Cтабилизация и дестабилизация эритроцитов озоном в

УДК: 612.118.221.3:612.014.464: 615.831-006.6
О.А. Соколик1, А.Л. Татарец1, В.Д. Зинченко2, Т.С. Дюбко1,2, Л.Д. Паценкер1
Стабилизация и дестабилизация эритроцитов озоном
в условиях фотодинамической терапии
Государственное научное учреждение "НТК "Институт монокристаллов"
НАН Украины, пр. Ленина, 60, Харьков 61001, Украина,e-mail patsenker@isc.kharkov.com
2
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины,
ул. Переяславская, 23, Харьков, 61015
1
Реферат
Исследовано действие озона в разных дозах (до 1.3810–11 мг О3/клетку) на эритроциты быка и лошади при фотодинамическом воздействии сенсибилизатора хлорина е6.
Установлено, что на концентрационной кривой уровня фотодинамическииндуцированного гемолиза эритроцитов наблюдаются три области их стабилизации при
начальной концентрации озона 0.05–0.28 мг/л (6.910–14 – 3.910–13 мг О3/клетку), 0.6–
1.2 мг/л (8.310–13 – 1.710–12 мг О3/клетку) и 1.6–5.0 мг/л (2.210–12 – 6.910–12 мг
О3/клетку) и одна узкая область дестабилизации при 0.4–0.6 мг/л (5.510–13 – 8.310–13 мг
О3/клетку). Разное видовое происхождение эритроцитов (бык или лошадь) слабо влияет на
положение этих концентрационных зон. Показано, что стабилизирующее и дестабилизирующее действие озона на эритроциты можно изучать с помощью флуоресцентного зонда
ДСП-13-2, который усиливает интенсивность свечения при дестабилизации эритроцитов
и уменьшает ее при стабилизации. Предполагается, что процедуры озонирования могут не
только способствовать доставке кислорода гипоксическим злокачественным клеткам, но и
стабилизировать эритроциты крови при нежелательном воздействим фотосенсибилизаторов, что может быть использовано при проведении фотодинамической терапии.
Реферат
О.О. Соколик1, А.Л. Татарець1, В.Д. Зінченко2, Т.С. Дюбко1,2, Л.Д. Паценкер1
Стабілізація та дестабілізація еритроцитів озоном
в умовах фотодинамічної терапії
Державна Наукова Установа "НТК "Інститут монокристалів" НАН України,
пр. Леніна, 60, Харків 61001, Україна. e-mail patsenker@isc.kharkov.com
2
Інститут проблем кріобіології і кріомедицині НАН України,
вул. Переяславська, 23, Харків, 61015
1
Досліджено дію озону в різних дозах (до 1.3810–11 О3/клітину) на еритроцити бика
і коня при фотодинамічній дії сенсибілізатору хлорину е6. Встановлено, що на концентраційній кривій рівня фотодинамічно-індукованого гемолізу еритроцитів спостерігаються
три області їх стабілізації при початковій концентрації озону 0.05–0.28 мг/л (6.910–14 –
3.910–13 мг О3/клітину), 0.6–1.2 мг/л (8.310–13 – 1.710–12 мг О3/клітину) и 1.6–5.0 мг/л
(2.210–12 – 6.910–12 мг О3/клітину) и одна узкая область дестабилизации при 0.4–0.6 мг/л
(5.510–13 – 8.310–13 мг О3/ клітину). Різне видове походження еритроцитів (бик або кінь)
2
слабо впливає на положення цих концентраційних зон. Показано, що стабілізуючу та дестабілізуючу дію озону на еритроцити можна вивчати за допомогою флуоресцентного зонду ДСП-13-2, який посилює інтенсивність світіння при дестабілізації еритроцитів і зменшує її при стабілізації. Передбачається, що процедури озонування можуть не лише сприяти доставці кисню гіпоксичним злоякісним клітинам, але і стабілізувати еритроцити крові під час небажаної дії фотосенсибілізаторів, що може бути використано при проведенні
фотодинамічної терапії.
