Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Кафедра биологии почв

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова
Факультет Почвоведения
Кафедра биологии почв
Сравнение влияния пассажа через кишечник пашенных червей
Aporrectodea caliginosa и серых кивсяков Cylindroiulus caeruleocinctus на
бактериальное сообщество.
Comparison of the influence of the passage through the gut of earthworms
Aporrectodea caliginosa and millipede Sarmatoiulus kessleri on the bacterial
community.
Квалификационная работа студента 4-го курса
Фролова Олега Алексеевича
Научный руководитель:
к.б.н. Якушев Андрей Владимирович
Оппонент:
Бубнов Иван Александрович
Москва 2015
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 3
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................ 6
1.Взаимодействие дождевых червей и микроорганизмов .............................. 6
2. Взаимодействие кивсяков и микроорганизмов ........................................... 27
3. Основы кинетики микробного роста ............................................................ 28
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ................................................................ 38
1. Объекты исследования................................................................................... 38
2. Методы исследования. ................................................................................... 38
3. Описание эксперимента ................................................................................. 40
4. Результаты ....................................................................................................... 41
5. Заключение...................................................................................................... 70
Выводы ................................................................................................................ 71
III. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................... 72
2
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность.
Плодородие почвы напрямую зависит от почвенной биоты (например,
разложение биополимеров, необходимое для образования почвенного гумуса
от которого, в значительной степени зависит плодородие почв). Разложение
растительных остатков происходит в результате взаимодействия почвенных
микроорганизмов и животных. Изучение физиологического состояние и
экологических стратегий кишечных микроорганизмов позволяют понять
механизм
таких
взаимодействий.
представителей почвенных
Одним
из
наиболее
значимых
животных для плодородия являются кивсяки,
перерабатывающие опад, и дождевые черви, активно питащиеся органикой в
гумусовом и нижележащих горизонтах. Есть данные по исследованию
состава кишечного сообщества (Битюцкий, Соловьева, Лукина и др., 2005;
Lavelle et al., 1997; König.,
2006; ) и ферментативной активности
(Хомяков, Харин, Нечитайло и др.,2007; Parle, 1963; Lee, 1985; Marinissen,
Dexter, 1990; Anderson, 2000; Lavelle et al., 1997), есть работы посвященные
исследованию влияния кишечной жидкости на микробные сообщества
(Khomyakov,
Kharin, Nechitailo и др., 2007), однако информации о
физиологическом состояние не достаточны.
Новизна
Впервые проводится исследование новым комплексным методом
позволяющим изучить влияние прохождения через кишечник дождевых
червей
и
кивсяков
на
изменение
физиологического
разнообразия
гидролитического бактериального блока при пассаже через кишечник с
изменением доминирующей экологической стратегии среди его членов и их
физиологического состояния, путём расчёта кинетических параметров
3
инициированных
микробных
сообществ.
Непосредственным
объектом
исследования этим методом являются ассоциации бактерий, возникающие
при инокуляции почвенной суспензии различных жидких питательных сред.
Таким образом, изучая на уровне ассоциаций микроорганизмов посредством
пассажа, представляется возможным дополнить данные, полученные при
изучение
на
видовом
и
на
уровне
целого
сообщества.
Практическая значимость.
Практическая значимость данного исследования связана с разработкой
на
основе
физиологических
параметров
инициированных
сообществ
критериев оценки последствий влияние присутствия беспозвоночных на
микробное сообщество, что
важно для разработки микробиологических
стандартов качества вермикомпостов, экологической оценки состояния
микробного сообщества при зоомелиорации почв. Дальнейшая отработка
методики
выделения
микроорганизмов
инициированных
микробных
сообществ, образовавшихся из исходного кишечного сообщества будет
полезна
при
поиске
микроорганизмов
потенциальных
компонентов
препаратов пробиотиков для животных и устойчивых бактериальных
ассоциаций способных к разложению определенных веществ.
Цель.
Изучение
транзитных
бактериальных
популяций
кишечника
Aporrectodea caliginosa и Cylindroiulus caeruleocinctus: сравнение в корме и
экскрементах
преобладающей
экологической
стратегии
роста,
физиологическое разнообразие, состав и физиологическое состояние его
членов.
4
Задачи:
1. Отбор
пашенных
червей
Aporrectodea
caliginosa
и
кивсяков
Cylindroiulus caeruleocinctus
2. Содержание и получение свежих экскрементов.
3. Сравнение
физиологического
состояния
бактерий
в
свежих
копролитах и почве (корм червей), экскрементах и подстилке (корм
кивсяков)
4. Сравнение преобладающей экологической стратегии роста бактерий в
корме и копролитах, экскрементах и подстилке.
5. Сравнение физиологического биоразнообразия гидролитиков.
6. Проведение сравнения полученных различий с использованием
статистических методов и их интерпритация.
Благодарности:
За идентификацию многоножек д.б.н. Головачу Сергею Ильичу и к.б.н.
Семенюк Ирине Игоревне.
5
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.Взаимодействие дождевых червей и микроорганизмов
В основе взаимодействия дождевых червей и микроорганизмов лежат
несколько основных принципов.
1.
Дождевые
черви
осуществляют
отбор
микробных
популяций
и
модифицируют микробные сообщества, пассируя пищевые субстраты через
свой пищеварительный тракт. Переваривание микроорганизмов животными
основано
на
"киллерном"
эффекте,
который
-
видо-
и
даже
штаммоспецифичен. Киллерный механизм – способ пищеварения животных,
основанный
на
гибели
клеток
микроорганизмов,
вызванной
пищеварительными вещества не пищеварительными ферментами.
2. Кишечник дождевых червей - специфическое местообитание в почве,
отличающееся по составу и активности микробов. Функциональная роль
кишечных симбионтов беспозвоночных, в том числе и у дождевых червей,
во многом аналогична таковой у позвоночных.
3. Регуляция по трофическому механизму основана на мобилизации
животными питательных веществ, связанных в микробных клетках, их
экскреции и высвобождению в почву микроорганизмов, размножающихся в
кишечнике.
Регуляция
по
метаболическому
механизму
предполагает
физиологический отклик микробов на метаболиты животных, обладающих
свойствами физиологически активных веществ.
Метаболический механизм объясняет быструю реакцию микробов на
воздействие животных, не пропорциональную количеству потребленной
биомассы.
4. Взаимодействие червей и микроорганизмов, да и зоомикробные
взаимодействия вообще во многом определяют протекание основных
6
почвенных процессов и состояние биотического сообщества в целом.
Эффекты от взаимодействий микроорганизмов и животных реализуются в
процессах
разложения
и
минерализации
органического
вещества,
мобилизации-иммобилизации и др. Взаимодействия определяют судьбу
популяций
микроорганизмов
и
фауны:
состав,
обилие,
активность.
Следствием взаимодействий является формирование микробных сообществ,
динамика биомассы и продукция микроорганизмов, транспорт микробов и их
профильное распределение, генетический обмен между микробами.
Микроорганизмы как источник пищи для дождевых червей.
Принципиальной пищей червей являются микроорганизмы: грибы,
простейшие и бактерии. Этому есть ряд прямых и косвенных свидетельств.
Беспозвоночные животные вообще и черви в частности не поселяются на
свежем растительном опаде (основная гипотеза - наличие репеллентов в
составе растительных тканей) (Mindermann, Daniels, 1967). Животные не
способны
к
деполимеризации
растительных
полимеров,
которые
преобладают в почвенном органическом веществе (Паников и др., 1985;
Варне и др., 1992). Целлюлазная активность пищеварительного тракта
почвенных животных очень низка (Siepel, de Ruiter-Dukman, 1993; Lattaud et
al., 1998). Даже термиты и фитофаги переваривают целлюлозу благодаря
симбиотическим целлюлозолитическим бактериям и простейшим или с
помощью ферментов перевариваемых грибов (Martin, 1984).
Следовательно все животные и дождевые черви в частности облигатно
зависят от микроорганизмов как источника незаменимых аминокислот,
которые сами синтезировать не могут (Бигон и др., 1989). В почве ресурс
аминокислот и сосредоточен в микробной биомассе (Покаржевский и др.,
1984). Животные нуждаются в органическом азоте и фосфоре, запас которых
сосредоточен в почве в микробной биомассе (Покаржевский и др., 1984).
7
Микроорганизмы - один из главных источников пищи. Материал микробных
клеток может поступать в пищу экзогенно - с кормом и эндогенно - за счет
использования
метаболитов
микробных
симбионтов,
реутилизации
продуктов обмена животного и тел микробных симбионтов. До сих пор,
однако, не удается количественно оценить вклад этих потоков в питании.
Наиболее исследованным с точки зрения пищевых предпочтений в отношении микроорганизмов является компостный червь Eisenia fetida. Есть косвенные свидетельства важной роли микроорганизмов в жизнедеятельности
червей.
В промытом водой компосте Е. fetida рос медленнее, чем в
непромытом; в термически обработанном компосте медленнее, чем в
нативном. Стерильно выведенную из коконов молодь Е. fetida стерилизовали
с поверхности карбенциллином и содержали в целлюлозной среде,
обогащенной одной из 18 культур бактерий, грибов и актиномицетов. Через 6
недель во многих вариантах черви погибли. Исключение составили варианты
с культурами бактерий Citrobacter freundii и Pseudomonas sp. Черви,
питающиеся грибами Aspergillus flavus, А.fumigatus, Fusarium sp. и Penicillum
sp., погибли через 10-40 дней. При питании Ascobolus sp. и Trichoderma sp.
отмечалась потеря в весе червей, но не гибель.
Только на грибах Arthrobotrys sp. и Cladosporium herbarum отмечали
прибавку в весе. В течение 14 недель черви росли соответственно со
скоростью 0,5 и 0,8 мг/сут. (Morgan, 1980). В аналогичном эксперименте
стерильно выведенную молодь Е. fetida кормили стерилизованными
субстратами,
инокулированными
чистыми
культурами
бактерий,
актиномицетов и грибов. Из бактерий наиболее "питательными" оказались
Acinetobacter calcoaceticus, Alcaligenes faecalis, Nocardia salmonicolor.
Снижение веса червей и даже смертность наблюдали при кормлении
культурами
Arthrobacter
simplex,
A.
tumescens,
Micrococcus
luteus,
Pseudomonas fluorescens, Flavobacterium sp. Грибы также отличались по
8
пищевой ценности. Привес червей был отмечен при кормлении Trichoderma
harzianum (заметим, что другой вид триходермы был не столь питателен) и
Mucor plumbeus. Fusarium oxysporum был токсичен. Интересно, что
термическая стерилизация не снижала питательной ценности бактерий и
грибов. Авторы заключают, что Е. fetida питается непосредственно
микробной плазмой, а не продуктами жизнедеятельности микроорганизмов.
Сделано предположение, что Е. fetida не обладает специфической кишечной
микробиотой
с
определенными
пищевыми
функциями,
поскольку
стерильные черви (гнотобионты) питались также эффективно (Hand, Hayes,
1988). Микроорганизмы могут быть основным источником азота. В
микробной биомассе содержится общего углерода до 1 мг С/г - в почве и до
10 мг С/г - в подстилке (Звягинцев, 1987).
При пассаже (прохождение) через пищеварительный тракт дождевых
червей снижается обилие грибного мицелия, особенно темноокрашенных
грибов,
и
увеличивается
обилие
бактерий,
в
основном,
за
счет
грамотрицательных. Судьба микробных клеток при пассаже зависит от вида
и даже штамма микроорганизма. Это может быть гибель с высвобождением
основной части веществ содержимого, замедление скорости размножения
при сохранении жизнеспособности, нейтральная реакция, размножение или
инициация прорастания спор, генетический обмен. Кишечные симбионты
более устойчивы к пребыванию в кишечной среде. В результате пассажа
формируется микробное население в почве.
Пищеварительный тракт животных - специфическое местообитание
микроорганизмов в почве. Кишечник - специфическое место обитания
микроорганизмов в почве. Физикохимические условия (состав питательных
элементов, рН, окислительно-восстановительный потенциал, влажность) и
биологические факторы (ферментативная активность, наличие киллерных
веществ) формируют не типичные для почвы микробные сообщества.
Выделяются два типа сообществ кишечных бактерий: пристеночное - на
9
внутренней поверхности стенок кишечника и полостное - в содержимом
кишечника. В пристеночном сообществе почвенных дождевых червей
доминируют
факультативно-анаэробные
гаммапротеобактерии
и
актинобактерии. Численность микроорганизмов возрастает от переднего
отдела пищеварительного тракта к заднему отделу и достигает 108 КОЕ/г
кишечных
тканей.
Потность
заселения
поверхности
кишечника
микроорганизмами в десятки и сотни тысяч раз выше, чем поверхности
почвенных частиц.
Полостное сообщество кишечника представлено бактериями корма и
кишечными
бактериями.
