xхiii е ж е г о д н а я н а у ч н а я
advertisement
1 ФЕДЕР АЛЬНОЕ ГОСУД АРСТВЕННОЕ БЮД ЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ Н АУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК XХIII Е Ж Е Г О Д Н А Я Н А У Ч Н А Я К О Н Ф Е Р Е Н Ц И Я 23-25 июня 2014 г., Москва 2 ПРОГРАММА КОНФЕРЕНЦИИ 23 июня, понедельник Утреннее заседание, начало в 10 часов Открытие конференции Вступительное слово члена-корреспондента РАН С.В. КОСТРОВА (20 мин) Председатель - Н.Ф. Мясоедов Е.Д. СВЕРДЛОВ – советник РАН. «Результаты доклинических испытаний генно-терапевтического средства «АнтионкоРАН-М». (30 мин) В.А. ГВОЗДЕВ – зав. Отделом молекулярной генетики клетки (ОМГК). «Ядерный белок рiwi в репрессии транспозонов в оогенезе дрозофилы (Результаты полногеномного СHIP-SEQ анализа)». (30 мин) Ю.Я. ШЕВЕЛЕВ - зав. Лабораторией анализа регуляции генов ОМГК. «Роль гистонацетилтрансферазы dmHAG407, нуклеопорина dELYS и ядерной ламины в поддержании связи хромосом с ядерной оболочкой». (25 мин) П е р е р ы в (15 мин) Е.Г. ПАСЮКОВА - зав. Лабораторией геномной изменчивости ОМГК. «Исследование механизмов контроля продолжительности жизни у дрозофилы». (25 мин) А.И. КАЛМЫКОВА – руководитель Группы исследования геномных повторов эукариот. «Механизмы регуляции экспрессии теломерных ретротранспозонов в герминальных тканях Drosophila». (20 мин) Дискуссия (10 мин) 3 23 июня, понедельник Вечернее заседание, начало в 16 часов Председатель – И.А. Хмель А.В. КУЛЬБАЧИНСКИЙ - зав. Лабораторией молекулярной генетики микроорганизмов ОМГК. «Структурно-функциональные исследования РНК-полимеразы и механизмов регуляции транскрипции у бактерий». (25 мин) М.А. ПЕТРОВА - зав. Сектором анализа и хранения микроорганизмов ЛМГМ ОМГК. «Изучение молекулярно-генетической структуры и свойств плазмид и бактериофагов, изолированных из древних и современных штаммов природных бактерий». (20 мин) Дискуссия (10 мин) 4 24 июня, вторник Утреннее заседание, начало в 10 часов Председатель – В.З. Тарантул А.А. АЛЕКСАНДРОВ - зав. Лабораторией биоинформатики. «Подходы к моделированию генетических и биохимических процессов. Анализ альфа-сателлитов ближайшего родственника человека - шимпанзе». (25 мин) Дискуссия (10 мин) С.А. ЛИМБОРСКАЯ, Л.В. ДЕРГУНОВА, О.Ю. СУДАРКИНА, А.В. РОЖКОВА, И.Б. ФИЛИППЕНКОВ - зав. Отделом молекулярных основ генетики человека (ОМОГЧ «Особенности экспрессии гена сфингомиелинсинтазы 1 в тканях человека». (30 мин) П.А. СЛОМИНСКИЙ - зав. Лабораторией молекулярных основ наследственных заболеваний ОМОГЧ. «Изучение генетических факторов риска мультифакториальных неврологических заболеваний» (25 мин) Дискуссия (10 мин) А.А. ВОЛОДИН - зав. Лабораторией молекулярной биофизики. «Влияние ионов двухвалентных металлов на реакцию обмена нитей ДНК в системе коротких олигонуклеотидов». (25 мин). Дискуссия (10 мин) 5 24 июня, вторник Вечернее заседание, начало в 16 часов Председатель – Е.Г. Пасюкова В.З. ТАРАНТУЛ - руководитель Отдела вирусной и клеточной молекулярной генетики (ОВКМГ). «Зависимость некорректной активности ДНК-полимераз от ионов металлов. Возможный механизм нейротоксичности ионов марганца». (30 мин) И.А. ГРИВЕННИКОВ - зав. Лабораторией молекулярной генетики соматических клеток ОВКМГ. «Регуляция процессов пролиферации, дифференцировки и функционирования соматических клеток млекопитающих с помощью генетических и химических факторов». (25 мин) А.Г. КОБЫЛЯНСКИЙ – руководитель Центра клеточных и генных технологий (ЦКГТ) «Системная оценка биологических свойств лекарственных субстанций с использованием нормальных и генно-модифицированных эмбриональных стволовых клеток» (20 мин) В.В. ДЕМКИН - зав. Лабораторией молекулярной диагности-ки. «Генетические маркеры и популяционная вариабельность генитальных микоплазм и лактобактерий». (25 мин) Дискуссия (10 мин) 6 25 июня, среда Утреннее заседание, начало в 10 часов Председатель – В.А. Гвоздев Н.Ф. МЯСОЕДОВ - руководитель Отдела химии физиологически активных веществ (ОХФАВ). «Исследование структуры и функции природных пептидов с целью создания новых лекарственных препаратов». (30 мин) С.И. ШРАМ – зав. Сектором нейрофармакологии ОХФАВ. «Структурно-функциональные исследования соединений с нейропротекторным действием». (20 мин) Дискуссия (10 мин) П е р е р ы в (15 мин) С.В. КОСТРОВ - руководитель Отдела молекулярногенетических основ биотехнологии и белковой инженерии (ОМГОБиБИ). «Уровень мРНК гена PCSK9 повышен в раковых опухолях пищевода человека». (30 мин) И.А. ХМЕЛЬ - зав. Лабораторией регуляции экспрессии генов микроорганизмов ОМГОБиБИ. «Химическая коммуникация бактерий: молекулярно-генетические и функциональные исследования». (25 мин) К.В. СЕВЕРИНОВ – зав. Лабораторией регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот. «Механизм, регуляция и эволюция системы адаптивной иммунности прокариот CRISPR/Cas». (25 мин) Е.В. ГАСАНОВ – зав. Лабораторией молекулярной генетики эмбрионального развития. «Роль нейротрофического фактора головного мозга (BDNF)в развитии боковой линии Danio rerio». (25 мин) Дискуссия (10 мин) Закрытие конференции 7 ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ЯДЕРНЫЙ БЕЛОК PIWI В РЕПРЕССИИ ТРАНСПОЗОНОВ В ООГЕНЕЗЕ ДРОЗОФИЛЫ (РЕЗУЛЬТАТЫ ПОЛНОГЕНОМНОГО СHIP-SEQ АНАЛИЗА) В.А. Гвоздев Лаборатория биохимической генетики животных Отдела молекулярной генетики клетки (ОМГК) С помощью мутации piwiNt, нарушающей транспорт белка Piwi в ядро, продолжено исследование роли этого белка в процессах модификации хроматина транспозонов в оогенезе. Использование piwiNt представляет определенные методические преимущества по сравнению c подходами, которые базировались на исследовании известных мутаций в гене piwi или нокдауна этого гена. Показано для ряда герминальных транспозонов существенное увеличение в хроматине уровня позитивной гетерохроматиновой модификации Н3К4me2, но не негативной H3K9me3, а также содержания белка HP1 при мутации piwiNt. Следовательно, Piwi может подавлять транскрипцию транспозонов, минуя метилирование H3K9. Этот результат согласуется с представлениями о природе модификаций хроматина при репрессии транспозона L1 в клетках человека. Наиболее сильная репрессия с участием Piwi выявлена для транспозонов, обнаруживающих заметный уровень транскрипции в норме, судя по присутствию в хроматине позитивной модификации H3K4me2. Полученный результат соответствует представлению (модель Т.Чека для репрессорных комплексов Polycomb) о существовании Рiwi-зависимой системы РНК-cайленсинга, сканирующей хроматин в составе комплекса РНК-связывающих белков. В целом полученные результаты указывают на возможность присутствия независимых от Рiwi репрессорных модификаций HP1/H3K9me3 в хроматине транспозонов наряду с необязательностью их присутствия для репрессии этих элементов. Потеря ядерного Piwi не сказывалась заметно на модификациях хроматина кластеров piРНК, участвующих в сайленсинге транспозонов. 8 Геном клетки-хозяина не отвечал на отсутствие Piwi в ядре, за исключением увеличения количества транскриптов малых ядерных РНК, участвующих в сплайсинге. Полученный результат привлек наше внимание к возможной роли белка Piwi в функционировании внутриядерных компартментов и прежде всего самого крупного – ядрышка. Показана внутиядерная колокализация Рiwi с белками - маркерами ядрышка. РОЛЬ ГИСТОНАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ dmHAG407, НУКЛЕОПОРИНА dELYS И ЯДЕРНОЙ ЛАМИНЫ В ПОДДЕРЖАНИИ СВЯЗИ ХРОМОСОМ С ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКОЙ Ю.Я. Шевелев Лаборатория анализа регуляции генов ОМГК Методом флуоресцентной in situ гибридизации были проанализированы положения двух хромосомных районов относительно ядерной оболочки в культуре клеток и в крыловых имагинальных дисках после искусственной экспрессии гистонацетилтрансферазы dmHAG407, а также в герминальных клетках семенников самцов дрозофилы - при нокдауне гена dmHAG407, в норме активно экспрессирующегося лишь в этом типе клеток. Доля сигналов района 60D в периферическом слое толщиной 0.4 mkm была достоверно снижена в культуре клеток после экспрессии в них dmHAG407 по сравнению с контрольными клетками без экспрессии. В то же время, не удалось детектировать достоверного смещения районов 60D и 22A от ядерной оболочки ни в крыловых имагинальных дисках при экспрессии dmHAG407, ни в сперматогониях и сперматоцитах при нокдауне этого гена, что указывает на незначительное, зависящее от района и типа клеток влияние данной гистонацетилтрансферазы на положение локусов относительно ядерной оболочки. В рамках исследования функций dELYS дрозофилы методом коиммунопреципитации было показано вхождение dELYS в единый комплекс с Nup107-Nup160 субкомплексом ядерных пор. При транзиентной трансфекции клеток S2 конструкцией pActEGFP-dELYS наблюдалась флуоресценция EGFP-dELYS как на периферии ядра, так и в виде неоднородного окрашивания 9 нуклеоплазмы, что, вероятно, отражает способность dELYS связываться с хроматином. Иммуноокрашивание политенных хромосом слюнных желез дрозофилы антителами к dELYS, Ago2 и РНК-полимеразе II выявляет колокализацию dELYS с Ago2, но не с полимеразой, что также подтверждает способность dELYS связываться с участками неактивного хроматина. При иммуноокрашивании находящихся в метафазе клеток S2 антителами к dELYS и альфа-тубулину не обнаруживается свойственная ELYS млекопитающих локализация на кинетохорах. Эти результаты в совокупности с полученными ранее показывают, что dELYS дрозофилы является компонентом ядерных пор, взаимодействует с хроматином и необходим для локализации хромосомных районов вблизи ядерной оболочки. Методом DamID получены полногеномные профили связывания ламина в ранних сперматоцитах и нейронах дрозофилы. Сравнение этих профилей с таковыми для клеток Kc (van Bemmel et al, 2010) выявляет как наличие общих ламина-ассоциированных доменов в разных типах клеток, так и существование определенной вариабельности между разными клетками. Провалы в профиле связывания ламина в ранних сперматоцитах частично совпадают с нахождением семенникспецифичных генов в этих участках генома, что подтверждает обнаруженную ранее корреляцию между экспрессией генов и их положением вдали от ядерной оболочки. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ КОНТРОЛЯ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ У ДРОЗОФИЛЫ Е.Г. Пасюкова Лаборатория геномной изменчивости ОМГК В 2013 году работа лаборатории развивалась в нескольких направлениях. В результате совместной работы с Петербургским институтом ядерной физики им. Б.