Лекция 6 - Лаборатория физиологии человека и регуляции

Лекция 6.
Коммуникативные сигналы бактерий.
1. Реакция кворум-сенсинга, ее механизм. Апоптоз у Bacteria subtilis.
2. Коммуникация у бактерий и в бактериальных образованиях.
1. Реакция кворум-сенсинга, ее механизм. Апоптоз у Bacteria subtilis.
Понятие «ощущение кворума» (quorum sensing) было предложено в 1994 году. Оно
означает восприятие клетками изменений среды, которые наступают при достижении
бактериальной культурой некоторой пороговой численности, и реакцию на эти изменения.
К числу описанных процессов, протекающих лишь при достаточно высокой плотности
популяции, относятся следующие явления:








биолюминесценция у морских бактерий Vibrio fisheri и V.harveyi;
агрегация клеток миксобактерий и последующее формирование плодовых тел со
спорами;
споруляция у бацилл и актиномицетов;
стимуляция роста у стрептококков и ряда других микроорганизмов;
конъюгация с переносом плазмид у Enterococcus faecalis и родственных видов, а
также у бактерий рода Agrobacterium;
синтез экзоферментов и других факторов вирулентности у патогенов растений
(Erwinia carotovora, E.hyacinthii и др.) и животных (Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus);
образование антибиотиков у представителей рода Streptomyces и у E.carotovora;
формирование биоплёнок у Р.aeruginosa и других микроорганизмов.
Раскрыты механизмы многих из указанных процессов, определены факторы
межклеточной коммуникации, отвечающие за процессы, зависящие от плотности
популяции.
Яркий пример социального контроля (на уровне колонии) за микробными клетками –
апоптоз, т.е. программированная гибель отдельных клетокв интересах популяции в
целом. Явление апоптоза у животных и, в меньшей мере, у растительных клеток –
нормальная составная часть индивидуального развития организма. Так, он необходим для
резорбции хвоста при превращении головастика; развитие мозга предполагает
программированную гибель некоторых нейронов, причём мутация, предотвращающая
апоптоз клеток эмбрионального мозга, является летальной. Апоптоз растительных клеток,
пораженных инфекционным агентом, предотвращает дальнейшее распространение
инфекции.
У микроорганизмов апоптоз и его механизмы находится в стадии исследования.
Прокариотическим аналогом апоптоза можно также считать гибель части клеточной
популяции E. coli или Bacillus subtilis в условиях стазиса – остановки роста бактериальной
популяции (например, при исчерпании питательного субстрата). Голодающая популяция
E. coli постепенно разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и
подвергается автолизу, в то время как другая субпопуляция использует продукты автолиза
как субстрат и продолжает расти и создавать колониеобразующие единицы.
В подобных случаях апоптоз может рассматриваться как пример альтруизма в
прокариотическом мире.
Ниже приведена статья с сайта elementy.ru, описывающая механизм апоптоза у Bacillus
subtilis, а здесь – статья «Одноклеточные альтруисты» (А.В.Гордеева, Ю.А.Лабас, 2005).
Бактерии-альтруисты помогают своим сородичам-каннибалам
себя съесть
27.02.06 | Генетика, Биология, Александр Марков
«Плодовое тело» Bacillus subtilis — сложный многоклеточный агрегат, часто образуемый дикими бактериями в природе, и
почти никогда — в лаборатории (фото с сайта gasp.med.harvard.edu)
Многоклеточные агрегаты B. subtilis, образующиеся в результате сложного коллективного поведения, порой напоминают
снежинки — частный случай фракталов (фото с сайта www.igmors.u-psud.fr)
Расшифрован молекулярный механизм, регулирующий взаимоотношения в сообществе
почвенных бактерий Bacillus subtilis. Их общественная жизнь полна драматизма: когда пищи
становится недостаточно, одна половина бактерий убивает другую ядом. Погибшие служат
пищей своим убийцам, которые не умирают от собственного яда благодаря особому
защитному белку.
Группа ученых из Гарвардского университета в результате многолетних исследований выяснила
генетическую подоплеку сложного социального поведения B. subtilis. Эти повсеместно
распространенные почвенные бактерии относятся к числу наиболее хорошо изученных
микроорганизмов. Геном «тонкой бациллы» прочтен еще в 1997 году. Его размер — 4 214 630 пар
оснований, общее число генов — 4225, и функции большинства генов в общих чертах известны.
Этого, однако, недостаточно, чтобы понять механизмы, управляющие сложным поведением
бациллы. Этот микроб, например, умеет при необходимости отращивать жгутики и приобретать
подвижность; собираться в «стаи» (swarming behavior); принимать решения на основе химических
сигналов, получаемых от сородичей; при этом используется особое «чувство кворума» (quorum
sensing) — нечто вроде химического голосования, когда определенное критическое число
поданных сородичами химических «голосов» меняет поведение бактерий. Мало того, B. subtilis
способна собираться в многоклеточные агрегаты, по сложности своей структуры
приближающиеся к многоклеточному организму.
В критической ситуации (например, при длительном голодании) бациллы превращаются в споры,
устойчивые к неблагоприятным воздействиям, чтобы дождаться лучших времен. Но превращение
в спору для B. subtilis — процесс дорогостоящий, требующий активизации около 500 генов, и эта
мера приберегается на самый крайний случай. Ну а в качестве предпоследней меры в голодные
времена микроб прибегает к убийству своих сородичей и каннибализму. Если, конечно, сородичей
вокруг достаточно много, то есть плотность популяции высока. Если нет — тогда делать нечего,
приходится превращаться в споры натощак.
Ученые выяснили, что при голодании у B. subtilis срабатывает особый генный переключатель,
который может находиться лишь в одном из двух дискретных состояний (включено/выключено).
«Переключатель» состоит из ключевого гена-регулятора Spo0A и нескольких других генов,
которые взаимно активируют друг друга по принципу положительной обратной связи.
Активизация Spo0A приводит к целому каскаду реакций, в том числе к производству клеткой
токсина SdpC, убивающего тех бацилл, у которых «переключатель» выключен. Тут вся хитрость в
том, что голодание приводит к активизации Spo0A только у половины микробов. Погибшие клетки
распадаются, высвободившиеся из них органические вещества всасываются убийцами. Если
никаких перемен к лучшему так и не произойдет, они теперь, по крайней мере, будут
превращаться в споры сытыми.
