Функциональное и молекулярное воздействие бутират аргинина и преднизолона на мышцы... MDX мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна.
advertisement
Функциональное и молекулярное воздействие бутират аргинина и преднизолона на мышцы и сердце у MDX мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна. Введение Долгосрочное развитие окончательного лечения МДД, решение проблемы первичного дефекта гена, восстановление или компенсация функций –все это относительно трудоемкие процессы, особенно в глазах больных мальчиков и их семей. По этой причине существует значительный интерес в тестировании потенциально паллиативных агентов, которые в настоящее время зарегистрированы для клинического применения. Так как такие агенты не решают основной причины дефекта, и наше понимание патологии этой основной причины остается недостаточным, они должны оцениваться с точки зрения эмпирически полезных и вредных воздействий. Кандидаты в этот класс терапевтических агентов выбираются в основном по своей деятельности при других патологических состояниях. С учетом неопределенностей, важно провести поиск для выявления положительного эффекта и, что более важно, на наличие вредных побочных эффектов. В случае МДД, большинство первичных исследований предполагаемых терапевтических агентов проводятся на мышах MDX, из-за своей простоты производства и обслуживания, но большинство таких исследований сосредоточены на небольшом числе измерений. В попытке исправить это, мы разработали протокол, который включает в себя широкий набор критериев оценки, с помощью которого можно обнаружить тонкие, но значительные последствия агентов тестирования на функциональные показатели исхода у мышей MDX, таким образом, чтобы определить как желательные, так и нежелательные эффекты любого данного режима лечения [1]. Здесь мы применяем этот протокол для сравнения двух различных агентов, которые могут влиять на ход миопатий, связанных с дефицитом дистрофина. Во-первых, преднизолон, который имеет хорошо известную терапевтическую ценность при МДД, но пока еще плохо понятные механизмы, что связано со значительными побочными эффектами. Во-вторых, бутират аргинина, который оказывает благотворное воздействие через сп гистондеацетилазу и опосредованный контроль экспрессии различных генов, а также обеспечивает субстрат для NOS сигнальных путей. При этом исследовании мы использовали широкий спектр поведенческих, функциональных, гистологических, биохимического и молекулярного анализа, чтобы всесторонне оценить влияние этих двух препаратов по отдельности или в комбинации у MDX мышиной модели мышечной дистрофии. Мы обнаружили, что аргинин бутират улучшает силу сцепления задних конечностей и снижает фиброз в икроножных мышцах, но не оказывает заметного улучшение мышечной гистологии, сывороточной креатинкиназы (КК). В отличие от этого, 6 месяцев непрерывного лечения преднизолоном в отличие от ежедневного введения однократной дозы привело к снижению функциональных, гистологических и биохимических показателей. Наши эксперименты генного профиля экспрессии указывают на значительные изменения в экспрессии генов, которые контролируют клеточный рост, дифференцировку, сигнализацию, воспаление и фиброз в скелетных мышцах в результате лечения бутиратом аргинина и преднизоном. Наши результаты указывают на целесообразность анализа нескольких систем мониторинга как положительных, так и токсических эффектов препаратов с широким спектром деятельности. Материалы и методы. Уход за животными. Все мыши были обработаны в соответствии с местными принципами по уходу за животными. C57BL/10ScSnDmdmdx/J (MDX) и C57BL/10ScSn (BL10) самки мышей весом 20-30 г (8 - 10-недельного возраста) были приобретены у Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Все мыши были размещены в индивидуальной клетке с вентилируемой системой с 12-ч циклом свет-темнота и получали стандартный корм и воду. Мышей отдыхали, по крайней мере, 10-14 дней до начала исследований и базовые показания были получены. Дизайн исследования. В исследовании принимали участие четыре группы по 15 животных в каждой: (а) контрольной группе вводили 0,9% NaCl (IP), (б) группа, получавшая бутират аргинина в дозе 250 мг / кг / день ИС , (в) группа, получавшая преднизон в дозе 1 мг / кг / день (медленным высвобождением подкожной гранулы) и (г) группа (называемая комбинированная группа) получала бутират аргинина в дозе 250 мг / кг / день IP и преднизолон в дозе 1 мг / кг / день. Мышей лечили в течение 6 месяцев, начиная с 3-месячного возраста в течение 5 дней в неделю (понедельник-пятница) в течение 6 месяцев. Бутират аргинина хранили при комнатной температуре. Подкожные гранулы медленного высвобождения преднизона (Инновационные Америки, Inc) с ежедневным медленным высвобождением преднизона 1 мг / кг 90 дней. Два введения были использованы у каждой мыши, при этом второе введение проводиться через 3 месяца. Тест на беговой дорожке. Мышей подвергали 30-минутному бегу на горизонтальной беговой дорожке (Columbus Instruments, Колумбус, Огайо) 12 м / мин. Испытание проводили в утренние часы два раза в неделю в течение 6 месяцев, за исключением тех дней, когда функциональные данные были получены. Вращательный тест. Тесты проводили, как описано ранее [1], [2]. Мыши прошли обучение (UgoBasile, В. А., Италия) в течение 2 дней до сбора данных. Каждое испытание было сделано два раза в день, с 2-часовым интервалом между сессиями, в течение 3 дней подряд. Задержка падения (в секундах) была записана, и все шесть