МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ Кафедра биологии почв
advertisement
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ Кафедра биологии почв Влияние температурного фактора на биологическую активность бактериальных сообществ формирующихся Антарктических почв Выпускная квалификационная работа студента 4 курса Синченко Д.С. Руководители работы: к.б.н. Соина В.С. к.б.н. Якушев А.В. МОСКВА 2014 Содержание работы Глава 1. Обзор литературы 1.1.Особенности почвообразования в условиях континентальной Антарктики. 1.2.Жизнеспособные бактерии в антарктических почвах и мерзлых осадках. 1.3.Биохимические исследования арктических и антарктических почв и осадков. 1.4.Факторы, оказывающие влияние на сохранение жизнеспособности бактериальных клеток в условиях замораживания- оттаивания. 1.5.Комплексный структурно функциональный метод характеристики микробных популяций. Глава 2. Экспериментальная часть. 2.1. Объекты и методы. 2.2. Результаты и обсуждение 2.2.1. Общая численность бактерий и динамика восстановления роста бактерий в процессе оттаивания образцов почв. 2.2.2. Число культивируемых клеток в условиях циклов замораживанияоттаивания. 2.2.3. Динамика активности каталазы и дегидрогеназы в разные сроки после оттаивания образцов почв. 2.2.4. Сравнительный морфологический анализ культивируемых бактерий при замораживании – оттаивании. 2.2.5. Функциональное разнообразие бактериальных сообществ. 2 Введение С недавнего времени ведутся интенсивные микробиологические исследования почв оазисов Восточной Антарктиды, которые характеризуются полным отсутствием таких важных почвообразователей и источников гумуса, как сосудистых растений с развитой корневой системой, за исключением бриофитов, имеющих очень ограниченное распространение. Согласно современным представлениям, большая часть исследуемой территории представляет собой снежниковую криптогамную пустошь, где развиваются цианобактерии, реже хлорофиты и лишайники, либо пустошь, в которой отсутствуют первичные продуценты и развиваются бактериальные комплексы, реже грибы. Микробиологическая характеристика почв холодных биотопов с низким почвообразующим потенциалом важна не только для понимания процессов минерализации и образования почв, но и может представлять интерес для изучения современных аналогов почвенных тел, сформировавшихся до появления высших растений. Изучение культивируемых форм микроорганизмов и их потенциальной жизнеспособности не утратило своего значения для характеристики физиологического состояния, биологической активности и устойчивости к внешним воздействиям антарктических микроорганизмов, участвующих в первичном почвообразовании. В настоящее время ведутся микробиологические исследования почв оазисов Холмов Ларсеманна. Исследуются грибные и бактериальные сообщества, биологическая определяются активность, их численность, однако, не жизнеспособность исследованными и остаются формирующиеся почвы, образцы которых отобраны в других точках данного оазиса В настоящей работе расширены исследования почв оазиса Холмов Ларсеманна, а также изучены образцы почв в районе оазиса Холмы Тала, микробиологические исследования которых ранее не проводились. 3 Цель работы - выявление особенностей функционирования бактериальных сообществ ранее не исследованных антарктических почв различных типов и условий формирования. Задачи исследования: 1. Изучить общую численность потенциально жизнеспособных бактерий и культивируемых форм гетеротрофных бактерий в образцах почв, отличающихся гидрологическими и мерзлотными условиями формирования. 2. Определить устойчивость гетеротрофных бактериальных сообществ к температурным воздействиям в нативных образцах почв. 3. Изучить физиологическое разнообразие гидролитического бактериального комплекса и физиологическое состояние его членов в профилях формирующихся почв, отличающихся условиями формирования. 4 Глава 1. Обзор литературы 1.1 Особенности почвообразования в условиях континентальной Антарктики. В настоящее время начались систематические исследования российскими специалистами почв и почвоподобных тел в береговой части Восточной Антарктики и на труднодоступных участках Западной Антарктики, расположенных в области российских антарктических станций. Первые работы были опубликованы в 1958-1959 г.г. (Глазовская, 1958; Сыроечковский, 1959), в последующем почвы изучались при ландшафтных исследованиях (Симонов, 1971; Александров, 1985), а собственно почвенномерзлотные исследования возобновились в 1994-1998. Результатом этих исследований была серия публикаций с американскими соавторами по микроорганизмам, обитающим в почве и мерзлоте (Wilson et al., 1996; Friedmann et al., 1996; Gilichinsky et al., 2007). Позже в работе М.А. Глазовской (2002) было показано интенсивное биохимическое выветривание основных пород под лишайниками субантарктического острова Кинг-Джордж. Основные характеристики факторов почвообразования по российским антарктическим станциям изложены в серии монографий (Марков с соавт., 1968; Симонов, 1971). В настоящее время опубликованы подробные обзоры по исследованию формирующихся антарктических почв в Антарктиде (Горячкин с соавт, 2012, Мергелов с соавт., 2012). В основе геологического строения Антарктиды лежит платформа и складчатая область Трансантарктических гор, идущих к Антарктическому полуострову. В качестве почвообразующих пород преобладают легкие по гранулометрическому составу элювии и ледниковые дериваты гранитов, гнейсов, эндербитов и чарнокитов (гранитоидов с амфиболами). Осадочных пород немного, некоторые из них содержат карбонаты. В целом же преобладают исходно бескарбонатные отложения. 5 Климат Антарктиды, как известно, самый холодный на Земле. Береговые оазисы имеют среднегодовые температуры около -10оС. От высоких широт Северного полушария климат оазисов отличается существенно более холодным летом (средняя температура января – до +3оС), но менее суровыми зимними температурами (в основном выше -30оС). На самых теплых для Южного полушария склонах северной экспозиции температура скал летним днем нередко превышает +30 оС. Отличительной особенностью являются ветры и осадки. Сильный ветер (до 70 м/с на станции Русская) переносит не только мелкозем, но и мелкие камни. Осадки выпадают в твердом виде (за исключением Антарктического полуострова и оазиса Грирсона), и перераспределяются, не успев достигнуть поверхности. В связи с этим такая важная для оценки развития почв в других районах Земли величина как сумма осадков, в Антарктиде не имеет большого значения. Особенности климата определяют и характер оттаивания, и температуру мерзлоты в почвах. (Gilichinsky et al., 2010), Горячкин с соавт, 2012, Мергелов с соавт., 2012). Растительность представлена разреженным покровом мхов, лишайников и водорослей, приуроченных, как правило, к понижениям, где есть талая снеговая вода. Два вида цветковых растений (колобантуса кито (Colobanthus quitensis) из семейства гвоздичные и луговика антарктического (Deschampsia antarctica) из семейства злаки) появляются только на Антарктическом полуострове и прилегающих островах. По мнению ряда авторов (Горячкин с соавт, 2012, Мергелов с соавт., 2012). Примитивные антарктические почвы можно в предварительном порядке сгруппировать не по их классификационным именам в какой-либо системе, а по характеру проявлений органоминеральных взаимодействий: 1) Органоминеральные почвы с макропрофилями (при привносе органических веществ из моря – «орнитогенные» и «пост-орнитогенные» и из озер (см. ниже) – в них идет взаимодействие гуано или донных органических остатков с минералами почв; 6 2) Органоминеральные почвы с микропрофилями в первые несколько сантиметров на мелкоземе подо мхами, лишайниками и водорослями; 3) «Безгумусовые» (“ahumic soils” по Тедроу и Уголини) профильно анизотропные почвы на мелкоземе без видимых признаков макрожизни – анизотропность создается абиогенными процессами: криогенным оструктуриванием, выдуванием мелкозема из верхних горизонтов, засолением и др.; 4) Эндолитные почвы, продуктом педогенеза в которых являются внутритрещинный мелкозем и новообразованные минералы – (гидр)оксиды железа, как остающиеся в трещинах, так и попадающие на поверхность камней и придающие им буроватую и красноватую окраску; по площади это, наверное, самые распространенные почвы Антарктиды. Жизнь в материковой Антарктиде уходит прямо в камень. Из-за больших перепадов температур здесь в плотных породах образуются многочисленные мелкие трещины, куда под прозрачные пропускающие свет минералы проникают повсеместно обнаруживаемые автотрофы – водоросли, роль в преобразовании минералов которых поистине колоссальна. В трещинах идет растворение железистых минералов, выход двухзарядного железа из решетки и его окисление, в результате чего на породе, имеющей зеленовато-серую окраску 5Y и 2.5Y (по Манселлу), формируются как поверхностные, так и внутритрещинные пленки красно-бурого и даже красного цвета до 10R. Кроме того, внутри глыб идет травление полевых шпатов и кварца и формирование мелкопесчаного и пылеватого мелкозема (подробнее см. ниже); 5) Мало изученные эпилитные почвы под лишайниками на камнях. ; 6) Эпилитные и эндолитные почвоподобные тела, сформированные на поверхности камня или внутри трещин, по-видимому, без участия организмов, например, за счет окисления тех минералов, которые могут окисляться и абиогенно. К ним относится часть «пустынных» или «скальных загаров» 7) «Ледовые почвы» (по украинскому микробиологу А.Б. Таширеву) – органо-аккумулятивные образования, 7 возникающие в углубленных проталинах льда, где накапливаются продукты гетеротрофного разрушения фотосинтезирующих микроорганизмов, поселяющихся непосредственно на льду (Hodson et al., 2008; Таширев, 2009). В классификационном отношении в материковой Антарктиде, очевидно, преобладают не Криосоли (по WRB – FAO, 2006) и Гелисоли (по Почвенной таксономии США – Soil Survey Staff, 2010), так как почвы зачастую ближе подстилаются скалами, чем мерзлотой из-за мелкого рыхлого чехла. Геокриологические данные по станции Молодежной и оазису Бангера показали, что рыхлые почвы могут оттаивать глубже метра (при отсутствии криотурбаций они тогда уже не Криосоли). Преобладают же Лептосоли (WRB) или Энтисоли (Почвенная таксономия США), причем в основном Нудилитик Лептосоли, к которым могут быть отнесены и эндолитные почвы, или Литик Гелортенты, недавно появившиеся в Почвенной таксономии (Soil Survey Staff, 2010). Большой интерес представляют почвы влажных долин оазисов (Горячкин с соавт, 2012, Мергелов с соавт., 2012). Важнейший структурный элемент ландшафтов оазисов – межсопочные долины, занимающие не менее четверти их площади, днища и низкие борта которых выполнены мелкоземисто-щебнистыми субстратами смешанного моренного, элюво-делювиального и аллювиального генезиса. Основной фракцией мелкозема полевошпатового максимального является состава. развития крупный песок мм) (1-0,5 кварц- Межсопочные долины – это антарктической биоты и, по-видимому, максимального биоразнообразия. лишайниковые, водорослевые бактериальные маты, Здесь покровы, многочисленные формируются обнаруживаются колонии области моховые, альго- микромицетов. Перечисленная биота участвует в образовании органоминеральных почв с микропрофилями мощностью в пределах 10-20 см. В связи с практически полным отсутствием жидких осадков и мощным ветровым и морозным иссушением грунта определяющим фактором для развития организмов в 8 оазисе является доступность влаги, основным источником которой являются тающие снежники. (Рис.1 . Межсопочная «влажная» долина в оазисе Холмы Ларсеманна) (Рис. 2. Органоминеральная почва с микропрофилем «влажной» долины*1) Определяющее влияние поверхностного увлажнения, а также поверхностного ветрового и морозного иссушения сочетается с огромными запасами внутрипочвенной надмерзлотной влаги, содержащейся в субстратах с глубины 20-40 см, однако оказывающейся недоступной для организмов. 