Херегулин улучшает дистрофический фенотип мышей MDX

Херегулин улучшает дистрофический фенотип мышей MDX
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является фатальным нервно-мышечным заболеванием,
вызванным отсутствием дистрофина. Атрофин- белок (DRP) схожий функциональными мотивами
с дистрофином. Способность атрофина к компенсации функции дистрофина находится в
развитии и трансгенная экспрессия предоставляется важным стимулом для выявления факторов
экспрессии атрофина. Промоутер атрофина А регулируется частично херегулин-опосредованным
внеклеточным сигналом связанным киназа-зависимой активацией GABPα / β комплекса факторов
транскрипции. Таким образом, этот путь предлагает потенциальный механизм для модуляции
экспрессии атрофина в мышцах. Мы протестировали способность херегулина для улучшения
дистрофическиго фенотипа модели МДД-MDX мышей. Внутрибрюшинные инъекции небольшого
пептида, кодирующего эпидермальный фактор роста. Херегулин в течение 3 месяцев в
естественных условиях в результате регулирования атрофина заметно улучшал механические
свойства мышц, о чем свидетельствует устойчивость к эксцентричным повреждениям,
опосредованному сокращению, и снижению мышечной патологии. Улучшение дистрофического
фенотипа путем херегулин-опосредованной регуляции атрофина предлагает фармакологическое
лечебное воздействие и устранение токсичности и вопросов, связанных с доставкой вирусным
вектором на основе генной терапии МДД.
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенным Х-сцепленным
нервно-мышечным заболеванием у 1 из 3500 новорожденных мужского пола. Заболевание
вызывается мутациями в гене дистрофина в результате количественных и / или качественных
нарушений в экспрессии дистрофина. Дистрофин, связанный с мембраносвязанным
дистрогликановым / саркогликановым комплексом (РСК), который формирует важную связь с
ламинином, в составе внеклеточного матрикса (5).
Дистрофин является частью спектринового надсемейства белков, в которые входят спектрин, αактинин, и дистрофин и тесно связанные с ними белки. Дистрофин- связанная семья состоит из
дистрофина, дистрофин- связанных белков (DRP) или атрофина (кодируется в хромосоме 6), DRP2
(Х-хромосомы), дистробревина (хромосома 18). Атрофин считается аутосомным гомологом
дистрофина. Атрофин связан с комплексом белков сарколеммы и связывает F-актин с похожими
на дистрофин белками. Пренатально, атрофин выполняет функции дистрофина, потому что
экспрессируется на высоком уровне по всей сарколемме. Действительно, некроз у дистрофиндефицитных мышей MDX происходит только один раз при высоком перинатальном уровне
атрофина снизился. Постнатально дистрофин заменяет атрофин в внесинаптическом отсеке
нормального мышечного волокна, оставшаяся экспрессия атрофина ограничена в зрелых
мышечных волокнах. Прямое доказательство способности атрофина функционально заменить
дистрофин происходит из экспериментов, демонстрирующих, что трансгенно управляемая
гиперэкспрессия атрофина может эффективно спасти дистрофин-дефицитных.
Таким образом, перспективная терапевтическая стратегия для МДД состоит в определении
молекул, которые модулируют экспрессию атрофина, активацию его промоутера. Ранее мы и
другие определили херегулин (HRG), как молекулу, способную активировать промоутер атрофина
через внеклеточный сигнал связанный с
киназа-зависимой активацией ETS связанных
транскрипционных факторов комплекса GABPα / β в культуре мышц. Полученные данные
свидетельствуют о терапевтическом потенциале этих молекул, если они будут доставлены в
дистрофин-дефицитные мышцы в естественных условиях. В этом исследовании мы проверили
способность HRG для улучшения дистрофического фенотипа у модели МДД- MDX мыши.
Материалы и методы
Мыши.
Мы получили когорты 4-недельных самцов дистрофин-дефицитных C57BL/10ScSn-Dmdmdx / J
(MDX) и C57BL/10ScSn (контроль) из лаборатории Джексона. MDX: utrn - / - дистрофин-атрофина
двойные мутанты были выведены из MDX и utrn - / - (атрофина-нуль-мутант) мышей, своего рода
подарок от Josh Sanes и Марк Грейди (Вашингтонский университет в Сент-Луисе). Все
эксперименты на животных были проведены в соответствии с датским и американским
законодательством.