оценок были усреднены для каждой мыши. Усредненные данные выражали задержку падения (в секундах) для каждой мыши. Испытание силы хвата. Силу захвата оценивали с помощью измерителя силы хвата, состоящего из горизонтальной сетки для передних конечностей и угловой сетки для задней конечности (Columbus Instruments, Columbus, OH). Пять успешных измерений силы хвата задних конечностей и передних конечностей в течение 2 минут были записаны и нормированны на массу тела, как описано ранее [1]. Поведенческие измерения активности. Открытое поле деятельности измерялась с использованием Digiscan аппарата (Omnitech Электроника, Колумбус, Огайо), как описано ранее [1], [3]. Все мыши проходили акклиматизацию в течение 60 минут до фактического сбора данных. Данные собирали каждые 10 минут в течение 1-часового периода каждый день в течение 4 дней подряд. Результаты рассчитывали как среднее значение ± SE всех записей. Эхокардиография. Пять мышей из группы лечения были исследованы в 9-месячном возрасте. Мышей анестезируют 1-2% изофлураном в 100% кислороде и сканирование проводили в течение 20 минут с помощью ультразвукового зонда высокой частоты (РМЗ 702a, Vevo 660, VisualSonics, Торонто, Канада), как описано ранее [1], [4]. Качественные и количественные измерения проводились с использованием аналитических программ (VisualSonics, Торонто, Канада). Гистологическая оценка. В конце исследования все мыши были умерщвлены, и из ткани были взяты образцы для всесторонних испытаний, как описано ниже. Часть каждой из расчлененных мышц (например, икроножной, диафрагмы и сердца) выдерживают в формалине и окрашивают H & E или Сириусом красным. Оставшаяся часть каждой ткани замораживали в изопентане, охлажденном в жидком азоте. Пять неперекрывающихся полей зрения ткани были обследованы под световым микроскопом 40 × (поле высокой мощности) и получены цифровые изображения с помощью компьютерной программы (Olympus CAST Стереология системы, Olympus Америка Инк, Center Valley, PA) . Цифровые изображения были загружены в J (NIH) с дополнительными плагинами для подсчета клеток. Общее количество клеток, центральные ядра, периферийные ядра и общее количество клеток с централизованными ядрами были подсчитаны и проанализированы по сравнениию между группами лечения. Волокна, показывающие вырождение или регенерацию и воспалительные очаги в поле были оценены слепым методом, как описано ранее [1]. Измерения диаметра волокна. Вкратце, 8-10 мкм замороженные срезы фиксировали в холодном ацетоне в течение 10 минут. Срезы блокировали с использованием 100 мкл 10% лошадиной сыворотки и инкубировали с первичными антителами к ламинину. После двух промывок PBS секции были обработаны козьими антителами против крыс с красителем Алекс Fluor 488 (зеленый). После двух промываний 5 минут при 1 × TBS стекла были установлены с использованием Vectashield монтажа среды с DAPI. Ткань исследовалась под флуоресцентным микроскопом 20 ×. Цифровые изображения были обработаны с использованием AxioVision программного обеспечения и минимальный диаметр измерялась. Для получения фактического размера микрона мы установили шкалу с помощью микроскопа (градусной сетки ООО Тонбридже, графство Кент, Англия) 100 × 0,01 = 1 мм. Данные были ранжированы в соответствии с размером, ряды были затем нормированы на размер выборки (число ранге / общее число образцов) и нормированный балл откладывают по вертикальной оси от размера волокон на горизонтальной оси. Тест Колмогорова-Смирнова был использован для оценки различий между распределением волокон по размерам. Измерения фиброза. Парафиновые срезы окрашивали Сириусом красным [Sigma-Aldrich, St Louis, MO], и гематоксилином для визуализации ядер. Молекулы красителя встраивается в структуру коллагена типов I и III и придают розовую окраску в большинстве тканей при их наблюдении в белом свете. Ткань исследовалась под оптическим микроскопом с использованием 4 × , и цифровое изображение получают с использованием компьютерного программного обеспечения (Olympus CAST Стереология системы, Olympus Америка Инк, Center Valley, PA). Цифровые изображения были обработаны с использованием J (NIH), с дополнительным плагином по определению цветового порога. Процент фиброзных областей в соответствующей области, окрашенных в красный был выражен по сравнению с общей площадью среза ткани, и результаты выражали в виде % немышечных областей. Профилирование экспрессии мРНК. Для выделения РНК икроножные мышцы (из 4 мышей / группа 16 мышей) замораживали в изопентане, охлажденным жидким азотом. Ткань помещали в трубку с 1 мл Trizol и гомогенизировали. Общую РНК выделяли и затем очищали с помощью набора Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя. В результате тотальная РНК проверялась количественно, используя Nanodrop ND-100 Спектрофотометр (Nanodrop Technologies, Уилмингтон, Делавэр).Профилирование экспрессии генов проводили, как описано ранее, с использование GeneChip 430 (Affymetrix 430 2,0, Santa Clara, CA) [5]. Вестерн-блоттинг. Общий белок экстрагируют из замороженных икроножных мышц, помещая ткань в NP40 буфер для лизиса. Образцы подвергали электрофорезу в 4-12% Bis-Tris геле (Invitrogen) в течение 2-2,5 ч при 200 В и переносили на нитроцеллюлозную мембрану в течение 2 часов при 300 мА. После переноса пятна были окрашены красным Ponceau для определения эффективности передачи. Затем блот блокировали в 5% молоке в течение 1 ч и инкубировали с анти-атрофином (1:100) (NCL-Drp2, Novocastra) в течение ночи при 4 ° С, промывали пять раз в течение 6 мин каждый с Tris солевым буфером и инкубировали с пероксидазой хрена (HRP), конъюгированной с козьими антителами против мышиного IgG (1:3000) в течение 1 ч при комнатной температуре. После второй промывки с TBST, блоты инкубировали в течение 1 мин с использованием ECL (Amersham). Авторадиограммы были проверены с использованием сканера Arcus II, и объем анализа проводили с использованием программного обеспечения Quantity One (Bio-Rad Discovery Series). Отношение атрофина к бета-тубулину рассчитывали для каждой группы мышей. КФK . Кровь собирали при проколе сердца сразу же после эвтаназии с диоксидом углерода. 