1 Рисунки из статьи Горячкина с соавт., 2012) 9 Первичный источник внутрипочвенной влаги – также снежники, вторичный – льдистая сезонная мерзлота. Перечисленный комплекс условий позволил авторам применительно к некоторым оазисам Восточной Антарктиды предложить термин «влажные долины», что подчеркивает их отличие от Сухих долин Западной Антарктиды. При продвижении к бортам долины и выходе из зоны постоянного течения талых вод в растительном покрове появляются, а затем доминируют мхи. Моховая подстилка развивается под щебнистой броней пустынной мостовой и иногда куртинами выходит на поверхность. Под подстилкой имеется отдельный минеральный горизонт с активным развитием микромицетов, макроморфологически диагностируемый по обильному белесому налету грибного мицелия на зернах крупного песка. Выше по склону следуют почвы, в которых из визуальных признаков жизни имеется лишь оливковый органоминеральный горизонт, образовавшийся за счет развития колоний водорослей в песчаной подушке пустынной мостовой. Жизнь в этой тонкой прослойке поддерживается за счет капиллярного подтягивания надмерзлотной влаги, редких снегопадов и защиты щебнистой броней пустынной мостовой от выдувания ветром и агрессивного ультрафиолетового излучения. Выше по склону внутрипочвенная влага недоступна для макроорганизмов, развиваются «безгумусовые» почвы. Почвы и грунты изученных влажных долин не вскипают во всей массе. Признаков оглеения также не обнаружено, несмотря на постоянное переувлажнение. Почвы имеют слабокислые и нейтральные значения рН, а содержание углерода и азота сильно варьирует в зависимости от количества примесей органического вещества, достигая 10,4% углерода и 0,5% азота. Даже в «безгумусовых» почвах содержание углерода в верхнем горизонте достигает 0,4% (0,7% гумуса), источник которого пока, по мнению авторов (Горячкие с соавт., 2012) не вполне ясен. Предполагается, что это «эндолитная память» материала почв, то есть органическое вещество, сформировавшееся на почвенных частицах, когда они были в эндолитной системе. Яркой и 10 повсеместной особенностью антарктических оазисов является также развитие эндолитных почв и «скальных загаров». Характерным является заселение внутреннего приповерхностного объема скальных пород организмами (водорослями, бактериями, микромицетами, лишайниками), невидимыми с поверхности. Красные, красно-бурые, ржавые пленки, натеки на поверхности скал традиционно называют пустынным «загаром», по аналогии со сходными образованиями, которые наблюдаются в аридных и семиаридных регионах. Населяющие породы организмы называют эндолитами и в более узком понимании криптоэндолитами, то есть организмами, развивающимися в структурных приповерхностных полостях породы и невидимыми с поверхности (Friedmann, 1982). Скальный «загар» и криптоэндолиты – два очень широко распространенных феномена на Земле, которые подробно изучены по отдельности, однако их взаимодействие и возможная генетическая связь практически не исследованы. Пустынный «загар», точнее скальный или горный «загар» (Dorn, 1998; Глазовская, 2002), является собирательным термином для поверхностных образований различного генезиса, имеющих сходное морфологическое проявление. Также, было показано, что эндолитные организмы широко распространены в оазисах Антарктики, где являются важными первичными продуцентами органического вещества (Friedmann, Ocampo, 1976). Эндолиты - это пионерные организмы и агенты первичного почвообразования, на которые мы редко обращаем внимание вне областей экстремальных природных условий. Проникая в породу по имеющимся трещинам и каналам, они разрабатывают их и формируют новые полости, используя инструменты физической дезинтеграции (в том числе криогенной за счет замораживанияоттаивания влагосодержащей биомассы) и биохимического выветривания. Эндолитные организмы могут выступать в качестве литотрофов, то есть использовать минеральные компоненты для осуществления биосинтеза, а также воздействовать на породу метаболитами/экссудатами (преимущественно органическими кислотами). В приповерхностном объеме 11 породы (граниты, гнейсы) эндолитные цианобактерии, зеленые водоросли и лишайники выступают единственными первичными продуцентами органического вещества, образование которого идет за счет фотосинтеза, так как порода содержит пропускающие свет зерна кварца и полевых шпатов (Friedmann, 1982). Синтезируемое ими органическое вещество, которое впоследствии разлагается эндолитными гетеротрофами (микромицетами), становится важным компонентом поверхностного слоя породы. Живая и мертвая биомасса эндолитных организмов организована в виде отдельного микрогоризонта в пределах 1 см от поверхности породы, проникает на первые миллиметры в породу, покрывая зерна минералов пленками толщиной до нескольких микрометров. В настоящее время внимание исследователей привлечено к изучению почвообразовательных процессов в районе оазисов Вестфолль и Ларсеманн, которые входят в первую десятку крупнейших свободных ото льда территорий Восточной Антарктиды, почвенный покров которых никогда не изучался на регулярной основе. Мощность деятельного слоя, который лишь частично затронут почвенными процессами, составляет 2090 см в зависимости от экспозиции и времени года. Несмотря на недостаток влаги на поверхности почв и пород над кровлей многолетнемерзлых пород скапливается влага, происходит латеральная миграция надмерзлотных вод. Среди химических элементов наиболее активно мигрирует в почвах Ca, а затем Mg, Sr, Zn, K и Na в порядке убывания. Среднее соотношение SiO2/Al2O3 составляет 5,8, что указывает на слабую интенсивность химического выветривания. С 2008 года отрядом мерзлотоведов под руководством Д.А. Гиличинского (в составе Российской антарктической экспедиции) в оазисе Ларсеманн стали проводиться регулярные работы по изучению температурных и гидрологических режимов почв, и пород, исследования структуры почвенного покрова, а также органоминеральных взаимодействий в таких специфических объектах как эндолитные 12 педогенные образования (Gilichinsky et al., 2010). Климат в данном регионе более мягкий и более благоприятный для протекания почвообразующих процессов, чем в хорошо изученных в почвенном отношении Сухих Долинах Земли Виктории в Западной Антарктике. Оазис Ларсеманн является одним из самых теплых безлёдных пространств на побережье Восточной Антарктиды. Среднегодовая температура воздуха составляет -9,8°С. При полном отсутствии жидких осадков надмерзлотные горизонты почв влажных долин в период всего летнего сезона пребывают в переувлажненном состоянии. Основной источник влаги – тающие снежники и внутрипочвенный шлировый лед (льдистая мерзлота) В зоне влияния снежника профильное распределение влажности обнаруживает два максимума: в верхней части непосредственно под каменной мостовой и в нижней надмерзлотной. Нижние горизонты с глубины >40 см пребывают в максимально влагонасыщенном состоянии, их влажность (2130%) близка к полной влагоемкости крупнопесчаных субстратов. Эта влага остается малодоступной для организмов, так как капиллярное подтягивание в крупнозернистых песках составляет первые сантиметры. Изучение почвообразовательных процессов в данном регионе позволило выделить несколько типов профилей формирующихся почв (Мергелов с соавт., 2014, в печати) В зоне тока талых вод, где формируются почвы аллювиального генезиса (тип профиля I), поверхностный органоминеральный водорослевый горизонт постоянно пребывает в субаквальной стадии с влажностью на уровне нижней границы диапазона полной влагоемкости крупнопесчаных субстратов. При продвижении к бортам долины и выходе из зоны постоянного течения талых вод в растительном покрове появляются, а затем доминируют мхи (профиль II). Моховая подстилка развивается под щебнистой броней каменной мостовой и иногда куртинами выходит на поверхность. Такие профили появляются, начиная со значений близких к нижнему пределу полной влагоемкости песчаных почв (~18%), и исчезают, когда влажность поверхностного 13 горизонта падает ниже 9-10%, то есть приближается к наименьшей влагоемкости песчаного субстрата. Существенно более высокая влажность оторфованной моховой подстилки (40-80%) в расчетах не учитывалась. Выше по склону развиваются почвы (профиль III), в которых из визуальных признаков жизни имеется лишь оливковый органоминеральный горизонт, образовавшийся за счет развития колоний водорослей в приповерхностном песчаном материале. Его влажность составляет 4-8%, то есть остается в пределах нижней части диапазона доступной для организмов влаги в песчаных почвах. Это зона слабого влияния снежника. Жизнь в этой тонкой прослойке поддерживается за счет редких снегопадов и еще реже за счет капиллярного подтягивания надмерзлотных вод при повышении их уровня в период максимального таяния снежников. Выше по склону внутрипочвенная влага не доступна для биоты, а влияние снежника заканчивается. Верхний слой безгумусовых почвоподобных тел (профиль IV) на высоких бортах долин имеет влажность всего лишь 0,5-2%, то есть близкую к гигроскопической для крупнопесчаных почв. Здесь макроорганизмы уже не развиваются. Полученные данные по мерзлотно-гидрологическим условиям позволили авторам заключить, что: а) снежники – определяющий регулятор био- и педоразнообразия оазисов; б) в условиях острого дефицита влаги жизнь большинства организмов в долинах оазиса, прежде всего, высших растений – мхов, стала возможна только благодаря снежникам, которые сначала аккумулируют влагу, а затем ее распределяют, формируя вокруг себя зоны влияния и «допуская» в них различные виды организмов, нуждающиеся в разной степени увлажнения субстрата; в) талые воды снежников оказывают влияние на температурный режим, динамику протаивания почв и грунтов, а также на проявление в них процессов криогенного массообмена. Градиенты влажности поверхностных горизонтов в большой степени объясняют наблюдаемое пространственное распределение почв и биотических комплексов; г) основным лимитирующим фактором для развития почв на рыхлых субстратах оазиса является недостаточность увлажнения, а не низкая 14 температура. Описаны также биотические комплексы, которые колонизируя минеральный субстрат в экстремальных условиях, как правило, образуют тонкие органические горизонты, биогенные корочки, в зарубежной литературе - «crust vegetation» или «soil crust vegetation» (цитировано по Мергелов с соавт., в печати). Определяющим фактором для развития таких комплексов в оазисе Ларсеманн, где практически не бывает жидких осадков, является наличие надежного источника влаги, часто в виде снежника, далее следует наличие ветрового укрытия, позиции в ландшафте, аккумулирующей тепло, и освещенность. Важная особенность оазиса Ларсеманна, как и некоторых других оазисов Восточной Антарктиды - большая часть живой и мертвой биомассы сосредоточена под дневной минеральной поверхностью почвы, а на скалах под десквамационными плитками. Стресс иссушением, сильный ветер и УФизлучение в большинстве случаев препятствует развитию организмов на поверхности и заставляют их искать убежище в мелкоземе (эндоэдафическая ниша) или под каменной мостовой (гиполитная ниша). Это значительно меняет облик почвы - «горячие» точки биоминеральных взаимодействий, подстилка и органоминеральные горизонты находятся не на поверхности, а внутри минерального каркаса Авторы выделяют следующие особенности эндолитных, гиполитных и эндоэдафических сообществ, формирующих почвы внутри камня, под камнем и внутри мелкозема под минеральным щитом: - минеральный субстрат – это убежище для макроорганизмов от воздействия экзогенных факторов; - отсутствие макроорганизмов на поверхности: нет растительных покровов, нет подстилок; - макроорганизмы экранированы минеральным щитом, часто в виде щебнистой мостовой; 15 - под минеральным щитом распространение макроорганизмов носит континуальный характер; - живая биомасса представлена криптогамными организмами, в том числе автотрофами способными синтезировать органическое вещество при низких уровнях освещенности внутри мелкозема без выхода на поверхность; - высшие растения представлены только бриофитами, которые при наличии влаги способны наращивать биомассу, не выходя за пределы минерального щита. Проведенные исследования некоторых свойств рыхлых субстратов во влажных долинах позволили авторам обосновать правомерность обозначения формирующихся образований почвами (Мергелов, в печати). Мелкоземисто-щебнистые морского генезиса криптогамных служат организмов отложения минеральным (бриофиты, озерно-ледникового, каркасом для лишайники, иногда поселения водоросли и микроскопические грибы) и бактерий, литогенный материал предоставляет также ряд экологических услуг по удержанию влаги, защите от ветра и УФизлучения, сохранению тепла. Органическое вещество очень слабо гумифицировано, состоит из мертвой и живой биомассы организмов. По данным макро и мезоморфологии органогенные горизонты представляют собой механическую смесь ОВ и минералов. Последовательность макроскопически диагностируемых горизонтов в верхних нескольких сантиметрах субстрата в большой степени объясняется сменой биотических комплексов, например, моховый комплекс, сменяется водорослевым, а затем мицелиальным грибным и актиномицетным. Это не «классические» почвенные горизонты, связанные с вертикальным перераспределением продуктов взаимодействия биоты и минералов. Авторы делают вывод, что продуктами почвообразования являются специфические органоминеральные субстраты, формирующиеся в отсутствии высших растений (за исключением мхов) и жидких осадков, за счет взаимодействия биопленок с минеральными зернами. Как показали исследования с помощью сканирующего микроскопа, 16 зерна кварца из верхней части горизонта B почвы в днище влажной долины покрыты тонкими органоминеральными пленками от оливкового до светлобурого оттенка. Очевидно, что пленки являются результатом взаимодействия минерального зерна с цианобактериальной биопленкой, т.