П. Константинова были освоены методы описания структуры и оценки активности нейро-мышечных синапсов у дрозофилы. Это позволило охарактеризовать влияние изменений активности исследуемых в лаборатории генов, контролирующих, с одной стороны, 10 развитие и функционирование нервной системы, а с другой, продолжительность жизни, на особенности строения и работы синаптических контактов. Было показано, что сверхэкспрессия гена shaggy в нервной системе приводит к снижению активности нейро-мышечных синапсов и уменьшению продолжительности жизни. Изменение экспрессии гена Lim3 в нервной и мышечной системе не влияло на активность синапсов, но приводило к изменению количества ацетилированного альфа-тубулина в нервных окончаниях. Работа в этом направлении развивается, поскольку позволяет напрямую связать изменения продолжительности жизни, выявленные нами ранее у особей с мутациями исследуемых генов, с изменениями структуры и функции нервной системы. Ранее в совместной работе с Институтом геронтологии им. Д. Ф. Чеботарева НАМН Украины мы показали, что неспецифические ингибиторы деацетилаз гистонов, бутират натрия и трихостатин А, влияют на продолжительность жизни дрозофилы. Мы предположили, что снижение активности глобальных регуляторов транскрипции, если оно действительно возникает под действием ингибиторов, должно повлиять на уровень транскрипции многих генов. Для проверки этого предположения мы исследовали влияние двух данных веществ на транскрипцию. В 2013 году у самцов и самок, получавших с кормом бутират натрия и трихостатин А, было охарактеризовано изменение транскриптома. В настоящее время полученные данные обрабатываются. Далее для дальнейшего более тщательного и подробного исследования будут отобраны гены, наиболее сильно изменившие экспрессию в условиях ингибирования деацетилаз гистонов. В конце 2010 года было начато, а в последующие годы продолжено создание коллекции линий мух, отловленных в природной популяции Александров. Около 200 линий, каждая из которых была заложена от одной самки, выловленной в природе, были подвергнуты инбридингу или изогенизированы для получения генетически однородного материала. Предварительные эксперименты по измерению продолжительности жизни показали, что линии существенно различаются по этому признаку, что делает перспективным их использование для дальнейшего анализа структурнофункционального разнообразия генов, характеризующего природную популяцию Александров. В 2014 году было 11 проведено секвенирование регуляторной области гена Lim3 в линиях 2010 и 2011 года, что позволило охарактеризовать сравнительную изменчивость этой области в двух популяциях – Александров, Россия и Raleigh, США, исследованной нами ранее – обитающих в различных экологических условиях и географических районах. По качественным и количественным показателям изменчивости заметных различий между выборками разных лет не выявлено. Сравнение генетической изменчивости в двух популяциях позволяет говорить о существенном сходстве паттернов полиморфных сайтов. Публикации Отдела молекулярной генетики клетки (ЛБГЖ, ЛАРГ, ЛГИ, СГВ): 1. Kibanov M.V., Kotov A.A., Olenina L.V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 2013, 436, 55-64. 2. Olovnikov I., Ryazansky S., Shpiz S., Lavrov S., Abramov Y., Vaury C., Jensen S., Kalmykova A. De novo piRNA cluster formation in the Drosophila germ line triggered by transgenes containing a transcribed transposon fragment. Nucleic Acids Res. 2013, 41, 5757-5768. 3. Гвоздев В.А. Регуляторные «короткие» РНК. Биохимия. 2013, 78, 633-634. 4. Лавров С.А., Шацких А.С., Кибанов М.В., Гвоздев В.А. Транскрипционная инактивация генов при эффекте положения у Drosophilamelanogaster коррелирует на уровне отдельных клеток с их перемещением в гетерохроматиновый компартмент ядра. Мол. Биология. 2013, 47, 286-291. 5. Шацких А.С., Гвоздев В.А. Формирование гетерохроматина и транскрипция в связи с транс-инактивацией генов и их пространственной организацией в ядре. Биохимия. 2013, 78, 684-694. 6. Якушев Е.Ю., Соколова О.А., Гвоздев В.А., Кленов М.С. Полифункциональность белков PIWI в определении судьбы стволовых клеток. Биохимия. 2013, 78, 763-770. 7. Пашковский П.П., Рязанский С.С. Биогенез, эволюция и функции микро РНК растений. Биохимия. 2013, 78, 811-824. 8. Вайсерман А.М., Кошель Н.М., Забуга О.Г., Коляда А.К., Рощина Н.В., Пасюкова Е.Г. Определение геропротекторного потенциала бутирата натрия у Drosophilamelanogaster: отсроченные эффекты. Успехи геронтологии. 2013, 26, 111-116. 12 9. Mukha D.V., Pasyukova E.G., Kapelinskaya T.V., Kagramanova A.S. Endonuclease domain of the Drosophila melanogaster R2 nonLTR retrotransposon and related retroelements: a new model for transposition. Front. Genet. 2013, 4, 63. 10. Alcedo J., Flatt T., Pasyukova E.G. Neuronal inputs and outputs of aging and longevity. Front. Genet. 2013, 4, 71. 11. Alcedo J., Flatt T., Pasyukova E. G. The role of the nervous system in aging and longevity. Front. Genet. 2013, 4, 124. МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ТЕЛОМЕРНЫХ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ В ГЕРМИНАЛЬНЫХ ТКАНЯХ DROSOPHILA А.И.Калмыкова Лаборатория исследования геномных повторов эукариот Важнейшей функцией теломер является удлинение концов хромосом. Этот процесс происходит в норме только в герминальных и стволовых клетках организма. Несмотря на особую роль теломер в герминальных клетках, биология теломер в этих клетках изучена мало. Можно предположить, что особые функции теломер в герминальных тканях обеспечиваются специфичными для этих тканей механизмами. У всех организмов удлинение теломерной ДНК происходит по механизму обратной транскрипции на матрице теломерной РНК. У дрозофилы теломерную ДНК составляют специфичные теломерные ретротранспозоны. Однако многие компоненты теломерного белкового комплекса высоко консервативны, несмотря на отличия в структуре теломерной ДНК. Используя Drosophila, как модельный объект, мы исследуем особенности функционирования теломер в герминальных тканях самок. Мы показали, что деаденилазный комплекс Ccr4-Not1 участвует в функционировании теломер в яичниках дрозофилы. Нарушение работы генов ccr4, pop2 и not1, кодирующих компоненты мультифункционального комплекса Ccr4-Not1, приводит к мощному накоплению транскриптов теломерного ретротранспозона НеТ-А в яичниках. Показано, что в норме транскрипты НеТ-А практически лишены поли(А) хвоста, в то время как нарушение работы комплекса Ccr4-Not1 сопровождается значительным удлинением длины поли(А) 13 хвоста у транскриптов НеТ-А. Транскрипты НеТ-А в норме обнаруживаются в деаденилированном состоянии в ядерной фракции РНК, что предполагает активность деаденилазного комплекса в ядре. Наконец, показано, что при нарушении работы комплекса Ccr4-Not1 происходят различные митотические нарушения в раннем эмбриональном развитии, приводящие к повышенному уровню летальности эмбрионов. Часто наблюдаемыми митотическими дефектами являются слияния и нерасхождения хромосом в митозах. Мы предполагаем, что это является следствием нарушения сборки теломерного защитного комплекса. Белок GAG, кодируемый транскриптами НеТ-А, является компонентом этого комплекса. Возможно, статус полиаденилирования транскриптов НеТ-А влияет на эффективность их трансляции и количество кодируемого ими теломерного белка GAG, что нарушает гомеостаз теломерного комплекса. Публикации Лаборатории исследования геномных повторов эукариот: 1. Shpiz S., Kalmykova A., Analyses of piRNA-mediated transcriptional transposon silencing in Drosophila: Nuclear run-on assay on ovaries. Mikiko C. Siomi (ed.), PIWI-Interacting RNAs: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 2013, 1093, 149-160. 2. Shpiz S., Lavrov S., Kalmykova A. Combined RNA/DNA fluorescence in situ hybridization on whole mount Drosophila ovaries. Mikiko C. Siomi (ed.), PIWI-Interacting RNAs: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1093, 161-169, 2013. 3. Olovnikov I, Ryazansky S, Shpiz S, Lavrov S, Abramov Y, Vaury C, Jensen S, Kalmykova A. De novo piRNA cluster formation in the Drosophila germ line triggered by transgenes containing a transcribed transposon fragment. Nucleic Acids Res. 2013, 41: 5757-68. 4. Оловников И.А., Калмыкова А.И. piРНК кластеры как основной источник коротких РНК в герминальных тканях животных. Биохимия, 2013,78: 647– 662. 5. Olovnikov I., Chan K., Sachidanandam R., Newman D.K., Aravin A.A. Bacterial Argonaute samples the transcriptome to identify foreign DNA. Mol. Cell, 2013, 51: 594-605. 14 СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РНКПОЛИМЕРАЗЫ И МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У БАКТЕРИЙ А.В. Кульбачинский Лаборатория молекулярной генетики микроорганизмов ОМГК РНК-полимеразы (РНКП) всех бактерий имеют консервативную структуру активного центра и используют одинаковый механизм синтеза РНК. В то же время, бактериальные РНКП могут значительно различаться по своим каталитическим свойствам, в частности, в зависимости от различной адаптации клеток. Кроме того, активность РНКП регулируется большим числом транскрипционных факторов, как универсальных, так и видоспецифических, а также кодируемых бактериофагами. В течение последнего года нами продолжены исследования механизмов работы бактериальной РНКП и ее регуляции на разных стадиях транскрипции. 1. Продолжено исследование структурных перестроек активного центра РНКП, происходящих в процессе катализа. Изучено влияние на активность РНКП мутаций в ключевых элементах активного центра, участвующих в синтезе и расщеплении РНК. Выявлены характерные различия в термодинамических параметрах реакции между РНКП мезофильных и термофильных бактерий и охарактеризованы структурные особенности активного центра, ответственные за эти различия. 2. Продолжено изучение функций сигма-фактора РНКП на начальных стадиях синтеза РНК: в формировании первой фосфодиэфирной связи, абортивной транскрипции, уходе РНКполимеразы с промотора, образовании пауз транскрипции и устойчивости РНКП к антибиотикам. Исследован механизм связывания инициаторных субстратов в активном центре РНКП, лежащий в основе инициации синтеза РНК в отсутствие затравки. 15 3. Изучены механизмы регуляции работы РНКП белками бактериофагов: белком gp39 фага Р23-45 термофильной бактерии Thermus thermophilus и белком р7 фага Xp10 бактерии Xanthomonas oryzae. Установлено, что белок gp39 подавляет инициацию транскрипции за счет изменения конформации доменов РНКП, участвующих в узнавании промоторов. Показано, что белок р7 подавляет паузы в синтезе РНК и является эффективным антитерминатором транскрипции, связываясь с РНКП рядом c каналом выхода РНК. . ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ПЛАЗМИД И БАКТЕРИОФАГОВ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ДРЕВНИХ И СОВРЕМЕННЫХ ШТАММОВ ПРИРОДНЫХ БАКТЕРИЙ. М.