До сих пор было неясно, почему токсин убивает только тех бацилл, которые его не выделяют (то
есть тех, у кого Spo0A не активирован). И вот что выяснилось. На мембране бацилл сидит
защитный белок SdpI, выполняющий сразу две функции. Во-первых, он защищает клетку от
токсина SdpC (просто хватает молекулы токсина и держит, не дает им ничего делать). Во-вторых,
молекула белка SdpI, схватившая молекулу токсина, изменяется таким образом, что другой ее
конец (торчащий из внутренней стороны мембраны) хватает и удерживает молекулы белка SdpR,
функция которого состоит в том, чтобы блокировать производство защитного белка SdpI.
Таким образом, схватывание защитным белком молекулы токсина приводит к инактивации белка,
тормозящего производство защитного белка. То есть чем больше будет токсина, тем больше
клетка будет производить защитного белка. А как только токсин в окружающей среде закончится,
молекулы SdpR перестанут инактивироваться, и производство защитного белка остановится.
По молекулярно-биологическим меркам это — крайне простой регуляторный каскад, проще
некуда. Так бациллы защищаются от собственного токсина. А почему же бациллы с выключенным
Spo0A оказываются незащищенными? Оказывается, синтез спасительного SdpI у них блокируется
еще одним белком — AbrB. Отключить AbrB можно только путем включения Spo0A; поэтому
клетки с выключенным Spo0A просто-напросто обречены.
На наш взгляд, самым интересным тут является даже не каннибализм бацилл-убийц, а альтруизм
бацилл-жертв, которые отключают себе всё, что только можно, лишь бы помочь своим сородичам
себя съесть.
Казалось бы, естественный отбор должен способствовать закреплению в потомстве признака
«Spo0A включается при голодании» и отбраковывать особей с противоположным признаком.
Действительно, ведь первые выживают и оставляют потомство, а вторые погибают, и так раз за
разом, при каждой очередной голодовке. Однако генный «переключатель» упорно остается
настроенным так, чтобы включаться при голодовке только в 50% случаев. Ведь если все особи в
популяции захотят стать каннибалами, а жертвами — никто, то всё мероприятие потеряет смысл,
есть будет некого. Интересы общества, как водится, оказываются выше личных, и каннибализм
одних расцветает лишь благодаря альтруизму других.
Источник: C. D. Ellermeier, E. C. Hobbs, J. E. Gonzalez-Pastor, R. Losick. A Three-Protein Signaling
Pathway Governing Immunity to a Bacterial Cannibalism Toxin // Cell. 2006. 124, 549–559.
Об эволюционных корнях альтруизма см. Главу 10 книги Р. Докинза «Эгоистичный ген»,
а также: А. Ярошенко. Эволюция стресса.
2. Коммуникация у бактерий и в бактериальных образованиях.
Вашему вниманию предлагается статья
Коммуникативные сигналы бактерий
В.Д. Грузина
Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе РАМН,
Москва
V.D. Gruzina. Bacteria Communicative Signals
G.F. Gause Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Реакции кворум-сенсинга у грамположительных микроорганизмов

Реакции кворум-сенсинга у грамотрицательных микроорганизмов

Кворум-сенсинг в многоклеточных образованиях

Межвидовые взаимодействия микроорганизмов

Бактериальные цитокины
В настоящее время наблюдается переход от традиционного представления о
бактериях как строго одноклеточных организмах к представлению о микробных
сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в
зависимости от изменения условий обитания.
Колонии практически всех видов бактерий демонстрируют способность к
клеточной дифференцировке и многоклеточной организации. Эта способность наиболее
очевидно проявляется при росте бактерий в их природных местах обитания, где они
формируют различные многоклеточные структуры: биоплёнки, бактериальные маты,
плодовые тела и др.
Понятие «ощущение кворума» (Quorum Sensing) было предложено в 1994 году.
Оно означает восприятие клетками изменений среды, которые наступают при достижении
бактериальной культурой некоторой пороговой численности, и реакцию на эти изменения.
К числу описанных процессов, протекающих лишь при достаточно высокой
плотности популяции, относятся следующие явления:
 биолюминесценция у морских бактерий Vibrio fisheri и V.harveyi;
 агрегация клеток миксобактерий и последующее формирование плодовых
тел со спорами;
 споруляция у бацилл и актиномицетов;
 стимуляция роста у стрептококков и ряда других микроорганизмов;
 конъюгация с переносом плазмид у Enterococcus faecalis и родственных
видов, а также у бактерий рода Agrobacterium;
 синтез экзоферментов и других факторов вирулентности у патогенов
растений (Erwinia carotovora, E.hyacinthii и др.) и животных (Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus);
 образование антибиотиков у представителей рода Streptomyces и у
E.carotovora;
 формирование биоплёнок у Р.aeruginosa и других микроорганизмов.
 Раскрыты механизмы многих из указанных процессов, определены факторы
межклеточной коммуникации, отвечающие за процессы, зависящие от
плотности популяции.
Серьёзной проблемой клинической практики является широкое распространение
устойчивых форм микроорганизмов, снижающее эффективность применения
антибактериальных препаратов. Особенную трудность представляет повышенная
лекарственная устойчивость бактерий в биоплёнках. Для синтеза факторов
вирулентности, антибиотиков и формирования биоплёнок бактерии часто используют
реакции кворум-сенсинга. Поэтому изучение механизмов таких реакций открывает новые
возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами,
а также позволяет по-иному взглянуть на сложный комплекс межвидовых бактериальных
взаимодействий в природных местах обитания микроорганизмов.
Механизмы реакций кворум-сенсинга различаются у грамположительных и
грамотрицательных бактерий, поэтому целесообразно их рассмотрение в отдельности.
Реакции кворум-сенсинга у грамположительных микроорганизмов
Грамположительные бактерии обычно осуществляют коммуникации, используя
олигопептидные сигнальные молекулы. Передача сигналов в большинстве случаев
включает двухкомпонентный механизм фосфорилирования. Как правило, состояние
кворума достигается при переходе популяции бактериальных клеток в стационарную фазу
роста. Именно в это время обнаруживаются сигнальные молекулы, при помощи которых
клетки контактируют друг с другом. Общую схему коммуникаций грамположительных
бактерий можно представить следующим образом: сначала в клетке синтезируется
предшественник, который, модифицируясь, превращается в зрелый олигопептид.
