Диссертация - Институт молекулярной и клеточной биологии СО

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ
СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
Мариловцева Екатерина Викторовна
Клеточная локализация и функция белка
везикулярного трафика Hrs в сперматогенезе и
развитии крыла Drosophila melanogaster
03.01.07 – молекулярная генетика
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
д.б.н. Омельянчук Леонид Владимирович
Новосибирск-2015
2
Содержание
Глава 1. Введение .................................................................................................. 6
Актуальность исследования............................................................................... 6
Цель исследования и задачи исследования ........................................................ 7
Научная новизна................................................................................................... 8
Научно-практическая значимость исследования. ........................................... 9
Научные положения, выносимые на защиту. ................................................... 9
Апробация работы .............................................................................................. 9
Публикации ......................................................................................................... 10
Вклад автора...................................................................................................... 10
Благодарности ................................................................................................... 11
Список использованных сокращений ............................................................... 11
Глава 2. Обзор литературы ............................................................................... 13
2.1 Природа и свойства белка везикулярного трафика Hrs.......................... 13
2.1.1 Hrs – многофункциональный белок .................................................... 13
2.1.2 Мультидоменная организация белка Hrs ............................................ 16
2.1.3 Положение Hrs в системе внутриклеточного везикулярного трафика
.......................................................................................................................... 21
2.1.4 Hrs подвергается фосфорилированию ................................................ 26
2.2 Особенности развития клеток зародышевой линии самцов D.
melanogaster ....................................................................................................... 27
2.2.1 Сперматогенез дрозофилы ................................................................... 27
2.2.2 Формирование акросомы...................................................................... 31
2.3 Развитие крыла D. melanogaster ................................................................ 32
2.3.1 Крыловой имагинальный диск............................................................. 32
2.3.2 Позиционирование и формирование жилок крыла............................ 37
2.4 Трансдетерминация .................................................................................... 41
2.5 Особенности регуляции сигнальных путей D. melanogaster ................... 42
2.5.1 Сигнальный путь Hedgehog ................................................................. 42
3
2.5.2 Сигнальный путь Dpp ........................................................................... 45
2.5.3 Сигнальный путь Wg ............................................................................ 49
2.5.4 Сигнальный путь EGFR ........................................................................ 53
2.5.5 Сигнальный путь Notch ........................................................................ 57
2.6 Малые ГТФазы ............................................................................................. 61
2.7 Методы эктопической экспрессии генов у дрозофилы ........................... 62
Глава 3. Материалы и методы ......................................................................... 68
3.1 Линии дрозофил ........................................................................................... 68
3.2 Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli ........................... 69
3.3 Выделение геномной ДНК ........................................................................... 70
3.3.1 Калий-ацетатный метод ........................................................................ 70
3.3.2 Фенол-хлороформный метод ............................................................... 70
3.4 Молекулярное клонирование ....................................................................... 71
3.4.1 Полимеразная цепная реакция ............................................................. 73
3.4.2 Очистка продуктов ПЦР ....................................................................... 74
3.4.3 Лигирование ДНК и очистка лигазных смесей .................................. 75
3.4.4 Трансформация компетентных клеток E.coli ..................................... 75
3.4.5 Выделение плазмидной ДНК ............................................................... 76
3.4.6 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и её очистка ................ 77
3.4.7
Определение
нуклеотидной
последовательности
полученных
конструкций .................................................................................................... 77
3.5 Работа с РНК .............................................................................................. 78
3.5.1 Выделение тотальной РНК из органов дрозофилы ........................... 78
3.5.2 Реакция обратной транскрипции ......................................................... 79
3.5.3 ОТ-ПЦР .................................................................................................. 80
3.6 Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы ........................ 81
3.7 Приготовление цитологических и гистологических препаратов........... 82
3.7.1 Покрытие стёкол полилизином............................................................ 82
3.7.2 Приготовление препаратов имагинальных дисков личинок 3
возраста и семенников имаго ........................................................................ 82
4
3.7.3 Приготовление препаратов крыльев куколок .................................... 83
3.7.4 Окрашивание крыловых имагинальных дисков и крыльев куколок
антителами ...................................................................................................... 83
3.7.5 Детектироване активности репортёра ß-галактозидазы в крыловых
имагинальных дисках .................................................................................... 84
3.7.6 in situ гибридизация мРНК ................................................................... 84
Глава 4. Результаты ........................................................................................... 87
4.1 Участие белка Hrs в сперматогенезе дрозофилы .................................... 87
4.1.1. Внутриклеточная локализация белка Hrs в сперматогенезе
дрозофилы ....................................................................................................... 87
4.1.2. Мутация и РНК-интерференция гена Hrs не вызывают нарушений
цитокинеза в премейотических митозах и мейозах. ................................... 93
4.1.3. Спектр экспрессии изоформ транскриптов гена Hrs в семенниках,
крыловых имагинальных дисках и ганглиях ............................................... 94
4.1.4. Внутриклеточная локализация маркеров эндосом Rab4, Rab7 и
Rab11 в сперматогенезе дрозофилы ............................................................. 96
4.2 Влияние Hrs на развитие крыла дрозофилы ............................................. 97
4.2.1 Влияние гена Hrs на поддержание D/V границы крылового
имагинального диска ..................................................................................... 98
4.2.2 Влияние гена Hrs на поддержание A/P границы крылового
имагинального диска ................................................................................... 105
4.2.3 Роль гена Hrs на поздних этапах развития крыла ............................ 107
4.2.4
Эктопическая
экспрессия
гена
Hrs
усиливает
эффект
трансдетерминации клеток крыла дрозофилы .......................................... 109
Глава 5. Обсуждение ......................................................................................... 112
5.1 Влияние белка Hrs на развитие клеток зародышевого пути самцов
дрозофилы ........................................................................................................ 112
5.1.1 Белок Hrs локализуется на фузомах сперматоцитов и сперматид
дрозофилы ..................................................................................................... 112
5
5.1.2
Мутация
и
РНК-интерференция
гена
Hrs
не
влияют
на
премейотические митозы, митозы и фертильность самцов дрозофилы . 112
5.1.3 Семенники дрозофилы имеют специфический спектр изоформ
транскриптов Hrs ......................................................................................... 113
5.2 Маркеры эндосом Rab4, Rab7 и Rab11 локализуются на
формирующейся акросоме в процессе сперматогенеза дрозофилы .......... 113
5.3 Новые данные о влиянии Hrs на развитие крыла дрозофилы ............... 114
5.3.1 Ген Hrs участвует в поддержании D/V границы крылового
имагинального диска ................................................................................... 114
5.3.2 Ген Hrs участвует в поддержании A/P границы крылового
имагинального диска ................................................................................... 115
5.3.3 Ген Hrs имеет два фокуса действия в процессе развития крыла
дрозофилы ..................................................................................................... 116
5.3.4 Эктопическая экспрессия Hrs оказывает влияние на развитие
эктопического глаза дрозофилы ................................................................. 116
Выводы................................................................................................................ 118
Список использованной литературы ............................................................ 120
6
Глава 1. Введение
Актуальность исследования
Одним из важнейших процессов, необходимых для подержания
нормальной жизнедеятельности клетки и организма в целом, является
везикулярный трафик. Разнообразие функций системы везикулярного
трафика, включающей эндо- и экзоцитоз, процессы внутриклеточного обмена
белковыми молекулами органелл и так далее, делает её участницей
многочисленных клеточных процессов, таких как поддержание активности
сигнальных путей (reviewed in Seto et al., 2002), акросомогенез (reviewed in
Berruti, Paiardi , 2011), цитокинез (Carlton, Martin-Serrano, 2007; Morita et al.,
2007) и многие другие.
Известно, что везикулярный трафик наиболее активен в клетках
нервной системы, а также в сперматогенезе. Наличие же в сперматоцитах и
сперматидах крупных органелл (облегчающих изучение внутриклеточной
локализации белков) делает сперматогенез удобной моделью исследования
данного биологического процесса.
Одним из ключевых участников везикулярного трафика является Hrs
(Hepatocyte growth factor regulated tyrosine kinase substrate), консервативный
белок эукариот, член Vps (vacuolar protein sorting) семейства вакуолярных
сортировочных белков, основной функцией которого является направление
белковых молекул, поглощённых в ходе эндоцитоза и меченных единичной
молекулой убиквитина, на деградацию в лизосомах, что определяет его
способность оказывать влияние на активность некоторых сигнальных путей.
Благодаря своему мультидоменному строению молекула Hrs способна
связываться со множеством разнообразных белков.
Мутации Hrs (в частности, нонсенс-мутация HrsD28 у дрозофилы) в
гомозиготе приводит к тяжёлым нарушениям гаструляции и вентрального
фолдинга и гибели эмбрионов на ранней стадии (Komada, Soriano, 1999).
Более детальное изучение Hrs показало, что он способен принимать участие
7
в регуляции некоторых сигнальных путей, к числу которых относятся EGFR,
Wg (Seto, Bellen, 2006), Notch (Vaccari et al., 2008) и некоторые другие
сигнальные пути, однако только в случае с EGFR проводились детальное
исследования
влияния
на
него
Hrs
(показано
для
эмбриональных
фибробластах мыши (Kanazawa et al., 2003) и для эмбрионов и имагинальных
дисков плодовой мушки (Chanut-Delalande et al., 2010)).
Кроме того, эксперименты на млекопитающих показали, что белок Hrs
является партнёром шванномина, тумор-супрессора нейрофиброматоза 2
(имеет 55% гомологии с Merlin дрозофилы) (Scoles et al., 2000; Scoles et al.,
2002; Gutmann, 2001), необходимым для поддержания его функции. Более
того, согласно данным (Sun et al., 2002), Hrs млекопитающих самостоятельно
способен выполнять функцию опухолевого супрессора. Поэтому уточнение
функций гена Hrs может играть роль в вопросах изучения регуляции
опухолевого роста и разработки противораковой терапии.
Цель исследования и задачи исследования
Целью данной работы было изучение клеточной локализации белка Hrs в
сперматогенезе дрозофилы и выявление ранее неизвестных функций гена Hrs в
развитии крыла Drosophila melanogaster.
В
cоответствии
с
целью
были
поставлены
следующие
задачи
исследования:
1.
Получить
линии
D.
melanogaster,
содержащие
встройки
последовательностей, кодирующих полноразмерную и различные усечённые
формы гена Hrs, в векторе pUASp-GFP, позволяющем экспрессировать
трансген в клетках зародышевой линии. С помощью полученных линий
изучить локализацию белка в сперматогенезе D. melanogaster.
2. Проанализировать способность Hrs к участию в регуляции цитокинеза
в сперматогенезе D. melanogaster.
8
3. Исследовать спектр экспрессии различных изоформ Hrs (Hrs-RA, HrsRB и Hrs-RC), анонсированных в базе данных FlyBase, в крыловых
имагинальных дисках, ганглиях и семенниках D. melanogaster.
4. Изучить локализацию отличных от Hrs маркеров эндосом в
сперматогенезе D. melanogaster.
5. Исследовать эффекты эктопической экспрессии и сайленсинга
(посредством РНК-интерференции) гена Hrs в развитии крыла D. melanogaster
и выявить ранее неизвестные точки воздействия Hrs на сигнальные пути,
задействованные в данном процессе. Исследовать влияние Hrs на процесс
формирования эктопического глаза на крыле D. melanogaster.
Научная новизна
Впервые изучен спектр транскриптов гена Hrs в соматических тканях
(крыловых имагинальных дисках и ганглиях) и семенниках самцов
дрозофилы, показано, наличие изоформ (Hrs-RA и Hrs-RC), специфичных для
сперматогенеза. В работе получены химерные белки, содержащие фрагменты
белка Hrs, маркированные GFP, что позволило выявить локализацию Hrs на
фузомах (межклеточных цитоплазматических мостиках, объединяющих
сперматоциты в синцитии). Установлено, что за указанную локализацию
белка
ответственен
мотив,
расположенный
между
383
и
472
аминокислотными остатками молекулы Hrs. Установлено, что маркеры
эндосом, отличные от Hrs, – Rab4, Rab7, Rab11 – локализуются в области
акросомы, а Rab4 и Rab7 также на фузоме.
Показано, что негативное влияние Hrs на активность сигнального пути
Wg в крыле опосредовано влиянием Hrs на формирование градиента Cut в
крыловом имагинальном диске. Выявлена роль Hrs в поддержании A/P
границы крылового имагинального диска на поздних личиночных стадиях.
Показано существование ранее неизвестной функции гена Hrs в процессе
развития крыла дрозофилы – участие в процессе сужения про-жилок (vein
refinement) и синхронизации развития поверхностей крыла.
9
Научно-практическая значимость исследования.
Результаты данного исследования вносят вклад в фундаментальные
знания о процессах, лежащих в основе регуляции сигнальных путей,
участвующих в индивидуального развития организма. В данной работе
впервые получены новые маркеры эндосом – фрагменты гена Hrs,
маркированные GFP, которые далее были встроены в геном дрозофилы.
Подобные маркеры позволяют проводить прижизненное наблюдение деталей
поведения эндосом в клетке и изучать клеточные структуры, родственные
эндосомам.
Научные положения, выносимые на защиту.
Ген Hrs экспрессируется на ранних стадиях сперматогенеза дрозофилы
и его белковый продукт ассоциируется с фузомами сперматоцитов за счет
сайта связывания, расположенного между аминокислотными остатками 383 и
472. Hrs влияет на активность сигнального пути Wg на уровне формирования
паттернов экспрессии Cut, Wg и поддержания границ паттерна экспрессии
Ap, и таким образом участвует в поддержании D/V границы крылового
имагинального диска. Hrs также участвует в поддержании A/P границы
крылового имагинального диска и в процессе формирования границ жилок
крыла на стадии куколки.
Апробация работы
Результаты работы представлены на конференции «Хромосома-2012»
(09.2012, г. Новосибирск) и на III Cъезде Общества клеточной биологии
(10.2012, г. Санкт-Петербург).
10
Публикации
1. Копыл С. А., Дубатолова Т. Д., Волкова Е. И., Мариловцева E.В.,
Омельянчук Л.В. Влияние морфогена Wg на формирование эктопического
глаза у Drosophila melanogaster. Генетика, 2011, том 47, № 8, с.1026–1031
2. Мариловцева Е.В., Омельянчук Л.В. P-элемент как инструмент анализа
генома и протеома Drosophila melanogaster. Вавиловский журнал генетики
и селекции, 2011, том 15, № 2, с.585-595.
3. Копыл С.А., Дубатолова Т.Д., Мариловцева Е.В., Омельянчук Л.В. Роль
гена Hrs в формировании крыла Drosophila melanogaster. Генетика, 2012,
том 48, № 9, с.1039-1045.
4. Мариловцева E.В., Копыл С.А., Дубатолова Т.Д., Омельянчук Л.В. Роль
гена
Hrs
в
развитии
Drosophila
melanogaster.
Сборник
трудов
междунарожной конференции «Хромосома 2012». 2-7 сентября, 2012,
Новосибирск, с. 135.
5. Копыл С.А., Дубатолова Т.Д., Мариловцева Е.В., Омельянчук Л.В. “Роль
гена Hrs в формировании крыла Drosophila melanogaster». Сборник трудов
III Съезда Общества Клеточной Биологии. 16-18 октября, 2012, СанктПетербург, с. 11.
6. Мариловцева E.В., Омельянчук Л.В. О роли гена Hrs в поддержании
границ компартментов крылового имагинального диска Drosophila
melanogaster. Генетика, 2015, том 51, № 10, с.1207-1211.
7. Мариловцева Е.В., Дубатолова Т.Д., Галимова Ю.А., Копыл С.А.,
Омельянчук Л.В. Исследование клеточной локализации HRS и других
маркеров эндосом в сперматогенезе Drosophila melanogaster с помощью
химерных GFP конструктов. Цитология, 2015, том 57, №7, с. 509-517.
Вклад автора
Основные результаты получены автором самостоятельно. Все работы
молекулярно-биологического и цитологического характера проводились
11
автором. Получение трансгенных линий дрозофилы проводилось совместно с
н.с. Дубатоловой Т.Д. Эксперименты по изучению трансдетерминации
проводились совместно с н.с. к.б.н. Копылом С.А.
Благодарности
Автор выражает благодарность своему научному руководителю,
Омельянчуку Л.В., сотрудникам лаборатории генетики клеточного цикла
ИМКБ СО РАН – Копылу С.А. и Дубатоловой Т.Д., а также сотруднице
сектора генетики клеточного цикла ИЦИГ СО РАН Дороговой Н.В. Работа
поддерживалась проектами РФФИ 10-04-00652а, 11-04-00256-а. Также была
использована
Правительства
финансовая
РФ
в
поддержка
рамках
РФБР
(проект
государственной
14-04-31412)
поддержки
и
научных
исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских
научных учреждениях (договор № 14.Z50.31.0005).
Список использованных сокращений
АТФ – аденозинтрифосфат
ГБ – гибридизационный буфер
гДНК – геномная ДНК
ГТФ – гуанозинтрифосфат
МВТ – мультивезикулярные тельца
5’-НТО – 5' нетранслируемая область
3’-НТО – 3’ нетранслируемая область
пДНК – плазмидная ДНК
П/О – после окукливания
РНК-и – РНК-интерференция
ССК – сперматогониальные стволовые клетки
12
ФБ – фиксирующий буфер
Aos – Argos
A/P – антерио-постериальная граница крыла
Ap – Apterous
Arm - Armadillo
DABCO – 1,4-диазабицикло [2.2.2] октан
DAPI – 4',6'-диамидино-2-фенилиндол
Dl – Delta
Dpp – Decapentaplegic
D/V – дорзо-вентральная граница крыла
ЕЕА-1 – Early endosomal antigen-1
EGF – эпидермальный фактор роста
EGFR – рецептор эпителиального фактора роста
En – Engrailed
ERM – подсемейство белков эзрин, радиксин, моезин
FLP – фермент рекомбиназа FLP
FRT – сайт посадки рекомбиназы FLP
GFP – green fluorescent protein
Hh – Hedgehog
Hrs (Hgs) – Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate
IPTG – изопропил-ß-D-1-тиогалактопиранозид
LB – бульон Лурия
Mad – Mother-against-Dpp
Neur - Neuralized
Nf2 – Neurofibromatosis 2, нейрофиброматоз второго типа
Omb – Optomotor-blind
Ptc – Patched
RTK – Receptor tyrosine kinase
Salm – Spalt-major
SDS – Sodium dodecyl sulfate
13
Sens – Senseless
Ser – Serrate
Smo – Smoothened
SNARE – Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein
receptor
STAM – signal-transducing adaptor molecule
Tkv – Thickvein
UAS – Upstream Activated Sequence
UIM – Ubiquitin-interacting motif
Vg – Vestigial
VHS – Vps27-Hrs-STAM
Vps – Vacuolar protein sorting
Wg – Wingless
X-GAL – 5-бромо-4-хлоро-3-индолил ß-D-галактопиранозид
Глава 2. Обзор литературы
2.1 Природа и свойства белка везикулярного трафика Hrs
2.1.1 Hrs – многофункциональный белок
Одним из важнейших белковых участников процессов везикулярного
транспорта и сортировки поглощаемых при эндоцитозе молекул является
субстрат рецептор-связанных тирозин-киназ Hrs (Hepatocyte growth factorregulated tyrosine kinase substrate), или Hgs. Ген Hrs локализуется в длинном
плече хромосомы 17 человека (район 17q25) (Lu et al., 1998) и в левом плече
хромосомы 2 D. melanogaster (район 2L(23A)) (согласно данным FlyBase).
Первоначально этот 115 кДа белок был идентифицирован как основной
фосфорилируемый
по
остаткам
тирозина
протеин
клеток
мышиной
меланомы B16-F1, подвергавшихся воздействию фактора роста гепатоцитов
(Hepatocyte growth factor – HGF). В дальнейшем стало известно, что помимо
HGF активаторами фосфорилирования Hrs являются также эпидермальный
14
фактор роста (Epidermal growth factor – EGF), фактор роста тромбоцитов
(platelet-derived
growth
factor
–
PDGF)
(Komada,
Kitamura,
1995),
интерлейкин-2 (IL-2) и колониестимулирующий фактор гранулоцитов и
макрофагов (granulocytes and macrophages colony-stimulating factor – GMCSF)
(Kobayashi et al., 2005; Stenmark et al., 2001).
Hrs – член семейства вакуолярных сортировочных белков Vps (vacuolar
protein
sorting)
–
является
гомологом
белка
Vps27
дрожжей
(последовательности Vps27 и Hrs на 23% идентичны). Vps белки крайне
консервативны и представлены у многих живых организмов, от дрожжей и
нематод до насекомых и млекопитающих (Komada et al., 1997). У
большинства живых организмов наличествует только одна изоформа белка
Hrs; исключение составляют крысы, в чьём организме также экспрессируется
белок Hrs-2, родственный Hrs и отличающийся от него наличием
дополнительных 150 аминокислотных остатков на C-концевом участке,
составляющими АТФазный домен (Bean et al., 1997). Согласно данным базы
данных FlyBase, дрозофилы в результате альтернативного сплайсинга
образуются три изоформы мРНК Hrs – Hrs-RA, Hrs-RB и Hrs-RC, причём HrsRB и Hrs-RC имеют одинаковые рамки считывания и отличаются только 5’НТО (FlyBase).
Присутствуя во всех типах клеток и тканей, Hrs является жизненно
важным белком. На клеточном уровне отсутствие или дефекты Hrs
проявляются в увеличении эндосом и накоплении в клетке, в частности, в её
кортексе, убиквитинированных рецепторных белков ввиду нарушения их
утилизации (Jekély, Rørth, 2003). Избыточная активность гена Hrs также
влечёт за собой цитотоксический эффект и увеличение эндосом клеток
(Kobayashi et al., 2005).
Эмбрионы дрозофилы, мутантные по гену Hrs, обнаруживают
множественные дефекты в ходе гаструляции. Мышиные эмбрионы Hrs-/также дефектны – у них нарушается формирование вентральных структур
(так называемый “ventral folding morphogenesis”), имеющее место на 8-9
15
сутки эмбрионального развития – и гибнут на 11 день развития. У погибших
эмбрионов обнаруживается два билатерально расположенных сердца (cardia
bifida) и выход вентральных участков тела наружу в область желточного
мешка,
при
этом
специализированный
возникновению
апоптоз
клеток
фенотипа
эндодермы.
Тот
предшествует
же
фенотип
обнаруживают особи, у которых инактивированы STAM1 и STAM2 (Komada,
Soriano, 1999).
Не менее важную роль Hrs играет и на более поздних этапах
онтогенеза. У млекопитающих Hrs необходим для поддержания нормального
функционирования нейронов, поскольку участвует в рециркуляции
полноразмерного
тирозин-киназного
рецептора
BDNF
(Brain-derived
neurotrophic factor) (Huang et al., 2009) и сортировке на деградацию
глутаминовых рецепторов NMDAR и AMPAR, чьё накопление в клетках
оказывает цитотоксические эффекты (Tamai et al., 2008). Также Hrs участвует
в регуляции Ca2+-зависимого экзоцитоза и синаптической передаче нервного
импульса (Bean et al., 1997; Kwong et al., 2000; Pridgeon et al., 2009).
Согласно современным данным, Hrs также участвует в поддержании
нормальной функции иммунной системы. У дрозофилы Hrs необходим для
осуществления сигнал зависимой деградации фосфорилированной киназы
Cactus (аналога киназы IkB млекопитающих) в ходе сигнального каскада
Toll-Spätzle;
это
приводит
к
активации
транскрипции
особых
противомикробных генов (Huang et al., 2010). У млекопитающих Hrs
вовлечён в регуляцию антиген-презентирующей активности дендритных
клеток: замечено, что в отсутствие Hrs количество секретирующих экзосом
дендритных клеток существенно уменьшается, а их антиген-презентирующая
функция, соответственно, супрессируется (Tamai et al., 2010). Также было
показано, что у мышей линий hrsflox/flox;mb1cre/+:hrs-cKO, нокаутированных по
гену hrs, существенно снижена выработка В-лимфоцитами антител in vivo, а
также
нарушена
пролиферация
В-клеток,
обработанных
in
vitro
моноклональными антителами против иммуноглобулина M (IgM), но не
16
липополисахаридами. Кроме того, несмотря на нормальное развитие Bклеток в костном мозге мышей линии hrs-cKO, число периферических Вклеток и В-клеток краевой зоны селезёнки было резко снижено (Nagata et al.,
2013).
По данным некоторых исследователей, Hrs требуется для нормального
созревания мужских половых клеток млекопитающих. В сперматидах
мыши, в которых наблюдается пик экспрессии hrs (Itman et al., 2011), он в
комплексе со своим партнёром STAM2 участвует в акросомогенезе (Berruti et
al., 2010).
Наконец, в работе Sun et al. для млекопитающих была показана роль
белка Hrs в обеспечении нормальной опухоль-супрессирующей функции
белка Merlin (Sun et al., 2002). В то же время результаты работы de Vreede
указывают на отсутствие опухоль-супрессирующей функции Hrs дрозофилы,
поскольку мутация Hrs в эксперименте автора не вызывали неопластических
опухолей (de Vreede, 2009).
У D. melanogaster наиболее изученной является летальная мутация
HrsD28, характеризующаяся аминокислотной нонсенс-заменой глутамина Q270
(Lloyd et al., 2002).
2.1.2 Мультидоменная организация белка Hrs
Молекула белка Hrs (молекулярный вес 115 кДа), состоящая из 760
аминокислотных остатков, имеет мультидоменную структуру (Рис. 1).
17
Рисунок 1. Мультидоменная организация белковой молекулы Hrs.
Домен VHS принимает участие в олигомеризации белка Hrs и связывании дилейциновых мотивов. Домен FYVE принимает участие в олигомеризации Hrs
и заякоревании его на мембранах эндосом. Домен UIM принимает участие в
связывании убиквитинированных белков. Y – сайты фосфорилирования.
Pro/Gln – пролин/глутамин-богатый домен, как и coiled-coil участвует в
белок-белковых взаимодействиях. Clathrin-binding домен связывает клатрин
(основано на рисунке из работы Lloyd et al., 2002).
Располагающиеся на N-конце молекулы 153 аминокислотных остатка
образуют домен VHS (Vps27-Hrs-STAM) типа цинкового пальца (Sun et al.,
2003), представляющий по своему строению правозакрученную суперспираль, состоящую из 8 α-спиралей. Подобный домен наличествует, по
крайней мере, у 60 белков различных сортировочных комплексов, и
участвует в распознавании ими разнообразных клеточных грузов (Lohi et al.,
2002). Так домен VHS сортировочных белков GGA, регулирующих
молекулярный обмен между эндосомами/лизосомами и транс-полюсом
аппарата Гольджи, может связывать ди-лейциновые мотивы маннозо-6фосфатных рецепторов (Hanyaloglu et al., 2005), а у партнёра Hrs – белка
STAM
домен
VHS
принимает
участие
в
связывании
сортируемых
убиквитинированных белков (Mizuno et al., 2003). Hrs посредством своего
домена VHS также взаимодействует – либо непосредственно, либо через
18
определённые линкерные белки – с транспортируемыми рецепторами и
таким образом может принимать участие в процессах их циркуляции.
Недалеко от домена VHS располагается характерный для белков
эндосом, таких, как EEA-1 и другие, домен FYVE. (Lloyd et al., 2002)
Структурно домен FYVE относится к доменам Cys2 типа: состоящий,
преимущественно, из петель, он содержит также два антипараллельных βлистка
и
одну
α-спираль
и
стабилизирован
двумя
тетраэдрически
координированными атомами цинка. Вместе домены VHS и FYVE образуют
пирамидальную структуру, в которой домен VHS формирует треугольное
основание, а домен FYVE занимает вершину (Mao et al., 2000).
Домены FYVE двух молекул Hrs способны к антипараллельной
ассоциации с образованием Hrs-гомодимера. Результатом этого является
формирование двух идентичных карманов, организованных максимально
выгодным
образом
для
связывания
лигандов
с
множественным
отрицательным зарядом, таких, как цитраты и фосфатидилинозитол 3-фосфат
(ФИ3Ф) (Mao et al., 2000). Это обеспечивает основную функцию домена
FYVE, которая заключается в осуществлении им заякоривания Hrs в
мембране эндосом. Согласно основной модели, FYVE домен связывается с
липидным бислоем мембран ранних эндосом за счёт неспецифического
электростатического взаимодействия с фосфатидилинозитол 3-фосфатом
(Gaullier et al., 1998); при этом положительный заряд домена нейтрализуется,
что
способствует
частичному
проникновению
его
специфического
гидрофобного участка в мембрану (Diraviyam et al., 2003; Stahelin et al., 2002).
Помимо этого, данный домен способствует взаимодействию Hrs с
некоторыми другими белками.