Устойчивые
к
перевариванию
транзитные
микроорганизмы размножаются при пассаже, при этом время удвоения
некоторых бактерий может достигать у дождевых червей 1,5-2 часов.
Численность бактерий обычно возрастает в десятки раз от корма к
экскрементам.
Функции микроорганизмов кишечника связаны, прежде всего, с
явлением симбионтного питания. Кишечные микроорганизмы являются
источником
незаменимых
аминокислот
и
витаминов,
реутилизируют
продукты обмена животных, могут участвовать в симбионтном питании,
осуществляют
азотфиксацию.
Симбионты
повышают
устойчивость
кишечника к колонизации чужеродными микроорганизмами за счет
образования антибиотических веществ.
Животные могут также регулировать микробные популяции, будучи
объектом питания микроорганизмов. Например, круглые черви (нематоды)
являются источником ростовых факторов (аминокислот или витаминов) для
хищных грибов, а стимулом к хищному образу жизни у грибов является
недостаток в среде витаминов или аминокислот. Как жертвы, нематоды
регулируют рост, развитие и сапротрофную активность хищных грибов в
почве.
10
Сформулирована концепция быстрого и медленного функциональных
ответов микробного комплекса на деятельность дождевых червей.
Выдвигается концепция трофических и метаболических (сигнальных)
механизмов регуляции животными структуры и метаболизма микробного
комплекса почвы. Принцип регуляции по трофическому механизму состоит в
мобилизации животными при питании питательных веществ, связанных в
микробных клетках, и их экскреции. В масштабах почвенных экосистем,
однако, вклад продуктов экскреции животных в пул питательных элементов
слишком мал и, следовательно, не может объяснить быструю нелинейную
реакцию микробного сообщества на поедание животными. Регуляция по
метаболическому механизму предполагает быстрый физиологический отклик
микроорганизмов в ответ на метаболиты (физиологически активные
вещества) животных. Трофический механизм может быть реализован в почве
через компенсаторный рост микроорганизмов после выедания микробов
животными, аналогично компенсаторному эффекту у растений в ответ на
поедание растительноядными животными. Он заключается в усиленном
росте и метаболической активности микроорганизмов и объясняет феномен
их быстрой реакции на воздействие животных, а также нелинейный характер
зависимости эффектов от метаболических потребностей животных (когда
они - хищники) или количества питательных веществ, содержащихся в них
(когда они - жертвы).
Регуляция со стороны микроорганизмов также может быть реализована
как по трофическому, так и по метаболическому механизму. Трофическая
регуляция связана с функцией клеточной массы микроорганизмов как
источника незаменимых аминокислот и фосфора для почвенных животных. С
другой стороны, в результате деятельности микробных экзоферментов
присходит разложение сложных органических полимеров до веществ,
которые уже могут быть переварены и ассимилированы животными
(олигосахаридов,
органических
кислот,
белков
и
аминокислот).
11
Метаболическое
воздействие
физиологически
активных
микроорганизмов
соединений
предполагает
микробного
участие
происхождения
(витаминов, аттрактантов и репеллентов, антибиотиков, токсинов) во
ввзаимодействие с животными.
Главной
отличительной
особенностью
взаимодействия
микроорганизмов с дождевыми червями является наличие развитого
симбиотического сообщества в пищеварительном тракте, состоящего из
бактерий, грибных спор и гиф. Прямая регулирующая роль этих животных
по отношению к почвенным микробам состоит, в основном, в модификации
микробных сообществ при их пассаже через пищеварительный тракт,
поскольку дождевые черви способны заглатывать крупные фрагменты
субстрата, заселенные целым набором микроорганизмов.
2 Участие дождевых червей в физических процессах
Участие дождевых червей в физических процессах, происходящих в
почве,
определяют
следующие
виды
их
деятельности:
измельчение
растительных остатков; перемещение и перемешивание подстилки и почвы;
образование экскрементов; роющая деятельность.
Измельчение растительного опада
Потребители подстилки и детритофаги при поглощении органических
остатков сильно измельчают их. Дождевые черви перетирают органические
остатки с помощью заглатываемых минеральных частиц в мускульном
желудке. При измельчении в сотни и тысячи раз увеличивается удельная
поверхность субстрата. При этом резко возрастает его доступность для
микроорганизмов и, как следствие, возрастает скорость разложения (Курчева,
1971; Стриганова, 1980; Hanlon, Anderson, 1980). Однако уплотнение мелких
частиц в экскрементах может ограничить колонизацию их бактериями и
грибами. Наблюдения в сканирующем электронном микроскопе показывают,
что бактерии колонизируют внутреннюю поверхность частиц в экскрементах
12
мокриц и многоножек, а грибные гифы распространяются только по
поверхности (Anderson, Ineson, 1984а).
Перемешивание и перемещение подстилки и почвы
Питаясь в разных горизонтах почвы и в подстилке, дождевые черви
активно перемешивают органические остатки с минеральными частицами.
Ключевую роль в этом процессе на ровне с дождевыми червями играют
термиты. В широколиственных лесах дождевые черви - главный первичный
разрушитель подстилки.
Ежегодно
черви
перемешивают
около
3-5
т
подстилки/га
с
минеральными горизонтами, образуя так называемый гумус типа мулль.
Такие же масштабы отмечены для перемешивания навоза на пастбищах.
Эпигейные (обитающие в поверхностных слоях почвы и в подстилке) черви
откладывают экскременты на поверхности почвы, а обитающие в почве - в
ходах или в других макропорах. Годовая продукция копролитов червей в
почвах умеренной зоны составляет 75-250 т/га год (в среднем - 40-50 т/га
год), а в тропических почвах - до 400 т/га. Рассчитано, что в регионах с
умеренным климатом за 50-100 лет верхние горизонты пахотных почв
пропускаются через пищеварительный тракт дождевых червей (Barois et al.,
1993; Makeschin, 1997). Значение того, что органическое вещество
перемещается вглубь почвы червями, например, демонстрируют полевые
эксперименты, проведенные в Новой Зеландии. Для утилизации навоза овец
в почву интродуцировали дождевых червей. Опыты проводили с мечеными
14
С-растительными остатками. Установлено, что при интродукции червей
углерод аккумулировался на 10 см глубже, чем без них. Содержание
углерода в почве в присутствии червей было на 30 % выше. Увеличивалась
продукция корней растений, растительная продукция возрастала на 70 %
(Makeschin, 1997).
Образование экскрементов
13
Масштабы этого процесса и его значение для экосистем больше всего
исследовано для дождевых червей. Экскременты (копролиты) червей состоят
из почвы, смешанной с органическими остатками. Они откладываются как
внутри ходов червей, так и на поверхности почвы. В обоих случаях
копролиты играют существенную роль в почвообразовании. Они содержат
больше глинистых и илистых частиц, больше органического материала и
меньше песка, чем окружающая почва, поскольку дождевые черви
избирательно поглощают более мелкие частицы и органические остатки.
Размер минеральных частиц, обнаруживаемых в пищеварительном тракте
дождевых червей, меньше, чем в почве и составляет 100—500 мкм.
Считается, что черви не способны измельчать минеральные частицы кроме
сильно выветрелых), но они перетирают растительные остатки и частицы,
содержащие органоминеральные комплексы. Это - один из важнейших
факторов воздействия червей на процесс разложения органического вещества
(Lee, 1985).
Копролиты червей - это почвенные агрегаты. Форма и физическая
прочность копролитов оказывает влияние на аэрацию, инфильтрацию воды,
водоудерживающую способность, удельную поверхность почвы. Агрегатное
состояние в свою очередь определяет возможность проникновения корней
растений, количество микрозон с доступными для растений питательными
элементами, микробную активность, соотношение аэробных и анаэробных
зон, движение микро- и мезофауны и, как следствие, плодородие почвы.
Проверка стабильности копролитов дождевых червей (устойчивость к
размыванию в капле воды или при просеивании в воде) показывает, что они
могут быть более, и менее стабильны, чем другие почвенные агрегаты. В
значительной степени это зависит от состава и концентрации органического
вещества, содержащегося в копролитах, но также и от микробиологической
активности в них.
14
Предполагали, что почвенные частицы цементируются гуматами
кальция, которые образуются в пищеварительном тракте при взаимодействии
органических соединений с карбонатом кальция, выделяемым кальциевыми
железами червей,
или смешиваются с измельченными растительными
остатками.Выдвигались также гипотезы о том, что стабильность копролитов
связана с грибными гифами, переплетающими их по поверхности или со
слизистыми полисахаридными выделениями, образуемыми в процессе
микробного разложения (Parle, 1963; Lee, 1985; Marinissen, Dexter, 1990). Уже
через несколько дней после отладки в почву копролиты колонизируются и
связываются друг с другом грибными гифами, прорастающими из почвы
(Lee, Pankhurst, 1992). Их стабильность возрастает с возрастанием длины
грибных гиф (Lee, 1985). Многие бактерии образуют полисахариды (леваны,
декстраны), которые способны склеивать частицы кварца и глин. Таким
образом, адгезия почвенных частиц за счет микробной активности одно из
наиболее популярных объяснений стабилизации копролитов. Однако
копролиты сохраняли стабильность даже после обработки перекисью
водорода, которая должна окислять полисахариды и гуматы кальция (Parle,
1963).
Детальное исследование причин механической прочности копролитов
проведено
(Манаенков
с
соавт.,1997).
Изучали
влияние
различных
растворителей на механическую прочность трех типов почвенных агрегатов:
зернистых, комковатых и копролитовых (старых копролитов), отобранных из
нативной почвы. Реагенты выбирали так, чтобы избирательно разрушить и
удалить различные клеящие вещества (метод "анатомирования" агрегатов,
разработанный А.Ф. Тюлиным). Результаты этой работы свидетельствуют о
том, что по составу клеящих веществ копролитовые агрегаты существенно
отличаются от комковатых. Известно, что в копролитах дождевых червей
содержится больше органического вещества, и они имеют более тонкий
механический состав, чем почва, в которой черви живут. Вероятно,
15
копролиты содержат больше веществ микробного происхождения и
микробных клеток, для разрушения которых необходимы ферменты. Это
согласуется с гипотезами о том, что стабильность копролитов связана с
развитием на них грибных гиф (и) или с полисахаридами микробного
происхождения.
В копролитах дождевых червей выше более, чем в 2 раза концентрация
органического вещества, чем в почве. Это связано с повышенным
содержанием слаборазложившихся растительных остатков. В копролитах
червей содержится больше лигнина и углеводов, чем в окружающей почве,
что объясняется интенсивным смешиванием свежего опада с минеральной
фракцией почвы. В копролитах продукты микробного происхождения
концентрируются в органическом веществе, связанном с глинистой и
илистой фракциями и сильно гумифицированным органическим веществом.
При этом степень разложения органического вещества выше в окружающей
почве, чем в копролитах червей. В процессе микробной трансформации
растительных углеводов в пищеварительном тракте червей образуется
муцигель и другие метаболиты, которые проникают в поверхностные слои
минеральных частиц и, тем самым, стабилизируют структуру копролитов.
Результатом взаимодействия слабо разложенных растительных остатков с
минеральной фракцией является образование активного, но физически
защищенного пула углерода, который постепенно высвобождается при
разрушении
копролитов.
выделяемых
микроорганизмами и дождевыми
стабильность
копролитов
Таким
образом,
обусловливают
кроме
и
мукополисахаридов,
червями, структурную
богатые
углеводами
растительные остатки, потребляемые червями (Guggenberger et al., 1996).
Итак, главные причины стабильности агрегатов в копролитах червей
следующие. Это - сильное перемешивание частично разложившихся
растительных остатков с измельченными почвенными частицами, которое
происходит в пищеварительном тракте; образование микроорганизмами
16
клеящих веществ полисахаридной природы в копролитах при их старении в
почве и переплетение и связывание грибными гифами фрагментов
растительных остатков и почвенных частиц.
Копролиты
червей
составляют
значительную
часть
почвенных
агрегатов. Например, в почвах с подстилкой типа мулль практически все
агрегаты в горизонте Ai представлены копролитами. Продукция копролитов,
которую можно учесть (копролиты, откладываемые на поверхность почвы),
сильно варьирует в зависимости от вида червя и типа экосистемы и
составляет от 0,25 до почти 30 кг/м2. В почвах тропиков черви за год
способны пропустить через пищеварительный тракт до 25 % от массы всего
горизонта Ah (Lee, 1985). В черноземных почвах под байрачными лесами
верхний слой целиком состоит из копролитов. Копролитовая структура
гумусового горизонта этой почвы отличает ее от соответствующего
горизонта
обычного
чернозема
(Карпачевский,
1983).
Содержание
копролитовых структурных агрегатов в черноземе обыкновенном в горизонте
А1 достигает 51 % (на комковатые агрегаты приходится 30 % , на зернистые 19 %), а в А2 их доля достигает 84 % (Манаенков и др., 1997).
