маркирование гена устойчивости or5 к расе е заразихи
advertisement
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (151–152), 2012 _____________________________________________ _________________________________________________________________________________ МАРКИРОВАНИЕ ГЕНА УСТОЙЧИВОСТИ OR5 К РАСЕ Е ЗАРАЗИХИ ОROBANCHE CUMANA WALLR. В ЛИНИЯХ ПОДСОЛНЕЧНИКА СЕЛЕКЦИИ ВНИИМК С.З. Гучетль, кандидат биологических наук Т.А. Челюстникова, старший научный сотрудник Н.М. Арасланова, кандидат сельскохозяйственных наук, Т.С. Антонова, доктор биологических наук ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, д. 17 тел.: Тел.: (861) 275-86-53, факс: (861) 254-27-80 e-mail: antonоva@mail.ru Ключевые слова: подсолнечник, заразиха, устойчивость, SSR- и SCAR-маркеры, маркирование УДК 631.524.86:582.952.6:633.854.78 Подсолнечник – один из значимых источников растительного масла в мире и основной – в Российской Федерации. В настоящее время мощным ограничивающим фактором в его производстве является заразиха (Orobanche сumana Wallr.) – паразитическое цветковое растение с высоким потенциалом воспроизводства. По- ражение подсолнечника заразихой значительно снижает урожай. Число физиологических рас быстро нарастает, новые гены устойчивости часто обусловливают устойчивость и к более ранним расам. Исследования в расщепляющихся популяциях показали, что гены от Or1 до Or5, контролирующие устойчивость подсолнечника к расам от А до Е, являются аллельными или сильно сцепленными, а устойчивость к расе Е заразихи контролируется одним доминантным геном Or5 [1; 2; 3; 4]. На данный момент насчитывается около 8 рас заразихи с разной вирулентностью, обозначенными латинскими буквами A, B, C, D, E, F, G, H [5–10]. Основная линия защиты против заразихи – создание сортимента с генетической устойчивостью [1; 2]. В связи с этим существует необходимость постоянного создания исходного материала, устойчивого к O. cumana [1; 2; 11]. Молекулярные маркеры, сцепленные с геном устойчивости к заразихе, могут быть инструментом быстрой идентификации желательных индивидов или линий, а также обеспечить контролируемый перенос интересующих генов. Зарубежными исследователями Lu et al. [12] были идентифицированы некоторые ДНКмаркеры в одной группе сцепления с Or5. Пять идентифицированных последовательностей ДНК характеризуют область SCAR-маркеров, сцепленных с Or5. Самый близкий SCAR-маркер картирован на расстоянии 5.6 сМ к дистальному концу Or5. Tang et al. идентифицировали маркеры SSR, тесно сцепленные с Or5 и картировали этот локус в верхней части LG3 генетической карты SSR-локусов [13]. Самые близкие маркеры SSR находятся на расстоянии 6.2 сМ и 7.5 сМ от Or5 локуса. В отечественной селекции в настоящее время существует проблема обнаружения доноров устойчивости к высоковирулентным расам заразихи: F, H, G. В коллекциях инбредных линий также ограничено число образцов, устойчивых к расе Е. Ни один из генов устойчивости не маркирован молекулярно-генетическими методами. В связи с этим цель работы – маркирование гена Or5, контролирующего устойчивость к расе Е заразихи в материале подсолнечника селекции ВНИИМК на основе применения методов ПЦР с известными SSR и SCAR праймерами. Материалы и методы. Материалом исследования служила популяция F2 (90 растений), полученная от скрещивания линий отдела селекции гибридного подсолнечника ВНИИМК ВА330В (устойчива к расе Е заразихи, генотип Or5Or5) и I6СЛ-Лакомка 1 (восприимчива к расе Е заразихи, генотип or5or5). Принудительное самоопыление и гибридизацию подсолнечника проводили общепринятым методом [14], используя индивидуальные изоляторы из спанбонда. Для тестирования устойчивости к расе Е заразихи родительских форм, индивидуальных растений F2 использовали метод ранней диагностики