Следом располагается короткий, около 20 аминокислотных остатков,
домен UIM (Ubiquitin-interacting motif). Это консервативный домен,
характерный для многих эндосомальных белков и выполняющий функцию
связывания убиквитина, преимущественно, в моно-, но также и в мульти- и
19
полиубиквитин меченных белковых субстратах. Кроме того, домен UIM сам,
в определённой степени, способствует процессу убиквитинирования, причём
UIM зависимое полиубиквитинирование не является сигналом протеосомной
деградации (Miller et al., 2004). В то же время, например, в белке STAM, в
отличие от Hrs, роль основного убиквитин связывающего участка выполняет
домен VHS (Mizuno et al., 2003).
Согласно данным Swanson et al. 2003 года один из двух доменов UIM
белка Vsp27 (ортолога Hrs Sacharomyces) имеет последовательность e-e-x-xφ-x-x-A266-φ-x-e/φ-S-z-x-e, где e – отрицательно заряженных аминокислотные
остатки, x – аминокислотные остатки α-спирали, расположенные внутри
домена, z – остатки крупных гидрофобных или полярных аминокислот, φ –
остатки гидрофобных аминокислот, A – аланин, S – серин. Остатки
гидрофобных аминокислот в положениях 5 и 9 последовательности домена, а
также Ala266 взаимодействуют с Leu8-Ile44-Val70 участком поверхности
молекулы
убиквитина.
В
свою
очередь,
отрицательно
заряженный
аминокислотный остаток в положении 11 последовательности домена
взаимодействует с His68 молекулы убиквитина. Таким образом, указанные
аминокислотные остатки абсолютно необходимы для активности всего
домена UIM (Swanson et al., 2003).
Домен
UIM
последовательность
белка
Hrs
имеет
сходное
строение
E259-E-E261-E-L-Q-L-A-L-A268-L-S-Q-S272-E
–
его
(Alam,
Sundquist, 2006); при этом, будучи единственным доменом UIM молекулы,
он, тем не менее, имеет два сайта связывания убиквитина, не связанных
эффектом положительной кооперативности (Hirano et al., 2006). Первый сайт
связывания убиквитина включает Leu263, Leu265, Ala266, Leu267 и Leu269,
взаимодействующие с Ile44 поверхности молекулы убиквитина, Glu259,
взаимодействующий электростатически с Arg42 и Arg72 убиквитина, Glu273,
взаимодействующий с Lys6 убиквитина, и Ser270, взаимодействующий с Gly47
убиквитина (Alam, Sundquist, 2006; Hirano et al., 2006; Shekhtman, Cowburn,
2002). В то же время второй сайт представлен аминокислотными остатками
20
Leu265, Leu267, Ala268, Leu269 и Gln271, также связывающими Leu8-Ile44-Val70
участок
молекулы
убиквитина.
Такое
строение
домена
позволяет
компенсировать низкую степень его сродства к убиквитину (Hirano et al.,
2006).
Следует отметить, что биоинформатические работы показывают, что
домен UIM белка Hrs позволяет ему связывать огромное количество белков,
включая белки переноса «белковых грузов» (33%), участники сигнальных
путей (17%), белки, задействованные в метаболических процессах (17%),
белки везикулярного трафика (13%). Это дополнительно указывает на
многочисленность функций, выполняемых Hrs в клетке (Pridgeon et al., 2009).
В центральной части молекулы Hrs находятся пролин-богатый
линкерный участок, два домена coiled-coil – H1 и H2 – и пролин-/глутаминбогатый участок (Lloyd et al., 2002). В молекуле Hrs человека эти участки
молекулы необходимы для её закрепления на мембране ранних эндосом
(Bache et al., 2003; Hayakawa, Kitamura, 2000), например при взаимодействии
домена H2 с белками STAP-25 (25 kDa synaptosome-associated protein) и
SNAP-23 комплекса SNARE (Stenmark et al., 2001). Также домены coiled-coil
способствуют взаимодействию Hrs с некоторыми другими белками.
Например, домен H1 coiled-coil участвует в формировании комплекса Hrs-2 с
Eps15 (Bean et al., 2000), а участок (470-497) домена H2 Hrs необходим для
взаимодействия последнего с аминокислотными остатками Leu360, Leu535 и
Gln538 молекулы Merlin (Sun et al., 2002).
Кроме того, Sun et al. показали, что расположенный вне coiled-coil
доменов Hrs участок, представленный аминокислотными остатками 498-551,
необходим
для
осуществления
белком
Hrs
опухоль-супрессирующей
функции, которая может быть обусловлена участием Hrs в сигнальных путях
TGF-β, JAK/STAT и RTK. осуществляющегося за счёт аминокислотных
остатков 470-497 домена H2 coiled-coil последнего и Leu360, Leu535 и Gln538
самого Merlin (Sun et al., 2002).
21
Наконец, 69 аминокислотных остатков C-концевого участка молекулы
представляют клатрин-связывающий домен (Raiborg et al., 2001a). Он
также способствует связыванию поверхностью эндосом белка Hrs, а через
него – белков STAM.
2.1.3 Положение Hrs в системе внутриклеточного везикулярного
трафика
Эндоцитоз – перенос молекул внутрь клетки последовательно серией
везикул (Рис. 2) (reviewed in Seto et al., 2002).
Рисунок 2. Схема внутриклеточного везикулярного трафика. shi –
ГТФаза shibire; CCV – везикулы, покрытые клатрином; TGN - транс-отдел
аппарата Гольджи. (Seto et al., 2002).
22
В соответствии с особенностями поглощаемого вещества, принято
выделять два типа эндоцитоза – фагоцитоз (поглощение крупных (>200 нм)
частиц) и пиноцитоз; последний подразделяется на 4 типа – клатринзависимый эндоцитоз (наличествует во всех типах клеток), кавеолинопосредованный эндоцитоз, макропиноцитоз, динамин/клатрин-независимый
эндоцитоза (reviewed in Seto et al., 2002). Наиболее изученным является
клатрин-зависимый эндоцитоз, посредством которого клетки поглощают
антигены,
питательные
вещества,
факторы
роста,
патогены
и
циркулирующие рецепторы (Takei, Haucke, 2001). Клатрин-зависимый
эндоцитоз, включающий в себя несколько этапов, может происходить
конститутивно, под влиянием определённых местных стимулов (например,
экзоцитоз синаптических везикул), или лиганд опосредовано; также на
данный тип пиноцитоза оказывают влияние модификации мембранных
липидов и процессы фосфорилирования (Brodsky et al., 2001).
Процесс клатрин-зависимого пиноцитоза состоит из следующих
этапов:
1. интернализация (поглощение) молекул с поверхности мембраны с
образованием первичных пузырьков;
2. слияние ранних эндосом;
3. образование поздних эндосом с сортировкой поглощённых молекул;
4. обмен поздних эндосом и лизосом.
При поглощении с поверхности белковой молекулы происходит
связывание её ди-лейциновых или тирозиновых мотивов адаптерным
комплексом AP-2; при этом образовавшийся комплекс молекула-мишень/AP2 взаимодействует с внутриклеточным клатрином, что приводит к изгибанию
и инвагинации соответствующего участка мембраны (Brodsky et al., 2001;
Takei, Haucke, 2001). Вспомогательные белки, взаимодействующие с АР-2
(например, Eps15 (Epidermal growth factor receptor pathway substrate clone
15)), облегчают поглощение таких молекул, как EGFR или трансферриновый
23
рецептор (Cupers et al., 1997; reviewed in Seto et al., 2002). Сформировавшаяся
везикула отпочковывается от мембраны при взаимодействии AP-2 с ГТФазой
динамином (её ортолог у D. melanogaster – Shibire (Shi)).
После этого происходит АТФ-зависимая диссоциация клатрина от
комплекса.
Образовавшиеся
небольшие
первичные
пузырьки
далее
сливаются с ранними эндосомами, которые, в свою очередь, сливаются друг
с другом. В этом процессе особую роль играют ионы кальция (Holroyd et al.,
1999; Luzio et al., 2000), ГТФаза Rab5 (Gorvel et al., 1991; reviewed in Seto et
al., 2002) и её эффектор – цитозольный белок ЕЕА-1 (Early endosomal antigen1) (Mills et al., 2001; Stenmark et al., 1996).
Далее, согласно разным теориям, происходит слияние ранних и
поздних эндосом либо преобразование одних в другие. Ранние и поздние
эндосомы различаются по времени достижения компартмента, мембранным
маркерам, внутриклеточной локализации, pH и морфологии. Важным
отличием поздних эндосом от ранних является наличие в первых внутренних
везикул (Hopkins et al., 1990), в связи с чем их также называют
мультивезикулярными тельцами (МВТ). На этом же этапе происходит
сортировка транспортируемых молекул в соответствии с их назначением.
При этом сортировке и транспортировке подвергаются не только молекулы,
поглощённые с поверхности клетки и направляемые, соответственно, либо
обратно на поверхность цитоплазматической мембраны, либо в лизосомы для
дальнейшей деградации, но также ферменты, модифицируемые в цистернах
аппарата Гольджи и необходимые для функционирования лизосом (reviewed
in Luzio, Piper, 2001; reviewed in Seto et al., 2002). В связи с функциональным
разнообразием транспортируемых эндосомами белков, последние несут
определённые метки, необходимые для их правильной сортировки. Так
белки,
подвергающиеся
убиквитином
и
лизосомальной
транспортируются
деградации,
во
модифицируются
внутренних
везикулах
мультивезикулярных телец (МВТ) (reviewed in Luzio, Piper, 2001; reviewed in
Seto et al., 2002). Однако прежде чем транспортируемый белок будет
24
утилизирован лизосомой, происходит отсоединение от него убиквитина за
счёт деубиквитинирующего фермента; таким образом, осуществляется
круговорот убиквитина (Nikko, André, 2007).
На последнем этапе транспортировки, происходит слияние поздних
эндосом и лизосом, после которого ферменты лизосом расщепляют белковые
и
липидные
компоненты
внутренних
везикул
МВТ,
а
также
мультивезикулярные тельца (reviewed in Luzio, Piper, 2001; reviewed in Seto,
2002).
В 1997 г. Komada et al. было показано, что Hrs в цитоплазме колокализуется с трансферрином, что указывает на его ассоциацию с ранними
эндосомами (Komada et al. 1997). Сейчас достоверно известно, что благодаря
своим доменам FYVE и H2 coiled-coil Hrs способен заякориваться в
липидном бислое мембран ранних эндосом (Raiborg et al., 2001b).
Hrs-зависимая регуляция везикулярного трафика начинается уже на
этапе формирования первичных пузырьков и ранних эндосом, о чём
свидетельствует усиление рекрутирования клатрина из цитоплазмы при
эктопической экспрессии Hrs (Raiborg et al., 2001a). Hrs связывает клатрин
своим
C-концевым
клатрин-связывающим
доменом;
дополнительное
взаимодействие Hrs-клатрин может осуществляться посредством домена
VHS по аналогии с клатриновыми адаптерными GGA-белками (Raiborg et al.,
2001a). Кроме того, Hrs-зависимое рекрутирование из цитоплазмы на ранние
эндосомы белка Tsg101 (Tumour susceptibility gene 101, ортолог Vps23
Sacharomyces) (Bouamr et al., 2007) дополнительно облегчает формирование
на эндосомах следующего сортировочного комплекса – ESCRT-I (Endosomal
sorting
complex
required
for
transport),
представленного
другими
сортировочными белками класса Е, семейства Vps (Vps23, Vps28, Vps37), с
«передачей»
ему
моноубиквитинированных
сортировки (Katzmann et al., 2001).
белков
для
дальнейшей
25
Далее белок Hrs играет важнейшую роль в сортировке белков на
лизосомальную деградацию. При этом Hrs образует гетеродимерные
комплексы с белками STAM (signal-transducing adaptor molecule) и STAM2/Hbp (Hrs-binding protein) (Takata et al., 2000), также членами семейства
сортировочных
белков
Vps.
Взаимодействие
белков
Hrs
и
STAM
осуществляется за счёт домена H2 coiled-coil одного и мотивов ITAM
(immunoreceptor
tyrosine-based
activation
motif)
и
SSM
другого,
соответственно (Bache et al., 2003; Kobayashi et al., 2005).
В конце 1990х гг. было показано, что белок Hrs-2 способен
образовывать комплекс с белком SNAP-25 семейства SNARE (Soluble Nethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) (Bean et al., 1997),
который,
в
свою
очередь,
образует
комплекс
с
синтаксинами
на
пресинаптической мембране и участвующим во вскрытии синаптических и
нейросекреторных везикул, то есть в осуществлении экзоцитоза (Holroid et
al., 1999). Позже Hrs также был идентифицирован как партнёр некоторых
белков семейства SNARE, что указывает на его способность влиять на
экзоцитоз. Своим доменом H2 coiled-coil белок – Hrs способен связываться
со SNAP-25 (Kwong et al., 2000), а через домен UIM– связывать
моноубиквитинированную форму белка Munc18-1 (Pridgeon et al., 2009).
Исследования,
проведённые
in
vitro
в
культуре
клеток
адренофеохромоцитомы крысы линии PC12, указывают на то, что
эктопическая экспрессия Hrs приводит к ингибированию Ca2+ зависимого
экзоцитоза (Kwong et al., 2000).
Наконец, у млекопитающих было показано, что белок Hrs способен
участвовать в рециркуляции некоторых рецепторов (прежде всего, βадренорецепторов), Эта функция Hrs ассоциирована с его доменом VHS и не
требует
ни
участия
МВТ/лизосомальной
его
белковых
сортировке,
белков (Hanyaloglu et al., 2005).
ни
партнёров,
задействованных
убиквитинирования
в
сортируемых
26
2.1.4 Hrs подвергается фосфорилированию
Как указывалось ранее, белок Hrs подвергается фосфорилированию при
активации
сигнальных
путей,
ассоциированных
с
тирозинкиназными
рецепторами. В этом процессе задействован тирозинкиназный домен
активированных рецепторов; при этом фосфорилированию подвергаются
аминокислотные остатки Hrs Tyr329 и Tyr334 (возможно, задействованы
некоторые дополнительные сайты фосфорилирования). Одновременно с этим
происходит фосфорилирование партнёра Hrs – белка STAM – по остатку
Tyr198. Причём, комбинации фосфорилированных тирозинов варьируют в
зависимости от природы сигнала: так EGF фосфорилирует STAM-Tyr198, HrsTyr334 и Hrs-Tyr329, HGF – STAM-Tyr198 и Hrs-Tyr? (неидентифицированный
остаток тирозина, отличный от Tyr334 и Tyr329), PDGF – Hrs-Tyr334 (Row et al.,
2005). После этого Hrs осуществляет сортировку убиквитинированного
рецептора, направляя его во внутренние везикулы формирующихся МВТ
(Abelle et al., 2005; Stern et al., 2007). Считается, что фосфорилирование Hrs
усиливает его способность сортировать тирозинкиназные рецепторы и
другие белки. В то же время, фосфорилирование Hrs способствует его
ассоциации с убиквитин-лигазами Е3 c-Cbl (Stern et al., 2007) и AIP4
(Kobayashi et al., 2005) и, следовательно, моноубиквитинированию, которое
опосредует ряд дальнейших событий. Во-первых, Hrs утрачивает сродство к
транспортируемым молекулам, «передавая» их, таким образом, другим
сортировочным белкам; во-вторых, вероятно, в результате конформационных
изменений теряет связь с мембраной эндосомы, переходя в цитозоль, где
подвергается
полиубиквитинированию
деградации (Stern et al., 2007).
и
дальнейшей
протеосомной
27
2.2 Особенности развития клеток зародышевой линии самцов D.
melanogaster
2.2.1 Сперматогенез дрозофилы
Гонады самцов дрозофилы формируются в середине эмбриогенеза.
Взрослый самец дрозофилы имеет пару семенников, каждый из которых
представляет трубку, замкнутую на апикальном конце и закрученную вокруг
одного из семенных пузырьков. С последними семенники связаны семенными
каналами. Семенные пузырьки, в которых накапливаются сперматозоиды,
имеют выход в общий семенной проток, который, в свою очередь, открывается
к передний семявыводящий канал, в который также открываются две
придаточные железы, чья функция заключается в продуцировании особого
вещества, стимулирующего самку к откладыванию яиц (Рис. 3).
28
Рисунок 3. Строение репродуктивного тракта взрослых самцов
дрозофилы.
(1)
семенник;
(2)
придаточная
железа;
(3)
передний
семявыводящий канал; (4) эдеагус (Ram, Wolfner, 2007).
На ультраструктурном уровне сперматогенез D. melanogaster был
впервые описан в 1970-х годах Tokuyasu et al. (Tokuyasu et al., 1972). 6-9
cперматогониальных стволовых клеток (ССК) занимают нишу на апикальном
конце семенника, где, делясь асимметрично, каждая из них даёт две клетки,
одна из которых поддерживает мультипотентность, а другая – гониабласт –
отделяется от общей массы ССК и вступает в процесс дифференцировки.
Гониабласт проходит четыре раунда митотических делений, в результате
которых образуется кластер из 16 сперматогониальных клеток. На этой
стадии цитокинез происходит не полностью, так, что клетки в кластере
остаются
связанными
кольцевыми
каналами.
ССК,
гониабласты
и
29
сперматогониальные клетки имеют сходную морфологию. По окончании S
фазы митоза, cперматогониальные клетки переходят на следующую стадию,
становясь сперматоцитами. Первичные сперматоциты растут, увеличиваются
в объеме в 30 раз, смещаясь при этом в середину семенника; это соответствует
прометафазе первого деления мейоза (Lindsley, Tokuyasu, 1978; Tokuyasu et al.,
1972).
Сразу
же
после
мейоза
начинается
спермиогенез.
В
процессе
спермиогенеза происходит ряд морфологических изменений 64 связанных
между собой сперматид: центриоль превращается в базальное тельце (из
которого развивается аксонема); начинается формирование акробласта;
митохондрии сливаются, образуя 2 крупные митохондрии, закрученные друг
вокруг друга – эта структура носит название «небенкерн» (nebenkern –
«находящийся около ядра» в переводе с немецкого). Данная стадия развития
сперматиды называется стадией «луковицы» (onion stage) (Fuller et al., 1993).
Далее следуют стадия «листа» (leaf-blade stage) и стадия «кометы»; на
протяжении этих стадий происходит элонгация сперматид, в ходе которой
осуществляется рост аксонемы, а небенкерн уплощается и вытягивается
вдоль всей сперматиды. Эти стадии протекают в цисте; при этом ядра
сперматид ориентированы в одном направлении и находятся на одном
уровне.
На заключительном этапе формирования из клеток удаляется почти вся
цитоплазма, большая часть органелл редуцируется, образуя подобие тонкого
тяжа, ориентированного вдоль аксонемы. Связи между клетками исчезают, и
вокруг каждой из них формируется собственная цитоплазматическая
мембрана – формируются спермии, которые при разрыве цисты выходят из
семенника и накапливаются в семенном пузырьке (Lindsley, Tokuyasu, 1978;
Tokuyasu et al., 1972) (Рис. 4).
30
Рисунок 4. Схема сперматогенеза дрозофилы. Сперматогониальная
стволовая клетка делится митотически с образованием сперматоцитов.
Сперматоциты, подвергаясь мейозу I и мейозу II, переходят в стадию
сперматид. В процессе созревания сперматид происходит элонгация клетки и
реорганизация органелл с формированием структур спермия – небенкерна,
акросомы и жгутика. Сперматогенез завершается формированием зрелого
спермия (Fuller, 1998).
31
2.2.2 Формирование акросомы
Акросома – узкоспецифическая органелла мужских половых клеток,
располагающаяся в апикальной части головки сперматозоида и необходимая
для растворения оболочки яйцеклетки в точке проникновения в неё
генетического материала сперматозоида. Акросома содержит большое
количество гидролитических ферментов, как акросомоспецифичных, так и
лизосомальных; в связи с этим, некоторые авторы полагают, что акросома
имеет лизосомальное происхождение (Moreno, Alvarado, 2006; Sun-Wada et
al., 2002). Ряд исследований, однако, показал, что акросома является
производной аппарата Гольджи (Martínez et al., 1996; Tang et al., 1982). На
настоящий момент наиболее правдоподобной кажется объединённая гипотеза
Гольджи-эндосомального акросомогенеза (reviewed in Berruti, Paiardi , 2011).
Ультраструктурные исследования акросомы дрозофилы показали, что
формирование этой структуры начинается с формирования из комлекса
Гольджи органеллы, называемой акробластом на стадии клубка (Early
spermatid at clew stage). На стадии «луковицы» в дополнение к акробласту
возникает акросомная гранула, расположенная рядом с акробластом, который
подвергается перестройке на стадии «листа». (Fuller et al., 1993). У
дрозофилы известен только один ген, белковый продукт которого
связывается с акросомой – это ген sneaky. Sneaky – трансмембранный белок,
детектируемый в сперматогенезе дрозофилы начиная со стадии первичных
сперматоцитов, в цитоплазме которых он распределён диффузно. В
сперматидах на стадии «луковицы» Sneaky собирается в крупные гранулы,
локализующиеся апикальнее ядра в зоне, соответствующей акробласту; на
«стадии кометы» наиболее крупное скопление Sneaky также наблюдается в
области будущей акросомы (Wilson et al., 2006). Интересно, что на данный
момент нет доказательств того, что гомологи Sneaky у других видов
вовлечены в процесс формирования акросомы. Единственное исключение
составляет белок SPE-42 Caenorhabditis elegans, для которого показана
32
функция в оплодотворении (Kroft et al., 2005; Wilson et al., 2011). Таким
образом, задача о том, насколько сходны процессы формирования акросомы
в отношении участвующих в этом процессе белков у разных видов на данный
момент решена не полностью.
2.3 Развитие крыла D. melanogaster
2.3.1 Крыловой имагинальный диск
Зрелое
крыло
имаго
дрозофилы
развивается
из
крылового
имагинального диска личинки. Имагинальные диски представляют собой
особые структуры, образующиеся путём инвагинации эмбрионального
эпителия.
Клетки
будущих
имагинальных
дисков
закладываются
после
формирования клеточной бластодермы (Bate, Arias, 1991). В результате
множественных делений к концу 3й личиночной стадии количество клеток
диска достигает приблизительно 50000.
Для нормальной компартментализации крылового диска необходима
координация пяти сигнальных путей – Hedgehog (Hh), Decapentaplegic (Dpp),
Wingless (Wg), EGFR и Notch, – определяющих антерио-постериальную (A/P)
и дорзо-вентральную (D/V) границы диска. Формирование A/P и D/V границ
диска и подразделение его на отдельные компартменты приводит в
дальнейшем к образованию крыловой пластинки и формированию на ней
жилок и сенсорных щетинок (Рис. 5).
33
Рисунок 5. Компартментализация крылового диска дрозофилы. (a)
Compartmentalization of Drosophila melanogaster wing disc. (a) Anteropos
Формирование антерио-постериальной (A/P) границы: (EN) Engrailed, (HH)
N) is expressed in all posterior (P) cells and specifies posterior identity. EN direc
Hedgehog, (DPP) Decapentaplegic. (b) Формирование дорзо-вентральной (D/V)
ge signalling
molecule Hedgehog (HH). Secreted HH protein crosses the bound
границы: (AP)
Apterous,
(SER) Serrate,
(DL) along
Delta, (WG).
(Dahmann, Basler,bound
on of Decapetaplegic
(DPP)
in anterior
(A) cells
the anteroposterior
1999).
rganizing molecule,
and controls growth and patterning of both compartments. (b
Apterous (AP) is expressed in all dorsal (D) cells and specifies dorsal identi
f Serrate (SER) and Delta (DL) leads to production of Wingless (WG) at th
WG acts as long-range organizing molecule and controls growth and patterning a
Идентификация
(Dahmann and Basler,
1999). переднего (A – anterior) и заднего (P – posterior)
компартментов крылового диска осуществляется за счёт экспрессии
ключевого, для данного процесса, гена Engraled (en), кодирующего
соответствующий транскрипционный фактор. Экспрессия En во всех клетках
y of Apterous confers dorsal fate and induces the expression of
заднего компартмента стимулирует выработку ими секретируемого белка
Hedgehog
Диффундируя,
пересекает
намеченную
A/P-границу
nd, in dorsal
cells(Hh).
(Bachmann
andHhKnust,
1998).
At early
stages Ser
компартмента и, взаимодейтвуя с приграничными антериальными клетками,
e signal toстимулирует
induce expression
of Wingless (Wg) and Delta (Dl) in
экспрессию в них гена Decapentaplegic (Dpp), кодирующего
морфоген, 2009).
контролирующий
клеток
и рост диска
ini and Vincent,
Wg isдифференцировку
a morphogen,
expressed
in aв strip
соответствии с его A/P осью (Basler, Struhl, 1994; Tabata, Kornberg, 1994;
V) boundary cells, and is required for the growth and patterning of
is. Delta, another Notch ligand, signals back to induce Wg and to m
34
Zecca et al., 1995). Ограничение зоны экспрессии Dpp обеспечивается за счёт
его Engrailed-зависимой супрессии постериальнее A/P оси и через Patched
(рецептор
Hh,
блокирующий
Hh
сигнальный
путь
по
принципу
отрицательной обратной связи) антериальнее A/P оси (Sanicola et al., 1995)
(Рис. 6).
Рисунок 6. Модель регуляции ограничения области A/P границы
крылового имагинального диска (en – Engrailed, ptc – Patched, hh – Hedgehog,
dpp – Decapentaplegic) (Sanicola et al., 1995).
35
В клетках-мишенях Dpp активирует ряд транскрипционых факторов,
среди которых наиболее важными для развития крыла являются Optomotorblind (Omb) (Grimm, Pflugfelder, 1996), Spalt-major (Salm) и Spalt-related (Salr)
(de Celis et al., 1996), необходимые для позиционирования ранних про-жилок
крыла.
Ключевым геном в процессе формирования D/V границы является
транскрипционный фактор Apterous (Ap), экспрессирующийся в дорзальном
компартменте крылового имагинального диска (Cohen et al., 1992; Gonzalez et
al., 2006; Milan, Cohen, 2000), где его активное состояние поддерживается за
счёт Hh. Супрессия Ap в вентральном компартменте диска осуществляется за
счёт белков Polycomb группы (reviewed in Held, 2002).
Обмен сигналами между дорзальным и вентральным компартментами
осуществляется через сигнальный путь Notch, опосредующий Apterous
зависимую
регуляцию
экспрессии
морфогена
Wg.
Это
происходит
следующим образом. Ap индуцирует и поддерживает экспрессию Notchлиганда Serrate в дорзальных клетках D/V границы на протяжении 2-3
личиночных стадий (Bachmann, Knust, 1998). Одновременно в середине 2
личиночной стадии в вентральной части D/V границы начинается экспрессия
Notch-лиганда Delta (Dl). Активность сигнала, передаваемого через Dl,
дополнительно усиливается под действием гликозилтрансферазы Fringe,
модифицирующей молекулу Notch (Moloney et al., 2000). Наконец, в поздней
2 – ранней 3 стадии развития личинки под контролем Delta-Notch сигнала в
области D/V границы начинается экспрессия Wg. Как следствие, в области
D/V-границы включается сигнальный путь Wg, активность которого
требуется для поддержания экспрессии Ser и Dl в соседних клетках.
Активность транскрипции Wg на D/V границе поддерживается за счёт
транскрипционного фактора Cut, который, вместе с тем, супрессирует в
указанной области гены Ser и Dl за счёт подавления активности сигнального
пути Wg посредством снижения транскрипционной активноти Armadillo
(reviewed in Held, 2002; Buceta et al., 2007) (Рис. 7). Генами-мишенями Wg
36
являются Vestigial (Vg) – ключевой регулятор развития крыловой пластинки,
– а также Achaete (Ac) и Scute (Sc), экспрессирующиеся по обе стороны от
области экспрессии самого Wg и индуцирующие образование сенсорных
щетинок края крыла. Кроме того, на поздних личиночных стадиях сигнал Wg
поддерживает границы паттерна экспрессии Ap по принципу отрицательной
обратной связи (reviewed in Held, 2002).
Рисунок 7. Формирование D/V границы крылового имагинального
диска посредством координации сигнальных путей Notch и Wg. Wg –
Wingless; Dl – Delta; Ser- Serrate; N – Notch; Ct – Cut. (Buceta et al., 2007).
37
2.3.2 Позиционирование и формирование жилок крыла
Созревание крыла является финальным этапом морфогенеза взрослой
особи дрозофилы (Kiger et al., 2007).
Зрелое крыло дрозофилы сформировано спинной (dorsal) и брюшной
(ventral) поверхностями, плотно соединёнными между собой базальными
мембранами клеток. Вдоль крыла располагается продольные жилки
(longitudinal veins), которые, как правило, обозначаются от L2 до L5, начиная
с переднего края крыла. Между жилками L3-L4 и L4-L5 располагаются две
поперечные жилки (cross veins) – антериальная (a-cv) и постериальная (p-cv),
соответственно. Кроме того, на крыле располагаются маргинальная жилка,
«маркирующая» передний край крыла, и две неполные жилки L1 и L6
(Fristromm et al., 1994). Участки межжилочного пространства (межжилки)
обозначаются буквами латинского алфавита от A до E, начиная с переднего
края крыла, либо в соответствии с нумерацией жилок, между которыми
межжилки располагаются (например, межжилка B также носит название L2L3) (Рис. 8).
