C. albicans - Институт медико

advertisement
На правах рукописи
ЛУКОВА ОЛЬГА АЛЕКСЕЕВНА
ФАКТОРЫ И УСЛОВИЯ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ
АКТИВНОСТЬ БУККАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ И ИХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С CANDIDA ALBICANS
03.03.01 – физиология
03.02.03 – микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2015
2
Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии Государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования
«Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор
Заславская Майя Исааковна
Официальные оппоненты:
доктор
медицинских
наук,
профессор,
заведующий отделом санитарно-гигиенической
безопасности человека в искусственной среде
обитания
Федерального
государственного
бюджетного
учреждения
науки
Государственного научного центра Российской
Федерации – Института медико-биологических
проблем Российской академии наук
кандидат биологических наук, доцент кафедры
физиологии медико-биологического факультета
Государственного бюджетного образовательного
учреждения
высшего
профессионального
образования
«Российский
национальный
исследовательский медицинский университет
имени
Н.И.
Пирогова»
Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Ильин Вячеслав Константинович
Бакаева Занда Валерьевна
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт
экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ"), 197376 Санкт-Петербург, ул. Акад.
Павлова,12.
Защита диссертации состоится «____ »_____________ 2015 года в___ часов на
заседании диссертационного совета Д 002.111.01, созданного на базе Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра
Российской Федерации – Института медико-биологических проблем Российской академии
наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного
бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации –
Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу (123007, г.
Москва, Хорошевское шоссе д.76а).
Автореферат разослан «_____» _______________ 2015 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологический наук
М. А. Левинских
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ
Актуальность проблемы
В настоящее время большое внимание уделяется поиску простых и
неинвазивных методов выявления патологических изменений в организме
человека. Одним из таких перспективных направлений является исследование
функционального состояния эпителиоцитов слизистых оболочек, которое
может служить источником важной диагностической и прогностической
информации (Маянский А.Н. и соавт. 2004; Полякова В.О. и соавт., 2015).
Функциональная активность мукозальных клеток находит отражение в
процессах клеточной дифференцировки, синтезе различных молекул,
экспрессии рецепторов и отражает состояние местного и общего гомеостаза
организма человека, а также его нарушения при патологии и старении
(Маянский А.Н и соавт., 2004; Пальцев М.А. и соавт., 2012; Полякова В.О. и
соавт., 2015). Изменение функционального состояния эпителиоцитов является
следствием различных воздействий на рецепторный аппарат клетки. Так,
благодаря способности экспрессировать toll-подобные рецепторы (TLRs),
эпителиальные клетки могут обнаруживать типовые молекулярные
последовательности-паттерны (PAMPs) микробного или иного происхождения,
не свойственные тканям человека (Полторак, А.Н., 2014; Brightbill H., Modlin R.
2000; Akira S., Hemmi H., 2003; Takeda K., Akira S., 2005; Naglik, J.R., Moyes D.,
2011; McClure R., Massari P., 2014). TLRs являются мощными активаторами
внутриклеточных сигнальных путей, таких как система нуклеарного фактора kB
и МАР-киназ, которые способствуют синтезу функционально активных
молекул (цитокины, молекулы межклеточной адгезии, рецепторы, белки острой
фазы, ферменты, молекулы главного комплекса гистосовместимости и др.)
мукозальными клетками (Маянский А.Н. и соавт., 2007; Baldwin A.S.Jr., 1996;
Barnes P.J. et al., 1997; Andreakos E. et al., 2005; Hayden M. S., Ghosh S., 2011).
Через продукцию данных медиаторов, эпителиоциты слизистых оболочек
активно вовлекаются в воспалительные и иммунные реакции, транслируя
сигналы лимфоцитам, макрофагам и дендритным клетками, присутствующим в
lamina propria (Топтыгина А.П., Афанасьев С.С., 2009).
Для оценки функциональной активности эпителиоцитов слизистых
оболочек в настоящее время используют различные методы, основанные на
изучении их морфологии, выявлении клеточных маркеров и рецепторов
(иммуногистохимия), продукции цитокинов, медиаторов, определении
содержания ДНК (микроспектрофотометрия), а также уровня естественной
колонизации нормальной микрофлорой (Банченко Г.В. и соавт. 1997; Быков
В.Л.,1997; Абаджиди М.А. и соавт., 2003; Авдалян А.М. и соавт., 2003; Махрова
Т.В., и соавт., 2004; Маянский А.Н. и соавт., 2005; Бочкарева О.П. и соавт.,
2013; Полякова В.О. и соавт., 2015; Steele С., Fidel P.L., 2002). В то же время,
функционирование рецепторного аппарата эпителиоцитов и его реактивность,
т. е. способность отвечать на стимулы - изучены недостаточно. Также не в
полной мере определен спектр экзогенных и эндогенных факторов, способных
4
регулировать экспрессию рецепторов эпителиальных клеток, в частности,
обеспечивающих адгезивные контакты с микроорганизмами.
В настоящей работе были использованы новые методические подходы
для оценки функционального статуса клеток слизистых оболочек, основанные
на изучении функционирования их рецепторного аппарата. Реактивность
рецепторов эпителиоцитов оценивалась по экспрессии TLRs, а также по
способности клеток к адгезивным взаимодействиям с тест-культурой Сandida
albicans в процессе искусственной колонизации in vitro.
Целью работы является исследование функциональной активности
рецепторного аппарата буккальных эпителиоцитов под влиянием различных
факторов и условий, а также при взаимодействии с C. albicans и микробиотой
полости рта.
Задачи исследования:
1. Определить влияние эндогенных и экзогенных факторов: половых гормонов,
цитокинов, иммуномодуляторов, антисептиков и микробных метаболитов на функциональную активность рецепторного аппарата эпителиоцитов
слизистых оболочек при адгезивных контактах с C. albicans.
2. Проанализировать взаимоотношение систем нуклеарного фактора kB и
митоген-активированных киназ с активностью рецепторного аппарата
буккальных эпителиоцитов при адгезивных взаимодействиях с C. albicans.
3. Оценить экспрессию TLR-2 и TLR-4 буккальными эпителиоцитами под
влиянием эндогенных и экзогенных факторов, а также, при хроническом
пародонтите.
4. Сравнить уровень естественной колонизации буккального эпителия у
пациентов с заболеваниями различного генеза до и после терапии с
использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.
Научная новизна
Впервые получены данные об изменении адгезивных свойств буккальных
эпителиоцитов под действием эндогенных и экзогенных факторов: половых
гормонов, цитокинов, иммуномодуляторов и антисептиков в системах с
C. albicans in vitro.
Получены новые сведения о значении нуклеарного фактора kB для
реализации контактных взаимодействий буккальных эпителиоцитов с
С. albicans.