А. Петрова Сектор анализа и хранения микроорганизмов (ЛМГМ ОМГК) В 2013 году продолжено изучение древних и современных штаммов природных бактерий, устойчивых к антибиотикам и солям тяжелых металлов. Работа велась по двум основным направлениям: изучение плазмид с генами устойчивости, изолированных из древних штаммов, и исследование двух новых нитчатых фагов, обнаруженных в современном штамме Stenotrophomonas maltophilia. Было завершено секвенирование плазмиды pKLH80, ранее обнаруженной в древнем арктическом штамме Psychrobacter maritimus, и проведен подробный анализ ее молекулярногенетической структуры. Было показано, что по многим параметрам pKLH80 имеет уникальную структуру и кардинально отличается от всех других известных плазмид психробактеров. В частности, в дополнительной части pKLH80 были обнаружены детерминанты устойчивости одновременно к трем антибиотикам разных классов (стрептомицину - strA-strB, тетрациклину tetR(H) и бета-лактамам - blaRTG-6), а также IS-элементы (ISPpy1, ISAba14 и ISPsma1), тогда как, ни одна из ранее полностью отсеквенированных плазмид психробактеров не содержала генов устойчивости. Кроме того, большинство таких плазмид не содержали каких-либо мобильных генетических элементов. В то 16 же время структура модулей репликации и мобилизации, образующих базовую часть pKLH80 в целом является типичной для плазмид, обнаруженных в штаммах Psychrobacter. Характерной особенностью pKLH80 является ее сложная мозаичная структура: плазмида состоит из участков, происходящих из различных плазмид, преимущественно штаммов Psychrobacter и Acinetobacter. Показано что прародителем генов blaRTG, встречающихся в настоящее время у клинических штаммов бактерий различных систематических групп, является ген blaRTG-6, обнаруженный в составе pKLH80. Также проведена работа по выявлению и первичной характеристике плазмид, содержащих гены устойчивости к антибиотикам и соединениям ртути, из древних штаммов Acinetobacter и Brevundimonas. Плазмиды были обнаружены у 13 штаммов Acinetobacter и одного штамма Brevundimonas, но не во всех случаях было выявлено сцепление с детерминантами устойчивости. Полученные результаты указывают на перспективность дальнейшего более детального изучения плазмид из древних штаммов. Подробно охарактеризована молекулярно-генетическая структура двух ранее неизвестных нитчатых фагов, phiSMA6 и phiSMA7, выделенных нами из природного штамма S. maltophilia, и проведено ее сравнение со структурой известных фагов. Установлено, что, как и у многих других известных нитчатых фагов, геном phiSMA6 и phiSMA7 состоит из 4 функциональных модулей: модуля репликации, структурного модуля, модуля сборки фаговых частиц и регуляторного модуля. Обнаружено большое сходство между геномами фага phiSMA7 и профага, идентифицированного нами в геноме ранее отсеквенированного клинического штамма S. maltophilia D457. Выявлена большая мозаичность молекулярно-генетической структуры фага phiSMA6. Также в составе этого фага обнаружен дополнительный ген-морон, имеющий гомологию с белком TrbP из S. maltophilia, участвующим в процессе конъюгации, а также с предполагаемым белком, ацетилирующим F пилин, у X. campestris. Впервые установлено, что нитчатые фаги S. maltophilia, в частности phiSMA6 и phiSMA7, обладают способностью интегрировать в хромосому хозяйской клетки. При изучении распространения phiSMA6 и phiSMA7 обнаружено, что они встречаются только у штаммов S. maltophilia, обитающих в воде. Также получены данные свидетельствующие о том, что 17 штаммы, содержащие нитчатые фаги, обладают устойчивостью к тяжелым металлам. Публикации Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ОМГК: 1. Miropolskaya N., Esyunina D., Klimašauskas S., Nikiforov V., Artsimovitch I., Kulbachinskiy A. 2013. Interplay between the trigger loop and the F loop during RNA polymerase catalysis. Nucl. Acids Res. 42: 544-552, doi:10.1093/nar/gkt877. 2. Pupov D., Esyunina D., Feklistov A., Kulbachinskiy A. 2013. Single-strand promoter traps for bacterial RNA polymerase. Biochemical Journal. 452: 241-248. 3. Zorov S., Yuzenkova Y., Nikiforov V., Severinov K., Zenkin N. Antibiotic streptolydigin requires noncatalytic Mg 2+ for binding to RNA polymerase. Antimicrob. Agents Chemother. 2013, Dec 16. 4. Sosunova E., Sosunov V., Epshtein V., Nikiforov V., Mustaev A. 2013. Control of transcriptional fidelity by active center tuning as derived from RNA polymerase endonuclease reaction. J. Biol. Chem. 288: 6688-6703. 5. Kozlov M., Nudler E., Nikiforov V., Mustaev A. Reactive rifampicin derivative able to damage transcription complex. Bioconjug Chem. 2013, 24: 443-447. 6. Petrova M., Shcherbatova N., Gorlenko Zh., Mindlin S.. A new subgroup of the IS3 family and properties of its representative member ISPpy1. Microbiology. 2013,159, 1900-1910. 7. Petrova M., Shcherbatova N., Kurakov A., Mindlin S. Genomic characterization and integrative properties of phiSMA6 and phiSMA7, two novel filamentous bacteriophages of Stenotrophomonas maltophilia. Arch Virol. 2013, Dec 11. [Epub ahead of print]. ПОДХОДЫ К МОДЕЛИРОВАНИЮ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ А.А. Александров Лаборатория биоинформатики 18 Анализ альфа-сателлитов ближайшего родственника человека - шимпанзе. Шимпанзе является ближайшим родственником человека среди всех животных, поэтому анализ альфа-сателлитов шимпанзе является актуальной задачей, решение которой может пролить свет на последние этапы антропогенеза. Проведено картирование альфа-сателлитов шимпанзе для хромосом 2B, 5, 6, 7, 8, 11, 17, 18, X, Y. Проведен анализ мертвых центромерных слоев старых семейств в геноме шимпанзе. Новых типов мономеров по сравнению с человеком не найдено. На указанных хромосомах был проведен поиск доменов новых семейств SF1,2,3, имеющих повторяющиеся единицы высокого порядка (ПЕВП). Такие домены были найдены для хромосом 8, 11, 17, 18, X, Y. На хромосоме 5 были найдены домены старого семейства SF5, содержащие ПЕВП. Эти ПЕВП были проанализированы, и для них выведен консенсус. Эти ПЕВП являются прямыми кандидатами на роль центромер шимпанзе. На основании полученных данных эти ПЕВП привязаны к хромосомной карте. Хромосома 6 примечательна тем, что на ней малокопийная ПЕВП SF1 окружает домен SF3, что свидетельствует о том, что SF3 было активно и после волны активности SF1. На остальных исследованных хромосомах имеются многочисленные короткие контиги, содержащие ПЕВП SF1, 2, 3. Они были частично проанализированы. Оказалось, что из этих ПЕВП можно выделить пентамер SF3, и два типа тетрамера SF1. Из-за сомнительной хромосомной атрибуции коротких контигов сомнительна и атрибуция этих ПЕВП. Каждая из этих ПЕВП занимает порядка 2% АС, что примерно соответствует средней ожидаемой длине домена ПЭВП на одной хромосоме. В данной работе не найдено ни одного случая, чтобы ПЭВП шимпанзе была бы похожа на ПЭВП человека. Это подтверждает представление о том, что абсолютно все живые центромеры шимпанзе и человека отличны, несмотря на явную ортологию (98%-99%) вне центромер. Были обновлены или вновь построены карты ортологии для хромосом 5, 8, 17, X. Во всех случаях ортология заканчивается на границе нового семейства или в предыдущем слое SF5. На хромосоме 8 действующие центромеры у человека и шимпанзе представлены разными надхромосомными семействами. 19 Таким образом, SF1 и 2 появились не позднее, чем у общего предка шимпанзе и человека, а SF3 - не позднее, чем у общего предка гориллы (данные других работ), шимпанзе и человека. Подтверждается, что SF5 активно и в геноме шимпанзе. Основные представления об этапах эволюции АС были изложены нами и другими авторами ранее. Полученные данные используются для построения детального сценария эволюции центромер человека и человекообразных обезьян. Построение и исследование математической модели взаимодействия метаболизма, происходящего в структурных компартментах клетки Sacharamyces cerevisiae, при аэробном процессе стационарного роста клетки на сахаре. С использованием имеющихся в мировой научной литературе данных осуществлено пополнение и коррекция ранее созданной базы данных (БД) по метаболизму клетки S.cerevisiae. Основное внимание было уделено уточнению данных по метаболизму, протекающему в эндоплазматическом ретикулуме, пероксисоме, аппарате Гольджи и вакуоли клетки. Уточнённые данные представлены в виде списков реакций, происходящих в этих компартентах клетки, в формате, требуемым пакетом FLUX II, что необходимо для использования этой информации при построении математической модели метаболизма стационарного роста клетки S.cerevisiae на сахаре в аэробных условиях. Получен суммарный список реакций для построения математической модели первичного метаболизма клетки S.cerevisiae, учитывающей наличие в ней 7-и компартментов. Список включает в себя 1069 реакций (включая транспортные). Построение простейшей математической модели кинетики процесса суицидной генной терапии раковой опухоли Построена и исследована простейшая математическая модель, описывающая изменение во времени численности клеток раковой опухоли (рассматриваемой как простая совокупность независимо растущих и не взаимодействующих клеток) при проведении процедуры суицидной генной терапии, в зависимости от: 1. начального соотношения численности клеток опухоли, в геном которых имплантирован «терапевтический ген», 20 обеспечивающий образование в этих клетках токсина (клетки D), и численности клеток с немодифицированным геномом, внутри которых токсин не образуется (клетки А). (Этот параметр (величина Nd0/( Nd0 + Na0) может задавать экспериментатор). 2. соотношения скорости синтеза токсина клеткой D (V) и удельной скорости роста раковой клетки (Ka). (Величина V так же до определённой степени может определяться экспериментатором за счёт варьирования силы промотора имплантируемого терапевтического гена). Модель учитывает зависимость кинетики процесса от величин шести кинетических констант, присущих конкретной опухоли (Ka - удельная скорость роста интактных клеток опухоли, Kap - удельная скорость гибели клеток опухоли, в которых запущен процесс апоптоза, R - удельная скорость гибели клеток опухоли от встречи с лимфоцитами, D - коэффицинт диффузии для молекул T через стенку клеток опухоли и капилляров, Ng - число «стоков» для токсина (дренажные входы) из межклеточного пространства опухоли, подлежащей терапии, B - чувствительность раковой клетки к запуску в ней апоптоза, концентрация токсина внутри, при которой вероятность запуска апоптоза равна 0.5) (эти константы не могут быть изменены экспериментатором) и подсказывает способ экспериментального определения части из них (b, R, Ng). Если указанные кинетические константы опухоли тем или другим способом определены, модель позволяет экспериментатору определить какое начальное значение Nd0/(Na0 + Nd0) нужно задать , чтобы при заданном значении V получить максимальный эффект подавления опухоли. А при фиксированном значении Nd0/(Na0 + Nd0) позволяет определить какую скорость V нужно обеспечить (варьируя силу промотора), чтобы максимальнй эффект подавления опухоли был достигнут. В результате исследования модели была обнаружена интересная специфика кинетической кривой, показывающей временной ход суммарной численности клеток опухоли (Na + Nd) в процессе генной терапии. Для этой кривой характерно начальное возрастание до некоторого максимума, затем падение до некоторого минимума (при определённых 21 соотношениях Nd0/(Na0 + Nd0) и V падение до 0), и затем (если 0 не достигнут) возростание до бесконечности. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА СФИНГОМИЕЛИНСИНТАЗЫ 1 В ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА С.А. Лимборская, Л.В. Дергунова, О.Ю. Сударкина, А.В. Рожкова, И.Б. Филиппенков Отдел молекулярных основ генетики человека (ОМОГЧ) Продолжено исследование особенностей функционирования гена сфингомиелинсинтазы 1 (SMS1) человека. Многообразие и сложность биологических процессов, опосредованных SMS1, предполагает высокую степень специфичности контроля экспрессии соответствующего гена в отдельных клетках и тканях организма. Однако особенности регуляции экспрессии гена SMS1 мало изучены. Детальное исследование структуры гена SMS человека позволило нам выявить множество его транскриптов. Были выявлены изоформы мРНК, отличающиеся участком 5’ НТО и кодирующие полноразмерный белок, а также транскрипты, возникающие в результате альтернативной комбинации экзонов, затрагивающих кодирующую область гена и 3’ НТО. На данном этапе работы с помощью метода ПЦР в реальном времени в разных тканях человека была исследована экспрессия транскриптов гена SMS1, отличающихся 5-НТО. По нашим данным, наряду с основным промотором, включающим экзон 1, в синтезе транскриптов, обеспечивающих синтез белка SMS1, участвуют альтернативные промоторы. Дифференциальный уровень содержания транскриптов, отличающихся 5’-НТО, свидетельствует, что альтернативные промоторы гена SMS1 участвуют в тканеспецифической регуляции его экспрессии. С помощью ПЦР в реальном времени в разных тканях человека определено содержание транскриптов гена SMS1, кодирующих полноценный белок, а также альтернативных транскриптов, кодирующая область которых прервана включенными в их состав альтернативными экзонами – сохранившимися участками интрона VII. По результатам проведенного исследования содержание транскриптов гена SMS1 в разных тканях человека существенно различается. К 22 числу механизмов, контролирующих уровень этих мРНК, можно отнести тканеспецифическое интронное полиаденилирование, приводящее к появлению укороченных транскриптов, не участвующих в синтезе полноразмерного белка SMS1. В настоящее время нами отработан метод получения белковых экстрактов тканей, обогащенных SMS1. Это позволило детектировать полноразмерную форму белка в большинстве исследованных тканей человека. Наибольшее количество SMS1 содержалось в экстракте почки, причем в мозговом веществе примерно в 1.5 раза больше, чем в корковом. Транскрипты, кодирующие полноразмерный белок детектируются во всех тестированных тканях, однако их количество относительно мРНК GAPDH не коррелирует с относительным уровнем белка SMS1. Это может свидетельствовать об активной пост-транскрипционной регуляции экспрессии гена SMS1. Ранее мы клонировали участок кДНК, соответствующий возможной кодирующей последовательности транскриптов, укороченных с 3’-конца, в вектор pEGFP-C2. По нашим данным, в системе in vitro укороченный белок, подобно полноразмерному белку SMS1, локализуется в аппарате Гольджи. Однако на данный момент укороченные формы белка SMS1, кодируемые рядом альтернативых транскриптов, с помощью иммуноблоттинга детектировать не удалось. Вероятно, появление в результате альтернативного сплайсинга и альтернативного полиаденилирования нефункциональных мРНК или транскриптов, кодирующих укороченный белок, является частью пост-транскрипционной регуляции экспрессии гена SMS1 человека, направленной на понижение уровня транскриптов, кодирующих полноразмерный белок. Показано, что содержание сфингомиелина и уровень сфингомиелинсинтазной активности в опухолях многих тканей изменяются. Однако, до сих пор практически не изучены особенности функционирования гена SMS1 в раковых клетках на уровне транскрипции. Нами исследована экспрессия гена SMS1 в опухолях легкого и пищевода человека по сравнению с прилежащей здоровой (неизмененной) тканью с использованием метода ПЦР в реальном времени. В ткани рака легкого наблюдается снижение уровня экспрессии гена SMS1, тогда как в опухоли и прилежащей ткани пищевода уровни экспрессии гена SMS1 статистически не отличаются. Таким 23 образом, в опухолях разного экспрессии гена SMS1 различен. происхождения характер ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РИСКА МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ П.А. Сломинский Лаборатория молекулярных основ наследственных заболеваний ОМОГЧ Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в изучении роли генетических факторов в патогенезе семейной и спорадической формы болезни Паркинсона (БП) и выявление ряда важных звеньев молекулярного патогенеза этого заболевания, остается не решенным ряд ключевых вопросов. Так, в настоящее время не ясно, почему при БП преимущественно поражаются дофаминэргические нейроны нигро-стриатного пути - хотя основные связанные с развитием патологические процессы не ограничены этим типом нейронов. Для выявления таких механизмов может быть использован анализ токсических моделей БП - в этом случае возможно изучение самых ранних этапов развития заболевания, недоступные при изучении патогенеза БП. Эти же модели могут быть использованы и для поиска новых методов ранней диагностики и лечения БП. Нами в настоящее время ведется анализ двух таких токсических моделей, полученных с использованием различных токсинов - 6-гидроксидофамина и 1-метил-4фенил-1,2,3,6-тетрахидропиридина (МPTP). При этом на основании сравнительного анализа транскнриптома в разных структурах мозга и на разных этапах прогрессирования патологического процесса выявлен ряд биологических процессов, которые могут быть связаны с ранними этапами развития заболевания. Параллельно ведется поиск мутаций у пациентов со спорадической и семейной формами БП и анализ изменения транскриптома в клетках периферической крови пациентов с БП на ранних стадиях развития заболевания с целью создания панели 24 биомаркеров для ранней диагностики БП. В итоге выявлен ряд потенциальных РНК маркеров и показано, что мутации в гене паркина могут быть причиной развития БП и в гетерозиготном состоянии. Анализ данных полногеномного секвенирования позволил идентифицировать причины развития спиномозжечковой атаксии в одной из давно изучавшихся нами семей с SCA в гене ITPR1 выявлена миссенс мутация G4684A (GUG>AUG, Вал>Мет), косегрегирующая с развитием заболевания. Продолжаются исследования по роли генетических факторов в развитии острого инсульта и выявлена возможная роль генетических факторов в формировании ответа организма на тромболитическую терапию при остром инсульте. Публикации Отдела молекулярных основ генетики человека: 1. Khrunin A.V., Khokhrin D.V., Filippova I.N., Esko T, Nelis M, Bebyakova N.A., Bolotova N.L., Klovins J, Nikitina-Zake L, Rehnström K, Ripatti S, Schreiber S, Franke A, Macek M, Krulišová V, Lubinski J, Metspalu A, Limborska S.A. A genomewide analysis of populations from European Russia reveals a new pole of genetic diversity in northern Europe. PLoS One. 2013, 8(3):e58552. doi: 10.1371/journal.pone.0058552. 2. Esko T, Mezzavilla M, Nelis M, Borel C, Debniak T, Jakkula E, Julia A, Karachanak S, Khrunin A, Kisfali P, Krulisova V, Aušrelé Kučinskiené Z, Rehnström K, Traglia M, Nikitina-Zake L, Zimprich F, Antonarakis SE, Estivill X, Glavač D, Gut I, Klovins J, Krawczak M, Kučinskas V, Lathrop M, Macek M, Marsal S, Meitinger T, Melegh B, Limborska S, Lubinski J, Paolotie A, Schreiber S, Toncheva D,Toniolo D, Wichmann HE, Zimprich A, Metspalu M, Gasparini P, Metspalu A, D'Adamo P. Genetic characterization of northeastern Italian population isolates in the context of broader European genetic diversity. Eur J Hum Genet. 2013 Jun;21(6):659-65. doi: 10.1038/ejhg.2012.229. 3. Medvedeva E.V., Dmitrieva V.G., Povarova O.V., Limborska S.A., Skvortsova V.I., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. Effect of semax and its C-terminal fragment Pro-Gly-Pro on the expression of VEGF family genes and their receptors in experimental focal ischemia of the rat brain. J Mol Neurosci. 2013 Feb;49(2):328-33. doi: 10.1007/s12031-012-9853-y. 25 4. Dergunova L.V., Rozhkova A.V., Sudarkina O.Y., Limborska S.A. The use of alternative polyadenylation in the tissue-specific regulation of human SMS1 gene expression. Mol Biol Rep. 2013, 40(12):6685-90. doi: 10.1007/s11033-013-2783-0. 5. Filatova E.V., Shadrina M.I., Fedotova E.Y., IvanovaSmolenskaya I. A., Illarioshkin S.N., Limborska S.A., Slominsky P. A. Analysis of known point mutations and SNPs in genes responsible for monogenic Parkinson’s disease in Russian patients. Advances in Parkinson’s Disease. 2013, 2, 1, 28-30. 6. Shadrina M.I., Filatova E.V., Alieva A.Kh., Stavrovskaya A.V., Khudoerkov R.M., Limborska S.A., Illarioshkin S.N., Slominsky P. A. «Transcriptome profiling of 6-OHDA model of Parkinson’s disease». Advances in Bioscience and Biotechnology, 2013, 4, 28-35. 7. Alieva A.Kh., Shadrina M.I., Filatova E.V., Ustinova V.V., Fedotova E.Yu., Karabanov A.V., Illarioshkin S.N., Slominsky P.A. Polymorphisms in the SNCA gene: association with the risk of development of the sporadic form of Parkinson’s disease and the level of SNCA gene expression in peripheral blood of patients from Russia. Neuroscience & Medicine, 2013, 4. 208-214 8. Ставчанский В.В., Творогова Т.В., Боцина А.Ю., Лимборская С.А., Скворцова В.И., Мясоедов Н.Ф., Дергунова Л.В. Влияние пептидов Семакс и PGP на экспрессию гена Vegfa в условиях неполной глобальной ишемии мозга. Молекулярная биология. 2013, 47, 3 , 461-466. 9. Коломин Т.А. , Агапова Т.Ю. , Агниуллин Я.В. , Шрам С.И. , Шадрина М.И. , Сломинский П.А. , Лимборская С.А. , Мясоедов Н.Ф. Изменение транскрипционного профиля гиппокампа в ответ на введение аналога тафтцина селанка. Журнал высшей нервной деятельности. 2013, 63, 3, 365-374. 10. Тупицына Т.В., Бондаренко Е.А., Кравченко С.А., Шетова И.М., Шамалов Н.А, Кузнецова С.М., Шульженко Д.В., Скворцова В.И., Сломинский П.А., Лившиц Л.А., Лимборская С.А. Сравнительный анализ ассоциации полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA and ACE с риском развития острого инсульта в российской и украинской популциях. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2013, (1):20-6. 11. Хохрин Д.В., Хрунин А.В., Иванова Ф.Г., Моисеев А.А., Горбунова В.А., Лимборская С.А.. Фармакогеномика химиотерапии на основе цисплатина. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2013, 4, 6-9. 26 12. Kolomin T. , Shadrina M. , Morozova M., Volkova A., Andreeva L. , Slominsky P. , Limborska S. , Myasoedov N. The temporary dynamics of inflammation-related genes expression under tuftsin analog Selank action. Molecular Immunology 2013 Nov 26;58(1):5055. doi: 10.1016/j.molimm. 2013,11.002. ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ДВУХВАЛЕНТНЫХ МЕТАЛЛОВ НА РЕАКЦИЮ ОБМЕНА НИТЕЙ ДНК В СИСТЕМЕ КОРОТКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ А.А. Володин Лаборатория молекулярной биофизики Ранее мы обнаружили, что многие лиганды катионной природы способны ускорять реакцию обмена нитей ДНК в системе коротких олигонуклеотидов. Такой эффект наблюдался как для некоторых поликатионов, так и низкомолекулярных лигандов, в частности, ионов магния и некоторых интеркаляторов. В прошедшем году проведено систематическое изучение влияния ионов магния и некоторых других двухвалентных металлов на реакцию обмена нитей в широком диапазоне условий. На основе теоретической модели, предложенной ранее [Reynaldo et al. J. Mol. Biol. (2000) 297:511], получены оценки вкладов разных ветвей реакции (через полную диссоциацию дуплекса, либо образование тройного комплекса с миграцией ветви) в её общую скорость. Изучены зависимости от температуры и концентрации ионов Mg++ для олигонуклеотидных субстратов разной длины. Особое внимание было уделено вопросу о том, существует ли корреляция между стабильностью ДНК дуплекса и скоростью реакции обмена нитей. Показано отсутствие такой корреляции. Это позволяет предполагать, что реакция обмена является относительно самостоятельной молекулярной активностью ДНК и, повидимому, РНК. Показано, что ионы металлов переходной группы (такие как Zn++ и Cu++) стимулируют реакцию обмена гораздо эффективнее, чем ионы щелочноземельных металлов (Mg++ и Ca++), что может быть обусловлено разным характером взаимодействия ионов металлов этих групп с ДНК и позволяет делать предположения о возможных механизмах обмена нитей в присутствии этих лигандов. 27 Публикации Лаборатории молекулярной биофизики: 1. Pezza, R.J., Voloshin, O.N., Volodin, A.A., Boateng, K.A., Bellani, M.A., Mazin, A.V., Camerini-Otero, R.D. The dual role of HOP2 in mammalian meiotic homologous recombination. Nucleic Acids Res. Epub 2013. Dec 3. ЗАВИСИМОСТЬ НЕКОРРЕКТНОЙ АКТИВНОСТИ ДНКПОЛИМЕРАЗ ОТ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ. ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ ИОНОВ МАРГАНЦА В.З. Тарантул Лаборатория репликации и репарации генома (ЛРРГ) Отдела вирусной и клеточной молекулярной генетики (ОВКМГ) Известно, что ионы марганца необходимы для многих ферментативных систем животных и человека. В то же время, длительное воздействие повышенных доз этого металла вызывает у людей заболевание, называемое манганизмом, симптомы которого сходны с симптомами болезни Паркинсона. Марганец гораздо менее токсичен, чем многие другие двухвалентные катионы металлов, но его опасность заключается в том, что он повсеместно распространен в продуктах питания и воде. В результате, его суммарное содержание в них почти всегда превышает суточную норму, а часто и допустимый предел. Молекулярные механизмы токсичности марганца до сих пор остаются до конца не выясненными. Длительное время существует гипотеза о том, что повышенные концентрации ионов марганца в клетках могут вызывать активацию некорректного синтеза ДНК у некоторых ДНК-полимераз, что повышает уровень мутагенеза. Нами показано, что по сравнению с семью другими биологически значимыми двухвалентными катионами металлов ионы марганца, за счет активации ДНК-полимеразы йота (Polι), способны в гораздо большей степени активировать некорректный синтез ДНК в экстрактах клеток головного мозга. При этом ионы кадмия и цинка ингибируют активность Polι. В этой связи мы предположили, что ингибирование Polι ионами кадмия может повысить устойчивость клеток к ионам марганца. 28 На зернистых клетках мозжечка крыс было показано, что хотя кадмий и является высокотоксичным элементом, его низкие концентрации способны существенно повысить выживаемость клеток под действием токсичных концентраций ионов марганца. Таким образом, полученные данные говорят в пользу того, что повышенная активность (Polι) может быть причиной генотоксического эффекта ионов марганца. Для подтверждения этого вывода мы поставили также эксперименты по изучению влияния ионов марганца на зернистые клетки мозжечка мышей 129 линии, мутантных по гену, кодирующему Polι. Предварительные результаты этих экспериментов показали, что в определенных условиях зернистые клетки мозжечка мышей 129 линии устойчивее к токсическому действию ионов марганца, чем аналогичные клетки мышей контрольной линии С57Bl. Скорее всего, токсическое действие ионов марганца распространяется и на другие молекулярные механизмы, не связанные с Polι, но, по крайней мере, наши эксперименты наряду с имеющимися данными литературы, показывают высокую вероятность участия этого фермента в генотоксическом эффекте ионов этого металла. РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ, ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И.А. Гривенников Лаборатория молекулярной генетики соматических клеток ОВКМГ Продолжены работы по созданию клеточной модели болезни Паркинсона на основе индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клеток от пациентов, страдающих наследственной формой этого заболевания. Для этого были использованы ИПС клетки, полученные из фибробластов кожи пациентов с мутациями в двух разных генах: PARK2 и PARK8. Осуществлена их направленная дифференцировка в нейрональном направлении под действием ряда ростовых факторов. Доказательством функциональной активности полученных нейронов служило наличие у них спонтанной 29 сетевой биоэлектрической активности при длительном культивировании на специальной мультиэлектродной матрице. Кроме того было показано, что у крыс с токсической моделью паркинсонизма, вызванной 6-гидроксидофамином, трансплантация нейронов, полученных из ИПС клеток здоровых доноров, в полосатое тело мозга приводила к отчетливому улучшению двигательных функций и редукции симптоматики паркинсонизма. При исследовании начальных стадий дифференцировки ИПС клеток было показано, что добавление αмеланоцитстимулирующего гормона (α-МСГ) и пептида Семакс увеличивало количество нейрональных предшественников в культурах этих клеток. Был разработан эффективный протокол получения фибробластоподобных клеток из недифференцированных ИПС клеток без добавления специфических индукторов дифференцировки. Показано, что такие фибробластоподобные клетки способны поддерживать (в качестве фидерного слоя) ИПС клетки в недифференцированном состоянии в течение длительного времени культивирования. После перевода ИПС клеток в бесфидерные условия они продолжали оставаться плюрипотентными (окрашивались антителами к ряду маркеров плюрипотентности: SSEA1, Oct3/4, Sox2, Nanog), морфологически не изменялись, а при дифференцировке формировали эмбриоидные тела и давали начало всем трем зародышевым листкам. Продолжены исследования по изучению механизмов действия меланокортинов и их аналогов на клетки центральной нервной системы млекопитающих. Показано, что системно вводимые некортикотропные меланокортины, включая пептид Семакс, в экспериментальной модели депрессии, вызванной хроническим стрессом, проявляют антидепрессантноподобную активность, предотвращая развитие ангедонии и снижение массы тела, гипертрофию надпочечников и снижение уровня нейротрофического фактора мозга BDNF в гиппокампе крысы. В воспалительной модели депрессии при системном введении αМСГ обнаружена нормализация уровней тревожности крыс в тесте «открытое поле» и ангедонии. В то же время, α-МСГ не влиял на торможение исследовательской активности животных и снижение потребления корма. Не обнаружено влияние этого пептида на уровень TNF-α в сыворотке крови и экспрессию 30 цитокинов TNF-α и IL-1β в гипофизе, гиппокампе и гипоталамусе крысы. Однако введение α-МСГ вызывало снижение стимулированной системным воспалением экспрессии мРНК индуцибельной NO-синтазы (iNOS) в исследованных тканях. Публикации Отдела вирусной и клеточной молекулярной генетики: 1. Maximov V.V., Martynenko A.V., Arman I.P., Tarantul V.Z. Humanin Binds MPP8: mapping interaction sites of the peptide and the protein. J. Peptide Science, 2013, 19, 5, 301-307. 2. Moura R., Albuquerque E., Melo C.H., Alcântara-Neto A., Batista R., Nunes-Pinheiro D.C., Pereira A., Teixeira D.I., Melo L., Serova I., Andreeva L., Serov O., Freitas V. Dynamics of recombinant hG-CSF in transgenic goat: preliminary study in founder during hormonally induced lactation. Animal Biotechnology, 2013, 24(1), 10-14. 3. Burkov I.A., Serova I.A., Battulin N.R., Smirnov A.V., Babkin I.V., Andreeva L.E., Dvoryanchikov G.A., Serov O.L. Expression of the human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) gene under control of the 5'-regulatory sequence of the goat alpha-S1-casein gene with and without a MAR element in transgenic mice. Transgenic Res., 2013, 22(5), 949-964. 4. Freitas V.J.F., Serova I. A., L. E. Andreeva , L. M. Melo, D. I. A. Teixeira, A. F. Pereira, R. R. Moura , E. S. Lopes-Jr., J. M. G. Souza-Fabjan, R. I. T. P. Batista, Serov O. L. The comparison of two embryo donor breeds for the generation of transgenic goats by DNA pronuclear microinjection. Animal Production Science, 2013, 54(5), 564-568. 5. Lakhin A.V., Kazakov A.A., Makarova A.V., Pavlov Y.I., Efremova A.S., Shram S.I., Tarantul V.Z., Gening L.V. Isolation and characterization of high affinity aptamers against DNA polymerase iota. Nucleic Acid Ther. 2013, 22, 49-57. 6. Лахин А.В., Ефремова А.С., Макарова И.В., Гришина Е.Е., Шрам С.Н., Тарантул В.З., Генинг Л.В. Влияние Mn (II) на ошибочную активность ДНК-полимеразы йота в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека. Мол. генет., микробиол., вирусол., 2013, 1, 14-20. 7. Лахин А.В., Тарантул В.З., Генинг Л.В. Аптамеры: проблемы, пути их решения и перспективы. Acta Naturae, 2013, 5, 4, 28-39. 8. Генинг Л.В., Лахин А.В., Стельмашук Е.В., Исаев Н.К., Тарантул В.З. Ингибирование Mn2+-индуцированного 31 некорректного синтеза ДНК с помощью Cd2+ и Zn2+. Биохимия, 2013, 78, 10, 1452-1462. 9. Шахбазян А.К., Тарантул В.З., Залесский А.Д., Рябова А.В., Лощенов В.Б., Антонов С.А., Гривенников И.А., Кривохарченко А.С., А. В. Карменян А.В., Надточенко В.А. Получение химерных бластоцист мыши методами лазерной нанохирургии. Онтогенез, 2013, 44, 6, 403-408. 10. Мануилова Е.С., Арсеньева Е.Л., Новосадова Е.В., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния альфамеланоцитстимулирующего гормона на начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши. Доклады академии наук, 2013, 453, 109-113. 