продуцент фибробластного интерферона человека

1
«Создание штаммов дрожжей Pichia pastoris - продуцентов фибробластного
интерферона человека».
Целью данного проекта является создание штаммов дрожжей Pichia pastoris секреторных продуцентов фибробластного интерферона человека, разработка методов
выделения и очистки рекомбинантного белка.
1. Фибробластный интерферон человека, бета-интерферон, относится к обширной группе
эволюционно родственных белков, получивших название интерферонов. Образование
интерферонов стимулируется воздействием вирусов, микроорганизмов, некоторых
химических соединений на различные группы клеток. Фибробластный интерферон
продуцируется эпителиальными клетками и фибробластами и обладат выраженным
местным
действием.
противовирусной
Интерфероны
защиты
представляют
организма,
оказывают
естественную
систему
иммуностимулирующее,
противовоспалительное и противоопухолевое действие. Клинические испытания
показали возможность использования бета-интерферона для лечения гепатита В (1),
гепатита С (2), папилломавирусных инфекций (3) и аутоиммунных заболеваний
человека (4). Показана возможность использования бета-интерферона в терапии ВИЧинфекции (5). Получены обнадеживающие результаты применения бета-интерферона
при онкологических заболеваниях (6,7). Бета-интерферон является перспективным
лекарственным препаратом при рассеянном склерозе (8-10).
2. Использование интерферонов для лечения заболеваний различной этиологии имеет
существенные преимущества по сравнению с традиционными антибиотиками и
химиотерапевтическими
препаратами
за
счет
широкого
спектра
действия,
обусловленного активацией иммунной системы, и из-за отсутствия побочных эффектов.
Однако выделение нативных цитокинов затруднено из-за их незначительного
количества в клетках. Использование в качестве источника бета-интерферона
донорской крови или культуры фибробластов, кроме того, несет опасность заражения
гепатитом В, C и ВИЧ. Перспективным подходом для получения бета-интерферона
человека в значительных количествах является использование микроорганизмов в
качестве продуцентов этого препарата. Escherichia coli, наиболее часто используемая
для
гетерологичной
экспрессии
белков,
является
условно
патогенным
микроорганизмом, и препараты бета-интерферона, полученные из бактериальных
клеток, могут содержать эндотоксины. Полное освобождение бета-интерферона от
примеси эндотоксинов, являющееся обязательным условием применения его в
2
клинической практике, значительно затрудняет процедуру очистки рекомбинантного
белка. Все вышеизложенное свидетельствует о перспективности создания штаммовпродуцентов бета-интерферона человека на основе других микроорганизмов, в
частности, дрожжей. Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не
содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов
белков
животных позволяет использовать рекомбинантные белки в клинической практике.
Ранее в лаборатории биохимической генетики ген бета-интерферона человека был
клонирован и экспрессирован в клетках дрожжей-сахаромицетов. Однако, штамм
дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцент бета-интерферона человека отличался
невысокой продуктивностью (11). Мы предлагаем использовать для гетерологичной
экспрессии метилотрофные дрожжи Pichia pastoris. Это, во-первых, дает возможность
существенно повысить выход рекомбинантных белков. Во-вторых, гликопротеины,
секретируемые дрожжами Pichia pastoris, не содержат маннозных остатков, связанных 
1-3 связями и являющихся сильными антигенными детерминантами, что позволяет
получать
наряду
с
внутриклеточными
аутентичные
секреторные
формы
рекомбинантных белков (12). Получение секреторного продуцента бета-интерферона
человека особенно актуально. Иммунный интерферон является гликопротеином, и
только в процессе секреции он претерпевает гликозилирование и приобретает
правильную конформацию. Накопление рекомбинантного белка в культуральной
жидкости значительно упрощает процедуру его очистки.
3. В настоящее время зарегистрированы и разрешены к применению
препараты
рекомбинантного бета-интерферона человека, экспрессированного в Escherichia coli:
BETASERON (Chiron Corp., США) (13), BETAFERON (Schering AG, Германия) (14).
Активным веществом этих преператов является негликозилированная форма бетаинтерферона человека. Длительное применение этих препаратов может приводить к
нежелательным
побочным
эффектам,
обусловленным
условной
патогенностью
штаммов-продуцентов (15, 16). Кроме того, существует препарат AVONEX (Biogen,
Inc.,
США,
Нидерланды),
представляющий
собой
гликозилированную
форму
рекомбинантного бета-интерферона человека, экпрессированного в культуре клеток
китайского хомячка (17). BETAFERON и AVONEX разрешены к применению в России
(14).
3
4. В настоящее время ген фибробластного интерферона человека клонирован нами в
составе векторов, обеспечивающих
продукцию рекомбинантного белка клетками
дрожжей Pichia pastoris и секрецию синтезированного белка в культуральную жидкость.