Впервые определен уровень экспрессии TLR-2 и TLR-4 на буккальных
эпителиоцитах в норме и при пародонтите методом проточной
цитофлюориметрии, а также выявлены субпопуляционные изменения среди
TLR-2- и TLR-4-позитивных клеток под влиянием эндогенных и экзогенных
факторов.
Впервые изучена динамика изменения уровня естественной колонизации
буккальных эпителиоцитов у пациентов на фоне применения комплексной
терапии с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.
5
Теоретическая и практическая значимость
Подтверждена
высокая
чувствительность
и
информативность
экспериментальной модели «адгезия C. albicans на эпителиоцитах слизистых
оболочек in vitro» для оценки реактивности рецепторного аппарата
эпителиальных клеток в ответ на различные стимулы.
Показано, что эпителиоциты разных биотопов – буккальные и
вагинальные клетки – однотипно меняют адгезивную активность в отношении
кандид под действием половых гормонов in vitro.
Разработан способ изучения функциональной активности и реактивности
буккальных эпителиоцитов по оценке экспрессии toll-подобных рецепторов
методом проточной цитофлюориметрии.
На основе метода исследования естественной колонизации буккального
эпителия разработан алгоритм оценки эффективности применения
иммуномодуляторов и оральных антисептиков в комплексном лечении
хронических патологий.
Внедрение результатов работы
Разработанные методы и алгоритмы используются в лабораторнодиагностической и научно-исследовательской работе Нижегородского филиала
ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии»
Минздрава РФ и стоматологической поликлинике ГОУ ВПО НижГМА
Минздрава РФ (г. Нижний Новгород).
Положения, выносимые на защиту
Гормоны, участвующие в обеспечении овуляции и поддержании
состояния беременности (лютеинизирующий гормон, прогестерон) усиливают
адгезивность эпителиоцитов слизистых оболочек в отношении C. albicans in
vitro. Обработка эпителиоцитов иммуномодуляторами и оральными
антисептиками in vitro снижает способность буккальных клеток адгезировать
C. albicans.
Кандида-зависимая активация нуклеарного фактора kB в буккальных
клетках
усиливает
контактное
взаимодействие
эпителиоцитов
с
C. albicans.
Экспрессия TLR-2 и TLR-4 на буккальных эпителиоцитах способна
регулироваться микробными метаболитами и иммуномодуляторами, а также
меняется при хроническом пародонтите.
Анализ изменения уровня естественной колонизации буккального
эпителия может применяться в оценке эффективности терапевтических
мероприятий с использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков
у пациентов разных возрастных групп с хроническими патологиями
(онихомикоз, микробная экзема, респираторные заболевания).
6
Апробация материалов диссертации
Диссертация апробировалась на расширенном заседании кафедры
микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава РФ
(г. Нижний Новгород) 20 февраля 2015 г; протокол № 8.
Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на: XI,
XII, XVI научно-практических конференциях по медицинской микологии
(Санкт-Петербург; 2008, 2009, 2013), 2-ом съезде Микологов России (Москва,
2008), Х международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии,
иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), 2-ом Международном
конгрессе по пробиотикам (Санкт-Петербург, 2009), XVII Российском
национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), всероссийской
научно-практической конференции, посвященной 95-летию ФБУН ННИИЭМ
им. академика И.Н. Блохиной (Нижний Новгород, 2014), на III СанктПетербургском международном экологическом форуме «Инфекция и
иммунитет» (Санкт-Петербург, 2014).
Публикации
По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 3 –
в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит
из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
главы собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы.
Диссертация
иллюстрирована
27
таблицами
и
39
рисунками.
Библиографический указатель включает 185 источников литературы, в том
числе 118 отечественных и 67 зарубежных авторов.
Вклад автора
Диссертация представляет собой обобщение результатов, полученных
автором лично. Эксперименты на проточном цитофлюориметре выполнялись
совместно с к.б.н. Кропотовым В.С. на базе ФГУ "Нижегородский НИИ
детской гастроэнтерологии" Минздрава РФ. Оценка ряда лабораторных
показателей у больных с микробной экземой и онихомикозом проводилась
совместно
с
врачами
ФГБУ
«Государственный
научный
центр
дерматовенерологии и косметологии» Минздрава РФ (Пышкина Е.И., к.м.н.
Шебашова Н.В., к.м.н. Мишина Ю.В.). Работы по изучению уровня
колонизационной резистентности полости рта у часто болеющих и здоровых
детей проводились совместно с проф., д.м.н. Якубовой И.Ш., к.м.н. Поляшовой
А.С. (на базе кафедры гигиены ГБОУ НижГМА Минздрава РФ).
Буккальный эпителий от больных пародонтитом был предоставлен зав.
стоматологической поликлиникой ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава РФ, к.м.н.
Китаевой Е.В.
7
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалы и методы исследования
В работе было исследовано свыше 1800 препаратов эпителиоцитов
(буккальных и вагинальных) человека. Проведено 54 серии экспериментов с
искусственной колонизацией кандид на эпителиоцитах. Естественная
колонизация буккальных эпителиоцитов исследована у пациентов с
онихомикозом (53 взрослых и 23 детей), у 52 больных микробной экземой, у
часто болеющих детей (21 человек), а также у 57 здоровых доноров. Проведено
свыше 200 анализов сыворотки 78 пациентов методом иммуноферментного
анализа. Выполнено 17 серий экспериментов с использованием проточного
цитофлюориметра BD FACS Canto II System with Fluidics Cart (6-color, blue/red,
USA).
Буккальные эпителиоциты получали от доноров (мужчин и женщин 2138 лет, а также детей и подростков 2-14 лет), утром, натощак, с внутренней
поверхности щеки, дважды отмывали (40g, 5 мин) забуференным
физиологическим раствором (ЗФР), готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл.
Клетки вагинального эпителия получали от женщин 25-36 лет (на базе
женской консультации №1, г. Нижний Новгород), готовили суспензию клеток в
ЗФР в концентрации 106 кл/мл.
В работе использовали штаммы Candida аlbicans 601, Candida krusei
583, Candida glabrata 441, Staphylococcus aureus 5983, Enterococcus faecium
179/2, Escherichia coli 205 (lact+) из коллекций кафедры микробиологии и
иммунологии ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская
академия» Минздрава РФ. Культуру C. albicans получали в дрожжевой фазе на
агаре Сабуро (HiMedia, Индия) (24 ч, 37С). Посевы смывали, отмывали
десятикратным объемом ЗФР и ресуспендировали в концентрации 107 кл/мл.
Концентрацию клеток определяли с помощью денситометра DEN-1 (ООО
«Biosan», Латвия).
Для получения микробных метаболитов кандиды выращивали на
жидкой среде Сабуро (ННПЦ ГИП, Оболенск), бактерии – на бульоне TSB
(Becton, Dickenson & Co, France, USA) (24ч, 37С). Супернатанты отделяли от
микробных клеток центрифугированием (2000g, 15мин) пропускали через
стерильные бактериальные фильтры (диаметр пор 20 мкм; Corning, Germany).
