Аналитическое значение определения оксидазной биоцидности

advertisement
УДК 616-002.5:576.8.77.3
АНАЛИТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗНОЙ БИОЦИДНОСТИ
НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЖЕНСКИХ ГЕНИТАЛИЙ
РАЗНОЙ СТЕПЕНИ АКТИВНОСТИ
Гучетль Е.В., Колесникова Н .В., Дорошенкова А .Е., Пономарева Л.П.
Кубанская государственная медицинская акдемия, Краснодар
ГУЗ «Клинический противотуберкулезный диспансер» департамента
здравоохранения Краснодарского края, главный врач Брагина В.В.
ТЕЗИСЫ
Биоцидность, или способность к уничтожению живых объектов, является итоговым
феноменом, в котором сфокусированы практически все звенья эффекторного потенциала
НГ – рецепция, адгезия, хемотаксис, поглощение и образование фаголизосом, секреторная
дегрануляция, метаболический взрыв. Участие НГ в противотуберкулезном иммунитете
сегодня не вызывает сомнений [8]. При этом основные дефекты НГ связаны со снижением
показателей адгезии и фагоцитоза [3], содержания неферментных катионных белков и
оксидазной биоцидности клеток [7]. Между тем данных о зависимости показателей
микробицидных систем НГ у больных с туберкулезом женских гениталий от уровня
активности процесса в доступной нам литературе не обнаружено, что и побудило
провести таковые исследования с учетом дополнительной антигенной нагрузки in vivo в
виде пробы Манту.
Оценка кислород-зависимой биоцидности НГ у больных туберкулезом женских
гениталий- ТЖГ разной степени активности была проведена с помощью классического
NBT-теста, где в качестве дополнительной антигенной нагрузки в стимулированном его
варианте были использован туберкулин. Анализируя полученные данные в целом, следует
заключить, что при туберкулезе женских гениталий наблюдаются выраженные
депрессивные изменения фагоцитарной функции НГ как на системном, так и на местном
уровне, что отличает состояние таковой от показателей фагоцитоза при ХНЗГ.
Одновременно при туберкулезе женских гениталий и неспецифических хронических
заболеваниях женской репродуктивной системы имеют место выраженные изменения
показателей оксидазной биоцидности НГ на местном и системном уровне, зависимые от
активности
туберкулезного
процесса
и
дополнительной
антигенной
нагрузки
туберкулином как in vitro (стимулированный NBT-тест), так и in vivo (проба Манту).
Снижение активности туберкулезного процесса в женской репродуктивной системе
сопровождается более выраженной, чем при АТЖГ депрессией %ФПК, особенно на
местном уровне, с отсутствием адекватного реагирования на нагрузку туберкулином in
vitro, следствием чего является более значительное, чем при активном туберкулезном
процессе снижение величины КМ перитонеальных и циркулирующих в крови НГ.
Соответствующий характер носят изменения оксидазной биоцидности НГ после
постановки пробы Манту: истощенность показателей данной функции является более
глубокой как на местном, так и на системном уровне. Это позволяет считать наблюдаемые
изменения при НТЖГ наиболее неблагоприятными в отношении противоинфекционной
защиты,
а
показатели
спонтанного
и
стимулированного
NBT-теста
считать
диагностически- и прогностически-значимыми ее маркерами.
Первыми клетками, которые сталкиваются с M.tuberculosis являются фагоциты и от
их
активности
зависит
эффективность
элиминации
возбудителя.
Вирулентность
микобактерий является вторым важнейшим фактором, определяющим результат
взаимодействия «микроб – хозяин», как развитие клинически выраженной инфекции или
бессимптомного
носительства.
При
этом
большое
значение
имеет
свойство
микроорганизма сохранять жизнеспособность внутри фагоцитов. Биоцидность, или
способность к уничтожению живых объектов, является итоговым феноменом, в котором
сфокусированы практически все звенья эффекторного потенциала НГ – рецепция, адгезия,
хемотаксис, поглощение и образование фаголизосом, секреторная дегрануляция,
метаболический взрыв. Известно
[3], что у пациентов с первично выявленным
туберкулезом легких (длительность заболевания – менее года) имеет место достоверное
снижение показателей адгезии и фагоцитоза, тогда как у больных с более давним сроком
начала болезни, находящихся на длительном патогенетическом лечении, парметры
адгезии и фагоцитоза находятся в пределах нормы Наряду с этим, доказано [4], что у
тубинфицированных детей резко снижается процент активно-фагоцитирующих клеток на
фоне сохранения их поглотительной способности Принимая во внимание факт, что НГ
вносят существенный вклад в механизмы иммунобиологической реакции по ограничению
и подавлению микробной инфекции, необходимо учитывать их функциональную
активность при разработке иммунореабилитационных программ у данной категории
больных. При этом большой интерес представляет оценка фагоцитарной функции НГ
периферической крови и местых очагов воспаления при внелегочном туберкулезе
различной степени активности.