Роющая деятельность
Значение роющей деятельности для протекания почвенных процессов и
для почвообразования очень велико. Черви прокладывают в почве ходы,
которые либо являются их постоянным местообитанием (постоянные ходы),
либо образуются в результате движения червей (временные ходы). На 1 м2
почвы может быть от нескольких десятков до сотен ходов, их общая
протяженность достигает более 800 м, а объем доходит до 9 л/м2. Ход червей
в диаметре составляет 1-10 мм. Объем, занимаемый ходами, может
составлять до 5 % от общего объема почвы (Edwards, Lofty, 1977) или 60 %
от всех крупных почвенных пор (макропор) (Satchell, 1983). За счет
гидростатического давления, которое генерируется в целомической полости
червей и сокращения мышц поверхности тела создается давление на почву
17
вокруг тела червя. Давление может достигать 18 кПа (около 0,2 атм.), при
этом минеральные частицы и фрагменты подстилки впрессовываются в
стенки ходов (Makeshin, 1997). Этот механизм, однако, не является главным
при образовании ходов, поскольку давление, создаваемое червями в сотни
раз меньше того, которое необходимо, чтобы проникнуть им в толщу почвы:
0,3-3 мПа (до 30 атм.). Ходы образуются, в основном, за счет того, что черви
прорываются сквозь почву. Кроме того, черви поглощают почву по ходу
своего движения ("проедаются") и откладывают ее в виде копролитов в
другом месте (Lee, 1985). Изнутри ходы имеют непрерывную выстилку.
Около 1/10 от диаметра хода приходится на слой глинистых частиц. Затем в
направлении к периферии могут быть три концентрических слоя из
гумусированного
глинистых
материала,
минералов,
содержащего
углекислого
кальция
повышенное
и
количество
гидроксидов
железа.
Концентрация железа в 1,5-3 раза выше на поверхности ходов, чем на
расстоянии в 100-200 мкм от его внешней поверхности. Кальций
концентрируется
в
микроскопических
(несколько
мкм)
округлых
образованиях, а железо распределено равномерно (Lee, 1985). Выделения
червей (мукус) склеивают почвенные частицы, и делает ход непрерывным
(Lee, 1985). Зона толщиной около 2 мм, непосредственно прилегающая к
ходу, названа дрилосферой (Bouche, 1975). Стенки ходов дождевых червей
содержат высокую концентрацию питательных элементов, в том числе - в
доступных
растению
формах,
поскольку
органическое
вещество,
перемешанное с минеральными частицами, поглощается червями селективно,
затаскивается внутрь почвы и откладывается в ходах в виде экскрементов.
Количество главных питательных элементов, обнаруженных в выстилке
ходов, близко к содержанию в соломе и зерне сельскохозяйственных
растений (Makeshin, 1997). Особенно велико влияние дрилосферы на
микробиологические свойства почв. Ходообразование сказывается на
физических свойствах почвы за счет ряда эффектов. Черви образуют каналы
18
между почвенными агрегатами. Ходы непрерывны в вертикальном и
горизонтальном направлениях, они проникают от поверхности до глубины
десятков или даже сотен сантиметров и на такое же расстояние по
горизонтали. Большой диаметр ходов и их значительная протяженность
делает их самыми большими порами в почве (макропорами). На их
поверхности
откладывается
вмывающийся
с
поверхности
почвы
органический материал. В отличие от обычных пустот ходы червей изнутри
покрыты
соединениями,
образующими
мукополисахаридно-белково-
липидный комплекс. Они выделяются с поверхности тела червей и
облегчают их скольжение сквозь толщу почвы. Эти соединения при
высыхании могут временно стабилизировать (укреплять) выстилку ходов и,
следовательно, их прочность. Черви, обитающие в ходах постоянно,
например, Lumbricus terrestris, могут поддерживать их целостность в течение
нескольких лет, удаляя из ходов на поверхность почвенные частицы, которые
вмываются в них. Ходы долгое время сохраняются даже после того, как
черви их покидают. В почвах с большим количеством ходов они очень часто
пересекаются. Ходы представляют собой магистральные пути для движения
поверхностных вод и крупных частиц в более глубокие горизонты. По ходам
легче распространяются корни растений. За счет образования ходов
дождевые черви влияют на порозность почв. В почве, в которой отсутствуют
черви, доля порового пространства может сократиться до 30—40 %. В почве
с червями (при их высокой биомассе - около 200 г живой биомассы/м2)
поровое пространство, заполненное водой и воздухом, составляет 60-70 %
(Lee, 1985).
3 Вермикомпосты
19
Почвенные беспозвоночные прямо и косвенно влияют на почвенное
плодородие, модифицируя режим питательных элементов в почве за счет
процессов естественной гибели, экскреции продуктов жизнедеятельности,
измельчения и перемешивания органических и неорганических частиц,
изменения микробиологической активности.
Прямое влияние связано с процессами естественной гибели и
экскреции.
Масштабы поступления в почву питательных элементов при гибели
животных впечатляющие. В почвах Центральной Европы выход азота за счет
гибели достигает 24 г N /м2 (Makeshin, 1997), что сопоставимо с ежегодной
дозой минеральных азотных удобрений, вносимых на поля - 100-200 кг N/гa.
Биомасса дождевых червей содержит 65-75 % белка, она очень быстро
разлагается в почве, но в то же время азот не так быстро вымывается, так как
иммобилизуется микроорганизмами.
Дождевые черви экскретируют неорганические и органические
метаболиты с выделениями или в составе кишечной или поверхностной
слизи. Основной конечный продукт азотного обмена - мочевина, очень
быстро гидролизуется до аммония. Слизистые выделение состоят из
мукопротеинов
-
водорастворимых
соединений,
богатых
белком
и
свободными аминокислотами: аспарагином, серином, глицином, а также
этаноламином. Поскольку продукцию мочевины и слизи в поле измерить
очень трудно, вклад червей в пул питательных элементов можно представить
только из лабораторных данных. Ежедневный выход азота из червей с
выделениями
составляет
88-270
г/кг
биомассы.
Ежегодно
черви
экскретируют 18-50 кг N/гa. На лугах ежегодный общий оборот азота
червями оценивается в 14 кг/га год. На пашне показана еще более высокая
величина - 63 кг/га год. Около 40 % от всего азота, ежегодно поглощаемого
растениями, проходит через популяции дождевых червей (Makeshin, 1997).
Жизнедеятельность червей влияет на значение рН почвы. Копролиты имеют
20
более высокое значение рН, чем окружающая почва. Стенки ходов имеют
тоже выше рН, чем окружающая почва. Экскреты червей имеют нейтральное
или слабо щелочное значение рН. Быстрая трансформация мочевины в
аммоний ведет к возрастанию рН за счет поглощения протона. Кроме того,
некоторые виды, например Lumbricus spp. экскретируют кальциевые
сферулы, образующиеся в кальциевых железах и в просвете кишечника.
Могут ли все эти выделения существенно изменить кислотность почвы, не
известно, поскольку черви воздействуют только на почву, непосредственно
прилегающую к их ходам. Тем не менее, считают, что некоторые черви
способны оптимизировать рН в местообитаниях. Это позволяет им
колонизировать кислые почвы (Makeshin, 1997).
В ненарушенных лесных и в меньшей степени в пахотных почвах
дождевые
черви
модифицируя
влияют
на
дифференциацию
физико-химические
свойства
почвенного
почв
и
профиля,
расширяя
круг
биологически активных зон. Это происходит за счет оборота и перемещения
почвы, увеличение аэрированности, порозности и дренажа, дезинтеграции и
инкорпорации подстилки. Ускоренные в результате этого процессы
минерализации,
гумификации
и
выветривания
увеличивают
оборот
питательных элементов и, как следствие, плодородие почвы и продукцию
растений. Активность червей приводит к расширению корнеобитаемой зоны
(Makeshin, 1997).
Наиболее
почвообразования
яркие
на
примеры
важности
сельскохозяйственных
червей
почвах
в
процессах
приводятся
для
культивируемых почв Новой Зеландии и Голландских польдеров. В Новой
Зеландии сведение лесов для пастбищ снизило продуктивность экосистемы и
привело к накоплению на поверхности толстого слоя экскрементов крупного
рогатого скота и овец, поскольку в результате интенсивной обработки почти
не осталось червей. В 1950 г. на отдельные участки были интродуцированы
черви Aporrectodea caliginosa. Через несколько лет слой навоза исчез и
21
улучшились физические свойства. В 1966 г. то же применили на польдерах.
Уже через год после интродукции увеличились стабильность агрегатов,
капиллярность и количество доступной воды. Долговременный эффект
выразился в увеличении содержания гумуса и азота в минеральных
горизонтах. До 10 см сформировался темный гранулярный и гомогенный
горизонт (Lee, 1985; Makeshin, 1997).
Копролиты червей - это биологически активные образования,
содержащие до 1010/г бактерий (это выше, чем в окружающей почве),
ферменты и продукты ферментативной активности, непереваренные остатки
растений, навоза и т.п. Важный компонент копролитов - гумусовые вещества.
Гуминовые кислоты имеют много активных центров, связывающих катионы
кальция, железа, калия, анионы, содержащие серу и фосфор. Реакции
происходят благодаря донорно-акцепторным и координационным связям,
образующимися между карбоксильными и другими функциональными
группами гуминовой кислоты и ионами, находящимися в растворе.
Питательные вещества сохраняются в гуминовых кислотах в формах,
легко доступных растениям, не вымываются из почвы и высвобождаются,
когда растения в них нуждаются. Растение выделяют органические кислоты,
а также С0 2 (протоны).
Последние вытесняют катионы из мест связывания на молекуле
гуминовой кислоты. За счет медленного и постепенного высвобождения
питательные вещества копролитов червей не "сжигают" корни растений.
Актуальность биотехнологии, основанной на вермикомпостировании,
следует
из
нескольких
положений.
Современное
промышленное
и
сельскохозяйственное производство сопровождается изъятием органического
вещества из биогеохимического цикла и изменением соотношения между
запасами углерода в атмосфере, океанах, в почве и растениях (Hartenstein,
1986). Необходим механизм, позволяющий возвращать углерод в почву,
поддерживать его ресурсы на суше. Такого рода ресурсосберегающим
22
механизмом является биотехнология вермикомпостинга, предполагающая
утилизацию
бросового,
но
потенциально
ценного
ресурса
отходов.
Источники органических отходов разнообразны. Это - сточные воды
целлюлозно-бумажных
предприятий,
маслобойни,
молочные
заводы,
мясокомбинаты, и т.п. Огромны запасы отходов и в сельском хозяйстве. Их
поставляют
животноводческие
фермы,
предприятия
по
разведению
шампиньонов. Одни из постоянно действующих источников органических
отходов - твердый осадок коммунальных сточных вод, городской мусор и
лиственный опад. Активный ил, наряду с коровьим навозом - один из
наиболее ценных субстратов в практике вермикомпостинга (Hartenstein et al.,
1980; Horner, Abrams, 1980; Pincince et al., 1980; Sabine, 1981; Hatanaka et al.,
1983; Haimi, Hunta, 1987; Grappelli et al., 1987).
Накапливаясь
ограниченных
в
значительных
территориях,
экологическую
количествах
органические
опасность,
угрожая
отходы
и
зачастую
создают
нарушением
на
реальную
санитарно-
эпидемиологической и токсикологической обстановки, самовозгоранием,
взрывами.
Особая роль вермикомпостинга состоит в возможности частичной
очистки
и
детоксикации
органических
отходов
высокотоксичных
производств: целлюлозно-бумажных и текстильных заводов, твердого осадка
городских сточных вод, городского мусора. Способ основывается на
свойстве дождевых червей аккумулировать и даже концентрировать в
биомассе некоторые тяжелые металлы и пестициды, тем самым, снижая их
концентрацию в компосте (Morgan, 1980; Lineras et al., 1985; Lofs-Holmin,
1985; Roberts, Dorough, 1985; Morris, Morgan, 1986; Hunter et al., 1987). Такой
компост, конечно, менее ценен как удобрение, так как все-таки загрязнен
выше нормы. Однако он имеет хорошие физические свойства и может быть
использован для целей, не связанных с получением продуктов питания,
например,
для
рекультивации
небольших
по
площади
нарушенных
23
территорий. Таким образом, аккумуляционная способность компостных
червей позволяет внедрять их в очистные сооружения в качестве
дополнительного биологического фильтра. Есть, однако, и противоположные
данные, свидетельствующие о том, что содержание тяжелых металлов в
компосте не снижается, а их подвижность несколько возрастает. Это
связывают
с
интенсификацией
микробиологической
деятельности
(Hartenstein, 1986).
Биомасса дождевых червей используется в качестве корма и пищевых
добавок к кормам в животноводстве, в рыбоводческих хозяйствах (Ferruzzi,
1984).