Последний экскретируется наружу клетки экспортером. Молекулы олигопептида
накапливаются в межклеточном пространстве по мере того, как растёт плотность
бактериальных клеток. Двухкомпонентная сенсорная киназа, пронизывающая мембрану,
распознает сигнал и осуществляет его передачу в клетку в процессе каскадного
фосфорилирования. В клетке олигопептидная молекула взаимодействует с целевым геном
(генами).
Классической пептидной кворум-зависимой системой можно считать систему,
отвечающую за конъюгативный перенос плазмид у Enterococcus faecalis и родственных
бактериальных видов. Эта система стимулирует распространение в микробной популяции
признаков, важных для взаимодействия микроорганизма и животного-хозяина, а также
для устранения конкуренции. Переносимая пептидной кворум-зависимой системой
плазмида pPDl отвечает за синтез гемолизинов, плазмида pCDl - за образование
бактериоцина, плазмида pCFlO - за устойчивость E.faecalis к тетрациклину. Каждый гексаили октапептид индуцирует слипание бактериальных клеток и их конъюгацию с
переносом от донора к реципиенту определенной плазмиды. Например, октапептид cPDl
стимулирует конъюгативный перенос плазмиды pPDl. Плазмида кодирует рецептор,
находящийся на белке-репрессоре соответствующего оперона. Взаимодействие
олигопептида с рецептором вызывает диссоциацию репрессора от ДНК, тем самым
запуская синтез соответствующего продукта. Плазмида pPDl включает также ген traC,
продуктом которого является белок, облегчающий проникновение пептида через
клеточную стенку. Олигопептидные сигналы интенсивно синтезируются клетками, не
несущими соответствующие плазмиды (реципиентами), в то время как у клеток-доноров
синтез таких сигналов подавлен, более того, плазмида кодирует ингибирующий пептид.
Продуктом плазмиды pPDl является пептид iPDl, HHaKTHBHpyiounmcPDl.
Другим кворум-зависимым процессом, обнаруженным у E.faecalis, является
выработка двух вирулентных факторов: желатиназы (GelE) и сериновой протеазы (SprE).
Примером использования пептидного сигнала для осуществления межклеточных
взаимодействий может служить система кворум-сенсинга, осуществляющая контроль над
синтезом экзотоксинов в поздней логарифмической фазе роста у Staphylococcus aureus.
В этой системе белок AgrD синтезируется в виде предшественника, состоящего из 46
аминокислот, который в процессе экспорта белком AgrB превращается в зрелый пептид
AIP (autoinducing peptide), состоящий из 8 аминокислот. AIP распознается
двухкомпонентной сенсорной киназой AgrC, которая передает сигнал внутрь клетки в
процессе фосфорилирования регулятора ответа - AgrA. AgrA~P активирует транскрипцию
целевых генов, стимулирует транскрипцию оперона agrB, D, С, А (положительная
ауторегуляторная петля), а также «запрещает» транскрипцию генов, кодирующих другие
экзотоксины. На основании различий в AIP и его рецепторе штаммы S.aureus могут быть
отнесены к четырём или более группам. Олигопептиды, синтезируемые одной из групп,
индуцируют патогенность в этой группе и специфически подавляют системы Agrвирулентности в других группах.
От плотности популяции зависит появление компетентности в поздней
логарифмической фазе роста у Streptococcus pneumoniae. Ген соmС кодирует
предшественник, состоящий из 41 аминокислотного остатка. Последний преобразуется в
зрелый пептид, состоящий из 17 аминокислотных остатков в процессе взаимодействия с
системой экспорта пептидов (АВС-система), которую образуют продукты генов соmАВ.
Пептид контактирует со своим рецептором на поверхности клетки - гистидинкиназой,
продуктом гена comD. Активированная гистидинкиназа фосфорилирует продукт гена
соmЕ. По мере накопления клеток количество пептидных сигналов растёт и достигает в
среде
критического
уровня.
Соответственно
увеличивается
и
количество
фосфорилированного белка cоmЕ, который, начиная с определенной концентрации,
связывается с промотором оперона comCDE, стимулируя его работу (положительная
ауторегуляторная петля), активирует промотор оперона соmАВ (система экспорта белка
из клетки), активирует оперон сотХ, который включает целую цепочку поздних генов
компетентности; отвечающих за связывание и поглощение трансформирующей ДНК и все
остальные, поздние стадии трансформации.
В добавление к приведённым примерам реакций кворум-сенсинга у
грамположительных бактерий нужно отметить, что в качестве сигнальных молекул
помимо олигопептидов грамположительными бактериями также используются вещества
другой химической природы. Так, у представителей порядка Actinomycetales наряду с
пептидными сигнальными молекулами были обнаружены вещества низкомолекулярной
природы, большинство из которых содержит лактонную группировку.
У стрептомицетов в системы кворум-сенсинга вовлечены бутиролактоны и
соответствующие им белковые рецепторы, которые совместно регулируют
морфологическое развитие и образование антибиотиков у их продуцентов. Наиболее
хорошо изученным актиномицетным регулятором является А-фактор, представляющий
собой 2-изо-каприлоил-3-оксиметил-у-бутиролактон.
Влияние
А-фактора
на
морфологическую
дифференцировку
и
антибиотикообразование подчиняется общей схеме работы стрептомицетных регуляторов,
содержащих лактонную группировку. На ранних стадиях роста, когда концентрация Афактора низка, рецептор А-фактора (АгрА) связывается и репрессирует экспрессию
общего гипотетического активатора биосинтеза стрептомицина и спорообразования. При
выделении АгрА из клеточного лизата S.griseus IFO 13350 было показано, что этот белок
состоит из 276 аминокислот и имеет молекулярную массу 29,1 кДа.
Когда плотность культуры возрастает, концентрация А-фактора достигает
критического уровня, при котором он связывает АгрА, вызывая диссоциацию последнего
от ДНК и, таким образом включая транскрипцию ключевого гена adpA, кодирующего
AdpA (белок, состоящий из 405 аминокислот, содержащий в центральном участке сайт
связывания с ДНК, схожий с регуляторами транскрипции из семейства белков AraC/XylS).