Физиологические исследования.
Физиологическую оценку мышц проводили, как описано ранее. Короче говоря, длинный
разгибатель пальцев (EDL) был иссечен у 16-недельных MDX мышей, которым был введен три
раза в неделю в течение 3 месяцев пептид, кодирующий эпидермальный фактор роста-как, 71-ая
область человеческого HRG β1 (GenBank не M94166, аминокислотные остатки 176-246.
TSHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNE FTGDRCQNYVMASFYKHLGIEFMEAEELYQK) в PBS (R
& D Systems) или один PBS (контроль). Используемая доза- 8 мкг пептида на кг веса тела, и она
была
доставлена
через
интраперитонеальные
инъекции.
Впрыск
материала
свежеприготовленного путем разбавления в PBS 1 мкМ HRG в день инъекции. Рекомбинантный
пептид был экспрессирован в кишечной палочке и имел чистоту> 97%, как это определено путем
окрашивания серебром и эндотоксинна уровне <1,0 Ед на мкг пептида. Недавно иссеченный MDX
EDL взвешивают и помещают в специально построенный механизм, содержащей 1,8 ° привод от
двигателя микрометра (длина контроллер; точности, 2,5 мкм) и FT-03 датчик силы (Astro-Med,
West Warwick, RI). Мышцы были прикреплены с обоих концов с помощью 5-0 нейлона и
поддерживается в растворе Рингера (рН 7,4) при 24 ° С в течение всего срока эксперимента.
Стимулирование проводилось с использованием поля электродов, подключенных к S48
стимулятору. Сила эксцентричных сокращений (ECC) была рассчитана с помощью разницы
изометрической силы в течение 1-го и 10-го сокращения стандартного ECC протокола
[сверхмаксимальный стимул 700 мс (500-мс изометрическая фаза, 200-мс эксцентрической фазы);
удлинение L0 / 10; удлинение скорости, 0,5 L0/sec]. Данные были оцифрованы с помощью
PowerLab/8SP A / D конвертера и программного обеспечения (AD Instruments, Колорадо-Спрингс,
CO). В конце физиологического исследования мышцы были погружены в 0,5% оранжевый
краситель (Sigma) в растворе Рингера в течение 5 мин, заморожены в изопентане охлаждают в
жидком азоте и хранят при -80 ° C до гистологического анализа.
Морфологические исследования.
Ранее описанные методы были использованы для морфологического исследования. Вкратце, 12мкм серийные криосекции из EDL и передней большеберцовой мышцы(TA) от описанных ранее
16-недельных мышей MDX и ТП от обработанных / необработанных MDX: utrn - / - были
зафиксированы в смеси 1:1 ацетон / метанол в течение 5 мин при 4 ° C. Срезы были обработаны
гематоксилином и эозином (H & E), анти-ламининовыми антителами (1 мкг / мл, Sigma), и Hoechst
красителем
33342
(Sigma)
для
морфологического
исследования.
Непрямая
иммунофлюоресценция была выполнена с помощью аффинно очищенных антител против BH11
атрофина (7, 14) (1 мкг / мл), родамин-конъюгированного бунгаротоксина (4 мкг / мл,
молекулярных зондов). Слайды были рассмотрены с помощью микроскопа Olympus BX51
оснащенного эпифлуоресцентной оптикой и Nikon Coolpix 995 цифровой камерой.
Молекулярные и биохимические исследования.