Влияние эндогенных и экзогенных факторов на адгезивность
эпителиальных клеток слизистых оболочек проводили с помощью
экспериментальной модели «искусственная колонизация C.albicans
на
эпителиоцитах in vitro», разработанной ранее в нашей лаборатории (Махрова
Т.В. и соавт., 2004). Эпителиоциты подвергали влиянию различных факторов:
гормоны, цитокины, иммуномодулирующие и антисептические препараты, а
также микробные метаболиты (табл.1). Эпителиальные клетки (буккальные или
вагинальные) и активные субстанции смешивали в равных объемах (по 0,5 мл),
инкубировали 30 мин при 37С. В контрольных пробах вместо исследуемых
факторов использовали ЗФР или среду для культивирования микроорганизмов.
Контролем служили интактные эпителиоциты. На следующем этапе равные
8
объемы (по 0,5 мл) взвеси эпителиоцитов и C.albicans 601 совместно
инкубировали (30 мин, 37°С) в ЗФР, встряхивая каждые 5 мин. Эпителиоциты
отмывали ЗФР от не прикрепившихся кандид (40g, 5 мин). Из осадка клеток
готовили мазки, которые фиксировали метанолом и окрашивали 0,25%
раствором азура А (“Sigma”, USA). Определяли индекс искусственной
колонизации, т.е. среднее количество адгезированных кандид в пересчете на
один эпителиоцит (микроскопировали 100 клеток). Каждая серия включала
эксперименты с эпителиоцитами не менее 5 доноров.
Таблица 1
Факторы, используемые для воздействия на эпителиальные клетки in vitro
Группы
Экзогенные и эндогенные факторы
Гормоны
Растворы гормонов в ЗФР: эстрадиол - 450 пмоль/л,
прогестерон - 50 нмоль/л, ХГЧ - 500 МЕ/л, эстриол - 15 нг/мл,
ЛГ- 100мМЕ/мл, ФСГ - 50 мМЕ/мл, тестостерон – 1,71 нмоль/л
(«Sigma», USA)
Растворы цитокинов в ЗФР: IL-1 (10– 12 г/мл); IL-6 (10– 12 г/мл),
IL-8 (10– 12г/мл); TNFα (10– 9г/мл), INFα (10– 9 г/мл) («Sigma»,
USA)
Метаболиты C. albicans 601, C. krusei 583, C. glabrata 441
S. aureus 5983, E. faecium 179/2 , E. coli 205 (lact+)
Ликопид® (1мг/мл; ЗАО «Пептек», Россия); Рибомунил®
(0,15 мг/мл; Пьер Фабр Медикамент Продакшн», Франция);
Полиоксидоний® (6мг/мл; ООО «НПО Петровакс Фарм»,
Россия); Иммунал® (8мг/мл; Лек, Словения); Деринат® (0,25%
раствор; ЗАО ФП «Техномедсервис», Россия), Имудон®
(5мг/мл; ОАО «Фармстандарт-Томскхимфарм», Россия);
Гриппферон® (3000МЕ; ЗАО «Фирн М», Россия)
Ксидифон® (2% водный раствор; ФГУП «Мосхимфармпрепараты», Россия), Лизобакт® (таблетки сублингвальные;
1мг/мл лизоцима, АО «Босналек», Босния и Герцеговина),
Лизоцим (таблетки сублингвальные, 7мг/таб.; «Биофит»,
Россия)
Цитокины
Микроорганизмы
Иммуномодулирующие
препараты
Антисептические
средства
Уровень экспрессии toll-подобных рецепторов на буккальных
эпителиоцитах и жизнеспособность клеток определяли методом проточной
цитофлюориметрии. Эпителиальные клетки, ресуспендировали, пропускали
через фильтры CellTricks (диаметр пор 100 мкм), затем инкубировали с
исследуемыми субстанциями (гормоны, цитокины, иммуномодулирующие
препараты, антисептики, микробные метаболиты) (30 мин, 37°С) (табл.1).
Контролем служили интактные эпителиоциты. Затем, к эпителиальным клеткам
(100 мкл) добавляли 10 мкл коктейля (смеси) антител для идентификации TLR2 (CD282) (5мкл) и TLR-4 (CD284) (5мкл) (BD Pharmingen, USA), выдерживали
в течение 15 минут. Оценивали экспрессию toll–подобных рецепторов на
9
проточном цитофлюориметре BD FACS Canto II System with Fluidics Cart (6color, blue/red, USA). Полученные результаты выражали в процентах как
отношение числа клеток, презентирующих на своей поверхности TLR-2 или
TLR-4 к общему числу клеток в популяции. В каждой серии экспериментов
использовали пул буккальных эпителиоцитов, полученных от 5-6 здоровых
доноров. В ряде экспериментов использовали эпителиоциты, полученные от
больных пародонтитом. Эксперименты каждой серии ставили в трех повторах.
При определении жизнеспособности, к 100 мкл буккальных
эпителиоцитов добавляли 20 мкл 7-AAD (BD Pharmingen, USA) и инкубировали
15 минут. Клетки с поврежденными мембранами (мертвые) способны
окрашиваться 7-AAD в отличие от живых (Сырцова М.А.и соавт., 2014). В
контрольный образец краситель не добавляли, с целью определения
спонтанного окрашивания.
Оценку естественной колонизации у пациентов, получавших
иммуномодулирующие и антисептические препараты, проводили путем
подсчёта общего количества бактериальных клеток, адгезированных на
эпителиоцитах. Из суспензии буккальных эпителиоцитов готовили мазки,
фиксировали метанолом (10 мин), окрашивали 0,25% водным раствором азура
А (“Sigma”, USA). Индекс естественной колонизации оценивали по числу
бактериальных клеток в пересчёте на один эпителиоцит (бакт/эп). Учитывали
средний результат после подсчета 100 эпителиоцитов.
Блокаду NF-kB и внутриклеточных MAP-киназ ERK1/2 и p38 в
буккальных эпителиоцитах проводили путем инкубации клеток с
соответствующими ингибиторами. Для подавления активации NF-kB
использовали ингибитор протеасом – ALLN, в качестве специфического
ингибитора ERK1/2 применяли U0126, для блокады p38 MAP-киназы SB203580 («Sigma», USA). Эпителиоциты (106 кл/мл) инкубировали с ALLN
(100 мкл, 90 мин, 37°С) или ингибиторами MAP-киназ (20 M, 1ч, 37°С). В
контроле использовали интактные клетки (без добавления ингибитора).
Определение уровня сывороточных молекул IgE, IgG и sICAM-1 у
пациентов проводили методом ИФА на спектрофотометре BIO-RAD-480
(USA). Кровь из локтевой вены отбирали утром натощак в объеме 5 мл,
получали сыворотку путем центрифугирования (1000g, 20 мин, 4°С). Для
определения уровня иммуноглобулинов и sICAM-1 использовали коммерческие
тест-системы ЗАО «Вектор Бест» (Россия) и Bender MedSystems (Австрия).