е. новообразованные органоминеральные пленки являются инситными микропродуктами почвообразования. Морфологические исследования показали, что в почвах влажных долин организмы, за исключением мхов и лишайников, развиваются преимущественно в виде биопленок, что является естественной формой развития организмов в субаэральных условиях на минеральных поверхностях. Биоплёнка представляет собой множество микроорганизмов, расположенных на какой-либо поверхности, клетки которых прикреплены друг к другу. Обычно клетки погружены в выделяемое ими внеклеточное полимерное вещество (внеклеточный полимерный матрикс, слизь), которое состоит из полисахаридов, ДНК, белков, включая гликопротеины. Наиболее выраженные биопленки в почвах влажных долин оазиса Ларсеманн создают цианобактерии, зеленые водоросли, мицелиальные грибы и актиномицеты. В горизонтах с максимальной биологической активностью (W, Balgae, Bfungi) практически каждое зерно кварца, полевого шпата, граната или биотита покрыто микроэкосистемой пленочного типа. При взаимодействии биопленок с минеральной поверхностью образуется новый продукт – органоминеральная пленка. Биопленки как сложные образования создают непрерывный органогенный слой, обладающий за счет полимерного матрикса принципиально иными свойствами, чем минеральная матрица, например, другой водоудерживающей способностью, химическим составом, рН. Наличие биопленки на минеральной поверхности поддерживает особенную геохимическую микросреду, способствующую ускорению или замедлению процессов выветривания. Потенциал биопленки по преобразованию минеральной поверхности крайне велик. Отдельные работы указывают [21] на возможность существенного локального снижения pH до 3,0–4,0 непосредственно в цианобактериальных пленках на минеральных зернах. В 17 других условиях цианобактериальные биопленки способны растворять кварц, локально смещая pH 3,4 до 9,0 [13]. Учитывая повсеместное распространение биопленок на минеральных поверхностях в субаэральных условиях, можно утверждать, что они широко представлены в «классических» почвах более умеренных климатов. Но развитие высших растений, большие скорости декомпозиции органического вещества и выветривания минералов, большое количество илистых и пылеватых частиц создают все условия, чтобы такие маскирующие агенты как гумус, глинистые кутаны, железистые пленки делали изучение взаимодействия биопленок и минералов в «чистом» эксперименте крайне сложным. В Антарктиде, в отсутствии гумуса высших растений (кроме мхов), на грубых слабовыветрелых субстратах органоминеральные пленки являются основным продуктом инситного взаимодействия литоматрицы и биоты, которая преимущественно организована в форме биопленок. Краткое описание почв оазиса Холмы Тала (А.В. Долгих) Результаты комплексных исследований в оазисах Молодежный и Вечерний (участки оазиса «Холмы Тала») позволяют относить данные территории к Среднеантарктическим снежниковым пустошам (по Горячкину и др., 2011). В данных оазисах широко представлены органо-минеральные почвы с микропрофилями под водорослевыми, лишайниковыми и моховыми покровами. Большинство почв лишено легкорастворимых солей и карбонатов, отмечаются признаки гидроморфизма, связанные с латеральными потоками талых вод снежника и перераспределения их в рельефе . В оазисах Молодежный и Вечерний обнаружены влажные долины, являющиеся аналогами влажных долин оазиса «Холмы Ларсеманн». Важнейшим фактором почвообразования в долинах является дополнительное поверхностное увлажнение за счет активного таяния снежников в теплый период года. В результате этого, приповерхностные горизонты почв, не смотря на сильное иссушение ветром, продолжают удерживать влагу. Поэтому в этих 18 условиях развиваются водоросли и мхи, под ними формируются органоминеральные почвы с микропрофилями . Самые распространённые почвы в оазисах – «безгумусовые», со следами криотурбаций. Неоднородность профиля создается абиогенными процессами. Следующими по распространению являются эндолитные почвы. Максимум растительности в оазисе приурочен к ветровым убежищам на элюво-делювии и наскальных ваннах. Здесь формируются мощные моховые покровы с лишайниками, а под ними органо-минеральные почвы с торфяноперегнойными горизонтами до 10 см . Радиоуглеродный возраст нижней части органогенного горизонта 360±60 лет (Ki-17840, общее органическое вещество) позволяет предположить, что такие убежища с моховыми покровами функционируют не менее 500 лет. Данные почвы характеризуются наличием срединного горизонта классифицироваться как аккумуляции подбур. Эти соединений почвы железа встречаются и может в оазисе повсеместно, однако площадь их незначительна. В любом случае, данный подбур является полнопрофильной почвой, не связанной генетически с привнесенным органическим материалом (в отличие от «земно-водных» и классических орнитогенных почв). Орография оазиса способствует широкому распространению таких убежищ. Ориентация гряд оазиса с юго-востока на северо-запада совпадает с направлением основных стоковых ветров. А летние циклонические ветры восточного и северо-восточного направления приносят обилие снежных осадков, которые могут сохраняться до следующего летнего периода. В условиях постоянного притока влаги (ручьи, проходящие через наскальные ванны) созадются условия для формирования торфяных горизонтов, мощностью до 15 см, почву можно классифицировать как Histic Spodic? Cryosol. В замкнутых депрессиях с восстановительными остановками на дне временных водоемов за длительный период формируются сульфидные солончаки. Частично дно таких водоемов имеет мощные альго-бактериальные маты. 19 Отличительной чертой оазисов Молодежный и Вечерний является распространение моренных мелкоземистых отложений (существенно больше в оазисе Вечерний). Площадь и распространение мелкоземистых отложений в оазисе Холмы Тала (участок Молодежный) не так обширна, как в оазисах Холмы Ларсеманн, Ширмахера. Здесь не встречаются мощные плащи мелкоземистых отложений в долинах. Для заполнения межгрядовых долин участка Молодежный характерен валунно-щебнистый элювиально- делювиальный материал, при не большом участии морены. В оазисе Вечерний обнаружены моренные гряды большой площади. На глубине 80 см обнаружена льдистая мерзлота. Для данных грунтов характерно широкое распространение криогенных структур (полигональность и полосчатость). Местами встречается растительный покров (водоросли), связанный с деятельностью временных ручьев, перераспределяющих влагу из тающих снежников вниз по склону. Для таких моренных террас характерны криогенно-структурные безгумусовые почвы. Во влажных долинах участка Вечерний моховой покров имеет площади больше, чем на участке Молодежный, что связано с дополнительным привносом органики птицами (Catharacta maccormicki и Pygoscelis adeliae). Здесь, под моховым покровом площадью более 60 м2, обнаружена почва с мощным органогенным слоистым горизонтами до 15 см, сменяющимися срединным горизонтом с аккумуляцией железа и нижним глеевым горизонтом (мощность сезонно-талого слоя – 75 см). Для доминирующих в оазисе скальных обнажений стратифицированные корки выветривания, эндолитные почвоподобные тела. Совместное протекание характерны эпи-эндолитные физико-химического и биогеохимического выветривания создает современную красновато-бурую окраску скал горы Вечерняя. Встречаемость эндолитных сообществ на территории участка Молодежный выше по сравнению с участком Вечерний. 20 Для оптимально увлажненных участков, лишенных мелкоземистого субстрата, характерны эпилитные почвы под лишайниками (листоватыми и кустистыми). 21 1.2 Жизнеспособные бактерии в антарктических почвах и мерзлых осадках. Исследования биологической активности осадочных толщ полярных арктических и антарктических областей земли показали, что “вечная мерзлота” представляет собой уникальное природное “хранилище” микробных сообществ, в котором в стабильных в течение многих тысячелетий и нескольких млн. лет условиях сохраняются разнообразные виды микроорганизмов (Звягинцев и др., 1985. Воробьева и др., 1997, 2002,; Gilichinsky, 2001). Показано, что в изученных мерзлых осадках, не таявших в течение 10 тыс. до 5 млн. лет сохраняются многие сообщества микроорганизмов, которые после восстановления жизнеспособности при таянии мерзлых осадков имеют широкий температурный диапазон активности от + 4°С до +50°С. При этом показатели численности жизнеспособных микроорганизмов в целом сопоставимы с численностью микроорганизмов в образцах тундровых почв от 107 до 109 КОЕ/ г. Однако, в древних мерзлых осадках отмечалась тенденция к снижению данного показателя. Характерной особенностью микробных сообществ из мерзлых подпочвенных слоев является быстрое восстановление их активности после таяния образцов, что проявляется в активизации ферментов, ускорении синтеза РНК по сравнению с синтезом ДНК, способности к утилизации разнообразных субстратов. Исследование динамики активизации микробных сообществ в процессах первичного таяния образцов выявило высокие показатели жизнеспособности по вероятности образования колоний в единицу времени (Воробьева и др., 1996). Среди культур, выделенных из мерзлых арктических толщ, были обнаружены грибы, дрожжи и большое разнообразие бактерий, которые были отнесены к Flavobacterium, родам: Bacillus, Acinetobacter, Arthrobacter, Rhodococcus, 22 Micrococcus, Cytophaga, Cellulomonas, Aeromonas, Pscudomonas, Exiguobacterium, а также нитрифицирующие бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter (Воробьева с соавт., 2002). Среди выделенных бактерий большинство составляли психроторофные, аэробные формы. Авторы считают, что устойчивые низкие температуры в криолитосфере не следует рассматривать как экстремальный фактор, а скорее, как стабилизирующий фактор, обеспечивающий поддержание жизнеспособности клеток и сохранение разнообразия микробных видов в течение многих тысяч лет. Большой интерес представляют собой исследования ледниковой и континентальной Антарктидой толщи делает Антарктиды. возможным Циркуляция занесение сюда атмосферы над микроорганизмов, характерных для более северных широт. Микробиологические исследования в Антарктиде убедительно свидетельствуют о развитии разнообразных микробных сообществ в антарктических почвах (Boyd et al-, 1966, Moiroud, Gounot, 1969, Horowitz et al., 1972, Cameron et al., 1976, Vishniac, 1993). Большой интерес представляет обзор данных по изучению микробных сообществ в антарктических почвах, опубликованных Вишняк в 1993 году (Vishniac, 1993). Среди представителей данного местообитания обнаружены простейшие, водоросли, грибы и дрожжи, среди последних преобладают психрофильные формы. Автор обращает внимание на то, что в большинстве работ основное внимание уделяется бактериям, которые по опубликованным данным преобладают среди обитателей почв Антарктиды. По мнению Камерона и др. (Cameron et al., 1976) анаэробные бактерии встречаются крайне редко в антарктических почвах, что, по-видимому, объясняется преимущественно аэробным режимом данных почв. Камерон и др. (1976) отмечают, что примерно 10% из 10г изученных образцов aнтарктических почв содержали некультивируемые бактерии и выглядели стерильными. Среди изолированных бактерий небольшой процент составляли психрофильные формы, и основная часть была представлена 23 психротолерантными бактериями. Авторы полагают, что для антарктических бактерий наибольшим стрессом при выделении является тепловой шок, который может погубить клетки в большей степени, чем длительное пребывание в покоящемся состоянии. Автор также отмечает, что бактерии в микробных сообществах почв Антарктиды представлены в основном неспорообразующими формами. На этот факт указывает также Вишняк в своем обзоре. Камерон и др.(1976) объясняют отсутствие спорообразующих бактерий лимитом доступной влаги, что препятствует образованию спор и их прорастанию. В обзоре Вишняк (1993) обращается внимание на то, что большинство бактерий в антарктических почвах представлены коринеподобными и грамотрицательными формами, причем в ряде случаев преобладали именно грамотрицательные бактерии. Среди идентифицированных бактерий были обнаружены представители родов Micrococcus, Corynebacterium, Kurthia, Cellulomonas, Flavobacterium, Pseudomonas. Achromobacter. Azotobacter, Deinococcus, Rhodococcus, Xanthomonas, миксобактерии, среди актиномицетов - нокардии и стрептомицеты. Некоторые авторы отмечают, что численность бактерий в антарктических почвах зависит от глубины взятия образца и метода учета жизнеспособных клеток (Ramsay a-Stannard, l986, цитировано по Vishniak, 1993), а именно методом прямого счета может обнаруживаться численность бактерий (lO9-IO10 г -1 сухой почвы) на 4-6 порядков превышающих численность, учитываемую чашечным методом (104 –106 г-1 сухой почвы). В образцах засоленных антарктических почв также были обнаружены живые бактерии (Horowitz et al., 1972), которые были способны расти в питательной среде с 15% NaCI при 15°С. В ряде работ (Vishniac. 1993) указывается на присутствие в антарктических почвах пигментированных бактерий, что позволяет им противостоять сильному ультрафиолетовому излучению. 