заразихоустойчивости [15] и способ выявления истинно устойчивых генотипов [16]. Семена подсолнечника сеяли в короба, заполненные смесью просеянной почвы с речным песком в соотношении 3:1. В почвенную смесь вносили семена заразихи (из расчета 200 мг семян на 1 кг почвы), собранные в 2003 г. в окрестностях станицы Привольненской Краснодарского края и хранившиеся в замороженном состоянии. Вирулентность заразихи из этой популяции обусловлена наличием преимущественно расы Е с незначительной примесью расы F. Растения подсолнечника выращивали в теплице в течение 30 дней при температуре 22–25 °С при 16-часовом фотопериоде. Через 30 дней после появления всходов проводили их оценку на устойчивость к заразихе. Восприимчивыми считались растения, на корнях которых было обнаружено более 2–3 клубеньков или сформировавшихся побегов заразихи; устойчивыми – растения, на корнях кото- рых не было обнаружено здоровых клубеньков и побегов, но были видны многочисленные некрозы клеток в области проникновения заразихи и погибшие клубеньки. Поскольку в использованной популяции имелось небольшое количество семян заразихи расы F, к устойчивым к расе Е также относили растения подсолнечника с поражением корней менее чем 2–3 клубеньками заразихи. В качестве контроля был использован сорт ВНИИМК 8883, не обладающий устойчивостью к современным расам O. сumana. ДНК подсолнечника выделяли из верхушечных листьев индивидуальных молодых побегов вегетирующих растений. Выделение проводили по модифицированному методу, описанному Saghai-Maroof с соавторами [17]. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мM сульфата аммония; 1,5–3 мM MgCl2; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Москва, ГОСНИИГЕНЕТИКА). Для амплификации использовали термоциклер S1000тм (BioRad, США). Условия амплификации: начальная денатурация – 2 мин при 96 °С, затем 30 циклов при соблюдении температурно-временного режима: денатурация при 94°С – 30 сек, отжиг при 60 °С в течение 40 сек, элонгация – 1 мин при 70 °С, финальная элонгация – 2 мин. Для ПЦР анализа использовали 2 типа праймеров: - SCAR (sequence characterized amplified region): RTS05, RTS28, RTS40 [12]. - SSR (simple sequence repeat): ORS 1036, ORS683, ORS1112, ORS 1021 [13]. Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (2 % агароза, 1х ТАЕ- буфер) с использованием камеры SE-2 для горизонтального электрофореза ( Хеликон, РФ) и полиакриламидном геле (8 %, 1хТБЕ) с использованием камеры VE-20 для вертикального электрофореза (Хеликон, РФ). Последующее окрашивание осуществляли бромистым этидием. Документирование результатов электрофореза обеспечивалось при помощи системы цифровой документации видеоизображения BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция). Математическую обработку результатов расщепления проводили с использованием χ2-критерия соответствия фактических расщеплений теоретически ожидаемым и оценки частоты рекомбинации в дигибридных скрещиваниях [18; 19]. Результаты и обсуждение. Для выявления сцепления между генами, контролирующими устойчивость к расе Е заразихи и локусами ДНК нами ранее была проведена паспортизация коллекции из 32 перспективных селекционных образцов подсолнечника ВНИИМК, устойчивых и восприимчивых к данной расе, то есть несущими гены Or5 или or5 соответственно, методом полимеразной цепной реакции амплификации ДНК по SSR- и SCAR- маркерам [20]. Были выявлены образцы подсолнечника с контрастными аллелями SSR- и SCAR-локусов среди устойчивых и восприимчивых к расе Е заразихи и получено 12 комбинаций гетерозиготного поколения F1. Семена F1 были проверены на гибридность по полиморфным ДНК локусам. В полевых условиях получены потомства F2 и ВС1, которые оценили в теплице на устойчивость и восприимчивость к расе Е заразихи описанными выше методами [15; 16]. Из 12 комбинаций скрещивания после оценки на устойчивость только у 4-х комбинаций фактические расщепления соответствовали теоретически ожидаемым. Для оценки растений методом ПЦР на наличие маркерного локуса, косегрегирующего с устойчивостью к расе Е заразихи, была выбрана комбинация скрещивания F2 (ВА 330В × I6СЛ-Лакомка 1) (табл. 1). Таблица 1 Различия по локусам ДНК линий подсолнечника, устойчивой и восприимчивой к расе Е заразихи Линия ВА 330В I6СЛЛакомка 1 Ген ДНК локусы устойчи- RTS RTS RTS ORS ORS ORS ORS вости 05 28 40 1036 1112 683 1021 Or5Or5 - 245* 373 392 250 or5or5 + + + 255 345 389 276 (-) – отсутствие, (+) – наличие фрагмента ДНК; * – количество пар нуклеотидов ДНК Как видно из таблицы 1, семь праймеров выявляли полиморфные продукты амплификации ДНК для выбранной комбинации скрещивания. Но после проведения гибридологического анализа, только у трех локусов ДНК фактические расщепления соответствовали теоретически ожидаемым. Проведен анализ сцепления гена Or5 c этими тремя локусами (табл. 2). Таблица 2 Значения χ2 и частоты рекомбинации при анализе сцепления между геном устойчивости к расе Е заразихи Or5 и локусами ДНК в потомстве F2 Пара локусов Or5-ORS1036 Or5-RTS05 Or5-RTS40 χ2А 1,2 1,2 1,2 χ2В 0,73 1,97 1,2 χ 2L PL r±SE 61,00 ˃0,01 0,12±0,04 13,38 ˃0,01 0,10±0,04 2,89 0,26 0,48±0,06 В таблице 2 представлены данные по оценке сцепления пар локусов, где отмечены три значения χ2: χ2А – характеризует отклонения в расщеплении по первому локусу, χ2В – по второму, χ2L – отклонения от независимого расщепления локусов А и В. Показаны также вероятность нулевой гипотезы о независимом наследовании (PL) и оценка частоты рекомбинации (r) между анализируемыми генами. Теоретическое расщепление при доминировании одного из признаков и кодоминировании другого в потомстве F2 должно соответствовать модели 3:6:3:1:2:1 (для пары генов Or5-ORS1036) (рис. 1), при доминировании обоих признаков – 9:3:3:1 (для пар генов Or5-RTS05 (рис.2) и Or5-RTS40). Рисунок 1 – Электрофореграмма продуктов амплификации по кодоминантному локусу ORS1036 ДНК индивидуальных растений F2 (ВА 330В х I6СЛ-Лакомка 1). Генотипы ORS1036: 2-5 – 255/255; 6,10,11,13,14 – 245/245; 1,7-9,12 – 245/255. Рисунок 2 – Электрофореграмма продуктов амплификации по доминантному локусу RTS 05 ДНК индивидуальных растений F2 (ВА 330В × I6СЛ-Лакомка 1). Генотипы RTS 05: 1, 2, 8, 11, 12 – отсутствие фрагмента ДНК 650 пн; 3–7, 9, 10, 13–15 – наличие фрагмента ДНК 650 пн.; М – маркер молекулярной массы ДНК 1 kb. Тест на независимое наследование подтвердил сцепление локусов Or5- ORS1036 с частотой рекомбинации 0,12±0,04 (12 сМ) и Or5- RTS 05 – 0,10±0,04 (10 сМ). Полученные данные о частоте рекомбинации между исследуемыми генами не совпадают с оригинальными, полученными на другом материале. Так, согласно Tang et al. [13], SSR-локус ORS1036 находится на расстоянии 7,5 сМ от Or5 локуса. В исследованиях Lu et al. [12] SCAR-маркер RTS 05 картирован 5,6 сМ к дистальному концу Or5, а RTS40, который в наших исследованиях независимо наследовался с геном устойчивости к расе Е заразихи, показал дистанцию 14,1 сМ. Подобное несоответствие полученных нами результатов, вероятно, имеет ряд причин. В настоящее время практически невозможно получить популяцию заразихи, которая содержит только расу Е. В используемой нами популяции преобладала раса Е заразихи, но также было и небольшое количество более вирулентной расы F. Учитывая этот факт, принимали за устойчивые растения подсолнечника, имевшие не более чем 2–3 клубенька заразихи на корнях. Такие «промежуточные» по устойчивости F2 растения подсолнечника, по локусу ORS1036 с кодоминантным наследованием имели в основном гетерозиготный генотип (рис. 1). Но наличие более вирулентной расы в популяции в