AdpA, в свою очередь, является позитивным регулятором обнаруженного
цитоплазматического активатора кластера генов биосинтеза стрептомицина и активаторов
процесса спорообразования. Цитоплазматический активатор, связываясь с ДНК в районе
промотора гена специфической регуляции кластера биосинтеза стрептомицина strR,
индуцирует транскрипцию данного гена, расположенного вслед за ним гена устойчивости
к собственному антибиотику - aphD, гена adsA, кодирующего экстрацитоплазматический
а-фактор РНК-полимеразы, необходимой для формирования воздушного мицелия, а также
гена sgmA, кодирующего белок-пептидазу, участвующую наряду с другими
гидролитическими ферментами в деградации белков субстратного мицелия в результате
формирования воздушного мицелия. Регуляторный продукт гена strR обусловливает
начало транскрипции структурных генов биосинтеза в составе кластера с StrR-зависимых
промоторов. Начало экспрессии с промотора strR гена под влиянием цитоплазматического
активатора
обеспечивает
также
наработку
продукта
гена
aphD
аминогликозидфосфотрансферазы, и тем самым создание базового уровня устойчивости
штамма к собственному антибиотику.
Показано, что у разных видов стрептомицетов наблюдается гомология между
структурными
элементами
регуляторов.
Нуклеотидные
последовательности,
гомологичные гену агрА у S.griseus, обнаружены также у других стрептомицетов.
Например, у S.coelicolor A3 (2) было обнаружено два гена сргА и сргВ, кодирующих
АгрА-подобные белки СргА и СргВ, которые на 90,7% сходны между собой и на 35% - с
АгрА.
Реакции кворум-сенсинга у грамотрицательных микроорганизмов
Более чем у 450 видов грамотрицательных бактерий обнаружены кворумзависимые системы, в которых сигнальными молекулами служат различные
ацилгомосеринлактоны. Общую схему коммуникаций грамотрицательных бактерий
можно представить следующим образом: в системе кворум-сенсинга грамотрицательных
бактерий белки семейства Luxl являются аутоиндукторными синтазами и катализируют
формирование специфических ацилгомосеринлактонных аутоиндукторных молекул.
Аутоиндукторы свободно диффундируют через мембрану и аккумулируются по мере
увеличения плотности клеток. Белки семейства LuxR связывают родственные им
аутоиндукторы при достижении достаточно высокой концентрации сигнальных молекул.
Комплекс LuxR - аутоиндуктор связывается с промотором целевых генов, запуская их
транскрипцию.
Бактерии рода Erwinia (E.carotovora, E.chrysanthemii) - патогены для растений. Они
расщепляют растительные клеточные стенки с помощью пектиназ и целлюлаз.
Образование этих ферментов является важным фактором вирулентности и зависит от
плотности популяции. У Erwinia функционирует генная система expI-expR, аналогичная
системе luxI-luxR у V.fisheri. В реакциях кворум-сенсинга также задействована
регуляторная система, обеспечиваемая транскрипцией генов rsmA-rsmB. От плотности
популяции у E.carotovora зависит также синтез антибиотика карбапенема. Продукция
этого антибиотика находится под контролем кластера генов сагА-сагН, и, возможно,
необходима для устранения конкурирующих микроорганизмов в локусе заражения
растения.
Другой пример использования в качестве сигнальных молекул гомосеринлактонов
показан для Pseudomonas aeruginosa - патогена для животных. Патогенность у Р.aeruginosa
обусловлена широким арсеналом факторов вирулентности. Одни из них ассоциированы с
клеткой (пили, адгезины, липополисахариды), другие секретируются (протеазы,
рамнолипиды, экзофермент S, экзотоксин А, антибиотик пиоцианин и т. д.). Образование
многих из внеклеточных факторов вирулентности контролируется системами
межклеточного взаимодействия. Центральными компонентами таких взаимодействий
служат las- и rhl-системы кворум-сенсинга, активирующие экспрессию генов в
зависимости от величины плотности клеток микроорганизма. Каждая система
представлена двумя генами: один кодирует фермент, при помощи которого синтезируется
специфический аутоиндуктор - ацилированный гомосеринлактон (lasl/rhll); другой
кодирует активатор транскрипции, с которым связывается соответствующий
аутоиндуктор (lasR/rhIR). Аутоиндуктором систем las и rhi является N-(3оксододеканоил)-L-гомосеринлактон (З-оксо-С12-HSL), для экспорта которого из клетки
служит специальная система, получившая название MexEF-OprN-помпа и N-бутирил-Lгомосеринлактон (C4-HSL) соответственно.
Система las контролирует экспрессию генов, кодирующих такие факторы
вирулентности, как эластазы А, В, а также щелочную протеазу; система rhi - ферменты
биосинтеза рамнолипидов, пиоцианина. Недавно была обнаружена третья сигнальная
молекула, принимающая участие в реакциях кворум-сенсинга у P.aeruginosa - 2-гептил-Згидрокси-4-хинолон (PQS). Эта сигнальная молекула может контролировать уровень
экспрессии las В, кодирующего эластазу Las В, а также уровень экспрессии rhil,
кодирующего синтазу C4-HSL.
Бактерия Agrobacterium tumefaciens вызывает образование корончатых галлов у
многих видов растений. Галлы представляют собой растительный аналог злокачественной
опухоли и образуются в результате переноса онкогенных фрагментов ДНК от бактерии в
ядро растительной клетки посредством Ti-плазмид. Некоторые из генов Ti-плазмид
обусловливают синтез растительными клетками опинов, которые служат питательным
субстратом для A.tumefaciens. Гомологичная luxI-luxR генная система traI-traR
стимулирует распространение Ti-плазмид в бактериальной популяции. Плазмидная ДНК
стремится распространиться в популяции бактерий и, как только создается достаточный
«кворум», побуждает несущие плазмиду клетки конъюгировать с другими
бактериальными клетками. В то же время конъюгативный перенос Ti-плазмид зависит от
опинов. В частности, транскрипция traR стимулируется фактором OccR, активируемым
октопином.
