очередь, для диабета 2 типа [3]. Поэтому взаимосвязь гипергликемии и системы врожденного иммунитета изучается на разных тканях и клетках. Но особый интерес представляет нервная 11 система. Клетки мозга чрезвычайно чувствительны к изменению содержания глюкозы в крови [17]. Длительное изменение уровня глюкозы при гипергликемии вызывает изменения в функциях клеток нервной системы (нейронов и клеток глии) [18]. Увеличивается риск появления когнитивных нарушений, деменции, депрессии и инсульта [19,20]. На клеточном уровне показано, что гипергликемия сопровождается увеличением гибели нейронов и активацией астроцитов, вызывая глиозис [21,22]. Таким образом, понимание на молекулярном уровне регуляции системы врожденного иммунитета и ее взаимосвязи с различными метаболическими нарушениями в организме является актуальной задачей современных исследований. 1.2.Толл-подобные рецепторы (TLR) как часть системы врожденного иммунитета на молекулярном уровне В общем случае клетки млекопитающих узнают о присутствии патогенов с помощью группы рецепторов, называемых паттерн узнающие рецепторы (PRRs, pattern recognition receptors). Эти рецепторы специализируются на распознавании консервативных молекулярных структур патогенов. Эти структуры называют патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) [23,24]. В этой группе выделяют семейства Толл-подобных, RIG-I подобных, Нод-подобных и цитозольных ДНК рецепторов [1]. Наиболее изученными на молекулярной уровне являются Толл-подобные рецепторы. Рассмотрим их подробнее. 1.2.1. Строение и локализация Толл-подобных рецепторов В 1985 году биолог Кристиана Нюсляйн-Фольхард в ходе работы над дрозофилами идентифицировала ген названный Толл, ответственный за эмбриональное развитие дрозофилы (цит. по [23]). В 1997 году Руслан Меджитов с соавторами клонировали человеческий гомолог Толл-белка дрозофилы, который теперь известен как TLR4, и показали, что активация этого 12 белка приводит к развитию врожденного иммунного ответа [25]. Было показано, что TLR4 участвует в воспалительном ответе при обработке мышей липополисахаридом (LPS) [26]. Эти открытия стимулировали исследования вызванной патогенами внутриклеточной передачи сигналов, которые имеют решающее значение для понимания механизмов, регулирующих врожденный иммунитет [27]. Толл-подобные рецепторы, характеризуются тремя основными доменами: 1) богатый лейцином внеклеточный домен, 2) трансмембранный домен, 3) цитоплазматический TIR домен, гомологичный подобному в IL-1 рецепторе, называемый Toll/IL-1 рецептор (TIR) домен [28]. Узнавание TLR лиганда обусловлено внеклеточным доменом, который содержит лейцин-богатые повторы (LRR) содержащие 19-25 копий [29] (Рис. 1.2). Внутриклеточный домен отвечает за образование гомо- и гетеромеров между TLR, т.е. с аналогичными белками или белками других TLR рецепторов. При образовании гетеродимеров их обозначают таким образом: TLR1/2 (гетеродимер TLR1 и TLR2). Также внутриклеточный домен отвечает за взаимодействие с адапторами, содержащими TIR домены [30]. Образование таких белковых комплексов приводит к активации TLR-сигнальных путей. Рис.1.2. Строение Толл-подобного рецептора. 13 На данный момент обнаружено 10 различных TLR рецепторов у человека и 13 TLR рецепторов у мышей [24,31]. Среди них TLR1-10 общие у людей и мышей, хотя TLR10 не функционален у мышей из-за ретровирусной вставки, в то время как TLR11-13 у людей не обнаружены (цит. по [23]). TLR рецепторы можно разделить на 2 большие группы, в зависимости от их локализации в клетке. Первая группа включает в себя TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 и TLR11, которые расположены на плазматической клеточной мембране, и отвечают за распознавание фрагментов клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий, липопротеинов и белков. Вторая группа рецепторов включает в себя TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9. Эти рецепторы расположены на мембранах внутри клеток, в эндоплазматическом ретикулуме, эндосомах и лизосомах. и отвечают за распознавание бактериальных и вирусных нуклеиновых кислот [23]. Толл-подобные рецепторы характерны не только для иммунных клеток, таких как макрофаги, дендритные клетки, B и Т-лимфоциты, но и для неиммунных клеток, включая фибробласты и эпителиальные клетки, а также клетки нервной системы [12]. 1.2.2. Внутриклеточная сигнализация Толл-подобных рецепторов Стимуляция TLR приводит к активации сложной системы внутриклеточных ответов, который включает в себя различные адапторные белки, киназы, факторы транскрипции (Рис. 1.3). После связывания лиганда рецепторы TLR образуют гомодимеры или гетеродимеры [1,23], и запускают сигнальный каскад к ядру клетки через так называемые MyD88-зависимый и MyD88-независимый пути [23,24]. MyD88 это цитозольный адаптерный белок, участвующий в передаче сигнала всех TLR, кроме TLR3. TLR1-2 и TLR5-13 действуют только через MyD88-зависимый путь. Толл-подобные рецепторы использующие этот путь могут активировать транскрипционный фактор АР-1 [2] через так называемый МАРК сигнальный путь (МАРК – митогенактивируемые протеинкиназы) [23], NF-κB [32] или регуляторный фактор интерферона 5 [7]. 14 Рис.1.3. Схема внутриклеточных сигнальных путей для плазматических TLR TLR4 реализует свой сигнал как через MyD88-зависимый, так и MyD88-независимый путь (Рис. 1.3). MyD88-зависимый путь в TLR4 сигнальном пути требует взаимодействия MyD88 с адаптерным белком TIRAP (адаптерный белок содержащий TIR домен) для инициации сигнального каскада, приводящего к транслокации ядерного фактора NF-κB и активации MAPK сигнального пути [1]. Различают такие МАРК пути как ERK-CREB, JNK-AP1 и p38 пути (Рис. 1.3.). Это приводит к стимуляции экспрессии и быстрому синтезу различных цитокинов, хемокинов и их рецепторов, включая TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-23 [33]. А также экспрессии индуцибельной NO синтетазы и циклооксигеназы 2 (COX-2), ферментов, принимающих участие в 15 синтезе NO и простагландинов, важных маркѐров воспаления [34,35]. Таким образом, нисходящий каскад передачи сигнала вызванного активацией TLR завершается регуляцией множества целевых генов, кодирующих цитокины, хемокины, факторы роста, различные ферменты и другие медиаторы воспаления [34,35]. Чрезмерное и/или слишком длительное действие медиаторов воспаления может быть вредно для клеток и ткани. Поэтому TLR-сигнальный путь контролируется с помощью различных механизмов обратной связи [36,37]. С другой стороны, MyD88-независимый сигнальный путь контролируется другими адаптерными белками (Рис. 1.3). Среди них TICAM-1 (TLR адаптерный белок 1), TICAM-2, TRIF (содержащий TIR-домен), TRAM (TRIF-related adaptor molecule). Адапторные белки активируют транскрипционный фактор IRF3 (IFN регуляторный фактор 3) и последующий синтез IFN-β и хемокина RANTES (Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted) [23]. Таким образом, между сигналами с разных типов TLR существует как сходство, так и различие. Если первоначальные исследования фокусировались обычно на одном типе рецепторов, то последнее время стало актуальным изучение взаимодействия между сигнальными путями TLR [36,38]. Это особенно существенно в контексте изучения патологий, когда изменения в активности одних рецепторов влияют на другие. Такие изменения могут происходить при развитии хронических воспалений [39], метаболических нарушениях [4,13], т.е. во всех случаях включения механизмов обратных связей и взаимодействия между отдельными путями на системном уровне. 1.2.3. Экзогенные и эндогенные лиганды толл-подобных рецепторов Толл-подобные рецепторы специфичны к различным лигандам эндогенного происхождения. Как уже упоминалось, LPS грамотрицательных бактерий узнает TLR4 [2,26]. TLR2 совместно с TLR1 и TLR6 распознают различные компоненты бактерий, такие как пептидогликан, липопептиды, липопротеин грамположительных бактерий и липопептиды микоплазмы [2]. В частности TLR1/2 и TLR2/6 узнают триациллипопептиды и диацил липопептиды 16 соответственно. TLR3 узнает двойную цепь РНК которая производится различными вирусами в ходе репликации [35]. TLR5 узнает бактериальный флагеллин [40]. Мышиный TLR11 распознает компоненты уропатогенных бактерий и пролифин-подобные молекулы простейшего паразита Toxoplasma gondii [41]. TLR7 узнает синтетические имидазохинолин-подобные молекулы, аналоги гуанозина, такие как локсобрин, одноцепочечные РНК полученные из ВИЧ тип 1 и т.д. TLR8 человека узнает бактериальную РНК, мышиный TLR8, который крайне близок к TLR7, по всей видимости, не функционален [23]. TLR9 узнает бактериальные и вирусные CpG ДНК мотивы и малярийный пигмент хемозоин [12]. Важно отметить, что Толл-подобные рецепторы играют важную роль в неинфекционных состояниях. Например, при инсультах и других повреждениях (клеточный стресс, травмы или гибель), когда клетка синтезирует и/или выбрасывает различные вещества. Такие вещества, называют DAMP (damageassociated molecular patterns). DAMP могут связывать и активировать TLR, что приводит к «стерильному» воспалению, когда система передачи сигнала TLR активирована без внешнего воздействия патогенами. Как эндогенные лиганды чаще всего рассматривают белки теплового шока, фибринонектины, олигосахариды, сульфат гепарина, насыщенные жирные кислоты и фибриноген [23]. Интересно что многие из этих веществ способны активировать TLR без существенного структурного сходства с их природными лигандами (эндотоксинами или липопротеинами) [42]. В связи с тем, что врожденный иммунитет активно участвует в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, роль эндогенных лигандов для TLR в ткани мозга активно изучают. Показано, что как DAMP могут выступать следующие молекулы: белки теплового шока, β-амилоид (Aβ), гиалуронан, сульфат гепарина, ДНК или РНК иммунные комплексы, окисленные липопротеины низкой плотности (oxLDL) и другие [43–45]. Из-за неясной природы взаимодействия эндогенных лигандов с TLR, для исследования TLR-запускаемых сигнальных путей используют специфические 17 лиганды экзогенной природы. Их механизм действия более понятен на молекулярном уровне, хотя и не скажешь, что ситуация такая же ясная, как в случае G-белок связывающих рецепторов, которые имеют низкомолекулярные лиганды. Для плазматических TLR, расположенных на используют следующие специфические агонисты: пептидогликан (TLR2), флагелин (TLR5), липополисахарид (TLR4) [2,40]. Наиболее изученным рецептором можно считать TLR4. Для этого рецептора даже предложен специфический селективный ингибитор CLI-095, который связывается с внутриклеточным доменом TLR4, что приводит к блокировке передачи сигнала с этого рецептора [46]. Таким образом, CLI -095 можно рассматривать как антагонист данного типа рецептора. 1.2.4. Толл-подобные рецепторы в головном мозге Роль Толл-подобных рецепторов (TLR) в центральной нервной системе в последнее десятилетие вызывает пристальное внимание исследователей, и рассмотрена в многочисленных обзорах [35, 41, 143]. Известно, что нейровоспалительные процессы это важный фактор сопровождающий различные нейродегенеративные расстройства [11,30]. Показано, что TLR вовлечены в различные заболевания ЦНС, участвуют в процессе гибели нейронов, повреждении ГЭБ, отеке мозга и воспалительных реакциях вызванных ишемией (смотри обзоры [48,49]), участвуют в развитии и прогрессе ряда нейродегенеративных заболеваний [11,30]. Как и в периферических органах, различные Толл-подобные рецепторы активно экспрессированы в нервной системе. Считается, что TLR рецепторы есть в микроглии [50], астроцитах [51,52] и олигодендроцитах [53]. Хотя наличие TLR рецепторов у нейронов до сих пор является спорным вопросом, немало свидетельств указывает на важную роль этих TLR в физиологическом и патологическом состояниях [11]. Они включены в защиту организма от микробиологического проникновения в ЦНС. Так же показано, что TLR участвуют в некоторых не-иммунных процессах, таких как костный метаболизм 18 [54], нейрогенез [55] и развитие мозга [56]. Они играют важную роль в развитии ткани, клеточной миграции и дифференциации и в ограничении воспаления, и в организации восстановительных процессов после травмы. В модели нейродегенерации in vivo показано, что введение LPS способно стимулировать врожденный иммунитет, вызывая значительное снижение количества нейронов в коре головного мозга. В тоже время животные, имеющие мутацию в гене TLR4 устойчивы к повреждениям нейронов, что указывает на взаимосвязь между TLR, врожденным иммунитетом и нейродегенеративными заболеваниями [49]. Показано, что TLR4 опосредованная активация NF-κB играет важную роль в развитии воспалительных процессов в мозгах при болезнях ЦНС [57] за счет активации транскрипции различных провоспалительных генов, включая цитокины, хемокины, и такие ферменты как циклооксигеназа 2 (СОХ-2) и матричная металлопротеиназа 9 (ММР-9) [10,58]. Недавние исследования так же показывают, что TLR4 является важным элементом в этанол-стимулированном воспалении в мозгу, так как нокдаун TLR4 снимает активацию MAPK и NF-κB сигнальных путей, а так же синтез воспалительных медиаторов в астроцитах [59]. Показано, что дефицит TLR2 и TLR4 подавляет экспрессию воспалительных цитокинов в лейкоцитах через 1 день после ишемии головного мозга, тем самым демонстрируя, что и TLR2 и TLR4 сигнальные каскады важны для запуска пост-ишемического воспаления [48]. Была также предложена молекулярная модель LPS-стимулированной нейропротекции от ишемического поражения [43], согласно которой предобработка LPS животных перепрограммирует TLR4 сигнальный путь, направляя его при инсульте по нейропротекторному пути через TRIF к IRF3. Среди всех TLR, TLR2 наименее селективен, и способен распознавать большое количество различных патогенов. Комплекс из TLR2 и TLR1 или TLR6 вовлечен в распознавание бактериальных липопротеинов [23,35]. TLR2 так же может взаимодействовать с другими белками, такими как CD36 или CD14 и 19 может вызывать мультимеризацию в ответ на различные микробные лиганды [23,60]. Интересно, что LPS вызывает усиление экспрессии TLR2 в мозгу, при этом сам TLR2 не является мишенью для LPS и не модулирует иммунный ответ на LPS [61]. В отличие от TLR2 в ЦНС TLR4 конститутивно экспрессируется в микроглии [49], и его лиганд LPS индуцирует продукцию воспалительных медиаторов, таких как TNFα, IL-6, NO [35] через NF-κB зависимый путь. Активация TLR4 приводит к образованию нейротоксичных веществ, таких как провоспалительные цитокины, NO, активные формы кислорода (ROS) и пероксинитрита [34,62]. Более того, микроглия активированная LPS синтезирует большое количество глутамата, важного нейромедиатора, который в некоторых случаях действует как мощный нейротоксин [63]. LPS так же может активировать TLR4 на поверхности микроглии, что приводит к травмам олигодендроцитов [64]. Астроциты иммунитета являются центральной основными нервной клетками системы, системы которые врожденного вовлечены в патологический процессы многих неврологических заболеваний [65]. Эти клетки обладают рядом Толл-подобных рецепторов (TLR), которые позволяют им распознавать и реагировать на широкий спектр патогенов [65]. Выдвинуто предположение, что более полное понимание функций и механизмов работы TLR и сопровождающих их активацию сигнальных путях приведет к разработке эффективных методов терапии различных заболеваний ЦНС, таких как инсульт, болезнь Альцгеймера, множественный склероз и различные инфекционные заболевания [34,66]. Понимание функции и изучение способов регулирования системы активации TLR, как с помощью эндогенных лигандов, так и синтетических соединений на разных стадиях сигнального пути поможет разработать эффективные методы борьбы с болезнями нервной системы. 20 1.3. Ядерные рецепторы PPAR на перекрестке метаболических и регуляторных сигнальных путей. В настоящее время перекрестком, регулирующим пересечение метаболизма и воспаления, считают факторы транскрипции, из которых ведущую роль отводят ядерным рецепторам PPAR. Рецепторы активаторов пролиферации пероксисом (PPAR, peroxisome proliferator-activated receptors) – семейство ядерных рецепторов, состоящее из трех подтипов: PPARα, PPARβ/δ (больше известное как PPARβ) и PPARγ. Все вместе PPARα, PPARβ и PPARγ представляют собой группу С подсемейства 1 суперсемейства ядерных рецепторов [67]. Первый член этого семейства транскрипционных факторов был обнаружен в 1990 году в исследованиях, посвященных снижению уровня холестерина при тестировании анти-гиперлипидемических веществ – фибратов на грызунах [68]. Фибраты вызывали пролиферацию пероксисом в гепатоцитах, таким образом «мишень» для фибратов была названа как рецептор активаторов пролиферации пероксисом. Впоследствии были обнаружены два других подтипа этого семейства - PPARβ и PPARγ [69,70]. Ядерные рецепторы PPAR активируются молекулами метаболических путей, такими как липиды и жирные кислоты, и таким образом функционируют как метаболические сенсоры. PPAR играют важную регуляторную роль в различных клеточных процессах относящихся к метаболизму, воспалению, дифференциации, Все 3 подтипа PPAR обладают тканевой специфичностью и активируют как перекрывающиеся, так и специфические гены. В частности, PPARα и PPARβ являются активаторами генов вовлеченных в окисление липидов [71,72]. PPARγ выделяется за счет дополнительной способности активировать липогенные гены и дифференциацию адипоцитов [73]. Как отражение этих подтип-специфичных свойств, PPARα и PPARβ высоко экспрессированы в клетках с высоким уровнем β-окисления, таких как печень, мускулы, сердце и бурой жировой ткани. Для сравнения PPARγ высоко экспрессирован в жировой ткани. PPARβ 21 экспрессируется практически повсеместно, при чем наибольший уровень этого белка был обнаружен в кишечнике и кераноцитах [72,74]. 1.3.1. Структурные свойства PPAR и механизмы регуляции ими экспрессии генов Все 3 изоформы PPAR регулируются различными генами, расположенными на разных хромосомах [75]. Для ядерного рецептора PPARγ выделяют две различных изоформы PPARγ – PPARγ1 и PPARγ2, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга [73]. Не смотря на некоторую тканеспецифичность показанную на клеточных линиях человека и мыши, в большинстве работ исследуют общую экспрессию изоформ PPARγ1 и PPARγ2 на уровне экспрессии мРНК и белка. Доменная структура ядерных рецепторов PPAR схожа со структурой большинства ядерных рецепторов (Рис.1.4.). Каждая изоформа PPAR содержит 4 основных домена: N-терминальный домен A/B, с лиганд-независимой активирующей функцией 1 (AF-1), С-домен, являющийся ДНК-связывающим доменом (DBD), состоящий из двух консервативных элементов «цинковых пальцев»; D-домен, так же называемый шарнирной областью, и наконец Eдомен, обычно называемый лиганд-связывающим доменом (LBD). Е-домен содержит лиганд-зависимую активирующую функцию 2 (AF-2), которая сильно зависит от С-концевой спирали 12. В то время как A/B и D домены различаются у разных изоформ PPAR, C и E-домены имеют высокий уровень гомологии . Было показано, что С-домены полностью взаимозаменяемы и не влияют на лиганд-специфичность рецепторов [76,77]. Лиганд-связывающий домен у PPAR большой, и может связывать различные эндогенные липиды, включая жирные кислоты, эйкозаноиды, различные производные жирных кислот [77,78]. 22 Рис.1.4. Структура ядерных рецепторов. Схема доменной структуры ядерных рецепторов. Обозначения: AF-1 – лиганд-независимый домен с функцией активации, DBD- ДНК-связывающий домен, LBD - лиганд-связывающий домен, RXR - , PPRE – участок связывания. Ядерные рецепторы PPAR могут активировать или ингибировать экспрессию генов с помощью различных механизмов. Среди них можно выделить основные: 1) регуляция транскрипции за счет связывания с участком ДНК, 2) регуляция по механизму трансрепрессии и трансактивации [79]. В первом случае PPAR образуют гетеродимеры с рецептором ретиноевой кислоты (RXR). PPAR/RXR гетеродимеры связываются с ДНК в месте, называемом PPRE (PPAR-отвечающий элемент), который состоит из прямых повторов (DR) AGG(A/T)CA разделенных одним или двумя парами оснований. При этом возможен вариант, когда в отсутствие активирующего лиганда гетеродимер PPAR/RXR находится в ядре, связанный с PPRE в комплексе с транскрипционным ко-репрессором, например, SMRT, N-CoR [80]. После связывания лиганда, PPAR претерпевают конформационные изменения, что позволяет вывести ко-репрессор для активации транскрипции целевых генов. Второй механизм - регуляция по механизму трансрепрессии. В этом случае для регуляции транскрипционной активности не требуется связывания PPAR с ДНК. PPAR конкурирует с другими транскрипционными факторами, прежде всего NFκB и AP-1 за сайты связывания на ДНК или коактиваторы. Для этого механизма 23 регуляции одним из основных факторов является экспрессия ядерного рецептора PPAR и количества белка этих факторов транскрипции. 1.3.2. Экзогенные и эндогенные лиганды PPAR Учитывая важную роль изоформ PPAR в регуляции метаболизма, воспаления, дифференциации и клеточного роста, было разработано большое количество специфических синтетических лигандов. Это подстегнуло интерес к изучению молекулярных механизмов трансактивации PPAR и полногеномных подходов к поиску новых генов-мишеней PPAR. Эти исследования показали как важно понимание того, как различные лиганды могут модулировать эффективность трансактивации PPAR и в какой степени отдельные домены PPAR участвуют в механизме специфичного узнавания лигандов что приводит к включению или предотвращению трансактивации различных подмножеств генов-мишеней. Все 3 изоформы PPAR могут активироваться как природными веществами - разнообразными жирными кислотами и их метаболитами (эикозаноиды, простагландины, лейкотриены), так и синтетическими лигандами. PPARα активируется фибратами и другими гиполиподемическими лекарствами, тогда как PPARγ активируется антидиабетическими тиазолидиндионовыми лекарствами [75]. Помимо фибратов, PPARα может активироваться промышленными пластификаторами, такими как ди-(2-этилгексил)-фталат (DEHP), некоторые пестициды и гербициды, растворители, а так же пищевые добавки [81]. Результатом воздействия этих разнообразных химических соединений является активация PPAR, что приводит к пролиферации пероксисом в гепатоцитах и значительном увеличении экспрессии генов, отвечающих за окисление жирных кислот. Так же различные жирные кислоты и их производные способны менять активность PPAR, так как они являются их природными лигандами. Наибольшей активностью как лиганды PPAR обладают мононенасыщенные и 24 полиненасыщенные жирные кислоты [82,83]. Это может играть особую роль при воспалительных процессах, когда происходит активация фосфолипазы А2 и высвобождение полиненасыщенных жирных кислот из sn-2 положения фосфолипидов [84]. Тот факт, что каждая изоформа PPAR активирует свой набор генов (несмотря на «перекрывание» этих наборов), казалось бы предполагает лигандспецифичность этих рецепторов к жирным кислотам. Как было показано рентгеноструктурным анализом структуры лиганд-связывающего кармана PPARα, PPARβ, PPARγ заметно различаются [83,85]. Однако натуральные жирные кислоты могут быть лигандами всех трех изоформ PPAR [85]. Как происходит различение сигналов на молекулярном уровне, где специфичная, а где общая для всех изоформ регуляция, остается не ясным. В первую очередь, необходимы исследования изменения поведения ядерных рецепторов в процессе развития ответов при активации TLR рецепторов на фоне массового выброса эндогенных лигандов. 1.3.3. Роль PPAR в регуляции генов липидного метаболизма Известно, что семейство транскрипционных факторов PPAR регулирует большое количество генов, в том числе и связанных с обменом липидов. Кроме того многие из жирных кислот и их производных являются эндогенными лигандами PPAR. Также известно, что плазматические TLR способны связываться с различными эндогенными лигандами, многие из которых имеют липидную природу, в том числе различные жирные кислоты и их производные предполагаются как лиганды TLR [16,23]. Это указывает на тесную взаимосвязь липидного обмена и системы врожденного иммунитета. Однако на полногеномном уровне исследований в таком направлении не проводилось. Поэтому в литературной части нашей работе мы использоли современные методы поиска информации и проанализировали: 1) примерно какое количество генов липидного метаболизма существует; 2) какие из генов липидного метаболизма регулируется PPAR. 25 Для анализа поведения биохимических путей метаболизма жирных кислот мы использовали списки генов метаболизма липидов по данным базы KEGG (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html). Для проведения сравнения был взят список генов находящихся под регуляцией PPAR – 71 ген. Список был выбран по материалам ресурса http://themedicalbiochemistrypage.org/ppar.php (автор профессор King W Michael, Indiana University). Для анализа изученности участия выбранных генов в процессах взаимодействия с PPAR был проведен семантический анализ с помощью программы Anni 2.1 [86]. Для этого перечень исследуемых генов был загружен как набор концептов в Anni, после чего проведен анализ совместной встречаемости в статьях этих генов с концептами PPAR, PPARα, PPARβ, PPARγ. Отобраны гены, непосредственно встречающиеся с термином «PPAR» более чем с 5 статьями. Результаты анализа представлены в Таблице 1.1. В базе KEGG липидный метаболизм (раздел 1.3 базы KEGG), содержится 17 карт, которые были проанализированы по следующим параметрам: количество генов в каждой карте, количество генов встречающихся только в этой группе, количество генов упомянутых в контексте изучения PPAR (Табл. 1.1). Из 17 карт две (№№ 5, 8) связаны с метаболизмом липидов только в растениях и прокариотах, две (№№ 15, 16) не имеют уникальных генов в метаболизме человека, т.е. белки этих генов участвуют в различных других путях метаболизма у человека. Всего в картах использовано 556 генов. Уникальных генов 271, 69, 10, 3, 21 встречаются в 1, 2, 3, 4, 5 картах, соответственно. Таким образом, изучаемый в работе перечень генов составляет 374 гена. В таблице 1 также не указаны сигнальные карты, которые не содержат генов, встречаемых с концептом PPAR. Не вошли в список по причине отсутствия целевых генов следующие сигнальные карты: Биосинтез воска, кутина, сиберина (карта №5), вторичный биосинтез ЖК (карта №8), метаболизм линолевой кислоты (карта 15), метаболизм сфинголипидов (карта №13), метаболизм эфиров липидов (карта №12). 