38
Рисунок 8. Крыло дрозофилы: L2-L5 – продольные жилки, M – краевая
жилка крыла, p-cv – задняя поперечная жилка, a-cv – передняя поперечная
жилка, L1 и L6 – рудиментарные продольные жилки; A-E – участки
межжилочного пространства.
Развитие крыла происходит следующим образом. Начиная с 6–8 ч. после
окукливания (П/О), эпителий крыла начинает секретировать апикальную
куколочную кутикулу, а его дорзальная и вентральная поверхности
разделяются и остаются в подобном состоянии вплоть до 18–30 ч. П/О. К
этому моменту положение продольных жилок уже соответствует зрелому
состоянию, кроме того, становятся различимыми a-cv и p-cv, а куколочная
кутикула отделяется от крыла и к 36 часу П/О заменяется взрослой
кутикулой (Fechtel et al., 1989).
Крыловой эпителий состоит из двух типов клеток – клеток жилок и
межжилок, составляющих, соответственно, 10% и 90% поверхности крыла, –
причём каждая из них формирует апикальный кутикулярный волосок
(Dobzhansky, 1929). После вылупления взрослой мушки из куколочного
кокона более крупные клетки межжилок, составляющие основу поверхности
крыла, погибают (Johnson, Milner, 1987).
39
Жилки крыла представляют собой трубочки, укреплённые толстой
пигментированной кутикулой. Функционально жилки – выстланные живыми
клетками канальцы, внутри которых проходят нервы, трахеи, циркулирует
гемолимфа; кроме того, жилки служат каркасом для поддержания формы
крыла (reviewed in de Celis, 1998). Зачатки продольных жилок появляются
ещё в крыловом диске; поперечные жилки закладываются в середине
куколочной стадии (Stark et al., 1999). В целом, процесс формирования жилок
может быть подразделён на два основных этапа: 1) детерминация координат
расположения каждой жилки; 2) дифференцировка клеток. Регуляция обоих
этапов
требует
поддержания
позиционной
информации
и
чёткой
координации сигнальных путей.
На начальных этапах своего формирования (ранняя 3я личиночная
стадия) жилки представлены широкими полосами клеток, расположенными
перпендикулярно дорзо-вентральной границе; эти полосы называются прожилками. На этом этапе особенно важную роль в локализации и
формировании про-жилок играют EGFR, Hh и Dpp сигнальные пути.
Действие EGFR сигнального пути в крыловом имагинальном диске
распространяется непосредственно на область про-жилок, в которых активно
экспрессируются модуляторы сигнального пути rhomboid (rho), star (s) и
argos, а также (в позднюю 3ю стадию) EGF-подобный лиганд vein; последний
наиболее активно экспрессируется в районе межжилки L3-L4, стимулируя
EGFR в соседних про-жилках (reviewed in Blair, 2007).
Действие Hh необходимо для нормального позиционирования и
формирования жилок L3 и L4 и межжилки C. Поскольку про-жилка L4
располагается в постериальной части A/P границы крыла, её клетки не
получают Hh сигнал; L3 про-жилка получает очень низкую дозу Hh,
поскольку находится достаточно далеко от A/P границы. Таким образом,
максимальный Hh сигнал приходится на межжилку L3-L4. Hh сигнал, в
частности, активирует в межжилке L3-L4 экспрессию транскрипционного
фактора knot (kn), который, в свою очередь, репрессирует так же мишени
40
EGFR, предотвращая формирование эктопического жилочного материала
(Strigini, Cohen, 1997).
Кроме того, клетки межжилки C под действием сигнала Hh начинают
экспрессировать BMP-4 подобный лиганд Decapentaplecic (Dpp) и BMP-7
подобный лиганд Glass bottom boat (Gbb), что обеспечивает активацию
сигнального пути BMP вдоль ранних про-жилок L3-L4 (reviewed in Blair,
2007). Позиционирование про-жилок L2 и L5 также зависит от активности и
градиента Dpp. Так в межжилке C активность сигнального пути Dpp
существенно снижена, что объясняется транскрипционной репрессией Dpp
рецептора Thickveins (Tkv) посредством Master of Thickveins (Mtv), однако,
вероятно, репрессия Tkv приводит к облегчению диффузии Dpp на
периферию крыла, где он активирует экспрессию транскрипционных
факторов Spalt major (Salm) и Spalt minor (Salr) постериальнее L2 и
антериальнее L5 (Teleman, Cohen, 2000). Salm и Salr индуцируют экспрессию
вдоль про-жилок L2 и L5 транскрипционных факторов Knirps (Kni) и Knirpslike (Knrl), которые, в свою очередь, стимулируют экспрессию в L2 и L5
Rhomboid. Это приводит к повышению активности сигнального пути EGFR
(Lunde et al., 1998). Формирование задней границы про-жилки L5
дополнительно требует активности другого гена-мишени Dpp – Optomotor
blind (Omb) (Cook et al., 2004).
Дальнейшее поддержание и созревание (refinement) жилок на стадии
куколки также осуществляется за счёт координации сигнальных путей,
прежде всего, EGFR, Notch и BMP.
Активность пути EGFR абсолютно необходима для поддержания и
созревания жилок (по крайней мере, их дистальной части) в первые 25 часов
П/О. Супрессия в данный период гена Rho – модулятора сигнального пути
EGFR – вызывает потерю жилочного материала во взрослом крыле, в то
время
как
эктопическая
экспрессия
Rho,
напротив,
приводит
к
формированию дополнительных жилок (reviewed in Blair, 2007). Стимуляция
41
EGFR в жилках осуществляется, преимущественно, посредством лигандов
Spitz и Keren (активируемых за счёт Star и Rhomboid), но также и Vein. В
свою очередь, негативный регулятор сигнального пути EGFR Argos
ограничивает распространение сигнала за пределы намеченной границы
жилки.
Notch в развивающемся крыле действуют антогонистически по
отношению к EGFR и необходим для ограничивания жилок. На протяжении
стадий личинки и куколки Notch лиганды Delta и Serrate экспрессируются в
про-жилках, активируя сигнальный путь Notch во фланкирующих их клетках.
Активация Notch приводит к повышению уровня экспрессии гена Enhancer of
split mβ (E(spl)mβ), который препятствует формированию жилок за
пределами границы про-жилок и ограничивает экспрессию генов Rho и Star
(de Celis et al., 1997).
Наконец, сигнальный путь Dpp. В отличие от имагинального диска, где
экспрессия гена Dpp ограничена областью A/P границы, в крыле куколки она
распространяется вдоль всех жилок. Причём, эктопическая экспрессия генов,
Dpp, Tkv и Saxophone (Sax), кодирующих лиганды и рецепторы данного
сигнального пути, приводит к формированию эктопического жилочного
материала (reviewed in Blair, 2007). Следует также отметить, что на более
поздней стадии (18-30 часов П/О) BMP (Dpp/Gbb) сигнал активно участвует в
формировании поперечных жилок p-cv и a-cv (Conley et al., 2000; Singer,
1997; Yan S.-J., 2009).
2.4 Трансдетерминация
В норме имагинальные диски дрозофилы крайне устойчивы в
отношении поддержания своего специфического статуса детерминации.
Эксперименты
по
трансплантации
фрагментов
имагинальных
дисков
демонстрируют, что клеточная детерминация устойчиво наследуется не
только на протяжении развития личинки, но и в течение длительного периода
пролиферации в ходе культивирования in vivo. Однако в некоторых случаях
42
небольшое количество клеток культивируемого фрагмента изменяет свой
статус детерминации, приобретая свойства, характерные для клеток других
дисков. Этот процесс называется трансдетерминация (Hadorn, 1965).
Трансдетерминация
эукариотических
необходима
относительно
организмов.
интенсивная
Для
широко
распространена
инициации
пролиферация
клеток,
среди
трансдетерминации
как
в
случае
культивирования фрагмента имагинального диска или при регенерации
повреждённого органа (например, у Carausius morosus (Chan, 1993)), а также
изменение статуса экспрессии некоторых генов. Например, эктопическая
экспрессия Wingless в переднем ножном имагинальном диске приводит к
образованию на ноге структур, характерных для крыла (Maves, Schubiger,
1995), а эктопическая экспрессия гена Eyeless в почке крыла крылового
имагинального диска приводит к формированию на крыле эктопического
глаза (Halder et al., 1995).
Согласно данным Maves и Schubiger (Maves, Schubiger, 2003) в
процессе трансдетерминации задействованы сигнальные пути Wg, Dpp и Hh,
активирующие ключевые селекторные гены вне нормального контекста
развития.
Другим
ключевым
элементом
трансдетерминации
является
измененение хроматинового статуса клеток при изменении экспрессии генов
групп Polycomb и Tritorax (Maves, Schubiger, 2003; Klebes et al., 2005).
2.5 Особенности регуляции сигнальных путей D. melanogaster
Строгая регуляция сигнальных путей необходима для нормальной
жизнедеятельности клеток, предотвращения их малигнезации и нормального
развития организма.
2.5.1 Сигнальный путь Hedgehog
Морфоген Hedgehog (Hh) – член группы генов сегментной полярности,
активирущий одноимённый сигнальный путь и выполняющий, таким
образом, важную роль в осуществлении правильного сегментирования
43
эмбриона, позиционировании информации в имагинальных дисках и других
процессах. Впервые Hh был идентифицирован в ходе мутационного
скрининга D. melanogaster (Nüsslein-Volhard, Wieschus, 1980), у которой
существует только один вид этого лиганда. Hh является секретируемым
лигандом; в процессе своего созревания подвергается автокаталитическому
расщеплению (Lee et al., 1994) с последующим О-ацилированием Nконцевого фрагмента О-ацилтрансферазой Skinny и присоединением к нему
цепи пальмитиновой кислоты, а также – с противоположного конца – цепи
холестерола. Эти модификации играют важную роль в процессе диффузии и
заякоривания секретированного Hh на мембранах клеток-акцепторов сигнала
(Chen et al., 2004, Gallet et al., 2006).
Сигнальный
путь
Hedgehog
поддерживается
в
«выключенном»
состоянии за счёт рецептора Hh Patched (Ptc), который конститутивно
экспрессируется клетками-акцепторами (в крыловом диске – клетками
антериального компартмента). Ptc связывает трансмембранный белок
Smoothened
(Smo),
подавляя
его
активность.
Зрелый
лиганд
Hh
взаимодействует с Ptc и индуцирует его поглощение и деградацию. В
отсутствие
Ptc
Smo
фосфорилируется
и
аккумулируется
на
цитоплазматической мембране, что необходимо для активации сигнального
пути Hh. В результате, в клетке, получившей сигнал Hh происходит
стабилизация транскрипционных факторов Gli, прежде всего, Cubitus
interruptus (Ci), которые поступают в ядро и способствуют началу экспрессии
генов-мишеней сигнального пути, включающих Ap, En, Wg, Dpp и Patched
(Ptc) (последнее обеспечивает негативную петлю регуляции сигнального
пути) (reviewed in: Gilbert, 1997; Nahmad, Stathopoulos, 2009; Murone et al.,
1999; Seto et al., 2002).
Подобно другим сигнальным путям, Hedgehog имеет несколько
уровней контроля. Прежде всего, активное участие в процессе регуляции
передачи сигнала Hh играют фосфорилирование и дефосфорилирование
медиатора сигнала – Ci. Фосфорилирование Ci киназой Fused (Fu) оказывает
44
активирующий
эффект
на
передачу
сигнала.
В
то
же
время,
фосфорилирование, в отсутствие сигнала Hh, Сi протеинкиназой А (PKA)
приводит к его частичному протеолизу с образованием продукта – Ci75, –
репрессирущего отдельные гены-мишени Hh. Другой механизм регуляции
Hh посредством действия на Ci – заякоривание его, а также Fu, на
микротрубочках через киназоподобные молекулы Cos-2 (reviewed in Murone
et al., 1999) (Рис. 9).
Рисунок 9. Сигнальный путь Hedgehog. Hh – Hedgehog, Smo –
Smoothened, PKA – протеинкиназа А, Fu – Fused киназа, P – остаток фосфора,
Ci – Cubitus interruptus (Chen, Jiang, 2013).
45
Другой способ регуляции Hh заключается в создании его градиента за
счёт диффузии, в которой, как уже было сказано, важную роль играет
модификация Hh липидами (Guerrero, Chiang, 2007).
Наконец, важное значение в регуляции активности сигнального пути
Hh имеет эндоцитоз и соритировка белков-участников сигнального пути на
деградацию
в
лизосомах.
Например,
предполагается,
что
механизм
ингибирования Smo посредством Ptc заключается в Patched-зависимом
эндоцитозе Smo с его дальнейшей деградацией в лизосомах. Данная гипотеза
подтверждается уменьшением концентрации Smo в клетках в отсутствии
лиганда.
Кроме того, Patched имеет в своём составе стерол-чувствительный
домен (sterol-sensing domain, SSD), свойственный также двум белкам
внутриклеточного везикулярного трафика – SCAP (SREBP cleavage-activating
protein), осуществляющему циркуляцию белков между ЭПР и аппаратом
Гольджи, и белку Niemann Pick C1, участвующему в транспортировке
липопротеинов низкой плотности от лизосом к цитоплазматической
мембране (Denef et al., 2000; reviewed in Seto et al., 2002).
Взаимная регуляция Hh и Ptc также основывается на эндоцитозе. Как в
крыловом имагинальном диске, так и в эмбрионе Ptc лимитирует градиент
Hh посредством динамин-зависимого поглощения комплекса Hh-Ptc с
последующим его убиквитинированием и лизосомальной деградацией с
участием Hrs (Jekély, Rørth, 2003; Torroja et al., 2004). Кроме того, в 2014 году
Fan et al. обнаружили, что Hrs способен стимулировать убиквитинирование и
блокировать фосфорилирование рецептора Hh Smoothened и, тем самым,
способствовать его инактивации (Fan et al., 2014).
2.5.2 Сигнальный путь Dpp
Трансформирующие факторы роста-β (TGF-β) широко представлены
среди различных организмов, от насекомых до млекопитающих, и играют
важную роль на различных этапах онтогенеза, а также в процессе
46
образования опухолей. Гомолог TGF-β дрозофилы был обнаружен в ходе
генетических экспериментов и назван Decapentaplegic (Dpp) (Spencer et al.,
1982). Dpp участвует в развитии яичников, позиционировании информации в
имагинальных дисках и осуществлении других этапов онтогенеза.
У дрозофилы существует, по крайней мере, 3 типа мембранных
рецепторов Dpp: рецептор I типа Thickveins (Tkv), рецептор II типа Punt (Put)
и Saxophone (Sax). Последний также необходим в позиционировании
информации в различных типах тканей, однако канонический сигнальный
путь Dpp, прежде всего, зависит от рецепторов I и II типов. Сигнальный путь
Dpp можно представить следующим образом: взаимодействие Dpp с Put
вызывает димеризацию последнего с Tkv. Оба эти типа рецепторов являются
серин/треониновыми киназами и при димеризации фосфорилируют друг
друга. Это фосфорилирование активирует киназу рецептора I типа, что
приводит к фосфорилированию C-концевого участка цитоплазматического
белка
Mothers
against
Фосфорилированный
Mad
Dpp
(Mad),
ассоциируется
члена
со
семейства
вторым
Smad.
ко-медиатором
семейства Smad – Medea (гомолог Smad4), – после чего образовавшийся
гетеромерный Smad-комплекс Mad-Medea транслоцируется в ядро (Wisotzkey
et al., 1998). В ядре Mad-Medea может связываться с цис-элементами геновмишеней, активируя или репрессируя их транскрипцию. Этому способствует
взаимодействие комплекса со специфическими ко-активаторами или корепрессорами;
в
частности,
было
показано,
что
Mad
может
взаимодействовать с транскрипционным ко-активатором CBP/p300 (reviewed
in Affolter, 2001). Основными мишенями Dpp в крыле являются гены
Optomotor-blind (Omb) (Grimm, Pflugfelder, 1996), Spalt-major (Salm) и Spaltrelated (Salr) (de Celis et al., 1996), кодирующие транскрипционные факторы
(Рис. 10).
47
Рисунок 10. Сигнальный путь Dpp. Tkv – Thickveins; Sax – Saxophone;
P – остаток фосфора. (Harris, Ashe, 2011).
Известно, что у дрозофилы Dpp сигнальный путь антогонистичен
сигнальному пути Wg, который во многом обеспечивается пересечением
путей Dpp и EGFR на поздних стадиях передачи сигнала.
Как и в случае других морфогенов, создание правильного градиента
играет первостепенную роль в регуляции процессов, вызываемых Dpp.
Однако вопрос о том, каким образом происходит регуляция создания
градиента Dpp – посредством диффузии с участием гликопинов Dally и Dallylike, связывающихся с гепарансульфатами экстраклеточного матрикса, или
путём трансцитоза по динамин-зависимому пути, – до сих пор окончательно
не решён. С одной стороны, Teleman и Cohen продемонстрировали, что
основная часть зрелых функциональных молекул GFP-Dpp расщепляется
протеиназой К, что говорит об их экстраклеточной локализации (Teleman,
Cohen, 2000). Belenkaya et al., на основании своих опытов с линиями
дрозофилы, несущими трансген GFP-Dpp, и мутантами по dally и dally-like,
также пришли к выводу, что Dpp локализуется вне клеток, и динамин-
48
зависимый эндоцитоз не требуется для создания его градиента (Belenkaya et
al., 2004). В то же время, эксперименты Entchev et al., также проведённые на
линии GFP-Dpp, показали очень низкое содержание молекул вне клетки. И,
кроме того, теми же авторами было показано, что в клетках, мутантных по
динамину, Dpp не способен проникать вглубь ткани и формирует «тень» с
пониженным содержанием Dpp позади мутантного клона (Entchev et al.,
2000). Наконец, альтернативная модель предполагает равноценный вклад
обоих процессов – диффузии и везикулярного трафика – в создание
градиента Dpp (Kruse et al., 2004).
Так или иначе, связь между сигнальным путём Dpp и везикулярным
трафиком была показана у дрозофилы при исследовании мутантов по гену
VPS25, кодирующему компонент комплекса ESCRT-II: в клонах мутантных
клеток мозаичных имагинальных дисков обнаруживается аккумуляция
активированного рецептора Thickveins в эндосомах. Кроме того, у мутантов
vps25 могут развиваться неопластические опухолевые образования, что во
многом связано с активацией сигнального пути Dpp (Thompson et al., 2005).
Это указывает на зависимость регуляции сигнального пути Dpp как такового
от эндоцитоза и лизосомальной деградации его участников, например,
рецептора Thickveins. Другое указание на зависимость передачи сигнала Dpp
от эндоцитоза обнаруживается в связи Dpp и его рецептора Tkv1 с Saraэндосомами. Sara-эндосомы – субпопуляция мультивезикулярных эндосом,
отличающаяся наличием PI(3)P-связывающего белка Sara (Gillooly et al.,
2003). В ходе митотического деления эпителиальных клеток крылового диска
Sara-эндосомы ассоциированы с веретеном деления, что, по-видимому,
способствует равноценному расределению их и содержащихся в них молекул
Dpp и Tkv1 между дочерними клетками. Это обеспечивает «запоминание» и
поддержания ответа на сигнал Dpp дочерними клетками (Bökel et al., 2006).
Наконец, согласно данным Jekély и Rørth, потеря Hrs повышает уровень
сигнала Dpp и количество мембраносвязанных рецепторов I типа (Tkv),
причём, по-видимому, за счёт Hrs происходит поглощение рецепторов, не
49
активированных
лигандом,
что
позволяет
также
контролировать
чувствительность к сигналу клетки-акцептора, а также интенсивность
диффузии морфогена Dpp (Jekély, Rørth, 2003). Эти данные говорят в пользу
гипотезы негативной Hrs-опосредованной регуляции Dpp. Любопытно, что у
млекопитающих наблюдается противоположный эффект Hrs на TGFβ
сигнальный путь: в мышиных эмбрионах Hrs необходим для активации
SMAD2-опосредованной передачи сигнала (Miura et al., 2000).
2.5.3 Сигнальный путь Wg
Wingless
(Wg)
D.
melanogaster
–
секретируемый
сигнальный
гликопротеин Wnt семейства, ортолог Wnt-1 млекопитающих, принимающий
участие
в
регуляции
эмбрионального
сегментирования
и
развития
предшественников органов имаго (reviewed in Akiyama, 2000). Подобно Hh,
Wg
в
процессе
последующим
созревания
также
присоединением
подвергается
О-ацилированию
пальмитиновой
с
кислоты.
Пальмитоилирование необходимо для нормального трафика и создания
градиента лиганда (Zhai et al., 2004).
Принцип действия сигнального пути Wg основан на изменении
стабильности его вторичного мессенджера β-катенина, кодируемого у
дрозофилы геном Armadillo (Arm) (Рис. 11). В отсутствие сигнала Arm
взаимодействует с белковым комплексом, состоящим из серин-треониновых
киназ Zeste White-3 (ZW3), или Shaggy (гомолог киназы гликогенсинтазы 3
(GSK3β) млекопитающих) (Siegfried et al., 1992), и Discs overgrown/double
time (Dco), а также белков Daxin (Drosophila Axin) и Dapc (Drosophila
adenomatous polyposis coli) (Yanagawa et al., 2002). Это взаимодействие
приводит к фосфорилированию четырёх консервативных остатков серина и
треонина Armadillo (Arm) входящими в комплекс киназами. В свою очередь
фосфорилированный Arm распознаётся и связывается субъединицей E3
убиквитин-лигазы Slimb и направляется на убиквитин-протеосомную
деградацию (Kemler et al., 1997; Yanagawa et al., 2004). Взаимодействие
50
зрелого Wg с одним из его семикратно пронизывающих мембрану
рецепторов семейства Frizzled – Frizzled (Fz) или D-Frizzled2 (DFz2),
приводит к гиперфосфорилированию цитоплазматического белка Dishevelled
(Dsh) и его ассоциации с цитоплазматической мембраной; это приводит к
ингибированию
ZW3.
Одновременно
лиганд-рецепторный
комплекс
взаимодействует с однократно пронизывающим мембрану ко-рецептором
Arrow – гомологом LRP5/6 млекопитающих, – который подвергается
фосфорилированию; фосфорилированная форма Arrow заякоривает аксин,
который затем подвергается инактивации за счёт дефосфорилирования его
протеинфосфатазой 2А (PP2A) (Grigorieff, Clevers, 2005; Piddini et al., 2005;
Yanagawa et al., 1995). Весь этот комплекс процессов приводит к
стабилизации Arm и переносу его в ядро, где он взаимодействует с Dtcf
(Drosophila T-cell factor), активируя транскрипцию многочисленных геновмишеней, таких как Ultrabitorax, Engrailed (Akiyama, 2000; Piddini et al.,
2005), Vestigial, Acheta и Scute (reviewed in Held, 2002).
51
Рисунок 11. Сигнальный путь Wg/Wnt. Wg – Wingless; Fz – Frizzeled;
Dsh – Dishevelled; APC – adenopolyposis coli; Arm – Armadillo; Zw3 – Zeste
White-3 (Zeng, Verheyen, 2004).
Поскольку
Wg
относится
к
группе
морфогенов,
создание
и
поддержание его градиента в соответствующей ткани является фактором,
необходимым для её нормального развития. Формирование градиента
секретированного лиганда Wg осуществляется за счёт его связывания с
гликозамингликанами экстраклеточного матрикса. В эмбрионе градиент
асимметричен и располагается спереди от парасегментарной границы.
Создание такого асимметричного градиента происходит за счёт активного
поглощения
клетками,
парасегментарной
расположенными
границы,
комплекса
постериально
относительно
Wingless-Frizzled-Arrow
с
дальнейшим его моноубиквитинированием и Hrs-зависимой сортировкой в
МВТ на лизосомную деградацию. Этот процесс ослабляет сигнал Wg в
52
указанной группе клеток, а его нарушения, в частности, при мутациях Hrs,
влекут за собой изменение спецификации эпидермальных клеток (Dubois et
al., 2001; Piddini et al., 2005).
В
крыловом
имагинальном
диске
создаётся
иной
градиент,
симметричный относительно дорзо-вентральной границы, с захватывающий
полосу
в
5-10
экспрессирующие
клеток
Wg
шириной.
клетки
В
этом
секретируют
предшественнике
специфические
крыла
везикулы
аргосомы, в которые заключаются молекулы лиганда, ассоциированные с
гепаран
сульфатом.
Аргосомы
могут
поглощаться
клетками,
не
экспрессирующими Wg, и разрушаться в них посредством сортировки на
лизосомную деградацию, что способствует созданию правильного градиента
морфогена (reviewed in Seto et al., 2002). Необходимость эндоцитоза для
нормальной регуляции активности Wg сигналинга в крыловом имагинальном
диске
подтверждается
нарушением
границ
зоны
действия
Wg
в
имагинальных дисках особей, несущих негативные мутации генов Rab
(Marois et al., 2005). А эктопическая экспессия в крыловых дисках гена Hrs
приводит к формированию аномальных поздних эндосом и у взрослых
особей фенотипически проявляется исчезновением одного или нескольких
рядов тройного ряда сенсорных щетинок (triple row) антериального края
крыловой пластинки; в то же время у мутантов по Hrs наблюдается
повышение уровеня активности сигнального пути Wg (Seto, Bellen, 2006).
Активность Wg регулируется не только созданием градиента лиганда и
разрушением
активированного
лиганд-рецепторного
комплекса,
но
и
поддержанием количества неактивированного рецептора на мембране
клеток-акцепторов
сигнала,
что
также
осуществляется
посредством
эндоцитоза. Так мутации деубиквитинирующего фермента dUBPY, равно как
и эктопическая экспрессия Hrs, приводит к ослаблению сигнала Wg (Goto et
al., 2010).
В то же время, по данным (Rives et al., 2006), основанным на
иммуноокрашивании продуктов генов-мишеней Wg, в мутантных клонах
53
крыловых имагинальных дисков, равно как и в дисках мутантов с делецией в
Hrs, не наблюдается изменений сигнала Wg, что противоречит гипотезе о
существовании влияния Hrs на активность сигнального пути Wg. Taelman et
al. предполагают, что различие в результатах аналогичных экспериментов
Seto и Bellen (2006) (Seto, Bellen, 2006) и Rives (2006) (Rives et al., 2006)
может объясняться тем, что у дрозофилы даже в отсутствие Hrs
формирование МВТ поддерживается за счёт других компонентов ESCRT-0; в
собственной работе Taelman et al. демонстрируют повышение активности
сигнального пути Wg в ответ на ингибирование Hrs за счёт РНКинтерференции в клеточных культурах и in vivo у Xenopus (Taelman et al.,
2010).
Интересные данные были получены для большого числа опухолевых
клеточных линий человека (Toyoshima et al., 2007). Согласно им, Hrs
способен
принимать
цитоплазматической
участие
мембраной
в
и
высвобождении
цитоскелетом
от
β-катенина
связи
за
с
счёт
поглощения и дальнейшей сортировки на лизосомную деградацию Екадгерина, способного заякоривать β-катенин на цитоплазматической
мембране. Это, в свою очередь, не только приводит к усилению
пролиферации клеток, но также к активной их миграции за счёт ослабления
контактного ингибирования (Palacios et al., 2005). Возможно, случай Hrsзависимого усиления сигнального пути Wg у дрозофилы обусловлен
аналогичным механизм регуляции.
2.5.4 Сигнальный путь EGFR
Сигнальные пути, ассоциированные с рецепторными тирозинкиназами
(RTK),
широко
распространены
у
эукариотических
организмов
и
необходимы для нормальной регуляции пролиферации клеток. У дрозофилы
группа RTK включает такие белки, как Sevenless (Sev), Torso (Tor) и
эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor (EGF)). Причём в
54
отличие от прочих RTK, EGFR вовлечён в регуляцию огромного количества
процессов в ходе развития организма: образование вентральных структур
эмбриона, формирование нервной системы и половых клеток и так далее
(reviewed in Perrimon, Perkins, 1997). В связи с этим необходима его чёткая
регуляция по времени и локализации.
У дрозофилы имеется несколько различных лигандов рецептора EGF:
Gürken (трансмембранный лиганд, функционирующий только в оогенезе)
(Neuman-Silberberg, Schüpbach, 1993), Spitz (активен только после Rhomboid
(Rho) и Star-зависимого процессинга (Kolodkin; reviewed by Held, 2002)), Vein
(конститутивно активный секретируемый лиганд, более слабый, чем Spitz).
Необходимо также упомянуть о регуляторе Spitz-активируемого пути EGFR
– секретируемой молекуле Argos, ингибирующей передачу сигнала через
EGFR (Schweitzer et al., 1995); любопытно, что экспрессия гена argos
индуцируется под влиянием сигнала EGFR, что обеспечивает регуляторную
петлю с отрицательной обратной связью (Golembo et al., 1996).
