Древний мир РНК
advertisement
Древний мир РНК А. С. Спирин Институт белка Российской академии наук и Кафедра молекулярной биологии Московского университета Резюме Основываясь на современных представлениях о многофункциональности РНК, автор рассматривает ряд новых механизма, участие которых в происхождении и эволюции древнего мира РНК могли играть критическую роль. Так, реакция спонтанной трансэстерификации полирибонуклеотидов, открытая А.Б. Четвериным с сотрудниками, могла приводить к удлинению первичных коротких олигорибонуклеотидов и к генерации вариантов последовательностей для последующего естественного отбора случайно возникающих функционально активных молекул. Далее, образование смешанных молекулярных колоний РНК на влажных твердых средах типа глин могла обеспечить компартментализацию ансамблей функционально активных РНК в отсутствие оболочек и мембран, что было необходимо для дальнейшей эволюции формирующегося мира РНК. Систематическое экспоненциальное обогащение популяции РНК функционально лучшими молекулами за счет попеременного растворения колоний при затоплении и образования новых колоний при подсушивании первобытных водоемов («первобытный естественный SELEX») могло быть главным двигателем эволюционного процесса в мире РНК. 1 Введение Главной проблемой в происхождении жизни является вопрос о возникновении аппарата наследственности, а, следовательно, о возникновении «вещества наследственности» нуклеиновых кислот. Обе нуклеиновые кислоты – рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – химически представляют собой линейные (неразветвленные) полимеры, построенные из четырех сортов нуклеозидных остатков (соединений пятиуглеродного сахара и азотистого пуринового или пиримидинового основания), соединенных между собой фосфатными группами. Фосфатные группы соединяют углеводные части нуклеозидов в цепь, так что цепь нуклеиновой кислоты может быть описана как пентозо-фосфатный полимер с азотистыми основаниями в качестве боковых групп. Основное различие химических структур РНК и ДНК состоит в том, что углеводным компонентом РНК является рибоза, а в ДНК – дезоксирибоза, дегидроксилированное производное рибозы. Однако, пространственная структура этих двух близкородственных полимеров различается принципиально: ДНК – это жесткая двойная спираль, образованная за счет парного взаимодействия бок-о-бок двух полидезоксирибонуклеотидных цепей, а РНК – одноцепочечная гибкая молекула. ДНК представляет собой гены, и ее двуспиральная пространственная структура необходима для точного копирования своей собственной первичной структуры (специфической последовательности четырех сортов мономеров цепи) в процессе комплементарной редупликации (Watson and Crick, 1953). Долгое время считалось, что функция РНК состоит лишь в копировании (транскрипции) одной из цепей ДНК для того, чтобы служить генетической матрицей для синтеза белков. Представление об этом потоке генетической информации от ДНК через РНК к белкам и его необратимости было сформулировано как «центральная догма молекулярной биологии» (рис. 1). Впоследствии, однако, утверждение о необратимости потока информации от ДНК к РНК было подвергнуто ревизии: было открыто, что в ряде случаев – в первую очередь при вирусных инфекциях – наблюдается явление «обратной транскрипции», когда на матрице РНК синтезируется комплементарная цепь ДНК (Baltimore, 1970; Temin and Mizutani, 1970). При этом признание строгой необратимости потока информации от нуклеиновых кислот к белкам продолжает быть основой всей современной генетики и молекулярной биологии. 2 Многофункциональность РНК Итак, вплоть до недавнего времени за нуклеиновыми кислотами, и в том числе за РНК, признавались лишь генетические функции (рис. 2). Главная генетическая функция – функция комплементарной комплементарной репликации полинуклеотидной (т.е. цепи) репликации при через участии образование катализирующего полимеризацию фермента – безусловная прерогатива ДНК, но оказалось, что она присуща и РНК. Выше было упомянуто об открытии способности РНК служить матрицей для синтеза ДНК в процессе обратной транскрипции. Еще раньше была продемонстрирована функция воспроизведения своей структуры – репликация РНК на матрице РНК –, прежде всего, на примере репликативного цикла ряда РНК-содержащих вирусов (Baltimore et al., 1966; Spiegelman and Haruna, 1966). Такую репликацию РНК, не зависимую от ДНК и запрещенную в большинстве случаев в циклах нормальных клеток современных организмов, можно рассматривать как реликт, сохранившийся в современном мире благодаря вирусам как реликтовым генетическим агентам, выводящим репликацию и трансляцию из под контроля клеточной ДНК. В настоящее время выясняется, что реликтовую репликацию РНК можно обнаружить и в нормальных клетках: многие животные и растения несут гены, кодирующие РНК-зависимые РНК-полимеразы или их гомологи, а недавно открытые регуляторные микроРНК и интерферирующие РНК являются, возможно, их субстратом для комплементарной репликации. Другая генетическая функция – кодирование белков – не требует особых комментариев. РНК (мРНК) кодирует белки не только «наравне» с ДНК, но именно она непосредственно участвует в процессе декодировки, служа матрицей для синтеза белков. Таким образом, обе генетические функции ДНК – репликативная и кодирующая – оказываются присущи как ДНК, так и РНК (рис. 2). Если кодирующие функции так или иначе связаны в основном с полинуклеотидами как линейными полимерами, то функции белков в основном зависят от их трехмерной структуры, т.