26 Анализ полученных данных показывает, что карты метаболизма липидов содержат 217 уникальных генов, из них 28 находятся под регуляцией PPAR (13%). Интересно, что пока не обнаружено перекреста PPAR и таких метаболических путей как метаболизм линолевой кислоты (карта №15), метаболизм сфинголипидов (карта №13), метаболизм эфиров липидов (карта №12). Это может указывать на различие роли PPAR в регуляции определенных модулей метаболизма. В то же время, сопоставление различных данных показало, что биохимические карты KEGG для метаболизма липидов требует значительной доработки и малоинформативно использовать их для использованного нами подхода, необходимо целенаправленное составление карт путей при изучении возможностей их регуляции и взаимосвязи липидного метаболизма с другими системами. Подробные данные по анализу концептов PPAR в картах липидного метаболизма и перечень статей имеющих перекрест PPAR-ген выложены на сайте www.lipidomics.ru. Следует отметить, что существует специфичные гены, регулируемые конкретными изотипами PPAR и общие для всех. Действительно, гены, для которых на данный момент известно, что они находятся под регуляцией PPARα можно разделить на гены липидного обмена, воспалительные, клеточного цикла, передачи сигнала, метаболизма ксенобиотиков и другие процессы. Это такие известные гены как liver X receptor α (LXRα) gene, lipoprotein lipase (LPL), steroyl-CoA desaturase 1 (SCD1), mitochondrial hydroxymethylglutaryl-CoA (HMGCoA) synthase, medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD), and carnitine palmitoyltransferase-1 (CPT-1). Все они вовлечены в различные аспекты метаболизма липидов. Характеризуя основную цель действия PPARα, следует отметить, что этот фактор транскрипции в основном отвечает за катаболическую регуляцию расхода энергии [79,87]. Активация PPARβ в скелетных мышцах, сердечной мышце и других тканях оказывает широкий спектр воздействий на клеточный рост, гомеостаз глюкозы, липидный обмен, и протекание воспалительных реакций. Активация 27 PPARβ приводит к повышению экспрессии генов, участвующих в окислении жирных кислот, таких как ACOX1, СРТ-1, very long-chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD), and long-chain acyl-CoA dehydrogenase (LCAD). PPARβ также активирует гены, участвующие в метаболизме триглицеридов, такие как гормон-чувствительная липаза (HSL) и гены, которые разрывают окислительное фосфорилирование в результате термогенеза (uncoupling protein 1, UCP1). UCP1 также активируется PPARβ в клетках белой жировой ткани [79,88]. В дополнение к роли PPARγ в регуляции экспрессии ряда генов, вовлеченных в липидный и глюкозный гомеостаз, этот рецептор так же играет важную роль в противовоспалительных и противоопухолевых сигнальных путях. Эффект PPARγ на липидный и глюкозный метаболизм реализуется через прямую активацию этих генов. Однако, способность PPARγ влиять на противовоспалительный ответ, обусловлена не только активацией противовоспалительных генов, но и лиганд-зависимой трансрепрессией, в ходе которой PPARγ ингибирует активность про-воспалительных транскрипционных факторов, таких как NF-κB. Среди провоспалительных генов, экспрессия которых так же ингибируется через механизм трансрепрессии это AP-1, signal transducers and activators of transcription 1 (STAT-1), and nuclear factor of activated T cells (NFAT). PPARγ оказывает значительное противовоспалительное действие в экспериментах in vitro на макрофагах. PPARγ ингибирует транспорт макрофагов к месту воспаления через подавление транскрипции monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), так же рецептора для MCP-1, CC chemokine receptor 2 (CCR2). Стимулированные макрофаги выбрасывают множество провоспалительных молекул, и активация PPARγ ингибирует синтез многих из них. Секреция про-воспалительных цитокинов, TNFα, IL-1b, IL-6 и IL-12 макрофагами ингибируется при активации PPARγ. PPARγ так же подавляет выработку NO через ингибирование экспрессии iNOS. PPARγ играет важнейшую роль в регуляции липидного и глюкозного метаболизма в норме, а так же в регуляции воспалительного ответа [79,89]. 28 Таблица 1.1. Анализ генов липидного метаболизма в базе данных KEGG № название карты в базе 1 биосинтез ЖК: 6 6/100 2 удлинение ЖК 23 7/30 3 4 6 7 деградация ЖК: синтез и деградация кетоновых тел биосинтез стероидов первичный биосинтез желчных кислот кол-во Уник. генов гены/%* Из них PPARрегулируемые ** (2) ACACA, ACACB Какие гены совместно изучают *** FASN (115), ACACA (18), (4) ACAA2, ELOVL4, ELOVL6, HADHA (13) ACAA1, ACAA2, ACADM, ACADS, ACADVL, ACAT1, ACOX1, ALDH9A1, CPT1A, CPT2, CYP4A11, HADHA, HADHB ACAA1 (6), ACADL (24), ACADM (58), ACADVL (9), ACOX1 (101), ACSL1 (12), ACSL4 (11), ACSL5 (5), ALDH2 (6), ALDH3A2 (5), CPT1A (65), CPT1B (38), CPT2 (22), CYP4A11 (65), EHHADH (30), HADHB (23) HADHB (23), ELOVL3 (5), ACOT1 (5) 44 28/64 9 7/78 (2) ACAT1, HMGCS2 HMGCS1 (25) 18 16/89 0 CYP24A1 (5), SOAT1 (11), 17 12/71 (2) CYP7A1, CYP8B1 CYP27A1 (12), CYP7A1 (30), CYP8B1 (5), HSD17B4 (19) AKR1C3 (11), CYP11A1 (11), CYP19A1 (45), CYP1A1 (27), CYP1A2 (16), CYP1B1 (7), CYP2C19 (8), CYP2C8 (11), CYP2C9 (15), CYP2E1 (34), CYP3A4 (31), CYP7A1 (30), HSD11B1 (31), HSD11B2 (9), UGT1A3 (6), UGT1A1 (11), UGT1A6 (9) AGPAT2 (12), AKR1B1 (9), ALDH3A2 (6), ALDH2 (6), DGAT1 (27), DGAT2 (19), LIPC (16), LPIN1 (24), LPL (280), MGLL (6), PNPLA2 (29), AGPAT2 (12), CHPT1 (22), GNPAT (9), GPD2 (8), GPD1 (27), LPIN1 (24), PCYT1A (18), PLA2G4A (10) AKR1C3 (11), ALOX15 (22), ALOX15B (11), ALOX5 (30), CYP2B6 (7), CYP2C19 (8), CYP2C8 (11), CYP2C9 (15), CYP2E1 (34), CYP4A11 (65), EPHX2 (16), PLA2G4A (10), PTGES (27), PTGDS (12), PTGES2 (16), PTGIS (35), PTGS1 (77), PTGS2(534) 9 биосинтез стероидных гормонов 61 47/77 (1) CYP7A1 10 метаболиз гликолипидов 55 22/40 (4) AGPAT2, ALDH9A1, LIPC, LPL 11 метаболизм глицерофосфол ипидов 91 34/37 (3) AGPAT2, GPAM, GPD1 14 метаболизм арахидоновой кислоты 67 37/55 (1) CYP4A11 25 0 (3) ACAA1, ACOX1, FADS2 ACAA1 (7), ACOX1 (101), ACOX3 (5), FADS2 (8), PLA2G4A (10) 21 4/19 (6) ACAA1, ACOX1, ELOVL6, FADS1, FADS2, HADHA ACAA1 (7), ACOT1 (5), ACOX1 (101), ACOX3 (5), ELOVL6 (5), FADS2 (8), SCD (36), 16 17 метаболизм альфалиноленовой кислоты биосинтез ненасыщенных жирных кислот * за 100% принято общее число генов карты ** - в столбце перечислены гены, находящиеся под регуляцией PPAR *** - в столбце перечислены гены связанные после семантического анализа с концептом PPAR в рамках выбранной карты метаболизма липидов. В скобках указано число статей. 29 1.3.4. Регуляция PPAR на молекулярном уровне Хотя ядерные рецепторы PPAR и регуляция их активности с помощью экзогенных лигандов активно изучается, большинство исследований посвящено влиянию лигандов этих рецепторов на клеточные процессы, на экспрессию PPAR-зависимых генов. Регуляция экспрессии самих ядерных рецепторов PPAR в регуляции транскрипции остается мало изученной. Однако для понимания механизмов пересечения метаболизма и воспаления ключевую роль играет выяснение механизмов регуляции самих ядерных рецепторов PPAR в процессах развития ответов на стимуляцию врожденного иммунитета. Как и другие гены эукариот, ядерные рецепторы PPAR могут регулироваться на уровнях транскрипционном [90,91], пост-транскрипционном [73,92], трансляционном и пост-трансляционном [71,76]. О молекулярных механизмах регуляции на уровне транскрипции известно относительно мало. Показано, что при различных воспалительных процессах в большинстве случаев происходит снижение экспрессии изоформы PPARα и PPARγ и увеличение экспрессии PPARβ [88,93]. Имеются отдельные работы по регуляции на пост-транскрипционном уровне, изучалась скорость деградации мРНК изоформы PPARγ [92], показано что за счет альтернативного сплайсинга PPARγ имеет две изоформы PPARγ1 и PPARγ2 [73]. Относительно хорошо изучены пост-трансляционные механизмы регуляции PPAR и их активности. Действительно, белки этих рецепторов подвергаются различным посттрансляционным модификациям, таким как фосфорилирование, SUMOилирование, убиквинирование, нитрование, за счет чего регулируется их транскрипционный потенциал [76,77,94]. Ядерные рецепторы PPAR являются фосфобелками. В процессе фосфорилирования PPAR принимают участие различные киназы, MAPK, PKA, PKC и другие. PPARα фосфорилируется на специфических остатках серина Ser12 и Ser21, находящихся в A/B домене белка, в результате его транскрипционная активность практически удваивается. При этом фосфорилирования Ser76 вызывает деградацию 30 рецептора. Для PPARγ добавление факторов роста приводит к фосфорилированию сериновых остатков в AF-1 домене. Показано, что Ser84 в PPARγ1 и Ser114 в PPARγ2 могут фосфорилироваться различными MAPKs такими как p38 MAPK, Jun N-terminal kinase (JNK), and extracellular signalregulated kinase ингибированию (ERK). как Фосфорилирование лиганд-зависимой, этими так и MAPK приводит к лиганд-независимой трансактивации белка [76,77,79]. Для изоформы PPARβ в литературе пока не отображены точные места фосфорилирования. Показано, что на транскрипционную активность PPARβ влияет p38 и JNK MAPK [88]. Совокупность данных, что 1) изотипы PPAR имеют высокую степень структурной гомологии, схожие механизмы действия, способны взаимодействовать с одними и те же партнерами-гетеродимерами и участками ДНК; 2) природные лиганды PPAR – жирные кислоты и их производные имеют низкую специфичность к конкретной изоформе PPAR, позволила предположить, что изотипы PPARα, -β, -γ могут быть взаимосвязаны на различном уровне и эта взаимосвязь может играть существенную роль для всех клеток, где происходит экспрессия всех трех изотипов на сопоставимом уровне [95]. Данные по влиянию PPAR агонистов на экспрессию различных изоформ PPAR свидетельствуют в пользу этого предположения. Таким образом, исследования регуляции PPAR в процессах развития ответов при стимуляции системы врожденного иммунитета должна учитывать возможность взаимодействия этих изоформ между собой. 1.4. Анализ подходов к изучению регуляции ядерных рецепторов PPARα, β, γ при стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии. Как уже было указано, воспаление, индуцированное гипергликемией, является ключевым моментом в осложнениях при диабете [96]. Показано, что TLR играют ключевую роль в развитии ответа врожденного иммунитета и воспалении при метаболических синдромах [97,98], а агонисты ядерных рецепторов PPAR активно изучаются как возможные модуляторы 31 воспалительных процессов при нарушении метаболизма [99]. Все три изоформы PPAR, важнейшие регуляторы обмена липидов и глюкозы в организме, и Толлподобные рецепторы находятся на пересечении воспалительных и метаболических (глюкозы и ожирение) путей, однако механизм регулирования этого пересечения по-прежнему отсутствует. Одним из подходов к изучению молекулярных процессов взаимосвязи воспалительных и энергетических процессов являются исследования на клеточных моделях гипергликемии, которые нами проанализированы в разделе 2.5.1. Исследования молекулярных механизмов взаимодействия TLR и PPAR при гипергликемии остаются актуальным для всех клеточных систем, однако особое значение это задача приобретает для нейробиологов, изучающих функции головного мозга. Поэтому мы сфокусировались в дальнейшем анализе на астроцитах, важнейших глиальных клетках мозга (раздел 2.5.2). Мы проанализировали, какие функции выполняют данные клетки в развитии ответов врожденной иммунной системы, что известно про систему трех изоформ PPAR на этих клетках. Малочисленные данные по регуляции TLR/PPAR сигнального пути заставили нас обратиться к современным подходам анализа на молекулярном и клеточном уровне экспрессии генов. При этом в первую очередь, в рассмотрение брали работы, которые используют не клеточные системы с искусственно экспрессированными генами, а те данные, которые связаны с изучением молекулярных механизмов разворачивания ответов клеток на стимул. Мы считаем, что данные модели больше отражают поведение и регуляцию гена при развитии клеточного ответа, чем модели с искусственной экспрессией. Из таких подходов наибольший интерес для исследований сигнальных путей, связанных с системой врожденного иммунитета являются изучение регуляции экспрессии генов с помощью ингибиторов белкового синтеза и связанное с ним явление супериндукции (раздел 2.5.3), а также исследование деградации мРНК генов как нового механизма регуляции экспрессии генов воспалительного ответа (раздел 2.5.4.). 32 1.4.1. Клеточные модели гипергликемии В разделе 2.1.2 описаны эффекты и нарушения, возникающие при диабете и гипергликемии на уровне организмов. Для исследований молекулярных процессов в клетках используют гипергликемические клеточные модели. Было показано, что в моноцитах человека адаптация культуры в среде с повышенной концентрацией глюкозы усиливает экспрессию Толл-подобных рецепторов [97]. Клетки линии U937 при культивировании в высокой глюкозе усиливают свою чуствительность к действию LPS [100]. Разный уровень глюкозы меняет выброс цитокинов и сигнальных молекул в астроцитах, усиливая выброс TNFα, IL-6, IL1β, VEGF [18]. При выборе условий модели гипергликемии нет единого «стандарта» клеточной модели. Считается, что нормальная концентрация глюкозы (она обычно содержится в полных клеточных средах культивирования) составляет 5 мМ, а концентрация 20-30 мМ имитирует состояние гипергликемии. Следует разделять протоколы использования высоких концентраций глюкозы. Когда при добавлении глюкозы к клеточной среде эксперимент проводят через 2-12 часов, то смотрят реакцию клеток на глюкозу как «острый» стимул. А когда повышенную концентрацию глюкозы в среде культивирования поддерживают более 24 часов (обычно 2-5 дней), то изучают уже адаптацию клеток к этим условиям. Эти модели относят к клеточной гипергликемии и показано, что они характеризуются изменениями, наблюдаемым в системе метаболизма глюкозы на уровне организма [101,102]. В большинстве работ 24-48ч культивирование клеток в среде с повышенной концентрацией глюкозы считается достаточным, для адаптации их к новым условиям [18,97,101,102]. 1.4.2. Астроциты как объект исследования врожденного иммунитета в центральной нервной системе Астроциты - глиальные клетки мозга, которые играют важную роль в поддержании жизнеобеспечения гематоэнцефалического барьера и нейронов, участвуя в формировании являясь основным звеном на пути 33 продвижения веществ от кровеносных сосудов к нейронам. Первоначально астроцитам отводили вспомогательную роль в поддержании деятельности нейронов, однако сейчас их стали считать равноправными участниками нервной системы, вплоть до регуляции проведения сигналов в синоптических контактах. Также астроциты участвуют в синтезе некоторых физиологически активных веществ, необходимых для развития иммунного и воспалительного ответов в ткани головного мозга и играют важную роль на ранних стадиях любых травм ЦНС и развитии патологических состояний [11,65,103]. Действительно, любые повреждения головного мозга ведут к развитию так называемого реактивного астроглиоза, процесса, при котором наблюдается резкое усиление метаболической и пролиферативной активности астроцитов [104]. Реактивный астроглиоз оказывает защитное влияние на ткань головного мозга (формирование защитных глиальных структур, обособление повреждѐнного участка мозга, усиление синтеза биологически активных веществ, способствующих поддержке и восстановлению нейронов, генерация адаптивного воспалительного ответа) [105]. Однако предполагается, что избыточное развитие этого процесса приводит к нарушению регенерации нервной ткани, формированию глиальных рубцов, а также к переходу воспаления в хроническую стадию [106]. Поэтому контроль астроглиоза очень важен и является необходимым для уменьшения таких отрицательных последствий, как гибель нейронов в зоне ишемического поражения, усиление нейродегенеративных изменений в ткани мозга, а также формирование астроглиом, опухолей мозга, которые в настоящее время практически не лечатся медикаментозными методами. Развитие воспалительного ответа – одна из основных составляющих реактивного астроглиоза. Изучение этого процесса на клеточном уровне и исследование возможности его регуляции является важным направлением современных нейробиологических исследований. Помимо их роли при воспалительных реакциях, астроциты также важны в регуляции энергетического и метаболического гомеостаза в мозгу. Эти клетки очень чувствительны к метаболическим изменениям в окружающей среде. На 34 уровне организма в модели сахарного диабета меняется экспрессия белкамаркѐра GFAP в астроцитах крысы, развиваются нейрональные дисфункции [107,108]. Развитие воспалительного процесса в астроцитах тесно связано с активацией Толл-подобных рецепторов [35], и их взаимодействие с такими сигнальными молекулами как TNFα и интерлекинами [56]. Интересным оказался тот факт, что относительно хорошо охарактеризованным оказался TLR4, были данные о регуляции PPAR при действии на клетки LPS, классического агониста TLR4 [64]. Имеются сведения о процессах, протекающих при активации TLR2 рецептора [23]. Однако, крайне мало данных по функциям и роли TLR5, особенно в астроцитах [51]. Для астроцитов характерно, что в их активации и реализации воспалительного ответа важную роль играет арахидоновая кислота и ее оксипроизводные – простагландины [109]. Это позволяет предположить, что клеточные ответы разворачиваются на фоне избытка эндогенных лигандов PPAR, а особую роль в регуляции экспрессионной эффективности PPAR приобретают их собственная экспрессия и процессы регуляции на различных уровнях экспрессии. Ранее в совместных работах группы системной биологии липидов (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ) и Института нейробиологии Университета Отто-фон-Герике г. Магдебурга (Германия) было показано, что арахидоновая и докозагексаеновые кислоты и регуляция их выброса из фосфолипидов с помощью ферментов семейства фосфолипаза А2 играют важные роли в регуляции ответов астроцитов на стимуляцию TLR, а росиглитазон и другие специфические агонисты PPARα, -β, -γ рецепторов регулируют экспрессию генов фосфолипазы А2, циклооксигеназы 2 [110,111]. Была исследована роль PPARβ в регуляции СОХ-2 [6] [112] и сформулировано положение о важной роли PPAR трио для регуляции воспалительных ответов в астроцитах [95]. Как логичным продолжением этих работ возникли выбор астроцитов как объекта исследования и вопросы, поставленные в данной работе. 35 1.4.3. Изучение регуляции экспрессии генов с помощью ингибиторов белкового синтеза. Явление супериндукции. Такие ингибиторы белкового синтеза как циклогексимид и анизомицин широко применяются в молекулярно-биологических исследованиях для определения, нужен ли de novo синтезированный белок для тех или иных биологических процессов [113]. Анизомицин и циклогексимид действуют схожим образом и связываются с Е-сайтом рибосомы, блокируя фазу элонгации [114]. Таким образом, если какой-либо клеточный ответ меняется после обработки ингибитором, то предполагается, что в реализацию данного клеточного ответа вовлекается синтез белка. Если изучают сигнальные каскады, то предполагают, что существует короткоживущий белок (живущий меньше, чем время изучения каскада), который вовлечен в регуляцию сигнального пути. На целом ряде клеточных линий (см. Таблицу 1.2.) показано, что добавление к клеткам ингибиторов белкового синтеза приводит к накоплению специфических генных транскриптов (Рис.1.5). Этот феномен назвали «генная супериндукция» [115,116]. Интерес к нему вызван и тем фактом, что указанные ингибиторы белкового синтеза широко применяют в опытах in vivo при исследовании процессов формирования памяти в мозгу, где применение этих ингибиторов вызывает амнезию [117]. Рис.1.5. Схема регуляции супериндукции на основе литературных данных. 36 Предложено несколько механизмов возникновения эффекта «супериндукции»: 1) увеличение стабильности мРНК [118,119]; 2) усиление транскрипции генов [120,121]; 3) снижение синтеза лабильных репрессоров генов [122]. Рассмотрим основные из них. Традиционно супериндукция циклогексимидом связывается с подавлением синтеза белка и получающимся после этого росте стабильности мРНК (гипотеза “связь трансляции-деградации”) [123,124]. В некоторых работах предполагается, что циклогексимид может стимулировать транскрипцию через прекращение синтеза предполагаемого коротко-живущего транскрипционного репрессора, который при наличии его в системе может блокировать инициацию транскрипции (гипотеза “лабильного репрессора”) или отключение текущей транскрипции (“пост-индуктивный механизм репрессора ”) [123]. В некоторых случаях показано, что некоторые из эффектов супериндукции могут быть вызваны стимуляцией циклогексимидом внутриклеточных сигнальных путей, которые могут изменить либо стабилизацию мРНК либо транскрипцию кофакторов путем их посттрансляционных модификаций. По данным [125–127] MAPK каскад и NF-κB это основные сигнальные пути ответственные за это. Если первоначально считали, что супериндукция генов возникает как прямое или косвенное следствие ингибирования белкового синтеза, то постепенно накапливались данные и о других возможных механизмах действия циклогексимида и актиномицина. Зависимость от концентрации. Было показано, что анизомицин оказывает физиологическое воздействие на клетки в концентрациях ниже, чем требуется для снижения белкового синтеза. Такие данные были получены на мышиных фибробластах [121] и мезанхемальных клетках мыши [128]. Зависимость от времени. В то время, как максимальное снижение биосинтеза белка возникает через 2-4 часа после добавления PSI, после чего начинает снижаться [118], эффект супериндукции генов наблюдается и дольше [120,123]. Таким образом эффект генной супериндукции будет преобладать над 37 эффектом ингибирования синтеза белка и тем самым доминировать над конечным результатом лечения. Специфичность. Стимулированная ингибиторами белкового синтеза супериндукция имеет клеточную и генную специфичность (Таблица 2). Набор индуцированных генов меняется в зависимости от типа клеток [120,129]. Интересно, что в мозгу такая специфичность наблюдается в различных отделах мозга. Например, обработка циклогексимидом вызывает супериндукцию мРНК Arc (Activity-regulated cytoskeleton-associated protein) в коре головного мозга, и некоторых участках гиппокампа, и снижает мРНК Arc в зубчатых зернистых клетках [130]. Таким образом можно сделать вывод что эффект циклогексимида строго зависит от типа клеток. 38 Таблица 1.2. Перечень генов супериндуцирующих при ингибировании белкового синтеза. Организм/Тип клеток человек/муцинозная цистаденокарцинома человек/Карцинома шейки матки (HeLa) человек/Карцинома шейки матки (HeLa) Ингибитор белкового синтеза Анизомицин Сигнальный путь Ген Ссылк а [131] Анизомицин ERK1/2 но не annexin V p38 MAPK Elk-1 c-fos Анизомицин /циклогексимид/ пиромицин Циклогексимид AhR p38, JNK1, JNK2 n/a [133] Хрящевые клетки человека Клетки легочного эпителия человека (H292) Клетки легочного эпителия (A549) Клетки легочного эпителия (A549) Клетки эндометрия морской свинки Мышиные клетки печени hepa1c1c7 Эпителиальные клетки кишечника (caco-2) Эпителиальные клетки молочной железы (MCF10A) Клетки печени курицы Циклогексимид Циклогексимид P38 but JNK n/a Циклогексимид Лимфоциты человека Клетки Т-лифмомы мыши (EL-4) Мышиные макрофаги (J774.2) Клетки печени человека (HepG2) CYP1A1, CYP1A2 PPAR-γ1, γ2, PPAR-α PGC-1α – not SOX9 [132] [134] [135] Il-8 [136] NF-κB, JNK COX2, Il-1 [137] Циклогексимид n/a NF-κB [138] Циклогексимид n/a c-fos [139] Циклогексимид n/a [140] Циклогексимид p38 Металлопро теаза I Il-6 Циклогексимид n/a CYP1A1 [133] Циклогексимид n/a [141] Циклогексимид Вомитоксин n/a n/a P4502H1 (CYP2H1), (ALAS) IFN-gamma Il-2 Циклогексимид p38 iNOS [144] [126] [142] [143] 39 Как видно из Таблицы 1.2, большое количество самых разнообразных по функциям генов увеличивает экспрессию при добавлении ингибиторов белкового синтеза, При этом происходит активация различных сигнальных путей. В большинстве работ отмечается, что именно MAPK (p38, JNK, ERK) играют ключевую роль в регуляции процесса супериндуции. Действительно, показано, что при супериндукции COX-2 и IL-1 идет активация NF-κB и JNK в клетках легочного эпителия [137], супериндукция iNOS в мышиных макрофагах регулируется через JNK MAPK [144], а регуляция IL-6 в эпителиальных клетках кишечника идет через p38 MAPK [126]. Примечательно, что большинство указанных в Таблице 2.2. генов и соответствующих сигнальных путей их активации вовлечены в развитие воспалительного ответа, т.е. включены в систему врожденного иммунитета. Этот факт ставит вопрос воспалительных о роли ответов клетки. эффекта «супериндукции» Кроме того, для в регуляции каждого гена, при исследовании его роли в системе врожденного иммунитета следует проводить исследования на выявление супериндукции. 1.4.4. Деградация мРНК как один из механизмов регуляции экспрессии В последнее время много внимания уделяется исследованиям регуляция генов на уровне изменения скорости деградации мРНК. Было показано, что для большинства провоспалительных генов характерна высокая скорость деградации мРНК и соответственно небольшое, меньше часа время полу-жизни мРНК [145]. Помимо этого, сами про-воспалительные агенты способны изменять время полужизни мРНК различных генов, что может являться одним из возможных механизмов регуляции развития воспалительного ответа [145,146]. Скорость обновления мРНК определяется ее временем полу-жизни, т.е. периодом времени пока мРНК находится в клетке, перед тем как деградировать. За деградацию мРНК отвечает особый класс белков – РНК-связывающие белки. Эти белки распознают особые элементы в РНК, такие как поли-А-хвосты, AU-богатые элементы, Jun-киназные элементы и др. 40 В последнее время работы посвященные изучению скорости деградации мРНК вызывают особенный интерес, поскольку показано, что многие гены, активно вовлеченные в провоспалительные процессы меняют скорость деградации мРНК при действии на клетки воспалительных стимулов [145]. Это означает, что возможен новый путь регуляции воспалительных процессов, воздействующий на пост-транскрипционном уровне через изменение времени полужизни мРНК соответствующих генов. Однако сами процессы регуляции на пост-транскрипционном уровне изучены относительно слабо. Это направление исследований в ближайшие годы, несомненно, ожидают интересные открытия. На данный момент понятно, что время полу-жизни мРНК генов при активации системы врожденного иммунитета является важной характеристикой воспалительного ответа. В ряде работ на разных типах клеток было показано, что время полужизни мРНК PPARγ и PPARα примерно 1-3 часа [134,147–149]. На астроцитах исследований не проводили. Данных о времени полу-жизни мРНК PPARβ отсутствуют для любых клеток. Не исследована возможность стабилизации или ускорения деградации мРНК ядерных рецепторов при стимуляции системы врожденного иммунитета. 1.5. Постановка целей и задач исследования Важной проблемой является исследование молекулярных механизмов пересечения энергетических воспалительных процессов. (система При этом врожденного существует иммунитета) модель и клеточной гипергликемии, которая позволяет изучать адаптированные к повышенному содержанию глюкозы клетки, т.е. исследовать на молекулярном уровне сигнальные регуляторные пути. Анализ литературы показал немногочисленность исследований в области регуляции рецепторов PPAR при стимуляции TLR. Также не ясен вопрос о роли МАРК ингибиторов в регуляции TLR/PPAR сигнального пути. Представляется важным также исследовать клеточные системы, которые содержат сразу три 41 изоформы PPAR, поскольку между изоформами может существовать взаимодействие и взаимовлияние на уровне эндогенных лигандов и регуляторов экспрессии. Сведения о процессах регуляции PPAR в процессе развития ответов на стимуляцию врожденного иммунитета соотнести с генами, классическими маркѐрами воспалительного процесса. Таким геном-маркѐром был выбран фермент циклооксигеназа, который является источником простагландинов (PG). PGЕ2 и TNFα выбраны как наиболее распространенные маркѐры воспаления. В настоящей работе была поставлена цель изучить процессы регуляции PPARα, PPARβ и PPARγ при активации Толл-подобных рецепторов в условиях гипергликемии и исследовать возможность модулировать активность этих изоформ для изменения характера и направления клеточного ответа в условиях гипергликемии. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи: - Охарактеризовать взаимосвязь активации TLR и PPAR в условиях гипергликемии на линии клеток человека HeLa и оценить возможность использования этой линии для изучения TLR/PPAR сигнального пути. - Исследовать влияние гипергликемии на экспрессию и ДНК-связывающую активность PPARα, PPARβ и PPARγ на первичных астроцитах крысы. - Сравнить влияние различных лигандов Толл-подобных рецепторов (TLR1/2, TLR4, TLR5) на экспрессию PPARα, PPARβ и PPARγ. - Оценить возможность регуляции на уровне деградации мРНК ядерных рецепторов PPAR. - Исследовать возможность модулирования при активации ТЛР экспрессии и активности PPAR с помощью селективного ингибирования элементов сигнального пути врожденного иммунитета (ингибиторы MAPK, фактора транскрипции NF-kB, белкового синтеза). 42 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Приборы Оптическая плотность растворов нуклеиновых кислот определялась на спектрофотометре Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech, Германия), а так же спектрофотометре Varian Cary 100 UV-Vis. Обратная транскрипция проводилась в амплификаторе C1000 (Bio-Rad, США), и в амплификаторе MyCycler (Bio-Rad, США). ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени проводилась в амплификаторе iCycler (Bio-Rad, США). Высушивание образцов РНК проводилось на центрифужном концентраторе (Labconco CentriVap, США). Оптическая плотность лунок 96-ти луночных планшет измеряли на планшетном спектрофотометре Spectramax M5 («Molecular Devices», США). Описание морфологии клеточной культуры проводили методом конфокальной микроскопии на микроскопе LSM 510 (Carl Zeiss, Jena, Germany). 2.2. Реактивы и препараты LPS, Актиномицин Д, Bay 11-7085, Антитела для определения количества белка PPARα, PPARβ, PPARγ и β-тубулина приобретены в фирме «Sigma Chemicals» (Германия, Мюнхен). Ингибиторы MAPK: PD 98059, SB 203580, U0126, SP600125 были приобретены в фирме «ALEXIS Biochemicals» (Грюнберг, Германия). CLI-095, Флагелин (FGL, Сенная палочка) и пептидогликан (PGN, Сенная палочка) были приобретены в фирме «Invivogen» (Сан Диего, США). Циклогексимид, анизомицин и полимиксин Б были приобретены в фирме «Calbiochem» (Дармштадт, Германия). Праймеры используемые для ПЦР 1) Для ПЦР в реальном времени использовались следующие праймера: GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа): CCTGGAGAAACCTGCCAAGTAT-3’; обратный, прямой, 5’- 5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’; 43 PPARβ: прямой, 5’-CTCCTGCTCACTGACAGATG-3’; TCTCCTCCTGTGGCTGTTC-3’;, обратный, PPARα: прямой, 5′-CGACACTCGATGTTCAGTGC-3′; обратный, 5’- 5′-TGCGGACTACCAGTACTTAG-3′; PPARγ: прямой, 5’- CCTGAAGCTCCAAGAATACC-3’; обратный, 5’-GATGCTTTATCCCCACAGAC-3’; COX-2: 5’-TGTACAAGCAGTGGCAAAGG-3’; обратный, 5’-TAGCATCTGGACGAGGCTTT-3’ 2) Для ОТ-ПЦР с денситометрическим способом детекции продукта использовались следующие праймера: PPARα прямой 5’-CCACCATCGCGACCAGAT3’ обратный 5’-GACGTGCTTCCTGCTTCATAGA-3’; PPARβ прямой 5’- GTCACACAACGCTATCCGTTT-3’, обратный 5’-AGGCATTGTAGATGTGCTTGG-3’; PPARγ прямой 5’-GGTGAAACTCTGGGAGATTCT-3’, обратный 5’-CTCTGTGTCAACCATGGTCA3’; COX-2 прямой 5’-AATGAGTACCGCAAACGC-3’, CATCTAGTCCGGAGCGGGAAG-3’; обратный СОХ1 прямой 5’-AAGCAGTCCAGGGTAGAA-3’; обратный 5’- 5’-ATGTCATCAGGGAGTCTC-3’, β-актин прямой 5’ CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3’, обратный 5’-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’. Антитела Первичные антитела к PPARα, PPARβ, PPARγ и β-тубулину приобретены в фирме «Sigma-Aldrich», США. Первичные антитела к COX-1 и COX-2 приобретены в фирме «Cayman Chemical», Эстония. Пероксидазные конъюгаты вторичных антител приобретены в фирме «Dianova», Германия. Маркеры Белковые маркеры «Precision Plus Protein All Blue Standard (250-10 kDa)» приобретены в фирме «Bio-Rad», Германия. В качестве маркеров длины ПЦР продуктов использовали «GeneRuler™ », фирмы Fermentas. Наборы Для визуализации иммуноблотов использовался набор «ECL+Plus», приобретенный в фирме «Amersham Pharmacia Biotech», Великобритания. Для проведения обратной транскрипции выделенной тотальной РНК использовали набор «iScript™ cDNA synthesis kit» (BioRad, США). Тотальная РНК выделялась 44 с помощью набора RNeasy (Qiagen, Германия) в экспериментах с ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили с помощью набора «iQ™SYBR®Green Supermix» (BioRad, США). В экспериментах с денситометрическим способом определения экспрессии генов РНК выделяли тризольным методом, для синтеза первой цепи кДНК использовался набор для обратной транскрипции «синтез первой цепи кДНК (олиго(дТ)15)» («Силекс», Россия), для проведения ПЦР использовался набор «амплификация ДНК с HotTaq полимеразой» («Силекс», Россия). Определение концентрации простагландина Е2 проводили с помощью набора ИФА «Prostaglandin E2 Express EIA Kit» («Cayman Chemical», Эстония). Для измерения ДНК-связывающей активности PPARα, PPARβ, PPARγ использовали набор «PPARα, -δ, -γ Complete Transcription Factor Assay Kit» («Cayman Chemical», Эстония). Культуральные среды Среда DMEM, эмбриональная бычья сыворотка (FBS), пенициллин и стрептомицин, приобретались в фирме Biochrom (Берлин, Германия) или фирме «ПанЭко» (Москва, Россия). Растворы Фосфатно-солевой буфер (PBS) 10x - 137 мМ NaCl; 2,6 мМ KCl; 8,1 мМ Na2HPO4; 1,4 мМ KH2PO4, pH 7,4. Модифицированный RIPA буфер - 50 мМ Tris/HCl, pH 7,4; 1% Igepal; 0,25% Na-дезоксихолат; 150 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат); 1 мМ Na3VO4; 1 мМ NaF и коктейль ингибиторов протеаз. 4х буфер для нанесения белковых образцов на денатурирующий гель (4х буфер Лэмли) 500 мМ Tris/HCl, pH6,8; 8% SDS, 40% глицерин; 0,01% бромфенолофый синий; 20% β-меркаптоэтанол (свежий). 60% Акриламид/бисакриламид 58,4% акриламид, 1,6% N,N’-метилен бисакриламид. Раствор фильтровали через 0,45 мкм фильтр и хранили не более месяца при 4°С, защищая от света. Разделяющий гель - 10% акриламид/бисакриламид, 750 мМ 45 Tris/HCl, pH 8,8; персульфат аммония 0,1%; TEMED (N,N,N,N– тетраметилэтилендиамин) 0,1%; 0,1% SDS. Концентрирующий гель - 4% акриламид/бисакриламид, 250 мМ Tris/HCl, pH 8,8; персульфат аммония 0,05%; TEMED 0,05%; 0,1% SDS. Буфер для «отшпаривания» мембран - 62,5 мМ Tris/HCl, pH 6,8; 100 мМ β-меркаптоэтанола, 2% SDS. 10x TBE буфер - 0,9 М основный трис, 0,9 М борная кислота, 20 мМ ЭДТА. 10x ТЕ буфер - 100 мM Tris/HCl, pH 7,5, 10 мM ЭДТА. PBST буфер 137 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 1,4 мМ KH2PO4, pH 7,4; 0,1% Твин 20 Буфер для переноса белков 25 мМ Tris, 192 мМ Глицерина, 20% (v/v) Метанола Гипотонический буфер (10х) 100 мМ HEPES, pH 7,5; 40 мМ NaF; 100 мкМ Na2MoO4; 1 мМ ЭДТА. Ядерный экстрагирующий буфер (2x) 20 мМ HEPES, pH 7,9; 0,2 мМ ЭДТА; 3 мМ MgCl 2; 840 мМ NaCl; 20% глицерина. 2.3. Выделение и культивирование клеточных линий 2.3.1. Первичные астроциты крысы Новорожденным детенышам крысы (2-3 дня) отсекали головы. С помощью пинцета из голов выдавливали мозг и переносили его в чашку Петри, содержащую фосфатносолевой буфер (PBS). Мозги промывали и удаляли остатки кровеносной системы, после чего мозги измельчались протиранием через нейлоновое ситечко с размером отверстий 250 мкм. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновое ситечко с диаметром отверстий 163 мкм. Полученную суспензию переносили в центрифужную пробирку. Далее, суспензию центрифугировали 5 мин при 500 g (4°C). После центрифугирования супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в 2 мл DMEM с добавлением 10% телячей эмбриональной сыворотки (TЭС), пенициллина (20 ед/мл) и стрептомицина (20 мкг/мл). Количество выделенных клеток подсчитывали в камере Горяева после окраски трипановым синим. Суспензию разводили до концентрации 6 × 105 кл/мл и помещали по 10 мл в 75-см2 культуральные флаконы. Клетки культивировали в DMEM с 10% FBS в стерильных условиях при 37°С в атмосфере с 10% CO2. Через 5 дней культуральную среду заменяли 46 на свежую, через 2 дня после этого их промывали фосфатносолевым буфером (PBS). К промытым клеткам добавляли 3 мл раствора трипсина с ЭДТА (0,05%/0,02%) и инкубировали 5 мин при 37°С. Затем в культуральные флаконы вносили по 3 мл DMEM, содержащей 10% FBS, для остановки трипсинолиза. Гомогенизировали полученную суспензию и центрифугировали в течение 5 мин при 500g (4°C). Осадок ресуспендировали в 2 мл DMEM/10% FBS. Количество выделенных клеток подсчитывали в камере Горяева после окраски трипановым синим. После разведения клеточной суспензии в DMEM/10% FBS до концентрации 2 × 105 кл/мл они рассеивались по 5 мл в одну лунку шестилуночной культуральной плашки или по 12 мл в 90 мм чашки Петри. Через 2 дня культуральная среда заменялась на свежую и клетки использовались в дальнейшей работе. Чистоту клеточной культуры контролировали методом иммуноцитохимии окраской по GFAP на астроциты и маркером микроглии изолейцином B4. Количество микроглии составляло менее 2% от общего числа клеток. 2.3.2. Клеточная культура HeLa Данный этап работы проводился на клетках карциномы шейки матки человека (HeLa). Клеточная культура выращивалась в культуральных флаконах на 75 мл. В один флакон добавлялось 10 мл питательной среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также пенициллином и стрептомицином (100000 ед./мл каждого антибиотика). Культивирование клеток производилось в СО2-инкубаторе (Heraeus BBD 6220, США) при 37оС и 5% СО2. Смена и среды проводилась на 3-ий день. Рассаживание клеток при необходимости проводилось в день смены среды. За 24 часа до проведения эксперимента клетки рассаживали на 6-ти луночные планшеты по 1 млн. клеток в каждую лунку. При этом клетки, которые планировалось культивировать в избытке глюкозы, суспендировали в DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 25 мМ глюкозы. Через 24 или 48 часов (для клеток культивированных в среде с повышенным содержанием 47 глюкозы) питательную среду в каждой лунке меняли на свежую (по 2 мл на лунку), после тридцатиминутной инкубации клетки подвергались экспериментальным обработкам. 2.3.3. Клеточная культура С6 Данный этап работы проводился на клетках астроцитомы крысы (С6). Клеточная культура выращивалась в культуральных флаконах на 75 мл. В один флакон добавлялось 10 мл питательной среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамином, а также пенициллином и стрептомицином (100000 ед./мл каждого антибиотика). Культивирование клеток производилось в СО2инкубаторе (Heraeus BBD 6220, США) при 370С и 5% СО2. Смена среды и, при необходимости, рассаживание клеток проводились на 3-ий день. За 2 часа до эксперимента среду в каждой лунке меняли на свежую (по 2 мл на лунку). 2.3.4. Оценка пролиферации клеток За 24 часа до проведения эксперимента клетки рассаживали на 96-ти луночные планшеты по 20 тыс. клеток в каждую лунку (100 мкл среды с клетками в лунку). Через 24 часа питательную среду в каждой лунке меняли на свежую (по 100 мкл на лунку) с добавлением исследуемых веществ. Через 48 часов снимались результаты эксперимента. Для определения числа клеток использовали метод окраски по MTS, который проводили по стандартному протоколу, предложенному фирмой производителем Promega с использованием CellTiter 96® AQueous One Solution Reagent. После обработки клеток действующими веществами в каждую лунку добавляли по 20 мкл MTS, предварительно размороженного на водяной бане 37 0С в течение 10 минут. Далее планшеты инкубировали 2 часа при температуре 37 0С и атмосфере с 5% содержанием СО2. По истечении данного времени измеряли оптическую плотность веществ каждой лунки на спектрофотометре при длине волны 492 нм. В предварительных экспериментах было показано, что величины показаний MTS пропорциональны числу клеток в системе при использовании 48 данного протокола. Каждый эксперимент проводили четыре раза, внутри эксперимента каждая экспериментальная точка определялась три раза. 2.4. Выделение тотальной РНК Выделение РНК с набором RNeasy Тотальная РНК выделялась из астроцитов с помощью набора RNeasy (Qiagen, Германия). После отбора культуральной среды клетки дважды промывали PBS и лизировали в 600 мкл RLT буфера. Гомогенизацию клеток проводили пипетированием. К гомогенату лизированных клеток добавляли 600 мкл 70 % этанола, после чего смесь тщательно перемешивали. Полученный образец наносили на микроцентрифужную колонку и пропускали через нее при 10000 об/мин в течение 1 мин, проскок отбрасывали. Для промывки на колонку наносили 350 мкл буфера RW1, после чего колонка центрифугировалась 1 мин при 10000 об/мин. Далее, сорбированные на колонке нуклеиновые кислоты обрабатывали ДНКазой. Для этого использовался набор RNase-Free DNase Kit (Qiagen, Германия). 10 мкл стокового раствора ДНКазы I смешивали с 70 мл буфера RDD. 10 мкл полученного раствора наносили на колонку и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Далее на колонку наносили 350 мкл буфера RW1 и центрифугировали 1 мин при 10000 об/мин. Колонка RNeasy переносилась в другую 2 мл пробирку-коллектор и в нее добавляли 500 мкл RPE буфера. Затем центрифугировали колонку 1 мин при 10000 об/мин. Проскок отбрасывали и вновь добавляли в колонку 500 мкл RPE буфера. Затем центрифугировали колонку 2 мин на максимальной скорости, чтобы тщательно просушить мембрану. В итоге колонку вставляли в 1,5 мл пробирку-коллектор и наносили в центр мембраны колонки 30 мкл воды свободной от РНКаз. После 10 мин инкубации при комнатной температуре колонка центрифугировалась 1 мин при 10000 об/мин, чтобы эллюировать тотальную РНК. Для определения концентрации РНК и отсутствия примесей ДНК в образце РНК, 10 мкл раствора 49 тотальной РНК разводили в буфере ТЕ в 100 раз, и определяли концентрацию далее с помощью спектрофотометра (Pharmacia Biotech, Германия). Выделенную РНК замораживали и хранили при -80°C. Отсутствие деградации РНК подтверждали агарозным РНК электрофорезом. Выделение тотальной РНК тризольным методом. Тотальная РНК выделялась тризольным методом согласно статье [150]. После отбора культуральной среды клетки дважды промывали 1 мл теплого (37° С) раствора Хэнкса. Планшет помещали в лед, далее в каждую лунку добавляли по 1 мл тризола и гомогенизировали многократным пипетированием. Полученный гомогенат центрифугировали в миницентрифуге (MiniSpin Eppendorf, Германия) 20 минут на скорости 13400 об/мин при температуре 4˚С. Супернатант отделяли от осадка, и в каждую пробирку с супернатантом добавляли по 200мкл хлороформа с последующим перемешиванием в течении 30 секунд. После этого образцы центрифугировали в миницентрифуге 20 минут на скорости 13400 об/мин при температуре 4˚С. После центрифугирования водную фазу переносили в новую пробирку, далее добавляли 400 мкл изопропанола и 400 мкл раствора цитрата натрия (0.8 M) и хлорида натрия (1.2 M). Полученный раствор перемешивали. Далее инкубировали пробирки при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого, пробирки центрифугировали 20 минут на скорости 13400 об/мин при температуре 4˚С. После этого супернатант сливали. К осадку РНК добавляли по 1 мл 75% этанола и перемешивали. Далее образцы центрифугировали в миницентрифуге 20 минут на скорости 13400 об/мин при температуре 4˚С. После этого супернатант сливали. Оставшийся осадок сушили в центрифужном концентраторе (Labconco CentriVap, США) в течении 1 минуты. Полученную сухую РНК растворяли в 50 мкл mQ воды и определяли концентрацию далее с помощью спектрофотометра Varian Cary 100 UV-Vis. Отсутствие деградации РНК подтверждали агарозным РНК электрофорезом. Выделенную РНК замораживали и хранили при -80°C. 50 2.5. Определение экспрессии генов ПЦР в реальном времени Для проведения обратной транскрипции выделенной тотальной РНК использовали набор «iScript™ cDNA synthesis kit» (BioRad, США). Перед проведением обратной транскрипции готовили следующую смесь: Тотальная РНК 1 мкг Обратная транскриптаза iScript 1 мкл 5 кратный реакционный буфер 4 мкл Вода свободная от нуклеаз до 20 мкл Обратную транскрипцию проводили в амплификаторе T3 Thermocycler (Biometra, Германия) по следующей программе: реакционная смесь инкубировалась 5 мин при 25°C, затем 30 мин при 42 °C и 5 мин при 85°C, в конце программы смесь охлаждалась до 4°C. ПЦР в реальном времени является количественным методом, основанным на флуоресценции красителя SYBR Green, связанного с двуцепочечной ДНК. Для количественных измерений использовали интенсивности экспоненциальное флуоресценции от количества приближение двуцепочечной зависимости ДНК. По результатам, полученным на пробах с последовательным разведением кДНК, выбирали пороговый уровень флуоресценции, далее для каждой пробы вычисляли цикл на котором это значение достигается (Ct). Концентрацию любой мРНК вычисляли как 2-C Затем значения нормировали на уровень GAPDH, а уровень экспрессии гена в контрольных клетках принимали за 1. Специфичность амплификации подтверждали агарозным электрофорезом и анализом кривых плавления ПЦР-продукта. Кривая плавления ПЦР продукта представляет собой график, отображающий зависимость интенсивности флуоресценции ПЦРпродукта, связанного с SYBR Green, от температуры смеси. Температура плавления каждого ПЦР продукта специфична и позволяет доказать отсутствие неспецифических продуктов и димеров праймеров в ПЦР смеси. ПЦР в реальном времени проводили с помощью набора iQ™SYBR®Green Supermix (BioRad). Для проведения реакции замешивали следующую смесь: кДНК 1 мкл реакционный буфер iQ SYBR Green Supermix 12,5 мкл 5’ праймер (10 мкM) 1 51 мкл 3’ праймер (10 мкM) 1 мкл вода свободная от нуклеаз до 25 мкл Реакцию проводили в амплификаторе iCycler (Bio-Rad) по следующей программе: 95°C − 3 мин; затем сорок циклов: 94°C − 30 сек, 60°C − 30 сек, 72°C− 1 мин; после завершения циклов строили кривые плавления (скорость изменения температуры 0,5°C/сек, температура варьировала от 60°C до 95°C). Определение экспрессии методом денситометрии В этой серии экспериментов для получения первой цепи кДНК использовали набор для обратной транскрипции «синтез первой цепи кДНК (олиго(дТ)15)» («Силекс» каталожный номер K0203). Реакция проводилась в соответствии с рекомендациями производителя. Реакцию проводили в объеме 25 мкл в пробирках для ПЦР фирмы «Genuine Axygen Quality». На первом этапе смешивали РНК-матрицу с праймером и проводили денатурацию. Для этого брали 1мкг РНК-матрицы, 1 мкл олиго(дТ) праймера (0,5 нг), и доводили mQ водой до конечного объема 25 мкл. Все процедуры проводили на льду. Затем пластиковая пробирка с реакционной смесью плотно закрывалась и прогревалась 5 минут при 700С в амплификаторе MyCycler (BioRad, США). После чего пробирку ставили обратно в лед и прямо в нее добавляли: х10-кратный ОТ буфер 2,5 мкл, смесь dNTP (1,5 мМ) 4 мкл, M-MLV обратную транскриптазу 0,5 мкл – до общего объема 25 мкл, все вместе аккуратно перемешивали. После этого пробирку с реакционной смесью помещали в амплификатор на 60 минут при 37 °С, после чего для инактивации фермента смесь нагревали 10 минут до 700С. Полученная кДНК использовалась для ПЦР в этот же день. Для проведения ПЦР использовали набор «амплификация ДНК с HotTaq полимеразой» («Силекс» каталожный номер K0133). Реакция проводилась в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР проводили в объеме 10 мкл в пробирках для ПЦР фирмы «Genuine Axygen Quality». В реакционную смесь добавляли 0,75 мкл 10х буферного раствора, 1,2 мкл раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (1,5 мМ каждого), 1 мкл матрицы кДНК, 3 мкл mQ воды, 4 мкл смеси 52 олигонуклеотидов (концентрация 2,5 мкМ). К каждой пробе добавляли 0,075 мкл HotTaq полимеразы. Пробы помещали в амплификатор. Для активации фермента, пробирку с реакционной смесью прогревали 10 минут при 94°С, далее еще 3 минуты 94°С - для начальной денатурации матрицы. Плавление (денатурация) ДНК проходило в течение 30 секунд при 94°С, отжиг специфических олигонуклеотидов - в течение 30 секунд при 57°С, амплификация ДНК - в течение 1 минуты при 72°С. Амплификация происходила в течение 35 циклов. После этого 10 мкл пробы смешивали с 2 мкл краски для нанесения и наносили на 2,5% TBE агарозный гель, содержащий 7 мкл бромистого этидия, под слой электрофорезного буфера TBE. Электрофорез проводили при напряжении 120 В методом "подводной лодки". В качестве маркеров длин фрагментов использовались маркеры длин фрагментов pUC19/MspI (Силекс, Россия). Денситометрический трансиллюминатора VILBER анализ LOURMAT проводился (Франция) и с помощью системы гель- документации Gel Explorer 2.2 (Россия). Анализ интенсивности полос, отвечающих искомому GWH продукту проводился с помощью программы GelAnalysis. Каждая электрофореграмма анализировалась тремя независимыми исследователями. 2.6. Иммуноблотинг и электрофорез Перед проведением иммуноблотинга образцы смешивали с буфером Лэмли. Далее образцы разделяли с помощью белкового денатурирующего электрофореза в 10% SDS ПААГ геле. На каждую дорожку наносили 10 мкг тотального белка. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Protran BA83, Whatman, Германия). Равномерность переноса контролировалась окраской по Понсо. Забивку мембран проводили при их инкубации с 10% раствором реактива Rotiblock (Roth, Германия) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мембрану 3 раза отмывали в буфере PBST; часовую инкубацию с первичными антителами (COX-1, COX-2 (1:1000), PPARα, 53 PPARβ, PPARγ, sPLA2 и cPLA2 (1:200)) проводили в PBST. После трехкратной отмывки в буфере PBST мембраны инкубировали со вторичными антителами в течение часа при комнатной температуре. Мембраны проявляли с помощью набора хемилюминесценции (Super-Signal West Pico; Pierce, Германия). Для иммуноблотинга β-тубулина мембрану 30 мин инкубировали в буфере для «отшпаривания» при 40°С, после инкубации мембрану промывали водой 5 раз. Далее мембрану гибридизовали с первичными антителами к β-тубулину (1:10000) и со вторичными антителами «anti-mouse IgG» (Dianova, Германия). Интенсивность сигналов измеряли денситометрией с помощью прибора GS- 800 (Bio-Rad, Германия). Электрофорез для проверки деградации РНК 10 мкл пробы смешивали с 2 мкл краски для нанесения и наносили на 0,8% агарозный гель, содержащий 7 мкл бромистого этидия, под слой электрофорезного буфера TBE. Электрофорез проводили при напряжении 120 В методом "подводной лодки" (камера для горизонтального электрофореза Helicon S-2N, источник питания "Эльф-8" - "НПФ ДНК-Технология"). В качестве маркеров длин фрагментов использовались маркеры длин фрагментов pUC19/MspI (Силекс, Россия). 2.7. Измерение концентрации простагландина (PG) Е2 Для измерения концентрации PGЕ2 отбирали 100 мкл культуральной среды, замораживали еѐ в жидком азоте и хранили при -70°С. После получения достаточного числа образцов проводили их анализ с помощью набора «Prostaglandin E2 Express EIA Kit» («Cayman Chemical», Эстония). В состав набора входит 96-ти луночная планшета с пресорбированными антителами к IgG мыши. В каждую лунку вносили 50 мкл образца или калибровочного раствора. Каждый образец вносился в трех повторностях. Далее в каждую лунку вносили по 50 мкл простагландина Е2, конъюгированного с ацетилхолинэстеразой, и 54 моноклональных антител к PGЕ2. После этих действий плашку закрывали пленкой и инкубировали в темноте на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 60 мин. Готовили раствор Элмана, добавляя 20 мл воды к одной виале, поставляемой в наборе. Выливали раствор из лунок плашки и промывали их 5 раз промывочным буфером. После промывки тщательно избавлялись от остатков буфера и в каждую лунку добавляли по 200 мкл реактива Элмана. Закрывали плашку пленкой и инкубировали ее в темноте на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 60 мин. Далее на планшетном спектрофотометре Spectramax M5 («Molecular Devices», США) измеряли оптическую плотность образцов и калибровочных растворов при длине волны равной 420 нм. По данным, полученным при измерении оптической плотности калибровочных растворов, строили калибровочную кривую по которой определяли концентрацию PGЕ2 в исследуемых образцах. 2.8. Измерение ДНК-связывающей активности PPAR Измерение ДНК-связывающей активности PPARα, -β, -γ проводили с помощью набора «PPARα, δ, γ Complete Transcription Factor Assay Kit» («Cayman Chemical», Эстония). Перед измерением активности PPAR клетки культивировали на 21,5 см2 чашках Петри до образования монослоя. Клетки механически, с помощью скребков, суспендировали, полученную суспензию переносили в 15 мл центрифужные пробирки. Пробирки центрифугировали 5 мин при 300g и температуре +4°С. После центрифугирования cупернатант отбрасывали и ресуспендировали осадок в 5 мл холодного PBS, после чего суспензию повторно центрифугировали 5 мин при 300g и температуре +4°С. Супернатант вновь отбрасывали и ресуспендировали осадок в 5 мл холодного PBS, после чего суспензию повторно центрифугировали 5 мин при 300g и температуре +4°С. После центрифугирования cупернатант отбрасывали и аккуратно ресуспендировали осадок в 500 мкл холодного гипотонического буфера. Полученную суспензию переносили в 1,5 мл центрифужные пробирки и инкубировали 15 мин на льду. После инкубации к суспензии добавляли 50 мкл 55 10% NP-40 и аккуратно перемешивали пипетированием. Полученную суспензию инкубировали 5 мин на льду и центрифугировали 30 сек при 13000g и температуре +4°С. Супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 50 мкл ядерного экстрагирующего буфера и перемешивали на вортексе в течение 15 сек. Затем суспензию инкубировали 15 мин на льду. После инкубации суспензию повторно перемешивали на вортексе в течение 30 сек. Затем суспензию инкубировали 15 мин на льду. После инкубации пробирку центрифугировали 10 мин при 13000g и температуре +4°С. Полученный cупернатант с экстрактом ядерных белков разделяли на аликвоты по 10 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Перед началом анализа активности PPAR в ядерных экстрактах поставляемая в наборе 96-ти луночная плашка размораживалась и принимала комнатную температуру. Только после этого плашку доставали из металлизированной упаковки. В каждую лунку вносили по 10 мкл ядерного экстракта и 90 мкл коммерческого буфера для связывания транскрипционных факторов (CTFB). После этого плашку закрывали пленкой и инкубировали 16 часов при +4°С. По окончании инкубации раствор из лунок сливали, и пять раз промывали их специальным промывочным буфером из набора. После этого в каждую лунку вносили 100 мкл раствора первичных антител к PPAR и закрывали плашку пленкой. После часовой инкубации при комнатной температуре раствор удаляли из лунок и пять раз промывали их промывочным буфером объемом 200 мкл. После этого в каждую лунку добавляли по 100 мкл вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Плашку закрывали пленкой и инкубировали час при комнатной температуре. По окончании инкубации раствор удаляли из лунок и пять раз промывали их 200 мкл промывочного буфера. В каждую лунку добавляли по 100 мкл проявляющего раствора и инкубировали плашку 30 мин в темноте и при комнатной температуре. После инкубации в каждую лунку вносили по 100 мкл стоп реагента. Через 5 мин на планшетном спектрофотометре Spectramax M5 («Molecular Devices», США) измеряли оптическую плотность образцов при длине волны равной 450 нм. 56 2.9. Статистический анализ Значения представлены как среднее ± ошибка средней. Данные анализировали с помощью метода ANOVA с последующей проверкой по критериям Бонферрони. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05 (*, p<0,05). 57 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Характеристика воспалительного процесса в условиях гипергликемии на клетках линии HeLa. Целью первого этапа работы было показать, что 1) условия клеточной гипергликемии меняют чувствительность клеток к действию TLR агонистов; 2) ядерные рецепторы PPAR меняются в условиях гипергликемии; 3) синтетический PPAR агонист росиглитазон позволяет модулировать TLRстимулированные ответы, как в нормальных, так и гипергликемических условиях. В качестве модели исследования мы выбрали клетки линии человека HeLa, поскольку это легко культивируемая линия и в ней экспрессируются все три изотипа PPAR [151–154], они отвечают на стимуляцию агонистами TLR4 LPS выбросом провоспалительных агентов IL-1, IL-6, COX-2, и др. [155,156]. Как характеристику воспалительного ответа мы выбрали индукцию классического маркера воспаления – циклооксигеназу (СОХ-1 и СОХ-2). Циклооксигеназа существует в виде изоформы СОХ-1, которая конститутивно экспрессируется в клетках и СОХ-2, экспрессия которой повышается при действии провоспалительных стимулов [157]. Однако в ряде клеток (миоциты сердца, астроциты, линия HeLa) наблюдается исходный, базовый уровень СОХ2, хотя он также увеличивается при стимуляции провоспалительными стимулами, как и в остальных типах клеток [156,158]. Условия клеточной гипергликемии создавали инкубацией клеток 48 часов в условиях концентрации глюкозы 25 мМ. Контрольные клетки инкубировали в среде, содержащей 5 мМ глюкозы. Ранее было показано, что 48 часов инкубации достаточно для адаптации клеток к новым условиям [18,159–161]. 58 3.1.1. Влияние LPS на экспрессию генов COX-1 и COX-2 в клетках, культивируемых с высокой концентрацией глюкозы Для характеристики влияния LPS на изменения экспрессии генов изоформ COX-1 и COX-2 при клеточной модели гипергликемии клетки линии человека HeLa инкубировали в присутствии 25 мМ глюкозы (условия гипергликемии) или в присутствии 5 мМ глюкозы (нормальные условия). Через 48 ч. добавляли LPS (100 нг/мл) на 24 ч, затем измеряли уровень мРНК в клетках (Рис. 4.1). На Рис. 4.1 хорошо видно, что стимуляция LPS при нормальной концентрации глюкозы (черные столбцы) не меняет экспрессию гена COX-1, тогда как уровень экспрессии гена COX-2 возрастает практически в 2 раза. Эти данные хорошо согласуются со сведениями из литературы об индукции гена СОХ-2 при активации Толл-подобных рецепторов (TLR) системы врожденного иммунитета [162]. Инкубация клеток при повышенной концентрации глюкозы (белые столбцы, Рис. 4.1), не влияет на уровень экспрессии гена COX-1, а уровень экспрессии гена COX-2 уменьшается, хоть и незначительно, но статистически значимо в этих условиях. Отсутствие изменения уровня экспрессии гена COX-1 согласуется с литературными данными, поскольку ранее было показано на линии моноцитов THP-1, что повышенный уровень глюкозы не приводит к изменению экспрессии гена COX-1 [161]. В литературе описано, что экспрессия гена COX-2 увеличивается при добавлении избытка глюкозы [161,163–165]. Эти данные отличаются от полученных нами результатов. Возможно, расхождения связаны с тем, что используются различные линии клеток. Линия HeLa отличается относительно высоким уровнем экспрессии гена СОХ-2 в не стимулированных клетках [156,158], в то время как на большинстве клеточных линий COX-2 экспрессируется только при стимуляции. 59 Рис. 3.1. Влияние LPS на уровень экспрессии генов изоформ циклооксигеназы COX-1 и СОХ-2 в клетках HeLa в условиях адаптации к повышенной концентрации глюкозы. Клетки инкубировали при нормальной (черные столбцы, 5 мМ) или повышенной (белые столбыцы, 25 мМ) концентрациях глюкозы в среде 48 ч, затем добавляли LPS (концентрация 100 нг/мл) на 24 ч. После этого выделяли тотальную РНК клеток. Экспрессия COX-1 и СОХ-2 определялась методом ОТ-ПЦР. Все значения нормированы на уровень мРНК актина. Контрольные клетки инкубировали в среде с нормальной концентрацией глюкозы 72 часа и уровень экспрессии в них СОХ-1 и СОХ-2 генов принимали за 1. Результаты представлены как изменения по сравнению с контрольными клетками. * - p<0.05. Интересно, что эффект совместного применения LPS и глюкозы (серые столбцы) заключается в уменьшении экспрессии гена СОХ-1 (Рис. 3.1). COX-1 считается конститутивно экспрессирующимся геном. Однако, имеются сведения, что его экспрессия в некоторых клетках может снижаться при воздействии LPS в условиях культивирования при нормальной концентрации глюкозы [166]. Почему этот эффект мы наблюдаем только в условиях высокой глюкозы остается неясным. На адаптированных к глюкозе клетках вообще не происходит роста экспрессии СОХ-2, т.е. характеристики LPS-стимулированного клеточного ответа меняются. Таким образом, изменения экспрессии COX-1 и COX-2 в условиях гипергликемии показывают, что LPS оказывает свое влияние на клетки, и мы 60 видим отражение изменившегося в условиях гипергликемии клеточного ответа на воспалительные стимулы. 3.1.2. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов COX-1 и COX-2 Росиглитазон относится к классу тиазолидиндионов и используется в терапии для снижения концентрации глюкозы в крови (увеличивает запас в клетках и снижает синтез). Кардиотоксичность является побочным действием этого лекарственного средства. Росиглитазон является специфическим агонистом PPARγ [167], однако на уровне клеточных ответов может модулировать другие типы PPAR [93]. В ряде исследований было показано, что росиглитазон, агонист ядерного рецептора PPARγ, обладает противовоспалительной активностью [168–170]. Все эти исследования были проведены на клетках, адаптированных к нормальной концентрации глюкозы. Поэтому, мы проверили, сохраняет ли он свою способность модулировать ответ клеток на LPS в условиях клеточной гипергликемии. В серии экспериментов проведено сравнение эффекта росиглитазона в условиях гипергликемии и нормальной концентрации глюкозы в среде. Инкубацию клеток проводили аналогично описанному в разделе 3.1.1. Росиглитазон добавляли вместе с LPS и оценивали через 24 ч изменение уровня мРНК COX-1 (Рис. 3.2.а) и COX-2 (Рис. 3.2.б). Влияние LPS на экспрессию генов СОХ-1 и СОХ-2 было аналогичным серии экспериментов, представленных на Рис. 4.1. Из Рис. 4.2.а видно, что обработка росиглитазоном приводит к падению уровня экспрессии COX-1 как при нормальных условиях, так и при культивировании клеток c повышенной концентрацией глюкозы. При этом на клетках, культивируемых в условиях гипергликемии, эффект росиглитазона выражен сильнее, что указывает на возможность изменения в системе ядерных рецепторов PPAR, для которых росиглитазон является агонистом. Росиглитазон приводит к снижению LPS-индуцированной экспрессии гена COX-2 (Рис. 3.2.б), что соответствует данным о противовоспалительных свойствах этого вещества [168–170]. Однако, совместное добавление LPS и 61 росиглитазона не изменяет эффект LPS на клетки, культивируемые в условиях гипергликемии (Рис. 3.2.б). Таким образом, при нормальной концентрации глюкозы росиглитазон оказывает противовоспалительное действие, однако в условиях гипергликемии он не влияет на эффекты LPS [162]. Мы предположили, что при адаптации клеток к повышенному содержанию глюкозы происходит изменение экспрессии ядерных рецепторов PPAR. Рис. 3.2. Влияние стимулов на уровень экспрессии генов изоформы СОХ-1 (А) и СОХ-2 (Б) в клетках HeLa. Клетки инкубировали в среде с нормальной (5 мМ) или повышенной (25 мМ) концентрациях глюкозы в течение 48 часов, затем добавляли 100нг/мл LPS, росиглитазон (рос, 20мкМ) или совместно LPS с росиглитазоном на 24 часа. После этого выделяли тотальную РНК клеток. Относительное количество генов COX было определено с помощью ОТ-ПЦР. Все значения нормированы на уровень мРНК актина. Контрольные клетки инкубировали в среде с нормальной концентрацией глюкозы 72 часа и уровень экспрессии в них генов СОХ-1 и СОХ-2 принимали за 1. *p<0.05 по сравнению с контрольными клетками, #p<0.05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. 62 3.1.3. Влияние LPS на уровень экспрессии генов PPARα, PPARβ и PPARγ Для проверки предположения, что при культивировании клеток линии HeLa в условиях повышенной концентрации глюкозы происходят изменения в уровне экспрессии PPARα, -β и –γ, мы провели следующую серию экспериментов. Измеряли уровень мРНК PPARα, -β и –γ в клетках, инкубированных с LPS в течение 24 ч (Рис. 3.3). Сравнивали клетки, предварительно инкубированные в 5 мМ и 25 мМ глюкозы. На Рис. 4.3 хорошо видно, что стимуляция LPS увеличивает экспрессию генов всех трех изоформ PPAR в контрольных клетках (5 мМ глюкозы). PPARγ возрастает в 1,5 раза, а PPARβ практически в 2 раза. Самый сильный эффект эта стимуляция оказывает на PPARα - уровень экспрессии гена этой изоформы увеличивается более чем в 2,5 раза. Рис. 3.3. Влияние LPS на уровень экспрессии генов трех изотипов PPAR в клетках HeLa, культивируемых с повышенной концентрацией глюкозы. Клетки инкубировали при нормальной (5 мМ) или повышенной (25 мМ) концентрациях глюкозы в среде 48 часов, затем добавляли LPS (концентрация 100 нг/мл). После этого выделяли тотальную РНК клеток. Относительное количество генов PPAR определяли с помощью ОТ-ПЦР. Все значения нормированы на уровень мРНК актина. Контрольные клетки инкубировали в среде с нормальной концентрацией глюкозы 72 часа, и уровень экспрессии в них генов PPARα, PPARβ, PPARγ принимали за 1. Результаты представлены как изменения по сравнению с контрольными клетками. *p<0.05. 63 При инкубации клеток в условиях повышенной концентрации глюкозы уровень экспрессии генов PPARα снижается. При этом при культивировании клеток в высокой глюкозе стимуляция LPS не приводит к изменению экспрессии этих генов. 3.1.4. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов PPARα, -β и -γ. Для выяснения, влияния росиглитазона мы провели серию экспериментов, в которых исследовали изменение уровней мРНК PPARα, -β и -γ в клетках, инкубированных с росиглитазоном – специфическим агонистом PPARγ, в течение 24 часов (Рис. 3.4). Влияние LPS на экспрессию генов было аналогичным серии экспериментов, представленным на Рис. 3.3. Обработка LPS приводит к увеличению экспрессии трех изотипов PPAR в нормальных условиях и не меняет уровень экспрессии в условиях гипергликемии (Рис. 3.3., Рис. 3.4.). Получено, что обработка росиглитазоном приводит к падению уровня экспрессии гена PPARβ практически в два раза, при этом на экспрессию генов PPARα и PPARγ росиглитазон влияния не оказывает (Рис. 3.4.). Росиглитазон снимает стимулирующий эффект LPS на экспрессию всех трех изоформ в нормальных условиях (Рис. 3.4.). В условиях гипергликемии он обладает выраженным влиянием на экспрессию PPARα (Рис. 3.4.а). Влияния на экспрессию PPARβ и PPARγ не проявляется. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы о взаимодействии между типами рецепторов на клеточном уровне, высказанной ранее [93,95]. Росиглитазон является специфическим агонистом PPARγ, однако в наших экспериментальных условиях его действие проявляется на уровне модуляции экспрессии PPARα и PPARβ. Антивоспалительное действие росиглитазона было показано в других моделях воспаления [100,171]. Остается открытым вопрос о противовоспалительных эффектах росиглитазона в условиях гипергликемии. 64 Рис. 3.4. Влияние стимулов на уровень экспрессии генов PPARα (а), PPARβ (б), PPARγ (в) в клетках HeLa. Клетки инкубировали при нормальной («без глюкозы» - 5 мМ) или повышенной («с глюкозой» - 25 мМ) концентрациях глюкозы в среде 48 ч, затем добавляли LPS (концентрация 100 нг/мл), росиглитазон (20 мкМ) или LPS с росиглитазоном на 24 ч. После этого выделяли тотальную РНК клеток. После чего была выделена тотальная РНК клеток. Относительное количество генов PPAR определяли с помощью ОТ-ПЦР. Все значения нормированы на уровень мРНК актина. Контрольные клетки инкубировали в среде с нормальной концентрацией глюкозы 72 часа и уровень экспрессии в них PPARα, PPARβ, PPARγ генов принимали за 1. Результаты представлены как изменения по сравнению с контрольными клетками. * - p<0.05. 65 Сочетанное применение противовоспалительных лекарств разных классов считается перспективным направлением патологий с выраженной воспалительной компонентой (см., например [10]). Мы оценили влияние совместного действия агонистов ядерных рецепторов PPAR и ингибиторов циклооксигеназы (СОХ) на клетки глиомы крысы С6. В этой клеточной культуре С6 экспрессированы все три изоформы PPAR [172] и можно было предполагать эффективность сочетанного применения. Для определения влияния ингибиторов СОХ на пролиферацию С6 клетки обрабатывали ацетаминофеном, NS-398 (специфический ингибитор СОХ-2) и SC-560 (специфический ингибитор СОХ-1) в течение 48 часов, после чего окрашивали MTS 2 часа и определяли уровень пролиферации по сравнению с необработанными клетками. Было получено, что указанные ингибиторы снижают уровень пролиферации при высоких концентрациях веществ (NS-398 – 10 мкМ, SC-560 – 1мкМ, ацетаминофен – 5мкМ). Полученный результат согласуется с описанным в литературе влиянием ингибиторов СОХ на пролиферацию С6 [173]. В отдельной серии экспериментов оценили влияние агонистов PPARα (GW7647), PPARβ (L-165041) и PPARγ (росиглитазон). Эффект ингибиторов СОХ (около 75% от контроля) сравним с эффектом агонистов PPAR (около 80% от контроля). Далее исследовали совместное действие агонистов PPAR и ингибиторов СОХ. К клеткам добавляли указанные вещества во всех комбинациях агонист PPAR – COX-ингибитор. Всего рассмотрено 9 вариантов. Предполагалось, что при ингибировании циклооксигеназ СОХ арахидоновая кислота перестанет окисляться СОХ, таким образом, наряду с внесѐнными к клеткам синтетическими агонистами PPAR, будут присутствовать и эндогенные лиганды (арахидоновая кислота), и тем самым подавляющий эффект PPAR-агонистов усилится. Однако, мы получили, что эффект исследуемых веществ нивелировался при любых концентрациях. Возможно двоякое объяснение наблюдаемого: ингибиторы СОХ мешают активации процессов разрешения воспаления, осуществляемых при активации PPAR синтетическими агонистами, или, наоборот, синтетические агонисты блокируют антивоспалительное действие 66 ингибиторов СОХ. Обнаруженное явление указывает на то, что комбинированное применение веществ одного типа воздействия (в данном случае антивоспалительные лекарственные препараты) может на уровне клеточного воспалительного ответа приводить к потере активности обоих классов веществ. Полученные результаты были опубликованы [174], однако стало понятно, что для сочетанного применения противовоспалительных лекарств разных мишеней действия необходимо детально исследовать молекулярные механизмы регуляции всех трех изоформ PPAR, и их участия в клеточном ответе. Таким образом, в экспериментах на линиях клеток нами показано: 1) Росиглитазон не влияет на LPS-стимулированную экспрессию COX-1 2) В нормальных условиях (5 мМ глюкозы) стимуляция LPS приводит к увеличению экспрессии СОХ-2 и увеличению экспрессии PPARα, -β и –γ. 3) В условиях клеточной гипергликемии (25 мМ глюкозы) происходит снижение экспрессии СОХ-2, PPARα и PPARβ. При стимуляции таких клеток LPS не происходит индукция экспрессии СОХ-2, PPARα, -β и –γ. Наблюдается только снижение экспрессии COX-1. Эти данные указывают на изменение экспрессии маркеров воспалительного ответа (COX-1 и COX-2) и ядерных рецепторов PPAR. 4) Росиглитазон, лекарственное средство, используемое как гипогликемический препарат, и агонист PPARγ, является антивоспалительным веществом в нормальных условиях, и снижает LPS-стимулированное увеличение экспрессии всех исследуемых генов, но не проявляет этого эффекта в условиях клеточной гипергликемии на PPARβ и PPARγ. Таким образом, условия гипергликемии меняют баланс между TLRиндуцированными внутриклеточными ответами и PPAR трио, которые отвечают за метаболический и энергетический гомеостаз клеток. Следует отметить, что полученным нами на линии HeLa данные не согласуются с исследованиями на клетках глиомы крысы C6 [175], где активация 67 PPARγ стимулировала экспрессию гена PPARβ. Так же полученные данные не согласуются с исследованиями, где было показано, что активация PPARγ приводит к повышению уровня экспрессии гена в раковых клетках слюнной железы и гипофиза человека [176] и эпителиальных клетках [177]. Связаны ли эти различия с видами клеток или экспериментальными условиями обработки (время, тип лиганды, концентрация) не ясно. Ранее было показано, что экспрессия гена PPARγ понижается при стимуляции LPS в клетках легких [91][178] и сердца [179]. Уровень экспрессии гена PPARγ понижается и после стимуляции макрофагов LPS [180]. При стимуляции клеток сердца LPS уровень экспрессии гена PPARβ снижался [179]. Эти данные не согласуются с полученными нами, возможно, это связано с тем, что наша работа проводилась на ―раковых‖ клетках. Поэтому было принято решение перейти на первичные линии клеток для дальнейших исследований. Такими клетками являются астроциты, которые получают из мозга новорожденных крыс. Эти клетки обладают следующими характеристиками: 1) с ними относительно просто работать, в лаборатории имелся опыт работы, клетки относительно долгоживущие в условиях культивации; 2) они обладают достаточно хорошо охарактеризованной системой врожденного иммунитета [103,181,182]; 3) на них показана экспрессия изучаемых генов PPARα, PPARγ, PPARβ [88,93,183]. 68 3.2. Характеристика TLR-стимулированных ответов астроцитов в условиях гипергликемии К настоящему времени показано, что при метаболическом синдроме, ожирении, диабете меняется характер протекания воспалительных ответов [4,13]. Развитие хронических воспалительных состояний – характерная черта данных заболеваний, кроме того воспалительные ответы сейчас активно исследуют в контексте таких заболеваний как травмы мозга, инсульт, вирусные инфекции, нейродегенеративные заболевания [17,18]. Известно, что глиальные клетки мозга – астроциты, играют важную роль в регуляции воспалительных процессов в мозге [65]. Эпидемиологические исследователи указывают, что увеличение концентрации глюкозы в мозгу при диабете меняет протекание воспалительного ответа на уровне организма [3]. Однако на уровне клеток этот вопрос изучен не был. Это и явилось предметом нашего исследования. Задачи исследования на этом этапе: 1) сравнить морфологически и иммуноцитохимически астроциты, культивируемых при 22,5 мМ глюкозы (гипергликемия) и 5 мМ глюкозы (контрольные условия); 2) сравнить клеточные ответы при активации системы врожденного иммунитета; 3) показать, меняются ли изучаемые нами гены (PPARα, PPARγ, PPARβ) в условиях гипергликемии. 3.2.1. Морфология и иммуноцитохимия по GFAP для астроцитов культивируемых при разной концентрации глюкозы. На первом этапе мы охарактеризовали морфологическую структуру астроцитов при культивировании в различных концентрациях глюкозы с помощью конфокальной микроскопии. После выделения первичных астроцитов из крыс и культивирования в течение 10 дней при нормальной концентрации глюкозы, клетки рассаживали по плашкам с разной концентрацией глюкозы на 48 ч. Затем клетки фиксировали и красили с помощью антител. 69 Рис. 3.5. Морфология и иммуноцитохимия для GFAP в астроцитах, культивируемых в высокой глюкозе. Астроциты выделелнные из новорожденных крысят культивировались при нормальной (5 мМ) и высокой (22,5 мМ) концентрации глюкозы в среде в течении 48 часов. Фазовый контраст для окраски астроцитов (GFAP, зеленый), клеточных ядер (EtBr, красный) и клеток микроглии (IB4, синий) показаны на Рис.4.5.а,б,с соответственно. Количественный подсчет клеток представлен на Рис.4.5.д, за 100% взято общее количество ядер на снимке. 70 На Рис. 3.5 представлен пример изображения с конфокального микроскопа. Зеленым на слайде прокрашены астроциты, для этого использовался маркер на специфический белок GFAP. Красным покрашены ядра (для покраски ядер использовался этидий бромид). Синим покрашена микроглия (использовался специфичный маркер на микроглию, согласно [184]). Для каждой концентрации глюкозы приготовили три чашки клеток с трех выделений, т.е. по 9 чашек на каждую глюкозную обработку. Подсчитывали количество прокрашенных клеток в каждой пробе. На графике видно, что культура состоит на 85% из астроцитов, 5% микроглии и 10 процентов клеток, которые прокрасились на ядра, но не прокрасились на астроциты и микроглию. Таким образом, не наблюдается заметных морфологических различий между астроцитами культивируемыми при высокой и нормальной концентрациях глюкозы. 3.2.2. Влияние глюкозы на выброс PGE2 и TNFα в астроцитах при активации системы врожденного иммунитета. Ранее было показано, что культивирование клеток в высокой глюкозе влияет на уровень синтеза провоспалительных маркеров в ответ на активацию системы врожденного иммунитета [100,185]. Как было показано в работе [186] максимальный уровень биосинтеза TNFα наблюдается через 4 часа после добавления LPS. Для характеристики воспалительного ответа мы оценили как меняется синтез TNFα и PGE2 при культивировании астроцитов в среде с нормальной (5 мМ) и высокой (22,5 мМ) концентрацией глюкозы. Получено, что при стимуляции клеток LPS синтез PGЕ2 увеличивается до 786 ± 42 пг/мл в высокой глюкозе против примерно 434 ± 64 пг/мл при культивировании клеток в нормальной глюкозе (Рис. 3.6.а). В тоже время и базовый уровень выброса PGЕ2 без обработки LPS увеличивается при обработке клеток глюкозой до 264 ± 37 нг/мл против 133 ± 23 нг/мл в контрольных клетках (Рис. 3.6.а). 71 Рис. 3.6. Влияние глюкозы на LPS-стимулированный выброс PGE2 (а) и TNFα (б). Астроциты культивировали в течении 48 ч в среде с концентрацией глюкозы 5 мМ (NG) или 22,5 мМ (HG), затем культивировали 4 ч без дополнительных обработок или в присутствии LPS (100 нг/мл). Концентрацию PGE2 и TNFα определяли с помощью ИФА (см. Материалы и Методы). Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p < 0,05. В контрольных клетках без обработки LPS уровень выброса TNFα был ниже пределов детектирования, однако стимуляция LPS вызывает выброс TNFα, на уровне 140+22 пкг/мл при нормальной концетрации глюкозы и 250 ± 25 пкг/мл при гипергликемии (Рис. 3.6.б). Полученные нами данные показывают, что клеточная гипергликемия увеличивает выброс провоспалительных маркеров PGE2 и TNFα При этом инкубирование астроцитов с глюкозой усиливает чувствительность клеток к действию LPS. 3.2.3. Изменение экспрессии и ДНК-связывающей активности PPARα, -β, -γ при культивировании астроцитов в условиях гипергликемии. К началу нашей работы было известно, что различные изоформы PPAR меняют свою экспрессию в экспериментах, где модулируют различные диабетические модели [187,188]. Однако крайне мало данных характеризующих изменение активности и экспрессии изоформ PPAR в клетках мозга. Чтобы оценить, влияет ли культивирование клеток в среде с разной концентрацией 72 глюкозы на нативное состояние астроцитов, мы изучили, как меняется экспрессия и ДНК-связывающая активность трех изоформ PPAR. Показано, что культивирование клеток в высокой глюкозе не влияет на ДНК-связывающую активность для всех трех изоформ PPAR (Рис. 3.7.а). Однако при этом увеличение концентрации глюкозы в клеточной среде меняет уровень экспрессии мРНК всех трех изоформ PPAR. Для генов PPARα и PPARγ происходит снижение экспрессии мРНК, в это же время наблюдается увеличение экспрессии PPARβ (Рис. 3.7.б) Рис. 3.7. Влияние глюкозы на ДНК-связывающую активность (а) и уровень экспрессии мРНК PPARα, PPARβ и PPARγ (б). Астроциты культивировались 48 часов в среде с нормальной (5 мМ) и повышенной концентрацией глюкозы (22,5 мМ). (а) ДНК-связывающую активность измеряли как описано в материалах и методах. Уровень мРНК . Уровень экспрессии мРНК PPARα, PPARβ и PPARγ определяли методом ПЦР в реальном времени. За 100% принят уровень мРНК соответствующего гена в клетках культивируемых при нормальной концентрации глюкозы. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с клетками культивируемыми при нормальной концентрации глюкозы. Таким образом, хотя адаптация к гипергликемии не влияет на морфологию глиальных клеток и их состав, клеточная система меняется при такой адаптации: при гипергликемии ответы на активацию системы врожденного иммунитета становятся более выраженными на уровне экспрессии трех изоформ PPAR. При этом изменение уровня глюкозы не влияет на ДНК-связывающую активность трех изоформ PPAR в нативных астроцитах. 73 3.2.4. Влияние глюкозы на экспрессию трех изоформ PPAR в условиях активации системы врожденного иммунитета. Полученные нами данные по синтезу PGE2 и TNFα показали, что при культивировании астроцитов в среде с различной концентрацией глюкозы клеточный ответ может изменяться при активации системы врожденного иммунитета. Кроме TLR4, агонистом которого является LPS, астроциты на плазматической мембране имеют TLR1,2 и, возможно, 5 [12,36]. Могут ли они действовать на экспрессию PPAR? Прежде всего мы определили, имеют ли антагонисты TLR провоспалительный эффект в тестируемых нами концентрациях. Для этого мы измерили уровень выброса PGE2 (Рис. 3.8.в) и TNFα (Рис. 3.8.г) клетками при действии агонистов TLR. Сравнивали влияние липополисахарида (LPS, 100 нг/мл), пептидогликана (PGN, 5 мкг/мл) и флагеллина (FGL, 5 мкг/мл) являющихся агонистами TLR4, TLR2 и TLR5 соответственно. Действительно, PGN, FGL так же как LPS вызывали выброс провоспалительных маркеров в тестируемых концентрациях. Чтобы оценить, как связанно изменение уровня мРНК PPARα, PPARβ и PPARγ вызванное добавлением агонистов TLR с концентрацией глюкозы мы сравнили уровень экспрессии мРНК на 4х часах после обработки астроцитов LPS, PGN и FGL. Обнаружено, что для всех трех изоформ PPAR наблюдается значимая разница между экспрессией в клетках культивируемых в среде с 5 мМ глюкозы и 22,5 мМ при стимуляции агонистами TLR2 и TLR4 (Рис. 3.8а,б). Адаптация астроцитов в условиях гипергликемии приводит к увеличению чувствительности мРНК трех изотипов PPAR к агонистам LPS и PGN. Мы наблюдаем более заметное падение PPARα и PPARγ (Рис. 3.8.а) и увеличение PPARβ в высокой глюкозе (Рис. 3.8.