любом случае ведет к искажению расщепления. Следует также учитывать, что популяции с одинаковым расовым составом, но произрастающие в разных географически отдалѐнных местах, на самом деле различаются по своей вирулентности [21], что накладывает свой отпечаток на воспроизводимость генетических исследований, выполненных в разных странах. Также в работе Tang et al. [13] отмечено, что на расстояния между Or5 и ДНК-маркерами могут оказать влияние фенотипические ошибки, потому что оценка восприимчивого фенотипа как устойчивого при классификации приводит к увеличению класса рекомбинантных генотипов и искажает дистанции на генетической карте. Так, Солоденко и др. [22] определено сцепление кодоминантного RTS 29 маркера и локуса, контролирующего устойчивость подсолнечника к «молдавской» заразихе с частотой рекомбинации 20 сМ, тогда как в работе Lu et al. [12] сцепление локусов RTS 29 и Or5 – 25,7 сМ. На экспрессию доминантно наследуемых генов устойчивости в некоторых случаях также могут оказывать влияние еще неопознанные гены, экспрессия которых зависит от температуры и экологических факторов [23]. Локусы ДНК RTS05 и ORS1036, показавшие в наших исследованиях сцепленное наследование с геном Or5, могут в дальнейшем использоваться для маркирования гена устойчивости к расе Е зарази- хи в программах переноса селекционноценных признаков среди линий подсолнечника. Это облегчит и ускорит создание новых генотипов подсолнечника с заданными параметрами комплексной устойчивости к заразихе. Однако данные маркеры не являются внутригенными и не могут гарантировать абсолютной вероятности переноса признака устойчивости к расе Е заразихи. К преимуществам маркерного локуса ORS1036 можно отнести его кодоминантность, что является полезным свойством маркера в селекционных программах, позволяя выделять гетерозиготные организмы. Таким образом, в результате проведенных исследований, нами был маркирован ген устойчивости к расе Е заразихи в материале подсолнечника селекции ВНИИМК. Два локуса ДНК RTS05 и ORS1036 сцеплены с данным геном с частотой рекомбинации 0,10±0,04 и 0,12±0,04 соответственно. Использование данных маркеров открывает новые пути для селекционеров подсолнечника, заинтересованных в практическом применением маркер-опосредованной селекции. Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ, грант № 11-04-96502. Список литературы 1. Sukno, S. Inheritance of resistance to Orobanche cernua Loefl. in six sunflower lines / S. Sukno, J.M. Melero-Vara, J.M. Fernández-Martínez // Crop Sci. – 1999. – V. 39. – P. 674–678. 2. Fernández-Martínez, J.M. Update on breeding for resistance to sunflower broomrape / J.M. Fernández-Martínez, J. Domínguez, B. Pérez-Vich, L. Velasco // Helia. – 2008. – V. 31 – P. 73–84. 3. Vrânceanu, A.V. Virulence groups of Orobanche cumana Wallr. differential hosts and resistance sources and genes in sunflower / A.V. Vrânceanu, V.A. Tudor, F.M. Stoenescu, N. Pirvu // In: Proc. 9th Int. Sunfl. Conf., Torremolinos. – Spain. Int. Sunfl. Assoc., Paris. – 1980. – P. 74–80 4. Fernández-Martínez, J.M. Selection of wild and cultivated sunflower for resistance to a new broomrape race that overcomes resistance to Or5 gene / J.M. FernándezMartínez, J.M. Melero- J.M. Vara, J. Muñoz-Ruz, J. Ruso and J. Domínguez // Crop Sci. – 2000. – V. 40. – P. 550–555. 5. Vrânceanu, A.V. Some aspects of the interaction Helianthus annuus L. / Orobanche cumana Wallr. and its implications in sunflower breeding / A.V. Vrânceanu, N. Pirvu, F. Stoenescu, M. Păcureanu // In: S.J. Ter Borg (ed.), Workshop on Biology and Control of Orobanche. Wageningen, The Netherlands. – 1986. – P. 181–188. 6. Shindrova, P. Broomrape (Orobanche cumana Wallr.) in Bulgaria: Distribution and race composition / P. Shindrova // Helia. – 2006. – V. 29. – N.44. – P. 111–120. 