11. Лебедева О.С., Лагарькова М.А., Киселев С.Л., И.В. Мухина, М.В. Ведунова, О.В. Усова, А.В. Ставровская, Н.Г. Ямщикова, Е.Ю. Федотова, И.А. Гривенников, Л.Г. Хаспеков, Иллариошкин С.Н. Морфофункциональные свойства индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из фибробластов кожи человека и дифференцированных в дофаминергические нейроны. Нейрохимия, 2013, 30, 3, 233-241. 12. Яценко К.А., Глазова Н.Ю., Иноземцева Л.С., Андреева Л.А., Каменский А.А., Гривенников И.А., Левицкая Н.Г., Долотов О.В., Мясоедов Н.Ф. Гептапептид Семакс ослабляет последствия непредсказуемого хронического стресса у крыс. Доклады академии наук, 2013, 453, 5, 581-584. СИСТЕМНАЯ ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОРМАЛЬНЫХ И ГЕННО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК А.Г. Кобылянский Центр клеточных и генных технологий (ЦКГТ) В настоящее время активно ведется поиск альтернатив животным моделям для фармакологического скрининга перспективных лекарственных препаратов. Применение культур клеток для оценки эмбриотоксического и тератогенного воздействия таких препаратов позволяет повысить продуктивность и снизить стоимость проводимых исследований. 32 Начальные стадии дифференцировки эмбриональных стволовых (ЭС) клеток in vitro рассматривают в качестве уникальных трехмерных моделей раннего развития млекопитающих для фундаментальных, фармакологических и токсикологических исследований. Нами предложена модель тест-системы, основанной на ЭС клетках мыши, для оценки токсического воздействия исследуемых соединений на процессы раннего эмбрионального развития. Были отработаны стандартные условия культивирования ЭС клеток, и анализа процессов их пролиферации, и дифференцировки. По своим свойствам ЭС клетки отражают фенотип внутренней клеточной массы предимплантационных бластоцист. Изменения скорости пролиферации ЭС клеток, культивируемых в присутствии изучаемого соединения, свидетельствует о наличии у него потенциального эмбриотоксического эффекта. Дифференцировка ЭС клеток в стандартных условиях приводит к образованию эмбриоидных тел, состоящих из производных трех зародышевых листов: экто,мезо- и энто-дермы. Способность изучаемых соединений изменять соотношение дифференцированных клеток в эмбриоидных телах, образующихся из ЭС клеток, свидетельствует о наличии тератогенного эффекта. В частности, снижение образования и пролиферации нейральных предшественников (НП) в популяции ЭС клеток, дифференцирующихся в присутствии изучаемых соединений, отражает наличие у них нейротоксических свойств. Оценка пролиферации недифференцированных ЭС клеток проводилась с помощью МТТ-анализа. Изучение экспрессии маркеров специализированных типов клеток, в частности нейральных предшественников, осуществлялась с помощью ОТ-ПЦР и иммунофлуоресцентной микроскопии. Для оценки пролиферации НП, в предложенной тест-системе, исследовалась экспрессия транскрипционных факторов SOX1 и PAX6, а также нестина, относящегося к классу промежуточных филаментов. С использованием разработанной модели проведен анализ влияния ряда пептидов с общей последовательностью Pro-GlyPro, а также известных факторов роста FGF2 и NGF, на выживаемость, пролиферацию и начальные этапы дифференцировки ЭС клеток в нейральном направлении. 33 Для пептидных препаратов было показано, что эти соединения не влияют на скорость пролиферации недифференцированных ЭС клеток, и на выживаемость ЭС клеток в среде с пониженным содержанием сыворотки. Испытанные препараты также не оказывали заметного влияния на рост дифференцированных производных ЭС клеток, в частности, нейральных предшественников. Для NGF было показано, что это соединение снижает численность общей популяции дифференцированных ЭС клеток, не изменяя пропорции нестин-положительных НП в общей популяции. В сочетании с FGF2, NGF снижал общий пролиферативный эффект на дифференцирующиеся ЭС клетки, индуцированный FGF2. Публикации Центра клеточных и генных технологии: 1. Шахбазян А.К., Тарантул В.З., Залесский А,Д., Рябова А.В, Лощенов В.Б., Антонов С.А., Гривенников И.А., Кривохарченко A.С., Карменян А.В., Надточенко В.А. Получение химерных бластоцист мыши с применением лазерной нанохирургии. Онтогенез,2013,6,403-408. 2. Иванов П.Л., Леонов С.Н., Земскова Е.Ю., Кобылянский А.Г., Дзюбенко Е.В. Мультилокусное генотипирование полиморфных STR-локусов хромосомной ДНК в единичных клетках: трудности технологий. Судебно-медицинская экспертиза, 2013, 5, 19-24. 3. Рындин В.В., Кобылянский А.Г., Дзюбенко Е.В., Клевно В.А. О молекулярно-генетическом исследовании биологических объектов, представленных в виде препаратов на предметных стёклах (мазков). Сборник трудов к Научно-практической конференции «Актуальные вопросы медико-криминалистической экспертизы: современное состояние и перспективы развития». Москва, 27-29.03.2013 г. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ И ПОПУЛЯЦИОННАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГЕНИТАЛЬНЫХ МИКОПЛАЗМ И ЛАКТОБАКТЕРИЙ В.В. Демкин Лаборатория молекулярной диагностики 34 Поиск генетических маркеров для идентификации и генотипирования микроорганизмов – возбудителей заболеваний человека и животных является актуальной задачей современной науки. С развитием полногеномного секвенирования появились принципиально новые возможности для поиска таких маркеров у бактерий. С использованием разработанной программы, обеспечивающей поиск консервативных участков в заданном наборе последовательностей, в том числе целых геномов, проведено сравнение геномов генитальных микоплазм M.hominis и M.genitalium. В результате сравнения идентифицирован новый не описанный ранее консервативный участок, способный служить генетическим маркером данной группы бактерий. Разработаны и проведены сравнительные испытания нескольких модельных систем на основе ПЦР в реальном времени. Полученные данные показали наличие полиморфных сайтов, которые могут быть причиной различной эффективности амплификации мишени различными праймерами у различных клинических образцов. Сконструирована серия систем детекции и идентификации вагинальных лактобактерий. Используя эти системы, а также системы для выявления и количественного определения таких компонентов вагинальной микробиоты, как хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, гарднереллы, изучали количественные соотношения между различными микроорганизмами в вагинальной микробиоте женщин. Полученные данные свидетельствуют, что число женщин, инфицированных по крайней мере одним из видов распространенных условно-патогенных и патогенных бактерий или вирусов составляет приблизительно две трети. Наиболее распространенными во влагалищной микрофлоре с патогенным потенциалом являются гарденереллы и уреаплазмы, инфицированность которыми наблюдается у 60% обследованных женщин. Этиологическая структура урогенитальных заболеваний, во многих случаях представлена ассоциацией нескольких инфекционных агентов. Получены предварительные данные о популяционном разнообразии распространения различных видов лактобацилл и их количественной представленности в вагинальных микробиотах женщин. 35 Публикации Лаборатории молекулярной диагностики: 1. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kurinov A.M., Demkin V.V., Vinogradova T.V., Zinovyeva M.V., Sass AV., Zborovskaya I.B., Kostrov S.V. Alterations in gene expression of proprotein convertases in human lung cancer have a limited number of scenarios. PLOS ONE. 2013, 8(2), e55752. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ПРИРОДНЫХ ПЕПТИДОВ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Н.Ф. Мясоедов Отдел химии физиологически активных веществ (ОХФАВ) В 2013 году были продолжены исследования в области химии и биологии пептидов, как основы для создания новых лекарственных препаратов пептидной природы. Проведены работы по разработке методов синтеза, синтез и исследование аминокислотных последовательностей сложных глипролинов для фармакологических исследований. Выявлены пути протеолиза фармакологически важных глипролинов под действием индивидуальных ферментов, а также ферментов гомогената мозга и крови крыс in vitro, идентифицированы продукты их деградации. Синтезированы новые аналоги фрагментов АКТГ и исследован механизм их действия и специфическое связывание. Проведено исследование пептида KKRRPGP в качестве нейропротектора. Показано, что синтетический пептид, в структуре которого присутствуют природный фрагмент АКТГ15-18 (KKRR) и обогащенная пролином последовательность Pro-Gly-Pro - АКТГ15-18PGP (KKRRPGP), обладает антистрессорной и анксиолитической активностью. Исследование эффектов природного пептида АКТГ15-18 и его аналога АКТГ15-18PGP проведено в моделях острого стрессогенного воздействия. Показано, что исследованные пептиды ослабляют анксиогенное действие острого стресса, снижая отставленное увеличение тревожности животных, перенесших стресс. При этом выраженность и длительность поведенческих эффектов препарата АКТГ15-18PGP значительно превышает выраженность и длительность эффектов его природного прототипа. Исследованы нейропротективные 36 эффекты новых синтетических пептидов группы глипролинов на клеточных моделях повреждения и гибели нейронов, воспроизводящих патофизиологические процессы, характерные для сахарного диабета. Проведены работы по изучению механизма взаимодействия пептидов с различными рецепторными системами клетки. В результате этих исследований разработана новая схема применения известных лекарственных препаратов бензодиазепинового ряда в терапевтической коррекции тревожных расстройств, основанная на совместном одновременном введении синтетических анксиолитиков и регуляторных пептидов. Методом радиолигандрецепторного анализа исследованы ключевые моменты молекулярного механизма влияния регуляторного пептида селанк на ГАМК - бензодиазепиновый рецепторный комплекс, представляющий собой ключевую мишень действия основной группы противотревожных лекарственных средств. Методом радиолиганд-рецепторного анализа показано, что в различных отделах мозга крысы (кора, мозжечок, гиппокамп, базальные ядра) присутствует, как минимум, два типа мест специфического связывания этого нейромедиатора, с константами диссоциации около 15 и 90 нМ. Проведен анализ влияния бензодиазепинового транквилизатора диазепама, селанка и его С-концевого фрагмента ArgPGP на специфическое связывание 3Н-ГАМК на плазматических мембранах клеток коры головного мозга крыс. В совокупности, эти данные позволили предположить, что один из молекулярных механизмов анксиолитического действия селанка опосредован взаимодействиями пептида с бензодиазепиновыми участками ГАМК(А) рецепторного комплекса. Полученные экспериментальные данные легли в основу планирования клинического исследования эффективности и переносимости сочетанного применения лекарственного препарата на основе селанка и бензодиазепиновых транквилизаторов (феназепама) при терапии тревожных расстройств. Комбинаторное применение феназепама с селанком в 2 раза (p<0.05) снижало у больных выраженность таких наиболее часто встречаемых побочных эффектов, как: нарушение концентрации, памяти, астения, седация, увеличение продолжительности сна, а также ортостатизм и сексуальные дисфункции. У больных, получавших монотерапию феназепамом, эти побочные эффекты были наиболее выражены. 