б). При этом не наблюдается изменения экспрессии PPARγ при обработке астроцитов PGN. При активации Толл-подобного рецептора 5 FGL мы не наблюдаем разницы от концентрации глюкозы. Как для PPARα и PPARγ, так и для PPARβ изменения экспрессии остаются на одном уровне и не зависят от концентрации 74 глюкозы в среде, в которой культивируются клетки. Это открывает новые страницы в направлении изучении этого рецептора в мозге. Действительно, до наших работ TLR5 рецепторы были показаны на астроцитах только в косвенных исследованиях. Так, в исследованиях на нокаутных мышах было показано, что MyD88 путь активации TLR (в числе прочих исследовали и TLR5) играет важную роль в инициации невропатической боли [189]. Методами молекулярной биологии было показано, что мРНК TLR5 рецепторов в конститутивных условиях экспрессируется на астроцитах [51]. Нами впервые показано, что TLR5 агонист, в концентрациях, обычно используемых для стимуляции воспалительных ответов в других типах клеток [92,190], влияет на синтез PGE2, TNFα, экспрессию PPAR. Агонист этого рецептора играет полноправную роль в системе врожденного иммунитета наравне с другими, более изученными TLR2 и TLR4. Сомнения в функциональности этого рецептора наряду с высокой стоимостью агониста ограничивали исследователей. Наши данные дают основания для развернутого изучения этого рецептора и поиска его эндогенных лигандов в мозге. Из литературных данных известно, что высокая глюкоза может вызывать активацию TLR2 и TLR4 [191]. Наши данные косвенно подтверждают эту гипотезу. Действительно при увеличении количества Толл-подобных рецепторов, мы будем наблюдать усиление внутриклеточного сигнала при их активации. Этим может объясняться большее изменение в экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ в высокой глюкозе. 75 Рис. 3.8. Сравнение влияния лигандов TLR1/2,4,5 на экспрессию PPARα, -γ (a) и PPARβ (б) в астроцитах, культивируемых в нормальной (5 мМ) и высокой (22,5 мМ) концентрации глюкозы. Астроциты стимулировались 4 часа с агонистами Толл-подобных рецепторов: липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл, TLR4); пептидогликаном (PGN, 5 мкг/мл, TLR1/2) и флагеллином (FGL, 5 мкг/мл, TLR5). Количество мРНК трех изоформ PPAR определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК в контрольных клетках принят за 1. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, # p < 0,05. 76 3.2.5. Модуляция LPS-стимулированного воспалительного ответа в астроцитах с помощью MAPK ингибиторов в условиях повышенной концентрации глюкозы в среде культивирования. В литературе есть разрозненные данные о том, что различные MAPK играют важную роль в регуляции клеточного ответа в условиях гипергликемии [185]. Мы предположили, что MAPK могут играть важную роль в регуляции экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ в условиях гипергликемии. Для того, чтобы оценить эффективность работы выбранных нами ингибиторов на астроцитах при стимуляции клеток LPS мы измерили выброс TNFα (Рис. 3.9.а) и PGE2 (Рис. 3.9.б), которые используются как маркеры воспалительного ответа. Для оценки синтеза TNFα, клетки прединкубировались 1 час с различными ингибиторами MAPK и затем обрабатывались LPS. Через 4 часа измерялся уровень выброса TNFα. Мы получили, что в условиях гипергликемии все исследуемые нами ингибиторы MAPK снижают синтез TNFα (Рис. 3.9.а). При этом, не смотря на разницу в уровне LPS-стимулированного синтеза TNFα, статистически значимого различия между действиями ингибитора не показано. Такую же картину можно наблюдать и для LPS-стимулированного уровня синтеза PGE2. Полученные результаты свидетельствуют, что культивирование астроцитов в среде с различной концентрацией глюкозы не снижает противовоспалительную эффективность тестируемых ингибиторов. 77 Рис. 3.9. Влияние ингибиторов MAPK на LPS-стимулированный выброс TNFα и PGE2. Астроциты прединкубировали 1 час с ингибиторами MAPK сигнальных путей включающих p38 (SB203580, 20 μM), MEK1/2 (U0126, 10 μM), ERK1/2 (PD98059, 20 μM), JNK (SP600125, 10 μM) и затем культивировали 4 часа в присутствии LPS (100нг/мл). Затем среда культивирования анализировалась с помощью наборов «TNFα ELISA kit и PGE2 express EIA kit» как описано в материалах и методах для определения уровня синтеза TNFα и PGE2. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с уровнем LPSстимулированного синтеза TNFα или PGE2 в клетках культивируемых в среде с концентрацией глюкозы 5 мМ, #p<0,05 по сравнению с уровнем LPS-стимулированного синтеза TNFα или PGE2 в клетках культивируемых в среде с концентрацией глюкозы 22,5 мМ. Чтобы выяснить как культивирование астроцитов при нормальной (5 мМ) или повышенной (22,5 мМ) концентрации глюкозы в среде, клетки прединкубировались 30 минут с тестируемым ингибитором, и затем клетки либо инкубировались без какой-либо обработки либо обрабатывались LPS в течении 4х часов. Уровень экспрессии мРНК PPARα, PPARβ и PPARγ измерялся с помощью ПЦР в реальном времени. 78 Рис. 3.10. Эффект p38, MEK1/2, ERK1/2 и JNK ингибиторов на экспрессию PPARα, -β, -γ в наивных и LPS-стимулированных клетках при культивировании астроцитов в среде с повышенной концентрацией глюкозы. Астроциты культивировали в условиях нормальной (NG, 5mM) и повышенной концентрации глюкозы (HG, 22.5mM). Затем прединкубировали 1 час с ингибиторами MAPK сигнальных путей включающих p38 (SB203580, 20 μM), MEK1/2 (U0126, 10 μM), ERK1/2 (PD98059, 20 μM), JNK (SP600125, 10 μM) и затем культивировали 4 часа в присутствии LPS (100нг/мл). Количество мРНК PPARα (а), PPARβ (б) и PPARγ (с) определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК в контрольных клетках принят за 1. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, # p < 0,05. 79 При изучении регуляции экспрессии мРНК PPARα нами не было выявлено никих значимых изменений при культивировании астроцитов в среде с нормальной (5 мМ) и повышенной (22,5 мМ) концентрацией глюкозы (Рис. 3.10.а). Из полученных данных видно, что для PPARβ добавление ингибитора SB 203580 незначительно увеличивает экспрессию мРНК как в NG, так и в HG. При этом в клетках стимулированных LPS ингибирование p38 резко увеличивает экспрессию PPARβ при высокой концентрации глюкозы по сравнению с нормальной глюкозой (Рис. 3.10.б). Ингибиторы ERK1/2 и MEK1/2 не меняет уровень экспрессии PPARβ независимо от концентрации глюкозы. В LPSстимулированных клетках применение и PD98059 и U0126 снимает LPSстимулированную экспрессию PPARβ независимо от концентрации глюкозы, однако в астроцитах, культивируемых в условиях гипергликемии и SP600125 (ингибитор ERK) и PD98059 (ингибитор ERK1/2) не возвращают экспрессию мРНК PPARβ к контрольным значениям (Рис. 3.10.б). Для PPARγ добавление ингибитора p38 (SB 203580) незначительно снижает экспрессию PPARγ в HG, и не влияет на экспрессию этого гена в NG. В LPS-стимулированных клетках ингибирование p38 никак не влияет на экспрессию PPARγ ни в HG, ни в NG. Ингибирование МЕК1/2 вызывает значительное увеличение экспрессии как в NG, так и в HG. При этом в LPSстимулированных клетках падение экспрессии, вызванное LPS при нормальной глюкозе снимается U0126, только в условиях нормальной (5 мМ концентрации глюкозы). При ингибировании JNK разницы в экспрессии PPARγ ни в NG, ни в HG нет – и там и там наблюдается небольшое повышение экспрессии мРНК. В LPS-стимулированных клетках ингибирование JNK и там и там снимает эффект LPS. При ингибировании ERK1/2 в не стимулированных астроцитах наблюдается значительное повышение экспрессии мРНК PPARγ в высокой глюкозе. В тоже время в LPS-стимулированных клетках ингибирование ERK1/2 так же снимает эффект LPS в HG (Рис. 3.10.в). 80 3.3. Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах. Взаимосвязь TLR сигналинга и ядерных рецепторов PPAR является интригующей задачей для многих исследователей. Из данных, полученных in vivo известно, что агонисты TLR приводят к изменениям PPAR и их способности модулировать экспрессию PPAR-зависимых генов. Однако сведений о регуляции PPAR в процессе разворачивания ответа клеток на действие стимулов, активирующих систему врожденного иммунитета, мало и этот вопрос требует детального изучения. Целью данного этапа работы являлось выяснение механизмов регуляции PPAR при стимуляции TLR рецепторов на астроцитах. Для этого решали следующие задачи: 1) показать, есть ли общий механизм в действии агонистов разных TLR на экспрессию (уровень мРНК и белка) и ДНК связывающую активность PPARα, -β -γ; 2) меняются ли параметры деградации мРНК трех изотипов PPAR при TLR-стимуляции; 3) зависит ли экспрессия PPAR от ингибиторов синтеза белка; 4) можно ли регулировать уровень экспрессии PPAR с помощью ингибиторов МАРК. В каждой серии клеточных экспериментов параллельно изучению генов PPARα, PPARγ, PPARβ исследовали экспрессию СОХ-2, как классического маркера воспаления. 3.3.1. TLR-агонисты подавляют уровень экспрессии PPARα и PPARγ, но увеличивают экспрессию PPARβ Ранее мы показали, что экспрессия PPAR на уровне мРНК модулируется агонистами TLR рецепторов (Рис. 3.8). Возник вопрос, участвует ли в этом действии MyD88 – зависимый или MyD88 – независимый пути внутриклеточного пути проведения TLR сигналов. MyD88 – зависимый путь вовлекает активацию фактора транскрипции NF-κB. Вовлеченность этого фактора проверяют с помощью ингибитора Bay 11-7085, который блокирует активацию NF-κB и фосфорилирование субъединицы IkB [192]. 81 Эффективность действия ингибитора оценивали по влиянию на LPSстимулированный выброс PGE2. Мы получили, что необработанные LPS клетки синтезируют 156 ± 4 нг/мл PGE2, добавление LPS практически в 5 раз увеличивает синтез PGE2 до уровня 787 ± 83 нг/мл, совместная обработка LPS и 5 мкМ Bay 11-7085 приводит к снижению уровня PGE2 до 86 ± 4 нг/мл (данные не представлены). Интересно, что в нестимулированных клетках добавление Bay 11-7085 приводит к увеличению выброса PGE2 до 259 ± 12 нг/мл. Это показывает что NF-κB вовлечен не только в LPS-индуцированный синтез PGE2, но так же играет важную роль в обеспечении базального уровня PGE2 в астроцитах. Проведенное исследование показало, что используемая нами концентрация ингибитора эффективна в наших экспериментальных условиях. Мы использовали LPS (100 нг/мл), пептидогликан (PGN, 5 мкг/мл) и флагеллин (FGL, 5 мкг/мл), являющихся агонистами TLR5, TLR2 и TLR5, соответственно. Клетки инкубировали со стимулами или стимулами совместно с Bay 11-7085 4 часа (Рис. 3.11). Измерение уровней мРНК с помощью ПЦР в реальном времени показало, что при инкубировании астроцитов со всеми тремя TLR агонистами происходит подавление экспрессии мРНК PPARα и PPARγ и увеличение экспрессии PPARβ (Рис. 3.11.), что показывает на сходство TLR/PPAR сигнальных путей этих транскрипционных факторов. Добавление вещества Bay 11-7085 блокирует эффекты тестируемых TLR агонистов на экспрессию PPARα, -β, -γ (Рис. 3.11.). Эти данные указывают на вовлечение MyD88 – зависимого пути в регуляции данных генов при активации системы TLR (см. Рис. 1.2 и раздел 1.3). Полученные данные показывают, что агонисты разных типов TLR влияют на экспрессию PPARα, -β, -γ через NF-κB зависимый путь. Примечательно, что все три агониста действуют схожим образом на экспрессию PPARα и PPARγ, хотя в выбросе провоспалительных маркеров наблюдается заметная разница в силе эффекта. 82 Рис. 3.11. Агонисты Толл-подобных рецепторов (TLR) модулируют экспрессию трех изоформ PPAR через NF-κB зависимый путь (в). Астроциты стимулировались 4 часа с агонистами Толлподобных рецепторов: липополисахаридом (LPS, 100нг/мл, TLR4); пептидогликаном (PGN, 5 мкг/мл, TLR1/2) и флагеллином (FGL, 5 мкг/мл, TLR5) с или без добавлением Bay 11-7085 (5 мкМ) ингибитора NF-κB. Уровень экспрессии мРНК PPARα (белые столбцы), PPARβ (серые столбцы) и PPARγ (черные столбцы) определяли методом ПЦР в реальном времени. Клетки прединкубировали с ингибитором Bay-11-7085 в течении 1 часа перед добавлением агонистов. Уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках принят за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками На следующем этапе исследования был поставлен вопрос, как изменения в уровне мРНК отражаются на уровень экспрессии белка и ДНК-связывающую активность исследуемых генов. Известно, что для большинства генов наблюдается корреляция между уровнем мРНК и белка [193,194]. Тем не менее, ранее было показано, что некоторые гены регулируются на уровне деградации мРНК, и активно участвуют в TLR-опосредованных клеточных ответах. Прежде всего это различные провоспалительные гены, такие как СОХ-2, TNFα, Il-1, [145]. Возник вопрос, как наблюдаемые нами в предыдущей серии экспериментов при стимуляции агонистами TLR изменения на уровне мРНК PPAR, отражаются на уровне белка 83 и ДНК-связывающей активности ядерных рецепторов. Для ответа на этот вопрос мы провели следующую серию экспериментов. Клетки стимулировали различными агонистами TLR и через 4 часа определяли уровень мРНК, белка и ДНК-связывающей активности для PPARα, -β, -γ (Рис. 3.12). Данные по мРНК в этой серии совпадали с предыдущими (см. Рис. 3.12.в) и на Рис. 3.12 не представлены. Из Рис. 3.12.а,б, где представлены данные иммуноблоттинга, видно, что содержание белков PPARα, PPARγ падает, а содержание белка PPARβ растет. Далее мы сравнили ДНК-связывающую активность PPARα,β,γ в клетках стимулированных тремя агонистами TLR. Ядерная фракция белка выделялась из астроцитов после инкубирования клеток с агонистами в течении 4х часов как описано в материалах и методах. ДНК-связывающая активность высчитывалась по отношению к не стимулированным клеткам. На (Рис. 3.12.с,д) приведены данные для ДНК-связывающей активности (с) и удельной ДНК-связывающей активности (д), при измерении которой данные по активности PPAR нормализовали на данные об уровне экспрессии белка соответствующих изоформ PPARα, -β, -γ полученных методом иммуноблоттинга. Взятые для расчетов данные представлены на Рис. 3.12.а,б. Из представленных данных видно, что изменения ДНК-связывающей активности PPARα, -β, -γ коррелируют с изменениями на уровне экспрессии белков PPARα, -β, -γ. Расчет удельной ДНК-связывающей активности не показал значимых различий между TLRстимулированными и не обработанными астроцитами (Рис. 3.12.г). Полученные данные могут указывать на то, что значительных модификаций белков ядерных рецепторов, которые бы меняли их ДНКсвязывающую активность при стимуляции TLR не происходит. Изменения происходят в первую очередь на уровне регуляции экспрессии рецепторов. 84 Рис. 3.12. Сравнение влияния агонистов Толл-подобных рецепторов (TLR) на уровень белка PPARα, -β, -γ (а,б), активность (в) и удельную активность (г). Астроциты стимулировались 4 часа с агонистами Толл-подобных рецепторов: липополисахаридом (LPS, 100нг/мл, TLR4); пептидогликаном (PGN, 5 мкг/мл, TLR1/2) и флагеллином (FGL, 5 мкг/мл, TLR5). (а,б) концентрацию белка PPARα, -β, -γ определяли методом иммуноблоттинга, данные нормализовались на β-тубулин. Приведена типичная электрофореграмма и результаты денситометрии. Уровень белка в контрольных клетках принят за 1. (с) ДНК-связывающую активность измеряли как описано в материалах и методах. За 1 принята активность соответствующей изоформы PPAR в нестимулированных астроцитах. (д) удельная активность Считалась как A/Б, где А это значение активности данной изоформы PPAR, а Б - концентрация белка полученное методом иммуноблоттинга. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками. 85 3.3.2.Характеристика LPS-стимулированной экспрессии мРНК и белка PPARα, -β, -γ. Нами получено, что все агонисты действуют на PPAR схожим образом. Из них LPS является агонистом наиболее изученного рецептора семейства Толл в астроцитах – TLR4 [36,93]. Поэтому дальнейшее исследование мы проводили с использованием LPS. 3.3.2.1. Доказательство действия LPS через TLR4 на астроцитах. На первом этапе этой серии экспериментов мы показали наличие TLR4/LPS пути с использованием традиционных подходов – обработки клеток полимиксином Б и антагонистом TLR4 рецептора CLI-095. Полимиксин Б используют для нейтрализации эффекта LPS in vitro [195], поскольку он связывается с анионной частью LPS называемой липид А [196]. Мы оценили способность полимиксина блокировать эффекты LPS в исследуемых нами условиях. Для этого астроциты инкубировали с полимиксином Б (50 мкг/мл) и LPS (100 нг/мл) в течении 4 ч, и определяли уровень мРНК PPAR (Рис. 3.13.в). Получено, что полимиксин не влияет на экспрессию PPARα, -β, -γ, но эффективно снимает LPS-стимулированное изменение экспрессии всех трех изоформ PPAR (Рис. 3.13). Полученные данные показывают, что эффект LPS на экспрессию PPARα, -β, -γ специфично модулируется липополисахаридом. 86 Рис. 3.13. Влияние ингибитора TLR4 рецептора CLI-095 и агониста TLR4 полимиксина на LPS-стимулированный уровень экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ. Астроциты пред обрабатывали в течение 10 минут (а,б) CLI-095 (5 мкМ) и 5 минут (в) полимиксином (50 мкг/мл), с или без последующей обработкой клеток LPS (100 нг/мл) в течении 4 ч. Концентрацию TNFα определяли методом ИФА (см. Материалы и Методы). Уровень экспрессии мРНК PPARα (белые столбцы), PPARβ (серые столбцы) и PPARγ (черные столбцы) определяли методом ПЦР в реальном времени. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, все эксперименты проводили не менее трех раз. Уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках принят за 1. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p< 0,05 по сравнению с LPS- стимулированными клетками. 87 Для доказательства, что эффекты LPS реализуются через активацию TLR4, использовали селективный ингибитор этого рецептора CLI-095, блокирующий внутриклеточный домен TLR4 [46]. К астроцитам добавляли CLI-095 в концентрации 5 мкМ на 10 мин и затем стимулировали LPS (100 нг/мл) в течение 4 ч. Анализировали уровень выброса TNFα для контроля влияния воздействия ингибитора на выброс провоспалительного маркера (Рис. 3.13.а), а так же уровень мРНК PPARα, -β, -γ (Рис. 3.13.б). Из Рис. 4.13 видно, что добавление CLI-095 практически полностью снижает уровень LPS- стимулированного синтеза TNFα, и полностью снимает эффект LPS на уровень мРНК PPARα и PPARγ. Полученные нами данные показывают, что LPS реализует свой эффект через TLR4. 3.3.2.2. Влияние LPS на кинетику экспрессии PPARα, -β, -γ. Ответ на активацию Толл-подобных рецепторов это комплексный, динамически развивающийся процесс. Чтобы описать временную зависимость экспрессии PPARα, -β, -γ от стимуляции TLR4 в астроцитах мы измерили уровень экспрессии мРНК и белка PPARα, -β, -γ в заданные временные промежутки после стимуляции (Рис. 3.14) методом ПЦР в реальном времени и иммуноблоттингом соответственно. Значительное снижение (более чем в 3 раза) уровня мРНК для PPARα и PPARγ было отмечено уже на 2х часах после стимуляции клеток LPS (Рис. 3.14.а). Для PPARγ уровень мРНК не вернулся к уровню не-стимулированных клеток даже при 24ч инкубации (Рис. 3.14.а). Уровень мРНК PPARα к этому времени вернулся в норму. Для PPARβ же наоборот происходит постепенное увеличение уровня мРНК до 2,5 раз с максимумом на 4х часах, далее уровень мРНК PPARβ начинает снижаться и через 24 часа приходит к уровню экспрессии гена в необработанных клетках (Рис. 3.14.а). Изменения в уровне мРНК в целом коррелировало с изменениями в уровне белка. Мы наблюдали 2х-кратное снижение количества белка PPARα и PPARγ 88 при 4х часах инкубации после стимуляции клеток (Рис. 3.14.б,с). который не вернулся к исходному уровню после 24х часов инкубации (Рис. 3.14.с). Для PPARβ наблюдали сохранение повышенного уровня белка (Рис. 3.14.в), хотя экспрессия мРНК уже вернулась к исходному уровню. Это показывает, что регулирование PPARα и PPARγ при ответе клеток на активацию TLR имеет краткосрочную стадию (падение) и долгосрочную стадию (восстановление). Полученные данные показывают, что регуляция экспрессии PPAR тесно связана с системой клеточного ответа на активацию TLR4 рецептора. В дальнейшей работе мы сконцентрировались на краткосрочной стадии клеточного ответа, т.е. на точке 4ч после стимуляции LPS чтобы оценить вклад транскрипционных и пост-транскрипционных процессов в регуляцию PPARα, -β, -γ. 89 Рис. 3.14. Изменение уровня экспресии PPARα, PPARβ и PPARγ при стимуляции астроцитов LPS. (а) Астроциты стимулировали LPS (100 нг/мл) и через указанные промежутки времени уровень мРНК PPARα,β,γ определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. (б,в) Концентрацию белков трех изоформ PPAR определяли с помощью иммуноблоттинга. Приведена типичная элеткрофореграмма (б) и результаты денситометрии (в). Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p< 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. 90 3.3.3. Скорость распада мРНК PPARα, -β, -γ. замедляется при активации TLR4. Полученные нами данные, что PPAR меняются в процессе развития ответа на LPS, позволило выдвинуть предположение, что экспрессия этих генов может регулироваться на пост-транскрипционном уровне. В последнее время посттранскрипционная регуляция генов на уровне времени жизни мРНК вызывает большой интерес, поскольку показано, что многие гены, активно вовлеченные в про-воспалительные процессы меняют скорость деградации мРНК при действии на клетки про-воспалительных агентов [145]. Поэтому, мы провели серию экспериментов по определению изменения уровня экспрессии мРНК PPARα, PPARβ PPARγ в присутствии ингибитора транскрипции актиномицина Д. Известно, что после добавления актиномицина изменяется только уровень уже существующей мРНК, что позволяет определять время полужизни мРНК [197]. Мы сравнили стабильность мРНК в нативных и LPS-стимулированных клетках (Рис. 3.15). Для определения стабильности мРНК в LPS-стимулированных клетках мы добавляли к клеткам LPS на 1 ч, затем синтез новой мРНК блокировался с помощью актиномицина Д (5 мг/мл). Уровень мРНК PPARα, -β, γ до добавления актиномицина Д был взят за 100%. Время полужизни мРНК PPARα и PPARγ в не стимулированных клетках меньше одного часа: примерно 30 мин для PPARα (Рис. 3.15.а), 75 мин для PPARγ (Рис. 3.15.в) и 90 минут для PPARβ (Рис. 3.15.б). Для удобства отображения в астроцитах обработанных LPS уровень мРНК PPARα, -β, -γ был взят за 100% после 1ч инкубирования клеток с этим агонистом TLR4. Мы определили, что время полужизни мРНК PPARα и PPARγ в LPS- стимулированных клетках стало примерно 80 мин для PPARα, 90 мин для PPARγ и 130 минут для PPARβ (Рис. 3.15). Таким образом мы видим, что LPS замедляет деградацию мРНК для всех трех типов PPAR. Полученные результаты указывают, что снижение уровня мРНК PPARα и PPARγ и увеличение уровня мРНК PPARβ при обработке клеток LPS не может быть объяснено увеличением скорости деградации мРНК. 91 Рис. 3.15. Влияние ингибирования p38 MAPK и добавления LPS на скорость деградации мРНК PPARα, PPARβ и PPARγ. (а,б,в) Астроциты культивировали без дополнительных обработок (черная сплошная линия), с добавлением LPS (100 нг/мл) на 1 час (пунктирная линия) или совместно инкубировались с ингибитором p38 MAPK SB203580 (SB, 20 мкM) и липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл) (серая линия). Затем клетки обрабатывали актиномицином Д (5 мкг/мл). Через указанные промежутки времени образцы собирали и уровень экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ анализировали методом ПЦР в реальном времени. За 100% на графике принят уровень экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ для необработанных астроцитов, и уровень экспрессии после 1ч обработки LPS соответственно (г) приведена электрофореграмма определения количества фосфо-p38 белка после 30 минут обработки LPSстимулированных астроцитов ингибитором p38 MAPK. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p< 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. 92 Хотя о механизмах регуляции распада мРНК известно не так много (см. обзоры [146,194,198], нет сомнений, что p38 MAPK может играть важную роль в регуляции деградации мРНК для многих генов [199]. Ранее было показано, что LPS вызывает активацию p38 MAPK в астроцитах [200]. Мы так же показали, что ингибитор p38 MAPK снижает выброс воспалительных маркеров PGE2 и TNFα в астроцитах (рис.3.9) и влияет на экспрессию PPARβ (Рис.3.10), т.е. p38 может быть активным участником регуляции PPAR и на стадии деградации мРНК. Для проверки этого предположения мы измерили скорость деградации мРНК PPARα, -β, -γ в присутствии специфического ингибитора p38 MAPK SB203580 (Рис. 3.15). Получили, что в LPS-стимулированных клетках инкубирование астроцитов с SB 203580 снижает скорость деградации мРНК до скорости деградации в не обработанных клетках для PPARα (Рис. 3.15.а), PPARγ (Рис. 3.15.б) и PPARβ (Рис. 3.15.в). 3.3.4. Активация p38 и скорость деградации мРНК Чтобы подтвердить влияние именно активации p38 на время жизни мРНК исследуемых генов, мы оценили скорость деградации мРНК трех изоформ PPAR в присутствии активатора p38 MAPK анизомицина (Рис. 3.16). Мы использовали концентрацию анизомицина, для которой в литературе было показано отсутствие ингибирования белка [121,128]. Было получено, что добавление анизомицина стабилизирует мРНК всех трех изоформ PPAR. Если через 4ч после добавления актиномицина Д уровень мРНК PPARα снижался до 15%, PPARβ до 34%, а PPARγ до 17%, то прединкубирование клеток с анизомицином перед добавлением Актиномицина Д на 4 часа повышало уровень мРНК до 75%, 52% и 71% для PPARα, PPARβ и PPARγ соответственно. Кроме того эффект анизомицина на стабилизацию мРНК снимался добавлением селективного ингибитора p38 MAPK SB 203580. 93 Рис. 3.16. Стабилизация мРНК PPARα, -β, -γ анизомицином. Астроциты культивировались с добавление анизомицина (1 мкг/мл) в течении 1 часа, после чего инкубировались с ингибитором p38 MAPK SB (SB 203580, 20 мкM. Затем клетки обрабатывались актиномицином Д (5 мкг/мл). Уровень экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ анализировался методом ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p< 0,05 по сравнению с анизомицин-стимулированными клетками, ^p< 0,05. Таким образом, наши данные показывают вовлеченность p38 MAPK в регуляцию экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ в TLR-опосредованном ответе астроцитов на пост-транскрипционном уровне. 3.3.5. Модуляция экспрессии и активности PPARα, -β, -γ различными ингибиторами MAPK Было известно, что инкубирование астроцитов с LPS вызывает активацию MAPK и увеличение выброса воспалительных маркеров, прежде всего PGE2 и TNFα [6,201]. Специфические ингибиторы MAPK снижают концентрацию маркеров [6]. В последнее время ингибиторы MAPK предлагаются как возможные модуляторы воспаления и глиоза в мозгу [202,203]. Поэтому мы использовали ингибиторы, которые находятся на стадии клинического исследования, и характеризовали их эффект на воспалительный ответ в LPS94 стимулированных астроцитах. Были выбраны вещества SB203580, U0126, PD98059, SP600125, которые известны как селективные ингибиторы киназной активности p38, MEK1,2, ERK1/2, и JNK соответственно [204–207]. В наших экспериментальных условиях мы показали, что ингибиторы МАРК в используемых нами концентрациях снижают LPS-стимулируемый выброс PGE2 и TNFα в условиях гипергликемии и при нормальных концентрациях глюкозы (Рис. 3.9). Эти данные показали, что протестированные MAPK ингибиторы оказывают противовоспалительное действие в тестируемых нами концентрациях. В этих концентрациях ингибиторы использовали и для установления влияния на LPS-стимулируемую модуляцию экспрессии PPAR. Дизайн нашего эксперимента с используемыми агонистами, ингибиторами MAPK и измеряемыми параметрами представлен на схеме (Рис. 3.17). Рис. 3.17. Общая схема ингибиторов, используемых в работе для изучения TLRстимулированных сигнальных путей и измеряемые параметры. TLR-агонисты выделены жирным, антагонисты TLR выделены курсивом. MAPK-ингибиторы выделены курсивом и подчеркиванием. 