Кворум-сенсинг в многоклеточных образованиях
Способность бактерий образовывать биоплёнки интересна ввиду того, что
представители патогенных для человека и животных возбудителей проявляют
устойчивость к действию антимикробных веществ при их росте в биоплёнках. Биоплёнки
- высокоупорядоченные бактериальные сообщества, которые позволяют бактериям жить в
прикреплённом состоянии. Биоплёнки могут состоять из одного или нескольких видов
бактерий. Их пронизывает сеть водных каналов, обеспечивающих доставку питательных
веществ членам сообщества и удаляющих продукты метаболизма. В одной биоплёнке
можно наблюдать различные образцы генной экспрессии, что говорит о том, что
индивидуальные члены сообщества имеют «специфические обязанности», которые,
комбинируясь с другими, усиливают жизнеспособность всего консорциума.
Биоплёнки формируются в лёгких патогенным микроорганизмом P.aeruginosa.
Толщина такой биоплёнки составляет несколько сотен микрометров. Микроколонии в
зрелой биоплёнке расположены во внеклеточном полисахаридном матриксе. Внутри
биоплёнки обнаруживается неоднородность: в ней существует кислородный градиент уменьшение концентрации кислорода от периферии вглубь. Предполагается, что сходные
градиенты будут обнаружены для рН и питательных веществ. Эти градиенты
обеспечивают физиологическую вариабельность среди индивидуальных клеток
биоплёнки: так, в глубине клетки растут гораздо медленнее, чем на периферии. Бактерия в
такой зрелой биоплёнке фенотипически устойчива к бактерицидным агентам. Таким
образом, биоплёнки вызывают различные типы хронических бактериальных инфекций.
Формирование биоплёнки у P.aeruginosa находится под контролем реакций кворумсенсинга. Мутации гена lasI нарушает созревание биоплёнки, так как белок LasI не
синтезирует 3-oкco-C12-HSL, и после стадии микроколонии формирование микропленки
не продолжается. Роль C4-HSL в процессах формирования остаётся неизвестной.
Биоплёнки, образуемые мутантами по LasI-белку, восприимчивы к детергентам, в то
время как нормальные биоплёнки устойчивы. Это дает повод думать, что терапия,
нацеленная на нарушение регуляции механизма кворум-сенсинга у P.aeruginosa, может
привести к остановке формирования биоплёнки, что повысит чувствительность этой
бактерии к антимикробным агентам.
Формирование биоплёнки у патогенной бактерии Burkholderia cepacia также
определяется «чувством кворума». При росте в биоплёнках данный микроорганизм
подобно P.aeruginosa обнаруживает значительную устойчивость к антимикробным
агентам.
Межвидовые взаимодействия микроорганизмов
Межвидовые коммуникации у бактерий могут служить для синхронизации
специализированных функций видов в группе. Разнообразие, присутствующее в каждой
данной популяции, может повышать выживаемость для всего сообщества. Более того,
продуктивные взаимодействия на основе кворум-сенсинга могут способствовать развитию
многовидовых бактериальных организаций, таких, как биоплёнки, а также установлению
специфических симбиотических ассоциаций с хозяевами - эукариотами.
Межвидовые взаимодействия микроорганизмов наиболее полно изучены на
примере микробного сообщества ротовой полости и поверхности зубов человека.
В биоплёнках на поверхности зубов выявлено около 500 видов бактерий, которые
функционируют как координированное сообщество, имеющее внутри- и межвидовые
коммуникации. Стрептококки составляют от 60 до 90% бактерий, которые колонизируют
поверхность зубов в течение первых четырёх часов после ее очистки стоматологом. Среди
других видов «ранних колонизаторов» обнаруживаются представители Actinomyces,
Capnocytophaga, Eikenella, Haemophilus, Prevotella, Propionibacterium и Veillonella.
Способы коммуникаций среди генетически идентичных клеток, по всей
вероятности, отличаются от сигналов при межвидовых коммуникациях. Нет доказательств
наличия среди сигнальных молекул бактерий ротовой полости типичных представителей
семейства ацилгомосеринлактонов, которые регулируют внутривидовую генную
экспрессию у грамотрицательных бактерий.
Главной сигнальной молекулой при межвидовых коммуникациях является AI-2
(autoinduktor). Подтверждением этому является факт обнаружения гена luxS,
кодирующего фермент, необходимый для синтеза молекулы AI-2, у нескольких родов
бактерий ротовой полости.
AI-2 впервые был обнаружен у морской светящейся бактерии Vibrio harveyi, для
которой он является сигнальной молекулой, регулирующей процесс биолюминесценции.
Позже наличие AI-2 было показано более чем у 30 видов бактерий, включающих
грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы.
Иногда для одной группы бактерий может быть полезным негативно влиять на
цикл реакций кворум-сенсинга конкурирующей группы бактерий. Исследования в этой
области выявляют несколько примеров стратегий антикворум-сенсинга, которые
используют сосуществующие популяции бактерий. Так, Staphylococcus epidermidis
использует пептид для контроля уровня своей agr вирулентности, а также для подавления
вирулентности у Staphylococcus aureus.
Штамм Bacillus sp. 240B1 демонстрирует способность к энзиматической
инактивации ацилгомосеринлактонов - сигнальных молекул грамотрицательных бактерий.
Было показано, что в присутствии АИА, гомосеринлактоназы, состоящей из 250
аминокислот, разрушаются молекулы гомосеринлактонов, продуцируемых патогеном у
растений Erwinia сагоtovora. Гены, гомологичные гену аiiА, обнаружены и у 16 подвидов
Bacillus thuringiensis, следовательно, данные микроорганизмы также способны
осуществлять деградацию гомосеринлактонов.
Почвенная
бактерия
Variovorax
paradoxus
может
использовать
ацилгомосеринлактоны в качестве единственного источника углерода и азота. Этот факт
указывает на то, что в своих природных местах обитания V.paradoxus может расти на
ацилгомосеринлактонах, извлекая выгоду из конкурентного обострения в окружающей
среде. В данном случае фермент, разрушающий ацилгомосеринлактоны, отличен от AiiAлактоназы: это - аминоацилаза, отщепляющая лактонное кольцо от ацильной группы.