250 мкл крови собирали в пробирки Эппендорфа, без добавки для отделения сыворотки, и КФK определение проводили с использованием стандартного спектрофотометрического метода. Поглощение при 340 нм измеряли каждую минуту в течение 2 мин при 37 ° С для расчета активности фермента. Повторяющиеся измерения были выполнены на каждом образце сыворотки. Статистический анализ. Статистический анализ проводили для анализа различий между двумя группами, One-дисперсионный анализ с последующим Бонферони тестом сравнивал разницу в пределах групп, и двусторонний дисперсионный анализ проводили для сравнения различий между группами и во времени. В общей сложности восемь измерений гистологии (дегенерация волокон, регенерирующие волокна, воспаление, кальцификации, центральные и периферические ядра), сравнивались между MDX и BL10 мышами. Сравнения были сделаны с использованием регрессии Пуассона или с помощью отрицательной биномиальной регрессии, где модель Пуассона не соответствовала данным из-за чрезмерной дисперсии. Тест Колмогорова-Смирнова для равенства в распределении был использован для сравнения параметров между 6 мышами при различных условиях лечения (лечение солевым раствором, аргинин-бутиратом, преднизоном, и комбинация преднизолона и аргинин-бутирата). Номинальная величина р = 0,05 рассматривалось как статистически значимая. Все анализы проводились с использованием Stata V10 (College Station, TX). Различия считались значимыми при AP значение <0,05. Результаты. Эффект 6 месяцев лечения аргинин-бутиратом, преднизолоном, или комбинацией этих препаратов у мышей MDX. Влияние на массу тела. 6 месяцев лечения бутиратом аргинина у MDX мышей существенно не изменили их общий вес тела и характер роста по сравнению с контрольными мышами (рис. 1). Однако введение преднизолона или сочетания преднизолона и бутират аргинина привело к значительному снижению массы тела в течение первых 2 месяцев лечения. Вес тела постепенно увеличивается в течение следующих 4 месяцев, но был значительно ниже, чем у мышей получавших бутират аргинина или солевой раствор (6 месяцев лечения; рис. 1). Затем мы сравнили эти данные в соответствии с возрастом и полом BL10 дикого типа мышей, что были ранее опубликованы [1]. Леченный бутиратом аргинина и получавшие физиологический раствор мыши показали рост на 103,12% и 100,93% соответственно, тогда как получавшие преднизон и комбинацию препаратов - 84,7% и 86,33% от нормальной массы тела соответственно. Это уменьшение массы тела было также отражено в значительном снижении веса икроножной мышцы при лечении преднизоном (абсолютный) и сочетанием препаратов (абсолютные и нормированные). Никаких статистически значимых различий не наблюдалось в весе ткани сердца у всех групп, но нормализация показала значительное увеличение массы сердца у получавших преднизон и комбинацию препаратов. Масса камбаловидной мышцы была значительно увеличена при лечении бутиратом аргинина (абсолютное) по сравнению контрольной группой, однако нормированные значения веса камбаловидной мышцы значительно увеличилась во всех группах по сравнению с контрольной группой (S1 Дополнительный таблицу). Мы также наблюдали значительное снижение массы селезенки (абсолютное) во всех трех обработанных лекарством группах за исключением получавших комбинацию препаратов (S1 Дополнительный таблицу). Влияние на поведенческие изменения. Прочность сцепления передних и задних конечностей уменьшилась во всех группах к концу лечения, в 9 месяцев (рис. 2). Получавшая бутират аргинина группа показала значительное улучшение показателей передних конечностей через 5 месяцев по сравнению с получавшими физиологический раствор (0,12 ± ± 0,01 0.01vs.0.11 р = 0,03). Темпы снижения силы передних конечностей были медленнее в этой группе, чем в других группах (рис. 2А). Сила задних конечностей показала прирост от 3 месяцев до 5 месяцев и последующее снижение к 9 месяцам у получавших бутират аргинина и контрольной группе, после чего группа бутират аргинина показала значительное улучшение силы, чем контрольная группа (0,16 ± 0,01 против 0,18 ± 0,01, р = 0,002). У получавших преднизон и комбинацию препаратов отмечено значительное снижение силы задних конечностей по сравнению с получавшими физиологический раствор животными (р = 0,01, р = 0,04 соответственно) (рис. 2В). Тем не менее, нормализация силы передних конечностей с массой тела показала более медленное снижение силы в группах, получавших лечение, чем в контрольной группе (фиг.2С). Опять же, группы бутират аргинина показали значительно более высокую прочность, чем контрольные в 5 месяцев (р = 0,01). Нескорректированная сила задних конечностей была ниже в 9-месячном возрасте в группах, получавших преднизолон и комбинированное лечение, чем в группах аргинина бутирата или контрольной группе. У всех мышей, обработанных лекарством, казалось, показатели имели более