Отличия вермикомпостов от обычных микробиологических компостов
состоят в следующем. Поскольку экскременты червей при подсыхании
приобретают
повышенную
водопрочность,
вермикомпост
хорошо
оструктурен (Hartenstein, Hartenstein, 1981; Sathell, 1983; Haimi, Hunta, 1987;
Edwards, Fletcher, 1988; Hand et al., 1988). Отмечают более тонкий
гранулометрический состав и большую гомогенность вермикомпоста по
сравнению с обычными компостами (Dash et al., 1986; Casalicchio, Grasiano,
1987). Использование червей для переработки органических отходов
позволяет повысить аэрированность субстрата и снизить концентрацию
газообразных продуктов анаэробного окисления. Это - прямое следствие
повышения агрегированности (Waugh, Mitchell, 1981). В присутствии
дождевых червей в компосте увеличивается содержание обменного и
водорастворимого кальция, а, следовательно, и емкость катионного обмена.
Это имеет физиологическое объяснение. В пищеводе дождевых червей есть
кальциевые железы, переводящие нерастворимый кальций в обменную
форму (Laverack, 1963; Satchell, 1983). В вермиком постах ускоряются
процессы минерализации органических соединений азота и нитрификация.
Копролиты содержат больше нитратов и нитритов, чем окружающий
субстрат. Помещенные в колонку с почвой, копролиты вызывали снижение
24
концентрации
ионов
аммония
и
аммиака.
Напротив,
термическая
стерилизация копролитов приводила к ослаблению эффекта дезодорирования
ими аммиака. Эти факты свидетельствуют о наличии в копролитах веществ и
(или) микроорганизмов, стимулирующих нитрификацию. Таким образом, в
результате деятельности червей в почве и компостах перераспределяется
соотношение аммиачный азот/нитратный азот в пользу последнего (Тиунов,
1989; Parle, 1963; Aldag, Graff, 1975; Syers et al., 1979; Anderson et al., 1984;
Scheu, 1987; Hand et al., 1988).
Отношение дождевых червей к тяжелым металлам, находящимся в
компосте (это относится, в основном, к компостам из активных илов
промышленных сточных вод) может быть рассмотрено с нескольких точек
зрения. Некоторые тяжелые металлы могут аккумулироваться в биомассе
дождевых червей. При этом черви проявляют толерантность к металлам.
Аккумулированные металлы локализуются, в основном, в кишечном
эпителии (Hartenstein, Hartenstein, 1981). Отмечается также, что аккумуляция
металлов - это следствие повышения их концентрации в содержимом
пищеварительного тракта (Lineras et al., 1985). Несмотря на способность
дождевых червей временно инкорпорировать тяжелые металлы, содержание
металлов в образующемся компосте не всегда снижается. Черви выводят
тяжелые металлы из своего организма, по-видимому, со слизистыми
выделениями. Предполагается, что в пищеварительном тракте червей многие
металлы
образуют
значительно
выше
растворимые
соединения,
(Атлавините
и
др.,
подвижность
1984).
которых
По-видимому,
при
взаимодействии дождевых червей с тяжелыми металлами в той или иной
мере протекают оба процесса: аккумуляция в биомассе и высвобождение.
Согласно выводам многих зарубежных специалистов нельзя надеяться на то,
что с помощью дождевых червей можно уменьшить содержание металлов в
массе отходов.
25
После заселения дождевыми червями разложение отходов ускоряется.
В лабораторных опытах минерализация органического вещества активного
ила протекала в 2-5 раз активнее, если черви присутствовали в нем. Однако,
такая экстремально высокая скорость разложения возможна лишь при очень
высокой плотности червей - до 20 г сырой биомассы/100 г осадков (Loehr et
al., 1985). Это соответствует 40-60 червям в 100 г. Целлюлоза - необходимый
компонент диеты дождевого червя, несмотря на то, что ее химическое
разложение в процессе вермикомпостирования незначительно отличается от
такого для обычного компоста (Hartenstein, 1983; Hatanaka et al., 1983; Hand
et al., 1988). Целлюлоза нужна червям как источник пищевых волокон. Тем
не менее, содержание органического углерода в органическом веществе
копролитов ниже, чем в исходном субстрате, а степень его окисленности
выше (Hatanaka et al., 1983; Grappelli et al., 1987). В вермикомпосте по
сравнению с обычным компостом также падают соотношение C:N и потери
при прокаливании (Satchell, 1983), возрастает электропроводность водного
раствора (Hand et al., 1988). Когда соотношение органическое вещество/зола
падает до значения 2, скорость воспроизводства червей снижается (Hatanaka
et al., 1983). Возможно, этот показатель целесообразно использовать для
определения степени зрелости вермикомпоста.
Дождевые черви способствуют переводу химических элементов в
доступную для растений форму. Однако, в чем суть этого "посредничества"
не известно. Копролиты содержат в 5 раз больше доступного азота, в 7 раз
больше доступного калия и в 1,5 раза больше кальция, чем в среднем
содержится в 15-ти см слое плодородной почвы. Время жизни питательных
элементов в вермикомпостах в 6 раз больше (до 30 суток), чем в
окультуренных почвах. Плодородные свойства вермикомпоста примерно в 5
раз выше, чем хорошо окультуренной почвы (Edwards, Fletcher, 1988).
Многие авторы отмечают относительное накопление в копролитах
гумусированных химических структур, переходящих в щелочные вытяжки и
26
придающих темную окраску последним (Курчева, 1971; Козловская, 1976).
Однако механизм гумусообразования в присутствии дождевых червей не
расшифрован.
Очевидно,
что
основные
химические
события
в
вермикомпостах, связанные с дождевыми червями, следует искать на уровне
биохимической трансформации, опосредованной микроорганизмами.
2. Взаимодействие двупарноногих многоножек и
микроорганизмов
Диплоподы - одни из основных активных первичных разрушителей
лестной подстилки. Они связанны с лесными почвами в разных природных
зонах и перерабатывают опад и древесину. Таким образом, они являются
одними из ключевых сапрофагов почвы. Среди пищевых энзимов у них
отмечена высокая активность карбогидраз, расщепляющих олигосахара,
протеаз и липаз (Nielsen., 1962; Marcuzzi, Turchetto., 1976).
В основе взаимодействия микроорганизмов и кивсяков лежат те же
принципы, что и для взаимодействия их с дождевыми червями.
1. Это осуществление отбора микробных популяций и модификация
микробных сообществ за счет пассажа пищевых субстратов через свой
пищеварительный тракт. Переваривание микроорганизмов животными
основано на "киллерном" эффекте. Есть такая работа по изучению киллерной
активности пищеварительной жидкости кивсяков Pachyiulus flavipes, где
подробно показан этот механизм (Бызов., 2005)
2. Не стоит забывать, что кишечник кивсякой также специфическое
местообитание в почве, как и у кишечник дождевых червей, отличающееся
27
по составу и активности микробов. Функциональная роль кишечных
симбионтов беспозвоночных во многом аналогична таковой у позвоночных.
Особенностью и отличием от дождевых червей является наличие в
кишечнике кивсяков перитрофической мембраны, расположенной в средней
кишке. Она создает барьер, который бактерии не могут преодолеть без
дополнительного фактора-стрессора.
3. Регуляция по трофическому механизму основана на мобилизации
животными питательных веществ, связанных в микробных клетках, их
экскреции и высвобождению в почву микроорганизмов, размножающихся в
кишечнике.
Регуляция
по
метаболическому
механизму
предполагает
физиологический отклик микробов на метаболиты животных, обладающих
свойствами физиологически активных веществ. Предполагается, что у
кивсяков есть свой энзим, действие которого многократно усиливает
активность микрофлоры в пищевом комке (Стриганова., 1980).
Метаболический механизм объясняет быструю реакцию микробов на
воздействие животных, не пропорциональную количеству потребленной
биомассы. Обилие бактерий в кишечники кивсяков на примере Pachyiulus
flavipes составляет 109-1010 КОЕ в экскрементах и 107 КОЕ в корме. (Бызов,
2003).
3. Основы кинетики микробного роста
Параметры роста и его анализ
Все подходы к изучению микробных организмов напрямую зависят от
задач, которые ставятся перед исследователем. Так, например, для многих из
них достаточно качественной характеристики роста, т.е. происходит ли он в
культуре или же нет. Количественно, рост обычно изображают в виде
графика зависимости биомассы от времени. Существуют различные
параметры роста, такие как удельная скорость роста, время удвоения
биомассы,
лаг-период,
или
фаза
задержки
роста,
метаболический
28
коэффициент, экономический коэффициент. Рассмотрим некоторое из них.
Удельная скорость роста.
Для роста биомассы необходимы следующие условия:
1. жизнеспособность засева
2. наличие источника энергии
3. внесение пищевых добавок, содержащих все компоненты, необходимые для
синтеза биомассы
4. отсутствие в среде ингибиторов, подавляющих рост клеток
5. поддержание в среде подходящих физико-химических условий
Формула удельной скорости роста выглядит следующим образом
dx/dt= µx , где dx увеличение биомассы, за бесконечно малый промежуток
времени dt, х - обилие (это может быть количество клеток, биомасса одной
особи, КОЕ и др), а µ - удельная скорость роста, измеряется в единицах
обратных единицам времени (1/t).
Интегрируя получаем следующие уравнения:
ln x = ln x0 +µt
ln( x/x0)=µt
x=x0eµt
Рост подчиняющийся этому закону, называется экспоненциальным или
логарифмическим. Необходимо отметить, что данный закон выполняется,
если условия окружающей среды и состав биомассы остаются постоянными.
29
Удельная скорость роста является основным параметром, характеризующим
скорость роста.
Выделяют так же время удвоения биомассы, степень размножения,
обратное время удвоения, вычисляемые по уравнениям соответственно:
1) td=ln2/µ=0.693/µ
2) x/x0=2n => n= 3.32 log(x/x0)
3) 1/td или log2x=log2x0 + t/td
Экономический коэффициент.
Определяется уравнением:
Δx/Δs=Y , где Δx - увеличением биомассы, соответствующее потреблению
субстрата
в
количестве
Δs,
Y
-
экономический
коэффициент.
Или же в дифференциальной форме, при ds стремящемся к 0 , выглядит
следующим образом: Y = - dx/ds. Знак минус вводится по тому, что x и s
изменяются
в
разные
стороны,
а
коэффициент
принято
считать
положительным числом. Важность данного параметра состоит в том, что он
выражает количественные потребности организма в пище.
Метаболический коэффициент.
Скорость потребления субстрата культурой в данный момент времени.
Выражается следующим уравнением: ds/dt= qx , где ds - потребление
субстрата, dt - момент времени, x -биомасса, q – метаболический
коэффициент или удельная скорость метаболизма.
Иначе можно записать, как µ / Y = q
Влияние концентрации субстрата на скорость роста.
30
Существование
фазы экспоненциального роста в периодической
культуре доказывает, что скорость роста может в довольно широких
пределах не зависеть от концентрации субстрата. Следовательно, рост в этом
случае характеризуется кинетикой нулевого порядка. Отсюда появляется
предположение, что кинетике потребления субстрата будет соответствовать
кинетика ферментативной реакции.
q=qms/(s+Ks) , где s - концентрация субстрата, q – метаболический
коэффициент, qm - максимальное значение q, полученное при s>>Ks, Ks константа насыщения, эквивалентная константе Михаэлиса-Ментен. Данные
по определению Ks немногочисленны, поскольку значения Ks крайне мыла,
часто ниже чувствительности химических методов определения. Численно
ровна количеству субстрата S соответствующего µmax/2.
Лаг-период.
Максимальному уровню удельной скорости роста часто предшествует
лаг-период. Длительность лаг-периода ( t лаг ) для многих целей удобно
описывать методом Лоджа и Хиншельвуда. Если на графике зависимости
логарифма биомассы от времени прямую линию экстраполировать до уровня
начальной биомассы, то отрезок, отсекаемый при этом на оси абсцисс, и
будет соответствовать t лаг . Тогда уравнение для роста культур приобретает
вид:
 x  x0 при t  t лаг

m ( t tлаг )
при t  t лаг
 x  x0e
Предельные границы максимальной концентрации биомассы.
Существует понятие о максимальной плотности биомассы, которая
может быть достигнута в данной среде. Она определяется одним из четырёх
условий:
1) количество лимитирующего субстрата в среде
2) накопление ингибирующего продукта
31
3) максимальная плотность упаковки биомассы
4) отмирание клеток
Высказано несколько предположений. Например, Бейл говорил, что
биологическое пространство значительно шире физического пространства,
занимаемого организмом. На данный момент эта концепция отвергнута.
Таким образом максимальная плотность упаковки клеток (число клеток в 1
см3) составляет около 1012/V, где V - объем индивидуальной клетки в мкм2
Биомасса и её определение.
