Актуальность работы - Институт цитологии и генетики СО РАН
advertisement
На правах рукописи УДК 575.11:575.21:575.22:591.557:595.773.4 ИЛИНСКИЙ ЮРИЙ ЮРЬЕВИЧ ЭНДОСИМБИОНТ WOLBACHIA В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ DROSOPHILA MELANOGASTER СЕВЕРНОЙ ЕВРАЗИИ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2008 Работа выполнена в Лаборатории генетики популяций Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Захаров Илья Кузьмич Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Бугров Александр Геннадьевич доктор биологических наук, профессор Бородин Павел Михайлович Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва Защита диссертации состоится ___ ________ 2008 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090. тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан _____ Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук _________ 2008 г. А.Д. Груздев Актуальность работы Симбиотическая система «Drosophila melanogaster – Wolbachia» представляет исключительный интерес для эволюционной биологии и генетики, коэволюции на геномном, клеточном и организменном уровнях. Бактерия Wolbachia - это альфапротеобактерия, которая трансовариально (вертикально) передается в поколениях многих представителей членистоногих и некоторых нематод (Werren, 1997; Захаров, Марков, 2005; Захаров и др., 2008). Столь значительный эволюционный успех бактерии связывается со способностью индуцировать репродуктивные аномалии, направленные на распространение инфицированной цитоплазмы в популяции вида-хозяина, а также с приспособительным эффектом, дающим преимущество содержащим эндосимбионта некоторым видам-хозяевам, по сравнению с неинфицированными особями (Werren, 1997; Горячева, 2004; Mercot, Charlat, 2004). Для насекомых показано чрезвычайно высокое распространение симбиотических систем «вид-хозяин – Wolbachia»: предполагают, что могут быть инфицированы от 20 до 70 % видов насекомых (Werren et al., 1995; Hilgenboecker et al., 2008). Одной из главных особенностей бактерии является ее способность вызывать целый спектр репродуктивных аномалий у вида-хозяина, а именно: партеногенез, феминизацию генетических самцов, гибель самцов-потомков (андроцид) и цитоплазматическую несовместимость, биологическая роль которых заключается в распространении инфицированной цитоплазмы в популяции вида-хозяина (Turelli, Hoffmann, 1995; Горячева, 2004). Неизвестно, какие молекулярные механизмы вовлечены во взаимодействие Wolbachia и вида-хозяина? Знания в этой области могли бы прорыв в области контроля вредных и полезных насекомых, произвести серьезное продвижение в фармакологии, описать ряд феноменов эволюционных преобразований Artropoda. Изучение природных популяций Drosophila simulans и D. melanogaster Австралии, Северной Америки и экваториальной Африки показало широкое распространение эндосимбионта (Hoffmann, Turelli, 1988; Turelli et al., 1992; Hoffmann et al., 1994; Turelli, Hoffmann, 1995; Weeks et al., 2007). Популяции дрозофил Евроазиатского континента оставались малоизученными. Для завершения картины глобального распространения Wolbachia актуальным было изучение динамики и характера распространения бактерии в Североевразийских популяциях Drosophila melanogaster. Методический прогресс в геномике последнего десятилетия позволил выделить и классифицировать Wolbachia в соответствии с различиями в их генотипах (Sun et al., 2001, 2003; Riegler et al., 2005). Это, в свою очередь, позволило решать проблемы, связанные с генетическими аспектами симбиотических взаимодействий. Цели и задачи Целью исследования было охарактеризовать популяционную динамику, биологию и генетику симбиотической системы «Drosophila melanogaster-Wolbachia». В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи. 1. Описать инфицированность и представленность различных генотипов эндосимбионта Wolbachia (wMel, wMelCS и wMelCS2) в природных популяциях Drosophila melanogaster Северной Евразии в пространстве и во времени за четверть века. 2. Охарактеризовать фонд Лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН на присутствие Wolbachia и оценить факторы, определяющие инфицированность лабраторных линий. 3. Установить разнообразие митохондриальных гаплотипов для линий Drosophila melanogaster, инфицированных вертикально передающейся бактерией Wolbachia. 4. Оценить уровень цитоплазматической несовместимости у Drosophila melanogaster, индуцируемой различными генотипами Wolbachia. 5. Выяснить влияние различных генотипов Wolbachia на компоненты общей приспособленности вида-хозяина Drosophila melanogaster. Научная новизна В работе систематически изучена представленность эндосимбионта Wolbachia в природных популяциях Drosophila melanogaster Северной Евразии за четверть века. Показано широкое распространение и высокая концентрация инфицированности, выявлены три генотипа Wolbachia (wMel, wMelCS и wMelCS2). По статусу инфицированности и генотипическому составу Wolbachia охарактеризованы тестерные и мутантные линии фонда Лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН. Преимуществом нашей работы является то, что сравнивалась не Wolbachiaположительная и Wolbachia-отрицательная цитоплазма, а инфицированность цитоплазмы различными генотипами бактерии. Впервые описана эволюционная сопряженность митохондриального генома Drosophila melanogaster и эндосимбионта Wolbachia, что объясняет наблюдаемую мономорфность мтДНК популяций D. melanogaster (David, Capy, 1988; Hale, Singh, 1991; Solignac et al., 1994). Для генотипов wMel, wMelCS и wMelCS2 Wolbachia даны характеристики их способности индуцировать цитоплазматическую несовместимость и влиять на показатель выживаемости при различных температурных условиях у Drosophila melanogaster. Основные положения диссертации, выносимые на защиту 1. Практически во всех природных популяциях северной Евразии Drosophila melanogaster обнаруживается первичный эндосимбионт Wolbachia штамм wMel. Широко распространены три генотипа этого штамма, wMel, wMelCS и wMelCS2. 