Известно, что нейтрофильные гранулоциты (НГ) периферической крови в период
обострения хронических инфекций характеризуются различными дисфункциями, которые
чаще всего представлены нарушениями фагоцитарной активности и способности к
киллингу и перевариванию бактериальных антигенов [4,5,10,11]. Это приводит к
персистенции бактериальной инфекции, нарушению элиминации антигенов и иммунных
комплексов, в свою очередь, отягощающих течение основного процесса, ухудшающих
прогноз заболевания и индуцирующих формы заболеваний, резистентных к традиционной
терапии [1,2,6,9]. Участие НГ в противотуберкулезном иммунитете сегодня не вызывает
сомнений [8]. При этом основные дефекты НГ связаны со снижением показателей адгезии
и фагоцитоза [3], содержания неферментных катионных белков
и оксидазной
биоцидности клеток [7]. Между тем данных о зависимости показателей микробицидных
систем НГ у больных с туберкулезом женских гениталий от уровня активности процесса
в доступной нам литературе не обнаружено, что и побудило провести таковые
исследования с учетом дополнительной антигенной нагрузки in vivo в виде пробы Манту.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.1 Характеристика исследуемого контингента
Для реализации цели настоящего исследования обследовано 67 больных
туберкулезом женских половых органов, 32 больных хроническими неспецифическими
заболеваниями женских половых органов поступивших в ГУЗ «Клинический
противотуберкулезный диспансер» департамента здравоохранения Краснодарского края
(КПТД) с 1995 по 2002 гг. и 55 практически здоровых лиц.
Больные были разделены на 3 подгруппы: «а» - составили пациенты с
активным туберкулезом (АТЖГ), «б» - с неактивным туберкулезом (НТЖГ), «в» – с
неспецифическими заболеваниями женских гениталий (ХНЗЖГ). У всех больных
заболевание выявлено впервые.
Таблица 1.1.
Распределение больных по характеру процесса и возрасту
Группа
Возраст в годах
Всего
До 25 лет
26-40 лет
Старше 40
1а
АТЖГ
14(43,8%)
13(40,6%)
5(15,6%)
32
1 б НТЖГ
7(20%)
14(40%)
14(40%)
35
1 в ХНЗЖГ
7(21,8%
11(34,4%)
14(43,8%) 32
Все пациенты прошли унифицированное обследование.
Проведен анализ жалоб и анамнестических данных, общеклинического,
иммунологического рентгенологического обследования (рентгенография грудной клетки,
гистеросальпингография), бактериологического, молекулярно-генетического (ПЦР),
морфологического исследования крови и перитонеальной жидкости Дугласова
пространства.
Группа
Количество
больных(чел.)
СОЭ> 15 мм/час
Лейко
циты>10х109/л
АТЖГ
32
(100%)
11
(34,4%)
3
(9,4%)
Таблица.1.2
Клинико-лабораторная характеристика больных
НТЖГ
ХНЗГ
35
32
(100%)
(100%)
3
(8,6%)
1
(2,9%)
3
(9,4%)
1
(3,1%)
Лимфоциты
<20%
Лимфоциты
>40%
Моноциты
>8%
Эозинофилы
>4%
Проба Манту
нормергия
Проба Манту
гиперэргия
Проба Манту
отрицательная
МБТ бактериология
МБТ
2
(6,2%)
2
(5,1%)
1
(3,1%)
12
(38,5%
3
(8,6%)
1
(3,1%)
7
(21,9%)
1
(2,9%)
1
(3,1%)
1
(3,1%)
1
(2,9%)
1
(3,1%)
25
0
0
(78,1%)
2
(6,2%)
0
0
5
(15,6%)
35
(100%)
32
8
(25%)
21
(65,6%)
0
(100%)
0
4
(11,4%)
1
(3,1%)
ПЦР
Клиническая оценка больных с заболеваниями женских гениталий показала,
что жалобы на боли предъявляли больные всех подгрупп, но чаще пациентки с АТЖГ.
Бесплодие наблюдалось у больных всех подгрупп с одинаковой частотой(78,1%-94,2%).
Нарушение менструального цикла фиксировалось как у больных туберкулезом, так и у
пациенток с ХНЗЖГ.
Таблица 1.3
Частота основных жалоб больных туберкулезом женских гениталий
Группы
Форма
заболевания
женских
половых
органов
Частота основных жалоб
(количество больных)
Боли
Бесплодие
(количество
(количество
больных)
больных)
1а
АТЖГ
22(68,7%)
25(78,1%)
Нарушение
цикла
(количество
больных)
19(59,4%)
1б
НТЖГ
17(48,6%)
33(94,2%)
9(25,7%)
35
1в
ХНЗЖГ
14(43,8%)
28(87,5%)
11(34,3%)
32
Всего
больных
32
При этом у больных с АТЖГ была яркая клиническая картина с симптомами
интоксикации различной степени выраженности (слабость, потливость, повышение
температуры тела, снижение аппетита и т.д.), наблюдаемыми у 17 больных(53,1%).
Методом посева обнаружены МБТ у 8(25%) женщин, методом ПЦР – у 21(65,6%). С
момента появления первых признаков заболевания до поступления больных в стационар
прошло от 3 до 18 месяцев.
В детстве по поводу виража туберкулиновых проб в противотуберкулезных
диспансерах наблюдались 12,5% больных (4 женщины). У 16(50%) пациенток диагноз
установлен по клинико-рентгенологическим признакам, а у 14(43,7%) - диагноз
верифицирован на основании морфологического исследования.
Морфологическое изучение (Таблица 1.4) крови позволило у 19 (59,4%)
женщин определить изменения, указывающие на активность специфического процесса. В
частности повышение СОЭ (>15 мм/час) найдено у 11(34,4% ) больных, лейкоцитоз (> 10
000\мкл) – у 3 (9,4% ), лимфопения (< 20%) – у 2 (6,2% ), лимфоцитоз (> 40%) – у 12 (38,5%
), моноцитоз (> 8%) – у 7(21,9% ), эозинофилия (> 4%) – у 1 (3,1% ).