95 Ранее на различных типах клеток было показано, что различные MAPK, такие как p38, JNK, MEK1/2, ERK играют важную роль в регуляции активности PPARα, -β, -γ [208–210]. В тоже время мало известно о роли MAPK в регуляции экспрессии PPARα, -β, -γ в ходе TLR-стимулированного клеточного ответа. Таким образом, мы решили проверить, как ингибиторы MAPK могут изменить активность и экспрессию PPARα, -β, -γ в астроцитах. Мы использовали ингибиторы SB 203580, SP600125, U0126, PD 98059 которые ингибитруют киназную активность p38, JNK, MEK1/2 и ERK MAPK соответственно [204– 207]. Астроциты прединкубировались 30 минут с тестируемым ингибитором, и затем клетки либо инкубировались без какой-либо обработки либо обрабатывались LPS в течении 4х часов. Уровень экспрессии мРНК PPARα, PPARβ и PPARγ измерялся с помощью ПЦР в реальном времени, уровень белка в клетках измерялся с методом иммуноблоттинга (Рис. 3.18.а,б; Рис. 3.18.а,б; Рис. 3.18.а,б). ДКН-связывающая активность определялась, как описано в материалах и методах, данные представлены на Рис. 3.18.в, Рис. 3.19.в. Так же для оценки возможного вклада MAPK ингибиторов в этот процесс мы сравнили результаты, при интерпретации которых ДНК-связывающая активность PPAR была нормализована на количество ядерного белка (Рис. 3.18.д,е, 3.19.д,е, 3.20.д,е), и данные были нормализованы на уровень белка соответствующей изоформы PPAR полученный с помощью иммуноблоттинга. 3.3.5.1. PPARα Ни один из исследуемых ингибиторов добавленный к наивным клеткам не повлиял на уровень экспрессии PPARα (Рис. 3.18.а белые столбцы). Так же ингибитор p38 MAPK не влияет на транскрипционную активность PPARα (Рис. 3.18.в), в то время как SP600125, ингибитор JNK увеличивает ДНКсвязывающую активность PPARα в 1,6 раза. Это позволяет предположить, что активность, но не экспрессия PPARα находится под негативным контролем JNK в астроцитах. 96 Рис. 3.18. Эффект p38, MEK1/2, ERK и JNK ингибиторов на экспрессию PPARα в наивных и LPSстимулированных клетках. Астроциты прединкубировали 1 час с ингибиторами MAPK сигнальных путей включающих p38 (SB203580, 20 μM), MEK1/2 (U0126, 10 μM), ERK1/2 (PD98059, 20 μM), JNK (SP600125, 10 μM) и затем культивировали 4 часа без дополнительных обработок (а,с) или в присутствии LPS (100нг/мл) (б,д). Уровень мРНК PPARβ (а,б – белые столбцы) определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Полученные значения нормализовали на уровень мРНК GAPDH. Уровень белка PPARβ (а,б – черные столбцы) определялись с помощью вестерн блотта и нормализовались на β-тубулин. Транскрипционная активность PPARβ (с,д) была определена через 0,5 часов (черные столбцы) и через 5 часов (белые столбцы) инкубации, как описано в материалах и методах. Экспрессия генов, белка и активность соответственно в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p< 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. 97 Стимуляция астроцитов LPS в течении 4х часов приводит к 2х-кратному снижению экспрессии мРНК PPARα, по сравнению с необработанными клетками (Рис. 3.18.б белые столбики), с пропорциональным снижением уровня белка (Рис. 3.18.б черные столбики). Этот эффект не снимается ингибированием p38, JNK, MEK1/2 или ERK. Так же протестированные ингибиторы не повлияли на ДНК-связывающую активность в LPS-стимулированных астроцитах. Другой важный вопрос, который следует из предыдущих исследований касательно изменения активности PPAR через изменение ДНК-связывающих свойств этих белков при фосфорилировании. [76]. Различная степень вовлеченности MAPK в регуляцию PPARα становится видна после сравнения удельной ДНКсвязывающей активности. В наивных клетках ингибитор p38 не влияет на относительный уровень ДНК-связывающей активность PPARα (Рис. 3.18.в), но в тоже время чувствителен к JNK ингибитору в обоих вариантах нормализации данных (Рис. 3.18.в,д). Добавление LPS влияет на уровень белка и таким образом на уровень удельной активности. При нормализации активности на уровень белка PPARα удельная активность в LPS-стимулированных клетках не меняется, однако добавление LPS усиливает чувствительность ДНК-связывающей активности к p38 и ERK ингибитору (Рис. 3.18.е). 3.3.5.2. PPARβ В не обработанных клетках нами наблюдалось небольшое увеличение экспрессии мРНК и белка при добавлении ингибитора p38 MAPK SB 203580 (Рис. 3.19.а). Ингибитор JNK SP600125 снижает экспрессию мРНК и белка в наивных клетках (Рис. 3.19.а). Стимуляция астроцитов LPS в течении 4х часов приводит к 2,5-кратному увеличению уровня мРНК PPARβ, по сравнению с необработанными клетками (Рис. 3.19.а). Инкубация клеток с ингибиторами MEK/ERK сигнальных путей (U0126 и PD98059) в не стимулированных LPS клетках не повлияла на экспрессию PPARβ как на уровне мРНК, так и на уровне белка. 98 Рис. 3.19. Эффект p38, MEK1/2, ERK и JNK ингибиторов на экспрессию PPARβ в наивных и LPSстимулированных клетках. Астроциты прединкубировали 1 час с ингибиторами MAPK сигнальных путей включающих p38 (SB203580, 20 μM), MEK1/2 (U0126, 10 μM), ERK1/2 (PD98059, 20 μM), JNK (SP600125, 10 μM) и затем культивировали 4 часа без дополнительных обработок (а,с) или в присутствии LPS (100нг/мл) (б,д). Уровень мРНК PPARβ (а,б – белые столбцы) определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Полученные значения нормализовали на уровень мРНК GAPDH. Уровень белка PPARβ (а,б – черные столбцы) определялись с помощью вестерн блотта и нормализовались на β-тубулин. Транскрипционная активность PPARβ (с,д) была определена через 0,5 часов (черные столбцы) и через 5 часов (белые столбцы) инкубации, как описано в материалах и методах. Экспрессия генов, белка и активность соответственно в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p< 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. 99 Было обнаружено, что астроциты культивируемые без добавления LPS и в его присутствии имеют разную чувствительность к ингибиторам MAPK. Ингибитор p38 MAPK SB203580 усиливает этот эффект приводя к 3,5-кратному увеличению уровня экспрессии PPARβ (Рис. 3.19.б). При этом, все остальные исследованные ингибиторы снижали эффект LPS на уровень экспрессии PPARβ (Рис. 3.19.б). Инкубация клеток с ингибиторами MEK/ERK сигнальных путей (U0126 и PD98059) или с ингибитором JNK пути (SP600125) снижает эффект LPS практически до уровня не стимулированных клеток, при этом в исследуемых концентрациях ингибитор ERK MAPK U0126 оказывается наиболее эффективным (Рис. 3.19.б). Эти изменения коррелируются с уровнем белка (черные столбцы Рис. 3.19.б). Полученные данные показывают, что LPSстимулированная экспрессия PPARβ чувствительна ко всем MAPK сигнальным путям. Мы исследовали влияние ингибиторов на ДНК-связывающую активность PPARβ (Рис. 3.19.в,г,д,е). Все исследуемые ингибиторы увеличивают активность PPARβ в 2-3 раза после 5 часов обработки (Рис. 3.19.в). С другой стороны мы получили, что ни один из исследованных MAPK ингибиторов не влияет на LPSстимулированный рост PPARβ ДНК-связывающей активности (Рис. 3.19.г). Уровень PPARβ активности в наивных клетках культивируемых с MAPK ингибиторами сравним с уровнем активности PPARβ при обработке клеток LPS (Рис. 3.19.г). После анализа удельной активности видно, что в не зависимости от варианта обработки, ДНК-связывающая активность PPARβ увеличивается при всех типах обработок (Рис. 3.19.д), в тоже время стимулияция астроцитов LPS усиливает чуствительность ДНК-связывающей активности только к ингибированию MEK1/2 MAPK (Рис. 3.19.е). 3.3.5.3. PPARγ Ингибитор p38 MAPK добавленный к наивным астроцитам проявляет не выраженный, но схожий со стимуляцией LPS эффект и снижает экспрессию 100 мРНК и белка для PPARγ (Рис. 3.20.а). Обработка клеток ингибиторами ERK (PD 98059), MEK1/2 (U0126) и JNK (SP600125), путей увеличивает уровень мРНК и белка для PPARγ (Рис. 3.20.а) в не стимулированных клетках. В тоже время добавление ингибитора p38 (SB 203580) незначительно снижает уровень мРНК и белка PPARγ. Стимуляция астроцитов с LPS в течении 4х часов приводит к 2-х кратному снижению экспрессии мРНК PPARγ, что коррелирует со снижением уровнем белка (Рис. 3.20.б). Предварительная обработка LPS-стимулированных клеток ингибитором ERK (PD 98059) снижает эффект LPS на экспрессию мРНК PPARγ. В тоже время добавление ингибитора JNK (SP600125) полностью снимает эффект LPS на уровень экспрессии PPARγ (Рис. 3.20.б). Оба ингибитора и p38 и JNK MAPK снижают активность PPARγ по сравнению с клетками, обработанными LPS (Рис. 3.20.г), в то время как в не стимулированных клетках небольшое увеличение активности происходило только при добавлении ингибитора JNK MAPK (Рис. 3.20.в). Так как уровень белка PPARγ снижается в присутствии ингибитора p38 (Рис. 3.20.а), при нормализации на общий уровень ядерного белка этого не было заметно, но привело к значительному повышению удельной активности при нормализации на уровень белка PPARγ (Рис. 3.20.д). Для PPARγ добавление LPS усиливает чувствительность ДНК-связывающей активности к JNK-ингибитору, и не влияет на чувствительность к остальным тестируемым ингибиторам. 101 Рис. 3.20. Эффект p38, MEK1/2, ERK и JNK ингибиторов на экспрессию PPARγ в наивных и LPSстимулированных клетках. Астроциты прединкубировали 1 час с ингибиторами MAPK сигнальных путей включающих p38 (SB203580, 20 μM), MEK1/2 (U0126, 10 μM), ERK1/2 (PD98059, 20 μM), JNK (SP600125, 10 μM) и затем культивировали 4 часа без дополнительных обработок (а,с) или в присутствии LPS (100нг/мл) (б,д). Уровень мРНК PPARγ (а,б – белые столбцы) определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Полученные значения нормализовали на уровень мРНК GAPDH. Уровень белка PPARγ (а,б – черные столбцы) определялись с помощью вестерн блотта и нормализовались на β-тубулин. Транскрипционная активность PPARβ (с,д) была определена через 0,5 часов (черные столбцы) и через 5 часов (белые столбцы) инкубации, как описано в материалах и методах. Экспрессия генов, белка и активность соответственно в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p< 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. 102 Таким образом, мы видим, что ингибиторы могут изменять баланс между включением PPARα, -β, -γ. в регуляцию генной экспрессии с помощью механизма трансрепрессии (где играет важную роль количество белка) или через ДНК-связывающую активность (где важна способность белка связывать соответствующий сайт в промоторах генов). Собранные вместе полученные нами данные показывают, что возможно модулировать ядерные рецепторы PPAR с помощью MAPK ингибиторов раздельно, как на уровне экспрессии, так и ДНК-связывающей активности. Кроме того, используя различные MAPK ингибиторы возможно изменить баланс между тремя изотипами PPAR, важной триадой рецепторов регулирующей различные функции астроцитов. 3.3.6. Роль p38 в регуляции экспрессии PPARα, -β, -γ. Из литературных источников известно, что добавление агониста TLR4 рецептора LPS приводит к активации различных митоген активируемых протеинкиназ. Поскольку нами были получены значимые результаты по влиянию p38 MAPK на экспрессию и активность трех изоформ PPAR мы решили оценить влияние активации p38 MAPK на экспрессию всех трех изоформ PPAR, а так же проверить действительно ли добавление SB203580 блокирует p38. Для этого мы инкубировали астроциты с анизомицином – известным активатором p38 MAPK. Нами было получено, что добавление анизомицина вызывает эффект супериндукции, схожий с эффектом циклогексимида. При этом этот эффект снимается ингибированием p38 MAPK для PPARα и для PPARγ, но не для PPARβ (Рис.3.21). 103 Рис. 3.21. Влияние активации p38 MAPK на экспрессию PPARα, -β, -γ. Астроциты инкубировали 4ч с ингибитором белкового синтеза анизомицином (1 мкг/мл) с или без предварительной обработкой ингибитором MAPK p38 (SB 203580, 20 мкМ) в течении 1ч. Уровень экспрессии мРНК PPARα (белые столбцы), PPARβ (серые столбцы) и PPARγ (черные столбцы) определяли методом ПЦР в реальном времени. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, все эксперименты проводили не менее трех раз. Уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках принят за 1. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, # p < 0,05 по сравнению с клетками стимулированными анизомицином. 3.3.7. Роль циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ. Известно, что некоторые гены, такие как СОХ-2 или ИЛ-6, чья экспрессия активируется в ответ на воспалительный стимул, регулируется через механизм называемый «супериндукция» [211,212]. Это процесс, при котором экспрессия некоторых генов резко возрастает в присутствии циклогексимида – ингибитора белкового синтеза [113]. Схожесть всех 3х изоформ PPAR как изобелков, и их взаимосвязь с COX-2 позволила нам предположить что исследуемые нами белки так же могут регулироваться через механизм супериндукции. Для определения как механизм LPS-стимулированной экспрессии PPARα, -β, -γ зависит от de novo синтезирующегося белка, мы добавляли циклогексимид в концентрации 5 мкг/мл к необработанным и LPS-стимулированным клеткам (Рис. 3.22). 104 Рис. 3.22. Модулирование циклогексимид-стимулированной экспрессии мРНК PPARα, β, -γ LPS и MAPK-ингибиторами. (а) Астроциты обрабатывали 0,5ч ингибиторами MAPK p38 (SB 203580, 20 мкМ), JNK (SP600125, 10 мкМ) и Bay 11-7085 (5 мкМ), ингибитором NF-κB или в течении 1ч LPS (100 нг/мл) и затем инкубировали 4ч с ингибитором белкового синтеза циклогексимидом (5 мкг/мл). Уровень экспрессии мРНК PPARα (белые столбцы), PPARβ (серые столбцы) и PPARγ (черные столбцы) определяли методом ПЦР в реальном времени. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, все эксперименты проводили не менее трех раз. Уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках принят за 1. (б) общая схема иллюстрирующая эффект ингибирования MAPK *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, # p < 0,05 по сравнению с клетками стимулированными только циклогексимидом 105 Мы показали, что добавление циклогексимида вызывает 5-кратное увеличение экспрессии PPARα, 6-кратное увеличение экспрессии PPARβ и 3кратное увеличение экспрессии PPARγ (Рис. 3.22). По данным различных работ [125,127,129,212] MAPK каскад и NF-κB это основные сигнальные пути ответственные за механизм регуляции супериндукции. Мы проверили вовлеченность MAPK используя ингибиторы SB203580 (ингибитор p38 MAPK), SP600125 (ингибитор JNK MAPK) и вовлеченность NF-κB используя ингибитор этого транскрипционного фактора Bay 11-7085. Экспрессия PPARα была снижена в присутствии ингибиторов p38 и NF-κB. На изоформу PPARβ оказывало влияние только ингибирование p38 MAPK. В тоже время транскрипционный фактор PPARγ был чувствителен только к JNKингибитору, который усиливал эффект циклогексимида. Несмотря на сходство изоформ PPAR по всей видимости регуляция этих изоформ при активации их экспрессии циклогексимидом идет по разным механизмам. Для всех исследуемых белков добавление LPS (активатора NF-κB) снижало эффект циклогексимида. В тоже время полученные данные для PPARα показывают более сложный механизм регуляции - и Bay 11-7085, ингибитор NF-κB и LPSактиватор NF-κB снимают эффект циклогексимида (Рис. 3.22). Полученные нами данные показывают, что для всех 3х изоформ PPAR реализуется механизм «супериндукции», при этом добавление липополисахарида к клеткам, стимулированным циклогексимидом, снижает уровень экспрессии мРНК по сравнению с циклогексимид-стимулированными клетками как для PPARα и PPARγ где добавление LPS к наивным клеткам снижает уровень мРНК, так и для PPARβ, где в клетках не стимулированных циклогексимидом наблюдается увеличение уровня мРНК этого гена. Эти данные позволяют нам предполагать, что в системе регуляции экспрессии PPAR существует неизвестный лабильный белок – супрессор экспрессии всех 3х изотипов PPAR, при этом, несмотря на то, что все 3 исследуемых белка относятся к одному суперсемейству, регуляция механизма 106 супериндукции происходит у них по разным механизмам. Для PPARα ключевыми факторами являются p38 и NF-κB. Для PPARβ p38, для PPARγ это JNK. 3.3.8. Регуляция СОХ-2 в астроцитах при стимуляции TLR СОХ-2 является индуцируемым белком, синтез которого как на уровне мРНК, так и на уровне белка активно увеличивается при различных воспалительных процессах. Экспрессия СОХ-2 регулируется через NF-κB зависимый путь, показана тесная взаимосвязь этого фермента с системой PPAR (как PPAR-зависимый ген и источник лигандов для этих ядерных рецепторов) [95,213]. Поэтому мы выбрали этот ген для параллельной характеристики процесса активации системы врожденного иммунитета при всех клеточных обработках, в которых исследовали PPARα, PPARγ, PPARβ. В процессе нашей работы вышло подробное исследование на астроцитах, в котором было показано, что активация TLR4 приводит к увеличению экспрессии мРНК и белка СОХ-2 [6]. Однако данных о влиянии других агонистов Толлподобных рецепторов на астроцитах на экспрессию СОХ-2 в литературе не встречалось. Отсутствовали сведения о других обработках, используемых в наших сериях экспериментов (см. разделы 3.3.1-8). 3.3.8.1. TLR-агонисты усиливают уровень экспрессии COX-2 Мы сравнили эффект липополисахарида (LPS, 100нг/мл), пептидогликана (PGN, 5 мкг/мл), флагеллина (FGL, 5 мкг/мл), являющихся агонистами TLR5, TLR2 и TLR5 соответственно, а так же АТФ (50 нМ) и тромбина (1 мкг/мл) на экспрессию СОХ-2. Измерение уровня мРНК с помощью ПЦР в реальном времени показало, что при инкубировании астроцитов со всеми исследуемыми стимулами происходит значительное увеличение экспрессии мРНК COX-2 (Рис. 3.23). Полученные данные показывают, что агонисты разных типов рецепторов, как TLR, так и АТФ с тромбиновыми рецепторами увеличивают на экспрессию СОХ-2 107 Рис. 3.23. Влияние агонистов TLR4 (LPS), TLR1/2 (PGN), TLR5 (FGL), ATP и тромбина (THR) на экспрессию мРНК COX-2. Астроциты стимулировались 4 часа с агонистами Толл-подобных рецепторов: липополисахаридом (LPS, 100нг/мл, TLR4); пептидогликаном (PGN, 5 мкг/мл, TLR1/2) и флагеллином (FGL, 5 мкг/мл, TLR5), АТФ (50нМ) и тромбином (1мкг/мл). определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках принят за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками – 3.3.8.2. Специфичность действия LPS -TLR4 для регуляции экспрессии СОХ-2 гена Ранее мы уже показали влияние ингибитора TLR4 CLI-095 на LPSстимулированный синтез TNFα и экспрессию трех изоформ PPAR (Рис. 3.13). На этом этапе мы подтвердили, что и LPS-стимулированное увеличение экспрессии СОХ-2 реализуется через TLR4. Для этого астроциты культивировались с ингибитором TLR4 CLI-095 [46]. Клетки подвергли воздействию CLI-095 в концентрации 1 мг/мл в течение 10 мин и затем стимулировали LPS (100 нг/мл) в течение 4 часов. После этого анализировалось изменение уровня мРНК СОХ-2 (Рис. 3.24.а), и изменение уровня белка (Рис. 3.24.б,в). Было получено, что добавление к астроцитам CLI-095 полностью снимает эффект LPS на уровень как мРНК, так и белка COX-2 (Рис. 3.24). Полученные нами данные показывают, что и для экспрессии СОХ-2 LPS реализует свой эффект через TLR4. 108 Рис. 3.24. Влияние CLI-095 - антагониста Толл-подобного рецептора 4, на LPSстимулированный синтез мРНК (а) и белка (б,в) СОХ-2. Антагонист TLR4 CLI-095 добавлялся за 10 минут до 4х-часовой стимуляции астроцитов LPS (100нг/мл). (а) Уровень экспрессии мРНК COX-2 определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках принят за 1. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, # p < 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. (б,в) Количество белка СОХ-2 определяли с помощью иммуноблоттинга. Приведена типичная электрофореграмма (б) и результаты денситометрии (в). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, все эксперименты проводили не менее трех раз. 109 3.3.8.3. Влияние LPS на кинетику экспрессии мРНК СОХ-2 в астроцитах. Ответ на активацию Толл-подобных рецепторов это комплексный, динамически развивающийся процесс, зачастую имеющий разные механизмы регуляции на разных стадиях клеточного ответа. Чтобы описать временную зависимость экспрессии COX-2 после стимуляции TLR4 в астроцитах мы измерили уровень экспрессии мРНК этого гена в заданные временные промежутки после стимуляции (Рис. 3.25, а) методом ПЦР в реальном времени. Мы наблюдали резкое увеличение уровня мРНК до 40 раз с максимумом на 2х часах, далее уровень мРНК COX-2 начинает резко снижаться и уже через 12 часа приходит к уровню экспрессии гена в необработанных клетках (Рис. 3.25.а). Далее мы измерили, как добавление LPS влияет стабильность мРНК СОХ-2. В отличие от всех трех изоформ PPAR, где добавление LPS вызывало стабилизацию мРНК, для СОХ-2 наблюдается обратный эффект, при которм время жизни мРНК снижается практически в два раза с 50±5 минут в не обработанных клетках до 25±5 минут при обработке астроцитов LPS (Рис. 3.25.б). Кроме того стабилизация мРНК зависит от активации JNK и p38 MAPK. И хотя в не обработанных клетках добавление SB 203580 не влияло на стабилизацию мРНК СОХ-2, при инкубировании астроцитов с анизомицином – активатором p38 мы наблюдали стабилизацию мРНК, при чем этот эффект снимался при добавлении SB 203580. Это согласуется с литературными данными, где показано, что p38 играет важную роль в стабилизации мРНК СОХ2 на клеточной линии HeLa [214]. Так же мы показали, что, как и в случае с тремя изоформами PPAR LPS влияет на экспрессию COX-2 через NF-κB зависимый путь (Рис. 3.25.в). Полученные данные показывают, что регуляция экспрессии COX-2 тесно связана с системой клеточного ответа на активацию TLR4 рецептора. В дальнейшей работе мы сконцентрировались на на краткосрочной стадии клеточного ответа, т.е. на точке 4 ч после стимуляции LPS чтобы оценить вклад транскрипционных и пост-транскрипционных процессов в регуляцию COX-2 и 110 сравнить ее с регуляцией трех изоформ PPAR. Кроме того стабильность мРНК COX-2 снижается при обработке LPS в отличии от PPAR, хотя и в этом случае активация p38 стабилизирует мРНК. Рис. 3.25. Характеристика LPS-стимулированной экспрессии СОХ-2. Астроциты стимулировали LPS (100 нг/мл) в течении 2,4,6,12 и 24 часов. (а) Через указанные промежутки времени образцы собирались и анализировались. (б) Астроциты обрабатывались актиномицином Д (5 мкг/мл) с пред-стимуляцией LPS или без нее Через указанные промежутки времени образцы собирались и анализировались. (в) Астроциты стимулировались 4 часа с агонистом Толл-подобного рецептора 4 липополисахаридом (LPS, 100нг/мл, TLR4) с или без добавлением Bay 11-7085 (Bay, 5 мкМ) ингибитора NF-κB. (г) Астроциты обрабатывались актиномицином Д с пред-стимуляцией анизомицином или без нее и добавлением ингибитора p38 (SB 203580). Уровень экспрессии мРНК СОХ-2 во всех экспериментах определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках принят за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками. 111 3.3.8.4. Модуляция экспрессии СОХ-2 через МАРК-зависимый путь Известно, что MAPK участвуют в регуляции LPS-стимулированного ответа [215], и могут влиять на экспрессию СОХ-2 [216]. Поэтому мы решили изучить действие специфических ингибиторов MAPK сигнального пути на LPSстимулированную экспрессию СОХ-2 в астроцитах. Стимулированная LPS экспрессия СОХ-2 снижалась при ингибировании p38 и JNK MAPK (Рис.3.26). Рис. 3.26. Эффект p38, MEK1/2, ERK и JNK ингибиторов на экспрессию COX-2 в LPSстимулированных клетках. Астроциты прединкубировали 1 час с ингибиторами MAPK сигнальных путей включающих p38 (SB203580, 20 μM), MEK1/2 (U0126, 10 μM), ERK1/2 (PD98059, 20 μM), JNK (SP600125, 10 μM) и затем культивировали 4 часа в присутствии LPS (100 нг/мл). Уровень мРНК COX-2 определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Полученные значения нормализовали на уровень мРНК GAPDH. Экспрессия генов, белка и активность соответственно в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #p< 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. 112 Полученные данные показывают, что экспрессия СОХ-2 реализуется через NFκB зависимый механизм. Кроме того p38 и JNK MAPK участвуют в регуляции экспрессии этого гена. 3.3.8.5. Роль p38 и циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК COX-2. Рис. 3.27. Участие NF-κB и MAPK в регуляции супериндукции COX-2. Астроциты прединкубировались 1 час с ингибиторами MAPK p38 (SB203580, 20 мкМ), JNK (SP600125, 10 мкМ) и Bay 11-7085 (5 μM), ингибитором NF-κB, и затем инкубировались в течении 4х часов с ингибитором белкового синтеза циклогексимидом (5 мкг/мл) или анизомицином (1 мкг/мл). Уровень экспрессии мРНК СОХ-2 во всех экспериментах определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках принят за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. *p < 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками. #p<0,05. Аббревиатуры: CHX, циклогексимид. Полученные нами данные показывают, что для СОХ-2 в астроцитах так же наблюдается эффект супериндукции. При этом сверхэкспрессия гена наблюдается как при добавлении циклогексимида, так и при добавлении анизомицина. Эффект циклогексимида снимается при ингибировании NF-κB, а 113 ингибирование p38 снимает эффект и анизомицина и циклогексимида (Рис.3.27). Таким образом эффект суперэкспрессии COX-2 регулируется прежде всего через p38 MAPK и NF-κB. Собранные вместе, эти данные демонстрируют ключевую роль COX-2 в синтезе простаноидов после стимуляции астроцитов LPS. Астроциты реагируют на про-воспалительные молекулы сильным выбросом PGE2, что может вызывать эффект на близлежащие микрососуды мозга и модулирует мозговое кровообращение при воспалениях 3.3.9. Обобщенная схема регуляции изоформ PPAR в LPS-стимулированных астроцитах. Полученные нами данные позволили предположить обощенную схему влияния MAPK и регуляции трех изоформ PPAR в астроцитах при стимуляции клеток LPS (Рис.3.28). Схема отображает важную роль фактора транскрипции NF-κB в регуляции экспрессии мРНК всех трех изоформ PPAR. Было известно, что активация TLR сопровождается активацией каскада MAPK, а это, в свою очередь, влияет на активность разных изоформ PPAR [76]. Наши результаты показывают, что MAPK-опосредованные изменения в активности PPAR это более сложный процесс, включающий в себя различные механизмы в ходе клеточного ответа на активацию TLR (Рис.3.28). Наши данные свидетельствуют о новом возможном аспекте применения MAPK ингибиторов. Действительно, при изучении взаимосвязи МАРК/PPAR большинство исследований концентрируются на регуляции ДНК- и лигандсвязывающей активности, поскольку сами PPAR принадлежат к семейству фосфобелков [76]. Предполагается, что ингибирование транскрипционной активности ядерных рецепторов при фосфорилировании это один из ключевых способов «выключения» лиганд-связанной активности [217]. Межклеточные сигналы активирующие внутриклеточные сигнальные пути и каскады фосфорилирования могут влиять на процессы деградации PPARγ [218]. В 114 большинстве случаев фосфорилирование PPARα вызванное стимулами ассоциируется с повышением транскрипционной активности [219,220]. В работах in vitro p38 MAPK фосфорилирует A/B домен PPARα. Это приводит к повышению лиганд-зависимой транскрипционной активности в кардиомицитах [220]. Нами получено, что активность PPARα находится под негативным контролем JNK в не обработанных астроцитах, так же как ингибирование p38 приводит к увеличению активности PPARγ. Что примечательно, этот механизм регуляции не применяется при активации клеток LPS, так и никакие из исследуемых ингибиторов MAPK не влияют на LPS-стимулированное снижение экспресси мРНК PPARα и ДНК-связывающую активность. С другой стороны, регуляция PPARγ ингибитором JNK снимает подавление экспрессии этой изоформы PPAR вызванное добавлением LPS. PPARβ при этом активируется при всех исследуемых обработках. Схема на Рис. 4.28. показывает, что, не смотря на схожесть изотипов PPAR мРНК PPARβ модулируется всеми предполагаемыми MAPK, Все три изоформы регулируются p38 на уровне деградации мРНК, а мРНК PPARγ находится под контролем JNK и ERK каскадов MAPK. Эти результаты могут представлять интерес при комбинированном применении синтетических агонистов PPAR и ингибиторов MAPK. Например, сочетание росиглитазона и JNK ингибитора может свести к минимуму снижение экспрессии PPARγ и усилить противовоспалительное действие агонистов PPARγ. Такие подходы позволяют снизить действующие концентрации лекарственных средств и уменьшить их токсические воздействия. Полученные результаты позволяют детализировать механизмы регуляции транскрипционных факторов PPAR при активации системы врожденного иммунитета. Активация данных ферментов является одним из ключевых компонентов в развитии целого ряда нейродегенеративных заболеваний и заболеваний с нарушением метаболических процессов (альцгеймер, паркинсон, диабет, ожирение и т.