Связывание лиганда с EGFR приводит к димеризации последнего с
дальнейшим
транс-аутофосфорилированием
по
остаткам
тирозина.
Активированный рецептор связывается адапторными белками Shc (Lai et al.,
1995) и Downstream of receptor kinases (Drk), что приводит к активации Son of
Sevenless (Sos) – фактора GTP/GDP-обмена, – который, в свою очередь,
катализирует активацию белка p21Ras1. Эти процессы приводят к запуску
каскада
Ras/Raf/MAPK,
включающего
последующие
активации
серин/треониновых киназ – Raf (киназы киназы MAP-киназы), Dsor1 (киназы
MAP-киназы) и, наконец, Rolled (Rl) (MAP-киназы) (reviewed in Olivier et al.,
1993;
Perrimon,
1994).
Активированная
MAPK
фосфорилирует
ряд
транскрипционных факторов, активируя одни из них (например, Pointed) и
ингибируя другие (например, Yan, конкурирующего с Pointed) (Рис. 12). Всё
это приводит к изменению статуса экспрессии определённх генов и,
соответственно, вызывает ряд последующих клеточных реакций, включая
активацию пролиферации (Chen et al., 2004; reviewed in Vivekanand, Rebay,
55
2006).
Рисунок 12. Сигнальный путь RTK (EGFR, HGFR). RTK – рецепторная
тирозинкиназа; Raf – киназа киназы MAP-киназы; MEK – киназа MAPкиназы; ERK – MAP-киназа; Pnt – Pointed; Aos - Argos (Yan H. et al., 2009).
Очевидно,
передающие
в
что
активированные
клетку
митогенные
тирозинкиназные
сигналы,
должны
рецепторы,
своевременно
инактивироваться. Инактивация EGFR сигнального пути у дрозофилы
обеспечивается, перимущественно, двумя путями – воздействием на них
специфических тирозинфосфатаз (Gandhi et al., 2005) и поглощением их
56
активированного рецептора в ходе клатрин-зависимого эндоцитоза (reviewed
in: Seto et al., 2002; Vivekanand, Rebay, 2006). Однако интересно, что у
дрозофилы эндоцитоз может оказывать на сигнальные пути RTK как
супрессирующий, так и активирующий эффект.
Так, по данным многих авторов, активность сигнального пути EGFR
ослабляется за счёт поглощения активированных рецепторов с поверхности
клетки, убиквитинирования их посредством убиквитин-лигаз E3 (Stern et al.,
2007) и сортировки их в лизосомы с последующей деградацией (Lloyd et al.,
2002; Wells et al., 1990). Этот процесс напрямую связан с действием Hrs, что
подтверждается ингибированием лизосомной деградации EGFR в клетках
личинок, гомозиготных по Hrs-/-, а также повышение активности сигнального
пути EGFR в эмбрионах дрозофил, мутантных по гену Hrs (Lloyd et al., 2002).
(Рис. 13).
Рисунок 13. Механизм сортировки тирозинкиназных рецепторов при
участии Hrs. Ub – убиквитин; MVB – мультивезикулярные тельца (Lloyd et
al., 2002).
57
В то же время, по данным Miura et al. за 2008 год, Hrs (в комплексе со
своим белковым партнёром Myopic) необходим для поддержания сигнала
EGFR в развитии фоторецепторов R1-7. В крыловых имагинальных дисках
дрозофилы
также
обнаружена
Hrs-зависимая
позитивная
регуляция
сигнального пути EGFR: в дисках, мутантных по белку Hrs (и/или его
белковому партнёру STAM), наблюдается снижение экспрессии argos – генамишени EGFR (Miura et al., 2008; Chanut-Delalande et al., 2010). Наконец, Hrs
и
STAM
необходимы
для
поддержания
активности
другого
тирозинкиназного сигнального пути, FGFR (fibroblast growth factor), в
трахеальной
системе
дрозофилы,
что
обеспечивается
рециркуляцией
поглощённого рецептора к мембране клетки (Chanut-Delalande et al., 2010).
2.5.5 Сигнальный путь Notch
Нормальное формирование крыла, как и многих других органов и
тканей дрозофилы, зависит от нормальной регуляции сигнального пути
Notch. Канонический сигнальный путь Notch основан на взаимодействии
рецептора Notch на поверхности одной клетки с его лигандом на поверхности
соседней клетки. Лиганды Notch – группа трансмембранных белков
семейства DSL (Delta/Serrate/Lag-2), представленная у дрозофилы двумя
белками, Delta и Serrate, экспрессия которых строго регулируется во времени
и пространстве. Рецептор Notch состоит из внеклеточного домена NECD и
трансмембранного домена NEXT. В отличие от своих лигандов, ген notch
активно экспрессируется в эмбрионах и имагинальных тканях на всём
протяжении онтогенеза (Le Borgne et al., 2005), однако его активность и,
соответственно,
активность
сигнального
пути
в
целом,
зависит
от
особенностей его посттрансляционного модифицирования, а именно,
формирования дисульфидных мостиков в ЭПР, гликозилирования и
протеолитического расщепления (Tien et al., 2009). Первые два вида
модификаций напрямую зависят от наличия небольших EGF-подобных
58
аминокислотных повторов домена NECD, содержащих по 6 остатков
цистеина, образующих по 3 дисульфидных мостика. Эти повторы, в
особенности, таковые 5-9, 11-12 и 25-36, необходимы для создания
нормальной конформации белка Notch и его эффективного взаимодействия с
лигандами, а их мутации, известные как аллели Abruptex, фенотипически
проявляются в виде исчезновения жилок крыльев и щетинок (типичный
фенотип Notch) (Le Borgne et al., 2005; Vaccari et al., 2008; Xu et al., 2005).
Гликозилирование, которому подвергается домен NECD белка Notch
осуществляется в два этапа – присоединение остатка фукозы к сериновому
или треониновому остатку последовательности C2-X4-5-T/S-C3 (где C –
цистеин, X – любая аминокислота, T – треонин, S – серин) EGF-повтора и
последующее присоединение к нему N-гликана. Этот вид модификации
изменяет сродство Notch к его лигандам. Помимо этого имеет место Оглюкозилирование остатков серина в последовательностях C1-X-S-X-P-C2
Notch, однако дефекты этой модификации, такие как нарушение S2расщепления, проявляются только при повышенных температурах (Tien et al.,
2009).
Протеолиз принимает непосредственное участие в осуществлении
передачи сигнала через Notch. При взаимодействии Delta/Serrate и Notch
активируются металлопротеазы Kuzbanian и TACE (TNF Alpha Converting
Enzyme) семейства ADAM, катализирующие отщепление NECD домена
Notch
(S2-расщепление);
одновременно
происходит
протеолитическое
расщепление лиганда с последующим поглощением его внутриклеточного
домена клеткой-донором сигнала, что вызывает ряд последующих реакций
(Le Borgne et al., 2005). В то же время в клетке-акцепторе сигнала происходит
высвобождение за счёт действия комплекса презенилин-зависимых γсекретаз внутриклеточного домена NICD белка Notch (S3-расщепление) с
последующей его ассоциацией с коактиваторами Deltex и Suppressor of
Hairless; образовавшийся комплекс затем поступает в ядро и активирует
транскрипцию генов комплекса Enhancer of Split и других (Рис. 14) (Gilbert,
59
1997; Lai, 2004; reviewed in Stewart, 2002). Также NICD может образовывать
комплекс с негативным регулятором Hairless.
Рисунок 14. Сигнальный путь Notch. NEC – внеклеточный домен
Notch, NTM – трансмембранный домен Notch, NICD – вутреклеточный домен
Notch, Su(H) – Supressor of Hairless (Bland, Rand, 2006).
Кроме
того,
трансмембранными
поскольку
белками,
Notch,
их
Delta
и
Serrate
убиквитинирование,
являются
эндоцитоз
и
внутриклеточный трафик также влияют на сигнальный путь Notch.
Например, мутации Liquid facets (гомолог гена epsin) и генов, кодирующих
убиквитин-лигазы Е3 Neuralized и Mindbomb – белков, приводящих к
поглощению, убиквитинированию и дальнейшей лизосомальной деградации
Delta, – вызывают фенотип, ассоциированный с нарушением передачи
сигнала Notch (Le Borgne et al., 2005). Также молекулы Delta, не способные
60
поглощаться посредством эндоцитоза, снижают сигнальную эффективность
Notch у дрозофилы (Parks et al., 2002). Также ассоциация NICD с такими
белками, как Numb и Suppressor of Deltex способствует сортировке NICD на
лизосомную деградацию (Cupers et al., 1997).
Согласно современной гипотезе, изменение конформации Notch при
его взаимодействии с лигандом, приводящее к открытию сайтов действия
протеаз и S2-расщеплению, осуществляется за счёт эндоцитоза лиганда.
Эндоцитоз же самого Notch необходим для эффективного осуществления S3расщепления и, соответственно, нормальной активации сигнального пути.
Это подтверждается большим содержанием γ-секретаз в эндосомальной
клеточной фракции (Pasternak et al., 2003; Vetrivel et al., 2004) и низким
эффективным pH их действия (Pasternak et al., 2003), характерным для
внутриклеточных компартментов, в которых он поддерживается действием
вакуолярных H+-АТФаз, мутации которых приводят к нарушениям передачи
сигнала Notch (Yan Y. et al., 2009). Также известен ряд мутаций различных
компонентов
везикулярного
трафика,
наличие
которых
приводит
к
аккумуляции рецептора Notch на определённых органеллах и к изменению
активности сигнального пути. Так в экспериментах на имагинальных дисках
мутации белков ESCRT (Tsg101, Vsg25 и других), при которых Notch
аккумулировался на Hrs-содержащих участках ранних эндосом, приводили к
увеличению активности передачи сигнала. Напротив, мутации участников
более ранних этапов эндоцитоза, а именно, динамина, синтаксина Avl
(Avalanche) и Rab5, приводили к накоплению Notch на цитоплазматической
мембране и практически полной блокировке передачи сигнала. Аналогично
активность сигнального пути снижалась при мутациях Hrs, при которых
Notch аккумулировался на Avl-содержащих участках ранних эндосом
(Vaccari et al., 2008). Эксперименты с особями дрозофилы, мутантными по
гену lethal giant discs (lgd) – опухолевому супрессору, участвующему в
негативной регуляции Notch (Klein, Jaekel, 2006), – Hrs или обоим указанным
генам, также показали, что, по крайней мере, в имагинальных крыловых
61
дисках мутация Hrs ослабляет передачу сигнала Notch (Halder et al., 2006;
Knoblich, Gallagher, 2006). Иными словами, Hrs является одним из звеньев
цепи позитивной регуляции сигнального пути Notch.
2.6 Малые ГТФазы
Малые ГТФазы Rab (Ras-like genes in rat brain), принадлежащие к
суперсемейству Ras-подобных ГТФаз, являются важными участниками
везикулярного трафика, необходимыми для регуляции ассоциации с
везикулами различных белков (в том числе, моторных), транспортировки
молекулярных грузов и слияния везикул. Так Rab7 стимулирует слияния
поздних эндосом с лизосомами и транспортировку последних вдоль
микротрубочек в центр клетки в околоядерную область, что, в частности,
обеспечивает процесс автофагии (Bucci et al., 2000; Cantalupo et al., 2001);
Rab4, связываясь с ранними эндосомами, регулирует быструю рециркуляцию
поглощённых рецепторов, таких как трансферриновый рецептор (Daro et al.,
1996); Rab11 участвует в транспортировке везикул от аппарата Гольджи к
цитоплазматической мембране, а также обеспечивает так называемую
медленную рециркуляцию эндосом и возвращение поглощённых рецепторов
на цитоплазматическую мембрану (Rodman, Wandinger-Ness, 2000; Dollar et
al., 2002). Таким образом, белки семейства Rab принимают непосредственное
участие в осуществлении процессов эндосомального и синаптического
везикулярного трафика. Кроме того, было показано, что некоторые белки
семейства Rab принимают участие в регуляции активности сигнальных путей
у дрозофилы и млекопитающих. Например, Rab5 модулирует сигнальный
путь Wnt благодаря своей способности направлять Wnt в ранние эндосомы
(Seto, Bellen, 2006); гиперактивация Rab7 приводит к укорочению времени
действия сигнала Dpp за счёт его преждевременного разрушения (Entchev et
al., 2000), а также нарушает передачу сигнала Hh; у мыши Rab23 является
негативным регулятором Hh в развивающейся нервной трубке (Eggenschwiler
et al., 2001).
62
Наконец, важной функцией Rab-ГТФаз является их участие в
цитокинезе. Так, для C. elegans было показано, что РНК-интерференция
Rab11 приводит к дефектам цитокинеза, таким как регрессия разделительной
борозды и, следовательно, к аномалиям разделения дочерних клеток. В in
vitro экспериментах для млекопитающих также было показано, что
рециркулирующие эндосомы, содержащие Rab11 и FIP3 (партнёр Rab11),
аккумулируются в области разделительной борозды, и Rab11 ГТФаза
необходима для успешного завершения цитокинеза. Rab35 – ещё одна
ГТФаза, задействованная в эндоцитозе и принимающая участие в регуляции
цитокинеза (Militello, Colombo, 2013).
Благодаря
тому,
ассоциируются
с
что
различные
определёнными
Rab
ГТФазы
субклеточными
специфически
мембранными
компартментами, их стало возможно использовать в качестве маркеров
соответствующих органелл. Так, Rab1 стал использоваться как маркер ЭПР,
Rab6 – маркер аппарата Гольджи, Rab3 – синаптических везикул, Rab5 –
ранних
эндосом,
Rab7
и
Rab9
–
поздних
эндосом,
а
Rab11
–
рециркулирующих эндосом (Pfeffer 2001; Pfeffer, Aivazian, 2004; Ali, Seabra,
2005; Pfeffer 2005).
Мутации генов, кодирующих Rab белки, приводят к нарушению роста
и подвижности клетки и обнаруживаются у пациентов с различными
заболеваниями, такими как синдром Гришелли (Sheela et al., 2004),
хороидермия и синдром Германски-Пудлака (reviewed in Di Pietro,
Dell’Angelica, 2005). Кроме того, мутации Rab белков могут оказывать
влияние на развитие некоторых разновидностей рака, например, рак толстого
кишечника нередко сопровождается инактивацией гена rab32 (reviewed in
Zhang et al., 2007).
2.7 Методы эктопической экспрессии генов у дрозофилы
Существует немало методов исследования функций генов. Одним из
таких
методов
является
эктопическая
экспрессия,
которая
может
63
осуществляться различными путями. Наиболее распространённый из них –
экспрессия
исследуемого
гена
под
контролем
тканеспецифического
регуляторного элемента – подразумевает соединение соответствующего
промотора
или
энхансера
с
кДНК
исследуемого
гена
посредством
молекулярного клонирования и создание на основе полученной конструкции
трансгенных линий изучаемого объекта (в том числе, дрозофилы). Основным
минусом указанного метода является невозможность создания стабильных
трансгенных линий в случае, если продукт гена оказывает цитотоксический
эффет.
Тканеспецифичный регуляторный элемент в данном методе может быть
заменён промотором гена теплового шока hsp70, активирующим экспрессию
подконтрольного
гена
под
воздействием
повышеных
температур.
Использование промотора hsp70 позволяет исследователю регулировать
время и степень активации гена, однако не позволяет пространственно
ограничить
экспрессию
изучаемого
гена,
что
зачастую
вызывает
цитотоксический эффект и гибель трансгенной линии (Wilder, 2000).
Другой метод эктопической экспрессии генов был разработан Struhl и
Basler (Struhl, Basler, 1993) и назван flip-out системой. В основе метода лежит
создание трансгенных линий дрозофилы, несущих две генетические встройки.
Одна из них представлена промотором повсеместно экспрессирующегося гена
(например, актина или тубулина) и кодирующей частью исследуемого гена,
пространственно
отделёнными
друг
от
друга
маркерным
геном,
фланкированным сайтами посадки фермента рекомбиназы FLP. Вторая вставка
несёт ген рекомбиназы, находящийся под контролем промотора hsp70. В
присутствии FLP (при тепловом шоке) в части клеток происходит
рекомбинация с удалением маркерного гена. При этом образуются клоны,
эктопически экспрессирующие исследуемый ген, но не маркерный ген,
который однако экспрессируется в соседних с клоном клетках (Рис. 15).
Данный метод эффективен, позволяет контролировать время активации
гена, а также даёт возможность визуализировать клоны на фоне других клеток
64
за счёт экспрессии в последнийх маркерного гена. В то же время, flip-out
система подходит только для анализа митотически активных клеток, а кроме
того, эксперименты на её основе не являются воспроизводимыми, поскольку
клоны образуются случайным образом.
Рисунок 15. Flip-out система эктопической экспрессии генов у
дрозофилы (Struhl, Basler, 1993). В присутствии FLP (при тепловом шоке) в
части клеток, несущих промотор повсеместно экспрессирующегося гена и
кодирующую часть исследуемого гена, пространственно отделённые друг от
друга маркерным геном, фланкированным сайтами посадки рекомбиназы
FLP, происходит удаление маркерного и активация исследуемого гена.
65
В настоящее время одним из популярных методов направленной
тканеспецифичной эктопической экспрессии генов у дрозофилы является так
называемая GAL4/UAS система, разработанная Brand и Perrimon (Brand,
Perrimon, 1992).
GAL4 – транскрипционный фактор класса Zn2/Cys6 (Pan, Coleman, 1990)
Saccharomyces cerevisiae, чья функция состоит в подержании активности
экспрессии генов gal1, gal2, gal7, gal10 и mel1, кодирующих ферменты
утилизации галактозы (Douglas, Hawthorne, 1964; Douglas, Hawthorne, 1966;
Kew, Douglas, 1976). Сайтом посадки GAL4 на ДНК является так называемый
Upstream
Activating
Sequence,
или
UAS,
–
цис-регуляторная
последовательность, аналогичная энхансерам многоклеточных эукариот. В
конце 1980-х годов Fischer et al. было показано, что транскрипционный
фактор GAL4 может экспрессироваться и функционировать в организме
дрозофилы (Fischer et al., 1988).
Эксперименты
на
основе
системы
GAL4/UAS
подразумевают
скрещивание мушек двух линий дрозофил – одной, несущей вставку гена
GAL4 под контролем тканеспецифического энхансера, и другой, несущей
вставку исследуемого гена под контролем энхансерного элемента UAS.
Причём уже у особей поколения F1 происходит активация экспрессии
исследуемого гена в клетках, в которых синтезируется GAL4 (Рис. 16).
Для создания GAL4/UAS системы необходимы три основных вектора:
pGaTB/N, имеющий сайты BamHI или NotI «выше» вставки GAL4,
позволяющие
клонирование
в
заданную
область
любого
тканеспецифического энхансерного элемента; pGawB, вектор «энхансерной
ловушки»; pUAST (Brand, Perrimon, 1992), включающий 5 UAS-элементов,
базальный промотор гена hsp70, полилинкер и терминатор транскрипции
вируса SV40, или pUASp (Rorth, 1998), содержащий промотор и первый
интрон Р-транспозазы, 14 UAS-элементов, сайты GAGA вектора ЕР,
полилинкер и 3'-НТО и терминатор транскрипции гена k10 (Рис. 17). Следует
отметить, что гены, встроенные в вектор pUASp (в отличие от pUAST),
66
эффективно экспрессируются в ответ на сигнал GAL4 не только в
соматических клетках, но и в клетках зародышевой линии (Grossniklaus et al.,
1989).
Существенным
преимуществом
системы
GAL4/UAS
является
возможность создания устойчивых трансгенных линий, поскольку гены,
находящиеся под контролем UAS элемента, не экспрессируются в отсутствие
GAL4. Поэтому в настоящее время уже существуют сотни GAL4- и UASлиний дрозофил, которые могут быть приобретены в соответствующих
организациях, таких как Drosophila Stock Center в Bloomington.
Рисунок 16. GAL4/UAS система эктопической экспрессии генов у
дрозофилы. Скрещивание мушек двух линий дрозофил – несущей вставку
гена GAL4 под контролем тканеспецифического энхансера, и несущей
вставку исследуемого гена под контролем энхансерного элемента UAS. В
организме
особей
поколения
F1
происходит
активация
исследуемого гена в клетках, в которых синтезируется GAL4.
экспрессии
67
Рисунок 17. Структура векторов pUAST и pUASp. pUAST включает 5
UAS-элементов, базальный промотор гена hsp70, полилинкер и терминатор
транскрипции вируса SV40. pUASp включает промотор и первый интрон Ртранспозазы, 14 UAS-элементов, сайты GAGA вектора ЕР, полилинкер и 3'НТО и терминатор транскрипции гена k10.
Также возможно комбинирование метода flip-out и GAL4/UAS
системы. В этом случае FLP рекомбиназа, которая начинает синтезироваться
в ответ на тепловой шок, производит удаление FRT-фланкированного
участка,
расположенного
между
тканеспецифичным
регуляторным
элементом и GAL4, активируя экспрессию последнего. GAL4, в свою
очередь, активирует экспрессию исследуемого гена, находящегося под
контролем
UAS-элемента.
Данная
комбинация
методов
позволяет,
одновременно, контролировать начало (за счёт теплового шока) и область (за
счёт промотора) экспрессии исследуемого гена.
68
Глава 3. Материалы и методы
3.1 Линии дрозофил
В работе использовались следующие линии D. melanogaster.
1. y w (лаб. популяционной генетики ИЦиГ)
2. y1, Df(1)w67c23; ∆2-3, Ki pp (лаб. молекулярной цитогенетики ИМКБ)
3. y w;If/CyO;Sb/Tb (лаб. популяционной генетики ИЦиГ)
4. Линии, содержащие UAS-конструкции:
•
P{UAS-Hrs.L} синоним P{UAST-Hrs}12 (лаб. H. J. Bellen, USA)
(далее в тексте указывается как UAST-hrs)
•
y w; UAS-GFP(S65T) (лаб. C. Lehner, Germany)
•
y w; P{w+ = UAS-ey} (№ 6294, Bloomington) (далее в тексте
указывается как UAST-ey)
•
w*; P{UAS-wg.H.T:HA1}6C (№5919, Bloomington)
5. y[1] v[1]; P{y[+t7.7] v[+t1.8]=TriP.JF02860} attP2 RNAi-Hrs (№28026,
Bloomington) (далее в тексте указывается как UAS-RNAi-Hrs)
6. Линии, содержащие GAL4-драйверы:
•
P{wg-Gal4} (лаб. G. Morata, Spain) (далее в тексте указывается
как wg-GAL4)
•
w1118 P{w+mW.hs = GawB}BxMS1096 (№ 1096, Bloomington) (далее в
тексте указывается как 1096-GAL4)
•
w* P{w+mW.hs = GawB}sdSG29.1 (№ 8609, Bloomington) (далее в
тексте указывается как 8609-GAL4)
•
y1 w1118; P{w+mW.hs=GawB}apmd544/CyO (№ 3041, Bloomington)
(далее в тексте указывается как 3041-GAL4)
•
y w*;CyO/Tft;P{Bam-Gal4} (лаб. геномики ИМКБ) (далее в тексте
указывается как bam-GAL4)
7. Линии, содержащие репортерные конструкции:
•
P{PZ}aprK568 ( лаб. G. Morata, Spain)
69
•
P{lArB}neurA101 (J. Mattila, Finland)
3.2 Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli
Для получения больших количеств плазмидной ДНК использовали
бактериальные клетки штамма XL1Blue MRF’ ( (mcrA)183
(mcrCB-
hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F' proAB lacIqZ
M15 Tn10(TetR)]. Преимущество данного штамма заключается в том, что у
него нарушена функция гена β-галактозидазы, вследствие чего клетки не
способны утилизировать субстрат фермента X-Gal. На этом основан метод
сине-белого скрининга при использовании векторов на основе плазмиды
pBluescript, несущих ген β-галактозидазы.
Все центрифугирования производили на центрифуге Beckman с
ротором JA-10.
Приготовление компетентных клеток проводили следующим образом.
Клетки из стока высеивали штрихом на чашку со средой Agar-triptose,
содержащей тетрациклин. Клетки растили при 37ºC в течение ночи, после
чего
отдельные
колонии
пересевали
для
УФ-скрининга
(обработку
производили в течение 30, 20, 10 и 0 секунд). Колонию, выросшую только на
участке, не подвергавшемся облучением УФ, засеивали в 3 мл LB с
тетрациклином (итоговая концентрация антибиотика 5 мкг/мл) и растили при
37ºC в течение ночи при покачивании на 160 оборотах в минуту.
Ночную культуру бактерий XL1Blue переносили в 0,5л LB с
тетрациклином; культуру растили при 37°С при скорости вращения 160
об/мин, до оптической плотности OD600 0,5-0,6. После этого бактерии
переносили в чистые стаканы для центрифугирования, далее их охлаждали
на льду в течение 30-40 минут и центрифугировали при 3000xg в течение 5
минут при температуре 4°С. Далее проводили последовательные отмывки
осадка автоклавированной дистиллированной водой (первый раз в 300 мл,
второй раз в 150 мл) с промежуточными центрифугированиями при 3000xg в
течение 15 минут при 4°С. После этого, клетки дополнительно промывали
70
10% глицерином на воде и снова центрифугировали при тех же условиях.
Отмытые таким образом бактериальные клетки бережно ресуспендировали в
500 мкл 10% глицерина и переносили в 0,5 мл пробирки аликвотами по 40
мкл. Аликвоты замораживали и хранились при -70°С.
3.3 Выделение геномной ДНК
Выделение геномной ДНК производили одним из двух способов: из
взрослых мух калий-ацетатным методом (Bender et al., 1983) либо из личинок
фенол-хлороформным методом.
3.3.1 Калий-ацетатный метод
Мух гомогенизировали с помощью пестика в 1,5 мл пробирке типа
эппендорф в 200 мкл лизирующего буфера (0,1M NaCl; 0,2М сахарозы, 0,05М
ЭДТА, 0,1М Трис-HCl (pH 9,0), 0,5% SDS). Полученный гомогенат
инкубировали при 65°С в течение 30 минут, после чего соединяли с 300 мкл
водного раствора, содержащего 3М ацетата калия и 2М уксусной кислоты;
полученную смесь перемешивали и инкубировали 30 минут на льду.
Содержимое пробирки снова перемешивали и центрифугировали при
11000xg в течение 10 минут. Супернатант переносили в новую пробирку и
смешивали с равным объёмом (500 мкл) 96 % этанола. Смесь инкубировали
при -200С в течение 10 минут, после чего центрифугировали при 11000xg в
течение
10
минут.
Осадок
промывали
500
мкл
70 %
этанола
(центрифугировали 10 минут при 11000xg), подсушивали и растворяли в50
мкл ТЕ буфера (0,01 М Трис-HCl (рН 8,0), 0,001М ЭДТА (pH 8,0)).
3.3.2 Фенол-хлороформный метод
Фермент диспазу разводили водой, очищенной от нуклеаз (итоговая
концентрации в пробе составляла 100 мг/мл), и инкубировали при 370С в
течение 1 часа.
71
Внутренности личинок (20-30 штук), отделённые от кутикулы,
гомогенизировали в небольшом количестве лизирующего буфера (0,1M
Трис-HCl (pH 9,0), 0,2М сахарозы, 0,1М NaCl, 0,05М ЭДТА (pH 8,0), 0,5%
SDS) с помощью полипропиленового пестика; лизирующим же буфером
объём смеси доводили до 750 мкл. Туда же вводили подготовленную диспазу
с конечной концентрацией 100 мкг/мл. Смесь инкубировали при 560С в
течение ночи.
По окончании инкубирования смесь центрифугировали при 11000xg в
течение 10 минут. Супернатант смешивали с равным объёмом фенолхлороформной
смеси
AppliChem
(ФХС),
полученную
смесь
центрифугировали, как указано выше. Супернатант отбирали в отдельную
пробирку и инкубировали с 1 е.а. РНКазы А в течение 1 часа при 370С. После
этого фермент инактивировали 10 минут при 650С, и смесь повторно
смешивали с ФХС и центрифугировали. Верхнюю (водную) фазу переносили
в чистую пробирку и смешивали с равным объёмом хлороформа; смесь
центрифугировали, как указано выше. Верхнюю фазу переносили в чистую
1,5мл пробирку и смешивали с 2 объемами 96% этанола, смесь инкубировали
1 час при -20ºC, после чего центрифугировали при тех же условиях. Осадок
промывали 70% этанолом, подсушивали и разводили в 30 мкл воды,
очищенной от нуклеаз. Образцы хранили при -20ºC.
3.4 Молекулярное клонирование
Для исследования роли различных доменов Hrs в сперматогенезе
дрозофилы
на
основе
вектора
pUASP-GFP
методом
молекулярного
клонирования получили серию конструкций, содержащих полноразмерную и
усечённые формы гена Hrs. Клонирование проводили в два этапа: сначала
выбранную полноразмерную или усечённую форму гена вводили в вектор
pTZ57R/T (#1214 Fermentas), затем переносили в вектор pUASP-GFP (Рис.