24 В антарктических поверхностных образцах были выявлены цианобактерии, которые обладали низкой скоростью роста р. Oscillatoria (Гиличинский с соавт., 1996). В работе коллектива авторов, изучавших микробиологическое разнообразие активного поверхностного слоя и нижележащих вечномерзлых пород в районе Сухих Долин (Западная Антарктика) было выявлено небольшое число культивируемых клеток- 102- 10 4 клеток на 1 г по сравнению с показателями по прямому свету, отражающими число потенциально жизнеспособных клеток - до 106 клеток на 1 г (Gilichinsky et al., 2007). Филогенетический анализ выявил во всех исследованных образцах две доминирующие группы, грамположительным Nocardioides, относящиеся бактериям. Bacillus, к протеобактериям Представители Caulobacter, родов Flavobacterium, и Arthrobacter, Pseudomonas, Sphingobacterium были выявлены практически во всех образцах. Также были обнаружены анаэробные бактерии- денитрифицирующие (2-18 кл на 1г), метаногены (2-22 кл на 1г) и сульфатредукторы (102- 103кл на1 г). В настоящее время проводятся интенсивные молекулярно-генетические исследования таксономического разнообразия антарктических почв (Yergeau E. Et al., 2007, Zeng X., et al., 2010). Опубликованные антарктических почв данные свидетельствуют жизнеспособными о заселенности микроорганизмами и их биоразнообразии, определяемом молекулярными методами. Однако изучение культивируемых форм микроорганизмов и их потенциальной жизнеспособности не утратило своего значения для характеристики физиологического состояния, биологической активности и устойчивости к внешним воздействиям антарктических микроорганизмов, участвующих в первичном почвообразовании. 25 1.3 Биохимические исследования арктических и антарктических почв, и осадков. Среди природных местообитаний арктические и антарктические почвы и осадки представляют собой уникальную среду, которая обеспечивает жизнеспособность и длительность ее сохранения в условиях отрицательных температур. Микробиологические и биохимические исследования таких местообитаний важны для решения важных биологических проблем длительности сохранения жизни, эволюции живых организмов и их устойчивости к экстремальным воздействиям. Микробиологические исследования Антарктиды выявили, как отмечалось выше, достаточно высокое биоразнообразие, однако, остаются мало изученными специфические признаки метаболической адаптации клеток к низкотемпературным воздействиям. В настоящее время ведется не так много работ по изучению биологической активности микробных экосистем в холодных местообитаниях. Безусловно, наиболее интересным представляется изучение длительности сохранения биологически активных молекул в экстремально холодных биотопах. Жизнеспособность микробных сообществ в естественных гетерогенных системах, какими являются почвы и подпочвенные осадки, поддерживаются благодаря активности внеклеточных иммобилизованных ферментов. Следует отметить, что работы, выполненные в этом направлении немногочисленны, однако дают общие представления о сохранении ферментов и динамике ферментативной активности в условиях замораживании - оттаивания или длительного воздействия низких температур. В основном исследования проводились в образцах вечномерзлых арктических осадков. Антарктические почвы, или активная поверхность антарктических отложений практически не изучались. Впервые проведенные исследования биохимической активности при таянии мерзлых арктических пород, т.е. при переходе микробного комплекса к активному состоянию, показало вспышку активности внеклеточных 26 ферментов (каталазы и инвертазы), а также синтеза РНК в первые часы таяния образцов по сравнению с тундровыми почвами. Одновременно, интенсивное выделение углекислого газа свидетельствовало о сохранении биохимической активности важнейших макромолекул в мерзлых биотопах, включающихся немедленно в репарационные процессы. (Мешкова, 1991, Vorobyova a Soina, 1994). Однако, в процессе таяния было отмечено подавление дегидрогеназной активности, что авторы объясняли возможной гибелью части клеток при размораживании. Авторы также отмечали, что описываемые ими процессы активизации каталазы и инвертазы в первые часы таяния образцов характеризовали поведение внеклеточных иммобилизованных ферментов, поскольку оба фермента хорошо стабилизируются в естественных субстратах, а корреляции с дыханием не прослеживалось. В пользу этого предположения свидетельствовал и факт отсутствия лаг-фазы, необходимой для накопления достаточного количества вновь синтезируемых ферментов. Также, в других работах статистически достоверно было показано повсеместное проявление активности гидролитических и окислительновосстановительных ферментов в длительно-мерзлых осадочных породах различного возраста и генезиса. (Миньковская, 1995, Vorobyova et al., 2001). Отмечалось, что уровень активности в средних значениях был на порядок ниже, чем в современных почвах, среднеобогащенных ферментами. Активность инвертазы обнаруживалась в 95% исследованных образцов арктических осадков, амилаз- в 87%, каталаз- в 63%, дегидрогеназы- в 57%. Активность уреазы в мерзлых осадочных породах не выявлялась. Было показано, что уровень ферментативной активности не зависит от возраста и генезиса осадков, однако, лишь инвертаза обнаруживалась практически во всех образцах, независимо от длительности воздействия отрицательных температур. Сохранение активности ферментов является результатом комбинации физико-химических свойств осадков, среди которых доминируют содержание органического вещества и гранулометрический состав. 27 Авторы также отмечали возрастание термостабильности ряда ферментов (инвертазы, амилазы, каталазы) из мерзлых осадков, особенно по сравнению с их термостабильностью в образцах тудровых почв. Авторы полагают, что это может объясняться показателем общей стабилизации этих ферментов в мерзлоте, а повышенная термостабильность инвертазы и каталазы- о внутриклеточных механизмах адаптации к низкотемпературному воздействию. Во многих случаях активность ферментов обнаруживалась в образцах, откуда не удавалось выделить культивируемые формы. В целом также отмечалось, что ферментативная активность была выше в суглинистых осадках по сравнению с песчаными. Интересно, что практически во всех исследованных авторами образцах был отмечен довольно низкий уровень каталазы. Наиболее высокий уровень достигал 1,15 мл О2 на г в мин. Была выявлена слабая положительная связь каталазы с содержанием органического углерода и обменного кальция в некоторых осадках не выявлена положительная связь между активностью каталазы и числом культивируемых клеток. Что касается дегидрогеназы, ее активность коррелировала с вероятностью обнаружения микробных клеток в образцах, что соответствует известным представлениям о внутриклеточной природе дегидрогеназной активности. Что касается антарктического поверхностного слоя и ниже лежащих осадков, их ферментативная активность остается мало исследованной. Отмечалось (Gilichinsky et al., 2007), что в 91 исследованном антарктическом образце выявлялась инвертазная активность, но слабая дегидрогеназная активность, а каталазная активность не обнаруживалась ни в одном из изученных образцов. Таки образом, в настоящее время установлен факт сохранения в активном состоянии гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов в мерзлых осадочных породах различного возраста и генезиса и сформулирован тезис о возможности более длительного сохранения активных ферментов по 28 сравнению с жизнеспособными клетками в условиях длительного воздействия криогенного фактора. Наряду с ферментами в мерзлых осадках присутствуют также и другие биомаркеры- пигменты, в частности, хлорофилл, растворимые метаболиты, биогазы (Воробъёва и др., 2002). Наличие биомаркеров по мнению авторов свидетельствует о широком спектре потенциальной биохимической активности в мерзлых осадках и является основой быстрого восстановления функционирования экосистем при таянии мерзлоты. 29 1.4 Факторы, оказывающие влияние на сохранение жизнеспособности бактериальных клеток в условиях замораживания- оттаивания. Антарктические почвы и вечномерзлые осадки представляет естественную среду обитания, где микроорганизмы реализуют уникальные возможности адаптации к продолжительному воздействию холода на живые организмы, которые могут быть универсальны для биологических систем. Микроорганизмы, сохранившие жизнеспособность в мерзлых подпочвенных осадках и адаптированные к воздействию низких температур, несомненно, испытывали в течение многих тысяч лет влияние физико-химических процессов, происходивших при промерзании и оттаивании мерзлых толщ: перенос жидкой влаги и ионов, пара и других газов. В настоящее время выделяются три разновидности элементарных криогенных почвенных процессов: криогенные процессы миграции и аккумуляции веществ криогенные процессы метаморфизации почв криотурбации. Важную роль для биологической активности могут играть специфические для криогенных почв две группы процессов. В первую группу включаются процессы переноса подвижных фаз в ходе промерзания. Вторая группа охватывает процессы, вследствие которых изменяется степень подвижности компонентов почвы, что наиболее ярко проявляется при многократном циклическом промерзании и протаивании. Важную роль в процессе промерзания почвы и подпочвенных слоев играет не только перенос жидкой влаги и ионов, но и пара и других газов. В закрытой системе перенос происходит за счет комплексного парожидкостного процесса, детально исследованного А. М. Глобусом (Глобус, 1974). В зоне фазовых превращений влаги наблюдается избирательное поглощение ионов растущим льдом. В результате взаимодействия процессов переноса в мерзлой и талой зонах, а также избирательного поглощения ионов 30 льдом вблизи фронта льдовыделения при промерзании почв возникает сложная картина распределения подвижных фаз. Основываясь на результатах экспериментов по одностороннему промерзанию засоленных пород, можно констатировать, что соли могут, как отжиматься от фронта промерзания, вызывая их криогенное концентрирование, так и переноситься к фронту промерзания, проникая далее в мерзлую часть породы, тем самым, повышая ее засоленность. Первый случай характерен для промерзания дисперсных пород (песков, легких супесей), в которых миграция влаги практически не происходит, льдообразование и фазовые переходы идут в основном с образованием льда-цемента. Растущие кристаллы льда при этом отжимают от фронта промерзания соли, которые, концентрируясь, могут создавать области переохлаждения перед фронтом кристаллизации и замедлять фазовые переходы. Этот случай достаточно хорошо освящен в ряде работ Ершова Э.Д. (Ершов Э.Д., 1992). Таким образом, в засоленных тонкодисперсных породах при промерзании фиксируется увеличение содержания воднорастворенных солей в мерзлой зоне, причем максимальное соленакопление отмечается в верхней, наиболее холодной части. В условиях «закрытой» системы перераспределение влаги и льдонакопления в мерзлой зоне происходит за счёт внутреннего миграционного потока. Под действием температурного градиента, как в мерзлой, так и в талой части происходит перемещение воды в область более низких отрицательных температур. (Ершов, 1979). Возникает направленное движение молекул воды, которые несут с собой ионы солей, содержащихся в поровом растворе, и увеличивают, таким образом, как влажность и льдистость, так и засоленность мерзлой породы. Было установлено, что не только влагоперенос вызывает и определяет солеперенос в промерзающих породах, но и сама миграция ионов, наличие градиента их концентрации влияет на перенос пленок не замерзшей воды (Ершов, Лебеденко, 1992). В целом на особенности массопереноса и характер протекания физических и химических 31 процессов существенное влияние оказывают дисперсность и химикоминеральный состав пород, их исходная засолённость и температурный режим. С процессами переноса, связаны изменения газового режима, подвижность влаги и растворенных веществ, структурные преобразования почв и подпочвенных пород, которые могут происходить при промерзании и протаивании. Периодическое повторение циклов промерзания и протаивания способствует выделению газов, содержащихся в почве и подпочвенных слоях в растворенном и сорбированном состоянии. Методом повторных взвешиваний установлено, что при промерзании и протаивании существенно возрастает летучесть органических веществ в почвах (Iskandar, Jenkins, 1986). Перенос ионов в промерзающих породах, как уже отмечалось, осуществляется с помощью подвижных не замерзших пленок воды, располагающихся на поверхности кристаллов льда. Толщина таких пленок колеблется от нескольких ангстрем при температуре -20 С - 30 С до 60-80 А при температуре -2 С -5 С (Ostroumov, 1993, Ershov et al., 1979). В настоящее время интенсифицированы исследования по изучению типов жидкой фазы в мерзлоте, которые могут характеризовать специфику мерзлых пород как местообитания микрооганизмов. Таким образом, микроорганизмы, которые подвергаются замораживанию в арктическ4их и антарктических почвах, и подпочвенных осадках, могут находиться в условиях повышенных концентраций солей, что может приводить к адаптивным перестройкам в клетках в сторону их высокой устойчивости к подобному стрессу и сохранению жизнеспособности. Как известно, на активность микроорганизмов существенное влияние оказывает водный потенциал. Полный потенциал почвенной воды – это то количество работы, которую необходимо совершить для того, чтобы 32 перевести единицу свободной чистой воды обратимо и изотермически из стандартного состояния в то состояние, в котором она находится в рассматриваемой точке почвы. То есть эта величина выражает способность воды в почве производить большую или меньшую работу по сравнению с чистой (без солей, осмотическое давление равно нолю) свободной (т.