Молекулярная и биохимическая оценка атрофина использовала ранее описанные методы и
реагенты (7, 19). Короче говоря, РНК выделяли из замороженных аликвот мышцы. Пять мкг РНК
преобразовано обратной транскрипцией в кДНК с помощью Invitrogen Life Technologies, и 10%
объема очищеной кДНК использовали в качестве шаблона для полуколичественного ПЦР,
используя праймеры для мышиного атрофина. В качестве внутреннего контроля для повышения
эффективности обратной транскрипции, мы одновременно усиливали глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназой. ПЦР-продукты были размещены на 2% агарозном геле, и количественная
реакция была выполнена на аликвоты, которые в пределах линейного диапазона усиления для
каждой реакции с помощью Typhoon 8600 сканера и imagequant 1,2 программного обеспечения
(Amersham Pharmacia). Для вестерн-блоттинга 50-мг замороженной мышцы TA
взвешивали, гомогенизировали в буфере для образцов, и разместили на 4-12%
SDS
полиакриламидном геле (BioWhittaker). Белки размещенына нитроцеллюлозные мембраны (BioRad). Эффективность передачи и даже загрузка полосы была проверена с помощью окрашивания
Ponceau S. Мембраны были исследованы с аффинно очищенными BH 11 атрофина антител (7) (1
мкг / мл), исследовали Typhoon 8600 сканером с помощью козьих анти-кроличьих антител
(Pierce) и SuperSignal Западной Dura ECL комплект (Pierce ). imagequant 1,2 программное
обеспечение было использовано для количественной оценки. Сывороточная креатинкиназа (CK)
была измерена с помощью косвенных колориметрических наборов для анализа и стандартов.
Статистический анализ.
Критерии Стьюдента были использованы в данном исследовании для расчета P для определения
статистической значимости. Все результаты представлены как среднее ± SEM; HRG обращение
MDX отображаются красным цветом, а также контроль MDX показан синим цветом. Пунктирные
линии представляют данные из подобранных по возрасту (нормальный) C57BL/10 мышей.
Результаты
Четырех-недельным самцам мышей MDX вводили через день небольшой ≈ 8-кДа пептид,
содержащий эпидермальный фактор роста, как область HRG эктодомена (доза 8 мг / кг в PBS
обработанной MDX группы) или один PBS (контроль MDX группа) в течение 3 месяцев, а затем
убиты, и различные группы мышц были вскрыты и исследованы. Мы провели вестерн блот и
иммунофлюоресценцию с целью определения степени и распределения регуляции атрофина в
естественных условиях. Экспрессия атрофина увеличилась ≈ в 2,7 раза на уровне белка в
очищенной по сравнению с контрольными мышами MDX (рис. 1а); подобный рост был замечен в
HRG обработанных культивируемых клетках мышц. В мышечных волокнах у мышей MDX
регуляции атрофина распространилась по всей сарколемме(рис. 1б). Увеличение маркировки
сарколеммы было также отмечено в регионах мышц с нехваткой синапсов, как подтверждено
отсутствием маркировки бунгаротоксина(рис. 1б ). Полуколичественный ОТ-ПЦР показал, что
атрофин мРНК регулируется ≈ в 1,8-кратном увеличении (п = 24, р <0,005, данные не приведены).
Эти наблюдения согласуются с уровнем и распределением атрофина по прогнозам, в зависимости
от времени ход развития понижающей регуляции и трансгенных исследований.
Чтобы определить, является ли регуляция атрофина достигнутая в естественных условиях связана
с уменьшением мышечной патологии, мы проанализировали EDL и TA мышцы обработанных и
контрольных мышей MDX. TA был использован в дополнение к EDL, потому что MDX мыши имеют
время от времени очаги дегенерации в возрасте 16 недель в мышцы конечностей. Криосекции H
& E-окрашенные показывают, что у мышей MDX было меньше дегенерации и некроза по
сравнению с контрольной MDX группой (рис. 2а), что соответствует> 2-кратному снижению числа
очагов некроза у мышей MDX (рис. 2б). Никаких существенных изменений не было отмечено в
одной области волокна, площадь поперечного сечения, или общего количества мышечных
волокон в обработанных MDX по сравнению с контрольными мышами MDX (данные не показаны).
Потому что MDX мышцы постоянно регенерирует в ответ на хроническое воспаление и
повреждение мышц, они имеет гораздо больший процент централизованно зарождающихся
волокон (УТС) по сравнению с нормальными мышами. Действительно, CNF обычно используется в
качестве индекса для мониторинга эффективности испытания генной терапии у мышей MDX.