Форма
заболе
вания
АТЖГ
НТЖГ
ХНЗГ
Конт
роль
СОЭ
мм/час
Таблица 1.4
Показатели лейкограммы у больных
с туберкулезом женских гениталий
Нейтрофилы ЛимфоцитыМоноциты Эозинофилы
Лейкоциты(109/л)
%
%
%
%
15,00±4,0
14,00±1,0
16,00±2,0*
12,00±2,0
7,00±4,8
7,10±5,2
6,50±3,4
6,00±2,2
45,60±2,02*
54,20±3,9
51,10±1,4
65,5±5,0
45,8±1,43
36,5±3,37
35,4±2,5*
44,0±2,9
6,5±1,5*
6,0±2,0
5,5±2,0
4,0±1,0
1,5±1,0
1,4±0,7
1,5±2,0
1,7±0,25
Примечание:*- различие достоверно по сравнению с ХНЗГ при (p<0,05)
Ú-различие
достоверно
по
сравнению
между
группами
больных
туберкулезом
при
(p<0,05)
Как следует из приведенных данных, наиболее часто изменялись СОЭ,
количество лейкоцитов и лимфоцитов. В то же время у 6 (28,1% ) больных
гематологические показатели оставались в пределах нормы.
Специфическую аллергическую реакцию определяли пробой Манту с 2ТЕ с
оценкой реакции согласно инструкции по применению туберкулиновых проб. При этом у
25 (78,1% ) больных реакция оказалась нормергической ( папула от 5 до 20 мм), у 2 (6,2%)
имели гиперергические проявления, а у 5 пациенток (15,6% ) – проба Манту была
отрицательной.
При сравнении данных гистеросальпингограмм отмечено, что проходимость
маточных труб с их незначительной деформацией в ампулярном отделе сохранялась у 11
(34,4%) больных активным туберкулезом гениталий, причем характерные
рентгенологические признаки зафиксированы у 7(21,9%) больных.
У 35 женщин выявлен неактивный туберкулез женских гениталий: диагноз
подтвержден патогистологически, МБТ методом посева не были выявлены, а методом ПЦР
- обнаружены у 4(11,4%). Длительность заболевания у 4 обследованных составила более
10 лет, у 16 – более 5 лет, а у 15 - от 3 до 5 лет. В детстве по поводу виража
туберкулиновых проб в противотуберкулезных диспансерах наблюдались 2 женщины
(5,7%).
Морфологическое исследование крови выявило следующее: повышение СОЭ
(>15 мм/час) - у 3(8,6% ) больных, лейкоцитоз (> 10 000\мкл) – у 1( 2,9% ), лимфопению (<
20%) – у 2 (5,1% ), лимфоцитоз (> 40%) – у 3 (8,6% ), моноцитоз (> 8%) – у 1(2,9% ),
эозинофилию (> 4%) – у 1 пациентки (2,9% ).
При сравнении данных гистеросальпингограмм отмечено, что проходимость
маточных труб с их незначительной деформацией в ампулярном отделе сохранялась у
7(14,3%) больных с неактивным туберкулезом гениталий. Характерные рентгенологические
признаки зафиксированы у 11(31,4%) больных неактивным туберкулезом гениталий.
1.2. Методы исследования
Оценка кислород-зависимой биоцидности НГ у больных туберкулезом
женских гениталий- ТЖГ разной степени активности была проведена с помощью
классического NBT-теста, где в качестве дополнительной антигенной нагрузки в
стимулированном его варианте были использован туберкулин. При этом как в спонтанном,
так и в стимулированном тесте определяли процентное содержание формазан-позитивных
клеток (%ФПКсп., %ФПКст.), и рассчитывали коэффициент мобилизации (КМ) по
отношению %ФПК в стимулированном и спонтанном NBT-тесте. Исследовались
нейтрофилы крови и перитонеальной жидкости Дугласова пространства.
Перитонеальные макрофаги получали из перитонеальной жидкости
Дугласова пространства. С этой целью пробирки с ПЖДП центрифугировали при 2,500
об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость убирали, а к осадку добавляли 1 мл
среды 199 и осторожно ресуспендировали. Количество клеточных элементов подсчитывали
в камере Горяева.
1.2.1 Реакция бактериального фагоцитоза нейтрофилов сопределением степени
завершенности (Нестерова И.В., 1996)
Каплю капилярной крови из пальца наносили на середину хорошо
обезжиренного стекла, добавляли 10 мкл гепарина, и 10 мкл микробной взвеси Candida
albicans на физрастворе. Инкубировали в термостате во влажной камере в течение 120
минут при 37°С. Мазки сушили, фиксировали в метаноле в течение 5 минут и окрашивали
по Романовскому в течение 5-10 минут. Промывали в дистиллированной воде, сушили,
микроскопировали под иммерсией в световом микроскопе. При этом оценивали
поглотительную способность и переваривающую функцию фагоцитов.
Определялись следующие показатели:
-
процент фагоцитоза – процент НГ, поглотивших микробы
(%ФАН), из общего числа посчитанных нейтрофилов;
-
фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число фагоцитированных
микробов, приходящееся на 1 «активный» НГ (ФАН);
-
фагоцитарный интегральный индекс (ФИ) – среднее число
фагоцитированных микробов, деленное на 100 НГ.
- индекс переваривания (ИП) = Муб
Ф
(среднее число убитых микробов на 1 посчитанный НГ).
1.2.2 Оценка активности оксидазной микробицидной системы нейтрофилов
1.2.2.1 Спонтанный NBT-тест (Нестерова И.В. и соавт., 1996)
На середину хорошо обезжиренного предметного стекла помещали каплю
крови в ЭДТА, добавляли 10 мкл гепарина (2 ед), затем добавляли 10 мкл физраствора и 10
мкл 0,1% раствора NBT. Мазок инкубировали в термостате при 37˚С в течение 15 минут.