е. не подверженной влиянию адсорбционных и капиллярных сил) водой (Ковда, Розанов, 1988). Полный потенциал почвенной воды равен сумме частных потенциалов, связанных с разными силовыми полями: адсорбционный потенциал возникает в результате взаимодействия молекул воды с поверхностью твёрдой фазы почвы, в результате, которого вода сорбируется твёрдыми почвенными частицами в виде тонкой плёнки. Возникающий при этом потенциал прямо пропорционален работе десорбции воды. осмотический потенциал возникает при наличии в воде растворённых веществ, пропорционален работе по удалению воды из раствора. Водный потенциал напрямую влияет на такие важнейшие показатели, как численность бактерий, их активность, рост грибных гиф и дыхание. Максимум микробного дыхания, нитрификации и процессов минерализации приходится на максимальное содержание влаги (при минимальном потенциале) при неограниченной аэрации почв. Водный потенциал начинает ограничивать микробную активность при значениях около – 40 Ма. Выделяют две разновидности водного стресса: матричный стресс – возникает при недостатке свободной неадсорбированой влаги (при наличии адсорбционного потенциала); осмотический стресс – возникает при высоких концентрациях солей в окружающей среде (наличии осмотического потенциала). Обычно микроорганизмы проявляют более высокую чувствительность к матричному стрессу, чем к осмотическому. Бактерии в основном гигрофилы. 33 Для того чтобы клетка находилась в состоянии тургора и не подвергалась плазмолизу, осмолярность в ней должна поддерживаться на достаточном уровне, а активность воды должна быть ниже, чем в среде. Под воздействием осмотического стресса клетка может поглотить какое-то количество растворённых веществ из окружающей среды и тем самым повысить концентрацию веществ внутри (Громов, Павленко, 1989), либо синтезировать специальные осмопротекторные вещества. Микроорганизмы, подвергающиеся матричному стрессу в среде с низкой концентрацией растворённых веществ, не имеют возможности поглощать осмотически активные соединения. Такие организмы должны либо сами синтезировать растворимые вещества de novo, либо осуществлять деструкцию внутриклеточных молекул (Громов, Павленко, 1989). Внутренний водный потенциал микроорганизмов находится в равновесии с внешним водным почвенным потенциалом, но при уменьшении внешнего потенциала, что происходит при замораживании среды, микроорганизмы способны активно уменьшать свой внутренний потенциал за счёт увеличения концентрации солей в цитоплазме. Микроорганизмы, лишенные осмопротекторных веществ, подвергаются пассивной регулировке равновесия – плазмолизу, и, таким образом, выравниванию потенциалов (Stotzky a. Bollag, 1992, Henis, 1993). Осмопротекторные вещества совместимы с физиологически активными. Например, у прокариотов это аминокислоты и амины. Грамотрицательные бактерии накапливают глютамат калия, пролин. Также может накапливаться аминобутират. Грамположительные бактерии накапливают, в основном, нейтральные аминокислоты (пролин), а актиномицеты – пролин, аланин и глютамин. Эукариоты (грибы и водоросли) накапливают сахара и полиолы, такие как глюкоза, трегалоза и глицерол. Осмопротектанты могут быть как конститутивными (т.е. обычно накапливающиеся в клетке) и индуктивными (т.е. вырабатывающимися как 34 ответ на высушивание). Некоторые микроорганизмы могут накапливать только конститутивные осмопротектанты (прокариоты – глютамат калия и эукариоты – полиолы: арабитол и манитол). Стенки клеток у таких микроорганизмов очень прочные для того, чтобы выдерживать высокое тургорное давление после снятия стресса. Большинство продуцировать микроорганизмов индуктивные (грамотрицательные) осмопротектанты; или способно индуктивные и конститутивные – грамположительные, у которых толстые клеточные стенки (Henis, 1993). Таким образом, микроорганизмы в промерзающих подвергаются не почвах только и мерзлых длительному осадках воздействию осмотического стресса, но и матричного стресса что, возможно, приводит к отбору наиболее устойчивых к подобному фактору клеток, способных оставаться неповрежденными в течение многих тысяч и миллионов лет. Большой интерес вызывает наличие подвижных тонких пленок не замерзшей воды вокруг ледяных кристаллов в мерзлых почвах и породах, в связи с их влиянием на возможную слабую метаболическую активность микроорганизмов в “мерзлоте”. В мерзлых породах содержание не замерзшей воды может колебаться от 2 до 7%. При этом при максимальных значениях активности воды видимо возможен обмен веществ с окружающей средой, в то время как при минимальных значениях клетки микроорганизмов вынуждены перейти на эндогенный обмен. Таким образом, условия мерзлоты как среды обитания микроорганизмов скорее следует рассматривать как условия физиологической сухости, в которых большинство микробов сможет сохранить свою активность только в покоящемся состоянии. При этом отсутствие сколько-нибудь значительных колебаний температуры в течение многих тысяч и миллионов лет определяет высокую стабильность среды для продолжительного сохранения жизни. 35 Комплексный 1.5 структурно-функциональный метод характеристики микробных популяций. Комплексный метод основан на распространении понятия “экологическая стратегия” не только на популяции, но и на микробные ассоциации; применимости кинетической модели, описывающей рост чистой культуры к ассоциациям; отказе от изучения поведения микроорганизмов в почве в пользу более стандартных и однородных условий жидких сред, где развиваются более простые микробные математическому микроорганизмов ассоциации, анализу; в которые признание микрокосме (ячейках поддаются точному аналогичным поведение культуральной планшеты) поведению в реальной почве (моделирования микрозоны в макромасштабе). Эти условия в за вуалированной форме лежат в основе применения сукцессионного подхода, основанного на изучении динамики микробных сообществ после инициации тем или иным способом сукцессии в почве в контролируемых условиях почвенных микрокосмов. Этот подход широко используется почвенными микробиологами и показал свою эффективность при изучении микробного комплекса почв. Динамика микробных ассоциаций в микрокосме после внесения хитина, глюкозы или нефти отличается от полевых условий. Все пере численные выше допущения означают, по сути, перенесение свойств, приписываемых в биологии виду, на искусственно создаваемые ассоциации. Таким образом, непосредственным объектом исследования микроорганизмов in situ в комплексном методе становится новый тип операционной таксономической единицы “комплексный (составной) вид” – ассоциация микроорганизмов, воспринимаемая как вид. Комплексный вид – доведенная до логического конца концепция самопроизвольных культур – изучение почвенного микробного сообщества путем анализа роста смешанных культур (самопроизвольных культур), возникающих при внесении в почву того или иного ростового субстрата, создающего селективное преимущество для размножения исследуемых 36 микроорганизмов. Однако только время и применение комплексного метода разными специалистами покажет точность, надежность и значимость анализа самопроизвольных ассоциаций, возникающих в жидких питательных средах для фундаментальных научных и прикладных исследований. 37 Глава 2. Экспериментальная часть. 2.1. Объекты и методы. (Рис.3. Фотографии разрезов. Восточная Антарктида) В работе были использованы образцы антарктических почв влажных долин оазиса Холмов Ларсеманна (ст. Прогресс- 19 образцов из 7 разрезов) и оазиса Холмов Тала (ст. Молодежная- 25 образцов из 9 разрезов). Для исследований были отобраны образцы почв с характерным набором горизонтов, формирующих определенные профили почв. 1. Органоминеральные почвы с микропрофилями в первые несколько см. подо мхами, лишайниками и водорослями 38 2. «Безгумусовые» почвы- на мелкоземе без видимых признаков макрожизни. Неоднородность профиля создается абиогенными процессами. 3. Эндолитные почвы, формирующиеся в результате трансформации горных пород и минералов в ходе жизнедеятельности криптоэндолитных микроорганизмов непосредственно «внутри камня». 4. Почвы на сапропелевых отложениях с оглеенными горизонтами. 5. Сульфидные солончаки, формирующиеся в депрессиях с восстановительными условиями на дне временных водоемов с мощными альго-бактериальными матами. В условиях острого дефицита влаги жизнь большинства организмов в долинах оазиса, прежде всего, высших растений – мхов, стала возможна только благодаря снежникам, которые сначала аккумулируют влагу, а затем ее распределяют, формируя вокруг себя зоны влияния и «допуская» в них различные виды организмов, нуждающиеся в разной степени увлажнения субстрата. Талые воды снежников оказывают влияние на температурный режим, динамику протаивания почв и грунтов, а также на проявление в них процессов криогенного массообмена, а градиенты влажности поверхностных горизонтов в большой степени объясняют наблюдаемое пространственное распределение почв и биотических комплексов. Как видно из таблицы, образцы почв отличаются содержанием органического углерода, наиболее высокое содержание углерода обнаруживается в торфянистом горизонте и в моховой подстилке. Образцы почв для микробиологического анализа были отобраны во время 55-ой Антарктической экспедиции в 2010 году в оазисах Лансермана (Восточная Антарктида) с соблюдением условий стерильности и хранились в морозильной камере при -18С. 39 Таблица 1. Описание образцов антарктических почв № разреза и описание почвы № Тип почвы Св% образца М3, мох, 1-3 1Д Тип профиля II 5.85 М2 Bfungi, 1-2 3Д Тип профиля III 0.28 М4 0-7 песчаный мелкозем в наскальной 4Д ванне под сообществами 3.30 эпилитных лишайников NSM 10-20 O см, мертвый Мох 5Д Тип профиля II 8.8 М3 Почва в днище влажной долины, В, 1-2 3 Тип профиля II 0.85 10 Тип профиля IV 0.08 13 Тип профиля II / III 0.12 14 Тип профиля II / III 8.74 15 Тип профиля II / III 0.26 см 10-15Р1. Каменная мостовая без признаков макробиоты 10-06 с торфяным горизонтом 0-2(4) см. Каменная мостовая со скоплениями одноклеточных водорослей 2-4см Торфянистый органогенный горизонт, в основном мертвая биомасса В1, 4-10см. Минеральный материал, ржаво-бурый крупнозернистый песок, Описание профилей Профиль II- образцы почвы с моховой подстилкой, развивающейся под щебнистой броней каменной мостовой, которые появляются, начиная со значений близких к нижнему пределу полной влагоемкости песчаных почв (~18%), и исчезают, когда влажность поверхностного горизонта падает ниже 9-10%, то есть приближается к наименьшей влагоемкости песчаного субстрата. Профиль III - образцы почвы, где из визуальных признаков жизни имеется лишь оливковый органоминеральный горизонт, образовавшийся за счет развития колоний водорослей в приповерхностном песчаном материале. Его влажность составляет 4-8%, то есть остается в пределах нижней части 40 диапазона доступной для организмов влаги в песчаных почвах. Это зона слабого влияния снежника Профиль IV- образец верхнего слоя безгумусового почвоподобного тела, развивающегося на высоких бортах долин и имеющего влажность всего лишь 0,5-2%, то есть близкую к гигроскопической для крупнопесчаных почв. Определение численности бактерий в образцах тундровой почвы и мерзлых отложений проводили чашечным методом и методом прямого счета. Численность бактерий в образцах определяли прямым микроскопическим люминисцентным методом с использованием красителя акридина оранжевого ("Методы почвенной микробиологии и биохимии", 1980). Для определения численности жизнеспособных бактерий чашечным методом для посева готовили водную суспензию с разведением 1:10 и высевали на агаризованную триптиказо-соевую среду (ТСА) Рассев каждого образца делали в трехкратной повторности. Подсчет числа колониеобразующих единиц (КОЕ) производили после инкубации от трех до 15 суток при комнатной температуре. Активизацию роста культивируемых бактерий изучали по динамике численности бактерий в процессе размораживания образцов почв по числу КОЕ, выявляемому при культивировании на ТСА при +200 С, сразу же после оттаивания образцов, а также через 5, 7. и 14 суток. Контролем служила численность бактерий, определенная по числу КОЕ на ТСА и температуре культивирования при выделении из нативных образцов почв сразу же после оттаивания. Для изучения влияния процессов замораживания- оттаивания на жизнеспособность бактерий in situ образцы почвы, хранившиеся в морозильной камере при –180С, подвергались оттаиванию при комнатной температуре (+23 0С) в течение 1 часа и последующим чередующимся циклам замораживания (в морозильной камере при –180 С) в течение 3-х суток) и оттаивания при тех же условиях, что и нативные образцы. После 10 и 30 41 чередующихся циклов замораживания- оттаивания определяли жизнеспособность бактерий по числу КОЕ на триптиказо-соевой среде через 5 суток культивирования при комнатной температуре. Контролем служило число КОЕ, полученное после первоначального оттаивания нативных образцов. О качественном составе бактерий, выявляемых на ТСА сразу после оттаивания образцов и последующих циклов замораживания – оттаивания судили по морфологическим особенностям клеток, наблюдаемым в фазовоконтрастном микроскопе. Принадлежность выделенных культур к бактериям с грамотрицательным и грамположительным типами клеточных стенок предварительно судили по тесту с КОН. Определяли динамику каталазной и дегдрогеназной активности исследуемых образцов почв в начальный период таяния и через 7 и 14 суток после их