5. Продолжение НИР:
I этап: Селекция штаммов дрожжей Pichia pastoris, несущих множественные встройки
клонированного гена
бета-интерферона человека и характеризующихся повышенным
уровнем продукции рекомбинантного белка.
II этап: Изучение возможности использования штаммов дрожжей, лишенных активности
протеаз, для увеличения продукции рекомбинантного бета-интерферона.
III этап: Оптимизация условий выращивания штаммов дрожжей Pichia pastoris продуцентов бета -интерферона человека.
IV
этап:
Отработка
рекомбинантного
иммунохимических
бета-интерферона
и
методов
способов
тестирования
определения
его
продукции
биологической
активности.
V этап: Разработка схемы выделения бета-интерферона человека из клеток дрожжей.
Наработка очищенного бета-интерферона человека.
6. В ходе
выполнения данного проекта будет проведена селекция штаммов дрожжей
Pichia pastoris с повышенным уровнем синтеза фибробластного интерферона человека,
оптимизированы условия выращивания штаммов-продуцентов и разработана схема
выделения и очистки рекомбинантного бета-интерферона человека. Результаты этой
работы могут послужить основой для получения штамма дрожжей - продуцента
рекомбинантного бета-интерферона человека и создания промышленного регламента
производства бета-интерферона человека (рекомбинантного, дрожжевого).
7. Литература.
1. Eto T., Takahashi H. Enhanced inhibition of hepatitis B virus production by
asialoglycoprotein receptor -directed interferon. Nat.Med.,1999, v.5, p.577-581.
2. Ikeda F., Shimomura H., Miyake M. et al. Early clearence of circulating hepatitis C virus
enhanced by induction therapy with twice-a-day intravenous injection of IFN-beta.
J.Interferon Cytokine Res., 2000, v.20, p.831-836.
4
3. Rockley P.F., Tyring S.K. IFN ,  and  therapy of anogenital human papillomavirus
infections. Pharmacol. Ther., 1995, v.65, p.265-287.
4. Tak P.P., Hart B.A., Kraan M.C. et al. The effects of interferon beta treatment on arthritis.
Rheumatol. (Oxford), 1999, v.38, p.362-369.
5. Sanhadji K., Leissner P., Firouzi R. et al. Experimental gene therapy: the transfer of Tatinducible interferons genes protects human cells against HIV-1 challenge in vitro and in
vivo in severe combined immunodeficient mice. AIDS, 1997, v.11, p.977-986.
6. Kuniyasu H., Yasui W., Kitahara K. et al. Growth inhibitory effect of interferon-beta is
associated with the induction of cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1 in human
gastric carcinoma cell line. Cell Growth Differ., 1997, v.8, p.47-52.
7. Nagatani T., Okazawa H.M., Kambara T. et al. Effect of natural interferon-beta on the
growth of melanoma cell line. Melanoma Res., 1998, v.8, p.295-299.
8. Goodin D.S. Therapeutic developments in multiple sclerosis. Expert Opin. Investig.
Drugs, 2000, v.9, p.655-670.
9. Kendrick M., Johnson K.I. Long-term treatment of multiple sclerosis with interferon-beta
may cost effective. Pharmacoeconomics, 2000, v.18, p.45-53.
10.Fischer J.S., Priore R.L., Jacobs L.D. et al. Neuropsychological effects of interferon-beta1a in relapsing multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Collaborative Research Group.
Ann.Neurol., 2000, v.48, p.885-892.
11.Падкина М.В., Парфенова Л.В., Самбук Е.В., Смирнов М.Н Рекомбинантная
плазмидная ДНК, обеспечивающая синтез фибробластного интерферона человека
клетками дрожжей, способ ее конструирования и штамм дрожжей - продуцент
фибробластного интерферона человека». № гос. регистрации 98106452, дата
приоритета 7 апреля 1998 года.
12.Montesino R., Garcia R., Quitero O. et al. Variation in N-linked oligosaccharide
structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris.
Protein Expr. Purif., 1998, v.14, p.197-207.
13.Lin L. Betaseron. Dev. Biol. Stand., 1998, v.96, p.97-104.
14.Тотолян Н.А. Рассеянный склероз. Диагностика и лечение с позиций доказательной
медицины. Мир медицины, 2000, №5-6.
15.Neilley L.K., Goodin D.S., Goodkin D.E. et al. Side effect profile of interferon beta-1b in
MS: results of an open label trial. Neurology, 1996, v.46, p.552-554.
16.Huber S., Spycher M., Lechner-Scott J. et al. Multiple sclerosis: therapy with recombinant
5
beta-1b interferon: initial results with 30 multiple sclerosis patients in northwest
Switzerland. Schweiz.Med.Wochenschr., 1996, v.126, p.1475-1481.
17.Rudick R.A., Simonian N.A., Alam J.A. et al. Incidence and significance of neutralizing
antibodies to interferon-beta-1a in multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Collaborative
Research Group. Neurology, 1998, v.50, p.1266-1272.