медленное снижение, чем у обработанной солевым раствором контрольной группы в 9 месяцев (рис. 2D) и группы аргинин-бутирата с значительной разницей в прочности в 9 месяцев (5,98 ± 0,67 vs.6.62 ± 0,44 р = 0,004). Мы сравнили эти данные силы хвата с ранее опубликованными у BL10 мышей дикого типа и пришли к выводу, что методы лечения привели к 61,62% (физиологический раствор), 66,91% (бутират аргинина), 75,32% (преднизолон) и 73,1% 1 (комбинация) изменению силы сцепления передних конечностей, и 65,16%% (физиологический раствор), 72,14% (бутират аргинина), 72,99%% (преднизолон) и 72,42% (комбинацию) изменению по отношению к BL10 мышам дикого типа. Задержка падения (SEC) при вращательном тесте используется для оценки координации движений и силы. Все группы показали снижение времени с увеличением возраста (дополнительные S1A рисунок). Аналогичным образом, в анализ поведенческих измерений, таких как горизонтальная деятельность, вертикальная активность и общее расстояние, используя открытую по сфере деятельности (Digiscan) камеру, не показали статистически значимых различий (дополнительные Рисунок S1B- 1D). Влияние на гистологию. Исследование окраски гематоксилином и эозином (H & E) срезов икроножной мышцы у получавших бутират аргинина мышей, не показало никаких значительных изменений в общем количестве волокон, общем количестве центральных ядер (см. количество регенерации в поле) и количестве волокон с центральными ядрами (волокна с централизованными ядрами относится к клеткам, где проходит цикл регенерации) количестве вырождающихся волокон и регенерирующих волокон, периферических ядер, воспалительных локусов и количестве периферийных ядер в одном поле по сравнению с группой, получавшей солевой раствор (табл. 1). Так как мы заметили существенные различия в массе тела, а также мышечной массе мы решили измерить распределение волокон по размерам во всех 4 группах мышей. Самые различия между размерами волокон (дополнительный рисунок S2) между группами лечения было обнаружено от 35 до 65 микрон. Волокна в контрольной группе показали больший размер, чем волокна у получавших преднизон и комбинацию препаратов, в то время как у получавших бутират аргинина обнаружен промежуточный размер между контрольной и группами, получавшими лечение (табл. 2). Затем мы дополнительно оценили фиброз в сердце, диафрагме и икроножной мышце этих мышей путем окрашивания тканей Сириусом Красным. Фиброз значительно снизилася в икроножной мышце мышей получавших аргинин (р = 0,04) по сравнению с получавшими физиологический раствор. (рис. 3) Там не было никаких существенных изменений в содержании коллагена в сердце. Однако количество фиброза наблюдаемого в сердце было значительно выше у получавших преднизолон и оба препарата по сравнению с получавшими физиологический раствор. (рис. 4) Отмечено также увеличение содержания коллагена в группе бутират аргинина (р = 0,004) (рис. 5) Сравнение уровней сывороточной креатинкиназы между группами не показало статистически значимых различий (данные не показаны). Влияние на функцию сердца. В конце исследования мы оценивали функцию сердца получавших лекарство и физиологический раствор групп с помощью эхокардиографии. Нет статистически значимых изменений, произошедших в фракции выброса и сокращении у группы бутират аргинина (фиг. 6). Этот результат отличается от значительного снижения выброса и как следствие сокращение, которое было замечено в группе, получавшей преднизолон (рис. 6). Влияния на экспрессию атрофина. Так как бутират аргинина, как известно, индуцирует экспрессию генов плода, в том числе атрофина, мы использовали вестерн-блоттинг для обнаружения атрофина в лизатах скелетных мышц из всех групп. Мы видели вариации в экспрессии атрофина среди группы, получавшей бутират аргинина (рис. 7). Нормализация экспрессии атрофина к экспрессии тубулина показала 28%-ное увеличение в экспрессии атрофина у групп, получавших бутират аргинина (рис. 7). Влияние на мРНК профилирование. Экспрессия мРНК в икроножной мышце из обработанных лекарством и солевым контрольных групп проводили с использованием чипов Affymetrix гена. Для интерпретации данных микрочипов, мы использовали несколько алгоритмов Установите щуп (MAS5.0, dCHIP разница модели, плоскогубцы). Мы проанализировали данные с помощью программного обеспечения GeneSpring. Выяснилось, что лечение бутират аргинином резко изменило экспрессию генов в скелетных мышцах дистрофических мышей (фиг. 8). Вначале мы искали гены, которые показали двукратное изменение экспрессии, с р значением 0,01. Мы обнаружили, что 1515 генов значительно изменены (453 активируется и 1062 подавляется) в группе, получавшей бутират аргинина, 136 (72 и 64 активируются/подавляются) в группе, получавшей преднизолон, и 261 (102 и 159 ) в группе комбинированного лечения. Некоторые из экспрессируемых генов были уникальны для конкретной группы лечения (например, 1461 генов для бутират аргинина, 103 преднизона и 217 для комбинированной терапии), а другие были разделены между группами (например, бутират аргинина набор общих 20 генов с группой преднизолона и 31 набор генов с группой комбинированного лечения; набор общих 10 генов у группы с сочетанием препаратов и группы преднизолона, 3 гена были общими для всех трех групп). Мы обнаружили, что гены, которые участвуют в различной клеточной активности, таких как адгезия, щелевой контакт, сигнальный путь Hedgehog, сигнальный путь Wnt, сигнальные пути кальция, сигнальный путь G белка, поперечно-полосатых мышц, клеточный цикл, МАРК