Излишек крови осторожно удаляли наклоном стекла под 45˚, фиксировали в метаноле в
течение 2 минут, подсушивали и докрашивали ядра 0,5% раствором нейтрального красного.
Подсчитывали клетки с восстановленным формазаном (% формазан позитивных клеток %ФПК) по принципу Kaplow L.S. (1955). Рассчитывали средний цитохимический индекс
(СЦИ):
СЦИ =- 1а + 2b + 3c + 4d %ФПК= b+c+d
100
где a, b, c, d -количество НГ соответственно 1, 2, 3, 4 степени
Оценка микробицидной системы нейтрофильных гранулоцитов в
1.2.2.2
нагрузочных тестах in vitro (стимулированный NBT-тест)
На середину двух хорошо обезжиренных предметных стекол помещали каплю
биожидкости, добавляли 10 мкл гепарина (2 ед.), затем в NBT-стимулированный тест
добавляли
туберкулин и 10 мкл 0.1% раствора нитросинего
тетразолия. Нужное
разведение готовили из сухого очищенного туберкулина следующим образом: содержимое
ампулы с препаратом разводили 1 мл растворителя, получали основной раствор
туберкулина,
содержащий
в
1
мл
50000
ТЕ.
Первое
разведение
туберкулина,
соответствующее 10000 ТЕ в 1мл готовят путем разведения основного раствора в 4 мл
растворителя. Второе разведение туберкулина готовили путем разведения первого в 10 раз,
т.е. к 1 мл первого разведения прибавляли 9 мл растворителя, в итоге
1000 ТЕ в 1мл (100 ТЕ в 0,1 мл).
получали
А в NВТ-спонтанный - 10 мкл физраствора и 10 мкл0,1%
раствора NВТ. Оба мазка инкубируются в термостате при 37°С в течение 15 минут.
Излишек биожидкости осторожно удаляли наклоном стекла под 45° и на предметных
стеклах оставался микролейкоконцентрат, ограниченный хорошо видимыми контурами
капли. Мазки фиксировали в метаноле в течение 1 минуты. Подсушивали и докрашивали
ядра 0,5% раствором нейтрального красного.
Подсчитывали
клетки
с
восстановленным
формазаном
(%
формазан
позитивных клеток - %ФПК) по принципу Kaplow L.S. (1955). Расчитывали средний
цитохимический индекс (СЦИ) и коэффициент мобилизации (КМ):
СЦИ =- 1а + 2b + 3c + 4d
%ФПК= b+c+d
100
где a, b, c, d -количество НГ соответственно 1, 2, 3, 4 степени,
КМ = % формазан-позитивных НГ в стимулированном NBT
% формазан-позитивных НГ в спонтанном NBT
или
КМ(СЦИ) = СЦИ NBTстимулированного
СЦИ NBTспонтанного
2.1 Результаты исследования
2.1.1
Фагоцитарная
активность
нейтрофильных
гранулоцитов
крови
при
туберкулезе женской репродуктивной системы
Таблица 2.1.1
Фагоцитарная активность и переваривающая способность НГ периферической крови при
туберкулезе женских гениталий разной степени активности (М±м,р)
Группа
%ФАН
ФИ
ФЧ
ИП
АТЖГ
24,40±2,06
0,36±0,03
1,45±0,04
1,20±0,05
р1<0,05
p1<0,001
p1<0,001
p1<0,001
p2<0,01
21,46±1,20
0,32±0,02
1,46±0,06
1,18±0,04
p1<0,001
p1<0,001
p1<0,001
р1<0,001
p2<0,01
35,20±0,50
34,50±3,60
1,85±0,02
1,90±0,08
5,50±0,05
5,50±0,04
р2<0,001
1,50±0,05
1,50±0,04
НТЖГ
ХНЗГ
Контроль
Примечание:
P1 – достоверность различий с контролем; Р2 – достоверность различий с ХНЗП; Р3 –
достоверность различий между группами больных МПТ
Проведенными исследованиями установлено (Таблица 2.1.1), что при туберкулезе
женских гениталий относительно практически здоровых лиц имеет место достоверное
подавление относительного содержания активно-фагоцитирующих клеток.
Рис.2.1.1 Относительно содержание активных фагоцитов при туберкулезе женских
гениталий разной степени активности
АТЖГ
–
активный
туберкулез
НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий
женских
гениталий
ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий
Контроль – практически здоровые лица
Причем наиболее выраженное – при неактивном туберкулезном процессе (в 1,4 раза).
В то же время при хронических неспецифических заболеваниях гениталий этот показатель
не отличается от такового в контроле.
Однако снижение ИП было менее значительно,
хотя и достоверно снижено (р<0,05) у больных ТЖГ по отношению к сравниваемым
группам. Несмотря на то, что при АТЖГ исследуемые показатели были выше, чем при
НТЖГ, отсутствие достоверных различий между ними не позволяет использовать их в
качестве критериев активности туберкулезного процесса. Однако их оценка имеет
диагностическое значение при дифференцировании заболеваний женской репродуктивной
системы воспалительного или туберкулезного характера(Рис.2.1.1).
Рис.2.1.2 Поглотительная способность (ФИ,ФЧ) и переваривающая
активность (ИП) НГ при туберкулезе женских гениталий разной степени активности
АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий
НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий
ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий Контроль –
практически здоровые лица
Сходный характер изменений отмечен и в отношении показателей поглощения и
переваривания бактериального антигена (БАГ). В частности, наблюдалось 5-ти кратное
снижение величины ФИ и почти 4-х кратное - ФЧ при АТЖГ и НТЖГ относительно ХНЗГ
и контроля(Рис.2.1.2).