По причине того, что у многих патогенов животных и растений системы кворумсенсинга контролируют вирулентность, эти системы можно рассматривать как
потенциальные мишени для действия антимикробных агентов. Во-первых, одна из
стратегий состоит в ингибировании синтеза молекул - предшественников
ацилгомосеринлактонов или самих ацилгомосеринлактонов. Во-вторых, мишенью
лекарственных препаратов могут служить системы, контролирующие выброс и диффузию
ацилгомосеринлактонов. В-третьих, ацилгомосеринлактон-подобные антагонисты могут
конкурировать с ацилгомосеринлактонами за связывание с гомологами LuxR. Вчетвертых, возможно применение ферментов, расщепляющих ацилгомосеринлактоны, а
также антител к этим молекулам. И, наконец, как было показано недавно, гены аiiА,
кодирующие лактоназы, осуществляющие деградацию ацилгомосеринлактонов, могут
быть внедрены в геном растений, экспрессируясь в котором, они могли бы обеспечивать
защиту растению-хозяину от патогенных микроорганизмов. Так, трансгенные растения
табака с включенным аiiА-геном успешно противостояли заражению E.carotovora.
Бактериальные цитокины
Обнаружено, что прокариотические микроорганизмы синтезируют вещества,
похожие на гормоны позвоночных (включая стероиды и полипептидные гормоны, такие,
как инсулин). Увеличивается количество данных, подчеркивающих важность химически
опосредованных межклеточных взаимодействий в бактериальных культурах для таких
событий, как споруляция, конъюгация, вирулентность и биолюминесценция. Таким
образом, в настоящее время многие исследования в области микробиологии посвящены
взаимодействиям между микроорганизмами, основанными на использовании
бактериальных цитокинов.
Известно, что микроорганизмы способны гибко адаптироваться к изменяющимся
условиям окружающей среды (в частности, к недостатку питательных компонентов). При
этом некоторые из них обладают генетически закреплённой специфической организацией
метаболизма, позволяющей существовать при очень низких концентрациях питательных
веществ (олиготрофы). Клетки другой категории (копиотрофы) при истощении среды
обитания способны включать специальные программы переживания неблагоприятных
условий. Часть из них образуют специализированные структуры (споры и цисты), которые
чрезвычайно устойчивы к различным стрессам, неспорулирующие же бактерии способны
переживать неблагоприятные условия, оставаясь вегетативными клетками с пониженной
метаболической активностью, т.е. переходя в особое VBNC (viable but nonculturable жизнеспособные, но некультивируемые) состояние. Естественно, что некультивируемые
бактерии остаются за рамками общепринятых методов исследований (высевы на плотные
или жидкие среды не позволяют их обнаруживать). Например, возбудители таких опасных
заболеваний, как холера и кампилобактериоз, склонны образовывать некультивируемые
формы. При микроскопическом исследовании образцов, выделенных из окружающей
среды (почва, речные и морские воды и т.д.) обнаружено множество клеток, которые,
обладая метаболической активностью, не могут образовывать полноценную культуру (т.е.
некультивируемые). В настоящее время известно всего несколько примеров превращения
таких бактерий в нормальные культивируемые клетки. Концепция цитокин-зависимого
роста микроорганизмов позволяет по-новому рассматривать проблему подбора сред для
восстановления некультивируемых форм.
Некультивируемые формы патогенных бактерий обнаружены не только в
окружающей среде, но и в тканях, органах человека и животных. Чаще всего они сильно
отличаются морфологически и биохимически. Например, возбудитель туберкулёза в
тканях образует нетипичные кокковидные формы. Возможно, такие клетки являются
особыми переживающими формами, способными к активации и размножению.
Существование таких покоящихся форм может объяснить периодически возникающие
рецидивы болезни у, казалось бы, вылеченных больных. Показано, что клетки
Mycobacterium tuberculosis могут переходить в нереплицируемое кокковидное состояние в
микроаэрофильных условиях in vitro, которые часто возникают in vivo (например, в
гранулемах). Кокковидные формы также обнаружены для Campylobacter jejuni и
Helicobacter pylori. Предполагается, что они образуются в тканях в ответ на воздействие
лекарств и, возможно, являются покоящимися клетками, устойчивыми к действию
антибиотиков. Однако данные о культивировании таких форм весьма противоречивы.
Возможно, такие бактерии могут быть активированы какими-то специфическими
ростовыми факторами, роль которых, вероятно, исполняют цитокины хозяина. Например,
рост туберкулёзных бацилл внутри моноцитов существенно стимулировался
трансформирующим ростовым фактором (TGF-1), тогда как рост клеток М.tuberculosis и
M.avium внутри макрофагов значительно ускорялся в присутствии эпидермадьного
ростового фактора. Очевидно, цитокинные факторы хозяина могут играть важную роль и
в активации покоящихся бактерий, и в размножении активных возбудителей. Снижение
уровня инсулина в крови больных сахарным диабетом приводит к значительному
размножению клеток Pseudomonas pseudomallei, являющихся возбудителями мелиоидоза,
а трансферрин имеет большое значение для роста и переживания внутри мышиных
макрофагов клеток Francisella tularensis.
Возможно, что специфические бактериальные цитокины также играют
существенную роль в образовании покоящихся форм и их восстановлении в активные
делящиеся клетки. Тогда, принимая во внимание проблемы возникновения устойчивости
к антибиотикам, сложно переоценить важность отыскания автокринных ростовых
факторов, необходимых для роста патогенных бактерий, и, следовательно, являющихся
мишенью для воздействия принципиально новых антибиотиков, нетоксичных для
больного.
Применение специфических бактериальных цитокинов также может существенно
улучшить ситуацию с выращиванием некультивируемых бактерий в средах, не вполне
подходящих для их размножения. Например, обычно не растущие на минимальной
сукцинатной среде микрококки начинают нормально в ней размножаться в присутствии
автокринного фактора Rpf (resuscitation-promoting factor), а отмытые клетки
Mycobacterium smegmatis, которые растут на минимальной среде только при добавлении
Rpf, выделенного из Micrococcus luteus, можно рассматривать в качестве модели
популяции «голодающих» бактерий в почве, вероятно, требующей для начала деления
присутствия специфического цитокина. Применение специфических бактериальных
цитокинов также может существенно улучшить ситуацию с выращиванием
некультивируемых бактерий в средах, не вполне подходящих для их размножения. Гены,
имеющие сходство с геном, кодирующим белок Rpf у М.luteus, широко распространены
среди грамположительных бактерий с высоким содержанием G+C, к которым относятся
стрептомицеты, коринебактерии и микобактерии. Этот факт открывает новые
возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами,
а также позволяет по-иному взглянуть на сложный комплекс межвидовых бактериальных
взаимодействий в природных местах обитания микроорганизмов.