е. специфически свернутой, по большей части компактной (глобулярной) конформации. Поэтому принципиально важным было установление того факта, что высокополимерные полинуклеотидные цепи РНК, как и полипептидные цепи белков, способны само-сворачиваться в компактные структуры (Спирин и др., 1959; Spirin, 1960; Kisselev et al., 1961; Богданова и др., 1962) (рис. 3) и что их сворачивание приводит к специфическим конформациям молекул РНК (Vasiliev et al., 1978; Vasiliev and Zalite, 1980). С другой стороны, в развитии современных представлений о функциях РНК решающим было открытие некодирующих РНК. Оказалось, что кодирующие РНК 3 составляют лишь малую долю клеточных РНК, а основная часть РНК представлена некодирующими РНК, куда относятся в первую очередь рибосомные РНК (Belozersky and Spirin, 1958; Brenner et al., 1961; Spiegelman, 1961). Именно для высокополимерных некодирующих РНК двух рибосомных субъединиц было показано, что их специфическое компактное само-сворачивание задает специфическую форму каждой из субъединиц и, в конечном счете, определяет конформацию рибосомы (Vasiliev et al., 1986). Таким образом, так же как и белки, РНК способны образовывать специфические третичные структуры, т.е. обладают структурной и формообразующей функцией. Способность РНК к формированию компактных трехмерных структур, как и в случае белков, дает основу для специфического взаимодействия с другими молекулами – как макромолекулами, так и малыми лигандами. Другими словами, для молекул РНК, свернутых в специфическую глобулу и тем самым создающих на своей поверхности уникальный пространственный узор, приходится допустить возможность функции молекулярного узнавания, как и у белков. Пожалуй, первыми известными «узнающими» РНК можно считать тРНК, выполняющие адапторную роль в биосинтезе белка (рис. 4). Эти среднего размера компактно свернутые молекулы РНК поочередно и очень избирательно взаимодействует с рядом макромолекулярных структур в клетке: сначала с аминоацил-тРНК-синтетазой, связанной с аминоациладенилатом как активированной формой аминокислоты, затем, уже неся на себе ковалентно присоединенный аминоацильный остаток, с фактором элонгации EF1, вместе с которым она поступает в рибосому. Хотя на этом пути несомненно реализуются функции специфического узнавания молекулами тРНК других макромолекул, долгое время все же молчаливо принималось, что основную роль здесь играет узнавание тРНК со стороны белков – ферментов, факторов трансляции и рибосомных белков. В 1980-х годах английским ученым Э. Кандлиффом (Cundliffe, 1986) было впервые заявлено о способности структурированных участков рибосомной РНК специфически узнавать малые лиганды ненуклеиновой и небелковой природы. Он представил экспериментальные данные в пользу избирательного взаимодействия (связывания) именно участков свернутой рибосомной РНК, а не рибосомных белков, с рядом антибиотиков рибосомного действия – тиострептоном, эритромицином, аминогликозидами (стрептомицином, канамицином, неомицином). Через 10 лет были представлены прямые структурные данные о специфическом связывании аминогликозидных антибиотиков районом малой (16S) рибосомной РНК (Fourmy et al., 1996). Окончательное признание самых широких возможностей у РНК узнавать другие молекулы и весьма специфично взаимодействовать 4 с ними пришло благодаря аптамерам – небольшим по размерам синтетическим РНК, получаемым путем отбора из многих вариантов нуклеотидных последовательностей с помощью процедур так называемой «бесклеточной эволюции», «эволюции в пробирке» (Ellington and Szostak, 1990; Tuerk and Gold, 1990). Оказалось, что можно отобрать и размножить РНК, обладающие способностью избирательно связывать практически любой вид молекул, начиная от низкомолекулярных органических соединений и кончая различными индивидуальными пептидами и белками (см. обзоры Gold et al., 1995; Puglisi and Williamson, 1999). Другими словами, РНК, как и белки, действительно в полной мере могут обладать функцией специфического молекулярного узнавания. На способности РНК к специфическому молекулярному узнаванию базируется и каталитическая функция РНК. Однако, на протяжении всей предшествующей истории биохимии утверждалось, что биохимический катализ – «прерогатива» исключительно белков-ферментов. Поэтому и все теории происхождения жизни вынуждены были исходить из первичности белков как макромолекул, абсолютно необходимых для возникновения биохимического метаболизма. Открытие каталитической функции РНК в американских лабораториях Т. Чека и С. Алтмана (Kruger et al., 1982; Guerrier-Takada et al., 1983) перевернуло все прежние представления об исключительной роли белков не только в возникновении жизни, но и в понимании самого явления жизни. По аналогии с белками-ферментами – энзимами – каталитические РНК были названы рибозимами. Повидимому, почти все