Abstract
O.O. Sokolyk, A.L. Tatarets1, V.D. Zinchenko2, T.S. Dyubko1,2, L.D. Patsenker1
Ozone-Initiated Stabilization and Destabilization of Erythrocytes
under the Photodynamic Therapy Conditions
1
State Scientific Organization "Institute for Single Crystals" of the NAS of Ukraine,
60, Lenin Ave., Kharkiv 61001, Ukraine. e-mail patsenker@isc.kharkov.com
2
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the NAS of Ukraine,
23, Pereyaslavska Str, Kharkiv, 61015
The effect of different ozone concentrations (up to 1.3810–11 mg О3/cell) on bovine and
horse erythrocytes was investigated under photodynamic impact of sensitizer chlorin e6. Three
stabilizing regions corresponding to the initial ozone concentrations of 0.05–0.28 mg/L (6.910–
14
– 3.910–13 mg О3/cell), 0.6–1.2 mg/L (8.310–13 – 1.710–12 mg О3/cell) and 1.6–5.0 mg/L
(2.210–12 – 6.910–12 mg О3/cell) and one destabilizing narrow region at 0.4–0.6 mg/L (5.510–
13
– 8.310–13 mg О3/ cell) were found for the curve that represents the photodynamically induced erythrocytes hemolysis level versus the ozone concentration. These concentration regions
are similar for bovine and horse erythrocytes. The stabilizing and destabilizing ozonation effect
can be monitored and investigated using fluorescent probe DSP-13-2 that increases emission intensity upon destabilization and decreases it upon stabilization. Ozonation is supposed to facilitate support of hypoxic malignant cells with oxygen but also protect blood erythrocytes from undesirable photosensitizing impact, which can be used within photodynamic treatment.
Введение
Фотодинамическая терапия (ФДТ) является щадящим современным методом лечения онкологических, бактериальных, грибковых и вирусных заболеваний [1, 2, 3]. Принцип терапевтического действия ФДТ состоит в индуцировании апоптоза и некроза злокачественных клеток, патогенных микроорганизмов и вирусов синглетным кислородом, супероксидом и другими реакционными частицами, генерируемыми молекулами органического красителя-фотосенсибилизатора под действием светового облучения [1, 4].
Согласно общепринятого механизма ФДТ, генерация указанных реакционных частиц требует наличия достаточных количеств обычного, триплетного кислорода, который
переходит в возбужденное синглетное состояние (синглетный кислород) при переносе
энергии электронного возбуждения от молекулы фотосенсибилизатора на молекулу триплетного кислорода [4]. Далее синглетный кислород может как непосредственно взаимодействовать с клетками, так и превращаться в супероксид, перекиси, радикалы и другие
реакционные частицы, которые также обладают высокой цитотоксичностью [5].
В нормальных условиях (нормоксия) концентрация триплетного кислорода обычно достаточна для эффективной генерации синглетного кислорода и проведения ФДТ. Однако в
3
патологических условиях, при которых клетки страдают от недостачи кислорода (гипоксия), проведение ФДТ становится затруднительным или даже невозможным [4, 6]. Так,
микроокружение опухолевых клеток, особенно при запущенных формах онкологических
заболеваний, является гипоксическим по сравнению с нормальными клетками, что существенно мешает проведению фотодинамического лечения [6, 7, 8,]. Снабжение опухолевых клеток кислородом, который могут выделять богатые кислородом химические соединения, существенно улучшает фотодинамическую терапию [4]. Одним из таких соединений, способных поставлять кислород, является озон [9].
Кроме гипоксии, проведение ФДТ может осложняться еще одной проблемой, которая связана с нежелательным возможным поражением сенсибилизатором здоровых клеток, тканей и органов при случайном световом облучении [1, 3]. Наиболее эффективным и
часто применяемым способом доставки фотосенсибилизатора к целевым патологическим
тканям и клеткам является его введение в ток крови пациента [10]. Однако при попадании
в кровоток сенсибилизатор может взаимодействовать и со здоровыми клетками и тканями
различных органов, прежде всего, с эритроцитами и другими клетками крови, поражение
которых является крайне нежелательным.
В то же время хорошо известно, что озон в узком диапазоне низких концентраций
может повышать устойчивость эритроцитов in vitro к действию различных внешних факторов, таких как замораживание-размораживание при криоконсервировании [11], действие
детергентов [12] и осмотический лизис [13]. Прямое озонирование крови пациентов, известное как большая аутогемоозонотерапия (БАГОТ) [14], или введение озонированного
физиологического раствора (ОФР) [15] в кровь приводят к стабилизации эритроцитарных
мембран и целых эритроцитов, оказывает выраженный антигипоксический эффект, улучшает кислородтранспортную функцию крови и нормализуют ее реологические свойства
[16, 17]. Описан также ряд попыток практического применения озона для улучшения результатов ФДТ в опытах на животных и в клинике [16, 18, 19]. В данном направлении, получившем название озоно-ФДТ, удалось достичь определенных положительных результатов, однако механизмы действия озона на клетки в условиях ФДТ и рациональные условия применения озоно-ФДТ изучены явно недостаточно. Много противоречивых результатов касается, в частности, выбора оптимальных количеств озона, которые по разным
данным колеблются от 1.5 до 3.8 мг/л, а также способов озонирования (до или во время
ФДТ, местно или внутривенно) [16, 20, 21].
