у Drosophila melanogaster

Аннотация к отчету по проекту РНП № 049 «Нейроспецифические функции гена sbr (nxf1) у
Drosophila melanogaster.» Руководитель Пугачева О.М.
Известно, что ряд нейропатологических заболеваний человека опосредован нарушением
функций определенных эволюционно консервативных генов. Исследования молекулярной
этиологии и способов лечения таких заболеваний обычно проводятся с использованием различных
модельных животных. Перспективным направлением является использование хорошо изученного
модельного объекта генетики – плодовой мушки Drosophila.
Ортологом гена Tap (NXF1) человека является ген small bristles - sbr (Dm nxf1) у Drosophila
melanogaster. Показано, что основная функция этого высоко консервативного гена заключается в
транспорте мРНК из ядра в цитоплазму (Wilkie et al., 2001). Мы предполагаем, что данный ген у
дрозофилы имеет дополнительные цитоплазматические и тканеспецифичные функции.
С помощью полученных нами антител (in press) к С-терминальной части белка SBR (NXF1)
методом иммуно-флуоресцентного окрашивания и конфокальных оптических срезов нами была
определена локализация данного белка в головном нервном ганглии личинок третьего возраста
дикого типа и у мутанта по гену sbr (nxf1) – линии sbr12.
Мы показали, что белок SBR в нервных ганглиях личинок дикого типа локализуется
преимущественно в области центрального мозга и в основании вентрального нервного ствола
(ВНС). Более детальный анализ показал, что в области центрального мозга, помимо ядерной
локализации, SBR находится в цитоплазме тел и отростков, как первичных дифференцированных
эмбриональных нейронов, так и вторичных нейронов, образовавшихся на стадии личинки и
формирующих аксональные тракты. В зонах активно делящихся нейробластов (зрительные
области, абдоминальный отдел ВНС) белок SBR локализуется точечно на границе ядер и иногда в
цитоплазме в виде отдельных гранул. В вентральном нервном стволе c дорзальной стороны нами
были обнаружены отдельные крупные специфические нейробласты, в цитоплазме которых
(причем полярно) SBR формирует большое количество крупных гранул. Каждый сегмент
вентрального нервного ствола имеет, как минимум, один такой «центральный» нейробласт.
Были обнаружены отличия в локализации белка SBR в нервном ганглии личинок самцов,
несущих мутацию sbr12, характеризующимися стерильностью и нарушением полового поведения.
Нами было показано, перераспределение белка из центральной области в зрительную, и
ассиметричное расположение в полушариях. Для определения предполагаемых отличий в
количестве белка SBR у исследуемой мутантной линии по сравнению с диким типом планируется
проведение Вестерн-блот анализа.
Исследователями нашей группы было впервые показано, что ген sbr (nxf1) у D.
melanogaster обладает множественными альтернативными транскриптами, в том числе был
выявлен транскрипт, специфичный для нервной ткани (Ivankova et al., in press). Мы предполагаем,
что такому длинному альтернативному нейроспецифичному транскрипту соответствует короткая
форма белка SBR, содержащая N-концевую часть конститутивной формы.
Для выявления такой формы белка необходимы антитела, специфичные к N-терминальной
части. Для этого нами был выделен фрагмент ДНК, соответствующий 1-3 экзонам гена sbr
методом ОТ-ПЦР. Полученный ПЦР продукт был успешно секвенирован и на данный момент
находится на этапе клонирования в вектор экспрессии pET24b (Novagen) для наработки белка в
бактериальных клетках. Полученным таким образом белком будут иммунизированы лабораторные
мыши, а полученная антисыворотка будет специфически очищена и в дальнейшем использована в
качестве первичных моноклональных антител к N-терминальной части белка SBR.
Таким образом, мы показали, что помимо основной функции транспорта мРНК из ядра в
цитоплазму белок SBR может выполнять дополнительные специфические функции в цитоплазме
клеток нервной ткани личинок дрозофилы, возможно, связанные с локализацией специфических
долгоживущих мРНК, транспортом мРНК к местам синапсов, нейрональной дифференциацией.
Нарушения локализации мутантного белка в центральных мозговых структурах может приводить
к нарушению как поведенческих, так и умственных реакций. Дальнейшие исследования в этой
области призваны выявить механизмы влияния исследуемого нами высоко консервативного гена
на вышеуказанные процессы.