Биомасса- общий термин, используемый для обозначения организмов в
культуре. Существует несколько методов измерения биомассы. Сухая
биомасса. Прямое определение количества сухой биомассы включает в себя
отделение организма от среды, отмывание и высушивание его в печи при
температуре 105 +/- 2 0C. Недостаток в том, что помимо биомассы среда не
должна содержать неизвестное количество каких-либо твёрдых веществ.
Сырая биомасса. Проводят путем прямого взвешивания, опуская этап
высушивания. Недостаток - не так точен, как метод определения сухой
массы.
Объем. Количество биомассы можно сравнивать, измеряя их объемы,
т.к. по плотности биомассы различаются незначительно.
Линейные размеры. Рост обычных или шаровидных колоний биомассы
можно проследить, измеряя их линейные размеры. Так же можно
использовать
количество
некоторого
клеточного
компонента.
Клеточный азот (с точностью до 1% можно определить по методу Кельдаля,
однако прямая зависимость между содержанием азота и количеством
биомассы наблюдается только в ограниченном диапазоне условий), белок
(для определения обычно используют два метода: в основе одного лежит
реакция биуретовой кислоты на пептидные связи, в основе другой - реакция
тирозиновых и триптофановых остатков на реактив Фолина-Чиокальто,
32
основанный на связывание красителя бромсульфалеина основными группами
белка), ДНК ( основано на колориметрическом определение дезоксирибозы.
Недостаток метода в низкой чувствительности и большими затратами
времени) и др. На выбор метода измерения влияют следующие факторы:
1) свойства биомассы
2) свойства культурной жидкости
3) требуемая точность
4) требуемая чувствительность
5)требуемая скорость
Свойства биомассы, влияющие на выбор:
1) содержит ли она нити или частицы
2) легко ли отделяется от среды
3) возраст биомассы
4) скорость её роста
Экономический коэффициенты
Образование количества биомассы Δx можно определить из количества
потребленного субстрата Δs или количества образовавшегося продукта Δp.
В идеале должна существовать прямая зависимость Δx=Yx/sΔs
и
Δx=Yx/pΔp, где экономические коэффициенты постоянны, однако этого
может и не быть, если изменяются условия культивирования.
Скорость метаболических процессов.
Количество биомассы можно соотнести со скоростью метаболического
процесса. x=(1/q)(dy/dt), где q- метаболический коэффициент, dy/dt скорость метаболического процесса, y - количество некоторого субстрата или
продукта
Метод светорассеяния
33
Суть метода заключается в следующем: суспензии организмов
рассеивают свет и кажутся мутными, если показатель преломления
организма, отличается от показателя преломления среды. Видимая мутнось
начинает проявляться, когда плотность бактерий бактерий достигает 106
ед/мл. Мутность можно измерять, определяя либо количество света
прошедшего через суспензию (абсорбциометрия), либо количество света,
рассеянного суспензией (нефелометрия). Метод светорассеяния применим к
суспензиям бактерий, дрожжей, спор и клеток млекопитающих.
Расчет проводится по уравнению:
log(I0/It) = Axl, где x -
концентрация организмов, l - длина светового пути, I0 и It - интенсивность
света падающего и рассеянного соответственно. log(I0/It) - называется
непрозрачностью, оптической плотностью или экстинкцией. Коэффициент А
- величина постоянная при небольших концентрациях бактерий, но при
больших начинает увеличиваться вследствие вторичного рассеяния, т.к. свет
наталкивается больше, чем на одну частицу.
Степень и направление рассеянного света зависит от размера и формы
частиц, длины световой волны и разницы между показателем преломления
частиц
и
среды.
Эти
влияния
выражены
в
виде
двух
законов:
1) Общее количество света увеличивается с увеличением отношения размера
частиц к длине световой волны.
2) Общее количество рассеянного света тем больше, чем больше различие
между показателем преломления у частицы и среды.
Подсчёт клеток и органелл.
Биомассу можно определить двумя путями:
1) Подсчёт общего числа индивидуальных организмов или органелл (таких,
например, как ядра, присутствующие в образцах) с помощью микроскопов и
некоторых электронных приборов.
34
2) Подсчёт жизнеспособных колоний, вырастающих из индивидуальных
клеток. Недостаток метода подсчета состоит в том, что если число клеток в
пробе мало, то ошибка выборки неизбежна. Преимущество метода - его
специфичность и более высокая чувствительность (по сравнению с другими
методами).
Подсчет живых клеток
Наиболее
важные
методы,
основанные
на
способности
индивидуальных организмов к размножению и образованию колоний,
которые можно подсчитать, описаны Мейнеллом и Мейнелл. Для подсчета
живых клеток должны использоваться не минимальные, а богатые среды,
поскольку изолированные индивидуальные клетки более требовательны к
питанию, среде, чем плотная популяция в целом. С помощью метода
элективных сред можно пересчитать организмы разных типов, которые
присутствуют в смеси.
Метод подсчета, основанный на разбавлении и используемый при
бактериологическом анализе воды, состоит в учете не проросших разведений
после
высева
суспензии
организмов
в
ряд
пробирок
со
средой.
Преимущество данного метода состоит в том, что он дает возможность
определять малые концентрации организмов ( < 1 клетка/мл). Однако
поскольку размер пробы мал, то велика ошибка измерения. Вместо метода
подсчета с помощью разбавления используется метод фильтрации через
мембранные фильтры и выращивание видимых колоний на фильтре.
Методы окрашивания
Наиболее бесспорный метод определения числа живых и мертвых
клеток состоит в сравнении числа колоний и общего числа клеток. В
некоторых случаях мертвые и живые клетки могут быть дифференцированы
с помощью окрашивания красителями. Живые клетки млекопитающих
35
непроницаемы для трипанового синего, а мертвые клетки воспринимают эту
окраску. Для культур дрожжевых клеток аналогично используется эозин.
Красители, окрашивающие только живые клетки, называются витальными
красителями. Окрашенные клетки млекопитающих в культуре с нейтральным
красным используются как количественный тест для определения клеток,
переживающих вирусную атаку.
Периодическая культура.
Открытые и закрытые системы
Культуры микроорганизмов можно подразделять на «открытые» и
«закрытые» системы. Открытая система — это система, все компоненты
которой могут поступать в систему и покидать ее. Закрытой называют такую
систему, в которой хотя бы один из существенных компонентов не может ни
поступать в систему, ни покидать ее. Следовательно, непрерывные культуры,
в которых происходит, с одной стороны, приток питательной среды, с другой
— отток биомассы и других продуктов, являются открытыми системами.
Простая периодическая культура, содержащая ограниченное первоначальное
количество питательного субстрата, служит примером закрытой системы. В
закрытой системе скорость роста биомассы должна стремиться к нулю либо
из-за недостатка субстрата, либо из-за непереносимости продукта при его
дальнейшем накоплении. Следовательно, такие системы всегда находятся в
неустойчивом состоянии. В отличие от этого в открытых системах всегда
есть возможность, что скорость превращения субстрата в продукты и
биомассу сбалансируется со скоростью выхода, иными словами, всегда
может установиться стационарное состояние.
Математическая модель простой периодической культуры.
Фазы роста простой периодической культуры представлены на рис. 1.
36
Рис. 1. Шесть фаз на кривой роста периодической культуры.
(I-лаг-фаза, II-фаза ускорения роста, III – фаза экспоненциального роста, IVфаза замедления роста, V-стационарная фаза, VI-фаза отмирания)
Если рост периодической культуры ограничен только лишь начальным
количеством субстрата, то кривую роста можно предсказать, исходя из
параметров роста.
dx/dt= µx,
µ= µms/(s+Ks),
x-x0=Y(s0-s)
Тогда dx/dt= µm(Ys +x0-x)x/(KsY+s0Y+x0-x)
Проинтегрировав получим
P ln(x/x0) - Q ln{(Ys0 +x0-x)/Ys0}= µmt, где P =(KsY+s0Y+x0)/(Ys0+x0)
и Q = KsY/(Ys0+x0).
37
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Объекты исследования
1.Зоологический объект исследования:
• Пашенный червь Aporrectodea caliginosa.
• Кивсяк Cylindroiulus caeruleocinctus
2.Микробиологический объект исследования:
• Культивируемые аэробные и факультативно анаэробные бактерии.
3.Почвенный объект:
• Гумусоаккумулятивный горизонт дерново-подзолистой почвы.
2. Методы исследования.
Микробиологический
анализ
проводят
комплексным
методом.
Готовятся водные суспензии (1:10) почвы (корма) и копролитов дождевого
червя. Бактерии десорбируются на вортексе «Multi Reax» фирмы Heidolph 20
мин. при 2000 об./мин. Для подавления роста грибов в суспензии добавляется
антигрибной антибиотик нистатин на кончике петли. Концентрация бактерий
в суспензиях определяется посевом на агаризованную глюкозо-пептонодрожжевую среду (ГПД) - агар-агара 15г/л, 1г глюкозы на 1 л, пептона 1г /л,
дрожжевого экстракта 1г/л. Готовятся жидкие среды, содержащие 5 г/л
биополимеров (крахмал, карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), пектин, ксилан,
казеин, декстран-500, твин-20, хитин) и соли среды Чапека ( 2г NaNO3 на 1 л,
1г KH2PO4 на 1л, 0,5г MgSO4*6H2O на 1 л, 0,5г KCl на 1л, H2O дист, 0,1г
FeSО4 на 1 л).
Среды вносятся по 100 мкл
в ячейки 96-луночной
культуральной планшеты.
В ячейки вносилось по 100 мкл исследуемой супензии. Предусмотрены
контроль на стерильность и на рост за счёт органического вещества
суспензии. Рост ассоциаций бактерий определяется в динамике по
38
оптической плотности при 620 нм. на иммунно-ферментном анализаторе
«Sunrise» фирмы «Tecan». Температура инкубаций 25°С. По окончании
инкубации состав возникших ассоциаций определяется посевом из ячеек на
агаризованную ГПД среду. Одновременно по данным посева из ячеек
устанавливается корреляция между оптической плотностью и концентрацией
бактерий. Выросшие на плотной ГПД среде бактерии предварительно
идентифицировались по культурально - морфологическим признакам.
Поведение ассоциаций в лаг-фазе и экспоненциальный рост описывали
уравнением взятым из синтетической хемостатной модели, упрощенной для
описания
периодической
культуры.
В
данной
работе
теоретически
интерпретировался только участок подготовки микроорганизмов к росту
(лаг-фаза) и фаза экспоненциального роста на основе комплексной модели
периодической культуры А.В. Якушева, которая для этих стадий роста очень
близка к синтетической хемостатной модели Н.С. Паникова. Эта модель
может быть записана в форме системы дифференциальных уравнений
или в виде одного интегрального уравнения:

x(t )  x0 1  r0  r0 e  mt

, где
μm – максимальная удельная скорость роста (1/ч)
х(t) – концентрация клеток (КОЕ/мл)
в момент времени t (ч)
r0 – начальное значение переменной физиологического состояния r
39
x0
– начальная концентрация клеток бактерий в момент инокуляции
(КОЕ/мл).
В модели X (концентрация клеток в среде), X0 (исходная концентрация
в суспензии культивируемых бактерий) и t (время) – экспериментальные
данные, а μm и r0 параметры. μm - максимальная удельная скорость роста. r0
- функция физиологического состояние растущей культуры, отражающее
отличие удельная скорость роста
μ
от
μm
в лаг-фазе. Параметр
r0
характеризует физиологическое состояние в момент интродукции (в почве).
На основании этого параметра вводится метаболическая готовность к росту.
Под метаболической готовностью к росту – это фактически готовность
организма к росту на определенной среде. Мы полагаем, что метаболическая
готовность
к
росту
характеризуется
определяется
физиологическим
состоянием.
r0
колебаниями на несколько порядков в связи с чем мы
считаем необходимым логарифмирование этой величины. А для создания
прямой зависимости (чем этот параметр выше, тем метаболическая
готовность к росту выше) необходимо добавить заведомо большое число.
Таким образом
  100  ln( 0 ) .
3. Описание эксперимента
Дождевые черви вида Aporrectodea caliginosa собираются на границе
«новой» Москвы и Московской области на залежи 20 лет. Черви содержатся
неделю на образце гумусо-аккумулятивного горизонта … почвы в условиях
лабораторного микрокосма при постоянной влажности 60%. Далее черви
отмываются от почвы, помещаются в чашку Петри и выдерживаются сутки
при температуре +10°. После чего отбираются копролиты и вместе с почвой,
в которой содержаться черви (корм), микробиологически анализируются.
40
Кивсяки вида Сilindroiulus caeroleocinctus собираются в городской
подстилке Москвы в парке. Содержатся на подстилке взятом на месте отбора
в условиях микрокосма. Далее отбираются экскременты червей и образца
опада и миробиологически анаизируются.