18).
72
Рисунок 18 Схема клонирования и внедрения в геном дрозофилы
различных форм Hrs. Значком «*» обозначены полноразмерная (HrsB) и
усечённые (Hrs1 (1-258), Hrs2 (1-298), Hrs4 (1-472), Hrs8 (290-760) и Hrs9
(383-760) формы Hrs.
73
3.4.1 Полимеразная цепная реакция
Фрагменты ДНК для клонирования амплифицировали в реакции ПЦР с
использованием в качестве матрицы гДНК дрозофил, несущих встройку
безинтронного
гена
Hrs.
В
реакции
использовались
следующие
олигонуклеотидные праймеры (5' à 3'):
hrsB-F: GCAGCATAAAAGAAAACAGAATTCTATGTT
hrsB-R: GGAATAACATCCCTAGGATTAATCAAAGC:
hrs(290-760)-F: CACCCGCTGCGAATTCTATGCAG
hrs(383-760)-F: GCCGCCAAGAATTCTATGCAGGTG
hrs(1-258)-R: TCCTTCCTAGGTTACTCGGTCTTGC
hrs(1-298)-R: GGACTCCTAGGTTATTGCTGCATG
hrs(1-472)-R: CATCTGTCGCCTAGGTTACTGCTCCTC
Все прямые и обратные праймеры несли рестрикционные сайты EcoRI
и BamHI, соответственно. Праймеры подбирали в соответствии с данными
биоинформатического анализа структуры и эволюционных изменений Hrs,
полученными в нашей лаборатории (Omelyanchuk et al., 2009).
ПЦР проводили в 0,2 мл пробирках (Axygen) с использованием
следующих стоковых растворов:
•
10 мМ dNTP (СибЭнзим)
•
10х AS-буфер (предоставлен лабораторией иммуногенетики, ИМКБ)
•
1
е.а./мкл
ДНК
полимераза
Taq
(предоставлена
лабораторией
иммуногенетики, ИМКБ)
Состав реакционной смеси: 50 нг геномной либо плазмидной ДНК, 0,2
мМ dNTP, по 0,1 мкМ каждого праймера, 1х буфер, 1 e.a. Taq полимераза.
Общий объём 10 мкл.
Реакцию проводили на амплификаторе BIS Thermocycler по следующей
программе:
74
95 °С
3 мин.
95 °С
30 сек.
56 оС
30 сек.
72 °С
3 мин.
72 °С
3 мин.
35 циклов
Усечённые формы Hrs имеют следующую структуру:
Hrs1 (1-258) – N-концевая форма, содержащая домены VHS и FYVE;
Hrs2 (1-298) – N-концевая форма, содержащая домены с VHS по UIM,
включительно;
Hrs4 (1-472) – N-концевая форма, содержащая домены с VHS по
(предположительно) Merlin-связывающий домен;
Hrs8 (290-760) – C-концевая форма, содержащая домены, начиная со
STAM-связывающего домена;
Hrs9 (383-760) – C-концевая форма, включающая домены, начиная с
пролин/глутамин-богатого домена.
3.4.2 Очистка продуктов ПЦР
Реакционную смесь, полученную после проведения ПЦР, смешивали с
1/10
части
объёма
буфера
для
нанесения
(50%
сахароза,
0,2%
бромфеноловый синий, 0,2% ксиленцианол) и подвергали электрофорезу в
1% агарозном геле, приготовленном на 1хТАЕ буфере (1x Трис-ацетатный
буфер, pH = 7.6: Трис-ацетат 40mM, ЭДТА 1mM), содержащем 10 мкг/мл
бромистого этидия. Электрофорез проводили при напряженности поля 2,5
в/см в течение часа. Результат электрофореза смотрели под УФ-излучением
на трансиллюминаторе. Фрагмент ДНК, содержащий необходимый ПЦРпродукт, вырезали из геля; ДНК выделяли с использованием набора QIAquick
Gel Extraction Kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией, прилагаемой
производителем.
75
3.4.3 Лигирование ДНК и очистка лигазных смесей
Лигирование в вектор pTZ57R/T проводили с использованием набора
реактивов InsTAclone™ PCR Cloning Kit (Fermentas) в соответствии с
инструкцией, прилагаемой производителем. Лигирование в вектор pUASpGFP проводили с использованием Т4 лигазы (1 е.а.) (Promega) и 10х буфера
для Т4 ДНК лигазы (Promega). В реакцию лигирования брали вставку
(продукт ПЦР или продукт рестрикции) и вектор в соотношении 3:1. Объём
реакционной смеси составлял 25 мкл. Реакцию проводили при температуре
40С в течение 16 часов.
По
окончании
реакции
лигирования
лигазу
инактивировали
посредством нагревания в течение 15 минут при 800С с добавлением 0,5 мкл
0,5М ЭДТА. Далее в смесь вносили 5М NaCl (1/10V) и 96% этанола (3V),
после чего смесь инкубировали в течение 1 часа (или более) при -200С. Далее
проводили центрифугирование (10 минут при 11000xg) и однократную
отмывку 300 мкл 70% этанолом. Осадок подсушивали и растворяли в 25 мкл
воды, очищенной от нуклеаз.
3.4.4 Трансформация компетентных клеток E.coli
В 40 мкл аликвоту подготовленных компетентных клеток E.coli
штамма XL1Blue вносили 2 мкл очищенной лигазной смеси; инкубировали
бактерии с ДНК в течение 5 минут на льду, после чего переносили в
предварительно охлаждённую кювету для электропорации (Eppendorf).
Электропорацию
проводили
при
1700V
(5.0
миллисекунд)
на
электропораторе Multiporator (Eppendorf) или Gene Pulser Xcell Microbial
System (BioRad); после этого трансформированные клетки переносили в 1 мл
среды LB, инкубировали в течение 40 минут при 370С и засевали на 9 см
чашки для культивирования со средой agar-triptose, содержащей 50 мкг/мл
ампициллина (а также 0,2 мг/мл X-Gal и 0,1мМ IPTG при трансформации
лигазными смесями на основе вектора pTZ57R/T). Культивирование
76
проводили в течение ночи при 370C. Одиночные колонии проверяли ПЦРскринингом с использованием праймеров M13/pUC, специфичных для
вектора
pTZ57R/T
(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3'
(Fermentas),
5'-
CAGGAAACAGCTATGAC-3' (Femrentas)), либо праймеров, специфичных
для вектора pUASp-GFP (5'-GGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCT-3’, 5'GGTATAATGTTATCAAGCTCCTCGAGTTAA-3').
ПЦР
проводили
в
соответствии с программой (пункт 3.4.1).
3.4.5 Выделение плазмидной ДНК
Колонию, содержащую неоходимый конструкт, засевали в 3 мл среды
LB с 1/1000 часть объёма ампициллина и наращивали в течение ночи при
370С и покачивании 140 об/мин. Плазмидную ДНК из полученных клеток
ночной культуры выделяли методом щелочного лизиса.
Культуру переносили в 1,5 мл пробирку типа эппендорф и осаждали
при 1500xg. Осадок ресуспендирови в 100 мкл буфера Р1 (Plasmid Maxi Kit,
QIAGEN). Затем смесь соединяли с 200 мкл лизирующего буфера (0,2 M
NaOH, 1% SDS) и осторожно перемешивали. Далее в смесь добавляли 150
мкл 3М NaAc, pH 5,0, смесь перемешивали до выпадения творожистого
осадка и инкубировали на льду в течение 3 минут. Образовавшийся осадок
отделяли от жидкой фазы посредством центрифугирования при 11000xg в
течение 10 минут. Супернатант соединяли с 1 мл 96% этанола, инкубировали
при -200С в течение 10 минут и центрифугировали при 11000xg в течение 10
минут. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 200
мкл ТЕ буфера. К ДНК, разведённой в буфере ТЕ, добавляли 200 мкл 5М
LiCl,
смесь
инкубировали
на
льду
в
течение
10
минут.
Смесь
центрифугировали при 11000xg в течение 10 минут. ДНК переосаждали из
супернатанта с использованием 96% этанола, как указано выше. Процедуру
очистки
LiCl
поводили
дважды.
Полученную
рестрикционному анализу (см. раздел 3.4.6).
пДНК
подвергали
77
Для
получения
трансгенных
линий
дрозофилы
проверенную
плазмидную ДНК выделяли из 100 мл ночной бактериальной культуры с
использованием набора реактивов Plasmid Midi Kit или Plasmid Maxi Kit
(Qiagen) в соответствии с инструкцией, прилагаемой производителем.
3.4.6 Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции и её очистка
Для предварительного анализа полученных плазмид и для переноса
фрагментов Hrs из одного вектора в другой использовали метод рестрикции
ДНК эндонуклеазами EcoRI и BamHI.
Реакцию рестрикции проводили в объёме 10 мкл (для анализа) или 20
мкл
(для
дальнейшего
переноса
фрагмента
в
вектор
pUASp-GFP).
Реакционная смесь содержала раствор ДНК в воде или буфере ТЕ, 1/10
объёма 10х буфера для рестрикции Green Buffer FastDigest (Fermentas) и по 1
мкл рестриктаз EcoRI FastDigest и BamHI FastDigest (Fermentas). Реакцию
проводили в течение 20 минут при 370C.
После окончания реакции смесь инактивировали 10 минут при 650С и
подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, приготовленном на основе
1x ТАЕ буфера (п. 3.4.1). Фрагмент, необходимый для дальнейшего
клонирования, вырезали их геля. Выделение ДНК проводили при помощи
набора QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией,
прилагаемой производителем.
Гидролиз ДНК pUASp эндонуклеазами EcoRI и BamHI проводили
аналогичным образом.
3.4.7 Определение нуклеотидной последовательности полученных
конструкций
Для
реакции
мечения
использоваи
образец
плазмидной
ДНК,
полученный методом щелочного лизиса с двойной очисткой LiCl (п. 3.4.5), в
концентрации 100мкг/мкл.
78
Реакционная смесь объёмом 20 мкл содержала также: 4 мкл 5х буфера,
1,5 мкл BigDye 3.1 и 0,15 мкМ праймера. Реакцию проводили с помощью
амплификатора БИС по следующей программе:
96 °С
2 мин.
96 °С
20 сек.
55 оС
30 сек.
60 °С
4 мин.
95 °С
3 мин.
40 циклов
После окончания реакции смесь разводили водой в соотношении 1:1 и
переносили в 0,5 мл пробирки, после чего туда же вносили 70 мкл смеси,
состоящей из 96% этанола и 7,5 М ацетата аммония. Затем к реакционной
смеси добавляли равный объём бидистиллированной воды, перемешивали и
кратковременно
центрифугировали.
Образец
переносили
в
пробирки
объемом 1,5 мл, добавляли 0,6 части объёма 100% изопропанола,
перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 20 минут.
Центрифугировали в течение 20 минут при 16000xg, удаляли супернатант,
осадок промывали 70% этанолом. Подсушивали осадок при комнатной
температуре.
Секвенирование проводили в центре секвенирования ДНК Института
Молекулярной
и
Клеточной
Биологии
СО
РАН
с
помощью
четырёхканального анализатора ABI3100 производства фирмы Applied
Biosystems.
3.5 Работа с РНК
3.5.1 Выделение тотальной РНК из органов дрозофилы
Тотальную РНК экстрагировали из органов и тканей дрозофилы
(семенники имаго, крыловые имагинальные диски, ганглии личинок) с
использованием реагента Trizol®Reagent (Invitrogen).
79
Органы
собирали
в
100
мкл
Trizol
и
гомогенизировали
с
использованием стерильных полипропиленовых пестиков. В пробирку с
гомогенатом дополнительно вносили 350 мкл Trizol (конечный объём 450
мкл), смесь инкуировали 5 минут при комнатной температуре (далее КТ)
после чего центрифугировали 15 минут при 11000xg при температуре 4°С.
Верхнюю (водную фазу) переносили в чистую 1,5 мл пробирку и смешивали
со 100 мкл хлороформа, после чего инкубировали 5 минут при КТ и снова
центрифугировали при тех же условиях. Верхнюю фазу переносили в чистую
пробирку и смешивали с равным объёмом (около 200 мкл) изопропанола,
после чего инкубировали на льду 10 минут и центрифугировали при тех же
условиях. Осадок промывали 75% этанолом (центрифугировали в течение 5
минут при 11000xg), подсушивали при КТ и разводили в 21,5 мкл
безнуклеазной воды.
Далее провоизводили очистку образца РНК от примесей геномной
ДНК. Для этого в раствор РНК вносили 2,5 мкл 10x буфера для ДНКазы
(Promega) и 1 мкл (1 е.а.) ДНКазы (Promega). Реакцию проводили при 37°С в
течение 90 минут. После окончания реакции ДНКазу инактивировали при
72°С в течение 10 минут. После этого производили повторную очистку РНК
Trizol/хлороформом (как описывалось выше). Итоговый осадок разводили в
25 мкл воды, очищенной от нуклеаз, 1 мкл использовали для определения
концентрации РНК с помощью прибора NanoDrop, 1,5 мкл – для определения
качества РНК с помощью электрофореза в 1,1% агарозном геле на 1хТАЕ
буфере.
3.5.2 Реакция обратной транскрипции
Синтез первой цепи кДНК с РНК производили с использованием
набора реактивов «Реверта-L» или «SuperScript II ® First Single Strand
synthesis system» (Invitrogen) в соответствии с инструкцией, предоставленной
производителем. В случае SuperScript II в качестве праймера использовали
Oligo-dT18
(дезокситимидиловая
кислота,
представляющая
собой
80
последовательность 18 дезокситимидинов, специфичную для поли(А)-хвоста
мРНК). В пробу вносили 1,5 мкг тотальной РНК, выделенной по методике,
описанной в п. 3.5.1; в отрицательный контроль вместо РНК вносили
соответствующий объём воды, очищенной от нуклеаз. Реакцию синтеза цепи
кДНК проводили в течение 45 минут. После окончания реакции ревертазу
инактивировали 15 минут при 65°С, смесь охлаждали на льду и
обрабатывали РНКазой Н в течение 30 минут при 37°С.
3.5.3 ОТ-ПЦР
Для определения наличия различных изоформ транскриптов гена Hrs в
органах
и
тканях
дрозофилы
мы
применили
методику
обратной
транскрипции – ПЦР (ОТ-ПЦР) с использованием следующих праймеров (5'
à 3'):
#1 (прямой): TCCTCCTGCTATTCCCTCCT
#2 (обратный): CGGTTGGTGAAGGTGAACTC
#3 (прямой): ATGAGCTCGGAGGAGGAACT
#4 (прямой): CATCTGGCAGCACTGTAAGG
#5 (обратный): GGAGGGAATAGCAGGAGGAG
Для идентификации Hrs-RA использовали комбинацию праймеров 2 и
3, для Hrs-RB – праймеры 1 и 2, для Hrs-RC – праймеры 4 и 5.
ПЦР проводили по следующей программе:
95 °С
2 мин.
95 °С
30 сек.
63 оС
30 сек.
72 °С
2 мин.
72 °С
3 мин.
35 циклов
Продукты ПЦР анализировали посредством электрофореза в 1,5%
агарозном геле, приготовленном на основе 1хТАЕ буфера. В качестве
маркера ДНК использовали 100 bp маркер (СибЭнзим).
81
3.6 Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы
Трансформацию проводили по схеме, предложенной А. Спрадлингом и
Дж. Рубинным (Rubin, Spradling, 1983), с некоторыми изменениями.
Использовали эмбрионы линии y1, Df(1)w67c23; ∆2-3, Ki pp на стадиях 1-4 (040 минут после откладывания яиц). Дехорионизацию проводили с
использованием раствора «Белизны» в течение 3-7 минут; после этого
эмбрионы тщательно промывали водой, выкладывали в ряд на подушечке из
агара (1,5 мг/мл) и переносили на двустороннюю
липкую
ленту,
приклеенную к покровному стеклу. Водный раствор ДНК (конструкции
pUASp-GFP-Hrs (п.3.4)) с концентрацией 1-2 мкг/мкл смешивали с каплей
галокарбонового
масла.
В
полученной
эмульсии
образовывались
микрокапли, содержащие ДНК. Полученную каплю подцепляли концом
ультратонкой стеклянной иглы и прокалывали эмбрионы, предварительно
подсушенные при комнатной температуре в течение 10 минут, с заднего
конца (в области клеток зародышевого пути), причём капля входила внутрь
эмбриона самопроизвольно под воздействием разницы давления (Рис. 19).
После инъекции эмбрионы помещали во влажную камеру (чашка
Петри, покрытая 1% агарозным гелем на воде) и выдерживали при
комнатной температуре до формирования личинок первого возраста, которых
далее собирали и переносили в корм для мух. Имаго вводили в
индивидуальные скрещивания с особями линии yw; потомство первого
поколения анализировали на наличие мозаичности в глазах (Шилова,
Омельянчук, 2007).
82
Рисунок 19. Трансформация клеток зародышевого пути дрозофила.
Стеклянной
иглой
подхватывают
каплю
галокарбонового
масла,
содержащего векторную плазмидную ДНК (А), подводят к аборальному
концу эмбриона (Б), прокалывают (В); капля масла, содержащая ДНК, входит
в эмбрион за счёт разницы давления (Г) (Шилова, Омельянчук, 2007).
3.7 Приготовление цитологических и гистологических препаратов
3.7.1 Покрытие стёкол полилизином
Предметные стёкла промывали и выдерживали в 1% растворе HCl на
70% этаноле, после чего повторно промывали водой и высушивали на
воздухе. Далее стёкла покрывали коммерческим раствором полилизина
(Sigma) и высушивали на воздухе.
3.7.2 Приготовление препаратов имагинальных дисков личинок 3 возраста и
семенников имаго
В растворе Хенкса из личинок 3 возраста извлекали имагинальные
диски, из самцов – семенники, которые фиксировали в течение 10 минут в
3,7% растворе формальдегида на 1x PBS (1.47 мМ KH2PO4, 4.29 мМ Na2HPO4,
137 мМ NaCl, 2.68 мМ KCl, pH 7,2). Фиксатор удаляли и препараты
промывали 1x PBS 3 раза по 5 минут. Далее органы обрабатывали в течение 5
минут 1х раствором DAPI и снова промывали 2 раза по 5 минут 1х PBS.
После этого фиксированные органы переносили на предметное стекло в
каплю среды для заливки препаратов (25% глицерин, 10% Mowiol (Sigma-
83
Aldrich), 5% DABCO (Sigma-Aldrich) в 0,2 М Tris-HCl pH 8,5) и накрывали
покровным стеклом. Семенники перед заключением в Mowiol раздавливали.
3.7.3 Приготовление препаратов крыльев куколок
Кокон куколок (18-25 часов) вскрывали с головного конца, головы
удаляли и куколки фиксировали в течение ночи в 3,7% формальдегиде на
1хPBS при 4°С в течение ночи. После окончания фиксации оболочку куколок
удаляли и куколки промывали в 1xPBS. Крылья отделяли от тела куколки,
удаляли покрывающую их кутикулу, переносили на предметное стекло в
каплю среды для заливки препаратов (п. 3.7.2) и накрывали покровным
стеклом.
3.7.4 Окрашивание крыловых имагинальных дисков и крыльев куколок
антителами
Кокон куколок (18-25 часов) вскрывали с головного конца, головы
удаляли и куколки фиксировали в течение ночи в 3,7% формальдегиде на
1хPBS при 4°С в течение ночи. После окончания фиксации оболочку куколок
удаляли и куколки промывали в 1xPBS. Крылья отделяли от туловища,
оболочку удаляли. Имагинальные крыловые диски личинок 3 возраста
фиксировали в 3,7% растворе формальдегида в 1x PBS при КТ в течение 20
минут. Образцы отмывали 1x PBS 3 раза по 10 минут, обрабатывали PBST
(1% Triton-X100 в 1xPBS) в течение 1 часа, инкубировали в блокирующем
буфере (1% обезжиренное сухое молоко в 1х PBST) при комнатной
температуре в течение 6 часов и окрашивали первичными антителами (Ratanti-Elav, 7E8A10, Hybridoma Bank (1:200); Mouse-anti-Wingless, 4D4,
Hybridoma Bank (1:250); Mouse-anti-Patched, Apa1, Hybridoma Bank (1:250);
Mouse-anti-Cut, 2B10, Hybridoma Bank (1:250)) при 4°С в течение 16 часов.
Препараты отмывали 3 раза по 10 минут в 1хPBS, окрашивали вторичными
антителами (Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488
conjugate, Life technologies, #A11001 (1:500); Goat anti-Rat IgG (H+L)
84
Secondary Antibody, Rhodamine conjugate, Thermo scientific, #31680 (1:200))
при 37°С в течение 1 часа и повторно отмывали 2 раза по 10 мин в 1хPBS.
Образцы заключали в Mowiol (п. 3.7.2).
Полученные
препараты
анализировали
с
использованием
флуоресцентного оптического микроскопа Axiovert-200 или Axioskope-2
(Сarl Zeiss).
3.7.5 Детектироване активности репортёра ß-галактозидазы в крыловых
имагинальных дисках
Имагинальные диски извлекали в растворе Хэнкса, фиксировали в
течение 20 минут в 0.75% глутаральдегиде, приготовленном
на 0,1M
какодилате натрия, после чего промывали 3 раза по 5 минут 1хPBS. Далее
диски помещали в раствор для окрашивания (10мМ NaH2PO4•2H2O/
Na2HPO4•2H2O, pH 7.2; 150мМ NaCl; 1mM MgCl2•6H2O; 0,3% Triton X-100;
3,1мМ
K[FeII(CN)6]; 3,1мМ
K3[FeIII(CN)6]; 0,2%
X-gal). Инкубация
проводилась в течение ночи.
3.7.6 in situ гибридизация мРНК
Участки генов Hrs и Cut амплифицировали с использованием
праймеров (5’ à 3’):
AGCATAAAAGAAAACAGAATTCTATGTT (Hrs-F-EcoRI)
GGAATAACATCCCTAGGATTAATCAAAGC (Hrs-R-BamHI)
CAATAAGAAGCTGGGTACCGCAG (Cut-F-KpnI)
CCAATAGTCGTTGTCTAGATGCTCC (Cut-R-XbaI)
и лигировали в векторную плазмиду pGem-T-easy (Promega). РНК-зонды,
меченные
дигоксигенином
(ДИГ),
синтезировали
с
использованием
полученных плазмид pGem-T-easy-Hrs и pGem-T-easy-Cut, подвергнутых
рестрикции эндонуклеазами SacI (сайт находится в векторной плазмиде)
(Hrs-antisense), BamHI (Hrs-sense), KpnI (Cut-antisense) или XbaI (Cut-sense), и
набора реактивов DIG RNA labeling kit (Sp6/T7) (Roche #11175025910) в
85
соответствии с инструкцией, предоставленной производителем. In situ
гибридизацию мРНК проводили в соответствии с протоколами, описанными
в протоколах (Nagaso et al., 2001) и (Sturtevant, Bier).
Личинок 3 возраста линии yw и линий, полученных в результате
скрещиваний 1096-GAL4 x yw и 1096-GAL4 x UAST-Hrs, диссектировали в 1х
PBS и фиксировали в ФБ (фиксирующий буфер: 4% формальдегид, 100мМ
Hepes, 2мМ MgSO4, 1мМ ЭГТА) при 4°С в течение 24 часов. Семенники
извлекали из имаго линии yw посредством диссекции в PBS и фиксировали в
ФБ при комнатной температуре в течение 30 минут.
Фиксированных личинок 5 раз споласкивали метанолом, отмывали 8
раз по 5 минут 100% этанолом и обрабатывали смесью ксилена с этанолом
(1:1) (в течение 1 часа при комнатной температуре), после чего снова 2 раза
споласкивали метанолом. Затем личинок повторно фиксировали в 5%
растворе формальдегида на смеси метанола и PBT (1:1) в течение 5 минут, и
споласкивали PBT. После этого, отделяли подготовленные имагинальные
диски от остатков кутикулы и фиксировали в третий раз в 5% растворе
формальдегида на PBT в течение 30 минут. Диски отмывали PBT 5 раз по 5
минут и обрабатывали раствором протеиназы К (20 мкг/мл) в течение 7-10
минут (в зависимости от количества дисков). Фермент инактивировали
обработкой образцов раствором глицина на PBT (2мг/мл) с дальнейшими
отмывками PBT (5 раз). Образцы постфиксировали в 5% растворе
формальдегида на PBT при 4°С в течение 12 часов и снова отмывали PBT (5
раз).
Семенники дважды отмывали 100% этанолом, обрабатывали смесью
ксилена с этанолом (1:1) (в течение 1 часа при комнатной температуре),
ополаскивали 100% этанолом (4 раза) и регидратировали в градиенте
разведений метанола (80%, 50%, 25%) и воде. Затем образцы обрабатывали
ацетоном (80%) в течение 10 минут при температуре -20°С, промывали ч 1x
PBS с 0,1% Tween-20 (PBT), повторно фиксировали в ФБ в течение 30 минут
и снова промывали PBT.
86
Подготовленные имагинальные диски и семенники подвергали
предгибридизации в ГБ (гибридизационный буфер: 50% формамид, 5x
цитратный буфер, 0.1% Tween-20, тРНК, гепарин, ДНК пуповинной крови
человека) в течение 2 часов при +65°C и последующую гибридизацию с
комплиментарным и некомплиментарным зондами на Hrs и Cut (2нг/мкл) в
течение 20 часов при температуре +65°C. Образцы промывали ГБ шесть раз
по 30 минут при температуре +65°С. Формамид удаляли из образцов
посредством промывания смесями ГБ с PBT (4:1, 3:2, 2:3, 1:4) и PBT. Далее
образцы блокировали в 2% растворе БСА в PBT в течение 40 минут при
комнатной температуре, окрашивали антителами против дигоксигенина,
коньюгированными с щелочной фосфатазой (Roche #11093274980) (антитела
предварительно
адсорбировали
на
фиксированных
яичниках
самок
дрозофилы), в течение 16 часов при температуре +4°С и отмывали PBT и ЩБ
(щелочной буфер: 100мМ Tris-HCl pH9.0, 100мМ NaCl, 50мМ MgCl2, 0.1%
Tween-20). Сигнал мРНК визуализировали посредством обработки образцов
раствором хлорида нитро синего тетразолия (4,5мкл) и 5-бромо-4-хлоро-3индолил фосфата (3,5мкл) в ЩБ в течение 20-30 минут при комнатной
температуре.
87
Глава 4. Результаты
4.1 Участие белка Hrs в сперматогенезе дрозофилы
Как указывалось в главе 2.3, Berruti et al. показали, что у
млекопитающих (а именно, у мыши) белок Hrs (Hgs) в сперматогенезе
локализуется
на
гранулах,
соответствующих
ранним
эндосомам
в
сперматоцитах, и на формирующихся акросомах сперматид (Berruti et al.,
2010). Кроме того, в экспериментах Юдиной и Галимовой было обнаружено,
что опухолевый супрессор Merlin влияет на сперматогенез дрозофилы
(Юдина, Галимова, 2008). Известно, что у млекопитающих Merlin является
белковым партнёром Hrs (Scoles et al., 2000), поэтому, предполагая
потенциальную способность Merlin и Hrs взаимодействовать также и у
дрозофилы,
мы
решили
исследовать
способность
Hrs
влиять
на
сперматогенез, в частности, на акросомогенез.
4.1.1. Внутриклеточная локализация белка Hrs в сперматогенезе дрозофилы
Для визуализации локализации полноразмерной и усечённых форм
белка Hrs в семенниках дрозофилы, осуществляли эктопическую экспрессию
полученных нами UASp-GFP-конструкций, кодирующих полноразмерную и
различные усечённые формы белка Hrs, маркированные GFP, под контролем
драйвера bam-GAL4, специфического для генеративных тканей самцов (Chen,
McKearin,
2003).
Результаты
нашего
эксперимента
показали,
что
полноразмерная форма Hrs (HrsB) и N-концевая форма Hrs4 локализуются в
цитоплазме и на фузомах – цитоплазматических мостиках, соединяющих
сперматоциты и поддерживающих обменные процессы в синцитии.
Аналогичную локализацию мы показали также для усечённых C-концевых
форм GFP-Hrs8 и GFP-Hrs9 (Рис. 20). Следует также отметить, что указанные
формы
Hrs
не
визуализировались
сперматогенеза (после стадии «листа»).
в
клетках
на
поздних
этапах
88
Рисунок 20. Локализация полноразмерной и усечённых форм белка Hrs,
маркированных
GFP,
в
сперматогенезе
дрозофилы.
Локализация
полноразмерной формы HrsB в сперматоцитах (А, Б) и сперматидах на
стадии «луковицы» (В, Г) и на стадии «листа» (Д, Е). Локализация Hrs4 (Ж,
З), Hrs8 (И, К) и Hrs9 (Л, М) в сперматоцитах. Белыми стрелками показана
локализация указанных форм на фузомах, оранжевыми стрелками – на
эндосомах. Масштаб – 10 микрон.