Существовало значительное снижение CNF доли у обработанных MDX по сравнению с
контрольной MDX EDL (рис. 2, 65,9 ± 3,8% против 80,0 ± 0,1%, п мышей = 20, N = 19787 волокна, р
<0,01). В соответствии с сокращением патологии мышц, значительное снижение (≈ 50%) было
отмечено в уровне сывороточной КФК по сравнению с уровнями, которые наблюдаются в
возрастной контрольной MDX (рис. 2). Снижение мышечной дистрофии, доли CNF, и КФK уровня
предлагают морфологические и биохимические признаки уменьшения патологии мышц HRGобработанных мышей MDX. Двойные мутанты имеют очень короткую продолжительность жизни,
имеют недостаточный вес, и серьезную патологию мышц. Нет отмечено пользы по отношению к
жизни, весу тела и мышечной патологии (рис. 3), что свидетельствует зависимости HRGопосредованного улучшения атрофина у мышей MDX.
Для количественной оценки степени функционального улучшения в мышцах в результате
регуляции атрофина, мы проанализировали физиологические свойства скелетных мышц. Свежий
расчлененный EDL был протестирован в бывших естественных условиях в ванне, оснащенной
преобразователем силы и шаговым
двигателем, контроллером, для определения их
механических свойств. MDX EDL имеет хорошую чувствительность к повреждению путем
увеличения сокращений в результате неспособности генерировать адекватные силы после серии
САОР (22, 29, 30). Пост-ECC падение силы (силу падения) возникает из-за повышенного
напряжения сарколеммы как следствие дефицит дистрофина. Мы увидели значительное
снижение в пост-ECC силе падения у мышей MDX (рис. 4, б, 54,3 ± 3,8% против 67,9 ± 3,8%,
соответственно; п = 20, р <0,02). Кроме того, окрашивание EDL процион оранжевым красителем
после ECC показали, что мыши MDX были менее чувствительны к мембранному повреждению во
время ECC, о чем свидетельствует их способность исключать молекулы красителя (рис. 4 Вставки и
с, 7,8 ± 1,4% против 20,4 ± 3,8%, соответственно; п мышей = 20, N = 6095 волокон, р <0,03). Хотя
было заметное улучшение в пост-ECC изометрической силе, генерируемой в группе, получавшей
лечение, конкретные силы как таковые не были увеличены. Интересно, что природа
физиологического улучшения похожа на улучшение (повышение устойчивости к повреждениям за
счет удлинения сокращений в сочетании с сохранением удельной силы), используя внутренний
усеченный R4-R23 микродистрофин построенный в вирусных векторах на основе генной терапии
исследуемых мышей MDX.
Обсуждение
В этом исследовании мы показали, что введение небольшого пептида HRG простой инъекцией
привело к регуляции атрофина и значительному функциональному улучшению дистрофического
фенотипа у MDX мышей в естественных условиях. Стратегия введения HRG не должна быть
использована в изоляции, она также может быть использована в сочетании с другими
терапевтическими вмешательствами, таких как стволовые клетки , олигонуклеотидами,
вирусныхми векторами на основе генной терапии, или блокадой миостатина. Действительно,
недавние исследования использовали клетки-предшественники в системной доставке у человека
к дистрофическим мышцам, демонстрируют преимущества комбинаторных
стратегий для мышечной дистрофии. По характеру физиологической пользы отмеченой в этом
исследовании, HRG-опосредованная регуляция атрофина могла бы синергетически усиливать
преимущества сопутствующей блокады миостатина в MDX мышах, однако эксперименты должны
быть выполнены, чтобы проверить эту гипотезу.
Концептуально, послеродовая активация промотора атрофина увеличивает свое выражение,
похожа на "реактивацию" стратегии, используемой для увеличения фетального гемоглобина
после рождения, в качестве дополнения к другим методам лечения в серповидно-клеточной
анемии. Сродни препаратам, используемым для плода для реактивации гемоглобина, HRG,
скорее всего, имеет плеотрофные эффекты и активировать гены, которые имеют сходные мотивы,
как атрофин. Улучшение фенотипа, о котором сообщалось здесь не столь резким, как сообщается
при использовании трансгенных средства для управления экспрессией атрофина у мышей MDX.