4. Результаты
Количественный посев из ячеек планшеты позволяет установить
зависимость между оптической плотностью и концентрацией клеток в
суспензии. Подобная зависимость позволяется изучать рост периодической
культуры по оптической плотности.
Корреляционный анализ показывает, что наблюдается прямая линейная
зависимость оптической плотности от концентрации бактерий в суспензии
(рис.2). Уравнение пересчета оптической плотности в концентрацию клеток:
x=a×OD, где x – концентрация клеток в суспензии (КОЕ/мл), OD – оптическая
плотность при 620нм, a = 2,7±0,6×109 – коэффициент пересчета.
r=0,77 – коэффициент корреляции, r2=0,59 – коэффициент детерминации
1,2E9
Оптическая плотность 620 нм
1E9
8E8
6E8
4E8
2E8
0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
Время, ч.
Рис. 2. Зависимость оптической плотности от концентрации бактерий в
суспензии
41
Исходные данные:
Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на жидких средах
содержащих различные биополимеры, представленные на рисунках 3-10 для
дождевых червей и с 11-20 для кивсяков.
Концентрация бактерий, КОЕ/мл
3E9
а
б
в
г
2E9
1E9
0
-20
20
0
60
40
100
80
140
180
220
260
120
160
200
240
Время, ч
Рис. 3. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на крахмале (a корм, б - копролиты, в - контроль на стерильность, г - контроль на рост за
счёт собственно органического вещества)
Концентрация бактерий, КОЕ/мл
3E9
а
б
в
г
2E9
1E9
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Время, ч
Рис. 4. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на КМЦ (a - корм,
б - копролиты, в - контроль на стерильность, г - контроль на рост за счёт
собственно органического вещества)
42
Концентрация бактерий, КОЕ/мл
3E9
а
б
в
г
2E9
1E9
0
0
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240
Время, ч
Рис.5. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на пектине (a корм, б - копролиты, в - контроль на стерильность, г - контроль на рост за
счёт собственно органического вещества)
Концентрация бактерий, КОЕ/мл
3E9
а
б
в
г
2E9
1E9
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Время, ч
Рис. 6. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на ксилане (a корм, б - копролиты, в - контроль на стерильность, г - контроль на рост за
счёт собственно органического вещества)
43
Концентрация бактерий, КОЕ/мл
3E9
а
б
в
г
2E9
1E9
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Время, ч
Рис. 7. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на казеине (a корм, б - копролиты, в - контроль на стерильность, г - контроль на рост за
счёт собственно органического вещества)
Концентрация бактерий, КОЕ/мл
3E9
а
б
в
г
2E9
1E9
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Время, ч
Рис. 8. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на декстране-500
(a - корм, б - копролиты, в - контроль на стерильность, г - контроль на рост за
счёт собственно органического вещества)
44
Концентрация бактерий, КОЕ/мл
3E9
а
б
в
г
2E9
1E9
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Время, ч
Рис. 9. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на твин-20 (a корм, б - копролиты, в - контроль на стерильность, г - контроль на рост за
счёт собственно органического вещества)
Концентрация бактерий, КОЕ/мл
3E9
а
б
в
г
2E9
1E9
0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220 240
Время, ч
Рис. 10. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на хитине (a корм, б - копролиты, в - контроль на стерильность, г - контроль на рост за
счёт собственно органического вещества).
45
Казеин
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
а
б
в
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 11. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на казеине (a корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
Твин 20
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
а
б
в
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 12. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на твине 20 (a корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
46
Декстран 500
а
б
в
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 13. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на декстран 500
(a - корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
Инулин
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
а
б
в
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 14. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на инулине (a корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
47
НК
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
а
б
в
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 15. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на нуклеиновой
кислоты (a - корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
Кератин
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
а
б
в
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 16. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на кератине (a корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
48
Хитин
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
а
б
в
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 17. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на хитине 20 (a корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
КМЦ
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
а
б
в
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 18. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на
карбоксиметилцеллюлозе (a - корм, б - экскременты, в - контроль на
стерильность).
49
Ксилан
а
б
в
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 19. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на ксилане (a корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
Крахмал
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
а
б
в
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 20. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на крахмале (a корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
50
Пектин
а
б
в
Оптическая плотность, 620 нм
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 220
Время, ч
Рис. 20. Кривые периодического роста ассоциаций бактерий на пектиине (a корм, б - экскременты, в - контроль на стерильность).
6E7
Median
25%-75%
6E9
Концетрация бактерий, КОЕ/г
Концетрация бактерий, КОЕ/г
7E9
5,655E9
5E9
4E9
3E9
2E9
1E9
7,65E8
Median
25%-75%
5E7
4E7
3E7
2,55E7
2E7
1E7
4,45E5
0
корм
экскремент ы
0
корм
экскремент ы
Рис 21 Обилие бактерий по данным посева для кивсяков (слева) и дождевых
червей
(справа).
Обилие бактерий в исходных корме и экскрементах (Рис.21)
исследовалось для определения параметра х0. Однако этот результат имеет и
самостоятельное значение. Нами было установлено увеличение обилия
культивируемых бактерий при пассаже как дождевых червей так и кивсяков
51
(что согласуется со многими литературными данными (Бызов, 2003)). У
дождевых червей увеличение было на два и у кивсяков на один порядок.
Состав ассоциаций, развивающихся на жидких средах с различными
биополимерами, определяется путем посева с последующей культуральноморфологической идентификацией бактерий. В табл. 1 представлено
количество и соотношение видов бактерий. В табл. 2 приведены индексы
Шеннона
и
Бергера-Паркера
характеризующие
биоразнообразие
для
дождевых червей.
Таблица 1. Соотношение видов бактерий формирующих ассоциации на
жидких средах с биополимерами.
среда
крахмал
КМЦ
Корм
копролиты
морфотип
морфотип
№
Доля
№
Доля
3
0,72
2
0,6667
4
0,26
4
0,3056
8
0,02
8
0,0278
13
1
2
0,75
9
0,25
2
0,9028
10
0,0833
12
0,0139
5
пектин
ксилан
казеин
1
6
0,6667 2
0,6897
11
0,3333 4
0,0689
6
0,0345
8
0,2069
1
0,6136 1
0,3443
2
0,3863 2
0,1312
3
0,5246
52
твин 20
декстран500
2
0,1064 2
0,1081
8
0,2128 3
0,4595
9
0,6809 4
0,027
8
0,3784
9
0,027
2
0,8667 2
0,0919
6
0,0381 4
0,4713
7
0,381
6
0,1149
8
0,0571 8
0,0805
10
0,2414
Таблица 2. Биоразнообразие ассоциаций формирующихся ассоциаций на
жидких средах с полимерами.
Корм
копролиты
Индекс
Индекс
индекс
Бергера- индекс
Бергера-
Шеннона
Паркера
Шеннона
Паркера
крахмал
0,9594
0,72
0,0563
0,6667
КМЦ
0
1
0,81128
0,75
пектин
0
1
0,5176
0,9028
ксилан
0,91826
0,6667
1,27342
0,6897
казеин
0,96244
0,6136
1,40231
0,5246
твин 20
1,19654
0,6809
1,67436
0,4595
1,12474
0,8667
1,97424
0,4713
среда
декстран500
Результаты
табл.
2
были
проанализированы
методом
непараметрической статистики (медиана, квартель) см. рис. 22 и рис. 23. На
рис. 24-25 представлены аналогичные графики для кивсяков.
53
2,2
2,0
1,8
Индекс Шеннона, бит
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Рис. 22.
Median
25%-75%
корм
копролиты
Сравнение биоразнообразия (индекс Шеннона) для ассоциаций
развивающихся на биополимерах при инокуляции питательных сред
суспензиями корма и копролитов дождевых червей.
1,0
Индекс Бергера-Паркера
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Median
25%-75%
корм
копролиты
Рис. 23. Сравнение доминирования (индекс Бергера-Паркера) самого
обильного вида для ассоциаций развивающихся на биополимерах при
54
инокуляции питательных сред суспензиями корма и копролитов дождевых
червей.
Индекс Бергера-Паркера
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Рис. 24.
Median
25%-75%
корм
экскременты
Сравнение биоразнообразия (индекс Бергера-паркера) для
ассоциаций развивающихся на биополимерах при инокуляции питательных
сред суспензиями подстилки (корма) и экскрементов кивсяков.
2,2
Median
25%-75%
2,0
Индекс Шеннона, бит
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Рис. 25.
корм
экскременты
Сравнение биоразнообразия (индекс Шеннона) для ассоциаций
развивающихся на биополимерах при инокуляции питательных сред
суспензиями подстилки (корма) и экскрементов кивсяков.
55
При
пассаже
структурное
биоразнообразие
бактериального
сообщества, оцененное по индексу Шеннона (Рис.22 и 25) снижается за счет
увеличения доли доминантного вида, что показывает индекс БергераПаркера (Рис.23 и 24).
Интересно охарактеризовать состав ассоциаций на полимерах, по
которым мы судим об гидролитическом комплексе непосредственно в корме
и экскрементах. Из сообществ, как корма так и экскрементов обоих видов
животных на полимерах формируются простые бактериальные ассоциации с
индексом Шеннона около 1,3 бит. В них чаще всего доминирует от 2 до 4
морфотипов бактерий. Причем доля выделения новых видов по сравнению с
исходной суспензией достигает 77%, а доля общих для корма и экскрементов
составляет 41% видов для кивсяков и 54% для дождевых червей. При этом из
корма и экскрементов обоих видов животных выделяется на 11 полимерах
около полутора десятков морфотипов бактерий.
86
корм
экскр
Доля потребления полимеров, %
84
82
80
78
76
74
72
70
подстилка и экскременты
почва и копролиты
Рис. 25. Доля потребления полимеров в корме и экскрементах бактериями
для кивсяков (слева) и дождевых червей (справа).
56
На основании кривых роста (рис. 3-20) ассоциаций бактерий корма и
экскрементов, видны различия между вариантами корма и экскрементов.
Исследовался роста на растительных полимерах: ксилан, КМЦ, пектин,
крахмал,
животных:
кератин,
микробных:
декстран
500,
хитин
и
универсальных: казеин, нуклеиновая кислота и твин 20(аналог жиров). Роста
не было на хитине и целлюлозе. На остальных полимерах рост был, однако,
не во всех повторностях. Физиологическое разнообразие гидролитического
комплекса бактерий для корма и копролитов дождевых червей одинаково
(доля от суммарного потребления полимеров 75% и 73% соответственно), как
и для кивсяков в подстилке и экскрементах (доля снижается с 80% до 78%) (
Рис.25).
Сравнение физиологического состояния бактерий и преобладающей
экологической стратегии роста бактерий в почве (корме) и копролитах.
1,2
1,0
0,8
N/Nmax
Корм
0,6
Экскременты
0,4
0,2
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
время, ч
Рис.26. Кривые появления колоний из корм и экскрементов для кивсяков.
57
Median; Whisker: 25%-75%
Максимальная удельная
скорость выхода из лаг-фазы
0,24
0,22
0,20
0,18
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
Экскременты
Корм
0,02
0,00
Оценка метаболической готовности
к росту
Median; Whisker: 25%-75%
94,5
94,0
93,5
93,0
92,5
92,0
91,5
91,0
эксрементах
корм
90,5
Рис.27. Определение метаболической готовности к росту и интенсивности
выхода бактерий из лаг-фазы по динамике появления колоний .
На основание вышеприведенных кривых роста (3-20 рис.) ассоциаций
применяя математическую модель роста лаг-фазы и экспоненциальной фазы
синтетической хемостатной модели (СХМ) были рассчитаны кинетические
параметры μm и
γ
= 100+ln(r0) (показатель метаболической готовности к
росту). Результаты определения представлены на рис. 28-35.
58
Оценка метаболической готовности
к росту
почва
копролиты
104
102
100
98
96
94
пектин
декстран
крахмал
ксилан
твин 20
кмц
казеин
хитин
Рис.28. Сравнение метаболической готовности к росту для ассоциаций
развивающихся на биополимерах при инокуляции питательных сред
суспензиями корма и копролитов для дождевых червей.
Частота встречаемости значения
а
37%
34%
31%
29%
26%
23%
20%
17%
14%
11%
9%
6%
Частота встречаемости значения
42%
40%
б
38%
33%
29%
25%
21%
17%
13%
8%
4%
3%
0%
0%
91
93
95
97
99
101
103
Оценка метаболической готовности к росту
105
91
93
95
97
99
101
103
105
Оценка метаболической готовности к росту
Рис.29. Гистограмма распределения частот встречаемости значений
γ
метаболическая готовность к росту для дождевых червей (а - почва, б копролиты).