В этой работе мы исследуем действие различных доз озона на эритроциты в условиях фотодинамической терапии. В качестве модельных объектов нами выбраны эритроциты быка и лошади, отличающиеся по ряду структурных и физиологических параметров,
таких как белок-липидный состав и содержание холестерина в мембранах, содержание
доминантного внутриклеточного катиона и степень гидратации [22]. В качестве фотосенсибилизатора использован хлорин е6, производные которого являются одними из наиболее эффективных, малотоксичных и быстро элиминирующихся из организма фотодинамических препаратов [23], разрешенных к клиническому применению в Украине, России,
Беларуси, США и многих других странах.
Методики
Эритроциты выделяли из крови быка и лошади, полученной из Харьковской государственной зооветеринарной академии (пос. Малая Даниловка, Харьковская обл.). Использовалась свежая кровь животных, заготовленная с антикоагулянтом: к 15 мл крови
прибавляли 5 мл раствора 2% цитрата натрия и 3% глюкозы в воде. После удаления плазмы эритромассу дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин (800 g) в течение 3 мин в 10-кратном объеме физиологического раствора. Содержание эритроцитов,
4
подсчитанное с помощью камеры Горяева, во всех экспериментах составляло примерно
725106 клеток/мл.
Озон для исследований получали из газообразного кислорода производства Харьковского кислородного завода (ГОСТ 5583-78) на озонаторе безбарьерного типа, разработанном в Харьковском физико-техническом институте [24]. Концентрацию озона в растворе (c[O3]) определяли спектрофотометрически в кварцевой кювете с длиной оптического пути (l) 20 мм по величине оптической плотности (A) на длине волны 255 нм (полоса Хартли) [25, 26], измеренной на спектрофотометре Specord UV VIS, и рассчитывали по
формуле (1).
c[O3] = 3.4  A255 (мг/л),
(1)
где A255 — оптическая плотность на длине волны 255 нм, а коэффициент 3.4 вычислен для кюветы с l = 20 мм [25].
Концентрация озона в газовой озоно-кислородной смеси на выходе озонатора составляла 30 мг/л при потоке 2 л/мин. Озонирование физиологического раствора проводили путем его барботирования озоно-кислородной смесью. Требуемую концентрацию озона для введения в биологические объекты получали, разбавляя исходный озонированный
раствор физиологическим раствором. Дозу озона в расчете на одну клетку вычисляли по
формуле (2), исходя из начальной концентрации озона (c[O3]) в суспензии клеток и количества клеток в единице объема (c[клеток]).
c[O3]/клетку (мг/клетку) = c[O3] (мг/л) / число клеток в 1 л
(2)
Озонирование эритроцитов производили путем их обработки озонированным физ.
раствором. Для этого отмытые от плазмы крови эритроциты в количестве примерно
725106 клеток помещали в пробирку, содержащую 1 мл физ. раствора с заданной концентрацией озона и инкубировали в течение 15 мин при 20 ºС. Затем, чтобы исключить возможную реакцию озона с фотосенсибилизатором, эритроциты отмывали от озона и продуктов его превращений 2-х кратным центрифугированием (5 мин при 800 g) и ресуспендировали в 1 мл свежего физ. раствора.
Фотосенсибилизатор хлорин е6 (фирмы Frontier Scientific Inc.) вводили в суспензию эритроцитов (1 мл) в виде небольшого количества фосфатного буфера с pH 7.4 (0.1–
10 мкМ) при быстром перемешивании и инкубировали при перемешивании 45 мин при
37 ºС.
Облучение эритроцитов производили светом лампы ИКЗК (250 Вт), расположенной на расстоянии 30 см от образца. Во избежание нагрева образцов между лампой и образцом размещали водяной тепловой фильтр. В качестве образцов для контроля использовали образцы, хранившиеся в темноте. Далее все облученные и необлученные образцы,
представляющие собой суспензию эритроцитов в 1 мл физ. раствора, выдерживали ~15 ч в
темноте при +4 ºС, после чего взбалтывали и центрифугировали 3 мин при 800 g.