2. Полиморфизм митохондриальной ДНК Drosophila melanogaster зависит от определенных генотипов бактерии в изучаемой цитоплазме. Различные генотипы Wolbachia индуцируют сходный уровень цитоплазматической несовместимости (слабый или отсутствие действия) у своего вида-хозяина Drosophila melanogaster. Влияние бактерии на продолжительности жизни мух носит слабый и неоднозначный характер. Теоретическая и практическая значимость исследования Drosophila melanogaster является модельным объектом общей и молекулярной генетики, полученные нами результаты позволяют по-новому подойти к решению генетических аспектов симбиотических взаимоотношений. Обнаруженные сопряженные изменения митохондриальной ДНК и эндосимбионта Wolbachia позволяют рассматривать мтДНК Drosophila melanogaster в качестве модели микроэволюционных преобразований. Полученные результаты вносят вклад в популяционную и эволюционную генетику. Апробация работы Результаты работы были представлены на: 2-й школе молодых ученых «Экологическая генетика» (Санкт-Петербург, 2005); 10-й Пущинской школеконференции молодых учёных, посвященной 50-летию Пущинского НЦ РАН (Пущино, 2006); 4-й международной научной конференции «Проблема вида и видообразования» (Томск, 2006); конференции «Современные проблемы биологической эволюции», посвященной 100-летию Государственного Дарвиновского музея (Москва, 2007); международной конференции «Развитие эволюционной идеи в биологии, социологии и медицине», посвященной 90-летию со дня рождения академика Д.К. Беляева (Новосибирск, 2007); 20-м международном 2 генетическом конгрессе (Берлин, 2008); отчётных конференциях «Динамика генофондов растений, животных и человека» (Москва, 2005, 2006, 2007); отчётной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2006). Публикации По результатам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи – в научных журналах, в которых по требованию ВАК Минобрнауки России должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата наук по биологическим наукам. Объем и структура работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 154 страницах, включает 12 рисунков и 13 таблиц. Список цитируемой литературы включает 264 наименования. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Линии Drosophila melanogaster. Для анализа представленности и распространенности Wolbachia в евразийских популяциях Drosophila melanogaster в работе использовали самок как непосредственно отловленных из природы, так и из изосамочьих линий. Все линии содержатся в фонде Лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН. Всего было исследовано 730 образцов дикого типа из популяций Украины, Белоруссии, Молдавии, Кавказа, Средней Азии, Урала, Удмуртии, Алтая, Западной и Восточной Сибири, Дальнего Востока за период с 1974 по 2007 гг. Определен статус инфицированности 322 мутантных линий Drosophila melanogaster из фонда лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН. На основе локализации мутаций и истории создания линий были выделены группы: хромосома 1 – 106 линий, хромосома 2 – 68, хромосома 3 – 75, хромосома 4 – 5; мультихромосомная группа – 19, транслокации – 8, группа мутаций lethal giant larva 16, yellow – 25. В работе по выявлению ассоциации между генотипами Wolbachia и гаплотипами митохондриальной ДНК Drosophila melanogaster исследовано 48 линий из природных популяций северной Евразии и используемых в лабораториях; еще 4 образца привлечены из ранее опубликованных в GenBank (AF200828, AF200829, AJ400907 и NC001709). Рис.1. Схемы трех генотипов Wolbachia, обнаруживаемых в популяциях Drosophila melanogaster северной Евразии (по Riegler et al., 2005). 3 Генотипирование Wolbachia. В случае определения положительного статуса зараженности Drosophila melanogaster эндосимбионтом Wolbachia – наличие ДНК Wolbachia в пробе (Рис. 1), устанавливали генотип бактерии по вариабельным локусам, а именно – кратности повторов двух минисателлитных мотивов VNTR-141 и VNTR-105; вставки инсерционной последовательности IS5 в два локуса - WD0516/7 и WD1310; и инверсии WD0394-WD0541, где амплифицировались участки возможного разрыва хромосомы в случае инверсии (Riegler et al., 2005). Работа с ДНК. Выделение ДНК проводили общепринятым методом (Nylander, 2004) с модификациями. В пробирку с 1-4 самками Drosophila melanogaster добавляли 200 мкл экстрагирующего буфера, гомогенизировали и инкубировали при 56°С три часа. ДНК переосаждали и растворяли в 50 мкл бидистиллированной воды. Условия амплификации: 30 циклов; первичная денатурация 95°С 5 мин., затем 95°С 20 сек. в каждом цикле, элонгация 72°С 1мин./1 т.п.