оттаивания общепринятыми методами – газометрическим для каталазы и калориметрическим методом для дегидрогеназы («Методы почвенной микробиологии и биохимии», МГУ, 1980. Функциональное разнообразие бактериальных комплексов изучали в профиле эндолитной почвы с торфянистым горизонтом и профиле глеезема, формирующегося в сапропеле пресноводного озера (Холмы Ларсеманна. станция Прогресс); а также органоминеральной почве с водорослевым покровом, отобранной в районе оазиса Холмы тала (станция Молодежная). Также определяли их максимальную удельную скорость роста на питательных средах, содержащих различные органические вещества. Использовали метод, основанный на определении продолжительности лагфазы роста микроорганизмов, выделяемых из природных субстратов на питательные среды, которая может зависеть не только от условий культивирования, но и от физиологического состояния микроорганизмов в природных субстратах перед их выделением. Предполагается, что чем короче лаг фаза роста микроорганизма в питательной среде, тем в более активном состоянии находился организм в природных условиях. Способность к 42 активному росту микроорганизмов определялась по кривой начального роста на питательных средах. В основе метода лежит синтетическая хемостатная модель, упрощенная для описания лаг-фазы и фазы нелимитированного роста периодической культуры микроорганизмов и рассчитывается по уравнению Применяемый метод позволяет также определить функциональное (трофическое) разнообразие микробных сообществ (число сред, на которых регистрируется рост) и кинетический параметр роста - максимальную удельную скорость роста , которая отражает экологическую стратегию роста бактерий. (Рис 4. Инфографика комплексного структурно-функционального метода.) Методика определения следующая: Водная суспензия исследуемых объектов вносилась в ячейки культуральной планшеты, с внесёнными в них биополимерами животного, растительного и микробного происхождения. Кривые периодического роста возникших на полимерах бактериальных ассоциаций детектировали по оптической плотности сред. На основании 43 калибровочной прямой производился пересчёт оптической плотности в концентрацию клеток в среде. Кинетика роста ассоциаций на полимерах описывалась математической моделью периодической культуры. В данной работе теоретически интерпретировался только участок подготовки микроорганизмов к росту (лаг-фаза) и фаза экспоненциального роста на основе новой комплексной модели периодической культуры А.В. Якушева, которая для этих стадий роста очень близка к синтетической хемостатной модели Н.С. Паникова. Эта модель может быть записана в форме системы дифференциальных уравнений или в виде одного интегрального уравнения. В модели экспериментальные данные это X – концентрация клеток в среде, X нулевое -исходная концентрация в суспензии культивируемых бактерий и T (время), а параметры мю м и ро. Мю - это удельная скорость роста микроорганизмов, то есть скорость роста единицы обилия микроорганизмов (биомассы, численности). Мю м - максимальная удельная скорость роста. Ро - функция физиологического состояние растущей культуры, отражающее отличие в лаг-фазе удельной скорости роста мю от мю м. Параметр ро нулевое характеризует физиологическое состояние в момент интродукции (то есть в природе). Метаболическая готовность к росту (гамма) – это фактически готовность микроорганизма к росту на конкретной среде. Мы полагаем, что метаболическая готовность к росту определяется физиологическим состоянием. Однако поскольку значения Ро нулевого колеблются на несколько порядков то необходимо логарифмировать эту величину и прибавить заведом большое число (100), чтобы получить прямую зависимость с метаболической готовностью. Физиологическое состояние бактерий, преобладающая среди членов бактериального блока экологическая стратегия и физиологическое разнообразие в гидролитическом бактериальном блоке различных почв сравнивали комплексным структурно-функциональным методом. 44 2.2. Результаты и обсуждение 2.2.1. Общая численность бактерий и динамика восстановления роста бактерий в процессе оттаивания образцов почв. Как показали проведенные ранее исследования (Boyd et al., Moiroud a.Gounot, 1969, Horowitz etal., 1972, Friedmann, 1982, Cameron,et al., 1976, Vishniac, 1993.), разнообразие и численность бактериального сообщества антарктических почв, выявляемых, в том числе, и по числу культивируемых клеток, на несколько порядков ниже по своим показателям по сравнению с почвами иных регионов. Разница в показателях числа жизнеспособных культивируемых клеток может зависеть как от химического состава и генезиса исследованных образцов антарктических почв, так и от методов выделения жизнеспособных микроорганизмов. Проведенное ранее изучение примитивных почв оазисов Ларсеманна Восточной Антарктиды показало, что общая численность бактерий в примитивных почвах влажных долин оазиса Ларсеманн не превысила 108 клеток в 1 г., это ниже значений, обычно регистрируемых в почвах умеренных широт. Также была выявлена высокая численность и доля жизнеспособных клеток в исследованных образцах (60 % и выше) свидетельствуют о высокой устойчивости бактериальных комплексов почв влажных долин к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды в условиях Восточной Антарктиды. В целом показатели численности, выявляемые по числу культивируемых клеток, из большинства исследованных нами образцов колеблются от 103 до 106кл/ г сух веса. Полученные нами данные по числу культивируемых форм гетеротрофных эубактерий, показали, что их численность в целом сопоставима с численностью культивируемых форм гетеротрофных бактерий, выделяемых из ранее изученных образцов антарктических почв. Наиболее высокие показатели числа КОЕ были отмечены в образцах каменной мостовой 45 (№ 5Д) с содержанием органики 8.8% - 2,3*105 КОЕ на г и торфянистом горизонте (№14) с содержанием органики 8.74%. - 3,8*105 КОЕ на г. Таблица 2. «Численность бактерий, определяемая методом прямого счёта и число КОЕ на г на 5 сутки культивирования при комнатной температуре на TSA)». № Разреза и описание почвы № образца C, % Прямой Число КОЕ на грамм счёт на пятые сутки культивирования M3, мох 1Д 5,85 2.8*𝟏𝟎𝟖 1,2*𝟏𝟎𝟒 M3 почва в днище влажной долины, 3 0.85 2.8*𝟏𝟎𝟖 4,9*𝟏𝟎𝟒 3Д 0,28 0.6*𝟏𝟎𝟖 Нет роста 4Д 3,3 2.2*𝟏𝟎𝟖 1,8*𝟏𝟎𝟒 5Д 8,8 3.8*𝟏𝟎𝟖 2,3*𝟏𝟎𝟓 без 10 0,08 4*𝟏𝟎𝟖 Нет роста Km+V 0-2(4) см. Каменная мостовая 13 0,12 2.9*𝟏𝟎𝟖 5,3*𝟏𝟎𝟒 14 8,74 2.3*𝟏𝟎𝟖 3,8*𝟏𝟎𝟓 15 0,26 3.1*𝟏𝟎𝟖 6,8*𝟏𝟎𝟒 B 1-2 см M2, Bfungi, 1-2 M4 0-7 песчаный мелкозём в наскальной ванне под сообществами эпилитных лишайников NsM 10-20 O мерт. 10-15P1 каменная мостовая признаков макробиоты 10-06 с торфяным горизонтом со скоплениями одноклеточных водорослей T 2-4 см. Торфянистый горизонт, в основном мёртвая биомасса B1 4-10 см. Минеральный материал, ржаво-бурый песок, есть крупнозернистый признаки мицелия (грибов или актиномицетов) В целом, как видно из таблицы, наблюдается положительная корреляция между числом культивируемых клеток гетеротрофных бактерий и содержанием органического углерода, что отмечалось ранее в других образцах формирующихся почв данного региона. Полученные нами данные, согласуются с опубликованными ранее (Соина с соавт., 2012). Авторы делают предположение, что положительная корреляция числа колониеобразующих единиц гетеротрофных бактерий указывает на то, что значимая часть 46 органического вещества лабильна и доступна для бактерий, но слабо связана с минеральной матрицей и слабогумифицирована. В целом число культивируемых клеток в исследованных образцах почв сопоставимо с такими же показателями а образцах древних мерзлых осадков Антарктиды. В отличие от данных по числу КОЕ, данные по прямому счету не выявили положительную корреляцию между содержанием органического углерода и числом определяемых клеток. Так, наиболее высокое число клеток по прямому счету 4.0*108 было выявлено в образце каменной мостовой (№10) с содержанием органики 0.08%, в то время как в торфянистом горизонте (№14) с содержанием органики 8.74% показатели численности были почти в 2 раза меньше - 2.3*108 кл на г. ( табл. 2 ). Следует отметить, что полученные показатели превышают таковые в антарктических отложениях на порядок. В тоже время, общая численность бактерий в исследованных почвах была ниже на порядок, чем обычно регистрируется в почвах умеренных широт, и значительно варьировала в разных образцах в зависимости от горизонта формирующихся почв. При сопоставлении полученных нами данных с уже имеющимися, можно сделать вывод, что наиболее высокая численность бактериальных клеток, определяемых прямым счетом, обнаруживается не на поверхности, а под защитой, например, каменной мостовой (№13, 10, 5Д), или в более глубоких горизонтах (№15, гор.В на глубине 4-10 см). Таким образом, подтверждается важная особенность влажных долин оазисов, что большая часть живой и мертвой биомассы сосредоточена под дневной минеральной поверхностью почвы, а стресс иссушением, сильный ветер и УФ-излучение в большинстве случаев препятствует развитию организмов на поверхности и заставляют их искать убежище в мелкоземе или под каменной мостовой. В некоторых образцах – верхнем органоминеральном горизонте, (№3Д), формирующемся за счет развития водорослей, и верхнем горизонте- образце каменной мостовой без признаков макробиоты (№10) культивируемые формы 47 не были обнаружены на 5 сутки культивирования на ТСА при численности по прямому счету- до 108кл на г. (табл. 2). Наличие «стерильных» горизонтов при высокой численности в них клеток по прямому счету является достаточно распространенным явлением в арктических и антарктических мерзлых породах, что может объясняться не только уровнем покоя бактериальных клеток, но и физико-химическими условиями формирования почв и осадков. 48 2.2.2. Число культивируемых клеток в условиях циклов замораживания- оттаивания. Нестабильные поверхностных условия горизонтов, воздействия колебание УФ излучения, температур до иссушение длительных отрицательных значений, позволяют рассматривать формирующиеся почвы Антарктиды как более экстремальные биотопы по сравнению с нижележащими мерзлыми осадками, где создаются стабильные условия консервации метаболических процессов, что может влиять на активизацию роста при выделении гетеротрофных бактерий на питательную среду. На способность к реактивации роста, а значит и на их биологическую активность in situ в антарктических почвах могут влиять процессы замораживания- оттаивания в летний и зимний периоды. Исследования арктических мерзлых осадков показали, что бактериальные сообщества после чередующихся циклов замораживания- оттаивания проявляют достаточно высокую устойчивость к 30 циклам замораживанияоттаивания (Демкина, 2004) Такая устойчивость некоторыми авторами рассматривается как результат возможного мутагенного действия замораживания на бактериальные сообщества в осадках разного типа криолитогенеза(Ashwood-Smith, 1970)с постоянными отрицательными температурами - в полярных районах Арктики и Антарктиды с селекцией более устойчивых к подобным стрессам форм. Исследования устойчивости бактериальных сообществ антарктических почв и мерзлых антарктических осадков до настоящего времени не проводилось. Полученные нами результаты по сравнительному анализу числа КОЕ при первом высеве из оттаявших образцов и после циклов замораживанияоттаивания представлены в таблице 3 и на рис. 5. 49 Таблица 3. Число КОЕ на грамм, определяемое на 5 сутки культивирования при комнатной температуре на TSA после первичного оттаивания и циклов замораживания-оттаивания. № Разреза и описание почвы № Прямой образца счёт M3, мох 1Д 2.8*𝟏𝟎𝟖 5,85 M3 почва в днище влажной 3 2.8*𝟏𝟎𝟖 M2, Bfungi, 1-2 3Д M4 0-7 песчаный мелкозём в C, % Исходное После 10 После 30 циклов З-О циклов З-О 1,2*𝟏𝟎𝟒 2,7*𝟏𝟎𝟓 1,5*𝟏𝟎𝟓 0.85 4,9*𝟏𝟎𝟒 6,5*𝟏𝟎𝟓 3,9*𝟏𝟎𝟓 0.6*𝟏𝟎𝟖 0,28 Нет роста 9,8*𝟏𝟎𝟒 8,3*𝟏𝟎𝟒 4Д 2.2*𝟏𝟎𝟖 3,3 1,8*𝟏𝟎𝟒 6,7*𝟏𝟎𝟓 7,9*𝟏𝟎𝟓 NsM 10-20 O мерт. 5Д 3.8*𝟏𝟎𝟖 8,8 2,3*𝟏𝟎𝟓 7,8*𝟏𝟎𝟓 6*𝟏𝟎𝟓 10-15P1 каменная мостовая 10 4*𝟏𝟎𝟖 0,08 Нет роста 4,2*𝟏𝟎𝟒 3,9*𝟏𝟎𝟒 13 2.9*𝟏𝟎𝟖 0,12 5,3*𝟏𝟎𝟒 7,2*𝟏𝟎𝟓 7,3*𝟏𝟎𝟓 14 2.3*𝟏𝟎𝟖 8,74 3,8*𝟏𝟎𝟓 8,6*𝟏𝟎𝟓 7,3*𝟏𝟎𝟓 15 3.1*𝟏𝟎𝟖 0,26 6,8*𝟏𝟎𝟒 5,8*𝟏𝟎𝟓 6*𝟏𝟎𝟓 долины, B 1-2 см наскальной ванне сообществами под эпилитных лишайников без признаков макробиоты с 10-06 торфяным горизонтом Km+V 0-2(4) см. Каменная мостовая со скоплениями одноклеточных водорослей T 2-4 см. горизонт, Торфянистый в основном мёртвая биомасса B1 4-10 см. Минеральный материал, ржаво-бурый крупнозернистый есть признаки песок, мицелия (грибов или актиномицетов) 50 10-15P1 каменная мостовая без признаков макробиоты 10-06 Km+V 02 см. Каменная мостовая со скоплениями водорослей 10-06 B1 410 см. Минеральн M2, Bfungi, 1ый 2 см материал, крупнозерни стый песок M3 почва в днище M3, 0 см, влажной мох долины, гор. B 1-2 см 10-06 T 2-4 см. Торфянистый М3 , гор. В 110-20, O см, горизонт, в 2 см подо мертвый основном мхом мох мёртвая биомасса (Рис.5. Динамика числа КОЕ выделенных из различных образцов почв при разном количестве циклов З-О.) Как видно, чередование от 10 до 30 циклов замораживания- оттаивания во всех образцах приводило к увеличению числа культивируемых гетеротрофных бактерий по сравнению числом КОЕ сразу после оттаивания образцов, в большинстве случае на порядок. Причем, значительной разницы между 10 и 30 циклами не наблюдалось. Из «стерильных» образцов почв методом замораживания- оттаивания удавалось выделить культивируемые формы численностью до 104 кл на г. Полученные результаты совпадают с опубликованными ранее по устойчивости к циклам замораживания - оттаивания бактериальных сообществ мерзлых арктических осадков (Мешкова, 1991, Демкина, 2004), однако, их устойчивость зависела от типа промерзания мерзлых отложений, что влияло на адаптационные механизмы устойчивости к таким стрессам. Полученные нами результаты позволяют предложить использовать метод замораживания- оттаивания для более полного выделения культивируемых 51 форм из антарктических почв. Помимо адаптации к подобным циклам, и отбору видов, способных к быстрой реактивации роста, можно предположить, что увеличение числа КОЕ в данном случае происходит за счет частичного разрушения биопленок, которые играют важную роль не только в сохранении жизнеспособных форм, но и в формировании органоминеральных пленок на поверхности минеральных частиц, которые в отсутствии «классических» почвенных горизонтов могут являться почвообразования. 