Цитотоксичность и фотоцитотоксичность оценивали по уровню гемолиза, который
мог меняться от нуля до 100%. Для этого из каждого образца отбирали 0.5 мл супернатанта в отдельную пробирку и добавляли дистиллированную воду (2 мл для слабо гемолизированных и 10 мл для сильно гемолизированных образцов). К остатку, содержащему осажденные эритроциты в 0.5 мл супернатанта добавляли 10 мл дистиллированной воды для
достижения полного (100%-ного) гемолиза [27] и использовали этот раствор для сравнения.
Уровень гемолиза, т.е. содержание гемоглобина в образцах определяли спектрофотометрически по оптической плотности (A) на длине волны 543 нм [28], и выражали в
процентах по отношению к оптической плотности (A100) раствора с полностью (на 100%)
гемолизированными эритроцитами. Уровень гемолиза рассчитывали по формуле (3).
5
Уровень гемолиза = (A / A100)  100%,
(3)
где A — оптическая плотность супернатанта в исследуемой пробе, A100 — оптическая плотность супернатанта в пробе со 100%-ным гемолизом.
Спектры поглощения записывали на спектрофотометре PerkinElmer Lambda 35, а
спектры флуоресценции — на спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse. Все измерения
проводили в стандартных 1-см кварцевых кюветах при комнатной температуре.
Флуоресцентный зонд ДСП-13-2 синтезирован в ГНУ "НТК "Институт монокристаллов" НАН Украины (Харьков).
Все эксперименты повторяли не менее трех раз. Статистическую обработку результатов производили с использованием t-критерия Стьюдента с доверительным интервалом
0.95 [29]. Воспроизводимость измеряемого уровня гемолиза была не хуже 7%.
Результаты и обсуждение
Прежде всего, мы исследовали действие на эритроциты быка и лошади разных доз
озона (1.3810–11 мг О3/клетку) в отсутствие фотосенсибилизатора. Изменение стабильности эритроцитов при озонировании оценивали по уровню их гемолиза, зависимость которого от концентрации озона представлена на рис. 1. На полученных кривых отчетливо
проявляются две области дестабилизирующего действия озона на эритроциты. Эти области соответствуют концентрации озона примерно 0.20–0.35 мг/л (2.810–13 – 4.810–13 мг
О3/клетку) и 0.70–1.65 мг/л (9.710–13 – 2.310–12 мг О3/клетку) и имеют максимумы, соответственно, при 0.30 мг/л (4.110–13 мг О3/клетку) и 1.3 мг/л (1.810–12 мг О3/клетку). Озон
в концентрациях свыше ~6 мг/л (~8.310–12 мг О3/клетку) приводит к необратимым нарушениям эритроцитарных мембран и вызывает полный (100%) гемолиз эритроцитов. Подобное действие озона наблюдалось ранее на различных клетках человека и микроорганизмах [11, 30, 39, 31].
Уровень гемолиза, %
8
Области дестабилизации эритроцитов
6
Эритроциты быка в темноте
4
2
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Концентрация озона, мг/л
Рис. 1. Зависимость абсолютного уровня гемолиза
эритроцитов быка от начальной концентрации озона
Затем мы убедились, что облучение эритроцитов быка и лошади источником света,
используемым в дальнейшем для изучения фотодинамического эффекта сенсибилизатора,
не влияет в пределах ошибки измерения ни на стабильность эритроцитов, ни на представленную на рис. 1 зависимость уровня гемолиза от концентрации озона.
Мы также измерили цитотоксичность хлорина е6 по отношению к исследуемым
эритроцитам в отсутствие светового облучения и озона и выяснили, что уровень гемолиза,
вызываемый этим сенсибилизатором при концентрациях 0.1–10 мкМ, имеет весьма низкие
6
значения, не превышающие 2%. Это хорошо согласуется с литературными данными о
низкой темновой цитотоксичности хлорина е6 [32].
Как известно, эффективность фотодинамического действия сенсибилизатора, зависит как от его концентрации, так и от дозы (продолжительности и мощности) светового
облучения. Поэтому уровень гемолиза эритроцитов также зависит от этих параметров.
Действительно, представленные в таблице 1 данные демонстрируют сильную зависимость
уровня гемолиза от концентрации хлорина е6 и времени светового облучения. Поэтому
мы подобрали такие концентрации сенсибилизатора (0.1 мкМ) и дозы света (20–40 мин,
250 Вт), чтобы уровень гемолиза в отсутствие озонирования находился в пределах 30–
70%. Такой "средний" уровень гемолиза позволил нам в дальнейшем отслеживать как стабилизирующее (снижение уровня гемолиза), так и дестабилизирующее (усиление гемолиза) действие озона.