н., отжиг праймеров к гену wsp 57°C 1 мин., мультипраймерная реакция wsp-co1 и 16S rDNA 56°C 1 мин., и для остальных реакций 55°С 1 мин. Для определения нуклеотидной последовательности необходимые ампликоны выделяли из агарозного геля, используя набор фирмы «Promega» (California, USA). Секвенирование проводили в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН, г. Новосибирск, с использованием реактива Big Dye версии 3,1 и 1,1. Тест на цитоплазматическую несовместимость. Анализ цитоплазматической несовместимости Drosophila melanogaster проводился для отдельно взятой линии. Самку и самца одного возраста помещали в пробирку, содержащую стандартный корм. Постановка эксперимента производилась на третий день. Особей пересаживали в пустую пробирку, которую скрепляли с предметным стеклом (планшеткой), содержащей слой корма и суспензии живых дрожжей. Самец и самка содержались вместе, в случае гибели одной из особей опыт прекращали. Весь эксперимент проводили при +25°С. Каждые 24 часа планшетки с кормом заменялись на новые. На планшетках подсчитывалось количество эмбрионов, отложенных за сутки, затем, через 48 час. учитывалось количество невылупившихся яиц. Фактически в эксперименте учитывалась доля эмбриональных леталей, к которым относили эмбрионы, у которых не отмечалось появление личинок в течение 48 час. Для 3 из 4 исследуемых линий скрещивания ставились в 4-х возможных вариантах (контроль: A - 1♀w × 1♂w; B - 1♀T × 1♂T и D - 1♀T × 1♂w; опыт ЦН: C - 1♀w × 1♂T -), а для одной линии (w153) только в двух вариантах - серии В и С. Тест на продолжительность жизни. В эксперименте на продолжительность жизни Drosophila melanogaster использовали 7 изосамочьих линий, инфицированных Wolbachia, и 7 их производных, избавленных от бактерии. Опыт проводился при разных температурных режимах: при пониженной - +16°С, нормальной - +25°С, и повышенной - +29°С. Мух одного возраста мягко наркотизировали эфиром и помещали по 30 особей одного пола в пробирки, содержащие стандартный изюмный корм. В опыт брали по 150 самок и самцов. Наблюдения вели каждые трое суток до начала массовой гибели мух, и затем ежедневно - до полной гибели. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы MS EXCEL. Результаты тестов на компоненты общей приспособленности считали статистически значимыми при уровне p < 0,05. Работу с нуклеотидными последовательностями осуществляли с использованием программ: Finch TV, Vector NTI 10, ClustalW 1.83. Для поиска оптимальной модели эволюции митохондриальной ДНК использовали алгоритм 4 MrAIC.pl 1.4.3. Оптимальная модель эволюции ДНК в дальнейшем использовалась при реконструкции филогенетического дерева с помощью метода максимального правдоподобия, как входной параметр. При реконструкции филогенетического дерева использовали алгоритмы aLRT-PHYML 1.1 (Anisimova, Gascuel, 2006) и TREEPUZZLE 5.2 (Schmidt et al., 2002). В работе приведены филогенетические деревья наиболее достоверные по критерию максимального правдоподобия и ветвлению. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Инфицированность Wolbachia природных популяций Drosophila melanogaster северной Евразии При популяционном анализе (учитывались выборки, в которых исследовано не менее 8 линий) нами не было обнаружено ни одной природной популяции Drosophila melanogaster, которая была бы свободной от Wolbachia. В целом, уровень инфицированности изученных природных популяций Drosophila melanogaster варьировал от 15 до 100 %. Инфицированность эндосимбионтом Wolbachia во времени относительно постоянна. Можно отметить зависимость встречаемости инфицированной цитоплазмы от географической локализации популяции: более часто Wolbachia встречается в среднеазиатских - 64 %, и алтайских популяциях - 56 %, по сравнению с восточно-европейскими (Украины, Белоруссии, Молдавии) - 45 %. Определение генотипического разнообразия Wolbachia среди исследованных линий выявило присутствие трех из пяти известных генотипов (Riegler et al., 2005). Нам не удалось диагностировать какой-либо новый генотип ни по сочетаниям анализируемых маркеров, ни по их отдельным характеристикам. Среди зараженных линий Drosophila melanogaster наиболее распространенным был генотип Wolbachia – wMel, который встречается во всех выборках Riegler et al., 2005; Ilinsky, Zakharov, 2006; Илинский, Захаров, 2007) и составляет: для популяций Украины - 99 % (в целом по восточно-европейскому региону 96 %), Алтая - 72 % и Средней Азии - 80 %. Другие регионы представлены немногочисленными выборками и отдельными линиями. Так, Восточно-Сибирская выборка в нашем исследовании представлена популяцией Улан-Удэ 2005 г. Из 26 проанализированных изосамочьих линий Drosophila melanogaster 9 оказались свободными от Wolbachia и 17 были инфицированы генотипом wMel. Одна линия - Владивосток 1982, и пять линий из популяций Drosophila melanogaster европейских стран (Болгария 1986; ГДР 1988 и 1989; Польша 1992) оказались свободными от Wolbachia. В наших исследованиях Кавказский регион представлен не столь обширно. В основном у мух обнаруживалась либо неинфицированная цитоплазма, либо Wolbachia генотипа wMel. Интересной оказалась проанализированная нами выборка Сочи 2004, которая характеризовалась, во-первых, тотальной зараженностью и, во-вторых, гетерогенностью по представленным генотипам Wolbachia (wMel и wMelCS2). В выборках популяций или в отдельных линиях дикого типа различных регионов - Восточной Европы и Кавказа, мы не зарегистрировали присутствие широко распространенного в популяциях мира генотипа wMelCS. Только при исследовании инфицированности фонда мутантных линий, в линии 2-95, полученной из популяции Умань 1991, удалось обнаружить этот генотип. Подтверждают этот результат данные, полученные на основе изучения сопряженности митотипов и Wolbachia. Среди неинфицированных линий популяции Умани, при определении нуклеотидной 5 последовательности мтДНК, обнаружились митотипы, свойственные для генотипа wMelCS. Выборки популяций Drosophila melanogaster Среднеазиатского и Алтайского региона обнаруживают сходство по характеру инфицированности (Табл. 1). Вопервых, концентрация инфицированной цитоплазмы высокая - 64 и 56 % соответственно по регионам; во-вторых, большинство популяций гетерогенно по генотипам Wolbachia - одновременно встречаются генотипы wMel и wMelSC2. Для