Статистическую обработку осуществляли по общепринятой методике с
использованием компьютерных программ Excel и Stadia. Данные представляли
в виде группового среднего арифметического (М) и стандартной ошибки
среднего (SEM). В качестве параметрического критерия использовали критерий
Стьюдента, в качестве непараметрического - критерий Вилкоксона - Манна Уитни. Различия между выборками считали достоверными при уровне
значимости р<0,05. Взаимосвязь параметров оценивалась методом
корреляционного анализа: вычисляли коэффициент ранговой корреляции
Спирмена (rs). Силу корреляционной связи определяли по значению rs: ниже 0,3
считали слабой, от 0,3 до 0,7 – средней и от 0,7 до 1,0- сильной.
10
Результаты собственных исследований
В работе оценивали функциональную активность эпителиоцитов по
способности клеток к адгезивным взаимодействиям с микробной тесткультурой (искусственная колонизация Сandida albicans in vitro), оральной
микрофлорой (естественная колонизация), а также по уровню экспрессии tollподобных рецепторов под воздействием различных факторов и при
патологических процессах.
Влияние эндогенных и экзогенных факторов на адгезивность
эпителиоцитов в экспериментальных системах с C. albicans in vitro
Гормональные изменения, регулярно происходящие в организме
женщины, влияют на функциональную активность эпителиоцитов (Coleman H.,
et al., 2001; Beagley K. еt al., 2003). Было проведено сравнение действия
гормонов, регулирующих менструальный цикл и репродуктивную активность у
женщин: ЛГ, прогестерон, ФСГ, эстрадиол, эстриол, тестостерон, ХГЧ - на
возможность эпителиоцитов слизистых оболочек (буккальных, вагинальных)
вступать в адгезивные контакты с C.albicans in vitro (табл.2).
Таблица 2
Влияние гормонов на адгезивные взаимодействия буккальных и вагинальных
клеток с C. albicans при разных режимах обработки эпителиоцитов, М ± m
Гормоны
ЛГ
Прогестерон
ФСГ
Эстрадиол
Эстриол
Тестостерон
ХГЧ
Кратность изменения индекса искусственной колонизации
эпителиоцитов (количество раз)
Обработка
Обработка
Обработка
гормонами
гормонами
гормонами
буккальных
буккальных
вагинальных
эпителиоцитов
эпителиоцитов
эпителиоцитов
до контакта
в процессе контакта до контакта
с C. albicans
с C. albicans
с C. albicans
1,31 ± 0,1 * ↑
2,59 ± 0,1 * /** ↑
1,28 ± 0,1 *
↑
1,26 ± 0,2 * ↑
1,34 ± 0,1 *
↑
1,17 ± 0,1
↑
0,90 ± 0,2
1,40 ± 0,1
1,11 ± 0,3
1,29 ± 0,2 * ↓
1,60 ± 0,2 * ↓
1,25 ± 0,2 * ↓
1,40 ± 0,3 * ↓
1,36 ± 0,3 * ↓
1,61 ± 0,3 * ↓
1,29 ± 0,3 * ↓
1,80 ± 0,2 * ↓
1,27 ± 0,2 * ↓
1,42 ± 0,2 * ↓
1,60 ± 0,3 * ↓
1,38 ± 0,3 * ↓
* - достоверность отличий относительно необработанных эпителиоцитов (контроль)
(р < 0,05)
** - достоверность отличий эпителиоцитов, обработанных гормонами во время
контакта с C. albicans, относительно клеток, прединкубированных с гормонами
до контакта с кандидами (р < 0,05)
↑ - увеличение, ↓ - снижение показателя
11
Эксперименты показали, что контакт буккальных клеток с эстрадиолом,
эстриолом, тестостероном и ХГЧ снижал способность эпителиоцитов к
взаимодействию с кандидами в 1,29 ± 0,2; 1,40 ± 0,3; 1,29 ± 0,3; 1,42 ± 0,2 раза
соответственно (р<0,05). Напротив, обработка эпителиоцитов прогестероном и
ЛГ усиливала способность буккальных клеток адгезировать C.albicans в 1,26 ±
0,2; в 1,31 ± 0,1 раз (р<0,05). Обработка эпителиоцитов ФСГ не приводила к
изменению адгезивности клеток (р<0,05) (см. табл.2). Можно предположить,
что высокий уровень прогестерона, характерный для беременных, обеспечивает
повышенную готовность мукозальных эпителиоцитов к адгезивным
взаимодействиям с кандидами. Это хорошо согласуется с исследованиями,
указывающими на увеличении частоты вагинального кандидоза среди
беременных женщин (Лебедева О.П. и соавт. 2006).
Эксперименты с вагинальными эпителиоцитами показали прямую
сильную корреляцию - от 0,71 до 0,83 изменений адгезивности буккальных и
вагинальных эпителиоцитах под влиянием гормонов (см. табл.2). Отсутствие
различий в способности к контактным взаимодействиям с кандидами у
эпителиоцитов разных биотопов позволило сделать вывод об однотипной
реактивности мукозальных клеток. В связи с этим, последующие эксперименты
выполняли только с буккальными эпителиоцитами.
В ряде экспериментов наблюдали усиления эффекта от гормонов, если
последние были добавлены во время контакта эпителиоцитов с кандидами (см.
табл.2). Это может означать, что контакт с микроорганизмом повышает
чувствительность эпителиальных клеток к данным воздействиям.
Оценивали влияние цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-α на
способность буккальных эпителиоцитов адгезировать кандиды. IL-1, IL-6, IL-8
и TNF-α относятся к цитокинам, запускающим и поддерживающим
воспалительную реакцию (Хаитов Р.М., и соавт., 2009), тогда как IFN-α
обладает противовирусной противоопухолевой и иммунорегуляторной
активностью (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008) (табл.3).
Прединкубация эпителиальных клеток с IFN-α приводила к снижению
адгезии в системе в 2,1 ± 0,3 раз (p<0,05). В то же время, обработка
эпителиоцитов IL-1, TNFα, IL-6, IL-8 повышала адгезию C.albicans на
буккальных клетках в 1,3 ± 0,1; 2,0 ± 0,2; 1,2± 0,1; 1,8 ± 0,5 раз соответственно
по сравнению с контролем (p<0,05). Добавление провоспалительных цитокинов
(IL-1, IL-6, IL-8, TNFα) в ходе взаимодействия эпителиоцитов и кандид также
приводило к увеличению индекса искусственной колонизации в 1,2-2,0 раза
(см. табл.3). Таким образом, можно предположить, что патологические
процессы на уровне слизистых оболочек, сопровождаемые синтезом большого
количества провоспалительных цитокинов (Серебренникова С.Н., 2008),
увеличивают восприимчивость эпителиальных клеток к микроорганизмам,
таким как кандиды.