Таблица 1. Влияние концентрации хлорина е6 и времени облучения
на уровень гемолиза эритроцитов быка
Время
Уровень
Концентрация хлорина е6,
облучения, гемолиза,
мкМ
мин
%
0
0.70.2
30
543
0.1
60
875
120
946
0
0.70.2
1.0
5
834
0
0.50.1
5.0
5
874
0
21
10.0
5
764
15
854
Далее мы изучили влияние озонирования эритроцитов различными дозами озона на
их стабильность к последующему воздействию сенсибилизатора при световом облучении,
т.е. в условиях фотодинамической терапии. При этом варьировались такие условия эксперимента, как концентрация хлорина е6 и доза светового облучения, а каждый эксперимент
повторялся в одинаковых условиях не менее трех раз.
Оказалось, что на концентрационных кривых зависимости уровня гемолиза от концентрации озона (рис. 2) имеются три минимума, соответствующие стабилизации эритроцитов, при концентрациях озона 0.05–0.28 мг/л (6.910–14 – 3.910–13 мг О3/клетку), 0.6–
1.2 мг/л (8.310–13 – 1.710–12 мг О3/клетку) и 1.6–5.0 мг/л (2.210–12 – 6.910–12 мг
О3/клетку), а также два максимума, один из которых, в узкой области 0.4–0.6 мг/л (5.510–
13
– 8.310–13 мг О3/клетку), соответствует дестабилизации эритроцитов. Второй максимум
(при ~1.4 мг/л, 1.910–12 мг О3/клетку) нельзя связывать с дестабилизацией, т.к. уровень
гемолиза при этой концентрации не превышает таковой в отсутствие озона (пунктирная
горизонтальная линия на рис. 2). Увеличение концентрации озона свыше ~6 мг/л приводит
к полному гемолизу эритроцитов вне зависимости от концентрации сенсибилизатора и дозы светового облучения. Форма полученных кривых, т.е. положение указанных минимумов и максимумов не зависит в пределах погрешности измерения от условий эксперимента, т.е. от концентрации хлорина е6, дозы светового облучения и видового происхождения
эритроцитов, а показанный на рис. 2 график представляет собой усредненную кривую по
ряду измерений с варьируемыми дозами светового облучения. Для получения этой усред-
7
Относительный уровень гемолиза, %
ненной кривой все кривые, полученные при разных условиях нормировались так, чтобы
уровень гемолиза в отсутствие озона был одинаковым — 63% (пунктирная линия). Таким
образом, кривая на рис. 2 представляет относительный, а не абсолютный уровень гемолиза. Проведенные эксперименты также показали, что озонирование может изменять абсолютный уровень гемолиза, т.е. стабильность эритроцитов в пределах около 30%.
0.5 Дестабилизация
80
70
60
50
2.0
Стабилизация
0.2 0.9
40
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Концентрация озона, мг/л
Рис. 2. Зависимость относительного уровня гемолиза от концентрации озона
при световом облучении в присутствии 0.1 мкМ хлорина е6.
Представлены усредненные данные, полученные на эритроцитах быка и лошади
при варьировании дозы светового облучения
Разное видовое происхождение эритроцитов (бык или лошадь) слабо влияет на положение этих минимумов и максимумов, хотя можно отметить небольшую тенденцию к
смещению максимума дестабилизирующего действия озона с ~0.5 мг/л для эритроцитов
быка до ~0.6 мг/л для эритроцитов лошади (рис. 3).
Уровень гемолиза, %
100
Бык, 40 мин
80
60
40
20
Лошадь, 20 мин
Бык, 30 мин
Лошадь, 10 мин
Бык, 20 мин
0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8
Концентрация озона, мг/л
Рис. 3. Влияние видового происхождения эритроцитов, концентрации
озона и длительности светового облучения на уровень гемолиза
Небольшие расхождения в поведении эритроцитов быка и лошади могут быть связаны с тем, что они различаются между собой по белок-липидному составу мембран, содержанию внутриклеточной воды и катионов [22]. Так, в липидном бислое мембран эритроцитов быка, по сравнению с эритроцитами лошади, содержится большее количество
сфингомиелина и холестерина [33]. Учитывая известную склонность холестерина к взаимодействию со сфингомиелином в смешанных мембранах с образованием гель-фазных
доменов [34], можно предположить, что в мембранах эритроцитов быка может присутствовать большее количество дефектных микрозон на границах доменов [35], что облегчает проникновение озона в мембраны. Кроме того, эритроциты быка и лошади отличаются
по доминирующему внутриклеточному катиону: эритроциты быка преимущественно со-
8
Эритроциты быка, облучение 30 мин
Уровень гемолиза, %
100
3
50
1
Интенсивность флуоресценции
ДСП-13-2 с САЧ
Эритроциты быка в темноте
Интенсивность флуоресценции, отн.ед.