рибозимы, естественно существующие в живой природе в клетках современных организмов, так или иначе, участвуют в процессах, связанных с превращениями полинуклеотидных цепей самих РНК. Однако, оказалось возможным создавать и искусственные рибозимы с более широким спектром катализируемых реакций (Cech and Golden, 1999). Кроме того, как выясняется из всей совокупности данных по структуре рибосом и особенностей катализируемой рибосомой реакции образования пептидных связей в процессе биосинтеза белка, каталитический центр этой реакции (пептидил-трансферазный центр рибосомы) формируется определенным доменом большой рибосомной РНК, без участия рибосомных белков, т. е. имеет рибозимную природу (Nissen et al., 2000). Итак, именно после открытия каталитической функции РНК поменялась парадигма, и взоры биохимиков и молекулярных биологов обратились к РНК как самому «самодостаточному» биополимеру. В самом деле, молекулы РНК оказались способны делать все то, что делают белки – складываться в специфические структуры и определять формообразование биологических частиц, с большой точностью узнавать другие 5 макромолекулы и малые лиганды и взаимодействовать с ними, наконец, осуществлять катализ ковалентных превращений узнаваемых молекул (рис. 5). Таким образом, РНК является уникальным биополимером, которому свойственны как функции ДНК, так и функции белков. Конечно, белки делают все это более эффективно и разносторонне, чем РНК. Но зато белки в принципе «не умеют» самовоспроизводиться не существует никаких собственных белковых механизмов для воспроизведения их структуры, кроме как через РНК. В то же время РНК содержит все необходимые структурные предпосылки для точного воспроизведения ее собственной структуры (см. выше). Гипотеза о древнем мире РНК Открытие каталитически активных РНК – рибозимов – в 1982-1983 г.г. сыграло решающую роль в формулировании и развитии гипотезы о том, что РНК как самодостаточный полимер могла бы и воспроизводиться, и функционировать в глубокой древности на Земле или других космических объектах до появления клеточных форм жизни. Можно предположить, что молекулы РНК могли бы обходиться не только без ДНК как генетического вещества, но и без белков для осуществления катализа важных синтетических и метаболических реакций. Идея древнего безбелкового мира РНК как возможного предшественника современной жизни на Земле была окончательно сформулирована в 1986 г. (Gilbert, 1986) и быстро приобрела многочисленных сторонников. В настоящее время гипотеза о том, что жизнь начиналась с молекул РНК и их ансамблей, является почти общепринятой (см. сборники «Мир РНК» - «The RNA World» – под редакцией Gesteland et al.,1993, 1999, 2006). Таким образом, термин «мир РНК» широко используется теперь для обозначения древней, пре-биотической ситуации на Земле, имевшей место около 4 млрд лет назад, когда само-реплицирующиеся молекулы РНК или их ансамбли могли существовать и эволюционировать без белков. Таким образом, согласно существующим представлениям, в древнем мире РНК не было ни белков, ни ДНК, а лишь ансамбли различных молекул РНК, выполняющих разные вышеперечисленные функции. Однако, вопрос о возникновении такого мира на Земле – один из самых трудных в теориях происхождения жизни. Можно предполагать, что первичные олигорибонуклеотиды возникали из абиогенно образующихся монорибонуклеотидов или их активированных производных путем полимеризации на поверхностях глин и глиноподобных минералов. Возможна была также и предшествующая химическая эволюция нуклеотидо-подобных и олигонуклеотидоподобных соединений. В любом случае появление олигорибонуклеотидов должно было 6 быть отправной точкой появления мира РНК. Однако, для дальнейшего развития было необходимо, чтобы абиогенный синтез олигорибонуклеотидов, основанный на редких случайных событиях, был дополнен постоянным механизмом, который бы мог генерировать варианты этих олигомеров и удлинять их (при сильной тенденции к их спонтанной химической и физической деструкции). Элонгация коротких олигорибонуклеотидов в полирибонуклеотиды представляется абсолютно необходимым условием для образования компактно свернутых структур со свойствами специфического узнавания лигандов и каталитическими активностями, а генерация вариантов в популяции абиогенных олиго- и полирибонуклеотидов требуется для того, чтобы дать шансы для случайного возникновения нужных функциональных, в том числе каталитических, активностей. В течение долгого времени не было предложено какого-либо удовлетворительного решения этой проблемы. Около 15 лет назад А.Б. Четвериным и Е.