52 единственным продуктом 2.2.3. Динамика активности каталазы и дегидрогеназы после первичного таяния образцов почв. Известно, что одной из важнейших характеристик почв является ферментативная активность, характеризующая биокаталитическую активность почв. Известно, что биокаталитическая активность почв зависит от степени обогащенности их микроорганизмами и от типа почв. Активность изменяется по генетическим горизонтам. Это связано с содержанием гумуса, типом реакций, окислительно-восстановительного потенциала и других показателей по профилю. Таким образом, интенсивность ферментативных реакций может отражать процессы, происходящие в почвах Учитывая тот факт, что почвообразовательные процессы в Антарктиде развиваются в экстремальных условиях недостатка влаги, смены температур, УФ воздействия, изучение ферментативной активности таких местообитаний представляется важным для характеристики биологической активности формирующихся почв. Как уже упоминалось в обзоре литературы, основные исследования были выполнены статистически достоверно в образцах арктических тундровых почв и осадков (Миньковская, 1995) Что касается изучения ферментативной активности в Антарктиде, исследования были немногочисленны, и касались в основном подповерхностных мерзлых осадков в районе Западной Антарктиды. В нашей работе мы исследовали динамику ферментативной активности 2-х ферментов: 1. Каталазы, которая катализирует реакции разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Образуемая в результате дыхания и при окислении органического вещества перекись водорода является вредным для живых организмов веществом, поэтому каталазу относят к антистрессовому ферменту. Каталазу синтезируют все живые организмы, и поэтому она всегда обнаруживается в почве, но при низком значении рН и высокой температуре быстро инактивируется. Особенностью активности 53 каталазы является то, что вниз по профилю она мало изменяется, имеет обратную зависимость от влажности почв и прямую – от температуры. Каталаза катализирует окислительно-восстановительные реакции, направляющие синтез и распад гумусовых веществ в почве. 2. Дегидрогеназы осуществляют окисление органических веществ в клетках, действуют на протяжении всего процесса дыхания и по характеру действия делятся на аэробные и анаэробные. Активность дегидрогеназы (DHA) считается индикатором для биологических окислительно- восстановительных систем и мерой интенсивности микробиологического разложения веществ в почве. Активность каталазы и дегидрогеназы измеряли сразу же после оттаивания образцов, а также через 7 и 14 суток после оттаивания. Одновременно определяли динамику численности культивируемых форм гетеротрофных бактерий, посеянных на питательную среду из водной суспензии образцов, сразу же после оттаивания, а также через 5, 7 и 10 суток после оттаивания из той же суспензии. Исследования показали, что во всех образцах численность культивируемых клеток увеличивалась по мере хранения образцов при комнатной температуре после оттаивания, причем в ряде образцов на порядок через 10 суток (таблица 4 и рис.6) 14 суток число КОЕ практически не менялось. 54 Таблица 4. Численность КОЕ при оттаивании образцов почв через 5,7. и 10 суток после оттаивания образцов почв (определяли на 5-ые сутки культивирования при комнатной температуре) № Разреза и описание почвы № C% 5 суток 7 суток 10 суток образца M3, мох 1Д 5,85 1,2*𝟏𝟎𝟒 7.8*𝟏𝟎𝟒 4,1*𝟏𝟎𝟓 M3 почва в днище влажной долины, B 3 0.85 4,9*𝟏𝟎𝟒 1.2*𝟏𝟎𝟓 2,6*𝟏𝟎𝟓 3Д 0,28 Нет роста 2.9*𝟏𝟎𝟑 2,8*𝟏𝟎𝟓 4Д 3,3 1,8*𝟏𝟎𝟒 8.6*𝟏𝟎𝟒 3,1*𝟏𝟎𝟓 5Д 8,8 2,3*𝟏𝟎𝟓 4.3*𝟏𝟎𝟓 9,7*𝟏𝟎𝟓 без 10 0,08 Нет роста 8,2*𝟏𝟎𝟓 9*𝟏𝟎𝟓 Km+V 0-2(4) см. Каменная мостовая со 13 0,12 2,3*𝟏𝟎𝟒 9,1*𝟏𝟎𝟒 1,8*𝟏𝟎𝟓 14 8,74 3,8*𝟏𝟎𝟓 6,2*𝟏𝟎𝟓 8,7*𝟏𝟎𝟓 15 0,26 2,8*𝟏𝟎𝟒 9,3*𝟏𝟎𝟒 1,2*𝟏𝟎𝟓 1-2 см M2, Bfungi, 1-2 M4 песчаный 0-7 мелкозём в наскальной ванне под сообществами эпилитных лишайников NsM 10-20 O мерт. каменная 10-15P1 мостовая признаков макробиоты 10-06 с торфяным горизонтом скоплениями одноклеточных водорослей T 2-4 см. Торфянистый горизонт, в основном мёртвая биомасса B1 4-10 см. Минеральный материал, ржаво-бурый крупнозернистый песок, есть признаки мицелия (грибов или актиномицетов) Общая динамика числа КОЕ 7 1Д 6 3 lg КОЕ 5 3Д 4 4Д 3 5Д 2 10 1 13 0 14 0 2 4 6 8 сутки 10 12 15 (Рис. 6. Динамика числа КОЕ при культивировании при комнатной температуре в начальный период таяния образцов, а также через 5, 7 и 10 суток после оттаивания (подсчет числа колоний осуществляли на 5ые сутки культивирования)) 55 Численность культивируемых гетеротрофных бактерий, высеянных из образцов в начальный период таяния, через 7 и 14 суток после оттаивания различается по трем основным группам образцов (см. рис. 7 ): 1) каменная представлены мостовая, гиполитными в которой первичные сообществами зеленых продуценты водорослей ОВ и цианобактерий, преимущественно в виде биопленок (обр. 10, 13), 2) моховые подстилки и горизонты с примесями оторфованного материала (обр. 1d, 3, 14, 5d) и 3) подстилающие минеральные горизонты B (обр. 15, 3d, 4d). Низкая численность гетеротрофных бактерий ожидаемо обнаружена в минеральных песчаных горизонтах B, для которых характерно небольшое содержание органического углерода. Из этой группы наибольшая численность наблюдалась в горизонте Bfungi (обр. 3d) c мицелиальными грибами, а, возможно, и актиномицетами. Повышенная численность бактерий и углерода характерна для моховых подстилок и оторфованного материала. Наиболее интересным является образец каменной мостовой, в которой в поле отсутствовали макропризнаки биоты, но оказалась высокая численность бактерий при высеве через 7 и 10 суток после оттаивания образца при низком содержании органического углерода. По данным СЭМ органическое вещество здесь представлено цианобактериальными биопленками и аморфными органоминеральными пленками (1-8 микрон) сложного генезиса на поверхности частиц кварца и полевых шпатов. Наиболее распространенной группой растений, представленной в изучаемых оазисах Восточной Антарктики являются высшие растения бриофиты- мхи. ОВ мохового генезиса - это более сложные органические соединения, нуждающиеся» в повышенной ферментативной активности для их деструкции. Другие первичные продуценты ОВ в антарктических оазисах, хлорофиты и цианофиты (зеленые водоросли и цианобактерии) организованы преимущественно в виде биопленок с привлечением защитных механизмов в 56 виде внеклеточного полимерного матрикса. По-видимому, их деструкция связана с иным уровнем активности, а возможно и составом ферментов. 10-15P1 каменная мостовая без признаков макробиоты 10-06 Km+V 02 см. Каменная мостовая со скоплениями водорослей 10-06 B1 410 см. Минеральн M2, Bfungi, 1ый 2 см материал, крупнозерни стый песок M3 почва в днище M3, 0 см, влажной мох долины, гор. B 1-2 см 10-06 T 2-4 см. Торфянистый М3 , гор. В 110-20, O см, горизонт, в 2 см подо мертвый основном мхом мох мёртвая биомасса (Рис. 7. Сравнительные показатели динамики числа КОЕ при высеве из образцов различных горизонтов формирующихся почв в разные сроки после их оттаивания.) Как показало изучение каталазной и дегидрогеназной активности в исследованных образцах их активность была низкой. В некоторых образцах она не обнаруживалась в начальный период оттаивания (№ 13 и 15). В целом, изучение динамики каталазной и дегидрогеназной активности ферментов после первичного оттаивания образцов, и далее через 7 и 14 суток после оттаивания выявило следующее: Динамика активации каталазы в процессе хранения образцов после их оттаивания выявила существенный разброс по показателям в сразу же после оттаивания и в последующие 7 и 14 суток после оттаивания - в некоторых образцах она возрастала к 7-м суткам 5Д, 3Д и 14), а в дальнейшем падала, а в 57 образце наоборот возрастала на 14 сутки после оттаивания. Т.е. в разный период оттаивания показатели менялись, и это изменение не коррелировало с возрастающим числом КОЕ. активность, мл/г почвы в минуту Общая динамика активности каталазы 0.8 0.7 0.7 0.6 0.5 0.5 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0 0 0 0.6 0.5 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0 2 4 0 6 8 10 12 14 16 сутки 3D 13 10 15 5D 4D 14 1D 3 (Рис. 8. Динамика активности каталазы в разные сроки после оттаивания.) Если автивность каталазы проявлялась прктически во всех образцах, активность дегидрогеназы была также низкой и в большинстве образцов не выявлялась , как сразу после оттаивания образцов, так и через 10 и 14 суток хранения при комнатной температуре при одновременно увеличении числа КОЕ. активность, мг ТТФ/10г почвы в сутки Общая динамика активности дегидрогеназы 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 сутки 5D 4D 1D 3D 3 10 (Рис. 9 Динамика активности дегидрогеназы в разные сроки после оттаивания.) Несмотря на низкие показатели активности каталазы и дегидрогеназы в исследованных горизонтах примитивных почв, можно сделать некоторые 58 выводы, которые даже при низких значениях могут охарактеризовать изученные образцы. Наиболее высокая каталазная активность наблюдалась в горизонте Bfungi (обр. 3d), в начальный период оттаивания – до 0.7 мл О2 / г в мин, некоторых моховых подстилках и оторфованном материале до 0.5 мл О2 / г в мин, а также в некоторых горизонтах каменной мостовой до 0.3 мл О2 / г в мин. 10-15P1 каменная мостовая без признаков макробиоты 10-06 Km+V 02 см. Каменная мостовая со скоплениями водорослей 10-06 B1 410 см. Минеральн M2, Bfungi, 1ый 2 см материал, крупнозерни стый песок M3 почва в днище M3, 0 см, влажной мох долины, гор. B 1-2 см 10-06 T 2-4 см. Торфянистый М3 , гор. В 110-20, O см, горизонт, в 2 см подо мертвый основном мхом мох мёртвая биомасса (Рис.10. Активность по каталазе.) Наибольшую дегидрогеназную активность имеют некоторые горизонты, где есть свежие или мертвые ткани мха. В некоторых моховых подстилках и одном горизонте каменной мостовой активность по ходу эксперимента нарастала или оставалась одинаковой. В горизонтах B, наоборот, снижалась. 59 10-15P1 каменная мостовая без признаков макробиоты 10-06 Km+V 02 см. Каменная мостовая со скоплениями водорослей 10-06 B1 410 см. Минеральн M2, Bfungi, 1ый 2 см материал, крупнозерни стый песок M3 почва в днище M3, 0 см, влажной мох долины, гор. B 1-2 см (Рис. 11. Активность по дегидрогеназе.) 60 10-06 T 2-4 см. Торфянистый М3 , гор. В 110-20, O см, горизонт, в 2 см подо мертвый основном мхом мох мёртвая биомасса 2.2.4.Сравнительный морфологический анализ культивируемых бактерий. Морфотипы выделенных бактериальных культур определяли по цвету и форме колоний, из которых в последующем готовили препараты для световой микроскопии и изучали их морфологию. Выделенные в чистую культуру штаммы относили предварительно к грамотрицательным или грамположительным формам по тесту с КОН. Среди выделяемых из поверхностных горизонтов бактерий - образцов каменной мостовой (№ 5Д, 10), песчаного мелкозема в наскальной ванне под сообществом эпилитных лишайников (4Д), моховой подстилки с минеральными примесями (№ 3) большинство выделенных культур относились к окрашенным формам - оранжевым, желтым, ярко- розовым, что по-видимому, позволяет им противостоять сильному ультрафиолетовому излучению, которое характерно для оазисов Антарктиды. В нижележащих горизонтах увеличивалось число неокрашенных форм. Обращает на себя внимание тот факт, что выделяемые на чашках после первоначального высева культуры по культурально-морфологическим признакам могут быть отнесены к небольшому числу таксонов, в отличие от культур, выделяемых из арктических почв, а также антарктических мерзлых осадков. Среди культивируемых культур споробразующие бактерии были выделены только из образца торфянистого горизонта (№ 13). Редкое выделение спорообразующих бактерий вообще характерно для местообитаний с отрицательными температурами, в частности, для нижележащих мерзлых осадков (Vorobyova et al., 1997, 2001). Обращает на себя внимание, также, присутствие в бактериальном сообществе изученных антарктических почв стрептомицетов, которые выделяются крайне редко из нижележащих горизонтов мерзлых осадков, но в тоже время обнаруживаются в образцах антарктических льдов. 