держат катионы Na+, а лошади — К+ [22]. В эритроцитах лошади также отсутствует белок
полосы 4.2, который относится к якорным белкам, связывающим интегральные белки с
цитоскелетным комплексом [36]. Все перечисленные факторы могут играть определенную
роль в отмеченном различии во взаимодействии озона с эритроцитами быка и лошади при
фотодинамическом воздействии.
Таким образом, при фотодинамической терапии озон может не только способствовать подавлению патологических клеток, находящихся в условиях гипоксии, как указывалось во введении, но и защищать эритроциты от нежелательного воздействия фотодинамических препаратов. При этом, по-видимому, возможны две методологии применения
озона, которые можно использовать как отдельно друг от друга, так и совместно. Первый
подход состоит в проведении курсов озонотерапии (ОФР или БАГОТ) перед применением
фотодинамической терапии. Вторая методология заключается в одноразовом введении заданных и контролируемых концентраций озона с тем, чтобы в момент облучения светом
его концентрация составляла порядка 0.2 мг/л или 0.9 мг/л. Такие дозы озона будут способствовать улучшению эффективности фотодинамического лечения и, в то же время, защищать эритроциты от нежелательного воздействия фотодинамического препарата.
Полученные нами результаты по стабилизирующему влиянию низких начальных
концентраций озона в области 0.05–0.28 мг/л, что соответствует дозам 6.910–14 – 3.910–
13
мг О3/клетку, на устойчивость эритроцитов к фотодинамическому воздействию довольно хорошо согласуются с известными данными по влиянию озонирования на стабильность
других биологических систем к внешним факторам. Так, озон при начальных концентрациях 0.16–0.22 мг/л повышает устойчивость эритроцитов человека к криоконсервации [17,
37, 38, 39, 40, 41, 42]. В то же время, о существовании концентрационных областей стабилизации при 0.6–1.2 мг/л (8.310–13 – 1.710–12 мг О3/клетку) и 1.6–5.0 мг/л (2.210–12 –
6.910–12 мг О3/клетку), обнаруженных нами при фотодинамически индуцированном воздействии, ранее не сообщалось.
Сложный характер зависимости уровня гемолиза, т.е. стабильности эритроцитов от
концентрации озона (наличие нескольких минимумов и максимумов на рис. 2) может быть
обусловлен, по нашему мнению, его сложным и неоднозначным влиянием на мембраны,
белки, липиды и другие компоненты клетки.
В работе [43] мы изучали влияние различных доз озона на сывороточный альбумин
человека (САЧ) с применением флуоресцентных зондов и показали, что интенсивность
флуоресценции зонда ДСП-13-2 чувствительна к конформационным изменениям молекул
САЧ, индуцированным действием озона. Интересно, что характер кривой зависимости интенсивности флуоресценции красителя ДСП-13-2 с белком от исходной концентрации
озона хорошо повторяет ход аналогичных кривых для темнового (рис. 1) и фотодинамически-индуцированного (рис. 2 и 3) уровня гемолиза эритроцитов, особенно в области низких начальных концентраций озона — до 1.5 мг/л (2.110–12 мг О3/клетку) (рис. 4).
2
0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Концентрация озона, мг/л
9
Рис. 4. Зависимость интенсивности флуоресценции зонда ДСП-13-2 с САЧ (1),
а также уровня гемолиза эритроцитов быка в темноте (2) и при облучении светом (30 мин)
в присутствии хлорина е6 (0.1 мкМ) (3) от концентрации озона
По-видимому, такой эффект связан со сходством в механизмах воздействия озона
на эритроциты и белки, что делает зонд ДСП-13-2 пригодным для изучения действия озона различные биообъекты. Учитывая то, что этот зонд, благодаря наличию длинного алкильного радикала (C13H27), способен глубоко встраиваться в гидрофобные области белков и биомембран и, в первую очередь, в липидный бислой, можно предположить, что изменения параметров его флуоресценции чувствительны к перестройкам гидрофобных областей мембран эритроцитов, в том числе в местах белок-липидных контактов, индуцированных действием озона. В области более высоких концентраций озона (свыше 1.5 мг/л)
эта зависимость несколько нарушается, что может быть связано с перекомпоновкой пространственной структуры мембран [30] и модификацией белков с образованием олигомерных комплексов [44, 45].