89
Внутриклеточное распределение N-концевых форм Hrs1 и Hrs2
отличается: ни одна из указанных усечённых форм Hrs не ассоциируется с
цитоплазматическими мостиками, в то время, как обе они обнаруживались в
ядре, но не в ядрышковом организаторе, сперматоцитов (Рис. 21 (А,В)). Та же
картина наблюдалась для Hrs1 на стадии «луковицы» (Рис. 21 (Б)).
Локализация химерных белков Hrs1 и Hrs2 в ядре оказалась отличной от
таковой полноразмерной и С-концевой форм белка, поэтому для исключения
возможности неспецифичной локализации белков в ядре за счёт GFP мы
провели контрольное сравнение локализации Hrs1 и Hrs2 и GFP (Рис. 22
(А,Б)) и GFP.nls (несущим сигнал ядерной локализации) (Рис. 22 (В,Г)).
Оказалось, что ядерная локализация Hrs1 и Hrs2 идентична локализации GFP.
Поскольку формы Hrs большего размера, не показали ядерной локализации,
мы предполагаем, что таковая для форм Hrs1 и Hrs2 обусловлена их малыми
размерами и, как следствие, лёгкостью их прохождения через ядерную
оболочку вслед за GFP-маркером. В то же время, поскольку GFP не
обнаруживается на фузомах, мы считаем локализацию форм HrsB, Hrs4, Hrs8
и Hrs9 на указанных органах специфичной.
90
Рисунок 21. Локализация Hrs1 и Hrs2, маркированных GFP. Обе формы
локазлизуются в ядре (указано белыми стрелками), но не в ядрышковом
организаторе (указано чёрными стрелками) сперматоцитов (А, В) и
сперматид на стадии «луковицы» (Б – для Hrs1). Масштаб – 10 микрон.
91
Рисунок 22. Локализация в сперматогенезе дрозофилы GFP (А, Б) и
GFP.nls (В, Г). Обе формы белка локализуются в ядре (отмечено белыми
стрелками), но не в ядрышковом организаторе (отмечено чёрными
стрелками) сперматоцитов (А, В) и сперматид на стадии «луковицы» (Б, Г).
Масштаб – 10 микрон.
92
Ни для одного из GFP-Hrs белков не была показана акросомная
локализация, в то время как некоторые из них показали способность
связываться
с
фузомой
сперматоцитов.
Таким
образом,
фузомы
сперматоцитов являются единственной обнаруженной клеточной мишенью
для Hrs в сперматогенезе дрозофилы, причём HrsB, Hrs4, Hrs8 и Hrs9
связываются с указанной органеллой, а Hrs1 и Hrs2 нет. Данное наблюдение
позволяет
локализовать
сайт
ассоциации
Hrs
с
фузомой
между
аминокислотными остатками 383 и 472 (Рис. 23).
Рисунок 23. Локализация сайта связывания белка Hrs с фузомами
сперматоцитов и ранних сперматид в сперматогенезе дрозофилы. STAM, NF2
и Growth suppression домены являются частями доменов Pro/Glu и coiled-coil.
93
4.1.2. Мутация и РНК-интерференция гена Hrs не вызывают нарушений
цитокинеза в премейотических митозах и мейозах.
Известно, что некоторые белки комплексов ESCRT принимают участие
в цитокинезе (Carlton, Martin-Serrano, 2007; Morita et al., 2007). Поскольку Hrs
является членом комплекса ESCRT-0, мы решили исследовать его роль в
цитокинезе.
Мухи,
гомозиготные
по
мутантной
аллели
HrsD28
не
жизнеспособны и умирают на поздней личиночной стадии, поэтому для
исследования нами были взяты семенники личинок. Цитологический анализ
не показал наличия в указанных органах полиплоидных сперматоцитов,
являющихся показателем нарушений цитокинеза премейотических митозов.
Цитологический анализ мейоза-1 и мейоза-2 в семенниках имаго линии bamGAL4/UAS-RNAi-Hrs также не выявил полиплоидных мейотических метафаз
(в анализ взято 30 образцов). В эксперименте было выявлено несколько
случаев появления клеток, похожих на клетки с двойным веретеном, однако
сравнение их количества в семенниках самцов опытной линии bamGAL4/UAS-RNAi-Hrs и контрольной линии bam-GAL4/+ не показало
статистической
значимой
разницы.
Это
означает,
что
появление
мейотических клеток, похожих на клетки с двойным веретеном, не является
результатом возникновения дефектов цитокинеза премейотических митозов
под влиянием нокдауна гена Hrs, но, по-видимому, является следствием
пространственного наложения двух клеток друг на друга, неизбежно
случающегося при изготовлении препаратов. Наконец, мы индуцировали
появление мозаичных клонов, гомозиготных по мутантному аллелю HrsD28, в
семенниках самцов линии hs-FLP; HrsD28 FRT/Ubi-GFP посредством
теплового шока в течение 1 часа при температуре +37°С. Анализ 30
мозаичных клонов (Рис. 24) не выявил полиплоидных сперматоцитов и
полиплоидных сперматид на стадии «луковицы».
Таким образом, согласно результатам трёх независимых экспериментов
ни мутация, ни РНК-интерференция гена Hrs не нарушают цитокинеза
премейотических митозов и мейозов.
94
Кроме того, следует отметить, что самцы bam-GAL4>UAS-RNAi-Hrs
были фертильны, а визуальная оценка зрелых спермиев не выявила
нарушений их подвижности.
Рисунок 24. Анализ мозаичных клонов (линия hs-FLP;HrsD28 FRT/UbiGFP). Окраска DAPI (А); сигнал GFP (локализация сигнала показана белой
стрелкой) (Б); наложение изображений (В). Зеленой стрелкой отмечены
клетки hs-FLP; HrsD28 FRT, белой – клетки hs-FLP; Ubi-GFP. Масштаб – 10
микрон.
4.1.3. Спектр экспрессии изоформ транскриптов гена Hrs в семенниках,
крыловых имагинальных дисках и ганглиях
В соответствии с информацией, представленной в базе данных Flybase,
существуют 3 изоформы Hrs: Hrs-RA, Hrs-RB и Hrs-RC (Рис. 25). Мы
использовали ОТ-ПЦР анализ для изучения различий в спектрах экспрессии
изоформ
Hrs
в
некоторых
тканях
(семенники,
ганглии,
крыловые
имагинальные диски) дрозофилы. Как и ожидалось, изоформа Hrs-RB была
обнаружена во всех исследованных тканях (в данной работе Hrs-RB
соответствует полноразмерной форме Hrs), в то время, как изоформы Hrs-RА
и Hrs-RС оказались специфичными для семенников. РНК Hrs-RC отличается
от РНК Hrs-RB только 5’-НТО; таким образом, трансляция Hrs может
специфически регулироваться в ходе сперматогенеза. RA изоформе Hrs
95
практически полнотью соответствует полученная в данной работе усечённая
форма Hrs8, в которой также отсутствуют домены, необходимые для
заякоревания белка Hrs на эндосомах, но наличествует домен, необходимый
для локализации Hrs на фузомах (п. 4.1.1). Это может счидетельствовать об
особой роли белковой формы Hrs-A в формировании и/или поддержании
функции фузом в ходе сперматогенеза у дрозофилы.
Результаты in situ гибридизации мРНК гена Hrs в целых семенниках,
представленные на Рис. 26, показывают, что экспрессия гена Hrs имеет место
в раннем сперматогенезе, что хорошо коррелирует с нашими данными о том,
что белок Hrs играет роль именно на стадии сперматоцитов.
Рисунок 25. Спектр изоформ транскриптов гена Hrs в семенниках,
крыловых имагинальных дисках и ганглиях дрозофилы. (А) Экзонная
структура изоформ Hrs; вертикальными штрихами показаны сайты посадки
праймеров, использованных в ОТ-ПЦР анализе. (Б) Результаты ОТ-ПЦР:
изоформы Hrs-RA, Hrs-RB и Hrs-RC обнаружены в семенниках; в крыловых
имагинальных дисках и ганглиях обнаружена только изоформа Hrs-RB.
96
Рисунок 26. In situ гиридизация мРНК Hrs в семенниках дрозофилы с
использованием некомплиментарного (отрицательный контроль) (А) и
комплиментерного (Б) зондов, меченных дигоксигенином. Стрелкой показана
область локализации зонда.
4.1.4. Внутриклеточная локализация маркеров эндосом Rab4, Rab7 и Rab11 в
сперматогенезе дрозофилы
Помимо белка Hrs мы исследовали способность белков Rab4, Rab7 и
Rab11
(маркеров
ранних,
поздних
и
рециркулирующих
эндосом,
соответственно) связываться с акросомой. Эктопичекая экспрессия UASpконструкций, содержащих Rab4, Rab7 и Rab11, маркированных YFP, под
контролем драйвера bam-GAL4 показало, что указанные белки локализуются
в гранулах, концентрирующихся в области формирования будущей акросомы
в сперматидах на стадии «луковицы» и на стадии «листа» (Рис. 27 (Ж-М)).
Данное
наблюдение
подтверждает
гипотезу
эндосомальной
природы
акросомы. Кроме того, изучение распределения белков Rab4, Rab7 и Rab11
на других стадиях сперматогенеза показало, что подобно Hrs, Rab4 и Rab7
локализуются на фузомах в мейотической телофазе (Рис. 27, (А-Г, Ж-К)).
97
Рисунок 27. Локализация маркеров эндосом Rab4, Rab7 и Rab11 в
сперматогенезе дрозофилы. В сперматоцитах Rab4 (А, Б) и Rab7 (В, Г)
обнаруживаются на фузомах (показано белыми стрелками), в то время как
Rab11 располагается на эндосомах в цитоплазме (Д, Е). На более поздних
стадиях локализация Rab4, Rab7 и Rab11 изменяется: в сперматидах все три
белка локализуются на эндосомах, формирующих акробласт (Ж-М; показано
жёлтыми стрелками); в спермиях белки концентрируются на акросоме (Н-Т;
показано голубыми стрелками). Масштаб – 10 микрон.
4.2 Влияние Hrs на развитие крыла дрозофилы
Для выявления роли Hrs в развитии крыла дрозофилы мы провели ряд
экспериментов по изучению влияния эктопической экспрессии и РНКинтерференции Hrs на формирование указанного органа и эктопической
экспрессии Hrs – на образование эктопического глаза на крыле дрозофилы.
98
4.2.1 Влияние гена Hrs на поддержание D/V границы крылового
имагинального диска
Эктопическая экспрессия гена Hrs под контролем драйверов 1096-GAL4
и 8609-GAL4 вызывает существенное искажение крыловой пластинки,
сопровождающееся уменьшением её размеров, локальным исчезновением
жилочного материала (преимущественно, в дистальной части крыла),
увеличением
ширины
проксимальной
части
отдельных
жилок
и
возникновением локальных очагов апоптоза (Рис. 28).
Рисунок 28. Фенотипические проявления эктопической экспрессии гена
Hrs в крыле дрозофилы под контролем драйверов 1096-GAL4 (В) и 8609GAL4 (Г) в сравнении с контролем (UAST-Hrs без драйверов) (Д). (А, Б) –
паттерны экспрессии 1096-GAL4 и 8609-GAL4 в крыловом диске,
соответственно. В обоих случаях эктопическая экспрессия Hrs вызывает
изменение формы крыла и формирование эктопического жилочного
материала.
99
Кроме того, эктопическая экспрессия Hrs в крыле приводит к
исчезновению крайних рядов сенсорных щетинок переднего края крыла (Рис.
29), что является следствием нарушения формирования или поддержания
D/V границы крылового имагинального диска. На уровне диска этот эффект
проявляется нарушением экспрессии гена Neuralized, маркирующего область
формирования маргинальных щетинок, что следует из эксперимента с
использованием репортера neur-LacZ (Рис. 30).
Рисунок 29. Влияние эктопической экспрессии гена Hrs под контролем
драйвера 1096-GAL4 на формирование сенсорных щетинок переднего края
крыла дрозофилы. По сравнению с контролем (А) у особей 1096GAL4>UAST-Hrs наблюдается частичное исчезновение сенсорных щетинок
triple-row (Б).
100
Рисунок 30. Влияние эктопической экспрессии гена Hrs под контролем
драйвера 1096-GAL4 на экспрессию гена Neuralized в области D/V границы
крылового имагинального диска дрозофилы. Кружком отмечен нормальный
паттерн экспрессии гена Neur в районе подушки крыла (А). В дисках особей
1096-GAL4>UAST-Hrs>neur-LacZ
наблюдается
исчезновение
паттерна
экспрессии гена Neur в области подушки крыла (Б).
Как известно, Neur является геном–мишенью сигнального пути Wg, и,
следовательно, снижение уровня экспрессии Neur является свидетельством
снижения активности указанного сигнального пути. Таким образом,
очевидно,
что
эктопическая
экспрессия
Hrs
оказывает
негативное
воздействие на активность сигнального пути Wg. Данный феномен был
показан также в работах других авторов (Seto, Bellen, 2006), однако в
настоящее время механизм действия Hrs на сигнальный путь Wg не изучен.
В своей работе Buceta et al. (Buceta et al., 2007) отвели важную роль в
формировании D/V границы имагинального крылового диска гену Cut,
101
поддерживающему транскрипционную активность гена Wg и, одновременно,
снижающему активность сигнального пути Wg за счёт транскрипционной
регуляции гена Armadillo на D/V границе (Buceta et al., 2007).
Для уточнения влияния Hrs на формирование паттерна экспрессии Cut
мы провели иммуноокрашивание антителами к белку Cut и in situ
гибридизацию мРНК Cut имагинальных крыловых дисков личинок 3
возраста, у которых производилась эктопической экспрессией гена Hrs под
контролем драйвера 1096-GAL4. На рисунке 31 видно, что в условиях
эктопической экспрессии гена Hrs паттерн экспрессии Cut изменяется: в
области экспрессии драйвера 1096-GAL4 мРНК и белок Cut не образуют
характерного паттерна, но распределены диффузно по всей почке крыла.
Изменение паттерна экспрессии Cut проявляется также аналогичным
искажением паттерна экспрессии гена Wg (Рис. 32).
Поскольку Cut – ген-мишень сигнального пути Notch, можно
предположить, что искажение паттерна его экспрессии является следствием
изменения паттерна активности сигнального пути Notch. Из рисунка 33
видно, что эктопическая экспрессия Hrs в крыловом диске приводит к
искажению паттерна экспрессии Ap, активность которого, как известно,
необходима для поддержания экспрессии Notch. В то же время, негативное
влияние на активность экспрессии Ap оказывает сигнальный путь Wg,
который,
таким
образом,
ограничивает
компартментом крылового диска.
паттерн
Ap
дорзальным
102
Рисунок 31. Изменение паттерна экспрессии гена Cut на D/V границе
крылового имагинального диска дрозофилы при эктопической экспрессии
Hrs в почке крыла. (А-В) Иммунокрашивание крыловых дисков антителами к
белку Cut в контроле (yw (А), yw;1096-GAL4 (Б)) и в опыте (1096GAL4>UAST-Hrs (В)). Стрелкой показано искажение паттерна Cut в почке
крыла. (Г-Е) In situ гибридизация комплиментарного РНК-зонда сut на мРНК
Cut в дисках в контроле (yw (Г), yw;1096-GAL4 (Д)) и в опыте (1096GAL4>UAST-Hrs
(Е)).
Белыми
стрелками
(Г,
Д)
показан
паттерн
распределения мРНК Cut в норме; бордовой стрелкой (Е) показано
искажение паттерна распределения мРНК Cut; чёрными стрелками показаны
неспецифичные сигналы в трахее.
103
Рисунок 32. Изменение паттерна экспрессии гена Wg на D/V границе
крылового имагинального диска дрозофилы при эктопической экспрессии
Hrs в почке крыла: связывание антител к белку Wg в контроле (yw (А)) и в
опыте (1096-GAL4>UAST-Hrs (Б)). Стрелкой показано искажение паттерна
экспрессии Wg.
Таким образом, основываясь на результатах проведённых нами
экспериментов, можно сделать вывод, что эктопическая экспрессия Hrs под
драйвером 1096-GAL4 приводит к формированию эктопического паттерна
экспрессии Cut в области, соответствующей экспрессии драйвера. Это может
являться следствием положительного влияния Hrs на активность сигнального
пути Notch (Halder et al., 2006; Knoblich, Gallagher, 2006). В свою очередь
эктопическая экспрессия Cut приводит к снижению активности сигнального
пути Wg и, следовательно, снижению транскрипционной активности генов
Ser и Dl и Ac и Sc, что приводит к исчезновению маргинальных щетинок, и
эктопической активации гена Ap в вентральном компартменте крылового
104
диска (Рис. 33), за счёт чего осуществляется положительная обратная связь
Notch и Wg (Рис. 34).
Рисунок 33. Влияние эктопической экспрессии гена Hrs под контролем
драйвера 1096-GAL4 на паттерн экспрессии гена Ap в крыловом
имагинальном диске дрозофилы. В норме ген Ap экспрессируется в
дорзальном компартменте диска (А). В дисках особей линии 1096GAL4>UAST-Hrs>ap-LacZ наблюдается искажение паттерна экспрессии гена
Ap на D/V границе. (Б). Повышенный уровень экспрессии Ap в области
пересечения D/V и A/P границ указывает на участие Hrs в формаировнии или
поддержании не только D/V, но также и A/P границы.
105
Рисунок 34. Путь воздействия Hrs на активность сигнального пути Wg
в крыловом имагинальном диске дрозофилы. D/V – D/V граница, D и V –
соответственно, дорзальный и вентральный компартменты крылового диска.
Серым обозначены неактивные гены; голубым обозначен Hrs и его
предположительная точка воздействия на сигнальный путь Notch; чёрными
стрелками показана положительная регуляция активности экспрессии генов,
красными
затуплёнными
стрелками
показана
негативная
регуляция
активности экспрессии генов, пунктирной стрелкой схематично обозначено
действие сигнального пути Wg.
4.2.2 Влияние гена Hrs на поддержание A/P границы крылового
имагинального диска
Как видно из п.4.2.1, одним из проявлений снижения активности
сигнального пути Wg при эктопической экспрессии Hrs является экспансия
паттерна экспрессии Ap в вентральном компартменте крылового диска (Рис.
33).
Вместе с тем, особенности эктопического паттерна Ap, а именно
повышенная активность гена в области пересечения D/V и A/P границ,
указывает на влияние Hrs на формирование или поддержание A/P границы.
Данное наблюдение было отмечено нами в работе 2012 года. Позже, в 2014
106
году, влияние Hrs на A/P границу было также показано в работе Fan с
соавторами (Fan et al., 2014): авторы данной статьи показали, что, связывая
рецепторную молекулу Smothened, Hrs оказывает негативное воздействие на
сигнальный путь Hh на ранних этапах формирования крылового диска и
таким образом влияет на формирование A/P границы.
Наш эксперимент с иммуноокрашиванием крыловых дисков показал
(Рис. 35), что в условиях эктопической экспрессии Hrs размеры области
локализации Ptc в диске увеличиваются по сравнению с контролем.
Поскольку
в
эксперимент
нами
был
взят
драйвер
1096-GAL4,
активизирующийся в конце 2 личиночной стадии, эффект на паттерн Ptc Hrs
указывает на участие последнего также в поддержании A/P границы на более
поздних этапах развития крылового диска.
Рисунок 35. Распределение белка Ptc в имагинальных крыловых дисках
контрольных линий yw (А) и 1096-GAL4 (Б) и при эктопической экспрессии
гена Hrs под контролем драйвера 1096-GAL4 (В). Размеры области
локализации белка Ptc в зоне повышенной экспрессии гена Hrs увеличена по
сравнению с контролем (белая стрелка).
107
4.2.3 Роль гена Hrs на поздних этапах развития крыла
Изучая далее влияние Hrs на развитие крыла, мы провели эксперимент
по снижению активности гена Hrs посредством РНК-интерференции. Для
этого мы экспрессировали трансген UAS-RNAi-Hrs под контролем драйверов
1096-GAL4, 7405-GAL4, 8609-GAL4 и 3041-GAL4. Поскольку в крыле
паттерн экспрессии использованных драйверов отличается (Рис. 36 (А-Г))
(1096-GAL4 и 7405-GAL4 экспрессируются, преимущественно, в прожилках, 8609-GAL4 – на границе дистальной части про-жилок, 3041-GAL4 –
в области межжилок), в нашем эксперименте экспрессия RNAi-Hrs под
контролем указанных драйверов имели различный «вектор действия».
Фенотипически РНК-интерференция гена Hrs проявляется существенным
утолщением продольных жилок (Рис. 36 (Д-З)), что может свидетельствовать
о снижении активности сигнального пути Notch, поддерживающего статус
клеток межжилок, и/или увеличении активности сигнального пути EGFR,
необходимого
для
формирования
жилок.
Известно,
что
белок
Hrs
характеризуется высокой стабильностью и сильным материнским эффектом
(Lloyd et al., 2002), что приводит к тому, что эффект РНК-интерференции,
наблюдаемый нами у имаго, проявляется именно на стадии куколки, что
свидетельствует об участии Hrs в регуляции процесса сужения про-жилок
крыла на стадии куколки.
Кроме того, во всех случаях экспрессии UAS-RNAi-Hrs наблюдается
уменьшение размеров крыла, а также, в некоторых случаях, искажение его
формы (крыло загибается в вентральном направлении, приобретая форму
черпака (Рис. 36 (Е, Ж)), что может свидетельствовать об уменьшении
площади вентральной поверхности крыла). Кроме того, для драйвера 3041GAL4 (Рис. 36 (З)) видно, что вентральная и дорзальная поверхности крыла
разобщаются. Таким образом, можно предположить, что Hrs не только
участвует в регуляции отдельных сигнальных путей, принимающих участие в
регулировании процесса сужения про-жилок крыла дрозофилы, но также
108
играет роль в поддержании обмена сигналами между поверхностями крыла
куколки (между 6-8 и 18 часами П/О), способствуя их параллельному
формированию и дальнейшему соединению.
Таким образом, проведённые эксперименты указывают на то, что Hrs
участвует в регуляции формирования крыла не только на стадии
формирования и поддержани границ крылового диска, но и на более поздних
стадиях в процессе сужение жилок и синхронизации развития поверхностей
крыла.
Рисунок 36. Фенотипические проявления РНК-интерференции гена Hrs в
крыле дрозофилы при экспрессии UAST-RNAi-Hrs под контролем драйверов
1096-GAL4 (Д), 7405-GAL4 (Е), 8609-GAL4 (Ж) и 3041-GAL4 (З) по
сравнению с контролем (yw;UAST-RNAi-Hrs) (И). Крылья располагаются
вентральной поверхностью вверх. Стрелками указаны аномалии (утолщения
жилок, эктопический жилочный материал); также в (Е, Ж) наблюдается
искажение формы крыловой пластинки, в (З) – разобщение дорзальной и
вентральной поверхностей крыла.
(А-Г) – паттерн экспрессии драйверов 1096-GAL4 (А), 7405-GAL4 (Б), 8609GAL4 (В), 3041-GAL4 (Г) в крыле куколки.
109
4.2.4 Эктопическая экспрессия гена Hrs усиливает эффект трансдетерминации
клеток крыла дрозофилы
Эктопическая экспрессия гена Eyeless в крыловом имагинальном диске
под
драйвером
1096-GAL4
трансдетерминации
(Halder
стимулирует
et
al.,
процесс
1995),
то
так
называемой
есть
изменение
транскрипционного статуса части клеток крылового диска с дальнейшим
формированием из них эктопических глазных тканей (эктопического глаза)
(Рис. 37 (А)). На уровне развивающегося диска клетки, подвергающиеся
трансдетерминации, можно идентифицировать по экспрессии глазного
мастер-гена Elav.
Исследуя Eyeless-опосредованную трансдетерминацию по типу «крылоглаз», мы показали антогонистическое взаимодействие генов Eyeless (Ey) и
Wg в трансдетерминирующем крыловом диске: оказалось, что при коэкспрессии Ey и Wg размеры эктопического глаза уменьшаются (Рис. 37 (Б)),
в то время как повышение уровня экспрессии Ey за счёт одновременного
использования
двух
драйверов
приводит
к
увеличению
размеров
эктопического глаза (Рис. 37 (В)). При этом, в процессе трансдетерминации
клеток крыла на участке D/V границы диска, где локализуются Elavположительные клетки (Рис. 38 (А)), экспрессия Wg нарушается, что видно
по изменению паттерна его белкового продукта (Рис. 38 (Б)). Это
подтверждает антогонистичность действия морфогенов Wg и Eyeless в
процессе формирования эктопического глаза у дрозофилы.
Из литературных данных следует, что при развитии нормального глаза
Wg и Ey также действуют антогонистически: эктопическая активация
сигнала Wg приводит к редукции глаза и трансформации глазной ткани в
кутикулу головы (Lee, Treisman, 2001).
110
Рисунок 37. Формирование эктопических глаз на крыле дрозофилы.
Эктопическая экспрессия гена Ey под контролем драйвера 1096-GAL4
приводит к формированию тканей глаза в области крыла (А). Одновременная
экспрессия гена Wg (1096-GAL4>UAST-Ey>UAST-Wg) вызывает уменьшение
размеров эктопических глаз и также приводит к гибели имаго (Б). Усиление
экспрессии гена Ey под контролем двух драйверов (1096-GAL4 и wg-GAL4)
вызывает визуальное увеличение размеров эктопических глаз (В).
Рисунок 38. Паттерн экспрессии генов Wingless (A) и Elav (Б) в
крыловых имагинальных дисках особей 1096-GAL4>UAST-Ey. (В) –
наложение изображений. (Г) – нормальный паттерн экспресси гена Wg в
дисках особей дикого типа.
111
Поскольку, как говорилось выше, ген Hrs оказывает влияние на
активность сигнального пути Wg, мы также проверили способность Hrs
оказывать влияние на формирование эктопического глаза на крыле
дрозофилы. Наши эксперименты показали, что эктопическая экспрессия Hrs
под контролем драйвера 1096-GAL4, как и усиление экспрессии Ey, приводит
к увеличению эктопического глаза (Рис. 39 (А)). При этом, в крыловом
имагинальном диске личинок 1096-GAL4>UAST-Ey>UAST-Hrs паттерн
экспрессии Wg сильно искажается (Рис. 39 (Б)), а потенциальные клетки
эктопического глаза, выявляемые по экспрессии Elav, образуют более
многочисленные скопления по сравнению с особями 1096-GAL4>UAST-Ey
(Рис. 39 (В)). Таким образом, видно, что при формировании эктопического
глаза Hrs действует на стадии, когда клетки крыла находятся в фазе
крыловой детерминации, ингибируя сигнальный путь Wg в почке крылового
имагинального диска, что приводит к увеличению количества клеток,
подвергающихся трансдетерминации.
Рисунок
39.
Влияние
эктопической
экспрессии
гена
Hrs
на
формирование эктопического глаза. Эктопическая ко-экспрессия Ey и Hrs
под контролем драйвера 1096-GAL4 приводит к видимому увеличению
размеров эктопических глаз (А) и вызывает увеличение размеров области
эктопической экспрессии Elav (Б) и искажение паттерна экспрессии Wg.
112
Глава 5. Обсуждение
5.1 Влияние белка Hrs на развитие клеток зародышевого пути самцов
дрозофилы
5.1.1 Белок Hrs локализуется на фузомах сперматоцитов и сперматид
дрозофилы
В ходе проведения данной работы мы получили линии плодовых
мушек, несущие генетические вставки, содержащие полноразмерную (HrsB)
и усечённые (Hrs1, Hrs2, Hrs4, Hrs8 и Hrs9) формы гена Hrs, маркированные
GFP. Дальнейшие эксперименты показали, что в сперматоцитах белковые
продукты HrsB, Hrs4, Hrs8 и Hrs9 локализуются на специфических
клеточных
структурах,
принимающих
фузомах
непосредственное
(цитоплазматических
участие
в
канальцах),
поддержании
обменных
процессов внутри синцития. HrsB сохраняет данную локализацию и на более
поздних стадиях сперматогенеза – в сперматидах на стадии «луковицы», –
где также обнаруживается в эндосомах; однако на поздних стадиях
сперматогенеза (после стадии «листа») Hrs в клетках не визуализируется. В
то же время, N-концевые формы Hrs1 и Hrs2 не были обнаружены на
фузомах, но были локализованы в ядрах сперматоцитов и сперматид.
Поскольку "свободный" GFP, как и GFP.nls также локализуются в ядрах
клеток, мы сделали вывод, что локализация Hrs1 и Hrs2 не является
специфичной, но являются следствием наличия у них GFP-маркера.
Основываясь
на
результатах
проведённых
экспериментов,
мы
локализовали сайт связывания фузомы в молекуле Hrs в области Pro/Glu и
coiled-coil доменов между 380 и 472 аминокислотными остатками.