д.). Результаты данной работы могут быть применены для разработки эффективной целевой терапии этих заболеваний. 115 Таким образом, используемый нами подход позволил получить новые результаты, из которых хотелось бы отметить следующее. В работе впервые было показано влияние агонистов ТЛР2 и ТЛР5 на активацию всех трех изоформ PPAR. Полученные данные показывают, что агонисты разных типов TLR играет важную роль в регуляции экспрессии всех трех изоформ PPAR в астроцитах. Проведено сравнение кинетики экспрессии рецепторов PPARα, -β, -γ и классического маркѐра воспаления гена COX-2. Сравнение показало, что в экспрессии PPARβ так же как и экспрессии СОХ-2 есть схожие элементы. Оба гена имеют фазу индукции и разрешения воспалительного ответа. В то время как кинетика экспрессии PPARα и PPARγ проходит стадии падения и возвращения к исходному уровню. Полученные данные показывают, что регуляция экспрессии PPARα, -β, -γ тесно связана с системой клеточного ответа на активацию TLR4 рецептора. Впервые была показано, что экспрессия и активность 3х изоформ PPAR регулируются через различные механизмы. Показано участие MAPK каскада в регуляции и зависимость этих процессов от времени. Изучение влияние ингибирования белкового синтеза показало наличие эффекта «супериндукции» генов для всех 3х изоформ PPAR. Изучение этого эффекта в клетках без/с активацией системы врожденного иммунитета позволяет нам предполагать, что в системе регуляции экспрессии PPAR существует неизвестный лабильный белок – супрессор экспресси всех 3х изоформ PPAR, при этом действие этого белка различно в не обработанных и LPSстимулированных клетках. Такой подход позволил построить общую схему регуляции PPAR с учетом регуляции на направленного пост-транскрипционном управления процессом уровне с и оценить возможность использованием ингибиторов митогенактивированных протеинкиназ (MAPK). Собранные вместе полученные нами данные показывают, что возможно модулировать ядерные рецепторы PPAR с помощью MAPK ингибиторов раздельно, как на уровне экспрессии, так и ДНК-связывающей активности. Кроме того, используя различные MAPK 116 ингибиторы возможно изменить баланс между тремя изотипами PPAR, важной триадой рецепторов регулирующей различные функции астроцитов. Рис. 3.28. Схема регуляции мРНК изформ PPAR в LPS-стимулированных астроцитах. На схеме – активирующее, - ингибирующее влияние, ---> - стабилизация мРНК 117 4. ВЫВОДЫ 1 . Показано, что адаптация клеток к гипергликемии приводит к увеличению выброса провоспалительных маркеров PGE2 и TNFα и меняет чувствительность клеток к действию агонистов TLR на клеточной линии HeLa и первичных астроцитах крысы. 2. Выявлено, что адаптация астроцитов к гипергликемии не влияет на ДНКсвязывающую активность ядерных рецепторов PPAR, однако меняет уровень экспрессии PPARα, PPARβ и PPARγ на уровне мРНК и белка. 3. Впервые показано, что при стимуляции TLR4 на астроцитах происходит стабилизации мРНК PPARα, PPARβ и PPARγ . Установлено, что этот процесс зависит от активации p38 МАРК. 4. Показано, что экспрессия мРНК PPARα, PPARβ и PPARγ при стимуляции системы врожденного иммунитета увеличивается в присутствии ингибиторов белкового синтеза, т.е. регулируется через механизм «супериндукции», характерный для других генов, участвующих в воспалительных ответах. 5. Охарактеризована вовлеченность в регуляцию экспрессии PPARα, PPARβ и PPARγ ингибиторов p38, JNK, ERK и MEK1/2 MAPK, фактора транскрипции NF-κB. 5. Построена обобщенная схема регуляции экспрессии PPARα, PPARβ и PPARγ при активации толл-подобных рецепторов системы врожденного иммунитета на первичных астроцитах крысы в условиях клеточной гипергликемии. 118 5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Kumar H., Kawai T., Akira S. Pathogen recognition by the innate immune system. // Int. Rev. Immunol. 2011. Vol. 30. P. 16–34. 2. Kawai T., Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. // Nat. Immunol. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 11, № 5. P. 373–384. 3. Mudaliar S. New frontiers in the management of type 2 diabetes. // Indian J. Med. Res. 2007. Vol. 125, № 3. P. 275–296. 4. Libby P. Inflammatory Mechanisms : The Molecular Basis of Inflammation and Disease. 2007. Vol. 2007, № December. 5. Serhan C.N., Savill J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end // Nat Immunol. 2005. Vol. 6, № 12. P. 1191–1197. 6. Font-Nieves M., Sans-Fons M.G., Gorina R., Bonfill-Teixidor E., Salas-Perdomo A., Marquez-Kisinousky L., Santalucia T., Planas A.M., Salas-Pérdomo A., Márquez-Kisinousky L., Font-Nieves M Gorina R, Bonfill-Teixidor E, SalasPérdomo A, Márquez-Kisinousky L, Santalucia T, Planas AM. S.-F.M.G. Induction of COX-2 enzyme and down-regulation of COX-1 expression by lipopolysaccharide (LPS) control prostaglandin E2 production in astrocytes. // J Biol Chem. 2012 Jan 4. 2012. Vol. 287, № 9. P. 6454–6468. 7. Lehnardt S. Innate immunity and neuroinflammation in the CNS: the role of microglia in Toll-like receptor-mediated neuronal injury. // Glia. 2010. Vol. 58, № 3. P. 253–263. 8. Serhan C.N. Systems approach to inflammation resolution : identification of novel anti-inflammatory and pro-resolving mediators // J Thromb Haemost. 2009. Vol. 7, № 1. P. 44–48. 9. Nathan C., Ding A. Nonresolving Inflammation // Cell. 2010. Vol. 140. P. 871–882. 10. Lucas S.-M., Rothwell N.J., Gibson R.M. The role of inflammation in CNS injury and disease. // Br. J. Pharmacol. 2006. Vol. 147 Suppl . P. S232–S240. 11. Pedras-Vasconcelos J., Puig M., Verthelyi D. TLRs as therapeutic targets in CNS inflammation and infection // Front Biosci (Elite Ed). 2009/06/02 ed. 2009. Vol. 1. P. 476–487. 12. Van Noort J.M., Bsibsi M. Toll-like receptors in the CNS: implications for neurodegeneration and repair // Prog Brain Res. 2009/08/08 ed. / ed. Joost Verhaagen E.M.H.I.H.J.W.A.B.B.G.J.B., Dick F.S. Elsevier, 2009. Vol. 175, № 09. P. 139–148. 13. Bastard J.P., Maachi M., Lagathu C., Kim M.J., Caron M., Vidal H., Capeau J., Feve B. Recent advances in the relationship between obesity, inflammation, and insulin resistance // Eur Cytokine Netw. 2006. Vol. 17. P. 4–12. 14. Bensinger S.J., Tontonoz P. Integration of metabolism and inflammation by lipid-activated nuclear receptors // Nature. 2008/07/25 ed. 2008. Vol. 454, № 7203. P. 470–477. 119 15. Davis J.E., Gabler N.K., Walker-Daniels J., Spurlock M.E. Tlr-4 deficiency selectively protects against obesity induced by diets high in saturated fat. // Obesity (Silver Spring). 2008. Vol. 16. P. 1248–1255. 16. Huang S., Rutkowsky J.M., Snodgrass R.G., Ono-Moore K.D., Schneider D.A., Newman J.W., Adams S.H., Hwang D.H. Saturated fatty acids activate TLRmediated proinflammatory signaling pathways // J. Lipid Res. 2012. Vol. 53. P. 2002–2013. 17. Levin B.E., Dunn-Meynell A. a, Routh V.H. CNS sensing and regulation of peripheral glucose levels. // Int. Rev. Neurobiol. 2002. Vol. 51. P. 219–258. 18. Wang J., Li G., Wang Z., Zhang X., Yao L., Wang F., Liu S., Yin J., Ling E., Wang L., Hao a. High glucose-induced expression of inflammatory cytokines and reactive oxygen species in cultured astrocytes. // Neuroscience. 2012. Vol. 202. P. 58–68. 19. McCall A.L. Diabetes mellitus and the central nervous system. // Int. Rev. Neurobiol. 2002. Vol. 51. P. 415–453. 20. Reagan L.P. Glucose, stress, and hippocampal neuronal vulnerability. // Int. Rev. Neurobiol. 2002. Vol. 51. P. 289–324. 21. Sarac K., Akinci A., Alkan A., Aslan M., Baysal T., Özcan C. Brain metabolite changes on proton magnetic resonance spectroscopy in children with poorly controlled type 1 diabetes mellitus // Neuroradiology. 2005. Vol. 47. P. 562–565. 22. Northam E.A., Rankins D., Lin A., Wellard R.M., Pell G.S., Finch S.J., Werther G.A., Cameron F.J. Central Nervous System Function in Youth With Type 1 Diabetes 12 Years After Disease Onset // Diabetes Care. 2009. Vol. 32. P. 445–450. 23. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity // Int Immunol. 2005. Vol. 17. P. 1–14. 24. Kawai T., Akira S. TLR signaling. // Cell Death Differ. 2006. Vol. 13, № 5. P. 816–825. 25. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Janeway C.A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. 1997. Vol. 388. P. 394–397. 26. Poltorak A., Ricciardi-Castagnoli P., Citterio S., Beutler B. Physical contact between lipopolysaccharide and toll-like receptor 4 revealed by genetic complementation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. Vol. 97. P. 2163–2167. 27. Bode J.G., Ehlting C., Häussinger D. The macrophage response towards LPS and its control through the p38 MAPK-STAT3 axis // Cell. Signal. 2012. Vol. 24. P. 1185–1194. 28. O’Neill L.A.J., Dinarello C.A. The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily: Crucial receptors for inflammation and host defense // Immunol. Today. 2000. Vol. 21. P. 206–209. 29. Jin M.S., Lee J.-O. Structures of the toll-like receptor family and its ligand complexes. // Immunity. 2008. Vol. 29. P. 182–191. 30. Okun E., Griffioen K.J., Lathia J.D., Tang S.-C., Mattson M.P., Arumugam T. V. Toll-like receptors in neurodegeneration. // Brain Res. Rev. Elsevier B.V., 2009. Vol. 59, № 2. P. 278–292. 120 31. McGuire K., Jones M., Werling D., Williams J.L., Glass E.J., Jann O. Radiation hybrid mapping of all 10 characterized bovine Toll-like receptors // Anim. Genet. 2006. Vol. 37. P. 47–50. 32. Zhang F.X., Kirschning C.J., Mancinelli R., Xu X.-P., Jin Y., Faure E., Mantovani a., Rothe M., Muzio M., Arditi M. Bacterial Lipopolysaccharide Activates Nuclear Factor- B through Interleukin-1 Signaling Mediators in Cultured Human Dermal Endothelial Cells and Mononuclear Phagocytes // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, № 12. P. 7611–7614. 33. Lee M.S., Kim Y.-J. Signaling pathways downstream of pattern-recognition receptors and their cross talk. // Annu. Rev. Biochem. 2007. Vol. 76, № Il. P. 447– 480. 34. Hanamsagar R., Hanke M.L., Kielian T. Toll-like receptor (TLR) and inflammasome actions in the central nervous system // Trends Immunol. 2012. Vol. 33, № 7. P. 333–342. 35. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signalling // Nat Rev Immunol. 2004/07/02 ed. 2004. Vol. 4, № 7. P. 499–511. 36. Borysiewicz E., Fil D., Konat G.W. Rho proteins are negative regulators of TLR2, TLR3, and TLR4 signaling in astrocytes // J Neurosci Res. 2008/12/31 ed. 2009. Vol. 87, № 7. P. 1565–1572. 37. Konat G.W., Krasowska-zoladek A., Kraszpulski M., Virginia W. Statins Enhance Toll-Like Receptor 4-Mediated Cytokine Gene Expression in Astrocytes : Implication of Rho Proteins in Negative Feedback Regulation. 2008. Vol. 609, № September 2007. P. 603–609. 38. Holm T.H., Draeby D., Owens T. Microglia are required for astroglial Toll-like receptor 4 response and for optimal TLR2 and TLR3 response. // Glia. 2012. Vol. 60, № 4. P. 630–638. 39. Tabas I., Glass C.K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. // Science (80-. ). 2013. Vol. 339(6116). P. 166–172. 40. Hayashi F., Smith K.D., Ozinsky A., Hawn T.R., Yi E.C., Goodlett D.R., Eng J.K., Akira S., Underhill D.M., Aderem A. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. // Nature. 2001. Vol. 410. P. 1099– 1103. 41. Zhang D., Zhang G., Hayden M.S., Greenblatt M.B., Bussey C., Flavell R.A., Ghosh S. A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria. // Science. 2004. Vol. 303. P. 1522–1526. 42. Oblak A., Jerala R. Toll-like receptor 4 activation in cancer progression and therapy // Clin. Dev. Immunol. 2011. Vol. 2011. 43. Marsh B., Stevens S.L., Packard A.E.B., Gopalan B., Hunter B., Leung P.Y., Harrington C. a, Stenzel-Poore M.P. Systemic lipopolysaccharide protects the brain from ischemic injury by reprogramming the response of the brain to stroke: a critical role for IRF3. // J. Neurosci. 2009. Vol. 29, № 31. P. 9839–9849. 44. Rivest S. Regulation of innate immune responses in the brain // Nat Rev Immunol. 2009/05/23 ed. 2009. Vol. 9, № 6. P. 429–439. 121 45. Yanai H., Ban T., Wang Z., Choi M.K., Kawamura T., Negishi H., Nakasato M., Lu Y., Hangai S., Koshiba R., Savitsky D., Ronfani L., Akira S., Bianchi M.E., Honda K., Tamura T., Kodama T., Taniguchi T. HMGB proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses. // Nature. 2009. Vol. 462. P. 99–103. 46. Ii M., Matsunaga N., Hazeki K., Nakamura K., Takashima K., Seya T., Hazeki O., Kitazaki T., Iizawa Y. A novel cyclohexene derivative, ethyl (6R)-6-[N-(2Chloro-4-fluorophenyl)sulfamoyl]cyclohex-1-ene-1-carboxylate (TAK-242), selectively inhibits toll-like receptor 4-mediated cytokine production through suppression of intracellular signaling // Mol Pharmacol. 2006. Vol. 69, № 4. P. 1288–1295. 47. Bsibsi M., Ravid R., Gveric D., van Noort J.M. Broad expression of Toll-like receptors in the human central nervous system // J.Neuropathol.Exp.Neurol. 2002. Vol. 61. P. 1013–1021. 48. Shichita T., Sakaguchi R., Suzuki M., Yoshimura A. Post-Ischemic Inflammation in the Brain // Front. Immunol. 2012. Vol. 3. 49. Lehnardt S., Massillon L., Follett P., Jensen F.E., Ratan R., Rosenberg P. a, Volpe J.J., Vartanian T. Activation of innate immunity in the CNS triggers neurodegeneration through a Toll-like receptor 4-dependent pathway. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 14. P. 8514–8519. 50. Olson J.K., Miller S.D. Microglia initiate central nervous system innate and adaptive immune responses through multiple TLRs. // J. Immunol. 2004. Vol. 173. P. 3916–3924. 51. Bowman C.C., Rasley A., Tranguch S.L., Marriott I. Cultured astrocytes express toll-like receptors for bacterial products // Glia. 2003/08/05 ed. 2003. Vol. 43, № 3. P. 281–291. 52. Kigerl K.A., Lai W., Rivest S., Hart R.P., Satoskar A.R., Popovich P.G. Tolllike receptor (TLR)-2 and TLR-4 regulate inflammation, gliosis, and myelin sparing after spinal cord injury // J. Neurochem. 2007. Vol. 102. P. 37–50. 53. Bsibsi M., Ravid R., Gveric D., van Noort J.M. Broad expression of Toll-like receptors in the human central nervous system // J Neuropathol Exp Neurol. 2002. Vol. 61. P. 1013–1021. 54. Bar-Shavit Z. Taking a toll on the bones: regulation of bone metabolism by innate immune regulators. // Autoimmunity. 2008. Vol. 41. P. 195–203. 55. Rolls A., Shechter R., London A., Ziv Y., Ronen A., Levy R., Schwartz M. Tolllike receptors modulate adult hippocampal neurogenesis // Nat. Cell Biol. 2007. Vol. 9. P. 1081–1088. 56. Kielian T. Toll-like receptors in central nervous system glial inflammation and homeostasis // J. Neurosci. Res. 2006. Vol. 83. P. 711–730. 57. Kerfoot S.M., Long E.M., Hickey M.J., Andonegui G., Lapointe B.M., Zanardo R.C.O., Bonder C., James W.G., Robbins S.M., Kubes P. TLR4 contributes to disease-inducing mechanisms resulting in central nervous system autoimmune disease. // J. Immunol. 2004. Vol. 173. P. 7070–7077. 122 58. Wang X., Jung J., Asahi M., Chwang W., Russo L., Moskowitz M.A., Dixon C.E., Fini M.E., Lo E.H. Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on morphological and motor outcomes after traumatic brain injury. // J. Neurosci. 2000. Vol. 20. P. 7037–7042. 59. Alfonso-Loeches S., Pascual-Lucas M., Blanco A.M., Sanchez-Vera I., Guerri C. Pivotal role of TLR4 receptors in alcohol-induced neuroinflammation and brain damage. // J. Neurosci. 2010. Vol. 30. P. 8285–8295. 60. Flo T.H., Ryan L., Latz E., Takeuchi O., Monks B.G., Lien E., Halaas Ø., Akira S., Skjåk-Braek G., Golenbock D.T., Espevik T. Involvement of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 in cell activation by mannuronic acid polymers. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 38. P. 35489–35495. 61. Naert G., Laflamme N., Rivest S. Toll-like receptor 2-independent and MyD88dependent gene expression in the mouse brain // J. Innate Immun. 2009. Vol. 1. P. 480–493. 62. Xie Z., Wei M., Morgan T.E., Fabrizio P., Han D., Finch C.E., Longo V.D. Peroxynitrite mediates neurotoxicity of amyloid beta-peptide1-42- and lipopolysaccharide-activated microglia. // J. Neurosci. 2002. Vol. 22. P. 3484–3492. 63. Takeuchi H., Jin S., Wang J., Zhang G., Kawanokuchi J., Kuno R., Sonobe Y., Mizuno T., Suzumura A. Tumor necrosis factor-alpha induces neurotoxicity via glutamate release from hemichannels of activated microglia in an autocrine manner. // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281. P. 21362–21368. 64. Lehnardt S., Lachance C., Patrizi S., Lefebvre S., Follett P.L., Jensen F.E., Rosenberg P.A., Volpe J.J., Vartanian T. The toll-like receptor TLR4 is necessary for lipopolysaccharide-induced oligodendrocyte injury in the CNS. // J. Neurosci. 2002. Vol. 22. P. 2478–2486. 65. Farina C., Aloisi F., Meinl E. Astrocytes are active players in cerebral innate immunity // Trends Immunol. 2007/02/06 ed. 2007. Vol. 28, № 3. P. 138–145. 66. Carty M., Bowie a G. Evaluating the role of Toll-like receptors in diseases of the central nervous system // Biochem Pharmacol. 2011. Vol. 81. P. 825–837. 67. Laudet V., Auwerx J., Gustafsson J.-A., Walter Wahli. Letter to the Editor A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Superfamily // Cell. 1999. Vol. 97. P. 161–163. 68. Issemann I., Green S. Activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators. // Nature. 1990. Vol. 347. P. 645–650. 69. Kliewer S.A., Forman B.M., Blumberg B., Ong E.S., Borgmeyer U., Mangelsdorf D.J., Umesono K., Evans R.M. Differential expression and activation of a family of murine peroxisome proliferator-activated receptors // Proc Natl Acad Sci U S A. 1994/07/19 ed. 1994. Vol. 91, № 15. P. 7355–7359. 70. Dreyer C., Krey G., Keller H., Givel F., Helftenbein G., Wahli W. Control of the peroxisomal beta-oxidation pathway by a novel family of nuclear hormone receptors. // Cell. 1992. Vol. 68. P. 879–887. 71. Moreno M., Lombardi A., Silvestri E., Senese R., Cioffi F., Goglia F., Lanni A., De Lange P. PPARs: Nuclear receptors controlled by, and controlling, nutrient handling through nuclear and cytosolic signaling // PPAR Res. 2010. Vol. 2010. 123 72. Desvergne B., Wahli W. Peroxisome proliferator-activated receptors: nuclear control of metabolism. // Endocr. Rev. 1999. Vol. 20, № 5. P. 649–688. 73. Mueller E., Drori S., Aiyer A., Yie J., Sarraf P., Chen H., Hauser S., Rosen E.D., Ge K., Roeder R.G., Spiegelman B.M. Genetic analysis of adipogenesis through peroxisome proliferator-activated receptor gamma isoforms. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 41925–41930. 74. Kersten S., Desvergne B., Wahli W. Roles of PPARs in health and disease. // Nature. 2000. Vol. 405. P. 421–424. 75. Escher P., Wahli W. Peroxisome proliferator-activated receptors: Insight into multiple cellular functions // Mutat. Res. - Fundam. Mol. Mech. Mutagen. 2000. Vol. 448. P. 121–138. 76. Burns K.A., Vanden Heuvel J.P. Modulation of PPAR activity via phosphorylation // Biochim Biophys Acta. 2007/06/15 ed. 2007. Vol. 1771, № 8. P. 952–960. 77. Youssef J., Badr M. Peroxisome Proliferator-activated Receptors: Discovery and Recent Advances // Curr. Atheroscler. …. New York: Springer New York Heidelberg Dordrecht London, 2013. 78. Schupp M., Lazar M. a. Endogenous ligands for nuclear receptors: digging deeper. // J. Biol. Chem. 2010. Vol. 285, № 52. P. 40409–40415. 79. Mandrup S., Bugge A. Molecular mechanisms and genome-wide aspects of PPAR subtype specific transactivation // PPAR Res. 2010. Vol. 2010. 80. Sonoda J., Pei L., Evans R.M. Nuclear receptors: decoding metabolic disease. // FEBS Lett. 2008. Vol. 582, № 1. P. 2–9. 81. Gohlke J.M., Thomas R., Zhang Y., Rosenstein M.C., Davis A.P., Murphy C., Becker K.G., Mattingly C.J., Portier C.J. Genetic and environmental pathways to complex diseases. // BMC Syst. Biol. 2009. Vol. 3. P. 46. 82. Krey G., Braissant O., L’Horset F., Kalkhoven E., Perroud M., Parker M.G., Wahli W. Fatty acids, eicosanoids, and hypolipidemic agents identified as ligands of peroxisome proliferator-activated receptors by coactivator-dependent receptor ligand assay. // Mol. Endocrinol. 1997. Vol. 11. P. 779–791. 83. Itoh T., Fairall L., Amin K., Inaba Y., Szanto A., Balint B.L., Nagy L., Yamamoto K., Schwabe J.W.R. Structural basis for the activation of PPARgamma by oxidized fatty acids. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2008. Vol. 15. P. 924–931. 84. Sergeeva M.G., Aleshin S.E., Grabeklis S., Reiser G. PPAR activation has dichotomous control on the expression levels of cytosolic and secretory phospholipase A2 in astrocytes; inhibition in naive, untreated cells and enhancement in LPS-stimulated cells // J Neurochem. 2010/07/31 ed. 2010. Vol. 115, № 2. P. 399–410. 85. Xu H.E., Lambert M.H., Montana V.G., Parks D.J., Blanchard S.G., Brown P.J., Sternbach D.D., Lehmann J.M., Wisely G.B., Willson T.M., Kliewer S.A., Milburn M. V. Molecular recognition of fatty acids by peroxisome proliferator-activated receptors. // Mol. Cell. 1999. Vol. 3. P. 397–403. 124 86. Jelier R., Schuemie M.J., Veldhoven A., Dorssers L.C.J., Jenster G., Kors J.A. Anni 2.0: a multipurpose text-mining tool for the life sciences. // Genome Biol. 2008. Vol. 9. P. R96. 87. Lefebvre P., Chinetti G., Fruchart J., Staels B. Review series Sorting out the roles of PPAR α in energy metabolism and vascular homeostasis. 2006. Vol. 116, № 3. P. 571–580. 88. Bishop-Bailey D., Bystrom J. Emerging roles of peroxisome proliferatoractivated receptor-beta/delta in inflammation. // Pharmacol. Ther. Elsevier Inc., 2009. Vol. 124, № 2. P. 141–150. 89. Heinäniemi M., Uski J.O., Degenhardt T., Carlberg C. Meta-analysis of primary target genes of peroxisome proliferator-activated receptors. // Genome Biol. 2007. Vol. 8, № 7. P. R147. 90. Aleshin S., Strokin M., Sergeeva M., Reiser G. Peroxisome proliferatoractivated receptor (PPAR)beta/delta, a possible nexus of PPARalpha- and PPARgamma-dependent molecular pathways in neurodegenerative diseases: Review and novel hypotheses // Neurochem Int. 2013. Vol. 63, № 4. P. 322–330. 91. Becker J., Delayre-Orthez C., Frossard N., Pons F. Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha expression during lung inflammation // Pulm Pharmacol Ther. 2008. Vol. 21, № 2. P. 324–330. 92. Necela B.M., Su W., Thompson E.A. Toll-like receptor 4 mediates cross-talk between peroxisome proliferator-activated receptor gamma and nuclear factorkappaB in macrophages // Immunology. 2008. Vol. 125, № 3. P. 344–358. 93. Aleshin S., Grabeklis S., Hanck T., Sergeeva M., Reiser G. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-gamma positively controls and PPARalpha negatively controls cyclooxygenase-2 expression in rat brain astrocytes through a convergence on PPARbeta/delta via mutual control of PPAR expression levels // Mol Pharmacol. 2009/06/02 ed. 2009. Vol. 76, № 2. P. 414–424. 94. Cantini G., Lombardi A., Borgogni E., Francalanci M., Ceni E., Degl&apos;Innocenti S., Gelmini S., Poli G., Galli A., Serio M., Forti G., Luconi M. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma (PPAR??) is required for modulating endothelial inflammatory response through a nongenomic mechanism // Eur. J. Cell Biol. 2010. Vol. 89. P. 645–653. 95. Aleshin S., Reiser G. Role of the peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR)-alpha, beta/delta and gamma triad in regulation of reactive oxygen species signaling in brain // Biol Chem. 2013. Vol. 394, № 12. P. 1553–1570. 96. Pickup J.C. Inflammation and activated innate immunity in the pathogenesis of type 2 diabetes. // Diabetes Care. 2004. Vol. 27. P. 813–823. 97. Monocytes H. High Glucose Induces Toll-Like Receptor Expression in Mechanism of Activation. 2008. Vol. 57, № November. 98. Kim F., Pham M., Luttrell I., Bannerman D.D., Tupper J., Thaler J., Hawn T.R., Raines E.W., Schwartz M.W. Toll-like receptor-4 mediates vascular inflammation and insulin resistance in diet-induced obesity // Circ Res. 2007. Vol. 100. P. 1589– 1596. 125 99. Libby P., Plutzky J. Inflammation in diabetes mellitus: role of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha and peroxisome proliferator-activated receptorgamma agonists. // Am. J. Cardiol. 2007. Vol. 99, № 4A. P. 27B – 40B. 100. Nareika A., Maldonado A., He L., Game B.A., Slate E.H., Sanders J.J., London S.D., Lopes-Virella M.F., Huang Y. High glucose-boosted inflammatory responses to lipopolysaccharide are suppressed by statin. // J. Periodontal Res. 2007. Vol. 42, № 1. P. 31–38. 101. Nardin P., Tramontina F., Leite M.C., Tramontina A.C., Quincozes-Santos A., de Almeida L.M.V., Battastini A.M., Gottfried C., Gonçalves C.-A. S100B content and secretion decrease in astrocytes cultured in high-glucose medium. // Neurochem. Int. 2007. Vol. 50, № 5. P. 774–782. 102. De Souza L.F., Barreto F., da Silva E.G., Andrades M.E., Guimarães E.L.M., Behr G.A., Moreira J.C.F., Bernard E.A. Regulation of LPS stimulated ROS production in peritoneal macrophages from alloxan-induced diabetic rats: involvement of high glucose and PPARgamma. // Life Sci. 2007. Vol. 81, № 2. P. 153–159. 103. Ransohoff R.M., Brown M.A. Innate immunity in the central nervous system. // J. Clin. Invest. 2012. Vol. 122. P. 1164–1171. 104. Neurochemistry J.O.F. Inflammation in the CNS Neurogenesis. 2009. P. 1343– 1359. 105. Sofroniew M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation // Trends Neurosci. 2009. Vol. 32, № 12. P. 638–647. 