трех популяций отмечен генотип - wMelCS (Ташкент, Поспелиха и Бийск). Это может объясняться относительной территориальной близостью популяций. Таблица 1. Инфицированность Wolbachia природных популяций Drosophila melanogaster трех наиболее представленных регионов. Регион Украина Средняя Азия Алтай Число неинфицированных линий 185 59 69 Число инфицированных линий wMel wMelCS wMelCS2 135 0 3 77 2 19 61 5 20 По-видимому, генотип wMelCS2 произошел от генотипа wMelCS в среднеазиатских популяциях Drosophila melanogaster. На это указывает тот факт, что wMelCS2 не выявлялся в других регионах мира (Riegler et al., 2005), тогда как в нашей работе wMelCS2 наиболее часто обнаруживается именно в этом регионе. Гетерогенность по генотипам Wolbachia в Среднеазиатских и Алтайских популяциях, возможно, объясняется более высокой экологической сложностью условий существования мух по сравнению с Украиной. Дополнительно к этому, надо учесть, что популяции Средней Азии и Алтая значительно более изолированы друг от друга, чем популяции Украины, вследствие ландшафтно-топографических особенностей этих регионов. Мы по-прежнему не знаем механизма распространения и поддержания бактерии в популяциях Drosophila melanogaster: осуществляется ли это за счет паразитической манипуляции бактерией репродуктивной системы хозяина, или отбор инфицированной цитоплазмы происходит вследствие мутуалистичного действия Wolbachia, или же имеют действие обе формы взаимоотношений? Кроме того, неизвестно, какое влияние оказывают условия окружающей среды на характер взаимоотношений между бактерией и Drosophila melanogaster? Последнее, возможно, имеет решающее значение в формировании репродуктивного преимущества инфицированной цитоплазмы. Инфицированность и генотипическое разнообразие Wolbachia в мутантных линиях, длительно поддерживающихся в лабораторных условиях Мы охарактеризовали мутантные линии Drosophila melanogaster фонда лаборатории генетики популяций СО РАН по статусу инфицированности эндосимбионтом Wolbachia. Скрининг лабораторных фондов Drosophila melanogaster проводился и прежде (Clark et al., 2005), однако информативность такого анализа оказывалась довольно низкой. Сказывалась ограниченность получаемой информации, а именно, отсутствие возможности генотипировать Wolbachia и, как следствие, не 6 представлялось возможным проследить генетические связи инфицированной и неинфицированной цитоплазмы. Общая доля инфицированных Wolbachia мутантных линий фонда лаборатории генетики популяций Drosophila melanogaster ИЦиГ СО РАН составила 37 % (Таблица 2). При сравнении инфицированности внутри групп, наиболее зараженной Wolbachia оказалась группа «хромосомы-2» – 51 %, для групп «хромосома-1» и «3» – этот показатель не превышал 30 %. Таблица 2. Сводная таблица по определению статуса инфицированности Wolbachia линий Drosophila melanogaster фонда Лаборатории генетики популяций Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск). Группа мутантных линий Исследовано линий Число инфицированных линий генотипы Wolbachia wMel wMelCS2 wMelCS всего Хромосома 1 105 5 23 2 30 Хромосома 2 68 16 17 2 35 Хромосома 3 75 17 1 3 21 Хромосома 4 5 1 2 0 3 Транслокации 8 1 0 1 2 Мультихромосомная 19 1 3 3 7 yellow 25 12 2 0 14 lethal giant larva 17* 1 8 0 9 Всего 322 54 56 * одна линия включена в состав группы «хромосома 2» 11 120 Как и в случае с линиями дикого типа из природных популяций, среди мутантных линий было обнаружено три генотипа Wolbachia: wMel, wMelCS и wMelCS2, какихлибо новых форм по набору анализируемых маркеров обнаружено не было. Внутри основных групп (хромосомы 1, 2 и 3) обнаружились характерные черты по статусу инфицированности, которые находят свое объяснение в истории создания самих линий. Так, большинство неинфицированных линий группы «хромосома-1», несущих конструкцию «C(1)DX, y w f», связано с тем, что в качестве ее донора при создании линии используются самки неинфицированной линии 1-163. Следовательно, все потомство от такого скрещивания должно быть неинфицированным. Мы не обнаружили фактов, которые могли бы указывать на случаи отцовской передачи Wolbachia через цитоплазму спермия, хотя такие случаи известны (Turelli et al., 1992; Hoffmann et al., 1998). Частое обнаружение генотипа wMelCS2 в группе «хромосома-1» связано, прежде всего, с линией, являющейся донором хромосом Basc (Muller 5). Эта хромосома, также как и конструкция «сцепленные X-хромосомы», используется для поддержания в генетической коллекции определенных X-хромосом. Линия Muller 5 оказалась инфицированной генотипом Wolbachia wMelCS2. Кроме того, для ряда линий удалось выяснить историю их создания. В некоторых случаях обнаруживалась цитоплазма, 7 инфицированная генотипом wMelCS2, но хромосомы Basc не было. Выяснилось, что для многих таких линий в истории их создания все же использовалась линия Muller 5. Однако, некоторые линии, несмотря на наличие хромосомы Basc, оказались свободными от Wolbachia. Объяснение данного феномена может быть разным, вопервых, технически возможно (в отличие от метода «сцепленных Х-хромосом») в качестве донора брать самца Basc / Y. Во-вторых, в фонде есть неинфицированные линии 1-123 и 1-125, которые могли быть использованы как доноры хромосомы Basc. Наконец, в-третьих, возможна потеря эндосимбионта в ряду поколений культивирования линий. Высокая доля инфицированности группы «хромосома-2» генотипом wMelCS2 также связана с историей создания линий. Линия 2-23 (L2 / In(2LR) Cy cn) - носитель генотипа Wolbachia wMelCS2, часто используется для выделения хромосомы 2. Кроме нее также используется неинфицированная линия «1» из мультихромосомной группы. Содержащаяся