Рассматривая возможные аспекты сочетанного применения озона и фотосенсибилизаторов (озоно-ФДТ) можно отметить, что вариации режимов озонирования и доз озона
могут использоваться при совершенствовании и разработке новых фототерапевтических
технологий для контролированного фотосенсибилизированного повреждения клеток, а
также для оптимизации методик лечения заболеваний онкологической и неонкологической природы.
Выводы
Таким образом, на эритроцитах быка и лошади показано, что варьированием доз
озона в условиях фотодинамической терапии может быть достигнут как мембраностабилизирующий, так и мембранодестабилизурующий эффект. При низких дозах озон преимущественно стабилизирует мембраны эритроцитов, причем максимальный уровень стабилизации эритроцитов быка и лошади достигается при концентрациях озона в среде суспендирования клеток 6.910–14 – 3.910–13 мг О3/клетку, 8.310–13 – 1.710–12 мг О3/клетку
и 2.210–12 – 6.910–12 мг О3/клетку. Только в узкой концентрационной области 5.510–13 –
8.310–13 мг О3/клетку озон оказывает дестабилизирующее действие. Разное видовое происхождение эритроцитов (бык или лошадь) слабо влияет на положение этих концентрационных зон.
Стабилизирующее и дестабилизирующее влияние озона на мембраны эритроцитов
можно изучать с помощью флуоресцентного зонда ДСП-13-2, который в области низких
концентраций озона (примерно до 1.5 мг/л, 2.110–12 мг О3/клетку) усиливает интенсивность свечения при дестабилизации и уменьшает ее при стабилизации эритроцитов.
Процедуры озонирования могут не только способствовать доставке кислорода гипоксическим злокачественным тканям, но и способствовать повышению устойчивости
нормальных здоровых клеток к нежелательному воздействию фотосенсибилизаторов, что
может быть использовано при проведении фотодинамического лечения.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке УНТЦ (проект № P384) и НАН Украины (проект
№ 0110U000488).
10
Список литературы
1 Hamblin M.R., Mróz P. (Eds.), Artech House, Boston, 2008, Advances in Photodynamic Therapy: Basic, Translational and Clinical., 559 p.
2 Wainwright M., 1998, J. Antimicrobial Chemotherapy, 42, 13–28.
3 O’Connor A.E., Gallagher W.M., Byrne A.T., 2009, Photochem. and Photobiol., 85,
1053–1074.
4 Macdonald I.J., Dougherty T.J., 2001, J. Porphyrins and Phthalocyanines., 5, 105–129.
5 Lee P. C.C., Rodger M. A., 1987, Photochem. and Photobiol., 45, 79–86.
6 Höckel M., Vaupel P., 2001, J. National Cancer Institute, 93, 266–276.
7 Wyld L., Reed M.W.R., Brown N.J., 1998, British J. Cancer, 77, 1621–1627.
8 Henderson B.W., Fingar V.H., 1987, Cancer Research, 47, 3110–3114.
9 Bocci V., Springer, 2005, Ozone a New Medical Drug, 295 p.
10 Gomer C.J. (Ed.), Humana Press., 2010, Photodynamic Therapy, Methods and Protocols, Springer Protocols, Methods in Molecular Biology, 635, 294 p.
11 Зинченко В.Д., Грищенко В.И., Высеканцев И.П., Белых И.А. 2005. Книжный
дом Университета, Москва, Материалы первой всероссийской конференции "Озон и другие экологически чистые окислители. Наука и технологии", посвященная 250-летию МГУ
им. М.В. Ломоносова, 217.
12 Калер Г.В., Рачковский Л.И., Матус В.К., Конев С.В., 1990, Биол. Мембраны, 7,
41–46.
13 Бєлих І.А., Харків, 2006, Дія озону на біополімери та озонові методи в кріобіології: Автореф. дис. … канд. біол. наук.
14 Козін Ю.І., Ганчев В.В., Ромасько Н.В., 2005, Деклар. патент України № 8550.
15 Масленников О.В., Конторщикова К.Н., Вектор—ТиС, Н.Новгород, 2003, Озонотерапия. Внутренние болезни, 52 c.
16 Bocci V., Larini A., Micheli V., 2005, J. Alternat. Complement. Medicine, 11, 257–
265.
17 Буряк И.А., Зинченко В.Д., Воловельская Е.Л. и др., 2007, Вісник Харківського
національного університету імені В.Н. Каразіна, № 788, Cер. біологія, вип. 6., 129–133.