Было установлено, что прединкубация буккальных клеток с
иммуномодулирующими препаратами и антисептиками, применяемыми для
обработки слизистых оболочек, приводила к снижению адгезивности
эпителиоцитов в отношении кандид в 1,2 - 2,1 раза (p<0,05) (табл.4). Во всех
12
случаях, за исключением экспериментов с препаратом «Ликопид», эти
изменения
носили
выраженный
характер
(p<0,05).
Аналогично
иммуномодулирующие препараты и антисептики действовали и на процесс
взаимодействия буккальных эпителиоцитов с кандидами (см. табл.4), снижая
восприимчивость эпителиоцитов к микроорганизмам.
Таблица 3
Влияние цитокинов на адгезивные взаимодействия буккальных клеток
с C. albicans при разных режимах обработки эпителиоцитов, М ± m
Цитокины
IL-1
IL-6
IL-8
TNF-α
IFN-α
Кратность изменения индекса искусственной колонизации
буккальных эпителиоцитов (количество раз)
Обработка цитокинами
Обработка цитокинами
эпителиоцитов до контакта
эпителиоцитов в процессе
с C. albicans (контроль)
контакта с C. albicans
1,3 ± 0,1 *
1,5 ± 0,1 *
↑
↑
1,2 ± 0,1 *
1,2 ± 0,15
↑
↑
1,8 ± 0,5 *
1,8 ± 0,7
↑
↑
2,0 ± 0,2 *
1,9 ± 0,2 *
↑
↑
2,1 ± 0,3 *
2,0 ± 0,8 *
↓
↓
* – достоверность отличий относительно контроля (р< 0,05)
↑ - увеличение, ↓ -снижение показателя
Таблица 4
Влияние иммуномодулирующих и антисептических препаратов на адгезивные
взаимодействия буккальных клеток с C. albicans при разных режимах
обработки эпителиоцитов, М ± m
Препараты
Кратность изменения индекса искусственной колонизации
буккальных эпителиоцитов (количество раз)
Обработка препаратами
Обработка препаратами
эпителиоцитов до контакта с эпителиоцитов в процессе
C. albicans (контроль)
контакта с C. albicans
Иммуномодуляторы
Рибомунил
1,7 ± 0,5 *
2,1 ± 0,3 *
↓
↓
Имудон
2,1 ± 0,7 *
1,9 ± 0,5 *
↓
↓
Иммунал
1,6 ± 0,4 *
1,7 ± 0,9 *
↓
↓
Деринат
1,6 ± 0,4 *
1,5 ± 0,3 *
↓
↓
Ликопид
1,2 ± 0,2
≈
1,2 ± 0,3
≈
Полиоксидоний 1,7 ± 0,4 *
1,6 ± 0,8 *
↓
↓
Гриппферон
1,8 ± 0,6 *
2,0 ± 0,8 *
↓
↓
Антисептические препараты
Ксидифон
1,4 ± 0,2 *
1,5 ± 0,3 *
↓
↓
Лизобакт
1,4 ± 0,3 *
1,3 ± 0,1 *
↓
↓
* – статистически значимые отличия относительно контроля (р< 0,05)
↑ - увеличение, ↓ - снижение показателя
13
*
Рис.1. Влияние микробных метаболитов C. albicans 601, E. faecium 179/2,
S.aureus 5983 и E.coli 205 на рецепторную активность буккальных
эпителиоцитов при взаимодействии с кандидами.
* - достоверность отличий относительно контроля (р < 0,05)
Были проведены эксперименты с микробными метаболитами
(супернатантами, полученными в ходе культивирования микроорганизмов в
жидкой среде) C. albicans 601, E. faecium 179/2, S.aureus 5983 и E.coli 205 с
целью установления их влияния на адгезивные способности эпителиоцитов.
Продукты метаболизма S.aureus, E. faecium не изменяли адгезивности
буккальных эпителиоцитов (рис. 1); действие метаболитов E.coli было
неоднозначным и варьировало, по-видимому, в зависимости от
функциональной активности клеток у разных доноров.
В то же время, продукты метаболизма C.albicans существенно (р < 0,05)
усиливали возможность контакта эпителиоцитов с кандидами (рис. 1). Эту
способность кандид можно рассматривать как еще одно из проявлений
патогенности данных микроорганизмов и их высокой адаптации к данному
биотопу.
Участие внутриклеточных сигнальных систем в регуляции адгезивности
буккальных эпителиоцитов
Исследовали взаимосвязь между активностью NF-kB и МАР-киназами и
способностью эпителиоцитов слизистых оболочек вступать в контактные
взаимодействия с микроорганизмами, такими как C. albicans.
Эксперименты показали, что блокирование NF-kB в клетках человека
приводило к существенному снижению уровня адгезии кандид на буккальных
эпителиоцитах в 1,7  0,6 раза и составляло 6,6  1,3 усл. ед. в контроле и 4,1 
0,9 усл. ед. в экспериментах с ингибитором протеасом ALLN (p 0,05). При
добавлении ингибитора p38 киназы к буккальным эпителиоцитам наблюдалось
некоторое увеличение индекса адгезии кандид: 6,24  0,64 (контроль) и 7,81 
1,03 (эксперимент) усл.ед. (р  0,05). Ингибитор ERK1/2-киназ не вызывал
14
значимых изменений адгезии в системе по сравнению с контролем: 3,89  0,65
и 3,86  0,55 усл. ед. соответственно.
Полученные данные продемонстрировали, что активность NF-kB, но не
МАР-киназ, способствует усилению рецепторной активности буккальных
клеток в отношении C. albicans.
Условия и факторы, регулирующие экспрессию TLR-2 и TLR-4 на
буккальных эпителиоцитах
Клетки человека способны обнаруживать и распознавать структуры,
общие для разных групп микроорганизмов, используя toll - подобные
рецепторы (McClure R., Massari P., 2014). В настоящей работе исследовали
экспрессию TLR-2 и TLR-4 для оценки функциональной активности и
реактивности (способности отвечать на стимулы) toll-зависимого рецепторного
аппарата буккальных клеток.
Эпителиоциты предварительно инкубировали с исследуемыми
субстанциями (гормоны, цитокины, иммуномодулирующие препараты,
антисептики, микробные метаболиты). Экспрессию TLR-2 и TLR-4 оценивали у
клеток жизнеспособного пула по наличию на их поверхности CD282 или CD284
соответственно. Полученные результаты выражали в процентах, как отношение
числа клеток, презентирующих на своей поверхности только TLR-2 или TLR-4,
одновременно оба рецептора (TLR-2/ TLR-4), или же общую фракцию TLR-2или TLR-4-позитивных клеток к общему числу живых эпителиоцитов.
Отметим, что жизнеспособность эпителиоцитов под воздействием экзогенных и
эндогенных стимулов существенно не отличалась от контроля (интактные
клетки) во всех сериях эксперимента (р > 0,05).
