ДИАГНОСТИКА И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИРУСА ГРИППА А/H1N1V В РОССИИ Грудинин М.П., Комиссаров А.Б., Елпаева Е.А., Писарева М.М., Бузицкая Ж.В., Паянкова А.А., Романовская-Романько Е.А., Слита А.В., Стукова М.А. ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург, Россия Появившийся в феврале-марте 2009 года в Мексике новый вирус гриппа А/H1N1v быстро распространился по всему миру и явился причиной пандемии гриппа. Эпидемические события в России начались в последнюю неделю сентября 2009 г. в Дальневосточном регионе (Южно-Сахалинск), второй отправной точкой эпидемии стал Калининград, а к октябрю 2009 г. эпидемия охватила всю территорию России. Настоящая работа посвящена анализу результатов диагностики пандемического гриппа в России и характеристике молекулярно-генетических особенностей вирусов гриппа А/H1N1v, выделенных в период с мая по декабрь 2009 г., в НИИ гриппа. Материалы и методы Клинический (мазки из носоглотки, бронхо-альвеолярный лаваж) и секционный материал (фрагменты трахеи, легких, бронхов, селезенки) поступал из клиник Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также из вирусологических лабораторий Опорных Баз Федерального центра по гриппу. Образцы были получены из лабораторий ФГУЗ «Центров гигиены и эпидемиологии» республик Коми, Карелия, Башкортостан; Белгородской, Воронежской, Калужской, Курской, Нижегородской, Новгородской, Астраханской, Архангельской, Саратовской, Псковской, Смоленской, Самарской, Вологодской областей и Ненецкого автономного округа. Исследование клинического материала проводилось в день поступления методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Rotor-Gene 6000, Австралия) c использованием комплекта реагентов по протоколу CDC (Атланта, США): набор для выделения РНК – RNeasy Mini Kit (Qiagen); набор для постановки ОТ-ПЦР – SuperScript III Platinum One-step qRT-PCR System (Invitrogen); набор праймеров и зондов - InfA, H1 сезонный, RNP и H1Sw (Biosearch Technologies), а также наборов АмплиСенс Influenza virus A/B и Influenza virus A/H1-swine-FL ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома вируса гриппа А/H1N1v проводили на приборе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора «BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit». Филогенетический анализ осуществляли с использованием программы Vector NTI 8,0 (Invitrogen) и MEGA 3.1 (PSU, США) методом «ближайших соседей» и Kimura. Результаты В период с мая по декабрь 2009 г. при анализе 1558 клинических образцов РНК вируса гриппа А(H1N1v) была обнаружена у 409 больных гриппом и 163 умерших. Вирусов гриппа А других субтипов и гриппа В выявлено не было. Из 409 больных 58% составили лица в возрасте до 14 лет, 41% - больные от 15 до 64 лет и 1% - лица старше 65 лет. Средний возраст обследованных больных составил 15,7 лет. Среди умерших пациентов большинство лиц (89,9%) были в возрасте от 15 до 65 лет, доля умерших детей до 14 лет составила 3,8%, а лиц старше 65 лет – 6,3%. Средняя продолжительность заболевания (до смерти) составила 10 дней (от 3-х до 30 дней). При этом в 84% случаев грипп был осложнен пневмонией вирусной или вирусно-бактериальной этиологии, у части больных регистрировали острый респираторный дистресс-синдром. По имеющимся данным у 6 умерших в анамнезе был сахарный диабет, у 7 – ожирение 2-3 степени, среди умерших было 6 женщин второго и третьего триместра беременности. Средний возраст умерших составил 39 лет. Молекулярно-генетическая характеристика 31 пандемического штамма (20 штаммов были выделены из клинических образцов и 11 штаммов - из секционного материала) показала, что по генам гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) данные штаммы были подобны штаммам вируса гриппа А/Техас/05/2009 и А/Калифорния/07/2009 (гомология по HA составила 98,9%). Филогенетический анализ показал, что популяция штаммов H1N1v эволюционно связана с вирусами гриппа А/H1N1 1918 года и вирусами классического гриппа свиней. При этом пандемические штаммы 2009 г. и эпидемические H1N1 штаммы различных годов выделения образовывали две отдельные группы. Гомология по HA со штаммом A/Брисбен/59/2007, входившим в состав гриппозных вакцин в сезоны 2007-2009 гг., составила всего 78%. Большинство Российских штаммов пандемического вируса гриппа А/H1N1, включенных в анализ, несли в гемагглютинине мутацию S203T, в нейраминидазе – мутацию N248D, в NS - мутацию I23V и, таким образом, принадлежали кластеру 2, согласно классификации Fereidouni и соавторов (Fereidouni et al., 2009). У ряда российских штаммов выявлялись штаммоспецифические аминокислотные замены в различных положениях HA, две из которых находятся в антигенных сайтах Ca и Sb. В гемагглютинине 8 изолятов вируса гриппа, выделенных из секционного материала, и в 2х изолятах, выделенных от больных с тяжелым течением гриппа, была обнаружена АК замена D222G. Известно, что АК остатки HA1 135, 183, 187, 191, 222, 223 и 225 (нумерация по H1) влияют на рецептор-связывающие свойства вирусов гриппа и, соответственно, на тропизм вируса. Появление АК замен в рецептор-связывающем сайте HA может быть связано с пассированием вируса гриппа на КЭ (Xu et al., 1993; Gambaryan et al., 1999). В данном исследовании пять штаммов, содержащих остаток глицина (G) в 222 положении HA, были выделены из секционного материала на клетках MDCK, что исключает адаптационный характер данных замен. Все проанализированные штаммы не имели в NA мутаций, определяющих устойчивость к озелтамивиру (H275Y), но содержали замену S31N в белке М2, определяющую устойчивость вирусов к адамантанам и характерную для циркулирующих в мире штаммов вируса гриппа АH1N1v и их предшественников по M гену – штаммов евразийского свиного птицеподобного (avian-like) гриппа А подтипа H1N1. Заключение Согласно исследованиям, проведенным в НИИ гриппа, в период с мая по декабрь 2009 г. эпидемия гриппа в России носила моноэтиологический характер и была вызвана вирусом гриппа А(H1N1v). В отличие от предыдущих эпидемических сезонов, когда наибольшее число тяжелых случаев гриппа регистрировалось у детей до 5 лет и лиц старше 65 лет, особенностью эпидемии, вызванной вирусом гриппа А (H1N1v), являлась высокая заболеваемость и смертность среди лиц молодого и среднего возраста. Показано, что популяция штаммов H1N1v генетически однородна и эволюционно связана с вирусами гриппа H1N1 1918 года и вирусами классического гриппа свиней. При этом пандемические штаммы 2009 г. и эпидемические H1N1 штаммы различных годов выделения образуют две отдельные группы. По данным Европейского Центра профилактики и контроля заболеваний (ECDC) G222 варианты штаммов вируса гриппа H1N1v были выделены во многих странах как от людей, умерших от гриппа или перенесших заболевание в тяжелой форме, так и при легком течении гриппа. Сведений, позволяющих доказать непосредственную связь данных замен с усилением тяжести течения заболевания на сегодняшний день недостаточно. Для установления патогенетической роли данной мутации требуются дальнейшие исследования.