59
подстилка
экскременты
99,0
Оценка метаболической
готовности к росту
98,5
98,0
97,5
97,0
96,5
96,0
95,5
95,0
пектин
декстран
крахмал
казеин
ксилан
твин 20
кмц
хитин
Рис.32. Сравнение метаболической готовности к росту для ассоциаций
развивающихся на биополимерах при инокуляции питательных сред
суспензиями корма (подстилка) и экскрементов для кивсяков.
50%
а
43%
36%
29%
21%
14%
7%
0%
93,5
94,0
94,5
95,0
95,5
96,0
96,5
97,0
97,5
Оценка метаболической готовности к росту
98,0
Частота встречаемости значения
Частота встречаемости значения
50%
44%
б
38%
31%
25%
19%
13%
6%
0%
93,5
94,0
94,5
95,0
95,5
96,0
96,5
97,0
97,5
98,0
Оценка метаболической готовности к росту
Рис.33. Гистограмма распределения частот встречаемости значений
γ
метаболическая готовность к росту для кивсяков ( а – подстилка, б –
экскременты).
60
На основании полученных данных (Рис.28,29,32,33) представлены
результаты определения метаболической готовность к росту. Исследование
метаболической готовности микробных ассоциаций расти на питательных
средах,
позволяет
полимеры
оценить
непосредственно
готовность
в
природе.
микроорганизмов
Параметр
γ
потреблять
(гамма)
прямо
пропорционален длительности лаг-фаз и чем он больше, тем метаболическая
готовность к росту больше. Наша гипотеза состоит в том, что доля
метаболически готовых к росту на полимерах ассоциаций (воспринимаемые
нами как целое), отражает действительную метаболическую готовность к
потреблению полимеров in situ. При пассаже для членов бактериального
сообщества наблюдается активизация способности разлагать полимеры в
экскрементах кивсяков и инактивация в копролитах дождевых червей.
Максимальная удельная скорость
роста, 1/ч
0,40
почва
копролиты
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
пектин
декстран
крахмал
ксилан
твин 20
кмц
казеин
хитин
Рис.30 Сравнение максимальной удельной скорости роста для ассоциаций
развивающихся на биополимерах при инокуляции питательных сред
суспензиями корма и копролитов для дождевых червей.
61
58%
54%
54%
50%
а
46%
42%
38%
33%
29%
25%
21%
17%
13%
8%
Частота встречаемости значения
Частота встречаемости значения
58%
50%
б
46%
42%
38%
33%
29%
25%
21%
17%
13%
8%
4%
4%
0%
0%
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
Максимальная удельная скорость роста, 1/ч
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
Максимальная удельная скорость роста, 1/ч
Рис.31 Гистограмма распределения частот встречаемости значений μm
максимальная удельная скорость роста для дождевых червей (а – почва, б –
копролиты).
Максимальная удельная скорость
роста, 1/ч
0,33
подстилка
экскременты
0,30
0,27
0,24
0,21
0,18
0,15
0,12
0,09
0,06
0,03
0,00
пектин
декстран
крахмал
ксилан
твин 20
кмц
казеин
хитин
Рис.34 Сравнение максимальной удельной скорости роста для ассоциаций
развивающихся на биополимерах при инокуляции питательных сред
суспензиями корма (подстилка) и экскрементов для кивсяков.
62
63%
Частота встречаемости значения
Частота встречаемости значения
64%
57%
а
50%
43%
36%
29%
21%
14%
7%
56%
б
50%
44%
38%
31%
25%
19%
13%
6%
0%
0%
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
Максимальная удельная скорость роста, 1/ч
0,55
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
Максимальная удельная скорость роста, 1/ч
Рис.35 Гистограмма распределения частот встречаемости значений μm
максимальная удельная скорость роста для кивсяокв ( а – подстилка, б –
экскременты).
На основании полученных данных (Рис.30,31,34,35) представлены
результаты определения максимальной удельной скорости роста ассоциаций
на полимерах. Наша гипотеза состоит в том, что доля быстрорастущих
ассоциаций отражает доли быстрорастущих бактерий (R-стратегов) в
сообществе корма и
экскрементов. Доля быстро растущих
членов
бактериального сообщества уменьшается при пассаже у кивсяков и
увеличивается у червей. Представление об экологической стратегии
сформулировано на основе уравнения логистического роста организмов:
dP
P
 rP (1  ) , где r характеризует скорость роста (размножения), а K
dt
K
параметр, характеризующий популяционную ёмкость среды (то есть,
максимально возможную численность популяции). Параметры уравнения: r и
K послужили обозначению двух основных стратегий роста. Организмы
делающие ставку на большие значения показателя r называют r-стратеги, а
организмы, которые долгое время поддерживают свою численность на
постоянном уровне, называют K-стратегами.. В экологии микроорганизмов
существует деление на три группы стратегов: r-стратеги (копиотрофы), K63
стратеги
(олиготрофы),
описывающих
микробный
(максимальная
удельная
L-стратеги
рост
(гидролитики).
аналогом
скорость
параметра
В
r
микроорганизмов).
уравнениях
является
μm
L-стратеги
характеризуются высокой способностью переживания неблагоприятных
условий в покоящемся состоянии (спора) и быстрой активизацией в
благоприятных условиях (характеризуется короткой лаг-фазой). Можно
сделать вывод, что из копролитов преобладают ассоциации с большим
значением μm. Это указывает на большую долю r-стратегов в бактериальном
сообществе свежих копролитов по сравнению с почвой. Причина этого в
более усиленном разложении органического вещества в кишечнике
дождевого червя по сравнению с почвой. Измельчение, перемешивание
растительных остатков делает почвенное органическое вещество более
доступным для разложения бактериями гидролитиками, которые, выделяя
дополнительное
количество
мономеров,
снабжают
дождевого
червя
(хозяина) и копиотрофных бактерий, что стимулирует рост последних.
Имеются литературные данные о высокой скорости размножения
и роста микроорганизмов в кишечнике почвенных сапротрофных животных.
Что подтверждает наш вывод об увеличение быстрорастущих бактерий при
пассаже. Приняв время прохождения пищи через кишечник кивсяка в 24 часа
(Стриганова, 1980), можно рассчитать кажущуюся максимальную удельную
скорость роста Pseudomonas sp. - 0,19 1/ч (время генерации 4,6 ч). В
действительности с учетом гибели в верхних отделах (за 3 часа пребывания в
кишечной жидкости титр КОЕ Pseudomonas sp. падал с lg 11,4 до 9,9)
скорость роста бактерий должна быть еще выше (Третьякова и др., 1996).
Такая высокая скорость размножения в почве реализуется, вероятно, только в
местообитаниях с повышенным содержанием питательных веществ - в
кишечнике животных, ризосфере растений и других. Аналогично высокая
скорость роста бактерии Pseudomonas mendocina (0,19 1/ч) обнаружена у
64
дождевых червей Ароrrесtodea caliginosa (Горбенко и др., 1986). Эта
величина приближается к максимальным значениям удельной скорости роста
бактерий рода Pseudomonas, реализуемых на искусственных питательных
средах. По мнению авторов, причина столь интенсивного роста псевдомонад
в пищеварительном тракте животных состоит в их кинетических свойствах:
высоком сродстве к субстрату, большой максимальной удельной скорости
роста, а также в малой биологической инерционности, которая позволяет им
быстро переходить к интенсивному метаболизму при переносе в среду с
высокими концентрациями органических веществ.
Статистические методы:
Полученные
данные
по
метаболической
готовности
роста
и
максимальной удельная скорость роста позволяют оценить тенденции и
отличия для сообществ корма и экскрементов двух видов животных. Для
этого необходимо провести анализ данных многомерными методами
статистики (Рис.35-42).
Root 1 vs. Root 2
7
6
5
4
Root 2
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-8
-6
-4
-2
0
2
4
а
б
в
г
Root 1
Рис.36. Дискриминантный анализ по параметру максимальная удельная
скорость роста (а – почва, б – копролиты, в – подстилка, г – экскременты).
65
Root 1 vs. Root 2
6
5
4
3
Root 2
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
а
б
в
г
Root 1
Рис.37.
Дискриминантный
анализ
по
параметру
метаболическая
готовность к росту (а – почва, б – копролиты, в – подстилка, г –
экскременты).
Tree Diagram for 17 Variables
Ward`s method
City-block (Manhattan) distances
почва1
почва3
почва2
почва4
почва6
почва5
копр1
копр4
копр2
экскр.3
копр3
экскр.1
экскр.2
подстилка4
подстилка1
подстилка2
подстилка3
0
20
40
60
80
100
120
Linkage Distance
Рис.38. Кластерный анализ по параметру метаболическая готовность к
росту.
66
Tree Diagram for 16 Variables
Ward`s method
City-block (Manhattan) distances
почва1
почва4
почва3
почва5
почва6
почва2
копр1
копр4
копр2
копр3
подстилка1
подстилка2
экскр.1
экскр.2
экскр.3
подстилка3
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Linkage Distance
Рис.39. Кластерный анализ по параметру максимальная удельная скорость
роста.
Projection of the variables on the factor-plane ( 1 x 2)
1,0
пектин
хитин
кмц
Factor 2 : 20,82%
0,5
твин 20
0,0
крахмал
казеин
декстран 500
-0,5
ксилан
-1,0
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
Active
Factor 1 : 40,49%
Рис.40. Многофакторный анализ, принцип главных компонент, проекция
переменных
на
факторную
плоскость
анализ
по
параметру
метаболическая готовность к росту.
67
Projection of the variables on the factor-plane ( 1 x 2)
1,0
Factor 2 : 19,11%
0,5
хитин
ксилан
декстран 500
0,0
казеин
кмц
твин 20
-0,5
пектин
крахмал
-1,0
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
Active
Factor 1 : 37,83%
Рис.40. Многофакторный анализ, принцип главных компонент, проекция
переменных
на
факторную
плоскость
анализ
по
параметру
метаболическая готовность к росту.
Projection of the cases on the factor-plane ( 1 x 2)
Cases with sum of cosine square >= 0,00
Labelling variable: Var9
2,5
2,0
1,5
Factor 2: 20,52%
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
-1,5
-2,0
-2,5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
а
б
в
г
Factor 1: 64,78%
Рис.41. Многофакторный анализ, принцип главных компонент, проекция
случаев на факторную плоскость, анализ по параметру метаболическая
готовность к росту ( а – экскременты, б – почва, в – копролиты, г –
подстилка).
68
Projection of the cases on the factor-plane ( 1 x 2)
Cases with sum of cosine square >= 0,00
Labelling variable: Var9
4
3
Factor 2: 19,11%
2
15
17
1
0
16
-1
-2
-3
-4
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
а
б
в
г
Factor 1: 37,83%
Рис.42. Многофакторный анализ, принцип главных компонент, проекция
случаев на факторную плоскость, анализ по параметру метаболическая
готовность к росту ( а – экскременты, б – почва, в – копролиты, г –
подстилка).
Наиболее удачным, на наш взгляд, оказался дискриминантный анализ,
поскольку является наиболее наглядным. В результате дискриминантного
анализа
можно
сделать
следующие
предположения:
метаболическая
готовность потреблять полимеры при пассаже сближается в свежих
экскрементах животных не смотря на различные типы пищеварительных
систем и разный исходный корм. При этом после пассажа стратегии роста
(параметр максимальная удельная скорость роста) в транзиторном кишечном
сообществе у разных животных изменяются по-разному.
69
5. Заключение
На
основании
всего
вышесказанного
выдвинуты
следующие
предположения:
1. Физиологическое разнообразие гидролитического комплекса бактерий для
корма и копролитов дождевых червей одинаково (доля от суммарного
потребления полимеров 75% и 73% соответственно), как и для кивсяков в
подстилке и экскрементах (доля снижается с 80% до 78%).
2.
Дискриминантный
анализ
метаболической
готовности
потреблять
полимеры бактериальным блоком показал, что физиологическое состояние
членов бактериального сообщества при пассаже сближается в свежих
экскрементах животных не смотря на различные типы пищеварительных
систем и разный исходный корм
3. Дискриминантный анализ максимальной удельной скорости роста показал,
что при пассаже наблюдается разнонаправленное изменение преобладающей
экологической стратегии среди членов комплекса и выражается в том, что
доля быстрорастущих членов бактериального сообщества увеличивается в
копролитах дождевых червей Aporrectodea caliginosa и снижается в
экскрементах кивсяков Cylindroiulus caeruleocinctus.
70
ВЫВОДЫ:
1. Физиологическое разнообразие гидролитического комплекса бактерий для
корма и копролитов дождевых червей и кивсяков примерно одинаково.
2. Физиологическое состояние членов бактериального сообщества при
пассаже сближается в свежих экскрементах животных.
3. При пассаже доля быстрорастущих членов бактериального сообщества
увеличивается в копролитах дождевых червей Aporrectodea caliginosa и
снижается в экскрементах кивсяков Cylindroiulus caeruleocinctus.