Последнее обновление: 20.02.2004
В.Д. Грузина. Коммуникативные сигналы бактерий
ЛИТЕРАТУРА
Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и
межклеточная коммуникация у микроорганизмов. Микробиология 2000; 69: 3: 309-327.
Fuqua W.С., Winans S., Greenberg Е. Quorum sensing in bacteria: the Lux R-Lux I
family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 1994; 176: 2: 269-275.
Meighen E. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol Rev 1991;
55:1:123-142.
Winans S.С., Bassler В.L. Mob psychology. J Bacteriol 2002; 184: 4: 873-883.
Writh R., Muscholl A., Wanner G. The role of pheromones in bacterial interactions.
Trends Microbiol 1996; 4: 3: 96-103.
Хохлов А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М.: 1988;270.
Waldburger С., Gonzalez D., Chambliss G.H. Characterization of a new sporulation
factor in Bacillus subtilis. J Bacteriol 1993; 175: 6321-6327.
Pestova E., Havarstein L., Morrison D. Regulation of competence for genetic
transformation in Streptococcus pneumoniae by an auto-induced peptide pheromones and a twocomponent regulatory systems. Mol Microbiol 1996; 21:4: 853-862.
Alloing G., Martin В., Granadel G., Claveris J. Development of competence in
Streptococcus pneumoniae: pheromone autoinduction and control of quorum-sensing by the
oligopeptide permease. Ibid 1998; 9:1: 75-83.
Прозоров А.А. Феромоны компетентности у бактерий. Микробиология 2001; 70:
1:5-14.
Salmond G., Bycroft В., Stewart С., Williams P. The bacterial «enigma»: cracking the
code of cell-cell communication. Mol Microbiol 1995; 16:4:615-624.
Greenberg E., Winans S., Fuqua C. Quorum-sensing by bacteria. Ann Rev Microbiol
1996; 50: 727-751.
Otto M., Sussmuth R., Vuong C. et al. Inhibition of virulence factor expression in
Staphylococcus aureus by the Staphylococcus epidermidis agr pheromone and derivatives. FEBS
Lett. 1999; 450: 257-262.
Dong Y., Xu J., Li X., Zhang L. AiiA, an enzyme that inactivates the acyl-homoserine
lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovoru. Proc Natl
Acad Sci 2000; 97:7: 3526-3531.
Byers J., Lucas C., Salmond G., Welch М. Nonenzymatic turnover of an Erwinia
carotovora quorum-sensing signaling molecule. J Bacteriol 2002; 184:4: 1163-1171.
Calfee М., Coleman J., Pesci E. Interference with Pseudomonas quinolone signal
synthesis inhibits virulence factor expression by Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci
2001; 98: 20:11633-11637.
Nakayama J., Takanami Y., Horii T. et al. Molecular mechanism of pep-tide-specific
pheromone signaling in Enterococcus faecalis: functions of pheromone receptor TraA and
pheromone-binding protein TraC encoded by plasmid pPDI. J Bacteriol 1998: 180: 3: 449-456.
Mylonakis E., Engelbert М., Qin X. et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key
component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit
endophthalmitis model. Infect Immun 2002; 70: 8: 4678-4681.
Sifri C., Mylonakis E., Singh V. et al. Virulence effect of Enterococcus faecalis protease
genes and the quorum-sensing locust in Caenorhabditis elegans and mice. Ibid 2002; 70:10:
5647-5650.
Matson М., Armitage J., Hoch J., Macnab R. Bacterial locomotion and signal
transduction. J Bacteriol 1998; 180: 5: 1009-1022.
Onaka H., Horinouchi S. DNA-binding activity of the A-factor receptor protein and its
recognition DNA sequences. Mol Microbiol 1997; 24: 991-1000.
Onaka H., Ando N., Nihira Т., Yamada Y. et al. Cloning and characterisation of the Afactor receptor gene from Streptomyces griseus. J Bacteriol 1995; 177: 21: 6083-6092.
Ohnishi Y., Kameyama S., Onaka H., Horinouchi S. The A-factor regulatory cascade
leading to streptomycin biosynthesis in Streptomyces griseus: identification of a target gene of
the A-factor receptor. Mol Microbiol 1999; 34: 102-111.
Yamazaki H., Ohnishi Y., Horinouchi S. An A-factor-dependent extracytoplasmatic
function sigma factor (OAdsA) that is essential for morphological development in Streptomyces
griseus. J Bacteriol 2000; 182:16:4596- 4605.
Kato J., Suzuki A., Yamazaki H. et al. Control by A-factor of a metalloendopeptidase
gene involved in aerial mycelium formation in Streptomyces griseus. Ibid 2002; 184: 21: 60166025.
Onaka H., Nikagawa Т., Horinouchi S. Involvement of two A-factor receptor
homologues in Streptomyces coelicolor A3(2) in the regulation of secondary metabolism and
morphogenesis. Mol. Microbiol. 1998; 28:4: 743-753.
Revenchon S., Bouillant М., Salmond G., Nasser W. Integration of the quorum-sensing
system in the regulatory networks controlling virulence factor synthesis in Erwinia
chrysanthemii. Mol Microbiol 1998; 29: 1407-1418.
Chatterjee A., Cui Y., Chatterjee A.K. RsmA and the quorum-sensing signal, N-[3oxohexanoyl]-L-homoserine lactone, control the levels of rsmB RNA in Erwinia carotovora
subsp. carotovora by affecting its stability. J Bacteriol 2002; 184:15: 4089-4095.
Kohler Т., Van Delden C., Curty L. et al. Overexpression of the MexEF-OprN multidrug
efflux system affects cell-to-cell signaling in Pseudomonas aeruginosa. Ibid 2001; 183: 18: 52135222.