Это различие может быть связано с уровнем регуляции атрофина, которая достигнута. Однако, в
отличие от исследований, в которых трансгенные мыши были созданы или вирусные векторы,
используемые для достижения регуляции атрофина, промоутер активации атрофина через
небольшой пептид имеет фундаментальное преимущество избегая иммунного ответа и проблем
с доставкой, связанных с зародышевой линией модификации и / или соматической генной
терапией пациентов с МДД.
Ссылки:
↵ Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Middlesworth, W., Colletti, C. A., Aldridge, J., Fischbeck, K. H., Bartlett,
R., Pericak-Vance, M. A., Roses, A. D. & Kunkel, L. M. (1985) Nature 316 , 842–845. CrossRef
Medline
Monaco, A. P., Neve, R. L., Colletti-Feener, C., Bertelson, C. J., Kurnit, D. M. & Kunkel, L. M. (1986) Nature
323 , 646–650. CrossRef
Medline
↵ Koenig, M., Hoffman, E. P., Bertelson, C. J., Monaco, A. P., Feener, C. & Kunkel, L. M. (1987) Cell 50 ,
509–517. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Hoffman, E. P., Brown, R. H., Jr., & Kunkel, L. M. (1987) Cell 51 , 919–928. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Ibraghimov-Beskrovnaya, O., Ervasti, J. M., Leveille, C. J., Slaughter, C. A., Sernett, S. W. & Campbell, K.
P. (1992) Nature 355 , 696–702. CrossRef
Medline
↵ Love, D. R., Hill, D. F., Dickson, G., Spurr, N. K., Byth, B. C., Marsden, R. F., Walsh, F. S., Edwards, Y. H. &
Davies, K. E. (1989) Nature 339 , 55–58. CrossRef
Medline
↵ Khurana, T. S., Hoffman, E. P. & Kunkel, L. M. (1990) J. Biol. Chem. 265 , 16717–16720. Abstract/FREE
Full Text
↵ Nguyen, T. M., Ellis, J. M., Love, D. R., Davies, K. E., Gatter, K. C., Dickson, G. & Morris, G. E. (1991) J.
Cell Biol. 115 , 1695–1700. Abstract/FREE Full Text
↵ Ohlendieck, K., Ervasti, J. M., Matsumura, K., Kahl, S. D., Leveille, C. J. & Campbell, K. P. (1991) Neuron
7 , 499–508. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Tinsley, J. M., Blake, D. J., Roche, A., Fairbrother, U., Riss, J., Byth, B. C., Knight, A. E., Kendrick-Jones, J.,
Suthers, G. K., Love, D. R., et al. (1992) Nature 360 , 591–593. CrossRef
Medline
↵ Matsumura, K., Ervasti, J. M., Ohlendieck, K., Kahl, S. D. & Campbell, K. P. (1992) Nature 360 , 588–591.
CrossRef
Medline
↵ Winder, S. J., Hemmings, L., Maciver, S. K., Bolton, S. J., Tinsley, J. M., Davies, K. E., Critchley, D. R. &
Kendrick-Jones, J. (1995) J. Cell Sci. 108 , 63–71. Abstract/FREE Full Text
↵ Clerk, A., Morris, G. E., Dubowitz, V., Davies, K. E. & Sewry, C. A. (1993) Histochem. J. 25 , 554–561.
Medline
Web of Science
↵ Khurana, T. S., Watkins, S. C., Chafey, P., Chelly, J., Tome, F. M., Fardeau, M., Kaplan, J. C. & Kunkel, L.
M. (1991) Neuromuscul. Disord. 1 , 185–194. CrossRef
Medline
↵ Tinsley, J. M., Potter, A. C., Phelps, S. R., Fisher, R., Trickett, J. I. & Davies, K. E. (1996) Nature 384 ,
349–353. CrossRef
Medline
↵ Tinsley, J., Deconinck, N., Fisher, R., Kahn, D., Phelps, S., Gillis, J. M. & Davies, K. (1998) Nat. Med. 4 ,
1441–1444. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Deconinck, N., Tinsley, J., De Backer, F., Fisher, R., Kahn, D., Phelps, S., Davies, K. & Gillis, J. M. (1997)
Nat. Med. 3 , 1216–1221. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Dennis, C. L., Tinsley, J. M., Deconinck, A. E. & Davies, K. E. (1996) Nucleic Acids Res. 24 , 1646–1652.