После пробы Манту (Таблица 2.1.1.1) при активном и неактивном женских гениталий
уменьшается % активно-фагоцитирующих клеток (%Ф), по сравнению с контрольными
показателями, при активном туберкулезе в 1,6 раза, при неактивном – в 2 раза (23,20±1,20
против 48,90±2,45).
Таблица 2.1.1.1
Влияние пробы Манту фагоцитарнуюя активность и переваривающую способность НГ
крови у больных туберкулезом женских гениталий (М±м,р)
Показатели
Группа
%ФАН
АТЖГ
Показатели
до пробы Манту
ФИ
ФЧ
24,40±2,06
0,36±0,03
1,45±0,04
р1<0,05
p1<0,001
p1<0,001
p2<0,01
%ФАН
после пробы Манту
ФИ
ФЧ
29,9±2,30
0,54±0,06
1,45±0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
НТЖГ
21,46±1,20
0,32±0,02
1,46±0,06
p1<0,001
p1<0,001
p1<0,001
p2<0,01
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p3<0,05
23,20±1,20
p3<0,05
0,33±0,02
1,46±0,02
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p3<0,05
p3<0,05
1,86±0,05
4,58±0,05
р1<0,05
2,00±0,03
р1<0,05
4,08±0,05
ХНЗГ
35,20±0,50
1,85±0,02
5,50±0,05
p3<0,05
40,30±0,20
Контроль
34,50±3,60
1,90±0,08
5,50±0,04
р1<0,05
48,90±2,45
Примечание:
P1 – достоверность различий с контролем
Р2 – достоверность различий с ХНЗГ
Р3 – достоверность различий между группами
Сходный характер изменений отмечен и в отношении показателей поглощения и
переваривания бактериального антигена (БАГ).
В частности, наблюдалось 4-х
кратное снижение величины ФИ и почти 3-х кратное - ФЧ при АТЖГ относительно ХНЗГ
и контроля. Однако снижение ИП было менее значительно, хотя и достоверно снижено
(р<0,05) у больных ТЖГ по отношению к сравниваемым группам (Таблица 2.2.2)
После пробы Манту по сравнению с исходными показателями при АТЖГ %
активно-фагоцитирующих клеток (%Ф) возрос на 22%, при НТЖГ – на 8 %, при
ХНЗГ на 14%, в то же время как контроле возрос на 41%.
ФИ увеличился на 50% при АТЖГ, на 3% при НТЖГ. В контроле и при ХНЗГ он
практически не изменился.
. ФЧ увеличилось на 35% при АТЖГ, на 6% при НТЖГ. При ХНЗГ оно уменьшилось
до 83,2%.
2.2.1
Фагоцитарная
активность
перитонеальных
нейтрофилов
больных
с
туберкулезом женских гениталий
Между тем исследование показателей фагоцитарной функции НГ при ХНЗГ и ТЖГ
на местном уровне позволила определить некоторые критерии степени активности
туберкулезного процесса (Рис.2.2.1.1).
Рис.2.2.1.1Относительно содержание активных фагоцитов перитонеальной жидкости
при туберкулезе женских гениталий разной степени активности
АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий
НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий
ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий
Контроль – практически здоровые лица
Во всяком случае, на это указывает достоверно более низкий %ФАН не только в
сравнении с контролем и ХНЗГ, но и по отношению к НТЖГ (17,10±0,03 против
20,00±0,05 при НТЖГ и против 33,80±2,60 – в контроле). При ХНЗГ данный показатель
также имел достоверные отличия от такового у женщин с ТЖГ, однако по отношению к
контролю наблюдалась лишь тенденция к снижению количества активных фагоцитов
(32,00±1,50). Обращает на себя внимание также
более глубокая депрессия ФИ
нейтрофилов перитонеальной жидкости при НТЖГ (0,38±0,03) в сравнении с активным
туберкулезным процессом (0,51±0,04), тогда как ФЧ оказывается достоверно более
Рис.2.2.1.2 Поглотительная способность (ФИ,ФЧ) и переваривающая
активность (ИП)
НГ перитонеальной жидкости при туберкулезе
гениталий разной степени активности
женских
АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий
НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий
ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий
Контроль – практически здоровые лица
высоким при АТЖГ (2,98±0,03 против 1,90±0,04 при НТЖГ) (Рис.2.1.2). Между тем
показатели поглощения БАГ при ХНЗГ достоверно не отличались от контроля, имея лишь
незначительную тенденцию к снижению, что коррелировало со сходной картиной
изменений в периферической крови. Переваривающая способность клеток, как и у НГ
периферической крови, была угнетена в меньшей степени, чем поглотительная, однако
достоверно отличалась от таковой в группе с ХНЗГ и практически здоровых лиц.
Анализируя полученные данные в целом, следует заключить, что при туберкулезе
женских гениталий наблюдаются выраженные депрессивные изменения фагоцитарной
функции НГ как на системном, так и на местном уровне, что отличает состояние таковой
от показателей фагоцитоза при ХНЗГ. При этом для НГ периферической крови больных
ТЖГ характерна тенденция к более выраженному снижению %ФАН, ФИ и ИП, а для НГ
перитонеальной жидкости – достоверное снижение %ФАН, прямо коррелирующее с
усилением активности туберкулезного процесса.