7. Alonso, L.C. New highly virulent sunflower broomrape (Orobanche cernua Loefl.) pathotype in Spain / L.C. Alonso, J. Fernández-Escobar, G. López, M. Rodríguez-Ojeda, F. Sallago // In: Advances in Parasitic Plant Research. Proc. 6th Int. Symp. Parasitic Weeds. Córdoba, Spain. – 1996. – P. 639–644. 8. Akhtouch, B. Inheritance of resistance to race F of broomrape (Orobanche cumana Wallr.) in sunflower lines of different origin / B. Akhtouch, J. Muñoz-Ruz, J.M. MeleroVara, J.M. Fernández-Martínez, J. Domínguez // Plant Breed. – 2002. – V. 121. – P. 266–269. 9. Pacureanu Joita, M. Virulence and aggressiveness of sunflower broomrape (Orobanche cumana Wallr.) populations in Romania / M. Pacureanu Joita, S. Raranciuc, E. Sava, D. Stanciu, D. Nastase // Неlia. – 2009. – V. 32. – N. 51. – P. 111–118. 10. Антонова, Т.С. Вирулентность заразихи, поражающей подсолнечник, в Волгоградской и Ростовской областях / Т.С. Антонова, Н.М. Арасланова, С.А. Рамазанова, С.З. Гучетль, Т.А. Челюстникова // Масличные культуры: Науч.техн. бюл. ВНИИМК. – Краснодар, 2011. – Вып.1 (146–147). – С.127–130. 11. Domínguez, J. R-41, a sunflower restorer inbred line, carrying two genes for resistance against a highly virulent Spanish population of Orobanche cernua / J. Domínguez // Plant Breed. – 1996. – V. 115. – P. 203–204. 12. Lu, Y.H. Development of SCAR markers linked to the gene Or5 conferring resistance to broomrape (Orobanche cumana Wallr.) in sunflower / Y.H. Lu, J.M. MeleroVara, J.A. Blanchard // Theor. and. Genet. – 2000. – V. 100. – P. 626–632. 13. Tang, S. Genetic mapping of the Or 5 gene for resistance to Orobanche race E in sunflower / S.Tang, A. Heesacker, V.K. Kishore, A. Fernandez, E. Sadik, G. Cole, St. Knapp // Crop. Sci. – 2003. – V.43. – P.1021–1028. 14. Гундаев, А.И. Основные принципы селекции подсолнечника // Генетические основы селекции растений / А.И. Гундаев. – М.: Наука, 1971. – С.417–465. 15. Панченко, А.Я. Ранняя диагностика заразихоустойчивости при селекции и улучшающем семеноводстве подсолнечника / А.Я. Панченко // Вестн. с.-х. науки. – 1975. – № 2. – С.107–115. 16. Антонова, Т.С. Способ диагностики заразихоустойчивости подсолнечника. Авторское свидетельство N 676242 АО1Н 1/04, 1979. 17. Saghai-Maroof, M.A. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics / M.A. Saghai-Maroof, K.M. Soliman, R.A. Jorgensen, R.W. Allard // PNAS USA. – 1984. – 81. – P. 8014–8018. 18. Серебровский, А.С. Генетический анализ / А.С. Серебровский. – М.: Наука, 1970. – 342 с. 19. Гершензон, С.М. Основы современной генетики / С.М. Гершензон. – Киев: Наукова думка, 1979. – 508 с. 20. Гучетль, С.З. SSR и SCAR генотипирование коллекции отечественных селекционных образцов подсолнечника, устойчивых и восприимчивых к расе Е Оrobanche cumana Wallr. / С.З. Гучетль, Т.А. Челюстникова, Н.М. Арасланова, Т.С. Антонова // Масличные культуры: Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. – Краснодар, 2012. – Вып. 1 (150). – С. 20–26. 21. Fernandez-Martinez, J.M. Current research strategies for sunflower broomrape control in Spain / J.M. Fernandez-Martinez, ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (151–152), 2012 _____________________________________________ _________________________________________________________________________________ J. Dominguez, B. Perez-Vich, L. Velasco // Helia. – 2009. – V. 32. – N. 51. – P. 47–56. 22. Солоденко, А.Е. Маркирование гена устойчивости к заразихе Or3 у подсолнечника / А.Е. Солоденко, А.В. Саналатий, В.В. Толмачев, К.В. Ведмедева, Ю.М. Сиволап // Цитология и генетика. – 2005. – Т. 39. – № 5. – С. 9–12. 23. Honiges, A. Orobanche resistance in sunflower / A. Honiges, K. Wegmann, A. Ardelean // Helia. – 2008. – 31. – N. 49. – P. 1–12.