После
обработки
гормонами
процент
буккальных
клеток,
экспрессирующих TLR-4 менялся незначительно (р>0,05) (табл. 5). Однако мы
обратили внимание на небольшое увеличение общего процента TLR-4позитивных клеток после воздействия гормонов, играющих роль в обеспечении
овуляции (ЛГ) и беременности (прогестерон, ХГЧ). Возможно, это одна из
причин, которая приводит к изменению взаимоотношений эпителиоцитов
слизистых оболочек с представителями нормальной микрофлоры, часто
наблюдаемое у беременных (Акопян Т.Е., 1996).
Цитокины также существенно не влияли на экспрессию TLR-2 и TLR-4, за
исключением IL-6, который снижал количество клеток, экспрессирующих TLR2 и увеличивал количество TLR-4 –позитивных клеток (р< 0,05) (см. табл.5).
Процент клеток, экспрессирующих TLR-2- и TLR-4 существенно не менялся
под влиянием антисептических препаратов «Лизобакт» и «Ксидифон»,
применяемых для обработки слизистых оболочек (р> 0,05) (см. табл. 5).
Таким образом, половые гормоны, большинство исследуемых цитокинов
(за исключением IL-6) и антисептические препараты, применяемые для
обработки слизистых оболочек, не меняют функциональную активность клеток,
выраженную в способности экспрессировать TLR-2- и TLR-4.
15
Таблица 5
Субпопуляции буккальных эпителиоцитов, экспрессирующие TLR-2 и TLR- 4
до и после обработки экзогенными и эндогенными факторами in vitro, М ± m
Факторы
Процент буккальных эпителиоцитов, экспрессирующих
TLR-2 и TLR-4 в популяции (%)
только
только
TLR-2 и всего TLR-2- всего TLR-4TLR-2
TLR-4
TLR-4
позитивных позитивных
клеток
клеток
Гормоны
Контроль
0,1 ± 0,01
29,2 ± 4,3
8,8 ± 2,3
8,9± 2,25
38,0 ± 6,1
Прогестерон
0,1 ± 0,01
36,3 ± 3,1
5,6 ± 1,2
5,7± 1,22 ↓
41,9 ± 4,5
↑
Эстрадиол
0,2 ± 0,02
24,5 ± 4,2
6,5 ± 2,2
6,7± 2,25 ↓
31,0 ± 6,3 ↓
Тестостерон
0,1 ± 0,02
28,5 ± 3,5
6,1 ± 2,8
6,2± 2,84 ↓
34,1 ± 6,1 ↓
Эстриол
0,1 ± 0,01
27,5 ± 2,1
5,7 ± 2,2
5,8± 2,19 ↓
33,2 ± 4,4 ↓
ХГЧ
0,1 ± 0,01
39,8 ± 2,1*
5,7 ± 2,3
5,7± 2,35 ↓
45,5 ± 4,2
↑
ЛГ
0,1 ± 0,01
37,9 ± 5,0*
5,6 ± 1,9
5,7± 1,89 ↓
43,5 ± 6,8
↑
Цитокины
Контроль
0,1 ± 0,01
76,4 ± 3,3
1,0 ± 0,19
1,1 ± 0,20
77,4 ± 3,47
IL-1
0,1 ± 0,01
85,8 ± 4,0
0,8 ± 0,09
0,9 ± 0,10 ↓ 86,6 ± 4,07 ↑
IL-6
0,1 ± 0,02
90,7 ± 2,0
0,6 ± 0,03
0,7± 0,07* ↓ 91,3 ± 2,05 * ↑
IL-8
0,1 ± 0,01
84,8 ± 3,1
1,1 ± 0,09
1,2± 0,31 ↑ 85,9 ± 3,15 ↑
TNF-α
0,2 ± 0,03 * 80,7 ± 5,2
1,0 ± 0,02
1,2± 0,06 ↑ 81,7 ± 5,23 ↑
IFN-α
0,1 ± 0,01
76,1 ± 3,0
0,8 ± 0,09
0,9± 0,22 ↓ 76,9 ± 3,20 ↓
Иммуномодуляторы
Контроль
0,1 ± 0,01
76,2 ± 5,6
19,5 ± 2,1
19,6± 2,30
95,7 ± 7,9
Рибомунил
0,4 ± 0,03
63,2 ± 4,9* 23,9 ± 3,4
24,3± 3,43 ↑ 87,1 ± 8,5 ↓
Имудон
0,1 ± 0,01
65,4 ± 4,8* 24,1 ± 3,6
24,2±3,65 * ↑ 89,5 ± 8,2 ↓
Иммунал
7,6 ± 0,04*
1,5 ± 0,4* 38,3 ± 3,5* 45,9± 3,52 * ↑ 39,8 ± 3,8 * ↓
Деринат
1,5 ± 0,01* 30,2 ± 3,2* 34 ,1 ±2,9* 35,5± 2,94 * ↑ 64,0 ± 6,3 * ↓
Ликопид
0,1 ± 0,03
44,1 ± 4,3* 14,5 ± 2,5
14,6± 2,54 ↓ 58,6 ± 6,4 * ↓
Полиоксидоний 0,1 ± 0,02
53,5 ± 4,6*
6,8 ± 1,6*
6,9± 1,64 *↓ 60,3 ± 6,5 * ↓
Гриппферон
0,1 ± 0,01
76,1 ± 5,1
5,5 ± 1,1*
5,6± 1,15 *↓ 81,6 ± 6,4 ↓
Антисептики
Контроль
0,1 ± 0,01
80,8 ± 7,5
15,5± 0,5
15,6± 0,53
96,3 ± 7,8
Лизобакт
0,1 ± 0,01
88,3 ± 7,2
8,2± 0,6*
8,3± 0,62* ↓ 96,5 ± 8,2
Ксидифон
0,1 ± 0,01
71,5 ± 7,9
22,8± 1,5* 22,9± 1,53* ↑ 94,3 ± 9,1 ↓
Микробные метаболиты
Контроль
1,1 ± 0,3
63,35 ± 7,2 27,4 ± 2,5
28,5 ± 2,8
90,7 ± 7,6
C. albicans 601
1,4 ± 0,2
64,76 ± 8,3 32,7 ± 3,1
34,2 ± 3,3
↑ 97,5 ± 8,2
↑
C. glabrata 441
1,6 ± 0,3
63,60 ± 7,5 32,4 ± 2,7
34,0 ± 3,0
↑ 96,0 ± 7,8
↑
C. krusei 583
1,7 ± 0,3
58,58 ± 6,9 35,9 ± 3,3
37,6 ± 3,6 * ↑ 94,5 ± 7,2
↑
S. aureus 5983
2,4 ± 0,5 * 45,91 ± 6,5* 17,1 ± 2,9* 19,5 ± 3,4 * ↓ 63,3 ± 7,8 * ↓
E. faecium 179/2 0,4 ± 0,2
53,71 ± 7,1 15,2 ± 2,3* 15,6 ± 2,5 * ↓ 68,9 ± 8,5 * ↓
E. coli 205
1,1 ± 0,3
69,31 ± 9,1 18,3 ± 2,1* 19,4 ± 2,4 * ↓ 87,6 ± 8,4 ↓
* – достоверность отличий относительно контроля в группе факторов (р< 0,05)
↑ - увеличение, ↓ - снижение показателя
16
(а)
(б)
Рис.2. Процент буккальных эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-2 и TLR-4 в
популяции здоровых доноров (а) и пациентов с заболеваниями пародонта (б).