После пробы Манту при активном и неактивном женских гениталий уменьшается %
активно-фагоцитирующих клеток (%Ф), по сравнению с контрольными показателями,
при активном туберкулезе в 1,6 раза, при неактивном – в 2 раза (23,20±1,20 против
48,90±2,45).
Таблица 2.2.2
Влияние пробы Манту фагоцитарную активность и переваривающую способность
перитонеальных НГ у больных туберкулезом женских гениталий (М±м,р)
Показатели
Группа
%ФАН
АТЖГ
Показатели
до пробы Манту
ФИ
ФЧ
17,10±0,06
0,51±0,03
2,98±0,04
р1<0,05
p1<0,001
p1<0,001
p2<0,01
НТЖГ
20,00±0,02
0,38±0,02
1,90±0,06
p1<0,001
p1<0,001
p1<0,001
p2<0,01
ХНЗГ
Контроль
32,00±1,50
33,80±2,60
2,00±0,02
2,20±0,08
6,25±0,05
6,75±0,04
%ФАН
после пробы Манту
ФИ
ФЧ
28,20±0,03
0,59±0,06
2,34±0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p3<0,05
22,40±0,05
p3<0,05
0,36±0,02
1,61±0,02
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p3<0,05
p3<0,05
29,90±2,20
p3<0,05
0,54±0,05
1,96±0,15
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
39,90±2,45
1,40±0,03
3,50±0,15
Примечание:
P1 – достоверность различий с контролем
Р2 – достоверность различий с ХНЗГ
Р3 – достоверность различий между группами ТГ
Сходный характер изменений отмечен и в отношении показателей поглощения и
переваривания бактериального антигена (БАГ).
В частности, наблюдалось 4-х
кратное снижение величины ФИ и почти 3-х кратное - ФЧ при АТЖГ относительно ХНЗГ
и контроля. Однако снижение ИП было менее значительно, хотя и достоверно снижено
(р<0,05) у больных ТЖГ по отношению к сравниваемым группам (Таблица 2.2.2).
После пробы Манту по сравнению с исходными показателями при АТЖГ %
активно-фагоцитирующих клеток (%Ф) возрос на 47%, при НТЖГ – на 12 %, при
ХНЗГ на 21%, в то же время как контроле возрос на 18%.
ФИ увеличился на 15% при АТЖГ, при НТЖГ уменьшился на 6%. В контроле он
составил 63,6% и при ХНЗГ он практически не изменился.
ФЧ уменьшилось на 22% при АТЖГ, на 16 % при НТЖГ. При ХНЗГ оно
уменьшилось до 87,4% в контроле уменьшилось до 52%.
3.1.1 Кислород-зависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови больных с
туберкулезом женских гениталий
Анализ результатов оценки оксидазной биоцидности НГ периферической крови в
спонтанном NBT-тесте показал (Рис.3.1), что при
активном туберкулезе женских
гениталий (АТЖГ) достоверно увеличивается %ФПК (3,90±0,70 против 2,00±0,50 у
практически здоровых лиц). Данные изменения носят специфический для активного
туберкулезного процесса характер, поскольку при хронических неспецифических
заболеваниях гениталий (ХНЗГ) процентное содержание ФПК не отличалось от контроля
(2,10±0,30),
а
при
неактивной
форме
заболевания
(НТЖГ)
отмечается
лишь
незначительная тенденция к увеличению %ФПК (2,25±0,30).
При дополнительной антигенной нагрузке туберкулином in vitro
адекватный
контрольному ответ оксидазной биоцидной системы отмечается лишь при ХНЗГ
(%ФПК=8,70±0,30 против 9,1±0,50 в контроле), тогда как при ТЖГ имеет место
недостаточное возрастание %ФПКст., обуславливающее снижение величины КМ,
наиболее выраженное – при НТЖГ (1,25±0,30 против 3,00±0,05 в контроле).
Дефекты оксидазной биоцидности НГ при ТЖГ особенно отчетливо прослеживаются
при сравнении полученных данных NBT-теста с таковыми после пробы Манту (Таблица
2.1). В частности, показано, что у здоровых лиц туберкулиновая проба вызывает
достоверное 4-х кратное возрастание %ФПК
Рис.3.1 Показатели NBT-теста нейтрофилов периферической крови при
туберкулезе женских гениталий разной степени активности
АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий
НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий
ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий
Контроль – практически здоровые лица
в спонтанном тесте и 6-ти кратное – в стимулированном с сохранением адекватного
реагирования на туберкулин in vitro, о чем свидетельствует величина КМ (2,18 ±0,03).
Между тем при ТЖГ наблюдается лишь 1,5-кратное
возрастание %ФПК как в
спонтанном, так и в стимулированном NBT-тесте с соответствующей выраженной
депрессией величины КМ (0,85±0,20). При НТЖГ имело место не только более низкий,
чем при АТЖГ, процент ФПК в спонтанном тесте, но и его дальнейшее снижение при
дополнительной антигенной нагрузке in vitro c достоверным снижением величины КМ
(0,95±0,10).
Таблица 3.1
Влияние пробы Манту на оксидазную биоцидность нейтрофилов периферической крови у
больных туберкулезом женских гениталий (М±м,р)
Группа
Показатели NBT-теста
%ФПКсп
до пробы Манту
%ФПКст.
КМ
Показатели NBT-теста
после пробы Манту
%ФПКсп
%ФПКст.