37 СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СОЕДИНЕНИЙ С НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ С.И. Шрам Сектор нейрофармакологии ОХФАВ Основные исследования в отчетный период были направленны на развитие новых экспериментальных подходов для изучения патологических процессов на клеточном уровне, выяснение патогенетических механизмов нейродегенерации при ряде патологий центральной и периферической нервных систем и механизмов кардиотоксичности противоопухолевых препаратов, а также на поиск и характеристику новых фармакологических веществ с нейропротекторным действием. В отчетный период были разработаны клеточные модели повреждения кардиомиоцитов в результате токсического действие противоопухолевых препаратов антрациклинового ряда, позволяющие исследовать как механизмы развития данного вида кардиомиопатии, так и проводить скрининг новых потенциальных кардиопротекторов. Метод основан на использовании стационарных культур кардиомиобластов крысы Н9с2 и первичной культуры кардиомиоцитов новорожденных крыс. Получены данные, указывающие на то, что кардиотоксичность доксорубицина в значительной степени может быть обусловлена активацией ядерных белков семейства поли(АДФ-рибоза)-полимераз. Показано также, что некоторые антиоксиданты ослабляют повреждающее действие доксорубицина на кардиомиоциты. Также были продолжены исследования, направленные на выяснение молекулярных и клеточных механизмов нейропротекторного действия новых биологически-активных пептидов группы глипролинов в норме и на моделях повреждения нейронов периферической и центральной нервных систем. Установлено, что пептид PGP (10 мкМ) оказывает положительное действие на жизнеспособность культивируемых нейронов гиппокампа, не влияя при этом на процессы нейритогенеза. В тоже время пептид семакс (10 мкМ) способствовал формированию возбуждающих синапсов и 38 подавлял формирование тормозных синапсов в ходе культивирования с нейронами гиппокампа крысы. Показано, что длительная прединкубация нейронов гиппокампа крысы с пептидом PGP (10 мкМ) приводила к увеличению средней амплитуды и частоты спонтанных возбуждающих потенциалов, а также стабилизировала электрофизиологические характеристики нейронов при их эксайтотоксическом повреждении глутаматом. Также было обнаружено, что пептид PGP (100 мкМ) усиливал зимозан-индуцируемый синтез лейкотриенов полиморфноядерными лейкоцитами человека а пептид N-ацетил-PGP (100 мкМ) предотвращал зимозаниндуцируемую гибель этих клеток. На основании полученных результатов нами сделано предположение, что нейропротекторные и провоспалительные эффекты глипролинов с С-концевой последовательностью Gly-Pro могут быть опосредованы разными типами рецепторов. Таким образом, полученные за отчетный период результаты, позволили значительно расширить наши представления о фармакологических свойствах пептидов группы глипролинов. Публикации Отдела химии физиологически активных веществ (зарубежные): 1. Medvedeva E.V., Dmitrieva V.G., Povarova O.V., Limborska S.A., Skvortsova V.I., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. Effect of Semax and its C-terminal Fragment Pro-Gly-Pro on the Expression of VEGF Family Genes and their Receptors in Experimental Focal Ischemia of the Rat Brain, Journal of Molecular Neuroscience, ISSN: 0895-8696, 2012 Jul 8. 2013, 49, 328-333. 2. Zolotarev Yu.A., Dadayan A.K., Borisov Yu.A., Kozik V.S., Nazimov I.V., Ziganshin R.H., Bocharov E.V., Chizhov A.O., Myasoedov N.F. New Development in the Solid State Isotope Exchange with Spillover Hydrogen in Organic Compounds, Journal Physical Chemistry, august 22, 2013, 117, 33, 16878-16884. 3. Nekrasova Y.N., Zolotarev Y.A., Navolotskaya E.V.. Synthetic peptide octarphin (TPLVTLFK) inhibits the activity of the hypothalamus-pituitary-adrenal axis through nonopioid β-endorphin receptor, Regulatory peptides. 2013 Mar 13 ; 183, 23-26. 4. Efremova A.S., Zakharenko A.L., Shram S.I., Kulikova I.V., Drenichev M.S., Sukhanova M.V., Khodyreva S.N., Myasoedov N.F., Lavrik O.I., Mikhailov S.N. Disaccharide Pyrimidine Nucleosides and Their Derivatives: A Novel Group of Cell-Penetrating Inhibitors of 39 Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1, Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2013, 32, 9, 510-528. 5..Kolomin T, Shadrina M., Slominsky P., Limborska S., Myasoedov N. A new generation of drugs: synthetic peptides based on natural regulatory peptides. Neuroscience & Medicine. 2013, 4, 4, 223-252. В российских журналах опубликовано 32 статьи, получено 4 российских патента. УРОВЕНЬ мРНК ГЕНА PCSK9 ПОВЫШЕН В РАКОВЫХ ОПУХОЛЯХ ПИЩЕВОДА ЧЕЛОВЕКА С.В. Костров Лаборатория белковой инженерии Отдела молекулярногенетических основ биотехнологии и белковой инженерии (ОМГОБиБИ) Пробелокконвертазы (ПК) – семейство высокоспецифичных субтилизинподобных сериновых протеаз млекопитающих, ключевой функцией большинства из которых является процессинг белков и пептидов. Существуют многочисленные данные об ассоциации ПК с возникновением и развитием онкологических заболеваний, что позволяет рассматривать ПК как перспективные диагностические маркеры и терапевтические мишени. В данной работе, выполненной совместно с сотрудниками с Российского онкологического центра им. Н.Н. Блохина РАМН и Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, впервые была количественно оценена экспрессия всех генов ПК (PCSK1, PCSK2, PCSK4, PCSK5, PCSK6, PCSK7, PCSK9, FURIN и MBTPS1) на уровне мРНК в опухолевой ткани и окружающей ткани без признаков патологии. Образцы тканей были получены от 19 пациентов с диагнозом «плоскоклеточный рак пищевода». Анализ полученных данных показал, что в опухолевой ткани значительно повышен уровень экспрессии генов PCSK9 (p<0,003), FURIN (p<0,008) и MBTPS1 (p<0,02). Наиболее интересным результатом работы является обнаружение повышенной экспрессии в опухолях гена PCSK9. PCSK9, в отличие от большинства ПК, не является процессирующим 40 ферментом. Этот белок связывается с рецепторами липопротеинов низкой плотности, индуцирует деградацию этих рецепторов и, таким образом, регулирует концентрацию циркулирующего комплекса липопротеинов низкой плотности с холестерином. Большое количество опубликованных работ демонстрирует ассоциацию высокого уровня активности PCSK9 с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний. В последнее время появляется информация о возможном участии PCSK9 в прогрессии раковых опухолей. Так, показано, что дефицит PCSK9 снижает метастазирование привитых мышам опухолей. Предполагается, что этот эффект связан со снижением уровня холестерина. При этом данных о повышении экспрессии PCSK9 в раковых опухолях человека до настоящего времени не было. Полученные результаты позволяют предположить, что непроцессирующая пробелокконвертаза PCSK9 может участвовать в развитии злокачественных опухолей пищевода. ХИМИЧЕСКАЯ КОММУНИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ: МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И.А. Хмель Лаборатория регуляции экспрессии генов микроорганизмов ОМГОБиБИ Основное направление работ Лаборатории связано с изучением регуляции экспрессии генов бактерий. Тематика Лаборатории включает молекулярно-генетические и функциональные исследования коммуникации бактерий, прежде всего, изучение Quorum Sensing (QS) регуляции экспрессии генов бактерий и ее роли в контроле клеточных процессов. QS регуляция функционирует с участием низкомолекулярных сигнальных молекул; эти молекулы, продуцируемые одной клеткой, могут взаимодействовать с рецепторным белком другой бактерии и индуцировать в ней экспрессию определенных генов. В результате происходит скоординированная экспрессия этих генов во всей популяции бактерий. Коммуникация с участием QS систем возможна 41 между бактериями одного и разных видов, родов и даже семейств. В 2013 г. были продолжены исследования QS регуляции бактерий на модели Serratia proteamaculans 94 и Burkholderia cenocepacia; в этих работах были выяснены особенности QS систем бактерий, регуляции их функционирования и роль в контроле процессов метаболизма. В плане изучения химической коммуникации бактерий большое внимание в последнее время привлекают летучие вещества, выделяемые бактериями, и, прежде всего, летучие органические соединения (ЛОС). Эти вещества называют «infochemicals», т.е. химические носители информации. Выделяемые одними бактериями, они могут действовать на больших расстояниях на другие бактерии, грибы и т.д., например, в почве. Мы продолжили исследования ЛОС бактерий родов Pseudomonas и Serratia, подавляющих, как мы показали, рост бактерий, фитопатогенных грибов, а также дрозофил и нематод. Было показано, что общий пул ЛОС, выделяемых бактериями Pseudomonas fluorescens и P. chlororaphis, подавлял образование биопленок фитопатогенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. В совместной работе с сотрудниками Иерусалимского Университета (Израиль) был проведен анализ ЛОС у модельных штаммов Pseudomonas и Serratia с помощью методов газовой хроматографии и массспектрометрии. Определены закономерности действия индивидуальных ЛОС - диметилдисульфида (ДМДС), 2нонанона, 2-гептанона, 2-ундеканона - на формирование биопленок A. tumefaciens и выживаемость клеток в зрелых биопленках. Было показано, что устойчивость к ЛОС бактерий в биопленках выше, чем устойчивость клеток в планктонном (неприкрепленном) состоянии. Получены транспозонные мутанты цианобактерий, устойчивые к действию кетонов 2-нонанона, 2-гептанона, 2ундеканона; проводится их сравнительное исследование, определяется локализация инсерций транспозонов. Еще одной стороной действия ЛОС на бактерии является их взаимодействие с функционированием QS систем. Ранее мы показали, что штаммы – продуценты ЛОС и индивидуально ДМДС подавляет синтез сигнальных молекул N-ацилгомосеринлактонов (АГЛ). В 2013 г. было установлено с использованием биосенсоров, сконструированных на основе 42 различных QS систем, что летучие кетоны, образуемые бактериями, могут также ингибировать синтез АГЛ, нарушая в результате функционирование QS систем регуляции. Полученные результаты открывают новые аспекты антагонистических отношений между микроорганизмами. Кроме того, действие ЛОС бактерий, ассоциированных с растениями, может быть важным фактором биологического контроля заболеваний растений, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами. Продолжались исследования действия наночастиц металлов на бактерии и бактериальные биопленки. Проводятся эксперименты по биогенезу наночастиц металлов клетками бактерий. Публикации Отдела молекулярно-генетических основ биотехнологии и белковой инженерии: 1. Shubin A.V., Lunina N.A., Shedova E.N., Roshina M.P., Demidyuk I.V., Vinogradova T.V., Kopantsev E.P., Chernov I.P., Kostrov S.V. Evaluation of the toxic effects evoked by the transient expression of protease genes from human pathogens in HEK293 cells. Applied Biochemistry and Microbiology. 