В. Четвериной с сотрудниками (Chetverin et al., 1991; Chetverina and Chetverin, 1993) был разработан метод молекулярного клонирования РНК: из единичных молекул РНК, помещенных на поверхность геля, содержащего катализатор репликации (в данном случае вирусную РНКзависимую РНК-полимеразу) и рибонуклеозид-трифосфаты, оказалось возможным выращивать колонии молекул РНК, идентичных исходной молекуле (рис. 6). Позднее метод был применен для регистрации единичных событий, происходящих с популяцией РНК в растворе, и была впервые экспериментально показана способность молекул РНК к спонтанной перестройке их нуклеотидных последовательностей в отсутствие каких-либо ферментов и рибозимов (Chetverina et al., 1999). Открытая спонтанная реакция характеризовалась следующими особенностями. Во-первых, цепи РНК в растворе при температурах от 5° до 37°C время от времени обменивались частями своих последовательностей; обмен мог осуществляться как между разными молекулами (трансперестройки), так и внутри одной и той же молекулы (цис-перестройки). Во-вторых, эти перестройки были не специфичны по отношению к последовательности и могли происходить в любом месте цепей. В-третьих, в отличие от рибозимных и ферментативных реакций, а также реакций самокатализируемого сплайсинга, 3´гидроксилы не участвовали в этой спонтанной реакции, а части РНК реагировали друг с другом внутренними районами. Реакция оказалась зависима от присутствия Mg2+. Скорость спонтанных перестроек была не высока – одно событие в час на миллиард нуклеотидов; это означает, что 0.002% – 0.02% цепей РНК с длиной 800 – 8000 нуклеотидных остатков спонтанно перестраиваются в популяции РНК в течение 24 часов. 7 Реакция не требует никаких других компонентов, кроме самой РНК и Mg2+, и, таким образом, может рассматриваться как присущее РНК химическое свойство и должна происходить в водной среде повсюду, как в живой, так и в неживой природе. Это открытие, очевидно, имеет прямое отношение к проблеме возникновения древнего мира РНК. Прежде всего, спонтанные перестройки нуклеотидных последовательностей могли быть основным эффективным механизмом непрерывной генерации вариантов олиго- и полирибонуклеотидов до эры рибозимов. Более того, элонгация олигорибонуклеотидов в полирибонуклеотиды путем спонтанной трансэстерификации, происходящей в этой реакции, представляется гораздо более реальной возможностью в то время, по сравнению с последовательным ростом цепи, требующим специального механизма, постоянной защиты от деградации удлиняемого полинуклеотида и постоянного притока энергии. Именно этим путем и могли появляться длинные полирибонуклеотиды на заре возникновения мира РНК. Появление достаточно длинных полирибонуклеотидов и генерация вариантов за счет спонтанных цис- и транс-перестроек должна была привести к случайному появлению рибозимов, и критичным должно было быть появление в популяции РНК рибозима, катализирующего процесс комплементарной репликации РНК. Это – принципиальное условие для того, чтобы размножить – амплифицировать – единичные молекулы случайно возникших в популяции вариантов и сохранить их для эволюции. Другими словами, появление механизмов РНК-катализируемой репликации РНК должно рассматриваться как первое и необходимое условие для начала эволюции мира РНК. В ряде экспериментов была экспериментально показана возможность создания рибозимов, осуществляющих лигирование олигонуклеотидов на комплементарной матрице (Doudna and Szostak, 1989; Doudna et al., 1991, 1993) или полимеризующих короткие олигонуклеотиды или мононуклеотиды путем удлинения олигонуклеотидной затравки на комплементарной матрице (Bartel and Szostak, 1993; Ekland and Bartel, 1996; Johnston et al., 2001). С появлением рибозимов, катализирующих полимеризацию РНК на матрице РНК, – хотя бы одной молекулы на популяцию молекул РНК в каком-то небольшом водоеме – мир РНК обретал свою сущность как самосохраняющаяся и развивающаяся материя на древней Земле. Компартментализация как условие биологической эволюции 8 Возникновение и существование мира РНК на Земле естественно требовало жидкой водной среды с нейтральной рН и растворенными солями одновалентных металлов (в первую очередь K+ и Na+) и Mg2+. Скорее всего это были мелкие водоемы и лужи («Дарвиновские пруды»), где могли концентрироваться абиогенно возникающие органические вещества; океанские просторы вовсе не годились для этого. (Впрочем, как полагает большинство геологов и палеонтологов, в то время океаны на Земле, повидимому, еще и не существовали). Присутствие РНК-репликазной активности в водной среде РНК-содержащей лужи или пруда давало в результате эффект амплификации всех олиго- и полирибонуклеотидов этого водоема, т.е. рост общей популяции молекул РНК. Однако, на этом этапе еще не могло быть никакого отбора «лучших» и, стало быть, никакой биологической эволюции. Дело в том, что в таком случае эффективный РНК-реплицирующий рибозим, присутствующий в луже, одинаково хорошо должен был амплифицировать как редкие молекулы РНК, обладающие какими-либо полезными для популяции свойствами (например, адсорбция из среды или катализ синтеза нужных веществ), так и основную массу неактивных, балластных молекул РНК. Чтобы естественный отбор начал работать, необходима была какая-то форма компартментализации, обособления отдельных ансамблей РНК, в которых рибозимы и их продукты удерживались бы вместе. Только тогда естественный отбор мог отличить те РНК, чей продукт лучше, и те ансамбли, чьи РНК функционально лучше дополняют друг друга. Лучшие обособленные ансамбли РНК – первозданные особи – должны расти быстрее других, перерастать других, тем самым обеспечивая отбор лучших. По-видимому, впервые идея «обособления от окружающей среды» как предпосылки для того, чтобы воспроизводящаяся система макромолекул могла эволюционировать, была выдвинута А.