КМ
АТЖГ
3,90±0,70
4,50±0,60
1,90±0,70
5,70±0,50
5,10±0,50
0,85±0,20
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,001
р1<0,001
р1<0,001
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,001
p2<0,001
p3<0,05
2,25±0,30
p3<0,05
2,80±0,50
1,25±0,30
p3<0,05
4,25±0,40
3,90±0,50
p3<0,001
1,95±0,10
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
p3<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
ХНЗГ
p3<0,05
2,10±0,30
p3<0,05
8,70±0,30
2,10±0,30
p3<0,05
2,80±0,25
11,20±0,20
1,88±0,30
Котроль
2,00±0,50
9,10±0,50
р1<0,01
3,00±0,05
р1<0,001
8,20±0,45
р1<0,05
12,40±0,30
р1<0,05
2,18±0,03
НТЖГ
Примечание :P1 – достоверность различий с контролем
Р2 – достоверность различий с ХНЗГ
Р3 – достоверность различий между группами больных ТЖГ
Отличительной особенностью НГ больных с ХНЗГ после пробы Манту явилось
максимально низкое значение %ФПК в спонтанном тесте (в 6 раз более низкое, чем в
контроле). Однако при этом сохраняется адекватное реагирование показателей оксидазной
биоцидности на дополнительную антигенную нагрузку туберкулином in vitro, о чем
свидетельствует величина КМ в данной группе больных, соответствующая таковой в
диапазоне контроля (1,88±0,30).
3.2 Кислород-зависимый метаболизм перитонеальных нейтрофилов
больных с туберкулезом женских гениталий
Анализ
полученных
результатов
исследования
оксидазной
биоцидности
перитонеальных НГ свидетельствует о наличии достоверных изменений показателей
спонтанного и стимулированного NBT-теста при его постановке до и после пробы Манту.
В частности установлено (Рис.3.2), что при АТЖГ имеет место достоверное (р<0,05)
возрастание %ФПК в перитонеальной жидкости (5,10±0,05), что в среднем в два раза
превышает уровень такового в
Рис.3.2 Показатели NBT-теста перитонеальных нейтрофилов при туберкулезе
женских гениталий разной степени активности
АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий
НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий
ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий
Контроль – практически здоровые лица
группе с НТЖГ (2,50±0,06), ХНЗГ (2,10±0,30) и у здоровых лиц (2,80±0,40).
Дополнительная нагрузка туберкулином in vitro позволила выявить адекватное
увеличение процента клеток, содержащих формазан, лишь в контрольной группе
(10,10±0,20) и при хронической неспецифической патологии гениталий (7,70±0,20), тогда
как при ТЖГ отмечалось достоверное по отношению к контролю снижение %ФПКст. при
АТЖГ (6,50±0,60) и более значительное – при НТЖГ (2,80±0,50). Такой характер
изменений %ФПК в стимулированном NBT-тесте отразился на величине коэффициента
мобилизации, который был максимально снижен при НТЖГ ( 1,15±0,30 против 3,10±0,04
в контроле)) и достоверно отличался от такового у здоровых лиц при АТЖГ (1,80±0,65).
Между тем при ХНЗГ значения КМ перитонеальных НГ не отличался от таковых в
контроле (3,30±0,09), что свидетельствует об отсутствии явных и скрытых нарушений в
кислород-зависимой биоцидности НГ перитонеальной жидкости при заболеваниях
женских гениталий нетуберкулезного характера.
Постановка пробы Манту в исследуемых группах позволила установить (Таблица
3.2), что в группе практически здоровых женщин происходит достоверное увеличение
%ФПК в спонтанном и стимулированном
NBT-тесте с сохранением КМ на уровне
адекватного реагирования, соответствующем таковому до нагрузки туберкулином in vivo
(3,20±0,05). Между тем данные спонтанного NBT-теста в клинических группах
свидетельствовали о
почти трехкратном снижении %ФПК
при ХНЗГ, а также
уменьшении данного показателя при НТЖГ в 1,9 раза и при АТЖГ – в 1,2 раза. Важное
диагностическое значение имеет достоверно более низкое снижение %ФПК при ХНЗГ в
сравнении с активным ТЖГ (р<0,05), в то время как между значениями данного
показателя в группах больных АТЖГ и НТЖГ достоверных отличий обнаружено не было.
Анализ показателей стимулированного NBT-теста после постановки пробы Манту
свидетельствует о том, что при туберкулезе женских гениталий наблюдается возрастание
%ФПК, но менее выраженное, чем в контрольной группе. В частности, при АТЖГ этот
показатель увеличился на 20%, а при НТЖГ – лишь на 6%. Между тем при ХНЗГ имело
место существенное возрастание %ФПК (в 3,3 раза). Тем не менее, величина КМ в
сравниваемых клинических группах была достоверно более низкой, чем в контроле,
причем
Таблица 3.2
Влияние пробы Манту на оксидазную биоцидность перитонеальныхнейтрофилов у
больных туберкулезом женских гениталий (М±м,р)
Группа
Показатели NBT-теста
%ФПКсп
АТЖГ
НТЖГ
до пробы Манту
%ФПКст.
КМ
Показатели NBT-теста
после пробы Манту
%ФПКсп %ФПКст.
КМ
5,10±0,05
6,50±0,60
1,80±0,65
7,50±0,30
9,10±0,50
1,85±0,50
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p3<0,05
2,50±0,06
p3<0,05
2,80±0,50
1,15±0,30
p3<0,05
4,90±0,20
p3<0,05
5,20±0,40
1,25±0,20
p3<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
р1<0,05
p3<0,05
ХНЗГ
Контроль
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
p2<0,05
2,10±0,30
p3<0,05
7,70±0,20
p3<0,05
2,30±0,09
p3<0,05
3,40±0,45
p3<0,05
11,20±0,20
2,85±0,05
2,80±0,40
р1<0,05
10,10±0,20
р1<0,05
3,10±0,04
р1<0,05
9,15±0,25
р1<0,05
13,20±0,30
р1<0,05
3,20±0,05
Примечание:
P1 – достоверность различий с контролем
Р2 – достоверность различий с ХНЗГ
Р3 – достоверность различий между группами больных ТЖГ
максимальное снижение имело место при НТЖГ (1,25±0,20 против 3,20±0,05 в контроле),
что в целом свидетельствует о снижении резервных микробицидных возможностей
перитонеальных НГ после пробы Манту.