2013, 49, 9, 750-755. 2. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kurinov A.M., Demkin V.V., Vinogradova T.V., Zinovyeva M.V., Sass A.V., Zborovskaya I.B., Kostrov S.V. Alterations in gene expression of proprotein convertases in human lung cancer have a limited number of scenarios. PLoS ONE. 2013, 8, 2, e55752. 3 .Demidyuk I.V., Gromova T.Y., Kostrov S.V. Protealysin. In: Handbook of proteolytic enzymes, 3rd Edition. Edited by Neil D. Rawlings and Guy Salvesen. Oxford: Academic Press. 2013, 1, 597602. 4. Poehlein A., Zverlov V.V., Daniel R., Schwarz W.H., Liebl W. Complete genome sequence of Clostridium stercorarium subsp. stercorarium strain DSM 8532, a thermophilic degrader of plant cell wall fibers. Genome Announc. 2013, 1, 2, e00073-13. 5. Köck D.E., Wibberg D., Köllmeier T., Blom J., Jaenicke S., Winkler A., Albersmeier A., Zverlov V. V., Pühler A., Schwarz W.H., Schlüter A. Draft genome sequence of the cellulolytic Clostridium thermocellum wild-type strain BC1 playing a role in cellulosic biomass degradation. Journal of Biotechnology. 2013, 168, 1, 62-63. 6. Великодворская Г.А., Чекановская Л.А., Лунина Н.А., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Дворцов И.А., Зверлов В.В. Углевод- 43 связывающий модуль 28 семейства термостабильной эндо-1,4β-глюканазы CelD из анаэробного микроорганизма Сaldicellulosiruptor bescii необходим для максимальной активности фермента и необратимо связывается с аморфной целлюлозой. Молекулярная биология. 2013, 47, 4, 667-673. 7. Radzig M.A., Nadtochenko V.A., Koksharova O.A., Kiwi J., Lipasova V.A., Khmel I.A. Antibacterial effects of silver nanoparticles on Gram-negative bacteria: influence on the growth and biofilms formation, mechanisms of action. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2013, 102, 300-306. 8. Plyuta V.A., Zaitseva J, Lobakova E, Zagoskina N, Kuznetsov A, Khmel I. Effect of plant phenolic compounds on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. APMIS. 2013, 121, 1073-1081. 9. Chernin L., Toklikishvili N., Ovadis M., Khmel I. Quorum-Sensing quenching by volatile organic compounds emitted by rhizosphere bacteria. In: Molecular Microbiol. Ecology of the Rhizosphere, V. 2, Ed. By Frans J. de Bruijn, 2013, John Wiley & Sons, Inc., 791-800. 10. Plyuta V.A., Lipasova V.A., Kuznetsov A.E., Khmel I.A. Effect of salicylic, indole-3-acetic, gibberellic, and abscisic acids on biofilm formation by Agrobacterium tumefaciens C58 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. Applied Biochemistry and Microbiology, 2013, 49, 1-5. 11. Koksharova O.A., Kravzova T.R., Lazebnaya I.V., Gorelova O.A., Baulina O.I., Lazebny O.E., Fedorenko T.A., Lobakova E.S. Molecular identification and ultrastructural and phylogenetic studies of cyanobacteria from association with the whote sea hydroid Dynamena pumila (L., 1758).Biomed. Research International, 2013, Article ID 760681, 1-11. 12. Gorelova O.A., Baulina O.I., Rasmussen U., Koksharova O.A. The pleiotropic effects of ftn2 and ftn6 mutations in cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942. An structural study. Protoplasma. 2013, 250, 931-942. 13. Плюта В.А., Андреенко Ю.В., Кузнецов А.Е., Хмель И.А. Образование биопленок Pseudomonas aeruginosa PAO1 в присутствии перекиси водорода; влияние гена aiiA. Молекулярная генетика, микробиология и вирусол. 2013, 4, 10-1 14. Кокшарова О.А. Бактерии и феноптоз. Биохимия, 2013, 78, 1229-1238. 15. Васетенков А.Е., Кокшарова О.А. Сравнительные и эволюционные аспекты изучения механизмов деления клеток 44 цианобактерий и пластид растений. Физиология растений, 2013, 60, 478-490. МЕХАНИЗМ, РЕГУЛЯЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ СИСТЕМЫ АДАПТИВНОЙ ИММУННОСТИ ПРОКАРИОТ CRISPR/CAS. К.В. Северинов Лаборатория регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот CRISPR/Cas системы адаптивного иммунитета прокариот состоят из CRISPR-кассет ДНК, содержащих идентичные повторы, разделенные уникальными спейсерами, и набора сas генов. CRISPR/Cas системы защищают клетки от чужеродного генетического материала, уничтожая ДНК фагов или плазмид, в которых имеются последовательности (т.н. протоспейсеры), идентичные последовательностям спейсеров CRISPR кассеты. Этот процесс получил название «CRISPRинтерференции». Процесс приобретения новых спейсеров (он носит название «CRISPR/Cas адаптация») требует наличия в клетке чужеродного генетического материала, который является источником новых спейсеров. На сегодняшний день, CRISPR/Cas адаптация – это единственный известный случай адаптивной, ламарковской эволюции, в ходе которой наследственные адаптивные изменения в клеточном геноме направленно приобретаются в результате изменения внешних условий (заражения вирусом, трансформации плазмидой и т.п.). Молекулярный механизм CRISPR/Cas адаптации неизвестен. Теоретически процесс встраивания новых спейсеров должен включать, как минимум, стадию узнавания протоспейсеров в чужеродной ДНК (1), копирование или вырезание будущего спейсера (2), направленный его перенос к CRISPR кассете (3), внесение разрывов в один из повторов CRISPR кассеты (4), и собственно встраивание спейсера с одновременной дупликацией CRISPR повтора (5). Ни один из этих процессов экспериментально не наблюдался. Нами разработаны высокоэффективные системы CRISPR/Cas адаптации для нескольких бактерий и получены приоритетные данные по 45 механизму адаптации и способам автоимунного действия CRISPR/Cas систем. предотвращения Публикации Лаборатории регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот: 1. Klimuk E., Akulenko N., Makarova K.S., Ceyssens P.-J., Lavigne R., Severinov K. Host RNA polymerase inhibitors encoded by fKMVlike phages of Pseudomonas. Virology. 2013, 436, 67-74. 2. Shadrin A., Sheppard C., Savalia D., Severinov K., Wigneshweraraj, S. Overexpression of Escherichia coli udk mimics the absence of T7 Gp2 function and thereby abrogates successful infection by T7 phage. Microbiol. 2013, 159, 269-274. 3. Savitskaya E., Semenova E., Dedkov V., Metlitskaya A., Severinov K. High throughput sequencing analysis of CRISPR spacer adaptation in Escherichia coli. RNA Biol. 2013,10, 716-725. 4. Soutourina O., Monot M., Boudry P., Saujet L., Pichon C., Sismeiro O., Semenova E., Severinov K., Le Bouguenec C., Coppée J.-Y., Dupuy B., Martin-Verstraete I. Genome-wide identification of regulatory RNAs in the human pathogen Clostridium difficile. PLoS Genetics. 2013, e1003493. 5. Mekler V., Severinov K. Cooperativity and interaction energy threshold effects in recognition of the -10 promoter consensus element by bacterial RNA polymerase. Nucl. Acids Res. 2013, 41, 7276-7285. 6. Westra E.R., Semenova E., Datsenko K. A., van der Oost J., Severinov K., Brouns, S. J. J. The mechanisms of discriminating self from non-self DNA by Type I and Type III CRISPR/Cas systems are fundamentally different. PLoS Genetics. 2013, e1003742. 7. Loredo-Varela L., Chechik M., Levdikov V., Abd-El-Aziz A., Minakhin M., Severinov K., Smits C., Antson A. Putative small terminase from the thermophilicdsDNA bacteriophage G20C is a 9subunit oligomer. ActaCrystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2013,69, 876-879. 8. Lopatina A., Krylenkov V., Severinov K. Activity and bacterial diversity of snow around Russian Antarctic stations. Res. Microbiol. 2013, 164, 949-958. 46 РОЛЬ НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА ГОЛОВНОГО МОЗГА (BDNF) В РАЗВИТИИ БОКОВОЙ ЛИНИИ DANIO RERIO Е.В. Гасанов Лаборатория молекулярной генетики эмбрионального развития Нейротрофины – семейство факторов роста, определяющих развитие и функционирование нервной системы и участвующих в формировании ряда других систем и органов. У хордовых выделяют 6 представителей семейства, при этом наиболее консервативными, встречающимися у всех позвоночных, являются нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF) и нейротрофин-3 (NT-3). Ключевая роль данных факторов давно известна: нокаут и нокдаун их генов ведут к тяжелым патологиям развития и нежизнеспособности эмбрионов. Подобные эксперименты выявили ведущую роль BDNF в формировании органов слуха млекопитающих, однако не дали ответа на вопрос о механизмах его действия. Предполагается его необходимость для развития и дифференцировки как сенсорных клеток системы внутреннего уха (Кортиев орган), так и чувствительных нейронов слухового нерва. Предполагается участие BDNF в росте чувствительных отростков слухового нерва или даже всех афферентных волокон восьмой пары черепно-мозговых нервов. Однако в виду сложности экспериментальных процедур с участием млекопитающих подтверждения или опровержения подобных предположений на данный момент нет. Аналогом и предшественником Кортиева органа тетрапод у рыб является система боковой линии. Также иннервируясь восьмой парой черепно-мозговых нервов, сенсорная система боковой линии рыб имеет аналогичное на клеточном уровне строение и выполняет функции, аналогичные органам слуха наземных животных. Неудивительно, что для боковой линии рыб также показана ключевая роль BDNF, и также отсутствует детальная информация о механизмах его действия. Используя модельную систему на основе пресноводной костистой рыбы Danio rerio, коллектив авторов попытался раскрыть конкретные механизмы действия нейротрофина BDNF 47 в процессе формирования боковой линии развивающегося эмбриона. Процесс формирования системы боковой линии анализировался с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии in vivo при блокировке или усилении действие фактора. Было показано, что BDNF обладает биологическим эффектом на клетки боковой линии Danio rerio, влияя как на клеточную миграцию, так и на дифференцировку сенсорных клеток. Публикации Лаборатории молекулярной генетики эмбрионального развития: 1. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kurinov A.M., Demkin V.V., Vinogradova T.V., Zinovyeva M.V., Sass A.V., Zborovskaya I.B., Kostrov S.V. Alterations in gene expression of proprotein convertases in human lung cancer have a limited number of scenarios. PLoS ONE. 2013, 8(2): e55752. doi:10. 1371/journal.pone.0055752.