5.1.2 Мутация и РНК-интерференция гена Hrs не влияют на премейотические
митозы, митозы и фертильность самцов дрозофилы
Исследование семенников личинок третьего возраста, гомозиготных по
мутантному аллелю HrsD28 показало, что нарушение функции белка Hrs не
вызывает
нарушений
цитокинеза
премейотических
митозов.
Анализ
113
мозаичных клонов, гомозиготных по аллелю HrsD28, в семенниках имаго
линии hs-FLP;HrsD28FRT/Ubi-GFP не выявил полиплоидных сперматоцитов и
полиплоидных
сперматид
на
стадии
«луковицы»
и,
следовательно,
нарушений мейоза. Наконец, цитологический анализ мейоза-1 и мейоза-2 в
семенниках имаго линии bam-GAL4/UAS-RNAi-Hrs также не выявил
нарушений премейотических митозов и мейозов в сперматогенезе.
Кроме того, самцы линии bam-GAL4>UAS-RNAi-Hrs были фертильны,
а визуальное исследование их сперматозоидов не выявило нарушения их
подвижности.
5.1.3 Семенники дрозофилы имеют специфический спектр изоформ
транскриптов Hrs
Результаты проведённой нами in situ гибридизации комплиментарного
зонда на мРНК hrs показали, что ген Hrs экспрессируется на ранних этапах
сперматогенеза, что согласуется с нашими данными, полученными в
результате исследования локализации белка Hrs, маркированного GFP, в
сперматогенезе дрозофилы (раздел 5.1.1). Исследование спектра трёх
анонсированных в базе данных FlyBase изоформ Hrs показало, что в отличие
от соматических тканей (имагинальные диски и ганглии)
в семенниках
дрозофилы содержатся не только изоформа Hrs-RB, но также изоформы HrsRA и Hrs-RC. Поскольку для изоформы Hrs-RA характерно отсутствие Nконцевых доменов, вовлеченных в связывание белка с эндосомами, и которая
практически идентична полученной в данной работе усечённой форме Hrs8,
на основании полученных данных было выдвинуто предположение, что
белковый продукт Hrs-A играет специфическую роль в поддержании
структуры и/или функционирования фузом сперматоцитов.
5.2 Маркеры эндосом Rab4, Rab7 и Rab11 локализуются на
формирующейся акросоме в процессе сперматогенеза дрозофилы
На данный момент не существует общей теории акросомогенеза.
Поскольку наши эксперименты не подтвердили способности белка Hrs
114
локализоваться на акросоме или оказывать влияние на фертильность самцов
дрозофилы, мы провели анализ локализации других маркеров эндосом –
белков Rab4, Rab7 и Rab11, маркированных YFP. Наш эксперимент показал,
что все три исследованных маркера локализуются на апикальном конце
сперматид и спермиев в области формирующейся акросомы, что может
являться косвенным подтверждением эндосомальной теории акросомогенеза.
Также мы показали, что в сперматогенезе дрозофилы маркер ранних эндосом
Rab4 и маркер поздних эндосом Rab7, но не маркера рециркулирующих
эндосом Rab11, подобно Hrs локализуются на фузомах, что дополнительно
указывает на возможную роль участников везикулярного трафика в процессе
поддержания структуры и функции цитоплазматических мостиков.
5.3 Новые данные о влиянии Hrs на развитие крыла дрозофилы
5.3.1 Ген Hrs участвует в поддержании D/V границы крылового
имагинального диска
Эктопическая экспрессия гена Hrs в почке крыла дрозофилы вызывает
ряд эффектов, таких как появление эктопического жилочного материала и
исчезновение краевых рядов маргинальных щетинок крыла. Анализ дисков
особей
1096-GAL4>neur-lacZ>UAST-Hrs
показал,
что
эктопическая
экспрессия гена Hrs в крыловом диске приводит к исчезновению паттерна
экспрессии Neuralized (мишени сигнального пути Wg).
Согласно модели (Buceta et al., 2007) одним из важнейших геновучастников процесса формирования крыла является ген Cut. Проведённые
нами иммуноокрашивание антителами к белку Cut и in situ гибридизация
зонда к мРНК Cut препаратов крыловых дисков особей 1096-GAL4>UASTHrs показали, что в условиях эктопической экспрессии Hrs паттерн
экспрессии Cut изменяется: в области экспрессии драйвера 1096-GAL4 мРНК
и белок Cut не образуют характерного паттерна, но распределены диффузно
по всей почке крыла. Изменение паттерна экспрессии Cut также приводит к
115
аналогичному искажению паттерна экспрессии Wg, активное состояние
экспрессии которого поддерживается за счёт Cut. В то же время, как
показано в работе (Buceta et al., 2007), Cut снижает уровень транскрипции
Arm, снижая, таким образом, активность сигнального пути Wg; таким
образом, нарушение границ паттерна Cut приводит к снижению активности
Wg во всей области эктопической экспрессии Hrs, что, в свою очередь,
предотвращает экспрессию Dl и Ser и Ac и Sc и формирование краевых рядов
маргинальных щетинок.
Поскольку Cut – ген-мишень сигнального пути Notch, по-видимому,
искажение паттерна его экспрессии является следствием изменения паттерна
активности сигнального пути Notch. Действительно, эктопическая экспрессия
Hrs в крыловом диске приводит к искажению паттерна экспрессии Ap,
активность которого необходима для поддержания экспрессии Notch. В то же
время, негативное влияние на активность экспрессии Ap оказывает
сигнальный путь Wg, который, таким образом, ограничивает паттерн Ap
дорзальным компартментом крылового диска.
Таким образом, показано, что Hrs снижает активность сигнального
пути Wg опосредованно за счёт участия в формировании паттерна
экспрессии Cut.
5.3.2 Ген Hrs участвует в поддержании A/P границы крылового
имагинального диска
Одним из проявлений снижения активности сигнального пути Wg при
эктопической экспрессии Hrs является экспансия паттерна экспрессии Ap в
вентральном компартменте крылового диска. Вместе с тем, особенности
эктопического паттерна Ap (повышенная активность гена в области
пересечения D/V и A/P границ) указывает на влияние Hrs на формирование
или поддержание A/P границы.. Участие Hrs в формировании A/P границы
было показано (Fan et al., 2014). В данной работе мы показали, что
эктопическая экспрессия Hrs вызывает изменение паттерна экспрессии
116
Patched, маркера A/P границы и гена-мишени сигнального пути Hh.
Поскольку использованный в работе драйвер 1096-GAL4 активизируется в
конце 2 личиночной стадии, данный эффект указывает на участие Hrs в
поддержании A/P границы на более поздних, чем формирование, этапах
развития крылового диска, возможно, за счёт формирования градиента Hh.
5.3.3 Ген Hrs имеет два фокуса действия в процессе развития крыла
дрозофилы
Мы
исселовали
влияние
РНК-интерференции
гена
Hrs
на
формирование крыла, вызвав эктопическую экспрессию UAS-RNAi-Hrs под
контролем драйвероы 1096-GAL4, 7405-GAL4, 8609-GAL4 и 3041-GAL4.
Данный эксперимент показал, что ген Hrs играет роль в развитии крыла не
только на ранних, но и на более поздних этапах указанного процесса, в
именно в сужении жилок (vein refinement) и, по-видимому, в поддержании
синхронности развития дорзальной и вентральной поверхностей крыла.
Фенотипические проявления РНК-и Hrs указывают на негативное влияние
Hrs на активность сигнальных путей Notch и/или EGFR.
5.3.4 Эктопическая экспрессия Hrs оказывает влияние на развитие
эктопического глаза дрозофилы
В данной работе мы показали, что в основе трансдетерминации клеток
крылового диска в клетки глаза посредством эктопической экспрессии гена
Eyeless лежит антогонистическое взаимодействие генов Ey и Wg: при коэкспрессии в крыловом диске Ey и Wg наблюдается уменьшение размеров
эктопического глаз, а при повышении уровня экспрессии Ey (за счёт
одновременного использования двух драйверов (1096-GAL4 и wg-GAL4)
размеры эктопического глаза, напротив, увеличиваются.
Дальнейшее изучение формирования эктопического глаза на крыле
дрозофилы показало, что эктопическая экспрессия гена Hrs также приводит к
увеличению размеров эктопического глаза, что может быть обусловлено
117
негативным влиянием Hrs на сигнальный путь Wg. Кроме того, с учётом
некоторой
общности
закономерностей
формирования
нормального
и
эктопического глаз, можно предположить, что Hrs влияет также на
формирование нормального глаза у D. melanogaster.
118
Выводы
1. Получены
линии
D.
melanogaster
с
геномными
встройками,
кодирующими полноразмерную форму и 5 усечённых форм гена Hrs,
маркированные
GFP
и
экспрессирующиеся
под
контролем
регуляторного элемента UASp. Исследование полученных линий
показало, что химерный белок GFP-Hrs локализуется в процессе
сперматогенеза на фузомах сперматоцитов, но не на акросомах, как
ожидалось исходя из исследований акросомогенеза млекопитающих
(Berruti, Paiardi, 2011). Сайт связывания Hrs с фузомой локализован
между 383 и 472 аминокислотными остатками.
2. Показано что Hrs не принимает участие в регуляции цитокинеза в
сперматогенезе D. melanogaster.
3. Показано,
что
ген
Hrs
экспрессируется
на
ранних
этапах
сперматогенеза, причём, для генеративных тканей самцов дрозофилы
характерно наличие всех изоформ РНК гена Hrs, анонсированных в
базе данных FlyBase. Поскольку изоформа Hrs-RA, для которой
характерно
отсутствие
N-концевых
доменов,
вовлеченных
в
связывание белка с эндосомами, практически идентична полученной в
данной работе усечённой форме Hrs8, на основании полученных
данных было выдвинуто предположение, что белковый продукт HrsRA играет специфическую роль в поддержании структуры и/или
функциии фузом сперматоцитов.
4. Обнаружено, что маркеры эндосом Rab4, Rab7 и Rab11 локализуются в
области акросомы, что является подтверждением эндосомальной
теории акросомогенеза. Кроме того, на ранних стадиях сперматогенеза
Rab4 и Rab7 подобно Hrs обнаруживаются на фузоме.
5. Показано, что Hrs оказывает негативное действие на активность
сигнального пути Wg опосредованно через формирование паттерна
экспрессии гена Cut, и таким образом влияет на поддержание D/V
119
границы крылового имагинального диска, причём данный эффект
обнаруживается не только в процессе нормального развития клеток
крылового диска, но и в процессе трансдетерминации клеток крыла в
клетки глаза. Выявлена роль Hrs в поддержании A/P границы на
поздних этапах развития крылового диска. Также обнаружено, что Hrs
имеет функцию на более поздних этапах развития крыла в процессе
сужения жилок крыла (vein refinement) и, возможно, поддержания
синхронности формирования дорзальной и вентральной поверхностей
крыла.
120
Список использованной литературы
1.
Шилова И. Э., Омельянчук Л. В. 2007. Метод трансформации клеток
зародышевого пути дрозофилы высококонцентрированной экзагенной
ДНК. Генетика 43 (1): 1-4.
2.
Юдина О. С., Галимова Ю. А. 2008. Структурный анализ супрессора
опухолей Merlin с помощью трансгенных конструкций в сперматогенезе
Drosophila. Информационный Вестник ВОГиС. 12 (3): 406-411.
3.
Abelle J. V., Peschard P., Naujokas M. A., Lin T., Saucier C., Urbé S., Park M..
2005. Met/Hepatocyte Growth Factor Receptor Ubiquitination Suppresses
Transformation and Is Required for Hrs Phosphorylation. Molecular and
Cellular Biology. 25 (21): 9632–9645.
4.
Affolter M., Marty T., Vigano M. A., Jazwinska A. 2001. Nuclear interpretation
of Dpp signaling in Drosophila. The EMBO Journal. 20 (13): 3298-3305.
5.
Akiyama, T. 2000. Wnt/β-catenin signaling. Cytokine & Growth Factor
Reviews. 11: 273-282.
6.
Alam S. L., Sundquist W. I. 2006. U2. Nature Structural & Molecular Biology.
13 (3): 186-188.
7.
Ali B. R., Seabra M.C. 2005. Targeting of Rab GTPases to cellular membranes.
Biochemical Society Transactions. 33 (4): 652-656.
8.
Bache K. G., Raiborg C., Mehlum A., Stenmark H. 2003. STAM and Hrs are
subunits of a multivalent ubiquitin-binding complex on early endosomes. The
Journal of Biological Chemistry. 278 (14): 12513-12521.
9.
Bachmann A. A., Knust E. 1998. Positive and negative control of Serrate
expression during early development of the Drosophila wing. Mechanisms of
Development. 76 (1-2): 67-78.
10.
Basler K. Struhl G. 1994. Compartment boundaries and the control of
Drosophila limb pattern by hedgehog protein. Nature. 368: 208-214.
11.
Bate M., Arias A. M. 1991. The embryonic origin of imaginal discs in
Drosophila. Development. 112 (3): 755-761.
121
12.
Bean A. J., Seifert R., Chen Y. A., Sacks R., Sheller R. H. 1997. Hrs-2 is an
ATPase implicated in calcium-regulated secretion. Nature. 385 (6619): 826829.
13.
Bean A. J., Chang Y. C., Davanger S., Chou M. F., Gerhardt B., Tsujimoto S.
2000. Hrs-2 Regulates Receptor-mediated Endocytosis via Interactions with
Eps15. The Journal of Biological Chemistry. 275 (20): 15271–15278.
14.
Belenkaya T. Y., Han C., Yan D., Opoka R. J., Khodoun M., Liu H., Lin X.
2004. Drosophila Dpp Morphogen Movement Is Independent of DynaminMediated Endocytosis but Regulated by the Glypican Members of Heparan
Sulfate Proteoglycans. Cell. 119: 231–244.
15.
Bender W., Pierre S., Hognes D. S. 1983. Chromosomal walking and jumping
to isolate DNA from Ace and rosy loci of bithorax loci in Drosophila
melanogaster. Journal of Molecular Biology. 168: 17-33.
16.
Berruti G., Ripolone M., Ceriani M. 2010. USP8, a regulator of endosomal
sorting, is involved in mouse acrosome biogenesis through interaction with the
spermatid ESCRT-0 complex and microtubules. Biology of Reproduction. 82
(5): 930-939.
17.
Berruti G., Paiardi C. 2011. Acrosome biogenesis. Revisiting old questions to
yield new insights. Spermatogenesis. 1 (2): 95-98.
18.
Blair S. S. 2007. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of
intercellular signaling. Annuual Review of Cell and Developmental Biology.
723: 293-319.
19.
Bland C., Rand M. D. 2006. Methylmercury induces activation of Notch
signaling. Neurotoxicology. 584. doi:10.1016/j.neuro.2006.04.005.
20.
Bökel C., Schwabedissen A., Entchev E. V., Renaud O., González-Gaitán M.
2006. Sara endosomes and the maintenance of dpp signaling levels across
mitosis. Science. 314 (5802): 1135-1139.
21.
Bouamr F., Houck-Loomis B. R., De Los Santos M., Casaday R. J., Johnson M.
C., Goff S. P. 2007. The C-Terminal Portion of the Hrs Protein Interacts with
Tsg101 and Interferes with Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag
Particle Production. Journal of Virology. 81 (6): 2909–2922.
122
22.
Brand A., Perrimon N. 1992. Targeted gene expression as a means of altering
cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118: 401–415.
23.
Brodsky F. M., Chen C. Y., Kneuhl C., Towler M. C., Wakeham D. E. 2001.
Biological basket weaving: Formation and function of clathrin-coated vesicles.
Annuual Review of Cell and Developmental Biology. 17: 517–568.
24.
Bucci C., Thomsen P., Nicoziani P., McCarthy J., van Deurs B. 2000. Rab7: a
key to lysosome biogenesis. Molecular Biology of the Cell. 11: 467–480.
25.
Buceta J., Herranz H., Canela-Xandri O., Reigada R., Sagués F., Milá M. 2007.
Robustness and Stability of the Gene Regulatory Network Involved in DV
Boundary Formation in the Drosophila Wing. PloS ONE. 2 (7): e602.
26.
Cantalupo G., Alifano P., Roberti V., Bruni C. B., Bucci C. 2001. Rabinteracting lysosomal protein (RILP): the Rab7 effector required for transport
to lysosomes. EMBO Journal. 20: 683–693.
27.
Carlton J. G., Martin-Serrano J. 2007. Parallels between cytokinesis and
retroviral budding: a role for the ESCRT machinery. Science. 316: 1908–1912.
28.
Chan, W. P. 1993. Antennapedial regenerate in the walking stick, Carausius
morosus: development and morphology. Department of Zoology, University of
Washington, Seattle, Washington, USA: Ph.D. thesis.
29.
Chanut-Delalande H., Jung A.C., Baer M. M., Lin L., Payre F., Affolter M.
2010. The Hrs/Stam Complex Acts as a Positive and Negative Regulator of
RTK Signaling during Drosophila Development. PLoS ONE. 5 (4): 1-10.
30.
Chen D., McKearin D.M. 2003. A discrete transcriptional silencer in the bam
gene determines asymmetric division of the Drosophila germline stem cell.
Development. 130: 1159-1170.
31.
Chen M.-H., Li Y.-J., Kawakami T., Xu S.-M., Chuang P.-T. 2004.
Palmitoylation is required for the production of a soluble multimeric Hedgehog
protein complex and long-range signaling in vertebrates. Genes &
Development. 18: 641–659.
32.
Cohen B., McGuffin M. E., Pfeifle C., Segal D., Cohen S. M. 1992. apterous, a
gene required for imaginal disc development in Drosophila encodes a member
of the LIM family of developmental regulatory proteins. Genes &
Development. 6: 715-729.
123
33.
Conley C. A., Silburn R., Singer M. A., Ralston A., Rohwer-Nutter. D. 2000.
Crossveinless 2 contains cystein-rich domains and is required for high level of
BMP-like aktivity during the formation of the cross veins in Drosophila.
Development. 127: 3947-3959.
34.
Cook O., Biehs B., Bier E. 2004. brinker and optomotor-blind act coordinately
to initiate development of the L5 wing vein primordium in Drosophila.
Development. 131: 2113-2124.
35.
Cupers P., ter Haar E., Boll W., Kirchhausen T. 1997. Parallel dimers and antiparallel tetramers formed by epidermal growth factor receptor pathway
substrate clone 15. The Journal of Biological Chemistry. 272: 33430–33434.
36.
Dahmann C., Basler K. 1999. Compartment boundaries: at the edge of
development. Trends in Genetics. 15 (8): 320-326.
37.
Daro E., Van Der Sluijs P., Galli T., Mellman I. 1996. Rab4 and cellubrevin
define different early endosome populations on the pathway of transferrin
receptor recycling. Cell Biology. 93: 9559-9564.
38.
de Celis J. F., Barrio R., Kafatos F. C. 1996. A gene complex acting
downstream of dpp in Drosophila wing morphogenesis. Nature. 381: 421-424.
39.
de Celis J. F., Bray S., Garcia-Bellido A. 1997. Notch signaling regulates
veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in
the Drosophila wing. Development. 124: 1919-1928.
40.
de Celis, J. F. 1998. Positioning and differentiation of veins in the Drosophila
wing. The International Journal of Developmental Biology. 42: 335-344.
41.
Chen Y., Jiang J. 2013.Decoding the phosphorylation code in Hedgehog signal
transduction. Cell Research. 23: 186–200.
42.
de Vreede G. 2009. Endocytic control of tumor suppression in Drosophila
melanogaster “How a trafficking defect causes tumor formation”. Master
Thesis in Cancer. 25 p.
43.
Denef N., Neubuser D., Perez L., Cohen S. M. 2000. Hedgehog induces
opposite changes in turnover and subcellular localization of patched and
smoothened. Cell. 102: 521-531.
124
44.
Di Pietro S. M., Dell’Angelica E. C. 2005.The Cell Biology of Hermansky–
Pudlak Syndrome: Recent Advances. Traffic. 6: 525–533.
45.
Diraviyam K., Stahelin R. V., Cho W., Murray D. 2003. Computer modeling of
the membrane interaction of FYVE domains. Journal of Molecular Biology.
328 (3): 721-736.
46.
Dobzhansky T. 1929. The influence of quantity and quality of chromosomal
material on the size of cells in Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s
Archives of Developmental Biolology. 115: 363-379.
47.
Dollar G., Struckhoff E., Michaud J., Cohen. R. S. 2002. Rab11 polarization of
the Drosophila oocyte: a novel link between membrane trafficking,
microtubule organization, and oskar mRNA localization and translation.
Development. 129: 517-526.
48.
Douglas H. D., Hawthorne D. C. 1964. Enzymatic expression and genetic
linkage of genes controlling galactose utilization in Saccharomyces. Genetics.
49: 837-844.
49.
Douglas H. D., Hawthorne D. C. 1966. Regulation of genes controlling
synthesis of the galactose pathway enzymes in yeast. Genetics. 54: 911-916.
50.
Dubois L., Lecourtois M., Alexandre C., Hirst E., Vincent J. P. 2001. Regulated
endocytic routing modulates wingless signaling in Drosophila embryos. Cell.
105 (5): 613–624.
51.
Eggenschwiler J. T., Espinoza E., Anderson K. V. 2001. Rab23 is an essential
negative regulator of the mouse Sonic hedgehog signalling pathway. Nature.
412 (6843): 194–198.
52.
Entchev E. V., Schwabedissen A., González-Gaitán M. 2000. Gradient
Formation of the TGF-β Homolog Dpp. Cell. 103: 981–991.
53.
Fan J., Jiang K., Liu Y., Jia J. 2014. Hrs Promotes Ubiquitination and Mediates
Endosomal Trafficking of Smoothened in Drosophila Hedgehog Signaling.
PLoS ONE. 8 (11): e79021.
54.
Fechtel K., Fristrom D. K., Fristrom J. W. 1989. Prepupal differentiation in
Drosophila: distinct cell types elaborate a shared structure, the pupal cuticle,
but accumulate transcripts in unique patterns. Development. 106 (4): 649-656.
125
55.
Fischer J. A., Giniger E., Maniatis T., Ptashne M. 1988. GAL4 activates transcription in Drosophila. Nature. 332: 853–856.
56.
Fristrom D., Gotwals P., Eaton S., Kornberg T. B., Sturtevant M., Bier E.,
Fristrom J. W. 1994. Blistered: a gene required for vein/intervein formation in
wings of Drosophila. Development. 120 (9): 2661-2671.
57.
Fuller M., Bate M., Arias A.M. 1993. Spermatogenesis, In The Development of
Drosophila melanogaster. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY: 71-147.
58.
Fuller M.T. 1998. Genetic control of cell proliferation and differentiation in
Drosophila spermatogenesis. Cell & Developmental Biology. 9: 433-444.
59.
Gallet A., Ruel L., Staccini-Lavenant L., Thérond P.P. 2006. Cholesterol
modification is necessary for controlled planar long-range activity of
Hedgehog in Drosophila epithelia. Development. 133 (3): 407-418.
60.
Gandhi T. K. B., Chandran S., Peri S., Saravana R., Amanchy R., Prasad T. S.
K., Pandey A. 2005. A Bioinformatics Analysis of Protein Tyrosine
Phosphatases in Humans. DNA Research. 12: 79–89.
61.
Gaullier J. M., Simonsen A., D'Arrigo A., Bremnes B., Stenmark H., Aasland
R. 1998. FYVE fingers bind PtdIns(3)P. Nature. 394 (6692): 432-433.
62.
Gilbert S. F. 1997. Developmental Biology. Sunderland, Massachusetts,
Sinauer Associates, Inc. Publishers. 960 p.
63.
Gillooly D. J., Raiborg C., Stenmark H. 2003. Phosphatidylinositol 3-phosphate
is found in microdomains of early endosomes. Histochemistry and Cell
Biology. 120 (6): 445-453.
64.
Golembo M., Schweitzer R., Freeman M., Shilo B.-Z. 1996. Argos transcription
is induced by the Drosophila EGF receptor pathway to form an inhibitory
feedback loop. Development. 122: 223-230.
65.
Gonzalez A., Chaouiya C., Thieffry D. 2006. Dynamical analysis of the
regulatory network defining the dorsal-ventral boundary of the Drosophila
wing imaginal disc. Genetics. 174 (3): 1625-1634.
66.
Gorvel, J. P., Chavrier P., Zerial M., Stahl P. D. 1991. Rab5 controls early
endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5): 915-925.
67.
Goto S., Mukai A., Yamamoto-Hino M., Awano W., Watanabe W., Komada M.
126
2010. Balanced ubiquitylation and deubiquitylation of Frizzled regulate
cellular responsiveness to Wg/Wnt. The EMBO Journal. 29: 2114–2125.
68.
Grossniklaus U., Bellen H. J., Wilson C., Gehring W. J. P-element-mediated
enhancer detection applied to the study of oogenesis in Drosophila.
Development. 1989. 107 (2): 189-200.
69.
Grigorieff A., Clevers H. 2005. Wnt signaling in the intestinal epithelium: from
endoderm to cancer. Genes & Development. 19: 877-890.
70.
Grimm S., Pflugfelder G. O. 1996. Control of the gene optomotor-blind in
Drosophila wing development by decapentaplegic and wingless. Science. 271
(5255): 1601-1604.
71.
Guerrero I., Chiang C. 2007. A conserved mechanism of Hedgehog gradient
formation by lipid modifications. Trends in Cell Biology. 17 (1): 1–5.
72.
Hadorn E. 1965. Problems of determination and transdetermination. Brookhaven
Symposia in Biology. 18: 148-161.
73.
Halder G., Callaerts P., Gehring W.J. 1995. Induction of Ectopic Eyes
by Targeted Expression of the eyeless Gene in Drosophila. Science. 267: 17881792.
74.
Halder G., Childress J. L., Acar M., Tao C. 2006. Lethal Giant Discs, a Novel
C2-Domain Protein, Restricts Notch Activation during Endocytosis. Current
Biology. 16 (22): 2228-2233.
75.
Hanyaloglu A. C., McCullagh E., von Zastrow M. 2005. Essential role of Hrs in
a recycling mechanism mediating functional resensitization of cell signaling.
The EMBO Journal. 24: 2265–2283.
76.
Harris R.E., Ashe H.L. 2011. Cease and desist: modulating short-range Dpp
signalling in the stem-cell niche. EMBO Reports. 12 (6): 519-526.
77.
Hayakawa, A., Kitamura N. 2000. Early endosomal localization of hrs requires
a sequence within the proline- and glutamine-rich region but not the FYVE
finger. The Journal of Biological Chemistry. 275 (38): 29636-29642.
78.
Held, L. I., Jr. 2002. Imaginal discs. The genetic and cellular logic of pattern
formation. Cambridge University Press. 460 p.
127
79.
Hirano S., Kawasaki M., Ura H., Kato R., Raiborg C., Stenmark H., Wakatsuki
S. 2006. Double-sided ubiquitin binding of Hrs-UIM in Endosomal protein
sorting. Nature Structural & Molecular Biology. 13, (3): 272-277.
80.
Holroyd C., Kistner U., Annaert W., Jahn R. 1999. Fusion of Endosomes
Involved in Synaptic Vesicle Recycling. Molecular Biology of the Cell. 10:
3035–3044.
81.
Hopkins C. R., Gibson A., Shipman M., Miller K. 1990. Movement of
internalized ligand-receptor complexes along a continuous endosomal
reticulum. Nature. 346 (6282): 335-339.
82.
Huang H.-R., Chen Z. J., Kunes S., Chang G.-D., Maniatis T. 2010. Endocytic
pathway is required for Drosophila Toll innate immune signaling. PNAS. 107
(18): 8322–8327.
83.
Huang S. H., Zhao L., Sun Z. P., Li X. Z., Geng Z., Zhang K. D., Chao M. V.,
Chen Z. Y. 2009. Essential role of Hrs in endocytic recycling of full-length
TrkB receptor but not its isoform TrkB.T1. The Journal of Biological
Chemistry. 284 (22): 15126-15136.
84.
Itman C., Wong C., Whiley P. A. F., Fernando D., Loveland K. L. 2011. TGFβ
superfamily signaling regulators are differentially expressed in the developing
and adult mouse testis. Spermatogenesis. 1 (1): 63-72.
85.
Jekély G., Rørth P. 2003. Hrs mediates downregulation of multiple signaling
receptors in Drosophila. The EMBO Reports. 4 (12): 1163-1168.
86.
Johnson S. A., Milner M. J. 1987. The final stages of wing development in
Drosophila melanogaster. Tissue Cell. 19: 505-513.
87.
Kanazawa C., Morita E., Yamada M., Ishii N., Miura S., Asao H., Yoshimori
T., Sugamura K. 2003. Effect of deficiencies of STAMs and Hrs, mammalian
class E Vps proteins, on receptor downregulation. Biochemical and
Biophysical Research Communications. 309 (4): 848-856.
88.