4.1 Выводы
Анализируя полученные результаты исследования в целом, следует заключить, что
при туберкулезе женских гениталий и неспецифических хронических заболеваниях
женской репродуктивной системы имеют место выраженные изменения показателей
оксидазной биоцидности НГ на местном и системном уровне, зависимые от активности
туберкулезного процесса и дополнительной антигенной нагрузки туберкулином как in
vitro (стимулированный NBT-тест), так и in vivo (проба Манту). Постановка последней у
практически здоровых лиц вызывает достоверное возрастание количества формазанпозитивных клеток в периферической крови и перитонеальной жидкости в среднем в 4
раза, а при постановке стимулированного NBT-теста – в 5,5 раз, что позволяет
микробицидным кислород-зависимым системам здоровых лиц после пробы Манту
сохранять адекватное реагирование на нагрузку туберкулином in vitro.
Между тем при активном туберкулезном процессе в женской репродуктивной
системе наблюдается активация оксидазной биоцидности НГ как на системном, так и на
местном уровне с признаками истощенности ее при дополнительной антигенной нагрузке
туберкулином in vitro, подтверждающейся достоверным снижением величин КМ
циркулирующих и перитонеальных НГ. После пробы Манту у больных данной группы
выявлено
еще
более
значительное
истощение
мобилизационных
и
резервных
возможностей кислород-зависимого метаболизма циркулирующих НГ, так как при этом
существенно снижается не только КМ, но и %ФПК. Перитонеальные НГ при этом
страдают в меньшей степени, сохраняя некоторую адекватность реагирования на
туберкулин в системе in vitro, тем не менее, величина КМ не достигает уровня контроля.
Снижение активности туберкулезного процесса в женской репродуктивной системе
сопровождается более выраженной, чем при АТЖГ депрессией %ФПК, особенно на
местном уровне, с отсутствием адекватного реагирования на нагрузку туберкулином in
vitro, следствием чего является более значительное, чем при активном туберкулезном
процессе снижение величины КМ перитонеальных и циркулирующих в крови НГ.
Соответствующий характер носят изменения оксидазной биоцидности НГ после
постановки пробы Манту: истощенность показателей данной функции является более
глубокой как на местном, так и на системном уровне. Это позволяет считать наблюдаемые
изменения при НТЖГ наиболее неблагоприятными в отношении противоинфекционной
защиты,
а
показатели
спонтанного
и
стимулированного
NBT-теста
считать
диагностически- и прогностически-значимыми ее маркерами.
Литература:
1.
Бережная Н.М., Пинчук В.Г. Возможности иммунотерапии злокачественного
роста //Биохимия человека и животных.- Киев: Наук.думка,1987.-Вып.10.-с.495219.Бобров Н.Н. Картина крови в клинике туберкулеза.-М.:Изд.АМН СССР,1950.219с.
2.
Дзержинская И.И. Микрофагоциты крови и их роль у больных с
опухолевыми процессами мочеполовых органов // Тез. докл. 1 съезда
иммунологов России, Новосибирск,1992.-с.134.
3.
Кисина Т.Е., Кноринг Б.Е., Калинина Н.М. Функциональная активность
нейтрофилов при туберкулезе легких//Медицинская иммунология,- 2001-т3№2 с221.
4.
Нестерова И.В., Колесникова В.В. Цитокиновая регуляция и функционирующая
система нейтрофильных гранулоцитов //Гематология и трансфузиология,1999.№2.18-20.
5.
Нестерова
И.В.
Интралейкоцитарная
микробицидная
система
нейтрофильных гранулоцитов у здоровых детей и при гнойно-септических
заболеваниях: Дис. …канд.мед.наук.- М.,1980.-249с.
6.
Нестерова И.В., Колесникова В.В. Современные представления о роли
системы нейтрофильных гранулоцитов //Русск. журнал иммунологии, 1999.т.4,№3.-с.229-234.
7.
Сахарова И.Я,Ариэль Б.М.,Скворцова Л.А. и др. Показатели приобретенного
иммунитета
и
катионные
белки
нейтрофильных
гранулоцитов
при
туберкулезе легких// Проблемы туберкулеза,- 2003-№10-с50-53.
8.
Чернушенко Е.Ф., Петренко В.М., Панасюкова О.Р., Иммунологические
механизмы
и
прогностические
критерии
прогрессирования
туберкулеза//Аллергология и иммунология, 2001- т2- №2.-с102.
9.
Jacobs J., Norman M.A. A familial defect of neutrophil che-motahxis with asthma,
cezema and recurrent skininfectlons //Pe-diat.Res.-1977.-11,N6.-p.732-736.
10. Lukas Josip. Novija sornanja omedusobrom djelovanju j funkkkeijama stsnica
immunooskog sustavo // an.Klin.Colnice: Dr.M.Stoiandvic.-1990.- Vol.29.-№3-4.p.131-141.
11. Konig W.. Schonfeld W., Raulf M., Knoller J.. Sheffer J., Brom J. The neutrophil and
leukotrienes role in health and disease //Eicosanoids.-1990.-3,N1.-P.1-22.
Скачать