сигнальный путь, процессинг мРНК, цитокин-цитокин рецепторное взаимодействие, адипоцитокин сигнальный путь, сигнальные пути инсулина, Jak-STAT сигнальный путь, МТор сигнальный путь, регулирование цитоскелета, инозит фосфатный обмен, биосинтез гликана, биосинтеза жирных кислот, TGF-бета-сигнальный путь, PPAR сигнальный путь, окислительное фосфорилирование, биосинтез фолата, транспорт электронов цепи, аминоацил-тРНК биосинтез дифференциально экспрессируются в ответ на лечение бутират аргинином, что четко указывает HDAC ингибирующую активность бутирата [6]. Принимая во внимание то, что преднизолон воздействовал на сравнительно меньшее количество путей, контролирующих иммунные функции, клеточной связи, рецепторов цитокинов, Wnt сигнальный путь, МАРК сигнальный путь, VEGF сигнальный путь, ГнРГ сигнальный путь, метаболизм арахидоновой кислоты, биосинтез стероидов, а также углеводов и метаболизм аминокислот. В группе комбинированной терапии изменения коснулись генов, контролирующих сигнальный путь Wnt, МАРК сигнального пути, регулирование цитоскелета, пуриновый обмен, биосинтеза фолата, клеточные связи, ECMрецепторного взаимодействия, обмен сфинголипидов, PPAR сигнальный путь, клеточный цикл, биосинтез гликана, метаболизм глицерофосфолипидов, малые взаимодействия везикулярного транспорта, сигнальный путь Hedgehog. Обсуждение. С момента открытия и характеристики гена, ответственного за мышечную дистрофию Дюшенна, было ясно, что исправление первичного дефекта станет проблемой. Мало того, что на сегодняшний день известные крупнейшие гены слишком велики, чтобы быть заключены в вирусные векторы, которые в настоящее время рассматриваются [7], но и преимущественно пораженные ткани, скелетных и сердечных мышечных клеток не являются простыми целями. Скелетные мышцы, в особенности, представляют проблему, так как являются наиболее обильными тканями в организме и так широко и диффузно распределены, что кровеносная система является единственным правдоподобным маршрутом доставки любых потенциально терапевтических агентов. Хотя обе ткани сильно васкуляризированы, нет никаких полезных функций, таких как эндотелиальная фенестрация, которая могла бы обеспечить свободный доступ через кровь агентов в мышечное волокно. В то время как генетические манипуляции, такие как пропуск экзона привели нас на грань терапевтического успеха у животных моделей, никто еще не достиг такого уровня эффективности, чтобы позволить немедленное терапевтическое применение. В то же время существует необходимость в промежуточном паллиативном лечении, чтобы остановить или замедлить прогрессирование заболевания. Такие процедуры направлены на то, что мы воспринимаем как патологические пути в следствие первичного дефекта, и потому что мы не знакомы с ролью многих из этих путей, или там, где есть оптимальный баланс, например, воспалительный ответ на некроз мышц, важно принять возможности самого широкого представления о преимуществах и недостатках какого-либо конкретного агента и режима введения. Таким образом, мы разработали протокол, который применяет широкий спектр критериев оценки эффективности конкретных режимов лечения. Значение его хорошо иллюстрируется примерами двух агентов, которые мы исследовали здесь. Один из них, преднизолон в настоящее время «стандарт медицинской помощи» для мальчиков с МДД, которые могут переносить его побочные эффекты, но нет твердых пояснений механизма этих преимуществ. Второй агент, бутират аргинина имеет потенциал для получения положительного эффекта двумя путями: аргинин доступен в качестве субстрата для нОАС, в то время как бутират изменяет гистоны и имеет широкое воздействие на экспрессию генов. Здесь снова круг потенциальных эффекторных путей является открытым для спекуляций. Наши результаты с оценкой этих двух агентов подтверждают наш общий подход, так как мы подобрали весьма различные наборы выгоды и дис-выгоды от двух методов лечения, ни один из которых не был бы предсказуемым по данным существующей литературы по их биологическим эффектам. В этом исследовании, мы приняли всесторонний подход к оценке последствий 6 месяцев лечения бутират аргинином, преднизоном и комбинацией обоих препаратов на фенотип болезни у MDX мышей. Наши данные показывают, что лечение в течение 6 месяцев бутиратом аргинина хорошо переносится MDX мышами. Мы отметили снижение фиброза в скелетных мышцах, которое хорошо коррелировало с улучшением силы хвата. Кроме того, экспрессия генов свидетельствует о повышении стимулирующих рост путей (например, IGF-1 путь) и уменьшение про-фиброзных путей. Мы не видели никаких существенных различий в поведенческой активности, производительности, гистологии, или сывороточной КФК между получающей препарат группой и контрольной группой. Тем не менее, в группе преднизона и комбинации препаратов показали значительные изменения в генах, которые влияют на фиброз, воспаление и миогенез. Эти данные согласуются с потерей массы тела, снижением производительности функциональных и поведенческих мер, а также снижение сердечной функции и увеличением фиброза. Так как вес тела является простой мерой общего действия препарата на фенотип мышей, мы измерили вес тела в разное время во время процесса и обнаружили, что бутират аргинина не оказывает существенного влияния на массу тела, а преднизон с бутиратом аргинина показывает характер роста, который отличается от позиции обработанных солевым раствором мышей. В противоположность этому, преднизон обработанные (1 мг / кг / день) мыши показали значительное снижение массы тела. Это преднизон индуцированное снижение массы тела и снижение веса у мышей MDX также было отмечено в предыдущих исследованиях [8], [9]. Похоже, что нормированная масса камбаловидной мышцы увеличивается во всех группах, получавших лечение, что указывает на некоторую степень гипертрофии, с другой стороны нормированная масса сердца значительно увеличена в группах преднизона и комбинации препаратов, что дает возможность предположить рост кардиомиопатии. Обобщая эти данные - 6 месяцев лечения бутиратом аргинина является безопасным, и, что хроническое непрерывное введение преднизолона оказывает катаболический эффект на дистрофические мышцы, явно вызывает иммуносупрессию, что отражает размер селезенки. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этого дифференциального катаболического влияния на различные ткани и мышечных групп в настоящее время исследуются. Прочность сцепления широко используется для оценки лекарственной эффектов у модели мыши MDX [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Абсолютная сила передних и задних конечностей (без учета массы тела) в течение лечения бутиратом аргинина в любом возрасте оказалась выше, чем у других групп медикаментозного лечения, предполагая, что лечение бутирата аргинина улучшает силу передних и задних конечностей. Несмотря на то, что бутират аргинина обработанные мыши не показывают значительного различия в массе тела, они все еще показали улучшенную производительность передних конечностей по сравнению с контрольной группой мышей. Напротив, после нормализации массы тела группы преднизолона и комбинированного лечения показали значительно лучшие силы сцепления передних конечностей из-за уменьшения массы тела. С точки зрения силы сцепления задних конечностей группы преднизолона и комбинированного лечения показали значительно более низкий уровень силы, чем бутиратом аргинина и контрольной группой мышей. Эффекты преднизолона на прочность сжатия широко варьировались, что свидетельствует о значительном увеличении [10], [11], [16] и другие, не обнаружившие эффект [17], [18]. Эти различия могут отражать различия в возрасте мышей, или дозы, пути введения, и / или продолжительность лечения преднизолона. Наши данные показывают, что существуют различия в силе передних и задних конечностей и что эффекты преднизолона более выражены в передних конечностях, чем в задних, особенно после результатов с поправкой на массу тела. Наши данные ясно показывают, что снижение нормированной силы передних и задних конечностей силы захвата стабилизируется более в группе преднизолона, чем в группе бутират аргинина и комбинированного лечения. Мы также оценили двигательную координацию используя вращательного теста. Похоже, что ни один из препаратов, которые мы тестировали, не имели значительного влияния на координацию движений в этих условиях. Мы также оценивали общую поведенческую активность мышей с использованием открытого поля аппарата Digiscan и обнаружили, что у животных, адаптированных к Digiscan аппарату в течение периода времени, тесты обычно выполняется лучше с течением времени, чем это было в начальный момент времени. Сравнение различных групп лечения четко указывает, что группа бутират аргинина в целом демонстрировала лучшую нижнюю горизонтальную активность, вертикальную активность и общее пройденное расстояние, чем в контрольной группе, но и в группе комбинированного лечения показывают лучшие результаты всех трех параметров. Причины этой низкой производительности на открытом поле поведенческой активности после лечения бутиратом аргинина неясны, однако, положительные поведенческие эффекты, наблюдаемые группе комбинированного лечения, вероятно, были под влиянием их пониженной массы тела по сравнению с контрольными мышами. H & E окрашивание скелетных мышц обработанных мышей не показало существенных изменений по сравнению с контрольной группой. Это неясно, почему улучшение силы хвата отражено в улучшении гистологических изменений. Так как окрашивание H & E не является полезным для обнаружения фиброза, мы использовали окраску красным Сириусом, которая была использована в течение многих лет для выявления фиброза [19]. Мы обнаружили тенденцию к снижению фиброза и в скелетных мышцах и в сердце мышей, получавших бутират аргинина. Удивительно, что мы не видели тенденцию к снижению фиброза диафрагмы этих мышей. В настоящее время неясно, как различные ткани реагировали на антифибротическое лечение. Тенденции, которые мы наблюдали в направлении увеличения силы сцепления и сердечной функции, наряду с уменьшением фиброза после лечения бутиратом аргинина, указывают на положительный эффект в скелетных мышцах и сердечной функции. Кроме того, противоположная тенденция видна в группах преднизолона и комбинированного лечения, что предполагает, что 6 месяцев лечения преднизоном наносит ущерб как скелетным мышцам, так и сердечной функции. У группы бутират аргинина снизилось распределение пор по размеру по сравнению с контрольной группой, вероятно, в связи с увеличением тенденции в волокнах с центральными ядрами / поле (регенерации), с другой- снижение размера волокон более выражено у группы преднизона и комбинации препаратов с корреляцией с увеличением тенденции к вырождающимся волокнам при H & E окрашивании. Наши результаты подтверждают вывод о том, что L-аргинин обработанные мыши MDX также показывают повышение коронарного кровотока и снижение диастолической жесткости по отношению к контрольным мышам MDX и что снижение жесткости связано