в генетической конструкции «In(2LR) Cy cn» доминантная мутация Curly (загнутые крылья) используется как фенотипический маркер и входит в состав многих других генетических конструкций (SM1, SM5, SM6 и другие). Поэтому возникают серьезные трудности в установлении родословной линии, если не известно, с какой именно линией она скрещивалась. В группе «хромосома-3» большинство линий неинфицировано. Это, скорее всего, объясняется тем, что для изогенизации хромосомы-3 обычно используются две неинфицированные линии - «3-13» D In(3LR)/Sb и «1» Cy/L2; D/Sb из мультихромосомной группы. Среди инфицированной цитоплазмы преобладает самый распространенный в природе генотип Wolbachia – wMel. Возможность потери эндосимбионта в течение длительного периода культивирования может рассматриваться для целого ряда изучаемых нами линий (237 и 280; группы «хромосома-2», «lethal giant larvae»). В то же время, для них есть вероятность другого объяснения наблюдаемых различий в инфицированности, в частности, скрещивание с другими линиями фонда, которое могло быть не отмечено в записях по истории линий. Однако факты, для которых хорошо прослеживается родословная цитоплазмы по наследованию генотипа wMelCS2, говорят в пользу стабильного существования Wolbachia у хозяина Drosophila melanogaster в лабораторных условиях. Сопряженная изменчивость генотипов Wolbachia и гаплотипов митохондриальной ДНК Drosophila melanogaster Передача Wolbachia от одной особи-хозяина к другой осуществляется вертикально по материнскому типу: от самки через инфицированную цитоплазму ооцита к потомству. Следует ожидать, что мтДНК особей, инфицированных разными генотипами Wolbachia, может иметь разную эволюционную историю. Для выявления нуклеотидных отличий по генам цитохромоксидазы С первой и третьей субъединиц, АТФазы шестой и восьмой субъединиц, а также трём транспортным РНК, в работе мы использовали охарактеризованные по эндосимбионту Wolbachia линии Drosophila melanogaster (Илинский, Захаров, 2007). Были взяты линии, имеющие происхождение из географически удаленных популяций D. melanogaster, а именно: Кавказа, Средней Азии, Украины и Алтая, инфицированные тремя разными генотипами Wolbachia: wMel, wMelCS и wMelCS2, а также ранее опубликованные последовательности митохондриальных геномов D. melanogaster. 8 Ассоциации между гаплотипами Drosophila melanogaster и Wolbachia (присутствием / отсутствием бактерии) ранее выявлено не было. Изучаемый митохондриальный полиморфизм не обнаруживал корреляции между инфицированными и неинфицированными особями (Solignac et al., 1994). Преимуществом нашей работы является то, что сравнивались не Wolbachiaположительная и Wolbachia-отрицательная цитоплазма, а её инфицированность разными генотипами бактерии. Это позволило выявить сопряженность наследования Wolbachia и митохондриального генома D. melanogaster (Ilinsky, Zakharov, 2006; Илинский, Захаров, 2007). Обнаруженный полиморфизм по двум сайтам гена первой субъединицы цитохромоксидазы С продемонстрировал четкую корреляцию для трех генотипов Wolbachia (Илинский, Захаров, 2007). Митотип «СТ» встречался только с генотипом wMel, «СС» - с wMelCS2, а «TС» с wMelCS (Табл. 3). При этом для неинфицированных линий мы также выявили существование таких митотипов в популяциях и, можно сказать, что их встречаемость пропорциональна распространенности генотипов Wolbachia, с которыми они ассоциированы. Так митотип «CT» среди неинфицированных особей встречается наиболее часто, при этом генотип wMel доминирует повсеместно в популяциях Drosophila melanogaster. Дальнейшая детализация, привлечение данных нуклеотидной последовательности мтДНК по другим генам и построение филогенетических древ по этим данным подтвердили результаты, полученные при описании полиморфизма по гену co1. Таблица 3. Инфекционный статус и гаплотипическое разнообразие гена COX1 митохондриальной ДНК Drosophila melanogaster (Илинский, Захаров, 2007). Гаплотип мтДНК D. melanogaster Число неинфицированных линий Число линий с известным статусом зараженности и генотипом бактерии Wolbachia wMel wMelCS2 wMelCS CT 14 18 0 0 CC 3 0 6 0 TC 2 0 0 4 Анализ филогенетических деревьев, отражающих эволюцию мтДНК, обнаружил существование двух главных клад, которым соответствуют цитоплазма, инфицированная генотипами Wolbachia – wMel и wMelCS/wMelCS2. При этом кластеризация митотипов не зависела от времени и географии происхождения анализируемых линий (см. Рис. 2). Из 4-х неинфицированных линий, для которых была определена последовательность размером 1280 п.н., две кластеризовались с линиями, инфицированными генотипами wMel, и две - с wMelCS. Мы не случайно взяли эти линии. При исследовании полиморфизма по гену co1, для них были определены митотипы «СТ» и «ТС», что соответствовало инфицированности генотипами Wolbachia wMel и wMelCS. Мы проверили, будут ли у случайных неинфицированных линий митотипы отличаться от приведенных нами в представлении сонаследования с Wolbachia? Полученный результат свидетельствует, что в популяциях Drosophila 9 335 Чемал 2003 (wMel) Bi90 Бишкек 2004 ( wMel) 3110 Умань 2003 (wMel) U4 Умань 2004 (wMel) 100 Z53 Зимбабве1990 GB:AF200829(wMel ?) 100 s400 Сочи 2004 ( wMel) 100 Harwich США 1967 (wMelH; wMel) Paris Париж 1952 GB:AJ400907(w ?) w75 Гомель 1980 ( wMelCS2) w109 Кишинев 1984 (wMelCS2) 74 w181 Тбилиси 1989 (wMelCS2) 2-23 Лаб. линия (wMelCS2) Oregon-R США1925 GB:AF200828 (wMelCS?) 100 99 w[1118] Лаб. линия ( wMelPop; wMelCS) 921189 Бийск 1989 (wMelCS) 54 78 w153 Ташкент 1989 (wMelCS) Oregon-R США1925 GB:NC001709 (wMelCS?) Рис. 2. Филогенетическое дерево митохондриальной ДНК Drosphila melanogaster для 2757 п.