Katzmann D. J., Babst M., Emr S. D. 2001. Ubiquitin-dependent sorting into
the multivesicular body pathway requires the function of a conserved
endosomal protein sorting complex, ESCRT-I. Cell. 106: 145-155.
128
89.
Kemler R., Aberle H., Bauer A., Stappert J., Kispert A. 1997. β-catenin is a
target for the ubiquitin–proteasome pathwa. The EMBO Journal. 16 (13):
3797–3804.
90.
Kew O. M., Douglas H. C. 1976. Genetic co-regulation of galactose and
melibiose utilization in Saccharomyces. Journal of Bacteriology. 125: 33-41.
91.
Kiger J.A, Jr., Natzle J. E., Kimbrell D. A., Paddy M. R., Kleinhesselink K.,
Green M. M. 2007. Tissue Remodeling During Maturation Of The Drosophila
Wing. Developmental Biology. 301 (1): 178–191.
92.
Klebes A., Sustar A., Kechris K., Li H., Schubiger G., Kornberg T. B. 2005.
Regulation of cellular plasticity in Drosophila imaginal disc cells by the
Polycomb group, trithorax group and lama genes. Development. 132: 37533765.
93.
Klein T., Jaekel R. 2006. The Drosophila Notch inhibitor and tumor suppressor
gene lethal (2) giant discs encodes a conserved regulator of endosomal
trafficking. Developmental Cell. 11: 655-669.
94.
Knoblich J. A., Gallagher C. M. 2006. The conserved C2 domain protein Lethal
(2) giant discs regulates trafficking in Drosophila. Developmental Cell. 11:
641-653.
95.
Kobayashi H., Tanaka N., Asao H., Miura S., Kyuuma M., Semura K., Ishii N.,
Sugamura K. 2005. Hrs, a Mammalian Master Molecule in Vesicular Transport
and Protein Sorting, Suppresses the Degradation of ESCRT Proteins Signal
Transducing Adaptor Molecule 1 and 2. The Journal of Biological Chemistry.
280 (11): 10468–10477.
96.
Komada M., Kitamura N. 1995. Growth factor-induced tyrosine
phosphorylation of Hrs, a novel 115-kilodalton protein with a structurally
conserved putative zinc finger domain. Molecular and Cellular Biology. 15
(11): 6213-6221.
97.
Komada M., Masaki R., Yamamoto A., Kitamura N. 1997. Hrs, a tyrosine
kinase substrate with a conserved double zinc finger domain, is localized to the
cytoplasmic surface of early endosomes. // The Journal of Biological
Chemistry. 272 (33): 20538-20544.
129
98.
Komada M., Soriano P. 1999. Hrs, a FYVE finger protein localized to early
endosomes, is implicated in vesicular traffic and required for ventral folding
morphogenesis. Genes & Development. 13 (11): 1475-1485.
99.
Komada M., Kitamura N. 2005. The Hrs/STAM Complex in the
Downregulation of Receptor Tyrosine Kinases. The Journal of Biochemistry.
137: 1–8.
100. Kroft T. L., Gleason E. J., L'Hernault S. W. 2005. The spe-42 gene is required
for sperm-egg interactions during C. elegans fertilization and encodes a spermspecific transmembrane protein. Developmental Biology. 286 (1): 169-181
101. Kruse K., Pantazis P., Bollenbach T., Jülicher F., González-Gaitán M. 2004.
Dpp gradient formation by dynamin-dependent endocytosis: receptor
trafficking and the diffusion model. Development. 131: 4843-4856.
102. Kwong J., Roudabush F. L., Moore P. H., Montague M., Oldham W., Li Y.,
Chin L.-S., Li L. 2000. Hrs interacts with SNAP-25 and regulates Ca2+dependent exocytosis. Journal of Cell Science. 113: 2273-2284.
103. Lai E.C. 2004. Notch signaling: control of cell communication and cell fate.
Development. 131: 965-973.
104. Lai K.-M. V., Olivier P., Gish G. D., Henkemeyer M., McGlade J., Pawson T.
1995. A Drosophila shc Gene Product Is Implicated in Signaling by the DER
Receptor Tyrosine Kinase. The Journal of Molecular and Cellular Biology. 15
(9): 4810–4818.
105. Le Borgne R., Bardin A., Schweisguth F. 2005. The roles of receptor and ligand
endocytosis in regulating Notch signaling. Development. 132: 1751-1762.
106. Lee J. J., Ekker S. C., von Kessler D. P., Porter J. A., Sun B. I., Beachy P. A.
1994. Autoproteolysis in hedgehog protein biogenesis. Science. 266 (5190):
1528-1537.
107. Lee J. D., Treisman J. E. 2001. The role of Wingless signaling in establishing
the anteroposterior and dorsoventral axes of the eye disc. Development. 128:
1519–1529.
108. Lindsley D. L., Tokuyasu K. T. 1980. Spermatogenesis. The Genetics and
Biology of Drosophila. 2: 225-294.
130
109. Lloyd T. E., Atkinson R., Wu M. N., Zhou Y., Pennetta G., Bellen H. J. 2002.
Hrs Regulates Endosome Membrane Invagination and Tyrosine Kinase
Receptor Signaling in Drosophila. Cell. 108: 261–269.
110. Lohi O., Poussu A., Mao Y., Quiocho F., Lehto V. P. 2002. VHS domain - a
longshoreman of vesicle lines. FEBS Letters. 513 (1): 19-23.
111. Lu L., Komada M., Kitamura N. 1998. Human Hrs, a tyrosine kinase substrate
in growth factor-stimulated cells: cDNA cloning and mapping of the gene to
chromosome 17. Gene. 213 (1-2): 125-132.
112. Lunde K., Biehs B., Nauber U., Bier E. 1998. The knirps and knirps-related
genes organize development of the second wing vein in Drosophila.
Development. 125: 4145-4154.
113. Luzio J. P., Rous B. A., Bright N. A., Pryor P. R., Mullock B. M., Piper R. C.
2000. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. Journal of Cell
Science. 113: 1515-1524.
114. Luzio J. P., Piper R. C. 2001. Late endosomes: Sorting and partitioning in
multivesicular bodies. Traffic. 2: 612–621.
115. Martínez M. J., Geuze H. J., Ballesta J. 1996. Evidence for a nonlysosomal
origin of the acrosome. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 44: 313320.
116. Mao Y., Nickitenko A., Duan X., Lloyd T. E., Wu M. N., Bellen H. J., Quiocho
F. A. 2000. Crystal structure of the VHS and FYVE tandem domains of Hrs, a
protein involved in membrane trafficking and signal transduction. Cell. 100
(4): 447-456.
117. Marois E., Mahmoud A., Eaton S. 2005. The endocytic pathway and formation
of the Wingless morphogen gradient. Development. 133: 307-317.
118. Maves L., Schubiger G. 1995. Wingless induces transdetermination in
developing Drosophila imaginal discs. Development. 121: 1263-1272.
119. Maves L., Schubiger G. 2003. Transdetermination in Drosophila imaginal
discs: a model for understanding pluripotency and selector gene maintenance.
Current Opinion in Genetics & Development. 13: 472-479.
131
120. Milan M., Cohen S.M. 2000. Temporal regulation of apterous activity during
development of the Drosophila wing. Development. 127 (14): 3069-3078.
121. Militello R., Colombo M. I. 2013. Small GTPases as regulators of cell division.
Communicative & Integrative Biology. 6 (5): e25460-1–e25460-4. doi:
10.4161/cib.25460.
122. Miller S. L., Malotky E., O'Bryan J. P. 2004. Analysis of the role of ubiquitininteracting motifs in ubiquitin binding and ubiquitylation. The Journal of
Biological Chemistry. 279 (32): 33528-33537.
123. Mills I. G., Urbé S., Clague M. J. 2001. Relationships between EEA1 their role
in endosome fusion. Journal of Cell Science. 114 (10): 1959-1965.
124. Miura G. I., Roignant J.-Y., Wassef M., Teisman J. E. 2008. Myopic acts in the
endocytic pathway to enhance signaling by the Drosophila EGF receptor.
Development. 135: 1913-1922.
125. Miura S., Takeshita T., Asao H., Kimura Y., Murata K., Sasaki Y., Hanai J.-I.,
Beppu H., Tsukazaki T., Wrana J. L., Miyazono K., Sugamura K. 2000. Hgs
(Hrs), a FYVE Domain Protein, Is Involved in Smad Signaling through
Cooperation with SARA. Molecular and Cellular Biology. 20: 9346–9355.
126. Mizuno E., Kawahata K., Kato M., Kitamura N., Komada M. 2003. STAM
proteins bind ubiquitinated proteins on the early endosome via the VHS
domain and ubiquitin-interacting motif. Molecular Biology of the Cell. 14 (9):
3675-3689.
127. Moloney D. J., Panin V. M., Johnston S. H., Chen J., Shao L., Wilson R., Wang
Y., Stanley P., Irvine K. D., Haltiwanger R. S., Vogt T,F. 2000. Fringe is a
glycosyltransferase that modifies Notch. Nature. 406 (6794): 369-375.
128. Moreno R. D., Alvarado C. P. 2006. The mammalian acrosome as a secretory
lysosome: new and old evidence. // Molecular Reproduction & Development.
73: 1430–1434.
129. Morita E., Sandrin V., Chung H.-Y., Morham S. G., Gygi S. P., Rodesch C. K.,
Sundquist W. I. 2007. Human ESCRT and ALIX proteins interact with proteins
of the midbody and function in cytokinesis. The EMBO Journal. 26: 4215–
4227.
132
130. Murone M., Rosenthal A., de Sauvage F. J. 1999. Hedgehog Signal
Transduction: From Flies to Vertebrates. Experimental Cell Research. 253: 25–
33.
131. Nagaso H., Murata T., Day N., Yokoyama K. 2001. Simultaneous detection of
RNA and proteins by in situ hybridization and immunological staining. The
Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49: 1177-1182.
132. Nagata T., Murata K., Murata R., Sun S. L., Saito Y., Yamaga S., Tanaka N,,
Tamai K., Moriya K., Kasai N., Sugamura K., Ishii N. 2014. Hepatocyte
growth factor regulated tyrosine kinase substrate in the peripheral development
and function of B-cells. Biochemical and Biophysical Research
Communications. 443 (2): 351-356.
133. Nahmad M., Stathopoulos A. 2009. Dynamic Interpretation of Hedgehog
Signaling in the Drosophila Wing Disc. // PloS Biology. 7 (9): e1000202
134. Neuman-Silberberg F. S., Schüpbach T. 1993. The Drosophila dorso-ventral
patterning gene gurken produces a dorsally localized RNA and encodes a TGF
a-like protein. Cell. 75: 165–174.
135. Nikko E., André B. 2007. Evidence for a Direct Role of the Doa4
Deubiquitinating Enzyme in Protein Sorting into the MVB Pathway. Traffic. 8:
566–581.
136. Nüsslein-Volhard C., Wieschus E. 1980. Mutations affecting segment number
andpolarity in Drosophila. Nature. 287: 795-801.
137. Olivier J. P., Raabe T., Henkemeyer M., Dickson B., Mbamalu G., Margolis B.,
Schlessinger J., Hafen E., Pawson T. 1993. A Drosophila SH2-SH3 adaptor
protein implicated in coupling the sevenless tyrosine kinase to an activator of
Ras guanine nucleotide exchange, Sos. Cell. 73 (1): 179-191.
138. Omelyanchuk L. V, Pertseva J. A., Burns S. S., Chang L. S. 2009. Evolution
and origin of HRS, a protein interacting with Merlin, the Neurofibromatosis 2
gene product. Gene Regulation and Systems Biology. 3: 143-157.
139. Palacios F., Tushir J. S., Fujita Y., D’Souza-Schorey C. 2005. Lysosomal
Targeting of E-Cadherin: a Unique Mechanism for the Down-Regulation of
Cell-Cell Adhesion during Epithelial to Mesenchymal Transitions. Molecular
and Cellular Biology. 25 (1): 389–402.
133
140. Pan T., Coleman J. E. 1990. GAL4 transcription factor is not a "zinc finger" but
forms a Zn(II)2Cys6 binuclear cluster. PNAS. 87 (6): 2077-2081.
141. Parks A. L., Klueg K. M., Stoutand J. R., Muskavitch M. A. 2000. Ligand
endocytosis drives receptor dissociation and activation in the Notch pathway.
Development. 127: 1373-1385.
142. Pasternak S. H., Bagshaw R. D., Guiral M., Zhang S., Ackerley C. A., Park B.
J., Callahan J. W., Mahuran D. J. 2003. Presenilin-1, nicastrin, amyloid
precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the
lysosomal membrane. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29): 2668726694.
143. Perrimon N. 1994. Signalling pathways initiated by receptor protein tyrosine
kinases in Drosophila. Current Opinion in Cellular Biology. 6: 260–266.
144. Perrimon N., Perkins L.A. 1997. There Must Be 50 Ways to Rule Minireview
the Signal: The Case of the Drosophila EGF Receptor. Cell. 89: 13–16.
145. Pfeffer S. R. 2001. Rab-GTPases: specifying and deciphering organelle identity
and function. Trends Cell Biology. 11 (12): 487-491.
146. Pfeffer S., Aivazian D. 2004. Targeting Rab GTPases to distinct membrane
compartments. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11): 886-896.
147. Pfeffer S. 2005. A model for Rab GTPase localization. Biochemical Society
Transactions. 33 (4): 627-630.
148. Piddini E., Marshall F., Dubois L., Hirst E., Vincent J. P. 2005. Arrow (LRP6)
and Frizzled2 cooperate to degrade Wingless in Drosophila imaginal discs.
Development. 132 (24): 5479-5489.
149. Pridgeon J. W., Webber E. A., Sha D., Li L., Chin L.-S. 2009. Proteomic
analysis reveals Hrs UIM-mediated ubiquitin signaling in multiple cellular
processes. FEBS Journal. 276 (1): 118–131.
150. Raiborg C, Bache K. G., Mehlum A., Stang E., Stenmark H. 2001a. Hrs recruits
clathrin to early endosomes. The EMBO Journal. 20 (17): 5008-5021.
151. Raiborg C., Bremnes B., Mehlum A., Gillooly D. J., D'Arrigo A., Stang E.,
Stenmark H. J. 2001b. FYVE and coiled-coil domains determine the specific
localisation of Hrs to early endosomes. Cell Science. 114 (12): 2255-2263.
134
152. Ram K.R., Wolfner M.F. 2007. Seminal influences: Drosophila Acps and the
molecular interplay between males and females during reproduction.
Integrative and Comparative Biology. 47 (3): 427–445.
153. Rives A. F., Rochlin K. M., Wehrli M., Schwartz S. L., DiNardo S. 2006.
Endocytic trafficking of Wingless and its receptors, Arrow and DFrizzled-2, in
the Drosophila wing. Developmental Biology. 293: 268–283.
154. Rodman J. S., Wandinger-Ness A. 2000. Rab GTPases coordinate endocytosis.
Journal of Cell Science. 113: 183-192.
155. Row P. E., Clague M. J., Urbé S. 2005. Growth factors induce differential
phosphorylation profiles of the Hrs–STAM complex: a common node in
signaling networks with signal-specific properties. Biochemical Journal. 389:
629–636.
156. Rubin G. M., Spradling A. C. 1983. Vectors for P element-mediated gene transfer
in Drosophila. Nucleic Acids Research. 11 (18): 6341-6351.
157. Sanicola M., Sekelsky J., Elson S., Gelbart W. M. 1995. Drawing a stripe in
Drosophila imaginal disks: negative regulation of decapentaplegic and patched
expression by engrailed. Genetics. 139: 745-756.
158. Schweitzer R., Howes R., Smith R., Shilo B. Z., Freeman M. 1995. Inhibition
of Drosophila EGF receptor activation by the secreted protein Argos. / Nature.
376: 699-702.
159. Scoles D. R., Huynh D. P., Chen M. S., Burke S. P., Gutmann D. H., Pulst S.M. 2000. The neurofibromatosis 2 tumor suppressor protein interacts with
Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate. Human
Molecular Genetics. 9 (11): 1567-1574.
160. Scoles D. R., Nguyen V. D., Qin Y., Sun C. X., Morrison H., Gutmann D. H.,
Pulst S. M. 2002. Neurofibromatosis 2 (NF2) tumor suppressor schwannomin
and its interacting protein HRS regulate STAT signaling. Human Molecular
Genetics. 11 (25): 3179-3189.
161. Seto E. S., Bellen H. J. 2006. Internalization is required for proper Wingless
signaling in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (1): 95106.
135
162. Seto E. S., Bellen H. J., Lloyd T. E. 2002. When cell biology meets
development: endocytic regulation of signaling pathways. Genes &
Development. 16: 1314-1336.
163. Sheela S. R., Latha M., Injody S. J. 2004. Griscelli syndrome: Rab 27a
mutation. Indian Pediatr. 41 (9): 944-947.
164. Shekhtman, A., Cowburn D. 2002. A ubiquitin-interacting motif from Hrs binds
to and occludes the ubiquitin surface necessary for polyubiquitination in
monoubiquitinated proteins. Biochemical
Communications. 296 (5): 1222-1227.
and
Biophysical
Research
165. Siegfried E., Chou T. B, Perrimon N. 1992. Wingless signaling acts through
zeste-white 3, the Drosophila homolog of glycogen synthase kinase-3, to
regulate engrailed and establish cell fate. Cell. 71 (7): 1167-1179.
166. Singer M. A., Penton A., Twombly V., Hoffmann F. M., Gelbart W. M. 1997.
Signaling through both type I DPP receptors is required for anterior-posterior
patterning of the entire Drosophila wing. Development. 124: 79-89.
167. Spencer F. A., Hoffmann F. M., Gelbart W. M. 1982. Decapentaplegic: a gene
complex affecting morphogenesis in Drosophila melanogaster. Cell. 28: 451461
168. Stahelin R.V., Long F., Diraviyam K., Bruzik K. S., Murray D., Cho W. 2002.
Phosphatidylinositol 3-phosphate induces the membrane penetration of the
FYVE domains of Vps27p and Hrs. The Journal of Biological Chemistry. 277
(29): 26379-26388.
169. Stark J., Bonacum J., Remsen J., DeSalle R. 1999. The evolution and
development of dipteran wing veins: a systematic approach. Annual Review of
Entomology. 44: 97-129.
170. Stenmark H., Aaslandi R., Toh B.-H., D’Arrigo A. 1996. Endosomal
Localization of the Autoantigen EEA1 Is Mediated by a Zinc-binding FYVE
Finger. The Journal of Biological Chemistry. 271 (39): 24048–24054.
171. Stenmark H., Raiborg C., Bache K. G., Mehlum A. 2001. Function of Hrs in
endocytic trafficking and signaling. Biochemical Society Transactions. 29 (4):
472-475.
136
172. Stern K. A., Visser Smit G. D., Place T. L., Winistorfer S., Piper R. C., Lill N.
L. 2007. Epidermal Growth Factor Receptor Fate Is Controlled by Hrs
Tyrosine Phosphorylation Sites That Regulate Hrs Degradation. Molecular and
Cellular Biology. 27 (3): 888–898.
173. Stewart B. A. 2002. Membrane trafficking in Drosophila wing and eye
development. Cell & Developmental Biology. 13: 91-97.
174. Strigini M. A, Cohen S. M. 1997. Hedgehog activity gradient contributes to AP
axial patterning of the Drosophila wing. Development. 124: 4697-4705.
175. Struhl G., Basler K. 1993. Organizing activity of wingless protein in
Drosophila. Cell. 72: 527–540.
176. Sturtevant M., Bier E. In situ protocol for imaginal discs and pupal wings.
University of Californis, San Diego. [Электронный ресурс]:
http://superfly.ucsd.edu/bierlab/research/protocols/imagdisc.html
177. Sun C.-X., Haipek C., Scoles D. R., Pulst S. M., Giovannini M., Komada M.,
Gutmann D. H. 2002. Functional analysis of the relationship between the
neurofibromatosis 2 tumor suppressor and its binding partner, hepatocyte
growth factor-regulated tyrosine kinase substrate. Human Molecular Genetics.
11 (25): 3167–3178.
178. Sun W., Yan Q., Vida T. A., Bean A. J. 2003. Hrs regulates early endosome
fusion by inhibiting formation of an endosomal SNARE complex. Journal of
Cell Biology. 162 (1): 125-137.
179. Sun-Wada G. H., Imai-Senga Y., Yamamoto A., Murata Y., Hirata T., Wada
Y., Futai M. 2002. A proton pump ATPase with testis-specific E1-subunit
isoform required for acrosome acidification. The Journal of Biological
Chemistry. 277: 18098–18105.
180. Swanson K. A., Kang R. S., Stamenova S. D., Hicke L., Radhakrishnan I. 2003.
Solution structure of Vps27 UIM-ubiquitin complex important for endosomal
sorting and receptor downregulation. The EMBO Journal. 22 (18): 4597-4606.
181. Tabata T., Kornberg T.B. 1994. Hedgehog is a signalling protein with a key
role in patterning Drosophila imaginal disks. Cell. 76: 89-102.
182. Taelman, V. F., Dobrowolsk R., Plouhinec J.-L., Fuentealba L. C., Vorwald P.
P., Gumper I., Sabatini D. D., De Robertis E. M. 2010. Wnt Signaling Requires
137
the Sequestration of Glycogen Synthase Kinase 3 inside Multivesicular
Endosomes. Cell. 143 (7): 1136–1148.
183. Takata H., Kato M., Denda K., Kitamura N. 2000. A hrs binding protein having
a src homology 3 domain is involved in intracellular degradation of growth
factors and their receptors. Genes to Cells. 5: 57-69.
184. Takei K., Haucke V. 2001. Clathrin-mediated endocytosis: membrane factors
pull the trigger. Trends in Cell Biology. 11 (9): 385-391.
185. Tamai K., Toyoshima M., Tanaka N., Yamamoto N., Owada Y., Kiyonari H.,
Murata K., Ueno Y., Ono M., Shimosegawa T., Yaegashi N., Watanabe M.,
Sugamura K. 2008. Loss of Hrs in the Central Nervous System Causes
Accumulation of Ubiquitinated Proteins and Neurodegeneration. The American
Journal of Pathology. 173 (6): 1806-1817.
186. Tamai K., Tanaka N., Nakano T., Kakazu E., Kondo Y., Inoue J., Shiina M.,
Fukushima K., Hoshino T., Sano K., Ueno Y., Shimosegawa T., Sugamura K.
2010. Exosome secretion of dendritic cells is regulated by Hrs, an ESCRT-0
protein. Biochememical and Biophysical Research Commununications. 399
(3): 384-390.
187. Tang X. M., Lalli M. F., Clermont Y. 1982. A cytochemical study of the Golgi
apparatus of the spermatid during spermiogenesis in the rat. American Journal
of Anatomy. 163: 283-294.
188. Teleman A. A., Cohen S. M. 2000. Dpp Gradient Formation in the Drosophila
Wing Imaginal Disc. Cell. 103: 971-980.
189. Thompson B. J., Mathieu J., Sung H. H., Loeser E., RØrth P., Cohen S. M.
2005. Tumor suppressor properties of the ESCRT-II complex component
Vps25 in Drosophila. Developmental Cell. 9 (5): 711-720.
190. Tien A.-C., Rajan A., Bellen H. J. 2009. A Notch updated. Journal of Cell
Biology. 184 (5): 621-629.
191. Tokuyasu K. T., Peacock W. J., Hardy R. W. 1972. Dinamics of
spermatogenesis in Drosophila melanogaster. I. Individualization process. Z.
Zellforsch Mikrosk. Anat. 124. (4): 479-506.
192. Torroja C., Gorfinkiel N., Guerrero I. 2004. Patched controls the Hedgehog
gradient by endocytosis in a dynamin-dependent manner, but this
138
internalization does not play a major role in signal transduction. Development.
131 (10): 2395-2408.
193. Toyoshima M., Tanaka N., Aoki J., Tanaka Y., Murata K., Kyuuma M.,
Kobayashi H., Ishii N., Yaegashi N., Sugamura K. 2007. Inhibition of tumor
growth and metastasis by depletion of vesicular sorting protein Hrs: its
regulatory role on E-Cadherin and β-Catenin. Cancer Research. 67 (11): 51625171.
194. Vaccari T., Lu H., Kanwar R., Fortini M. E., Bilder D. 2008. Endosomal entry
regulates Notch receptor activation in Drosophila melanogaster. The Journal of
Cell Biology. 180 (4): 755-762.
195. Vetrivel K. S., Cheng H., Lin W., Sakurai T., Li T., Nukina N., Wong P. C., Xu
H., Thinakaran G. 2004. Association of gamma-secretase with lipid rafts in
post-Golgi and endosome membranes. The Journal of Biological Chemistry.
279: 44945-44954.
196. Vivekanand P., Rebay I. 2006. Intersection of signal transduction pathways and
development. Annual Reviews in Genetics. 40: 139-157.
197. Wells A., Welsh J. B., Lazar C. S., Wiley H. S., Gill G. N., Rosenfeld M. G.
1990. Ligand-induced transformation by a noninternalizing epidermal growth
factor receptor. Science. 247: 962–964.
198. Wilder E. L. 2000. Ectopic Expression in Drosophila. In: Tuan R. S., Lo C. W.
2000. Developmental Biology Protocols, Volume III. Humana Press: 552 p.
199. Wilson K. L., Fitch K. R., Bafus B. T., Wakimoto B. T. 2006. Sperm plasma
membrane breakdown during Drosophila fertilization requires Sneaky, an
acrosomal membrane protein. Development. 133: 4871-4879.
200. Wilson L. D., Sackett J. M., Mieczkowski B. D., Richie A. L., Thoemke K.,
Rumbley J. N., Kroft T.L. 2011. Fertilization in C. elegans requires an intact
C-terminal RING finger in sperm protein SPE-42. BMC Developmental
Biology. 11: 10. doi: 10.1186/1471-213X-11-10.
201. Wisotzkey R. G., Mehra A., Sutherland D. J., Dobens L. L., Liu X., Dohrmann
C., Attisano L., Raftery L. A. 1998. Medea is a Drosophila Smad4 homolog
that is differentially required to potentiate DPP responses. Development. 125:
1433-1445.
139
202. Xu A., Lei L., Irvine K.D. 2005. Regions of Drosophila Notch that contribute
to ligand binding and the modulatory influence of Fringe. The Journal of
Biological Chemistry. 208: 30158-30165.
203. Yan H., Chin M.-L., Horvath E. A., Kane E.A., Pfleger C. M. 2009. Impairment
of ubiquitylation by mutation in Drosophila E1 promotes both cell-autonomous
and non-cell-autonomous Ras-ERK activation in vivo. Journal of Cell Science.
122 (9): 1461-1470.
204. Yan S.-J., Zartman J. J., Zhang M., Scott A., Shvartsman S. Y., Li W. X. 2009.
Bistability coordinates activation of the EGFR and DPP pathways in
Drosophila vein differentiation. Molecular Systems Biology. 5 (278): doi:
10.1038/msb.2009.35.
205. Yan Y., Denef N., Schüpbach T. 2009. The vacuolar proton pomp, V-ATPase,
is requied for Notch signaling and endosomal trafficking in Drosophila.
Developmental Cell. 17: 387-402.
206. Yanagawa S., van Leeuwen F., Wodarz A., Klingensmith J., Nusse R. 1995.
The Dishevelled protein is modified by Wingless signaling in Drosophila.
Genes & Development. 9: 1087-1097.
207. Yanagawa S., Matsuda Y., Lee J.-S., Matsubayashi H., Sese S., Kadowaki T.,
Ishimoto A.. 2002 Casein kinase I phosphorylates the Armadillo protein and
induces its degradation in Drosophila. The EMBO Journal. 21 (7): 1733-1742.
208. Yanagawa S., Matsubayashi H., Sese S., Lee J.-S., Shirakawa T., Iwatsubo T.,
Tomita T. 2004. Biochemical Characterization of the Drosophila Wingless
Signaling Pathway Based on RNA Interference. Molecular and Cellular
Biology. 24 (5): 2012–2024.
209. Zecca M., Basler K., Struhl G. 1995. Sequential organizing activites of
engrailed, hedgehog, and decapentaplegic in the Drosophila wing.
Development. 121: 2265-2278.
210. Zeng Y. A., Verheyen E. M. 2004. Nemo is an inducible antagonist of Wingless
signaling during Drosophila wing development. Development. 131: 29112920.
211. Zhai L., Chaturvedi D., Cumberledge S. 2004. Drosophila Wnt-1 Undergoes a
Hydrophobic Modification and Is Targeted to Lipid Rafts, a Process That
140
Requires Porcupine. The Journal of Biological Chemistry. 279 (32): 33220–
33227.
212. Zhang J., Schulze K. L., Hiesinger P. R., Suyama K., Wang S., Fish M., Acar
M., Hoskins R. A., Bellen H. J., Scott M. P. 2007. Thirty-One Flavors of
Drosophila Rab Proteins. Genetics. 176: 1307–1322.