71
III. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Атлавините О.П., Ванагас И., Вишняускас А.К. Значение дождевых
червей в процессе деструкции органических отходов и трансформации
тяжелых металлов в почве и растениях. Деструкция органического
вещества в почве. Вильнюс, 1984. С. 10-14.
2.
Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К. Экология. Особи, популяции и
сообщества. М.: Мир, 1989. Т. 1.667 с.
3.
Битюцкий Н.П., Соловьева А.Н., Лукина Е.И., Лапшина И. Н., Власов
Д.Ю., Кудряшова Н.В. Влияние дождевых червей на модификацию
популяции микроорганизмов и активность ферментов в почве. М.:
Наука, 2005.
4.
Бызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве. М: ГЕОС, 2005.
5.
Бызов Б.А. Зоомикробные взаимодействия в почве. Автореф. дисс. ...
докт. биол. Наук. М.: Макс Пресс, 2003, 52 с.
6.
Горбенко А.Ю., Паников Н.С., Звягинцев Д.Г. Влияние беспозвоночных
животных на рост почвенных микроорганизмов // Микробиология.
1986. Т. 55. Вып. 3. С. 517-522.
7.
Звягинцев Д.Г., Паников Н.С, Горбенко А.Ю. Количественная оценка
влияния беспозвоночных животных на рост микроорганизмов в почве //
Почвенная фауна и почвенное плодородие. Труды 9 Международного
коллоквиума по почвенной зоологии (под ред. Б.Р. Стригановой). М.:
Наука, 1987. С. 63-67.
8.
Карпачевский Л.О. Почвы как зеркало ландшафта. М.: Мысль, 1983.154
с.
9.
Козловская Л.С. Разложение растительных остатков в почве. М.: Наука,
1985. С. 110-131.
72
10.
Курчева Г.Ф. Роль почвенных животных в разложении и гумификации
растительных остатков. М.: Наука, 1971. 155 с.
11.
Маиаенков И.В., Зубкова ТА., Карпачевский И.О. Механическая
прочность почвенных агрегатов разной формы // Почвоведение. 1997.
№ 12. С. 1438-1444.
12.
Паников Н.С., Горбенко А.Ю., Звягинцев Д.Г. Количественная оценка
влияния мезофауны на скорость разложения растительного опада //
Вестн. МГУ. Сер. 17. Почвоведение. 1985. № 3. С. 37-45.
13.
Покаржевский АД., Сикора И., Гордиенко С.А. Ресурсы аминокислот в
пище сапрофагов // Доклады АН СССР. 1984. Т. 277, № 1. С. 253-256.
14.
Стриганова Б.Р. Питание почвенных сапрофагов. М.: Наука, 1980. 244
с.
15.
Тиунов А.В. Влияние дождевых червей Nicodrilus caliginosus на
нитрификацию
в
дерново-подзолистых
почвах
//
Деструкция
органического вещества в почве. Вильнюс, 1989. С. 172-176.
16.
Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г.
Сообщества
бактерий,
ассоциированные
с
почвенными
беспозвоночными // Микробиология. 1996. Т. 65, № 1.С. 102-110.
17.
Хомяков Н. В., Харин С. А., Нечитайло Т. Ю., Голышин П. Н., Кураков
А. В., Бызов Б. А., Ззвягинцев Д. Г. Реакция микроорганизмов на
воздействие пищеварительной жидкости дождевых червей. М.:Наука,
2007.
18.
Aldag R, Graff O. N-fraktionen in Regenwurmlosung und deren
ursprungsboden // Pedobiologia.1975. V. 15. P. 151-153.
19.
Anderson J.M., Ineson P. Interactions between soil arthropods and microbial
populations in carbon, nitrogen and mineral nutrient fluxes from
decomposing leaf litter // Lee J.A., McNeill S., Rorison I.(eds) Nitrogen as
an Ecological factor. 1984a, Oxford, Blackwell Scientific Publications. P.
413-442.
73
20.
Anderson J.M. Food web functioning and ecosystems processes: problems
and perception of scaling // Invertebrates as Webmasters in Ecosystems.
D.C. Coleman, P.F. Hendrix (eds.). CABI Publishing, 2000. P. 3-24.
21.
Barois I., Villemin G., Lavelle P., Toutain F. Transformation of soil
structure through Pontoscolex corethrurus (Oligochaeta) intestinal tract I I
Geoderma. 1993. V. 56. P. 57-66.
22.
Bouche M.B. Action de la faune du sol sur les etats de la matiere organique
dans les ecosystems // Humification et biodegradation. G. Kilbertus et al.
(eds.). Pierron. 1975. P. 157-168.
23.
Byzova B.A., Khomyakova N. V., Kharina S.A., Kurakovb A. V. Fate of soil
bacteria and fungi in the gut of earthworms // European Journal of Soil
Biology Volume 43, Supplement 1, November 2007, Pages S149–S156
24.
Casalicchio G., Graziano P.L. A comparison of the chemical properties of
composts and worm casting from solid municipal waste and sewage sludge
// On Earthworm. Selected Symposium and monographs U.Z.I., 2, Mucchi,
Modena, 1987. P. 419-457.
25.
Dash N.K., Behera N., Dash M.C. Gut load, transit time, gut microflora and
turnover of soil, plant and fungal material by some tropical earthworms //
Pedobiologia. 1986. V. 29. P. 13-20.
26.
Edwards C.A., Lofty J. R. Biology of Earthworms. 1977, Chapman & Hall,
London.
27.
Ferruzzi K. Manuale del Lombricontrole. Bologna, 1984.
28.
Grappelli A., Galli E. t Tomati U. Olivi oil wastewaters recycled as fertilizer
viawormocomposting // In: On Earthworms. Selected symposia and
monographs U.Z.I., Mucchi, Modena. 1987. № 2. P. 419^122.
29.
Guggenberger G., Thomas R.J., Zech W. Soil organic matter within
earthworm casts of an anecic-endogeic tropical pasture community,
Colombia // Appl. Soil Ecol. 1996. № 3. P.263-274.
74
30.
Hand P., Hayes W.A., Frankland J.C., Satchell J.E. Vermicomposting of
cow slurry Pedobiologia. 1988. V. 31. P. 199-209.
31.
Haimi J., Huhta V. Effects of earthworms on decomposition process in raw
humus forest soil. A microcosm study// Biol. Fertil. Soils. 1990. № 10. P.
178-183.
32.
Hatanaka K., Ishioka L, Feruichi E. Cultivation of Eisenia foetida using
dairy waste sludge cake // In: Earthworm Ecology from Darwin to
vermiculture. J.E. Satchell (ed.). London-New York, 1983. P. 323-329.
33.
Hartenstein R. Earthworm biotechnology and global biogeochemistry //
Advanced Ecological Researches. 1986. V. 15. P. 379-409.
34.
Hartenstein Т.Е., Hartenstein R. Gut load and transit time in the earthworm
Eisenia foetida // Pedobiologia. 1981. V. 22, № 1. P. 5-20.
35.
Hartenstein R., Leaf A.L., Neuhauser E.T. Decomposition of the earthworm
Eisenia foetida and assimilation 15 elements from sludge during growth.
Comparative Biochemistry and Physiology. 1980. V. 66. P. 187-192.
36.
Hanlon R.D.G., Anderson J.M. Influence of macroarthropod feeding
activities on microflora in decomposing oak leaves // Soil Biol. Biochem.
1980. № 12. P. 255-261.
37.
Horner S.G., Abrams B.I. Decomposition of sewage sludge in drying beds
and the potential role of the earthworms Eisenia foetida// J.Envir. Quality.
1980. № 9. P. 373-378.
38.
Hunter B.A., Johnson M.S., Thompson D.J. Ecotoxicology of cooper and
cadmium in a contaminated grassland ecosystem // J. Appl. Ecol. 1987. V.
24, № 2. P. 587-599.
39.
Khomyakov
N. V., Kharin S. A., Nechitailo T. Yu., Golyshin
P. N.,
Kurakov A. V., Byzov B. A., Zvyagintsev D. G. Reaction of microorganisms
to the digestive fluid of earthworms //Microbiology January–February
2007, Volume 76, Issue 1, pp 45-54
75
40.
König H. Bacillus species in the intestine of termites and other soil
invertebrates Journal of Applied Microbiology//Volume 101, Issue 3, pages
620–627, September 2006
41.
Lattaud C, Locati S., Moira P., Rouland C., Lavelle P. The diversity of
digestive systems in tropical geophagous earthworms //Appl. Soil Ecol.
1998. V. 9, № 1-3. P. 193-199.
42.
Laverack M.S. The Physiology of Earthworms, 1963.
43.
Lavelle P., Bignell D., Lepage M., Wolters V, Roger P., Ineson P., Heal
O.W., Dhillion S. Soil function in a changing world: the role of invertebrate
ecosystem engineers // Eur. J. Soil Biol. 1997. V. 33, № 4. P. 159-193.
44.
Lee K.E., Pankhurst C.E. Soil organisms and sustainable productivity //
Austr. J. Soil Lee K.E. Earthworms. Their Ecology and Relationships with
Soils and Land Use. Academic Press (Harcourt Brace Jovanovich,
Publishers),
Sydney-Orlando-San
Diego-New
York-London-Toronto-
Montreal-Tokyo, 1985.
45.
Lineras M., Fayolle L. f Tauzin J., Juste C. Accumulation des metaux tourds
dans Eisenia foetida andrei (Oligochaeta, Lumbricidae) // Agronomie. 1985.
V. 5, № 9. P. 779-784.
46.
Loehr R.C., Neuchauser E.F., Malecki M.C. Factor affecting the
vermistabilization process. Temperature, moisture content and polyculture
11 Water Research. 1985. V. 19, № 110. P. 1311-1318.
47.
Lofs-Holmin A. Vermiculture. Uppsala, 1985.
48.
Marcuzzi G., Turcherro L.M. Conrribute to the knowledge of the digestive
enzymes of some litter feeding animals. Oligosacharases. - Rev. ecol. et biol.
sol., 1976, 13, 3, р. 449-458.
49.
Marinissen J.C.Y., Dexter A.R. Mechanisms of stabilization of earthworm
casts and artificial casts // Biol. Fertil. Soils. 1990. № 9. P. 163-167.
50.
Makeschin F. Earthworms (Lumbricidae: Oligochaeta): Important promoters
of soil development and soil fertility // Fauna in soil ecosystems. Recycling
76
processes, nutrient fluxes and agricultural production. G. Benckiser (ed.).
1997. P. 173-223.
51.
Martin M.M. The role of ingested enzymes in the digestive process of insects
//Invertebrate-microbial
interactions:
British
mycological
society
symposium; 6. J.M. Anderson et al. (eds.). Cambridge: Univ. press, 1984. P.
155-172.
52.
Mindermann G., Daniels L. Colonization of newly fallen leaves by
microorganisms // Progress in Soil Biology, Braunschweig, 1967. P. 3-9.
53.
Morris В., Morgan A.J. Calcium-lead interactions from earthworms:
observations on Lumbricus terrestris L. sampled from a calcareous
abandoned lead mine site // Bulletin of Environment Contamination and
Toxicology. 1986. V. 37, № 2. P. 226-233.
54.
Nielsen C.O. Carbohydrases in soil аnd litter invettebrates. - Oikos, 1962,
13, 2, р. 200-215.
55.
Parle J.N. A microbial study of earthworms casts // J. General
Microbiol.1963. V. 31. P. 13-22.
56.
Pirt S. J. Principles of microbe and cell cultivation // Blackwell Scientific
Publications Oxford London Edinburgh Melbourne. 1975.
57.
Pincince A.B., Donovan J.F., Bates J.E. Vermicomposting of municipal
sludge: aneconomical stabilization alternative // Sludge. 1980. № 3. P. 2630.
58.
Sabine J.R. Vermiculture as an option for resource in the intensive animal
industries // Proc. Workshop on the role of earthworms in the stabilization of
organic residues, Michigan, 1981. P. 241-252.
59.
Satchell J.E. Earthworm microbiology // Earthworm ecology from Darwin to
vermiculture, London, New York, 1983. P. 351-364.
60.
Scheu S. The influence of earthworms (Lumbricidae) on the nitrogen
dynamics in the soil litter system of a deciduous forest // Oecologia. 1987.
V. 72. P. 197-201.
77
61.
Siepel H., de Ruiter-Dukman E.M. Feeding guilds of oribatid mites based on
their carbohydrase activities // Soil Biol. Biochem. 1993. V. 25, № 11. P.
1491-1497. Res. 1992. V. 30. P. 855-892.
62.
Roberts В., Dorough H. Hazards of chemical to earthworms //
Environmental Toxicology and Chemistry. 1985. V. 4, № 3. P. 307-323.
63.
Waugh J.H., Mitchell H.J. Effect of the earthworm Eisenia foetida, on sulfur
speciation and decomposition in sewage sludge // Pedobiologia. 1981. V. 22.
P. 268-275.
78