н., построенное методом максимального правдоподобия (TREE-PUZZLE 5.2). Приведены значения бутстрепа, указано название, происхождение и статус инфицированности линий. Некоторые отводки линии Oregon-R возможно сохранили инфицированность, генотип wMelCS, по данным GenBank и (Lewis et al., 1995) AF200828- и NC001709-последовательности принадлежат линии Oregon-R; Линия w1118 инфицирована штаммом Wolbachia wMelPop, генотипический профиль wMelCS; Линия Z53 инфицирована Wolbachia предположительно wMel-генотипа GenBank AF200829; Wolbachia, обнаруженная в линии Harwich, в некоторых работах обозначалась как штамм wMelH (Sun et al., 2003; Paraskevopoulos et al., 2006), генотипический профиль - wMel; Линия Paris, статус инфицированности неизвестен, GenBank AJ400907 (Azou, Bregliano, 2001). 10 melanogaster существуют и, возможно, в значительных концентрациях митотипы, сходные с митотипами инфицированных особей (Табл. 3 и Рис. 2). В соответствии с представлением ускорения фиксации новых мутаций и появлением новых гаплотипов под воздействием Wolbachia, такие линии, по-видимому, относительно недавно утратили бактерию. Наименьшей изменчивостью обладала мтДНК, ассоциированная с генотипом wMelCS2, что говорит в пользу его происхождении от wMelCS. Дополнительно в пользу этого свидетельствуют факты: (1) более широкое распространение в мире генотипа wMelCS (Riegler et al., 2005) и (2) характер отличия по анализируемым маркерам: разница для этих генотипов заключается в большей повторенности минисаттелита VNTR105 у генотипа wMelCS2 по сравнению с wMelCS (см. Рис. 1). Разнообразие мтДНК, ассоциированной с генотипами wMel и wMelCS, значительно выше, чем у wMelCS2, и это не зависит от географии и времени выделения из природы линии. Так, инфицированная генотипом wMel линия s400, которая была выделена из популяции Сочи 2004, по нуклеотидной последовательности мтДНК (2757 п. н.) оказалась идентична линии африканского происхождения Z53, Зимбабве 1990 г. Собственно, считается, что этот регион является центром происхождения Drosophila melanogaster (David, Capy, 1988). Из литературы известно, что линия Z53 инфицирована Wolbachia (Fry et al., 2004), и у нас есть все основания предполагать, что это генотип wMel. Линии U4, 335 и Bi90, инфицированные генотипом wMel, оказались идентичны друг другу по мтДНК - 2757 п.н., между тем, происхождение этих линий разное. Данных по инфицированности линии Paris, созданной в 1952 году из популяции г. Париж, у нас нет. Но на основе нуклеотидной последовательности мтДНК, опубликованной в GenBank AJ400907, мы предполагаем, что эта линия либо инфицирована генотипом wMel или каким-нибудь близким ему генотипом, либо существовала инфицированность этой цитоплазмы в недалеком эволюционном прошлом. Штамм Wolbachia – wMelPop, которым инфицирована линия w1118, по диагностическим маркерам генотипируется как wMelCS. Нуклеотидная последовательность мтДНК этой линии идентична опубликованной ранее последовательности митохондриального генома линии OregonR GenBank 200828. Здесь следует отметить, что опубликована и другая последовательность, которая относится к линии Oregon-R (Lewis et al., 1995) GenBank NC001709. Обе эти последовательности попадают в кладу, характерную для сонаследования с генотипом Wolbachia – wMelCS. Влияние эндосимбионта Wolbachia на компоненты общей приспособленности Drosophila melanogaster Распространение и поддержание в популяции вида-хозяина Wolbachia осуществляется посредством воздействия эндосимбионта на репродуктивную систему, в частности, проявляется в виде ЦН, андроцида, партеногенеза и феминизации самцов. Для некоторых видов, включая и Drosophila melanogaster, выраженность ЦН, опосредованной бактерией, варьирует. Для большинства случаев отмечается либо отсутствие, либо слабое проявление ЦН (Hoffmann et al., 1994, 1998; Min, Benzer, 1997; Fry et al., 2004; Harcombe, Hoffmann, 2004). Высокий уровень несовместимости удавалось показать только в отдельных экспериментах при особых условиях (Reynolds, Hoffmann, 2002; Mercot, Charlat, 2004; Yamada et al., 2007). Если высокие частоты инфицированности популяций объясняются не ЦН, то гипотетически должны существовать другие механизмы, представляющие собой 11 выгодные для вида-хозяина условия симбиоза, возможно, такие как увеличение плодовитости, стрессоустойчивости, выживаемости (Turelli, 1994; Hoffmann et al., 1998; Mercot, Charlat, 2004). Единого мнения о механизмах поддержания и распространения эндосимбионта Wolbachia в популяции Drosophila melanogaster нет. Исходя из вышеизложенного, мы попытались выяснить, во-первых, есть ли отличия в уровне ЦН, индуцируемой тремя генотипами Wolbachia, и, во-вторых, существует ли влияние на продолжительность жизни мух с разным цитоплазматическим статусом при разных температурных режимах. Тест на цитоплазматическую несовместимость В своем эксперименте мы поставили задачу оценить способность индукции эмбриональной смертности для трех генотипов Wolbachia - wMel, wMelCS и wMelCS2. Данные о способности Wolbachia вызывать цитоплазматическую несовместимость у Drosophila melanogaster достаточно противоречивы, и они получены в общем как для Wolbachia штамма wMel, без разделения на генотипы. В результате нам удалось выявить достоверно повышенный уровень эмбриональной смертности в варианте «цитоплазматическая несовместимость» (С) по сравнению с контролем для линии Bi90 (p < 0,05). Для трех других линий значения варианта «С» были повышенными, но не превышали контрольные варианты. Таким образом, оценка уровня эмбриональной смертности (Табл. 4), опосредованного Wolbachia, демонстрирует либо низкий уровень (Bi90), либо