И. Опариным в двадцатые годы прошлого столетия (Опарин, 1924). В качестве наиболее примитивного способа первичной компартментализации, который мог бы осуществляться в присутствии абиогенно возникающих полипептидов и белков, он предложил коацервацию – образование капелек концентрированного золя в разбавленной среде с растворенными макромолекулами. Это было логично в рамках гипотезы Опарина о начале жизни на основе абиогенного синтеза белка (хотя в конце концов ученый мир пришел к пониманию того, что на основе белков без нуклеиновых кислот невозможно создать самовоспроизводящуюся систему). Однако, согласно гипотезе о древнем мире РНК, этот мир был «однополимерным», и по причине отсутствия полипептидов, полисахаридов и других полимеров, способных к коацервации, 9 да еще и в достаточно больших концентрациях, компартментализация ансамблей РНК в виде коацерватных капель кажется мало вероятной. Тем не менее, для того чтобы каждый ансамбль РНК мог существовать как система, наследовать приобретенные признаки, полезные для всей системы, и эволюционировать, его РНК-реплицирующий рибозим, лиганд-связывющие РНК, нуклеотид-синтезирующие рибозимы и продукты синтезов должны быть, очевидно, как-то связаны, объединены в пространстве. Поэтому в большинстве теорий происхождения жизни возникновение каких-то примитивных ограничивающих мембран или хотя бы поверхностей раздела фаз постулируется необходимым условием начала эволюции, в том числе эволюции ансамблей РНК. И в этом состоит одна из основных трудностей таких теорий. Возможна, однако, и очевидная альтернатива обособлению за счет мембран или поверхностям раздела фаз. Как уже указывалось выше, А.Б. Четвериным с сотрудниками была экспериментально показана способность молекул РНК формировать молекулярные колонии на гелях или других влажных твердых средах, если на этих средах им предоставлены условия для репликации (рис. 6). Смешанные колонии РНК на твердых или полутвердых поверхностях, без каких-то ни было мембран, и могли быть первыми эволюционирующими бесклеточными ансамблями, где одни молекулы выполняли генетические функции (репликацию молекул РНК всего ансамбля), а другие формировали структуры, необходимые для успешного существования (например, такие, которые адсорбировали нужные вещества из окружающей среды) или были рибозимами, ответственными за синтез и подготовку субстратов для синтеза РНК (Спирин, 2003). Такая бесклеточная ситуация создавала условия для очень быстрой эволюции: колонии РНК не были отгорожены от внешней среды и могли легко обмениваться своими молекулами – своим генетическим материалом. Легкое распространение молекул РНК через среду, в том числе атмосферную, также было продемонстрировано в прямых экспериментах (Chetverin et al., 1991). Эта альтернатива представляется вероятной потому, что образование колоний РНК легко себе представить как естественное следствие подсыхания лужи, населенной молекулами РНК: на влажной поверхности глины, в тех местах, где оказывался РНКреплицирующий рибозим, молекулы РНК, осевшие на поверхность, должны были амплифицироваться и образовывать колонии – при условии, что необходимые органические вещества (предшественники пуринов, пиримидинов, рибозы, и т.д.) и высокоэнергетические фосфаты присутствовали на той же поверхности. Таким путем могли образовываться смешанные колонии РНК с различными функциональными 10 активностями. Такой ансамбль молекул РНК в виде растущей смешанной колонии мог быть успешным в своем существовании и росте, если он включал в себя (1) лигандсвязывающие РНК для избирательной адсорбции и аккумуляции необходимых веществ из окружающей среды, (2) набор рибозимов, катализирующих метаболические реакции для синтеза нуклеотидов и их активированных (фосфорилированных) производных, и (3) рибозим, катализирующий комплементарную репликацию всех РНК колонии. Наиболее серьезным следствием компартментализации РНК в форме смешанных колоний было появление механизма естественного отбора: колонии, содержащие РНК, более активные и более подходящие друг другу (функционально дополняющие друг друга) могли расти быстрее, становиться больше и тем самым «перерастать» другие колонии, вытеснять их. Таким образом, образование компартментализованных ансамблей функционально дополняющих друг друга РНК в качестве особей, способных расти и конкурировать друг с другом, представляется вероятным без окружающих их мембран или оболочек другого типа, и даже без четкой границы раздела. Эволюция древнего мира РНК путем «систематического экспоненциального обогащения» (SELEX) В 1990 г. одновременно тремя группами ученых в США (Tuerk and Gold, 1990; Ellington and Szostak, 1990; Robertson and Joyce, 1990) была опубликована методология бесклеточной селекции или бесклеточной эволюции в пробирке молекул некодирующих РНК, позволившая быстро получать в лаборатории нужные синтетические функционально активные РНК, специфически взаимодействующие с определенными лигандами (аптамеры) или катализирующие определенные химические реакции (искусственные рибозимы), а также совершенствовать функции таких РНК. Оказалось, что эта методология может указать тот путь, которым, возможно, шла естественная эволюция древнего мира РНК. Суть методологии «эволюции в пробирке» состоит в многократном чередовании стадий селекции и амплификации РНК (“Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment”, SELEX). После того как в лаборатории А.