- экспрессия только TLR-2;
- только TLR-4;
- TLR-2/ TLR-4 –негативные клетки
- экспрессия TLR-2/ TLR-4.
В то же время, иммуномодуляторы разнонаправлено стимулировали
экспрессию toll-подобных рецепторов на эпителиоцитах (см. табл. 5). Так,
количество эпителиальных клеток, экспрессирующих TLR-2 под влиянием
препаратов «Иммунал» и «Деринат» значительно увеличивалось (р<0,05), тогда
как «Полиоксидоний» и «Гриппферон» вызывали заметное снижение числа
TLR-2 - позитивных клеток (р<0,05). Способность подавлять экспрессию TLR-4
отчетливо наблюдалась у препаратов «Иммунал», «Деринат», «Ликопид» и
«Полиоксидоний» (р<0,05). Отметим, что направленность изменений была
схожей у иммуномодуляторов, принадлежащих к одной группе, например, у
бактериальных препаратов («Рибомунил», «Имудон») и синтетических
/полусинтетических препаратов («Полиоксидоний», «Ликопид») (см. табл. 5).
В серии экспериментов было произведено измерение экспрессии
рецепторов на буккальных эпителиоцитах здоровых людей и пациентов с
заболеваниями пародонта. Установлено, что среди буккальных эпителиоцитов
здоровых людей общее количество TLR-4 - позитивных клеток выше, чем TLR2 - позитивных. В то же время, у пациентов с заболеваниями пародонта процент
эпителиоцитов, экспрессирующих TLR-4 снижался, а экспрессирующих TLR-2увеличивался (р<0,05) (рис. 2а,б, рис. 3а,б). Одновременно существенно
увеличивался процент клеток, способных производить оба рецептора (р<0,05).
Изменения уровня экспрессии TLR-2, а TLR-4 среди эпителиоцитов на
фоне патологического процесса в полости рта (хронический пародонтит)
позволили предположить следующее: экспрессия TLR-2 (в норме низкая)
может быть связана с уровнем возбужденности клеток, поскольку она
увеличивается при патологических состояниях. С другой стороны, экспрессия
TLR-4 (в норме высокая) снижается при заболеваниях, это указывает на то, что
17
данный признак, возможно, связан со способностью клетки отвечать на
стимулы, т.е. отражает ее реактивность. Отметим, что на снижение
реактивности клеток при пародонтите указывает также и то, что количество
TLR-2-/ TLR-4 - негативных клеток (не способных экспрессировать данные
TLRs) резко увеличивается при данной патологии (рис. 2 а, б).
Было замечено, что у больных с пародонтитом изменения процентного
соотношения TLR-2 и TLR-4-позитивных клеток после воздействия
иммуномодуляторов выражены слабее, чем у здоровых доноров (рис. 3 a,б).
Это, возможно, связано с тем, что буккальные клетки уже подверглись
воздействию со стороны эффекторов воспаления, что, возможно, повысило
уровень возбуждения (активность) пула эпителиоцитов и одновременно
снизило возможность отвечать (реактивность) на дополнительные стимулы.
С другой стороны, появления значительного числа клеток у больных
пародонтитом, экспрессирующих одновременно TLR-2 и TLR-4 (рис. 3 б) могло
сглаживать результаты воздействия иммуномодуляторов. Проанализировав
полученные данные, мы пришли к выводу, что для оценки действия
иммуномодуляторов при патологии удобнее рассматривать колебания фракций
эпителиоцитов, экспрессирующих только TLR-2 или TLR-4 (без учета фракции
TLR-2/ TLR-4), поскольку изменения в этих фракциях резче выражены (рис. 3
а, в).
Известно, что экспрессия TLR может меняться в присутствии различных
микроорганизмов (McClure R., et al., 2014). Эксперименты позволили
установить, что метаболиты всех исследуемых штаммов бактерий: S. aureus
5983, E.faecium 179/2 и E.coli 205 – подавляли клеточную экспрессию TLR-2
(см. табл. 5). Так, воздействие метаболитов S. aureus уменьшало общее
количество TLR-2-позитивных клеток в 1,46 раза (р<0,05); метаболитов
E.faecium и E.coli в 1,83 и 1,47 раз соответственно (р< 0,05). В то же время,
метаболиты кандид различных видов: C. albicans 601, C.glabrata 441, C. krusei
583 – усиливали способность эпителиоцитов к экспрессии TLR-2, причем для
экспериментов с супернатантами C. krusei эти изменения носили наиболее
выраженный характер: количество TLR-2-позитивных клеток увеличивалось с
28,5 ± 2,8% (контроль) до 37,6 ± 3,6% (р< 0,05) (см. табл. 5).
Метаболиты бактерий преимущественно подавляли экспрессию TLR-4 на
буккальных клетках: в экспериментах с супернатантами S. aureus и E.faecium
количество TLR-4 – позитивных клеток существенно уменьшалось: в 1,43 и
1,32 раз соответственно (р< 0,05); эксперименты с метаболитами E. coli имели
такую же тенденцию, но оказывали менее выраженный эффект (р> 0,05). В то
же время, воздействие метаболитов кандид вело к некоторому увеличению
процента TLR-4 – позитивных эпителиоцитов в популяции (р> 0,05).
Таким образом, результаты показали, что представители фунгальной и
бактериальной микрофлоры, обладают разными механизмами регуляции
экспрессии TLR-2 и TLR-4 на эпителиальных клетках слизистых оболочек.
18
а)
Всего
TLR-2- или
TLR-4позитивных
клеток
(%)
*
*
*
*
*
*
*
*
б)
Всего
TLR-2- или
TLR-4позитивных
клеток
(%)
*
*
*
*
*
в)
Клетки,
экспрессирующие
только
TLR-2 или
TLR-4
(%)
*
*
*
*
*
*
*
*
Рис. 3. TLR-4 и TLR-2 – позитивные буккальные эпителиоциты здоровых людей (а)
и пациентов с заболеваниями пародонта: до (контроль) (б) и после (в)
обработки иммуномодулирующими препаратами.
- TLR-4- позитивные клетки;
- TLR-2- позитивные клетки
* – достоверность отличий относительно контроля в группе (р < 0,05).