ее отсутствие. Эти результаты согласуются с ранее известными данными о слабом проявления ЦН у Drosophila melanogaster (Hoffmann et al., 1994, 1998; Min, Benzer, 1997; Fry et al., 2004; Harcombe, Hoffmann, 2004). Несмотря на то, что генотипы Wolbachia wMel и wMelCS/2 дивергировали относительно давно, по уровню и характеру опосредуемой ими ЦН они сходны. Возможно, что репродуктивная манипуляция все же имеет бόльшую роль, чем ей ранее отводилось (Hoffmann et al., 1994, 1998; Poinsot et al., 1998; Mercot, Charlat, 2004). В умеренных широтах, после холодного периода года численность популяции сильно сокращается - эффект «бутылочного горлышка». Возможно, что определенные генотипы, взаимодействуя с Wolbachia, имеют некие преимущества и, таким образом, бактерия получает распространение в популяции хозяина. Среди таких преимуществ могут быть и ЦН, обеспечивающая репродуктивный успех инфицированным самкам, и повышенная продуктивность инфицированных особей по сравнению с неинфицированными, и более высокая устойчивость к абиотическим или биотическим условиям среды и, как следствие, более высокая продолжительность жизни и пролонгированный репродуктивный период. Тот факт, что именно устойчивость или повышенная репродуктивность в связи с Wolbachia в явном виде не обнаружена для Drosophila melanogaster, может говорить, что для этого вида реализуется несколько стратегий и сценариев. Биологические эффекты Wolbachia могут также определяться динамикой частот определенных генов в популяции хозяина, которые влияют на плотность бактерии в клетке (Hurst et al., 2000; Noda et al., 2001; Ikeda et al., 2003; Duron et al., 2006). Известно, что в зависимости от бактериальной плотности Wolbachia в клетках и тканях хозяина наблюдаются различия в физиологическом проявлении бактерии, ЦН, выживаемости (Breeuwer, Werren, 1993; Sinkins et al., 1995; McGraw et al., 2002). 12 Продолжительность жизни линий Drosophila melanogaster, инфицированных различными генотипами Wolbachia Продолжительность жизни является одним из ключевых приспособительных признаков, который может характеризовать «силу генотипа», репродуктивный потенциал, устойчивость к биотическим и абиотическим факторам среды. Так, согласно литературным источникам, репродуктивный период для самцов составляет 20-50 дней (Duncan, 1930; Керкис, Таблица 4. Уровень эмбриональной смертности 1935) и 30-80 для самок (Hanson, во внутрилинейных скрещиваниях линий 335 1929; Gowen, Jonson, 1946). Самка, [wMel], Bi90 [wMel], w181 [wMelCS2], w153 при этом, может оставить до 3 тыс. потомства, а самец до 14 тыс. [MelCS]. (Hanna-Alava, 1965). При температуре +25°С Серия Число Доля максимальный срок жизни мух эксперимента* эмбрионов эмбриональной составил 107 дней, такие значения смертности были отмечены для самок Bi90T и 335 [wMel] 335Т. Наименьшие значения, А (контроль) 4468 0,030 ± 0,006 кроме контрольной линии w1118, В (контроль) 5170 0,040 ± 0,006 отмечаются для линии w153 – 64С (ЦН) 3520 0,075 ± 0,015 65 дня, равно как для D (контроль) 3861 0,028 ± 0,005 инфицированных, так и для Bi90 [wMel] неинфицированных вариантов А 2651 0,040 ± 0,012 опыта. Для сублинии w153T как В 2477 0,011 ± 0,003 при +25°С, так и при +29°С С (ЦН) 2699 0,109 ± 0,019 наблюдалось превышение средней D 5716 0,019 ± 0,004 продолжительности жизни самцов w181 [wMelCS2] над самками. Наоборот, самцы А 5453 0,042 ± 0,024 линии w75, как инфицированные, В 5247 0,049 ± 0,011 так и неинфицированные, С (ЦН) 5143 0,057 ± 0,018 превосходили по средней D 4469 0,035 ± 0,014 продолжительности жизни самок. w153 [MelCS] Максимальное и среднее значение В 4311 0,048 ± 0,010 продолжительности жизни С (ЦН) 5865 0,107 ± 0,020 «вылеченных» тетрациклином самок U4 превосходило инфицированных (Рис. 3). Достоверные отличия по продолжительности жизни отмечены для самцов линии Bi90, средняя продолжительность жизни вылеченных самцов превосходила инфицированных почти на 10 дней. При повышенной температуре +29°С максимальная продолжительность жизни для линий - Bi90, U4, 335, w181, w75 и w153, в основном, не превышала 53 дней. Минимальное значение, если не учитывать контрольную линию w1118, отмечено для инфицированных самок линии w153 – 30 дней, и для неинфицированных самок w181T – 31 день. В целом, для большинства линий средняя продолжительность жизни самок превосходит или не отличается от средней продолжительности жизни самцов. Средняя продолжительность жизни инфицированных самок в линиях Bi90-wMel и w181-wMelCS2 и самцов U4-wMel при температуре +29ºС достоверно превышала свободные от Wolbachia (p < 0.05). А самцы w153-wMelCS жили меньше чем их неинфицированные братья. 13 äí è äî ëÿ æèâû õ 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 äí è 20 30 40 50 60 70 80 90 100 äî ëÿ æèâû õ б) a) Рис. 3. Динамика выживаемости имаго Drosophila melanogaster. Белые квадраты сублиния избавленная от Wolbachia, черные треугольники - сублиния инфицированная Wolbachia. a) самцы U4 при t +25ºС (Умань 200 4г. Wolbachia wMel); б) самки U4 при t +25ºС. При пониженной температуре, +16ºС, в эксперименте участвовало только три линии, инфицированных наиболее распространенным генотипом Wolbachia wMel, и линия w1118, инфицированная штаммом wMelPop, для которой отмечалась только максимальная продолжительность жизни. Максимальная продолжительность жизни была зарегистрирована для имаго Bi90, при этом она превысила полугодовой рубеж, и составила для самцов Bi90T 230 дней. Наименьшая продолжительность жизни при пониженной температуре зафиксирован для линии w1118 109 дней. Отличие в зависимости от статуса инфицированности отмечено только для самок линии Bi90, которые жили дольше неинфицированных. В наших экспериментах мы не выявили ярко выраженных отличий между инфицированными и неинфицированными сублиниями, но все же зафиксировали в некоторых случаях статистически достоверные отличия между ними, что может говорить о влиянии цитоплазматического фона на такой важный и сложный признак общей приспособленности как выживаемость. Тот факт, что некоторые линии Drosophila melanogaster при разных температурных режимах обнаруживали отличия в характере реакций, может указывать на неоднозначность симбиотических взаимоотношений. Это, опять же, говорит о существовании и реализации нескольких сценариев взаимоотношений симбиотической системы «Drosophila melanogasterWolbachia». 