Б. Четверина была экспериментально показана возможность существования, роста и амплификации молекул РНК в форме колоний на влажных твердых средах, можно было предположить, что подобное чередование процессов селекции и амплификации могло иметь место на первобытной Земле (Спирин, 2005). Действительно, важным свойством молекулярных колоний РНК является то, что они не имеют никакой ограничивающей их оболочки, удерживающей молекулы внутри компартмента: молекулы РНК удерживаются 11 вместе только благодаря их локализации на твердой поверхности в отсутствие перемешивания и конвекции, типичных для жидкой среды. Это – временное состояние, и любое затопление должно приводить к растворению колоний и перемешиванию всех РНК в общей луже. Исходя из вышесказанного, можно предложить следующий сценарий «естественного первобытного SELEX’a». (1) Когда функционально различные молекулы РНК, включая РНК-реплицирующий рибозим, оказываются в одной луже, вся популяция РНК количественно увеличивается, а благодаря реакциям спонтанной трансэстерификации (реакция Четверина) и ошибкам репликации увеличивается и разнообразие молекул. (2) Когда лужа подсыхает, молекулы РНК оказываются на влажной поверхности глины или другого минерального субстрата, и при наличии в данном месте молекулы РНК-реплицирующего рибозима и нескольких других молекул РНК, обеспечивающих связывание нужных веществ и катализ нужных реакций, образуется и растет смешанная колония РНК; наиболее успешные колонии (т.е. колонии с наиболее активными и лучше всего дополняющими друг друга молекулами РНК) растут быстрее других. (3) Последующее затопление подсушенного водоема или его части растворяет колонии, и в общем водоеме опять начинается общая амплификация, но уже в популяции, обогащенной «хорошими», т.е. активными и функционально дополняющими друг друга молекулами. Таким путем чередующиеся затопления и подсушивания РНК-содержащих водоемов (луж) функционально обеспечивают лучшими экспоненциального систематическое молекулами обогащения»). обогащение («систематическая Именно таким путем и популяции эволюция мог РНК путем развиваться и эволюционировать древний мир РНК. Две ипостаси этого мира РНК сосуществовали на Земле и переходили друг в друга: коммунальные сообщества размножающихся и разнообразящихся индивидуальных молекул РНК, растворенных в водной среде луж, где реализовался принцип «от каждого по способностям, каждому по потребностям», и конкурирующих особей в виде смешанных колоний РНК, временно существующих и растущих на влажных поверхностях. Общая гипотетическая картина существования и эволюции древнего мира РНК дана на рис. 7. Таким образом, циклы амплификации-селекции вышеописанного типа могли быть основной формой существования эволюционирующего древнего мира РНК на первобытной Земле. Эволюционный процесс должен был быть исключительно быстрым благодаря трем обстоятельствам. Во-первых, непрерывные спонтанные рекомбинации и перестройки молекул РНК, а также низкая точность примитивных механизмов 12 репликации, обеспечивали широчайшее поле вариантов для отбора. Во-вторых, свободный латеральный перенос и обмен молекулами РНК между колониями через воду и атмосферу делал любые полезные инновации достоянием всех и позволял колониям быстро совершенствоваться в течение короткого времени их существования. В-третьих, экспоненциальное обогащение всей популяции «лучшими» молекулами РНК в циклах амплификации-селекции создавало мощный эволюционный двигатель для всего коммунального мира РНК в целом. В свое время К. Вуз (Woese, 1998) выдвинул концепцию «Универсального Предшественника» живых существ на Земле. Он предположил, что предшественники современных организмов – «прогеноты» – представляли собой примитивные особи, лишенные полноценной внешней мембраны или любого другого барьера, который бы препятствовал свободному обмену генетического материала между ними. Они характеризовались высоким уровнем мутаций (ошибок репликации) из-за примитивности и несовершенства механизмов репликации генетического материала, и интенсивным латеральным обменом генами и продуктами, когда любые продукты и инновации одних становились достоянием всех. Тем самым они существовали как коммуна, и этот коммунальный мир отличался очень высокой скоростью эволюции. Именно этот коммунальный мир «прогенотов», без строго очерченных индивидуальностей, Вуз предложил считать универсальным предшественником всех живых организмов на Земле. В результате эволюционного распада этого единого коммунального мира обособились три главные линии клеточных живых существ – бактерии (эубактерии), археи (архебактерии) и эуакарии (эукариоты), – обладающие одинаковым генетическим кодом – кодом своего универсального предшественника. В настоящее время, в свете всех данных и представлений о мире РНК, представляется возможным передать роль Универсального Предшественника коммунальному сообществу колоний-ансамблей РНК, временно существующих