Abstract/FREE Full Text
↵ Khurana, T. S., Rosmarin, A. G., Shang, J., Krag, T. O., Das, S. & Gammeltoft, S. (1999) Mol. Biol. Cell 10 ,
2075–2086. Abstract/FREE Full Text
↵ Gramolini, A. O., Angus, L. M., Schaeffer, L., Burton, E. A., Tinsley, J. M., Davies, K. E., Changeux, J. P. &
Jasmin, B. J. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 , 3223–3227. Abstract/FREE Full Text
↵ Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M. & Sweeney, H. L. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90 , 3710–3714. Abstract/FREE Full Text
↵ Moens, P., Baatsen, P. H. & Marechal, G. (1993) J. Muscle Res. Cell Motil. 14 , 446–451. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Khurana, T. S. & Davies, K. E. (2003) Nat. Rev. Drug Discovery 2 , 379–390. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A. & Sloper, J. C. (1988) Neuropathol. Appl. Neurobiol. 14 ,
53–70. Medline
Web of Science
↵ Grady, R. M., Merlie, J. P. & Sanes, J. R. (1997) J. Cell Biol. 136 , 871–882. Abstract/FREE Full Text
Deconinck, A. E., Potter, A. C., Tinsley, J. M., Wood, S. J., Vater, R., Young, C., Metzinger, L., Vincent, A.,
Slater, C. R. & Davies, K. E. (1997) J. Cell Biol. 136 , 883–894. Abstract/FREE Full Text
↵ Grady, R. M., Teng, H., Nichol, M. C., Cunningham, J. C., Wilkinson, R. S. & Sanes, J. R. (1997) Cell 90 ,
729–738. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Deconinck, A. E., Rafael, J. A., Skinner, J. A., Brown, S. C., Potter, A. C., Metzinger, L., Watt, D. J.,
Dickson, J. G., Tinsley, J. M. & Davies, K. E. (1997) Cell 90 , 717–727. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Brooks, S. V. (1998) J. Muscle Res. Cell Motil. 19 , 179–187. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Gillis, J. M. (1999) J. Muscle Res. Cell Motil. 20 , 605–625. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Harper, S. Q., Hauser, M. A., DelloRusso, C., Duan, D., Crawford, R. W., Phelps, S. F., Harper, H. A.,
Robinson, A. S., Engelhardt, J. F., Brooks, S. V., et al. (2002) Nat. Med. 8 , 253–261. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Gussoni, E., Soneoka, Y., Strickland, C. D., Buzney, E. A., Khan, M. K., Flint, A. F., Kunkel, L. M. &
Mulligan, R. C. (1999) Nature 401 , 390–394. CrossRef
Medline
↵ Lu, Q. L., Mann, C. J., Lou, F., Bou-Gharios, G., Morris, G. E., Xue, S. A., Fletcher, S., Partridge, T. A. &
Wilton, S. D. (2003) Nat. Med. 9 , 1009–1014. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Bertoni, C., Lau, C. & Rando, T. A. (2003) Hum. Mol. Genet. 12 , 1087–1099. Abstract/FREE Full Text
↵ Gilbert, R., Nalbantoglu, J., Petrof, B. J., Ebihara, S., Guibinga, G. H., Tinsley, J. M., Kamen, A., Massie,
B., Davies, K. E. & Karpati, G. (1999) Hum. Gene Ther. 10 , 1299–1310. CrossRef
Medline
Web of Science
↵ Bogdanovich, S., Krag, T. O., Barton-Davis, E. R., Morris, L. D., Whittemore, L., Ahima, R. & Khurana, T.
S. (2002) Nature 420 , 418–421. CrossRef
Medline
↵ Bachrach, E., Li, S., Perez, A. L., Schienda, J., Liadaki, K., Volinski, J., Flint, A., Chamberlain, J. & Kunkel,
L. M. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 , 3581–3586. Abstract/FREE Full Text
↵ Olivieri, N. F. & Weatherall, D. J. (1998) Hum. Mol. Genet. 7 , 1655–1658. Abstract/FREE Full Text
Оригинал статьи: http://www.pnas.org/content/101/38/13856.long
Переведено проектом МОЙМИО www.mymio.org