14 ВЫВОДЫ 1. Скрининг инфицированности эндосимбионтом Wolbachia природных популяций Drosophila melanogaster Северной Евразии за более чем двадцатилетний период выявил повсеместное её распространение при концентрациях от 15 до 100 %. Не обнаружено ни одной природной популяции Drosophila melanogaster свободной от Wolbachia. Отмечены различия среднего уровня встречаемости инфицированной цитоплазмы в популяциях по регионам: в восточно-европейских (Украины, Белоруссии, Молдавии) - 45 %, в алтайских - 56 %, в среднеазиатских - 64 %. Выявлено существование гетерогенности по трем генотипам (wMel, wMelCS и wMelCS2) эндосимбионта Wolbachia в популяциях Drosophila melanogaster. 2. Результаты скрининга фонда Drosophila melanogaster Лаборатории генетики популяций ИЦиГ СО РАН указывают на то, что, во-первых, инфицированность зависит от происхождения и генеалогии линии, во-вторых, бактерия стабильно поддерживается в длительном ряду поколений ведения культуры. 3. Сравнительный анализ геномного полиморфизма мтДНК Drosophila melanogaster, инфицированных тремя различными генотипами Wolbachia, позволил выявить сопряженность гаплотипов митохондрий с конкретными генотипами Wolbachia и построить филогенетическое древо мтДНК с двумя главными ветвями, соответствующими генотипам wMel и wMelCS/wMelCS2 Wolbachia. 4. Не обнаружено четких отличий по силе индукции цитоплазматической несовместимости тремя генотипами Wolbachia у Drosophila melanogaster: для одной линии, инфицированной генотипом wMel, показана слабая индукция цитоплазматической несовместимости, а для трех других достоверных отличий выявлено не было. 5. Обнаруженные различия в тесте на продолжительность жизни Drosophila melanogaster при инфицированности эндосимбионтом Wolbachia в вариантах эксперимента указывают на слабое и неоднозначное влияние бактерии на продолжительность жизни имаго при разных температурных режимах. 15 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Васильева Л.А., Кикнадзе И.И., Киселёва Е.В., Гундерина Л.И., Истомина А.Г., Голыгина В.В., Ваулин О.В., Воронин Д.А., Илинский Ю.Ю., и др.. Механизмы генетической изменчивости популяций и видов Diptera // Динамика генофондов растений, животных и человека. Отчётная конференция. Москва. 2005. С. 35-36. 2. Илинский Ю.Ю. Эндосимбионт Wolbachia в популяциях Drosophila melanogaster Евразии // Биология - наука 21 века. 10-я Пущинская школаконференция молодых учёных, посвященная 50-летию Пущинского НЦ РАН. Пущино, 17-21 апреля 2006 г. Сборник тезисов. – Пущино: Пущинский научный центр РАН. 2006. С. 192. 3. Ilinsky Yu.Yu., Zakharov I.K. Genetic correlation between types of mtDNA of Drosophila melanogaster and genotypes of its primary endosymbiont, Wolbachia // Drosophila Inform. Serv. 2006. No. 89. P. 89-91. 4. Ilinsky Yu.Yu., Zakharov I.K. Wolbachia in populations of Drosophila melanogaster // Drosophila Inform. Serv. 2006. No. 89. P. 91-92. 5. Захаров И.К., Кикнадзе И.И., Киселёва Е.В., Гундерина Л.И., Ваулин О.В., Синянский Я.Я., Илинский Ю.Ю., и др. Механизмы генетической изменчивости популяций и видов Diptera: Разнообразие геномов // Программа фундаментальных исследований РАН. № 11. “Биоразнообразие и динамика генофондов”. Подпрограмма 2. “Динамика генофондов”. Сб. материалов. – М: ФИАН. 2006. С.26-28. 6. Илинский Ю.Ю., Захаров И.К. Характеристика инфицированности цитоплазматическим эндосимбионтом Wolbachia популяции Drosophila melanogaster Умани // Доклады Академии наук. 2007. Т. 413. № 4. С. 561-563. 7. Илинский Ю.Ю., Захаров И.К. Эндосимбионт Wolbachia в евразийских популяциях Drosophila melanogaster // Генетика. 2007. Т. 43. № 7. С. 905-915. 8. Илинский Ю.Ю., Захаров И.К. Коэволюция эндосимбионта Wolbachia и митохондриального генома Drosophila melanogaster / Материалы конф. “Современные проблемы биологической эволюции”. К 100-летию Государственного Дарвиновского музея. 2007. Москва. - М.:Изд-во ГДМ. 2007. С. 177-178. 9. Захаров И.К., Киселёва Е.В., Илинский Ю.Ю. и др. Механизмы генетической изменчивости популяций и видов Diptera: Взаимодействия генетических и средовых факторов // Программа фундаментальных исследований РАН. № 11. “Биоразнообразие и динамика генофондов”. Подпрограмма 2 “Динамика генофондов”. Материалы отчётной конференции, посвящённой памяти академика Ю.П. Алтухова. – Москва. 2007. С. 39-40. 10. Захаров И.К., Ваулин О.В., Илинский Ю.Ю Синянский Я.Я., Коромыслов Ю.А., Коваленко Л.В., Иванников А.В., Захаренко Л.П., Волошина М.А., Чересиз С.В., Юрченко Н.Н.. Источники генетической изменчивости в природных популяциях Drosophila melanogaster // Информационный вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. № 1/2. С. 112-126. 11. Ilinsky Y., Koromyslow Y., Zakharenko L., Erokhina I., Yurchenko N., Zakharov I. Genetic instability in natural population of Drosophila melanogaster // XX Internationa Congress of Genetics. Abstract Book. Berlin, Germany, 2008. – Berlin. 2008. P. 196. 16