на твердых или гелеобразных поверхностях первобытной Земли, не ограниченных физически никакими мембранами и фазовыми разделами и потому свободно обменивающихся как генетическим материалом, так и продуктами катализируемых реакций, а затем растворяющихся в общей коммуне и заново собирающихся в новых комбинациях молекул. Как уже указывалось выше, такая коммуна должна была очень быстро эволюционировать. Во всяком случае, если мир РНК возник и эволюционировал в клеточные формы жизни на Земле, то весь путь эволюции до индивидуальных организмов с клеточной структурой, ДНК и современным аппаратом белкового синтеза должен был быть пройден менее чем за пол-миллиарда лет, – во 13 временной промежуток между возникновением планеты Земля 4,6 млрд лет назад и появлением на Земле первых клеточных организмов современного типа 3,8 – 3,9 млрд лет назад. Конечно, вполне вероятной альтернативой этому сценарию может быть космическое происхождение жизни на Земле: примитивные клеточные формы жизни – скорее всего бактерии и/или археи – были занесены на Землю из ближнего или далекого космоса, возможно, как раз в период интенсивной метеоритной бомбардировки между 4,6 и 4 млрд лет назад, а в дальнейшем на Земле происходила лишь их эволюция в высокоразвитые многоклеточные организмы. В последнее время именно эта точка зрения приобретает все больше сторонников, так как само возникновение и существование безбелкового мира РНК на первобытной Земле сталкивается со многими, не разрешимыми пока, проблемами (Спирин, 2007). Тем не менее, это не снимает принципиального вопроса о возникновении клеточной формы жизни из мира РНК, а лишь переносит его на другие космические объекты. 14 Литература Богданова, Е.С., Гаврилова, Л.П., Дворкин, Г.А., Киселев, Н.А., и Спирин А.С. (1962) Изучение макромолекулярной структуры высокополимерной (рибосомальной) рибонуклеиновой кислоты из Escherichia coli. Биохимия 27: 387-402. Опарин, А.И. (1924). Происхождение жизни. Изд-во «Московский рабочий», Москва. Спирин, А.С. (2003) Рибонуклеиновые кислоты как центральное звено живой материи. Вестник РАН 73: 117-127. Спирин, А.С. (2005) Мир РНК и его эволюция. Молекулярная биология 39: 550-556. Спирин, А.С. (2007) Где, когда и в каких условиях мог возникнуть и эволюционировать мир РНК? Палеонтологический журнал, №5, 11-19. Спирин А.С., Гаврилова Л.П., Бреслер С.Е. и Мосевицкий М.И. (1959) Изучение макромолекулярной структуры инфекционной рибонуклеиновой кислоты из вируса табачной мозаики. Биохимия 24: 938-947. Baltimore, D. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226: 1209-1211. Baltimore, D., Girard, M., and Darnell, J.E. (1966). Aspects of the synthesis of poliovirus RNA and the formation of virus particles. Virology 29: 179-189. Bartel, D.P., and Szostak, J.W. (1993). Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences. Science 261: 1411-1418. Belozersky, A.N., and Spirin, A.S. (1958). A correlation between the compositions of deoxyribonucleic and ribonucleic acids. Nature 182: 111-112. Brenner, S., Jacob, F., and Meselson, M. (1961). An unstable intermediate carrying information from genes to ribosomes for protein synthesis. Nature 190: 576-581. Cech, T.R., and Golden, B.L. (1999). Building a catalytic active site using only RNA. In: The RNA World, Second Edition (eds. Gesteland, R.F., Cech, T.R., and Atkins, J.F.) p.p. 321347. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. Chetverin, A.B., Chetverina, H.., and Munishkin, A.V. (1991). On the nature of spontaneous RNA synthesis by Q replicase. J. Mol. Biol. 222: 3-9. Chetverina, H.V., and Chetverin, A.B. (1993). Cloning of RNA molecules in vitro. Nucleic Acids Res. 21: 2349-2353. Chetverina, H.V., Demidenko, A.A., Ugarov, V.I., and Chetverin, A.B. (1999). Spontaneous rearrangements in RNA sequences. FEBS Letters 450: 89- 94. 15 Cundliffe, E. (1986). Involvement of specific portions of ribosomal RNA in defined ribosomal functions: A study utilizing antibiotics. In: Structure, Function, and Genetics of Ribosomes (eds. Hardesty, B., and Kramer, G.), p.p. 586-604. Springer-Verlag, New York. Doudna, J.A., and Szostak, J.W. (1989). RNA-catalysed synthesis of complementary-strand RNA. Nature 339: 519-522. Doudna, J.A., Couture, S., and Szostak, J.W. (1991). A multisubunit ribozyme that is a catalyst of and template for complementary strand RNA synthesis. Science 251: 1605-1608. Doudna, J.A., Usman, N., and Szostak, J.W. (1993). Ribosome-catalyzed primer extension by trinucleotides: A model for the RNA-catalyzed replication of RNA. Biochemistry 32: 2111- 2115. Ekland, E.H., and Bartel, D.P. (1996). RNA-catalysed RNA polymerization using nucleoside triphosphates. Nature 382: 373 – 376. Ellington, A., and Szostak, J. (1990). In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 346: 818-822. Fourmy, D., Recht, M.I., Blanchard, S.C., and Puglisi, J.D. (1996). Structure of the A site of E. coli 16S rRNA complexed with an aminoglycoside antibiotic. Science 274: 1364-1371. Gesteland, R.F., and Atkins, J.F., eds. (1993). The RNA World , First Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Gesteland, R.F., Cech, T.R., and Atkins, J.F., eds. (1999). The RNA World , Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Gesteland, R.F., Cech, T.R., and Atkins, J.F., eds. (2006) The RNA World, Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Gilbert,W. (1986). Origin of life: The RNA world. Nature 319: 618. Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O., and Yarus, M. (1995). Diversity of oligonucleotide functions. Ann. Rev. Biochem. 64: 763-797. Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., March, T., Pace, N., and Altman, S. (1983). The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35: 849-857. Johnston, W.K., Unrau, P.J., Lawrence, M.S., Glasner, M.E., and Bartel, D.P. (2001). RNAcatalyzed RNA polymerization: Accurate and general RNA-templated primer extension. Science 292: 1319-1325. Kisselev, N.A., Gavrilova, L.P., and Spirin, A.S. (1961) On configurations of high-polymer ribonucleic acid macromolecules as revealed by electron microscopy. J. Mol. Biol. 3: 778-783. 16 Kruger, K., Grabowski, P.J., Zaug, A.J., Sands, J., Gottschling, D.E., and Cech, T.R. (1982). Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. Cell 31: 147-157. Nissen, P., Hansen, J., Ban, N., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000). The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289: 920-930. Puglisi, J.D., and Williamson, J.R. (1999). RNA interaction with small ligands and peptides. In: The RNA World, Second Edition (eds. Gesteland, R.F., Cech, T.R., and Atkins, J.F.), p.p. 403-425. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Robertson, D.L., and Joyce, G.F. (1990). Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature 344: 467-468. Spiegelman, S. (1961). The relation of informational RNA to DNA. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 26: 75-90. Spiegelman, S., and Haruna, I. (1966). A rational for an analysis of RNA replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55: 1539-1554. Spirin, A.S. (1960). On macromolecular structure of native high-polymer ribonucleic acid in solution. J. Mol. Biol. 2: 436-446. Temin, H.M., and Mizutani, S. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226: 1211-1213. Tuerk, C., and Gold, L. (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment. Science 249: 505-510. Vasiliev, V.D., Selivanova, O.M., and Koteliansky, V.E. (1978) Specific self-packing of the ribosomal 16S RNA. FEBS Letters 95: 273-276. Vasiliev, V.D., and Zalite, O.M. (1980) Specific compact self-packing of the ribosomal 23S RNA. FEBS Lett. 121: 101-104. Vasiliev, V.D., Serdyuk, I.N., Gudkov, A.T., and Spirin, A.S. (1986). Self-organization of ribosomal RNA. In: Structure, Function, and Genetics of Ribosomes (eds. Hardesty, B., and Kramer, G.) p.p. 128-142. Springer-Verlag, New York. Watson, J.D., and Crick, F.H.C. (1953). Genetical implications of the structure of deoxyribose nucleic acid. Nature 171: 964-967. Woese, C.R. (1998). The universal ancestor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6854-6859. 17 Подписи к рисункам Рис. 1. Центральная догма молекулярной биологии. Рис. 2. Генетические функции РНК. Рис. 3. Конформации и конформационные переходы высокополимерной РНК в зависимости от ионной силы и температуры. Внизу справа – конформация компактной глобулы. Spirin (1960) J. Mol. Biol. 2: 436-446. Рис. 4. Кодирующая РНК (мРНК) и два основных типа некодирующих РНК (рибосомные РНК и тРНК). Рис. 5. Основные типы функциональной активности молекул РНК в живой природе. Рис. 6. Колонии молекул РНК, выросшие на влажной поверхности агарозы или полиакриламидного геля в присутствии рибонуклеозид-трифосфатов и катализатора комплементарной репликации РНК (РНК-зависимой РНК-полимеразы фага Q). Chetverin et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 3-9. Chetverina and Chetverin (1993) Nucleic Acids Res. 21: 2349-2353. Рис. 7. Сценарий возникновения и эволюции мира РНК. Спирин (2005) Молекул. биология 39: 550-556. 18 Ancient RNA World Alexander S. Spirin Institute of Protein Research, Russian Academy of Sciences, and Molecular Biology Department of the Moscow State University Abstract The recently discovered capability of RNA to rearrange their sequences in solution by spontaneous cis- and trans-transesterification reactions may help to solve the problems of polyribonucleotide elongation and variant generation in the ancient, pre-enzyme and preribozyme era. The earlier demonstrated formation and growth of RNA colonies on gels and other moist solid surfaces shows the possibility of compartmentalization of molecular ensembles without an enfolding membrane. This can solve the problems of concentration/dilution of substrates and products in an aqueous medium on the prebiotic Earth, retention of the “gene” and the “trait” together, and thus identification and selection of the best “genes” (RNAs) for the evolution of RNA ensembles. The application of the principle of “systematic evolution by exponential enrichment” (SELEX) to the idea of periodically dissolving and reforming RNA colonies (as alternating amplification and selection stages, respectively) can explain very fast progressive evolution of the ancient RNA world. 19