Gallagher L., McKnight S., Kuznetsova М. el al. Functions required for extracellular
quinolone signaling by Pseudomonas aeruginosa. Ibid 2002; 184:23:6472-6480.
Parsek М., Greenberg P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram-negative
bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms. Proc Natl Acad
Sci 2000; 97: 16: 8789-8793.
Conway В.А., Уепи V., Speert D. Biofilm formation and acyl-homoserine lactone
production in the Burkholderia cepacia complex. J Bacteriol 2002; 184:20:5678-5685.
Kolenbrander P., Andersen R., Blehert D. et al. Communication among oral bacteria.
Microb. Molecular Biology Rev 2002; 66: 3: 486-505.
Miller M., Bassler B. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 2001; 55: 165199.
Frias J., Olle E., Alsina M. Periodontal pathogens produce quorum sensing signal
molecules. Infect Immun 2001; 69: 3431-3434.
McNab R., Ford S., EI-Sabaeny A. et al. LuxS-based signaling in Streptococcus gordonii:
Autoinducer 2 controls carbohydrate metabolism and biofilm formation with Porphyromonas
gingivalis. J Bacteriol 2003; 185: 1:274-284.
Bassler В., Wright M., Silverman M. Multiple signalling systems controlling expression
of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory
pathway. Mol Microbiol 1994; 13: 273-286.
Ji G., Beavis R., Novick R. Bacterial interference caused by autoinducing peptide
variants. Science 1997; 276: 2027-2030.
Lee S., Park S., Lee J., et al. Genes encoding the N-acyi homoserine lactone-degrading
enzyme are widespread in many subspecies of Bacillus thuringiensis. Appl Environ Microbiol
2002; 68: 8: 3919-3924.
Leadbetter J., Greenberg E. Metabolism of acylhomoserine lactone quorum-sensing
signals by Variovorax paradoxus. J Bacteriol 2000; 182:6921-6926.
Hoang Т., Schweizer H. Characterization of Pseudomonas aeruginosa enoyl-acyl carrier
protein reductase (Fabl): a target for the antimicrobial triclosan and its role in acylated
homoserine lactone synthesis. Ibid 1999; 181:. 5489-5497.
Pearson J., Delden C., Iglewski B. Active efflux and diffusion are involved in transport of
Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signals. J. Bacteriol. 1999; 181: 1203-1210.
Manefield M., Welch M., Givskov G. et al. Halogenated furanoses from the red alga,
Delisea pulchra, inhibit carbapenem antibiotic synthesis and exoenzyme virulence factor
production in the phytopatoge Erwinia carotovora. FEMS Microbiol Lett 2001; 205: 131-138.
Dong Y., Wang L., Xu J. et al. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection
by an N-acyl homoserine lactonase. Nature. 2001; 411:813-817.
Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Цитокины - возможные активаторы роста
патогенных бактерий. Вести РАМН 2000; 1: 13-17.
Barcina I., Lebaron P., Vives-Rego J. Survival of allochthonous bacteria in aquatic
systems: a biological approach. FEMS Microbiol Ecol 1997; 23:1-9.
Heim S., Lleo M., Bonato B. et al. The viable but nonculturable state and starvation are
different stress responses of Enterococcus faecalis, as determined by proteome analysis. J
Bacteriol 2002; 184:23: 6739-6745.
Xu H., Roberts N., Singleton F. el al. Survival and viability of nonculturable Escherichia
coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microb Ecol 1982; 8: 313323.
Kell D., Kaprelyants A., Grafen A. Pheromones, social-behavior and the functions of
secondary metabolism in bacteria. Trends In Ecology & Evolution 1995; 10: 126-129.
Domingue G., Woody H. Bacterial persistence and expression of disease. Clin Microbiol
Rev 1997; 10: 320-328.
Khomenko A. The variability of Mycobacterium tuberculosis in patients with cavitary
pulmonary tuberculosis in the course of chemotherapy. Tubercle Lung Disease 1987; 68: 243253.
Gangadharam P. Mycobacterial dormancy. Tub Lung Dis 1995; 76: 477-479.
Wayne L. Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease. European J
Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 908-914.
Wayne L., Hayes L. An in vitro model for sequential study of shiftdown of
Mycobacterium tuberculosis through 2 stages of nonreplicating persistence. Infect Immun 1996;
64: 2062-2069.
Beumer R., Devries J., Rombouts F. Campylobacter jejuni nonculturable coccoid cells.
Intern J Food Microbiol 1992; 15: 153-163.
Kusters J., Gerrits M., Van Strijp J. el at. Coccoid forms of Helicobacter pylori are the
morphologic manifestation of cell death. Infect Immun 1997; 65: 3672-3679.
Cellini L., Hui P., Leung K. el at. Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro
reverts in mice. Microbiol Immun 1994; 38: 843-850.
Hirsch С., Yoneda T., Averill L. et al. Enhancement of intracellular growth of
Mycobacterium tuberculosis in human monocytes by transforming growth-factor-b-l. J. Infect
Dis 1994; 170: 1229-1237.
Bermudez. L., Pelrofsky M. Regulation of the expression of Mycobacterium avium
complex proteins differs according to the environment within host cells. Immunol Cell Biol
1997; 75: 35-40.
Woods D., Jones A., Hill P. Interaction of insulin with Pseudomonas pseudomallei. Infect
Immun 1993; 61: 4045-4050.
FortierA., Leiby D., Narayanan R. et al. Growth of Francisella tularensis LVS in
macrophages - the acidic intracellular compartment provides essential iron required for growth.
Ibid 1995; 65:1478-1483.
Duncan S., Glover L., Killham K., Prosser J. Luminescence-based detection of activity of
starved and viable but nonculturable bacteria. Appl Environ Microbiol 1994; 60: 1308-1316.
Young D., Duncan K. Prospects for new interventions in the treatment and prevention of
mycobacterial disease. Ann. Rev. Microbiol. 1995; 49: 641-673.
Mukamolova G., Kapreilyants A., Young D. et al. A bacterial cytokine. Proc Nat! Acad
Sci USA. 1998; 95: 8916-8921.
Шлеева M.О., Мукамолова Г.В., Телков M.В. и др. Образование
«некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление. Микробиология
2003; 72: 76-83.
2004
http://www.antibiotic.ru/
©
ANTIBIOTIC.ru