со значительным сокращением коллагена. Это говорит о том, что хроническое лечение Lаргинином выгодно тем, что оно улучшает функцию и уменьшает фиброз в дистрофин-дефицитном сердце [20]. Более того, недавние исследования также показали, что L-аргинин снижает активность NF-Кб и металлопротеиназы ММП-2 и ММП-9, уменьшает бета-дистрогликан, и вызывает транслокацию атрофина, способствуя тем самым целостности мембран мышцы и снижение фиброза дистрофических мышц [21]. Недавние исследования также показали, что L-аргинин значительно снижает некроз в мышцах мышей MDX [21], [24], [25]. L-аргинин снижает травмы сарколеммы, вызывая регуляцию атрофина, β-дистрогликана и повышение стабильности ассоциированных с мембранами белков, таких как интегрин альфа 7 [26]. С другой стороны, Lаргинин как ранее было показано, вызвает экспрессию атрофина у мышей MDX [25], [27]. Причины этого несоответствия остаются неясными, они могут быть связаны с тем, что мы использовали бутират аргинина, а не Lаргинин. В отличие от результатов, полученных для бутират аргинина, мы увидели более выраженную экспрессию атрофина в группах преднизона и комбинированного лечения, чем в других группах. Ранее было показано, что глюкокортикостероиды стимулировали экспрессию атрофина в скелетных мышечных волокнах [28]. Наши результаты показали, что MDX мыши как правило, имеют более высокие уровни сывороточной КФK, чем контрольные мыши. Одни опубликованные исследования показали, что L-аргинин снижает сывороточные уровни КФK [25], но еще не зарегистрирован ни эффект L-аргинина [27] на мышах MDX. Несмотря на то, что группы преднизолона и комбинированного лечения показали тенденцию к снижению в сыворотке крови уровня КФК, эти изменения не были статистически значимыми. Наши данные о преднизоне согласуются с отчетами благотворного воздействие на сывороточные уровни КФK у мышей MDX [16].Бутират фрагмент бутират аргинина, как было показано, ингибируют гистондеацетилазу, в результате чего гиперацетилирование гистонов Н3 и Н4. Ацетилированные гистоны имеют уменьшенное сродство хроматина, позволяя хромосомной ДНК разворачиваться, что потенциально может модулировать экспрессию определенных генов, в том числе фетальной формы взрослых генов. Это положение согласуется с наблюдением, что наши 6015 генов были значительно изменены у мышей, получавших бутират аргинина, 972- у мышей, обработанных преднизолоном, и 1411- в группе комбинированного лечения. Наши данные генного профиля экспрессии указывают на клеточную пролиферацию, рост и дифференцировку. Дальнейшие подтверждающие эксперименты необходимы для расследования дифференциальной реализации программы гена на уровне белка. В целом, лечение бутиратом аргинина имело тенденцию к улучшению силы сцепления и снижению фиброза в икроножных мышцах. Эти данные поддерживают увеличение экспрессии способствующих росту генов и снижение профиброзных генов, которые наблюдались в скелетной мышце бутират аргинина обработанных мышей. С другой стороны, мы не наблюдали значительных изменений в гистологии, поведенческих измерений, функции сердца или сывороточной КФK после лечения бутиратом аргинина. Подробные эксперименты необходимо проводить для того, чтобы оценить эффекты бутирата аргинина у молодых мышей. В общем, наше понимание патологических путей и наши знания о диапазоне возможных последствий любого низкомолекулярного препарата на эти сложные сети путей является довольно поверхностным. В таких условиях было бы неразумно ограничивать анализ функционального воздействия на основе предварительного ожидания. Что еще более важно, такой широкий опрос также увеличивает вероятность выявления неожиданных побочных эффектов, таких как повышенный сердечный фиброз, связанный с непрерывным введением преднизолона. Это исследование подчеркивает необходимость всеобъемлющих стратегий оценки для выявления как положительных, так и вредного воздействия любых препаратов в настоящее время используемых или для которых терапевтическое тестирование предполагается. Ссылки. 1. Spurney CF, Gordish-Dressman H, Guerron AD, Sali A, Pandey GS, et al. (2009) Preclinical drug trials in the mdx mouse: assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve 39: 591–602. Find this article online 2. Raben N, Nagaraju K, Lee E, Plotz P (2000) Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene. Neuromuscul Disord 10: 283–291. doi: 10.1016/j.nbd.2005.02.010. Find this article online 3. Nagaraju K, Casciola-Rosen L, Rosen A, Thompson C, Loeffler L, et al. (2000) The inhibition of apoptosis in myositis and in normal muscle cells. J Immunol 164: 5459–5465. doi: 10.1096/fj.04-1859fje. Find this article online 4. Spurney CF, Knoblach S, Pistilli EE, Nagaraju K, Martin GR, et al. (2008) Dystrophin-deficient cardiomyopathy in mouse: Expression of Nox4 and Lox are associated with fibrosis and altered functional parameters in the heart. Neuromuscul Disord 18: 371–381. doi: 10.1016/j.nmd.2008.03.008. Find this article online 5. Lamason RL, Mohideen MA, Mest JR, Wong AC, Norton HL, et al. (2005) SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science 310: 1782–1786. Find this article online 6. Candido EP, Reeves R, Davie JR (1978) Sodium butyrate inhibits histone deacetylation in cultured cells. Cell 14: 105– 113. doi: 10.1371/journal.pone.0002309. Find this article online 7. Kumar-Singh R, Chamberlain JS (1996) Encapsidated adenovirus minichromosomes allow delivery and expression of a 14 kb dystrophin cDNA to muscle cells. Hum Mol Genet 5: 913–921. doi: 10.1016/S0960-8966(02)00100-1. Find this article online 8. Anderson JE, Weber M, Vargas C (2000) Deflazacort increases laminin expression and myogenic repair, and induces early persistent functional gain in mdx mouse muscular dystrophy. Cell Transplant 9: 551–564. doi: 10.1002/(SICI)10974598(199612)19:12<1576::AID-MUS7>3.0.CO;2-7. Find this article online 9. Anderson JE, McIntosh LM, Poettcker R (1996) Deflazacort but not prednisone improves both muscle repair and fiber growth in diaphragm and limb muscle in vivo in the mdx dystrophic mouse. Muscle Nerve 19: 1576–1585. doi: 10.1002/mus.20425. Find this article online 10. Hudecki MS, Pollina CM, Granchelli JA, Daly MK, Byrnes T, et al. (1993) Strength and endurance in the therapeutic evaluation of prednisolone-treated MDX mice. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 79: 45–60. doi: 10.1038/nrd1085. Find this article online 11. Granchelli JA, Pollina C, Hudecki MS (2000) Pre-clinical screening of drugs using the mdx mouse. Neuromuscul Disord 10: 235–239. Find this article online 12. Granchelli JA, Avosso DL, Hudecki MS, Pollina C (1996) Cromolyn increases strength in exercised mdx mice. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 91: 287–296. Find this article online 13. De Luca A, Pierno S, Liantonio A, Cetrone M, Camerino C, et al. (2003) Enhanced dystrophic progression in mdx mice by exercise and beneficial effects of taurine and insulin-like growth factor-1. J Pharmacol Exp Ther 304: 453–463. doi: 10.2353/ajpath.2008.071009. Find this article online 14. Hartel JV, Granchelli JA, Hudecki MS, Pollina CM, Gosselin LE (2001) Impact of prednisone on TGF-beta1 and collagen in diaphragm muscle from mdx mice. Muscle Nerve 24: 428–432. doi: 10.1016/S0960-8966(99)00117-0. Find this article online 15. Connolly AM, Schierbecker J, Renna R, Florence J (2002) High dose weekly oral prednisone improves strength in boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 12: 917–925. doi: 10.1016/S0960-8966(99)00126-1. Find this article online 16. Keeling RM, Golumbek PT, Streif EM, Connolly AM (2007) Weekly oral prednisolone improves survival and strength in male mdx mice. Muscle Nerve 35: 43–48. Find this article online 17. Yang L, Luo J, Petrof BJ (1998) Corticosteroid therapy does not alter the threshold for contraction-induced injury in dystrophic (mdx) mouse diaphragm. Muscle Nerve 21: 394–397. Find this article online 18. De Luca A, Pierno S, Liantonio A, Conte Camerino D (2002) Pre-clinical trials in Duchenne dystrophy: what animal models can tell us about potential drug effectiveness. Neuromuscul Disord 12: Suppl 1S142–146. doi: 10.1016/j.febslet.2004.12.081. Find this article online 19. Sweat F, Puchtler H, Rosenthal SI (1964) Sirius Red F3ba as a Stain for Connective Tissue. Arch Pathol 78: 69–72. doi: 10.1093/hmg/5.7.913. Find this article online 20. Hoey AJ, Erp CV (2006) Effect of L-arginine on cardiac function and fibrosis in mdx mice. Proceedings of the Australian Physiological Society 37: 57. doi: 10.1002/1097-4598(200103)24:3<428::AID-MUS1018>3.3.CO;2-5. Find this article online 21. Hnia K, Gayraud J, Hugon G, Ramonatxo M, De La Porte S, et al. (2008) L-arginine decreases inflammation and modulates the nuclear factor-kappaB/matrix metalloproteinase cascade in mdx muscle fibers. Am J Pathol 172: 1509– 1519. Find this article online 22. Reyes AA, Karl IE, Klahr S (1994) Role of arginine in health and in renal disease. Am J Physiol 267: F331–346. doi: 10.1002/(SICI)1097-4598(199803)21:3<394::AID-MUS14>3.0.CO;2-#. Find this article online 23. Morrissey JJ, Ishidoya S, McCracken R, Klahr S (1996) Nitric oxide generation ameliorates the tubulointerstitial fibrosis of obstructive nephropathy. J Am Soc Nephrol 7: 2202–2212. doi: 10.1016/0092-8674(78)90305-7. Find this article online 24. Archer JD, Vargas CC, Anderson JE (2006) Persistent and improved functional gain in mdx dystrophic mice after treatment with L-arginine and deflazacort. Faseb J 20: 738–740. doi: 10.1016/S0960-8966(02)00180-3. Find this article online 25. Voisin V, Sebrie C, Matecki S, Yu H, Gillet B, et al. (2005) L-arginine improves dystrophic phenotype in mdx mice. Neurobiol Dis 20: 123–130. doi: 10.1126/science.1116238. Find this article online 26. Chazalette D, Hnia K, Rivier F, Hugon G, Mornet D (2005) alpha7B integrin changes in mdx mouse muscles after Larginine administration. FEBS Lett 579: 1079–1084. doi: 10.1096/fj.05-4821fje. Find this article online 27. Barton ER, Morris L, Kawana M, Bish LT, Toursel T (2005) Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function. Muscle Nerve 32: 751–760. Find this article online 28. St-Pierre SJ, Chakkalakal JV, Kolodziejczyk SM, Knudson JC, Jasmin BJ, et al. (2004) Glucocorticoid treatment alleviates dystrophic myofiber pathology by activation of the calcineurin/NF-AT pathway. Faseb J 18: 1937–1939. doi: 10.1124/jpet.102.041343. Find this article online 29. Miura P, Andrews M, Holcik M, Jasmin BJ (2008) IRES-mediated translation of utrophin A is enhanced by glucocorticoid treatment in skeletal muscle cells. PLoS ONE 3: e2309. doi: 10.1002/mus.20646. Find this article online 30. Khurana TS, Davies KE (2003) Pharmacological strategies for muscular dystrophy. Nat Rev Drug Discov 2: 379–390. doi: 10.1002/mus.21211. Find this article online Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org Оригинал статьи: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0011220