106. Hamby M.E., Sofroniew M. V. Reactive Astrocytes As Therapeutic Targets for CNS Disorders // NURT. Elsevier Inc., 2010. Vol. 7, № 4. P. 494–506. 107. Revsin Y., Saravia F., Roig P., Lima A., De Kloet E.R., Homo-Delarche F., De Nicola A.F. Neuronal and astroglial alterations in the hippocampus of a mouse model for type 1 diabetes // Brain Res. 2005. Vol. 1038. P. 22–31. 108. Valastro B., Cossette J., Lavoie N., Gagnon S., Trudeau F., Massicotte G. Upregulation of glutamate receptors is associated with LTP defects in the early stages of diabetes mellitus. // Diabetologia. 2002. Vol. 45, № 5. P. 642–650. 109. Tzeng S.F., Hsiao H.Y., Mak O.T. Prostaglandins and cyclooxygenases in glial cells during brain inflammation // Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2005. Vol. 4. P. 335–340. 110. Sergeeva M.G., Aleshin S.E., Grabeklis S., Reiser G. PPAR activation has dichotomous control on the expression levels of cytosolic and secretory phospholipase A2 in astrocytes; inhibition in naïve, untreated cells and enhancement in LPS-stimulated cells. // J. Neurochem. 2010. Vol. 115, № 2. P. 399–410. 111. Strokin M., Sergeeva M., Reiser G. Proinflammatory treatment of astrocytes with lipopolysaccharide results in augmented Ca2+ signaling through increased expression of via phospholipase A2 (iPLA2) // Am J Physiol Cell Physiol. 2010/12/24 ed. 2011. Vol. 300, № 3. P. C542–C549. 112. Chistyakov D. V, Aleshin S., Sergeeva M.G., Reiser G. Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) beta/delta expression and 126 activity levels by toll-like receptor agonists and MAP kinase inhibitors in rat astrocytes // J Neurochem. 2014. 113. Siegel M.R., Sisler H.D. Inhibition of Protein Synthesis in Vitro by Cycloheximide // Nature. 1963/11/16 ed. 1963. Vol. 200. P. 675–676. 114. Oksvold M.P., Pedersen N.M., Forfang L., Smeland E.B. Effect of cycloheximide on epidermal growth factor receptor trafficking and signaling // FEBS Lett. 2012/09/14 ed. 2012. Vol. 586, № 20. P. 3575–3581. 115. Cochran B.H., Reffel A.C., Stiles C.D. Molecular cloning of gene sequences regulated by platelet-derived growth factor. // Cell. 1983. Vol. 33. P. 939–947. 116. Lau L.F., Nathans D. Expression of a set of growth-related immediate early genes in BALB/c 3T3 cells: coordinate regulation with c-fos or c-myc. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. Vol. 84. P. 1182–1186. 117. Radulovic J., Tronson N.C. Protein synthesis inhibitors, gene superinduction and memory: too little or too much protein? // Neurobiol Learn Mem. 2008. Vol. 89, № 3. P. 212–218. 118. Fort P., Rech J., Vie A., Piechaczyk M., Bonnieu A., Jeanteur P., Blanchard J.M. Regulation of c-fos gene expression in hamster fibroblasts: Initiation and elongation of transcription and mRNA degradation // Nucleic Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 5657–5667. 119. Rahmsdorf H.J., Schonthal A., Angel P., Litfin M., Ruther U., Herrlich P. Posttranscriptional regulation of c-fos mRNA expression // Nucleic Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 1643–1659. 120. Greenberg M.E., Hermanowski A.L., Ziff E.B. Effect of protein synthesis inhibitors on growth factor activation of c-fos, c-myc, and actin gene transcription // Mol Cell Biol. 1986. Vol. 6. P. 1050–1057. 121. Mahadevan L.C., Edwards D.R. Signalling and superinduction. // Nature. 1991. Vol. 349, № 6312. P. 747–748. 122. Wall R., Briskin M., Carter C., Govan H., Taylor A., Kincade P. A labile inhibitor blocks immunoglobulin kappa-light-chain-gene transcription in a pre-B leukemic cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. Vol. 83. P. 295–298. 123. Edwards D.R., Mahadevan L.C. Protein synthesis inhibitors differentially superinduce c-fos and c-jun by three distinct mechanisms: lack of evidence for labile repressors // EMBO J. 1992/07/01 ed. 1992. Vol. 11, № 7. P. 2415–2424. 124. Semenkovich C.F., Coleman T., Goforth R. Physiologic concentrations of glucose regulate fatty acid synthase activity in HepG2 cells by mediating fatty acid synthase mRNA stability // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 6961–6970. 125. Itani O. a, Cornish K.L., Liu K.Z., Thomas C.P. Cycloheximide increases glucocorticoid-stimulated alpha -ENaC mRNA in collecting duct cells by p38 MAPK-dependent pathway // Am J Physiol Ren. Physiol. 2002/12/31 ed. 2003. Vol. 284, № 4. P. F778–F787. 126. Hershko D.D., Robb B.W., Wray C.J., Luo G.J., Hasselgren P.O. Superinduction of IL-6 by cycloheximide is associated with mRNA stabilization and sustained activation of p38 map kinase and NF-kappaB in cultured caco-2 cells // J Cell Biochem. 2004/03/23 ed. 2004. Vol. 91, № 5. P. 951–961. 127 127. Tew S.R., Hardingham T.E. Regulation of SOX9 mRNA in human articular chondrocytes involving p38 MAPK activation and mRNA stabilization // J Biol Chem. 2006/10/20 ed. 2006. Vol. 281, № 51. P. 39471–39479. 128. Thomson S., Clayton A.L., Hazzalin C.A., Rose S., Barratt M.J., Mahadevan L.C. The nucleosomal response associated with immediate-early gene induction is mediated via alternative MAP kinase cascades: MSK1 as a potential histone H3/HMG-14 kinase // EMBO J. 1999. Vol. 18. P. 4779–4793. 129. Joiakim A., Mathieu P., Elliott A., Reiners Jr. J. Superinduction of CYP1A1 in MCF10A cultures by cycloheximide, anisomycin, and puromycin: a process independent of effects on protein translation and unrelated to suppression of aryl hydrocarbon receptor proteolysis by the proteasome // Mol Pharmacol. 2004/09/24 ed. 2004. Vol. 66, № 4. P. 936–947. 130. Wallace C.S., Lyford G.L., Worley P.F., Steward O. Differential intracellular sorting of immediate early gene mRNAs depends on signals in the mRNA sequence. // J. Neurosci. 1998. Vol. 18. P. 26–35. 131. Konishi Y., Sato H., Tanaka T. Anisomycin superinduces annexin V mRNA expression through the ERK1/2 but not the p38 MAP kinase pathway // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. Vol. 313. P. 977–983. 132. Zinck R., Cahill M.A., Kracht M., Sachsenmaier C., Hipskind R.A., Nordheim A. Protein synthesis inhibitors reveal differential regulation of mitogen-activated protein kinase and stress-activated protein kinase pathways that converge on Elk-1. // Mol. Cell. Biol. 1995. Vol. 15. P. 4930–4938. 133. Joiakim A., Mathieu P. Elliott A.A., Reiners Jr. J.J., Reiners J.J. Superinduction of CYP1A1 in MCF10A cultures by cycloheximide, anisomycin, and puromycin: a process independent of effects on protein translation and unrelated to suppression of aryl hydrocarbon receptor proteolysis by the proteasome // Mol Pharmacol. 2004/09/24 ed. 2004. Vol. 66, № 4. P. 936–947. 134. Rypka M., Veselý J., Vesely J. Evidence for differential effects of glucose and cycloheximide on mRNA levels of peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR-) machinery members: Superinduction of PPAR-gamma1 and -gamma2 mRNAs // Acta Biochim Pol. 2010/06/22 ed. 2010. Vol. 57, № 2. P. 209–215. 135. Tew S.R., Hardingham T.E. Regulation of SOX9 mRNA in human articular chondrocytes involving p38 MAPK activation and mRNA stabilization // J Biol Chem. 2006/10/20 ed. 2006. Vol. 281, № 51. P. 39471–39479. 136. Roger T., Out T., Mukaida N., Matsushima K., Jansen H., Lutter R. Enhanced AP-1 and NF-kappaB activities and stability of interleukin 8 (IL-8) transcripts are implicated in IL-8 mRNA superinduction in lung epithelial H292 cells. // Biochem. J. 1998. Vol. 330 ( Pt 1. P. 429–435. 137. Newton R., Stevens D.A., Hart L.A., Lindsay M., Adcock I.M., Barnes P.J. Superinduction of COX-2 mRNA by cycloheximide and interleukin-1?? involves increased transcription and correlates with increased NF-??B and JNK activation // FEBS Lett. 1997. Vol. 418. P. 135–138. 128 138. Newton R., Adcock I.M., Barnes P.J. Superinduction of NF-kappa B by actinomycin D and cycloheximide in epithelial cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 218, № 2. P. 518–523. 139. Pellerin I., Vuillermoz C., Jouvenot M., Royez M., Ordener C., Marechal G., Adessi G. Superinduction of c-fos gene expression by estrogen in cultured guineapig endometrial cells requires priming by a cycloheximide-dependent mechanism. // Endocrinology. 1992. Vol. 131. P. 1094–1100. 140. Bi Y., Lin G.X., Millecchia L., Ma Q. Superinduction of metallothionein I by inhibition of protein synthesis: Role of a labile repressor in MTF-1 mediated gene transcription // J. Biochem. Mol. Toxicol. 2006. Vol. 20, № 2. P. 57–68. 141. Dogra S.C., Hahn C.N., May B.K. Superinduction by cycloheximide of cytochrome P4502H1 and 5-aminolevulinate synthase gene transcription in chick embryo liver. // Arch. Biochem. Biophys. 1993. Vol. 300. P. 531–534. 142. Siggens K.W., Morris A.G. Interferon gamma mRNA ―superinduction‖ in human lymphocytes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. Vol. 133. P. 274– 279. 143. Li S., Ouyang Y.L., Dong W., Pestka J.J. Superinduction of IL-2 gene expression by vomitoxin (deoxynivalenol) involves increased mRNA stability. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1997. Vol. 147, № 2. P. 331–342. 144. Lahti A., Sareila O., Kankaanranta H., Moilanen E. Inhibition of p38 mitogenactivated protein kinase enhances c-Jun N-terminal kinase activity: implication in inducible nitric oxide synthase expression. // BMC Pharmacol. 2006. Vol. 6. P. 5. 145. Anderson P. Post-transcriptional regulons coordinate the initiation and resolution of inflammation // Nat Rev Immunol. 2010. Vol. 10, № 1. P. 24–35. 146. Thapar R., Denmon A.P. Signaling pathways that control mRNA turnover. // Cell. Signal. Elsevier Inc., 2013. Vol. 25, № 8. P. 1699–1710. 147. Blanquicett C., Kang B.Y., Ritzenthaler J.D., Jones D.P., Hart C.M. Oxidative stress modulates PPAR gamma in vascular endothelial cells // Free Radic Biol Med. 2010. Vol. 48. P. 1618–1625. 148. Tsai Y.-S., Xu L., Smithies O., Maeda N. Genetic variations in peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression affect blood pressure. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106. P. 19084–19089. 149. Fu M., Zhu X., Wang Q., Zhang J., Song Q., Zheng H., Ogawa W., Du J., Chen Y.E. Platelet-Derived Growth Factor Promotes the Expression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells by a Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Signaling Pathway // Circ. Res. 2001. Vol. 89, № 11. P. 1058–1064. 150. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1. P. 581–585. 151. Misra P., Owuor E.D., Li W., Yu S., Qi C., Meyer K., Zhu Y.-J., Rao M.S., Kong A.-N.T., Reddy J.K. Phosphorylation of transcriptional coactivator peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-binding protein (PBP). 129 Stimulation of transcriptional regulation by mitogen-activated protein kinase. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 48745–48754. 152. Ruan H., Pownall H.J., Lodish H.F. Troglitazone antagonizes tumor necrosis factor-alpha-induced reprogramming of adipocyte gene expression by inhibiting the transcriptional regulatory functions of NF-kappaB. // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 28181–28192. 153. Tolón R.M., Castillo A.I., Aranda A. Activation of the prolactin gene by peroxisome proliferator-activated receptor-alpha appears to be DNA bindingindependent. // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 26652–26661. 154. Stockert J., Wolf A., Kaddatz K., Schnitzer E., Finkernagel F., Meissner W., Müller-Brüsselbach S., Kracht M., Müller R. Regulation of TAK1/TAB1-mediated IL-1β signaling by cytoplasmic PPARβ/δ. // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 4. P. e63011. 155. Wang X.H., Yan G.T., Wang L.H., Hao X.H., Zhang K., Xue H. The mediating role of cPLA2 in IL-1 beta and IL-6 release in LPS-induced HeLa cells. // Cell Biochem. Funct. 2004. Vol. 22, № 1. P. 41–44. 156. Lasa M., Abraham S.M., Boucheron C., Saklatvala J., Clark A.R. Dexamethasone causes sustained expression of mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphatase 1 and phosphatase-mediated inhibition of MAPK p38. // Mol. Cell. Biol. 2002. Vol. 22. P. 7802–7811. 157. Сергеева М.Г. В.А.Т. Каскад арахидоновой кислоты. Москва: Народное образование, 2006. 158. Fernández N., Alonso S., Valera I., Vigo A.G., Renedo M., Barbolla L., Crespo M.S. Mannose-containing molecular patterns are strong inducers of cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin E2 production in human macrophages. // J. Immunol. 2005. Vol. 174. P. 8154–8162. 159. Patel H., Chen J., Das K.C., Kavdia M. Hyperglycemia induces differential change in oxidative stress at gene expression and functional levels in HUVEC and HMVEC. // Cardiovasc. Diabetol. 2013. Vol. 12. P. 142. 160. Hahn T., Barth S., Weiss U., Mosgoeller W., Desoye G. Sustained hyperglycemia in vitro down-regulates the GLUT1 glucose transport system of cultured human term placental trophoblast: a mechanism to protect fetal development? // FASEB J. 1998. Vol. 12. P. 1221–1231. 161. Shanmugam N., Gaw Gonzalo I.T., Natarajan R. Molecular mechanisms of high glucose-induced cyclooxygenase-2 expression in monocytes. // Diabetes. 2004. Vol. 53, № 3. P. 795–802. 162. Hwang D. Modulation of the expression of cyclooxygenase-2 by fatty acids mediated through toll-like receptor 4-derived signaling pathways. // FASEB J. 2001. Vol. 15. P. 2556–2564. 163. Cosentino F., Eto M., De Paolis P., van der Loo B., Bachschmid M., Ullrich V., Kouroedov A., Delli Gatti C., Joch H., Volpe M., Lüscher T.F. High glucose causes upregulation of cyclooxygenase-2 and alters prostanoid profile in human endothelial cells: role of protein kinase C and reactive oxygen species. // Circulation. 2003. Vol. 107. P. 1017–1023. 130 164. Du Y., Sarthy V.P., Kern T.S. Interaction between NO and COX pathways in retinal cells exposed to elevated glucose and retina of diabetic rats. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2004. Vol. 287. P. R735–R741. 165. Sheu M.L., Ho F.M., Yang R. Sen, Chao K.F., Lin W.W., Lin-Shiau S.Y., Liu S.H. High glucose induces human endothelial cell apoptosis through a phosphoinositide 3-kinase-regulated cyclooxygenase-2 pathway // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005. Vol. 25. P. 539–545. 166. Beyan H., Goodier M.R., Nawroly N.S., Hawa M.I., Bustin S.A., Ogunkolade W.B., Londei M., Yousaf N., Leslie R.D.G. Altered monocyte cyclooxygenase response to lipopolysaccharide in type 1 diabetes. // Diabetes. 2006. Vol. 55. P. 3439–3445. 167. Edvardsson U., Bergström M., Alexandersson M., Bamberg K., Ljung B., Dahllöf B. Rosiglitazone (BRL49653), a PPARgamma-selective agonist, causes peroxisome proliferator-like liver effects in obese mice. // J. Lipid Res. 1999. Vol. 40. P. 1177–1184. 168. Cuartero M.I., Ballesteros I., Moraga A., Nombela F., Vivancos J., Hamilton J.A., Corbí Á.L., Lizasoain I., Moro M.A. N2 neutrophils, novel players in brain inflammation after stroke: Modulation by the pparγ agonist rosiglitazone // Stroke. 2013. Vol. 44. P. 3498–3508. 169. Sánchez-Hidalgo M., Martín A.R., Villegas I., Alarcón De La Lastra C. Rosiglitazone, an agonist of peroxisome proliferator-activated receptor gamma, reduces chronic colonic inflammation in rats // Biochem. Pharmacol. 2005. Vol. 69. P. 1733–1744. 170. Cuzzocrea S., Pisano B., Dugo L., Ianaro A., Maffia P., Patel N.S., Di Paola R., Ialenti A., Genovese T., Chatterjee P.K., Di Rosa M., Caputi A.P., Thiemermann C. Rosiglitazone, a ligand of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma, reduces acute inflammation // Eur. J. Pharmacol. 2004. Vol. 483. P. 79–93. 171. Straus D.S., Glass C.K. Anti-inflammatory actions of PPAR ligands: new insights on cellular and molecular mechanisms // Trends Immunol. 2007. Vol. 28. P. 551–558. 172. Leisewitz A. V., Urrutia C.R., Martinez G.R., Loyola G., Bronfman M. A PPARs cross-talk concertedly commits C6 glioma cells to oligodendrocytes and induces enzymes involved in myelin synthesis // J. Cell. Physiol. 2008. Vol. 217. P. 367–376. 173. Bernardi A., Jacques-Silva M.C., Delgado-Cañedo A., Lenz G., Battastini A.M.O. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs inhibit the growth of C6 and U138MG glioma cell lines // Eur. J. Pharmacol. 2006. Vol. 532. P. 214–222. 174. Грабеклис С.А., Чистяков Д.В., Андреева Л.Ю., Сергеева М.Г. Совместное участие агонистов ядерных рецепторов PPAR и ингибиторов циклооксигеназ в регуляции пролиферации клеток глиомы С6 // Биологические мембраны. 2012. Vol. 29, № 6. P. 429–432. 175. Czajkowski R., Barańska J. Cross-talk between the ATP and ADP nucleotide receptor signalling pathways in glioma C6 cells. // Acta Biochim. Pol. 2002. Vol. 49. P. 877–889. 131 176. Begum N.M., Nakashiro K., Kawamata H., Uchida D., Shintani S., Ikawa Y., Sato M., Hamakawa H. Expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and the growth inhibitory effect of its synthetic ligands in human salivary gland cancer cell lines // Int J Oncol. 2002. Vol. 20. P. 599–605. 177. Lee J., Hong E.M., Byun H.W., Choi M.H., Jang H.J., Eun C.S., Kae S.H., Choi H.S. The effect of PPAR?? and PPAR?? ligands on inflammation and ABCA1 expression in cultured gallbladder epithelial cells // Dig. Dis. Sci. 2008. Vol. 53. P. 1707–1715. 178. Delayre-Orthez C., Becker J., Auwerx J., Frossard N., Pons F. Suppression of allergen-induced airway inflammation and immune response by the peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist fenofibrate // Eur. J. Pharmacol. 2008. Vol. 581. P. 177–184. 179. Feingold K., Kim M.S., Shigenaga J., Moser A., Grunfeld C. Altered expression of nuclear hormone receptors and coactivators in mouse heart during the acutephase response. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2004. Vol. 286. P. E201– E207. 180. Zhou M., Wu R., Dong W., Jacob A., Wang P. Endotoxin downregulates peroxisome proliferator-activated receptor-gamma via the increase in TNF-alpha release. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2008. Vol. 294. P. R84– R92. 181. Landreth G.E., Reed-Geaghan E.G. Toll-like receptors in Alzheimer’s disease // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2009. Vol. 336. P. 137–153. 182. Sriram S. Role of glial cells in innate immunity and their role in CNS demyelination // J. Neuroimmunol. 2011. Vol. 239. P. 13–20. 183. Drew P.D., Xu J., Storer P.D., Chavis J.A., Racke M.K. Peroxisome proliferator-activated receptor agonist regulation of glial activation: Relevance to CNS inflammatory disorders // Neurochem. Int. 2006. Vol. 49. P. 183–189. 184. Colton C.A., Abel C., Patchett J., Keri J., Yao J. Lectin staining of cultured CNS microglia. // J. Histochem. Cytochem. 1992. Vol. 40. P. 505–512. 185. Sherry C.L., Connor J.C.O., Kramer J.M., Freund G.G. on Elevated Glucose and Requires p38 MAPK 1. 2009. 186. Shao B., Li C., Yang H., Shen A., Wu X., Yuan Q., Kang L., Liu Z., Zhang G., Lu X., Cheng C. The relationship between Src-suppressed C kinase substrate and beta-1,4 galactosyltransferase-I in the process of lipopolysaccharide-induced TNFalpha secretion in rat primary astrocytes // Cell Mol Neurobiol. 2011/05/17 ed. 2011. Vol. 31, № 7. P. 1047–1056. 187. Hu Y., Chen Y., Ding L., He X., Takahashi Y., Gao Y., Shen W., Cheng R., Chen Q., Qi X., Boulton M.E., Ma J.-X. Pathogenic role of diabetes-induced PPARα down-regulation in microvascular dysfunction. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013. Vol. 110. P. 15401–15406. 188. Whiteside C., Wang H., Xia L., Munk S., Goldberg H.J., Fantus I.G. Rosiglitazone Prevents High Glucose-Induced Vascular Endothelial Growth Factor and Collagen IV Expression in Cultured Mesangial Cells. 2009. Vol. 2009. 132 189. Stokes J. a, Cheung J., Eddinger K., Corr M., Yaksh T.L. Toll-like receptor signaling adapter proteins govern spread of neuropathic pain and recovery following nerve injury in male mice. // J. Neuroinflammation. 2013. Vol. 10. P. 148. 190. Zhang L., Che C., Lin J., Liu K., Li D.-Q., Zhao G. TLR-mediated induction of proinflammatory cytokine IL-32 in corneal epithelium // Curr. Eye Res. 2013. Vol. 38, № 6. P. 630–638. 191. Dasu M.R., Park S., Devaraj S., Jialal I. Pioglitazone inhibits Toll-like receptor expression and activity in human monocytes and db/db mice. // Endocrinology. 2009. Vol. 150, № 8. P. 3457–3464. 192. Pierce J.W., Schoenleber R., Jesmok G., Best J., Moore S.A., Collins T., Gerritsen M.E. Novel inhibitors of cytokine-induced IkappaBalpha phosphorylation and endothelial cell adhesion molecule expression show anti-inflammatory effects in vivo // J Biol Chem. 1997/08/22 ed. 1997. Vol. 272, № 34. P. 21096–21103. 193. De Sousa Abreu R., Penalva L.O., Marcotte E.M., Vogel C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. // Mol. Biosyst. 2009. Vol. 5. P. 1512–1526. 194. Schwanhäusser B., Busse D., Li N., Dittmar G., Schuchhardt J., Wolf J., Chen W., Selbach M. Global quantification of mammalian gene expression control. // Nature. 2011. Vol. 473. P. 337–342. 195. Storm D.R., Rosenthal K.S., Swanson P.E. Polymyxin and related peptide antibiotics // Annu Rev Biochem. 1977/01/01 ed. 1977. Vol. 46. P. 723–763. 196. Morrison D.C., Jacobs D.M. Binding of polymyxin B to the lipid A portion of bacterial lipopolysaccharides // Immunochemistry. 1976/10/01 ed. 1976. Vol. 13, № 10. P. 813–818. 197. Ross J. mRNA stability in mammalian cells // Microbiol Rev. 1995. Vol. 59, № 3. P. 423–450. 198. Hao S., Baltimore D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. // Nat. Immunol. 2009. Vol. 10. P. 281–288. 199. Gao J., Wagnon J.L., Protacio R.M., Glazko G. V, Beggs M., Raj V., Davidson M.K., Wahls W.P. A stress-activated, p38 mitogen-activated protein kinaseATF/CREB pathway regulates posttranscriptional, sequence-dependent decay of target RNAs. // Mol. Cell. Biol. 2013. Vol. 33. P. 3026–3035. 200. Gorina R., Font-Nieves M., Marquez-Kisinousky L., Santalucia T., Planas A.M. Astrocyte TLR4 activation induces a proinflammatory environment through the interplay between MyD88-dependent NFkappaB signaling, MAPK, and Jak1/Stat1 pathways // Glia. 2011. Vol. 59, № 2. P. 242–255. 201. Carpentier P.A., Begolka W.S., Olson J.K., Elhofy A., Karpus W.J., Miller S.D. Differential activation of astrocytes by innate and adaptive immune stimuli // Glia. 2004/11/13 ed. 2005. Vol. 49, № 3. P. 360–374. 202. Borders A.S., de Almeida L., Van Eldik L.J., Watterson D.M. The p38alpha mitogen-activated protein kinase as a central nervous system drug discovery target // BMC Neurosci. 2009/01/06 ed. 2008. Vol. 9 Suppl 2. P. S12. 133 203. Chico L.K., Van Eldik L.J., Watterson D.M. Targeting protein kinases in central nervous system disorders // Nat Rev Drug Discov. 2009/10/31 ed. 2009. Vol. 8, № 11. P. 892–909. 204. Alessi D.R., Cuenda A., Cohen P., Dudley D.T., Saltiel A.R. PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo // J Biol Chem. 1995/11/17 ed. 1995. Vol. 270, № 46. P. 27489– 27494. 205. Cuenda A., Rouse J., Doza Y.N., Meier R., Cohen P., Gallagher T.F., Young P.R., Lee J.C. SB 203580 is a specific inhibitor of a MAP kinase homologue which is stimulated by cellular stresses and interleukin-1 // FEBS Lett. 1995/05/08 ed. 1995. Vol. 364, № 2. P. 229–233. 206. Favata M.F., Horiuchi K.Y., Manos E.J., Daulerio A.J., Stradley D.A., Feeser W.S., Van Dyk D.E., Pitts W.J., Earl R.A., Hobbs F., Copeland R.A., Magolda R.L., Scherle P.A., Trzaskos J.M. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase // J Biol Chem. 1998/07/11 ed. 1998. Vol. 273, № 29. P. 18623–18632. 207. Venugopal S.K., Chen J., Zhang Y., Clemens D., Follenzi A., Zern M.A. Role of MAPK phosphatase-1 in sustained activation of JNK during ethanol-induced apoptosis in hepatocyte-like VL-17A cells // J Biol Chem. 2007/09/13 ed. 2007. Vol. 282, № 44. P. 31900–31908. 208. Su W., Necela B.M., Fujiwara K., Kurakata S., Murray N.R., Fields A.P., Thompson E.A. The high affinity peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonist RS5444 inhibits both initiation and progression of colon tumors in azoxymethane-treated mice // Int J Cancer. 2008. Vol. 123, № 5. P. 991–997. 209. Joly E., Roduit R., Peyot M.L., Habinowski S.A., Ruderman N.B., Witters L.A., Prentki M. Glucose represses PPARalpha gene expression via AMP-activated protein kinase but not via p38 mitogen-activated protein kinase in the pancreatic beta-cell // J Diabetes. 2009. Vol. 1, № 4. P. 263–272. 210. Kiec-Wilk B., Grzybowska-Galuszka J., Polus A., Pryjma J., Knapp A., Kristiansen K. The MAPK-dependent regulation of the Jagged/Notch gene expression by VEGF, bFGF or PPAR gamma mediated angiogenesis in HUVEC. // J. Physiol. Pharmacol. 2010. Vol. 61. P. 217–225. 211. Newton R., Stevens D.A., Hart L.A., Lindsay M., Adcock I.M., Barnes P.J. Superinduction of COX-2 mRNA by cycloheximide and interleukin-1beta involves increased transcription and correlates with increased NF-kappaB and JNK activation // FEBS Lett. 1997. Vol. 418, № 1-2. P. 135–138. 212. Hershko D.D., Robb B.W., Wray C.J., Luo G.J., Hasselgren P.O. Superinduction of IL-6 by cycloheximide is associated with mRNA stabilization and sustained activation of p38 map kinase and NF-kappaB in cultured caco-2 cells // J Cell Biochem. 2004/03/23 ed. 2004. Vol. 91, № 5. P. 951–961. 213. Tanabe T., Tohnai N. Cyclooxygenase isozymes and their gene structures and expression // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. Vol. 68-69. P. 95–114. 134 214. Ridley S.H., Dean J.L.E., Sarsfield S.J., Brook M., Clark A.R., Saklatvala J. A p38 MAP kinase inhibitor regulates stability of interleukin-1-induced cyclooxygenase-2 mRNA // FEBS Lett. 1998. Vol. 439. P. 75–80. 215. Guha M., O’Connell M.A., Pawlinski R., Hollis A., McGovern P., Yan S.F., Stern D., Mackman N. Lipopolysaccharide activation of the MEK-ERK1/2 pathway in human monocytic cells mediates tissue factor and tumor necrosis factor ?? expression by inducing Elk-1 phosphorylation and Egr-1 expression // Blood. 2001. Vol. 98. P. 1429–1439. 216. Lamon B.D., Upmacis R.K., Deeb R.S., Koyuncu H., Hajjar D.P. Inducible nitric oxide synthase gene deletion exaggerates MAPK-mediated cyclooxygenase-2 induction by inflammatory stimuli. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2010. Vol. 299. P. H613–H623. 217. Rochette-Egly C. Nuclear receptors: Integration of multiple signalling pathways through phosphorylation // Cell. Signal. 2003. Vol. 15. P. 355–366. 218. Floyd Z.E., Stephens J.M. Interferon-gamma-mediated activation and ubiquitinproteasome-dependent degradation of PPARgamma in adipocytes. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 4062–4068. 219. Shalev A., Siegrist-Kaiser C.A., Yen P.M., Wahli W., Burger A.G., Chin W.W., Meier C.A. The peroxisome proliferator-activated receptor alpha is a phosphoprotein: regulation by insulin. // Endocrinology. 1996. Vol. 137. P. 4499– 4502. 220. Barger P.M., Browning a C., Garner a N., Kelly D.P. P38 Mitogen-Activated Protein Kinase Activates Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha: a Potential Role in the Cardiac Metabolic Stress Response. // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 48. P. 44495–44501. 135