61 (Рис.12. Процентное содержание морфотипов, выделяемых из различных образцов почв при комнатной температуре.) По морфологии выделенные нами культуры были разделены на 4 типа: коринеформные, грамположительные кокки, стрептомицеты и палочки с грамотрицательным типом клеточной стенки. На рис. 12. видно, что большинство культур относится к коккам и коринеформным бактериям, а грамотрицательные палочки составляют меньшинство. Чередующиеся циклы замораживания- оттаивания выявили, что в большинстве случаев изменений в морфотипах выделяемых культур не наблюдалось, за исключением образца почвы, формирующейся под моховым сообществом в днище влажной долины (№1Д) и образца песчаного мелкозема в наскальной ванне под сообществом эпилитных лишайников. (№4Д), где выделялись спорообразующие бактерии. 62 2.2.5 Функциональное разнообразие бактериальных сообществ. Разнообразие потребляемых субстратов мало изменяется по профилю глеезема и органоминеральной почвы с поверхностным водорослевым горизонтом, в то время как оно снижается по профилю почвы под каменной мостовой. (Рис 13. Доля быстрорастущих представителей в бактериальном блоке) Однако, доля быстро растущих бактерий в профиле этой почвы наоборот увеличивается (рис 13). Другие типы почв обнаружили иную тенденцию: либо с глубиной не изменяется данный показатель (почвы Холмов Тала) либо снижается – в глееземе оазиса холмов Ларсеманна. Это объясняется тем, что доля быстрорастущих ассоциаций отражает долю быстрорастущих бактерий (r-стратегов) в сообществе почв, а доля быстро растущих бактерий в профиле этой почвы наоборот увеличивается. Таблица 5. Физиологическое состояние образцов. Субстрат Холмы Горизонт Талла, GP algae 0-1см % % ячеек в потребляемых которых субстратов, есть рост 42 39 органоминеральная с водорослевым Субстраты Казеин, твин, НК. Ксилан, крахмал B 4-7см 33 33 покровом Казеин, твин, крахмал BC 20-25см 25 25 63 Казеин, твин, НК НК., Холмы Ларсеманна, V (0-4 см) 67 44 глеезем Казеин, твин, НК кератин, ксилан крахмал декстан пектин B1v (4-17см) 42 31 Казеин, твин, НК хитин, ксилан B1g (4-17см) 67 58 Казеин, твин, НК кератин, ксилан крахмал пектин, хитин Холмы Ларсеманна, органоминеральная с Каменная 87 65 мостовая (0-2см) казеин,крахмал, торфянистым горизонтом КМЦ крахмал хитин ксилан декстран под каменной мостовой Торфянистый 75 53 горизонт (2-4см) Минеральный Казеин, твин. крахмал, хитин ксилан декстран 37 30 Крахмал, казеин хитин горизонт (4-10 см) Доля метаболически готовых к росту на полимерах ассоциаций (воспринимаемые нами как целое), отражает действительную метаболическую готовность к потреблению полимеров in situ (Таблица 5.). Рис 14. Физиологическое состояние, оцененное по метаболической готовности к росту. Физиологическое состояние, оцененное по метаболической готовности к росту (рис 14) может в разных типах почв либо возрастать, либо падать. Таким образом, быстрое заселение r стратегами горизонтов различных почв не коррелирует с их готовностью к гидролизу полимеров, что определяется, очевидно, условиями формирования почвенных профилей. 64 65 Выводы 1. Показано, что исследованные образцы почв береговых оазисов антарктических станций Прогресс и Молодежная по показателям общего числа клеток, (10^8 кл\г), показателям КОЕ (10^4- 10^5кл\г), а также по наличию корреляции числа культивируемых гетеротрофных бактерий с содержанием органического углерода, близки к исследованным ранее почвам оазиса Холмов Ларсеманна на станции Прогресс. 2. Определение числа культивируемых форм гетеротрофных бактерий и общего числа клеток, выявляемых микроскопическим методом, выявило неоднородность в заселении формирующихся горизонтов микроорганизмами, что может быть связано с физико-химическим условиями формирования прогресс самих горизонтов. 3. Показано, что чередующиеся циклы замораживания- оттаивания приводят к увеличению числа культивируемых гетеротрофных бактерий по сравнению с показателями КОЕ из первоначально оттаявших образцов, что свидетельствует об устойчивости бактериальных сообществ к данному фактору, и может быть использовано для более полного выделения культивируемых форм из антарктических почв. 4. Исследованные образцы почв характеризуются низкой каталазной и дегидрогеназной активностью, что совпадает с данными по активности этих ферментов в арктических вечномерзлых осадках. 5. Выявлено, что условия формирования и типы антарктических почв существенно влияют на степень заселения, физиологическое состояние и физиологическое разнообразие гетероторфных бактерий. 66 Список литературы 1. Абакумов Е.В., Помелов В.Н., Власов Д.Ю., Крыленков В.А. Морфологическая организация почв Западной Антарктики // Вестник СПетерб. университета. 2008. Сер. 3. Вып. 3. C. 102-116. 2. Бабьева И.П., Голубев В.И.. Психрофильные дрожжи в оазисах Антарктиды, Микробиология, 1969, 38, 3. 3. Беликова Л.В., Гетеротрофные бактерии арктической Восточно- Сибирской тундры. Изд. АН СССР, сер. биол., 1986, №4,С. 613-616. 4. Вайнштейн М. Б., Кудряшова Е. Б., ’’О нанобактериях’’, Микробиология, том 69, №2, с. 163-179. 5. Волошин С. А., Капрельянц А. С. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях. // Биохимия, 2004. Т. 69, №1. С. 1555-1564. 6. Воробьева Е.А., Мамукелашвили А. Оценка микробной биомассы в мерзлых осадках Международная Арктики и конференция Антарктиды.// "Проблемы Тезисы криологии докладов. Земли. Фундаментальные и прикладные исследования" г. Пущино. 1997. с. 214217 7. Горячкин С. В., Гиличинский Д. А., Мергелов Н. С., Конюшков Д. Е., Лупачев А. В., Абрамов А. А., Зазовская Э. П. Почвы Антарктиды: первые итоги, проблемы и перспективы исследований // Геохимия ландшафтов и география почв (к 100-летию М. А. Глазовской). М., 2012. С. 361-388. 8. Горячкин С.В., Гиличинский Д.А., Абакумов Е.В., Зазовская Э.П., Мергелов Н.С., Федоров-Давыдов Д.Г. Почвы Антарктиды: разнообразие, география, генезис (по исследованию районов Российских станций) // Матлы V Межд. конф. по криопедологии, Улан-Удэ, 14-20 сентября 2009. С. 32. 9. Дёмкина Е.В, Автореферат диссер. к.б.н. Москва (2004). 10. Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Бактериальные сообщества тундровых почв района Диксона / /Биологические проблемы Севера. Сыктывкар. 1981. Ч.1. С.28. 67 11. Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н., Лысак Л.В.Метоы выделения и идентификации почвенных бактерий// Изд. Московского университета.1982.С.72. 12. Ершов Э.Д., Лебеденко Ю.П., Чувилин Е.М., Наумова Н.С., Массоперенос в промерзающих засоленных грунтах// Тезисы 1-ой международной конференции “Криопедология”, г.Пущино, 1992, с 69-72. 13. Ершов Э.Д., Преобразование дисперсных пород в процессе их одностороннего промерзания// Инженерная геология. – 1979. - №1. – С. 9197 14. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Под ред. Д. Кашнера. – Москва: Мир, 15. Звягинцев Д.Г., Гиличинский Д.А., Благодатский С.А., Воробьёва Е.А., Хлебников Г.М., Архангелов А.А., Кудрявцева Н.Н. Длительность сохранения микроорганизмов в постоянно мёрзлых осадочных породах и погребённых почвах // Микробиология, 1985. Т.54. № 1. С.155-161. 16. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. //Л.:Наука, 1972. 17. Мергелов Н. С., Горячкин С. В., Шоркунов И. Г., Зазовская Э. П., Черкинский А. Е. Эндолитное почвообразование и скальный «загар» на массивно-кристаллических породах в Восточной Антарктике // Почвоведение. 2012. № 10. С. 1-18. 18. Мергелов Н.С., Горячкин С.В. Почвы и почвоподобные тела Антарктиды (оазис «Холмы Ларсеманна») // Генезис, география, классификация почв и оценка почвенных ресурсов. Мат-лы научн. конф., посвященной 150летию со дня рождения Н.М.Сибирцева. VШ Сибирцевские чтения. Архангельск, 2010. С. 38-42. 19. Миньковская Н.Е., Ферментативная активность мёрзлых осадочных пород. Автореферат диссертации к.б.н. Москва, 1995. 20. Мишустин Е.Н. Почвенные микроорганизмы биогеоценоза//М.: Наука. 1984. 68 как компоненты 21. Н.А. Кряжевских, Е.В. Демкина, Н.А. Манучарова, В.С. Соина, В.Ф. Гальченко, Г.И. Эль-Регистан Реактивация покоящихся и некультивируемых форм бактерий из древних почв и мерзлых подпочвенных отложений. //Микробиология, 2012, том 81, №4, с. 474-485 22. Паринкина О.М. Микрофлора почв Арктики и ее активность // Теория почвенного криогенеза. Пущино. 1989. С.79-80. 23. Сушкина Н.Н. Об особенностях микрофлоры арктических почв // Почвоведение. 1960.4. С.75-83. 24. Якушев А.В. О кинетическом методе определения физиологического состояния бактерий в природных местообитаниях. // IV Съезд общества почвоведов им. В.В. Докучаева. Материалы докладов. 2012. Стр. 428-429. 25. Boyd W.L., et al. Ecology of soil microorganism of Antarctica // Antarctic Res. Ser., 1966. 8. p.125-159. 26. Cameron R. E., Hanson R. B., Lacy G. N., Morelli F. A. Soil Microbial and Ecological Investigations in the Antarctic Interior// Antarctic J. of the United States. 1970. Vol. 5. P. 87-88. 27. Cameron R. E., Honour R.C., Morelli T.A. " Antarctic microbiology-preparation for Mars life detection, quarantine and back contamination" In : Extreme enviroments. Mechanisms of microbial adaptation. Ed. M.R. Heinrich. Acad. Press. 1976, p.57-81. 28. Cameron R.E. / / Antarct. Terrestr. Biol. Antarct. Res. Ser. 1972 №20. p. 195260. 29. Friedman E. I., Gilichinsky D. A., Wilson G., Ostroumov V., Vorobyova E. A., Soina V. S., Sherbakova V., Vishnivetskaya T. A., Chanton J., Friedman O., McKay C. P., Rivkina E. Viable Bacteria, Methane, and High Ice Content in Antarctic Permafrost, Relevance to Mars // ISSOL’96: 8th ISSOL Meeting: 11th International Conference on the Origin of Life. Orleans, 1996. 30. Friedmann E. I. Endolithic Microorganisms in the Antarctic Cold Desert // Science. 1982. Vol. 215. P. 1045-1053. 69 31. Gilichinsky D. A., Wilson G. S., Friedmann E. I., McKay C. P., Sletten R. S., Rivkina E. M., Vishnivetskaya T. A., Erokhina L. G., Ivanushkina N. E., Kochkina G. A., Shcherbakova V. A., Soina V. S., Spirina E. V., Vorobyova E. A., Fyodorov-Davydov D. G., Hallet B., Ozerskaya S. M., Sorokovikov V. A., Laurinavichyus K. S., Shatilovich A. V., Chanton I. P., Ostroumov V. E., Tiedje J. M. Microbial Populations in Antarctic Permafrost: Biodiversity, State, Age and Implication for Astrobiology // Astrobiology. 2007. Vol. 7 (2). P. 275-311. 32. Gilichinsky D., Abakumov E., Abramov A., Fyodorov-Davydov D., Goryachkin S., Lupachev A., Mergelov N., Zazovskaya E. Soils of Mid and Low Antarctic: Diversity, Geography, Temperature Regime // Proceedings of the 19th World Congress of Soil Science. Brisbane, 2010. P. 32-35. 33. Gilichinsky D.A., Wagener S. Microbial life in permafrost./ Ed. by Gilichinsky D.-Отдел научно-технической информации ПНЦ РАН, Пущине. 1994. р.720. 34. Gilichinsky, D.A. (2001) Permafrost model of extraterrestrial habitat. In Astrobiology, edited by G. Horneck and C. Baumstark-Klan, Springer -Verlag, Berlin, pp. 125-142. 35. Gilichinsky, D.A., Vorobyova, E.A., Erokhina, L.G., Fedorov-Davydov, D.G. and Chaikovskaya, N.R. (1992) Long-term preservation of microbial ecosystems in permafrost. Adv. Space Res., 12, pp. 255-263. 36. Horowitz N.M., Cameron R. E., Hubbard J.S. Microbiology of the dry valleys. 37. Lacy G.H, Cameron R.E„ Hanson R. В.,//Antarct. J. US. 1970. №5.p. 88-89. 38. Llano G. / / Proc. ofcollog. on conserv. probl. in Antarct. Lawrence (Kans.): Alien, 1972. p. 1-12. 39. McLean A.L. //Austr. Antarct. Exped., 1911-1914: Sci. Rep. Ser. C.Sydney, 1919. Vol. 86. p. 15-44. 40. Moiroud A. Gounot A,- M. Sur une bacterie psychrophilile obligatoire isolee de limons glaciaries / / Сотр. Rend. Acad- Sci- Paris. 1969. 269. p.2150-2152. 41. Targulian V., Mergelov N., Gilichinsky D., Sedov S., Demidov N., Goryachkin S., Ivanov A. Dokuchaev’s Soil Paradigm and Extraterrestrial “Soils” / ed. by R. 70 Gilkes, N. Prakongkep // Proceedings of the 19th World Congress of Soil Science: Soil Solutions for a Changing World - 2010. Brisbane, 2010. P. 1-4. 42. Valleys of Antarctica/ / Science. 1972. Vol. 1976, N 4032. p.242-245. 43. Vishniac H. S. The microbiology of antarctic soils. In: Antarctic Microbiology. Ed.:E.J. Friedmann, Wiley-Liss, Inc.,1993., p.297-329. 44. Vorobyova, E., Soina, V., Gorlenko, M., Zalinuva, N., Mamukelashvili, A., Gilichinsky, D., Rivkina, E., and Vishnevetskaya, T. (1997) The deep cold biosphere: facts and hypothesis. FEMS Microbiol. Rev. 20, 277-290. 45. Vorobyova, E.A., Minkovsky, N., Mamukelashvili, A., Zvyagintsev, D.G., Soina V.S., Polanskaya, L., and Gilichinsky, D. A. (2001) Microorganisms and biomarkers in permafrost, In Permafrost Response on Economic Development, Environmental Security and Natural Resourses., edited by R.Paepe and V.Melnikov, Kluwer Academic Publishers, Netherlands, pp. 527-541. Абакумов В. Почвы Западной Антарктики. СПб.: Изд-во СПбГУ, 2011. 112 46. Yergeau E., Newsham K. K., Pearce D. A., Kowaichuk G. A. Patterns of Bacterial Diversity across a Range of Antarctic Terrestrial Habitats // Environmental Microbiology. 2007. Vol. 9. P. 2670-2682. 47. Zeng X., Xiao X., Wang F. Response of Bacteria in the Deep-Sea Sediments and the Antarctic Soils to Carbohydrates: Effects on Ectoenzyme Activity and Bacterial Community // J. Environ. Sci. (China). 2010. Vol. 22 (11). P. 1779. 71