18 Логинов Л.Е., Торшина Н.Л., Волкова А.И., Посыпанова А.М., Новосибирск,
1996, VI Национальный конгресс по болезням органов дыхания, Озоно-фотодинамический
эффект в эксперименте in vitro. 198.
19 Аблицов Ю.А., Лощенов В.Б., Дадвани С.А., Чистов Л.В., Назаренко Г.И., Логинов Л.Е., Петров С.Н., Аблицов А.Ю., 2000, Патент РФ 2160615.
20 Zänker K.S, Kroczek R., 1990, Chemotherapy, 36, 147–154.
21 Логинов Л.Е., Торшина Н.Л., Волкова А.И., Посыпанова A.M. Новосибирск,
1996, Национальный конгресс по болезням органов дыхания, 198.
22 Bogner P., Sipos K., Ludany A. еt al., 2002, Eur. Biophys. J., 31, 145–152.
23 Isakau H.A., Parkhats M.V., Knyukshto V.N., Dzhagarov B.M., Petrov E.P., Petrov
P.T., 2008, J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 92, 165–174.
24 Зинченко В.Д., Голота В.И., Сухомлин Е.А. и др., 2006, Проблемы криобиологии, 16, 68–72.
25 Лунин В.В., Попович М.П., Ткаченко С.Н., Изд-во МГУ, Москва, 1998, Физическая химия озона, 480 c.
26 Перетягин С.П., В.И. Карелин, Н. Новгород, 1998, Всеросс. научно-практ. конф.
"Озон и методы эфферентной терапии в медицине", III, 162–164.
27 Александрова Д.И., Орлова Н.В., Шпакова Н.М., 2009, Проблемы криобиологии,
19, 406–412.
28 Дервиз Г. В., Бялко Н. К., 1966, Лаб. дело, 8, 461–464.
29 Чарыков А.К., Химия, Ленинград, 1984, Математическая обработка результатов
химического анализа, 168 с.
11
30 Волотовский И.Д. (Ред.), Белсэнс, Минск, 2002, Биофизика живых систем: от
молекулы к организму, 204 с.
31 Белых И.А., Зинченко В.Д., Высеканцев И.П., 2004, Проблемы криобиологии,
14, 41–45.
32 Oseroff A.R., Ohuoha D., HasanT., Bommert J.C., Yarmush M.L., 1986, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 83, 8744–8748.
33 Florin-Christensen J., Suarez C.E., Florin-Christensen M. еt al., 2001, Proc. Natl.
Acad. Sci., 98, 7736–7741.
34 Veiga M.P., Arrondo J.L.R., Goni F.M., Alonso A., Marsh D., 2001, Biochemistry,
40, 2614–2622.
35 Дюбко Т.С., 2006, Проблемы криобиологии, 16, 271–285.
36 Cohen C., Dotimas E., Korsgren C., 1993, Semin. Hematol., 30, 119–137.
37 Мусіна І.А., Зінченко В.Д., Бєлих І.А., Воловельська Є.Л. Львів, 2006, II міжнародна наукова конференція студентів і аспірантів "Молодь та поступ біології", 437.
38 Зинченко В.Д., Буряк И.А., Дюбко Т.С., 2007, МГУ, Москва, 29-й Всеросс. семинар "Озон и другие экологически чистые окислители. Наука и технологии", Применение биологических эффектов малых доз озона в криобиологии, 141–149.
39 Зинченко В.Д., Белых И.А., Мусина И.А., 2005, Проблемы криобиологии, 15,
286–288.
40 Зинченко В.Д., Мусина И.А., Высеканцев И.П. и др., 2005, Вестник физиотерапии и курортологии, №5, 33.
41 Musina I.A., Zinchenko V.D., Volovelskaya Y.L. Hamburg, 2006, The 43rd Meeting
of the Society for Cryobiology in association with the Society for Low Temperature Biology
"CRYO 2006", 48.
42 Buriak I.A., Vysekantsev I.P., Martsenyuk V.F. et al., Cryobiology, 2007, 55, 333–
334.
43 Соколик О.А., Дюбко Т.С., Козин Ю.И., Федюняева И.А., Паценкер Л.Д., 2011,
ДАН Украины, №8 (в печати).
44 Конев С.В., Матус В.К., Мельникова А.М., Руденок А.Н., 1982, Микробиология,
51, 220–223.
45 Матус В.К., Мартынова А.М., Конев С.В., 1990, Докл. АН БССР., 34, 466–469.