19
Естественная колонизация буккальных эпителиоцитов в оценке
эффективности применения иммуномодуляторов
и оральных антисептиков при некоторых хронических патологиях
Естественная колонизация буккальных эпителиоцитов отражает
состояние местного и системного гомеостаза организма, а также его нарушения
при патологии (Маянский А.Н. и соавт. 2004; Полякова В.О. и соавт., 2015). В
работе была рассмотрена возможность использования уровня естественной
колонизации эпителиоцитов как критерия эффективности лечебнопрофилактических мероприятий у больных с хроническими заболеваниями
(микробная экзема, онихомикозом дрожжевого генеза, хронические
заболевания респираторной системы) с использованием иммуномодуляторов и
оральных антисептиков.
Больные с микробной экземой и онихомикозом дрожжевого генеза
находились на амбулаторном лечении в ФГБУ «Государственный научный
центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава РФ (г.Н.Новгород).
Пациенты получали терапию согласно стандарту лечения соответствующих
патологий, по ранее разработанной схеме (Шебашова Н.В., и соавт., 2008).
Антибиотики назначались лечащим врачом в соответствии с данными
резистограммы. У отдельных групп пациентов в схему лечения были
добавлены иммуномодуляторы: «Полиоксидоний» (для больных с микробной
экземой) и «Деринат» (для больных онихомикозом)
Исследования больных с микробной экземой проводились совместно с
сотрудником из ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии
и косметологии» Минздрава РФ (г.Н.Новгород) Пышкиной Е.И. Показатель
адгезии буккальных клеток у пациентов с экземой повышался до 36,79 ± 15,52
(р>0,05). Стандартная схема лечения больных приводила к снижению индекса
естественной колонизации до 35,12 ± 15,21 бакт/эп. После комплексной
терапии с использованием препарата «Полиоксидоний», индекс естественной
колонизации снижался в большей степени и составлял 26,47 ± 12,03 бакт/эп,
приближаясь к показателям в контрольной группе 14,31 ± 6,91 бакт/эп (р>
0,05).
Мы сравнили возможность использования различных параметров: индекса
естественной колонизации буккального эпителия, растворимых молекул
межклеточной адгезии sICAM-1 и иммуноглобулинов IgG, IgЕ для оценки
выраженности патологического процесса и эффективности терапии у больных с
микробной экземой. Исследования показали, что концентрация sICAM-1 и IgE в
сыворотке также повышалась при патологии, однако, в отличие от индекса
естественной колонизации, не отражала динамику положительных изменений в
ходе лечения заболевания (табл. 6).
На следующем этапе проводили оценку естественной колонизации
буккального эпителия на фоне комплексного лечения онихомикозов,
вызываемых грибами рода Candida с использованием препарата «Деринат».
20
Таблица 6
Естественная колонизация буккального эпителия и сывороточные показатели
у больных с микробной экземой при различных схемах лечения, М ± m
показатели
группы
пациентов
показатель
адгезии
(бакт/эпит)
здоровые (n=25) 14,31 ± 6,91
факторы сыворотки
sIСАM-1
(ng/ml)
IgG
(mg/ml)
377,6 ± 92,78
IgE
(mg/ml)
10,45 ± 0,68
25,53 ± 5,51
пациенты с
экземой до
36,79±15,52 ↑ 514,73± 110,57 ↑ 12,92 ± 0,93 42,38±15,74 ↑
лечения (n=52)
пациенты с
экземой после
35,12 ± 15,21
510,54 ± 110,26
12,92 ± 0,89 42,85 ± 15,25
стандартного
лечения (n=28)
пациенты с
экземой после
26,47±12,03 ↓ 505,61 ± 114,29
12,87 ± 0,56 43,81 ± 16,87
комплексного
лечения*(n=24)
* - комплексное лечение с применением препарата «Полиоксидоний»
↑ - увеличение показателя относительно группы здоровых; ↓ - снижение показателя
в процессе лечения.
Уровень естественной колонизации,
(бакт/эпит)
Эксперименты показали, что уровень естественной колонизации
эпителиоцитов у больных онихомикозом был выше, чем у здоровых как для
взрослых: 45,32 ± 22,14 бакт/эп и 14,30 ± 7,89 бакт/эп (рис. 4) соответственно
(p>0,05), так и для детей: 84,31 ± 39,06 бакт/эп (23 человека).
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Здоровые доноры
n=28
Больные
онихомикозом
n=53
После
стандартного
лечения
n=26
После
комплексной
терапии с
применением
препарата
"Деринат"
n=27
Рис. 4. Влияние препарата «Деринат» на уровень естественной колонизации
буккальных эпителиоцитов у взрослых пациентов с онихомикозом.
21
и 40,56 ± 18,98 бакт/эп (28 человек) соответственно (p>0,05).При этом
отмечали, что уровень естественной колонизации эпителиоцитов у детей, в
среднем, выше, чем у взрослых.
После проведенного курса стандартного лечения уровень естественной
колонизации несколько понижался и составлял 34,19 ± 17,21 (p>0,05). При
комплексной терапии с использованием препарата «Деринат» индекс
естественной колонизации снижался в большей степени - до 23,71 ± 11,0
(p>0,05), приближаясь к показателям в контрольной группе. Результаты
показали, что на фоне комплексной терапии (хронических заболеваний) с
использованием иммуномодуляторов, изменения показателя естественной
колонизации буккальных эпителиоцитов всегда были выражены сильнее и
стремились к норме.
Дополнительно были проанализированы результаты состояния
естественной колонизации буккального эпителия детей 6-8 лет из двух
общеобразовательных школ г. Нижнего Новгорода. Были выделены группа
здоровых (29 человек) и группа часто болеющих детей (ЧБД) (21человек) в
состоянии ремиссии, имеющих в анамнезе хронические заболевания верхних
дыхательных путей. Группа ЧБД получала по 3 сублингвальные таблетки,
содержащие лизоцим – «Биофит», 1 раз в день, в течение 21 дня.
Средний
показатель
естественной
колонизации
буккальных
эпителиоцитов был в 1,6 раза (р>0,05) выше в группе ЧБД , чем у здоровых
детей и составлял 70,18 ± 31,97 бакт/эп и 40,56 ± 18,98 бакт/эп соответственно.
После приема лизоцим-содержащего препарата уровень естественной
колонизации в группе ЧБД снижался до 48,4 ± 25,61 бакт/эп, приближаясь к
показателям в группе контроля (здоровые дети) (р>0,05). Таким образом,
сублингвальное применение препарата с лизоцимом нормализовало состояние
микробиоциноза полости рта у детей с хроническими заболеваниями верхних
дыхательных путей.
Это говорит о том, что применение в вышеуказанных группах пациентов
иммуномодулирующих и антисептических препаратов способствовало
восстановлению гомеостаза, что нашло свое отражение в нормализации
функционального состояния буккальных эпителиоцитов и их взаимоотношения
с микробиотой полости рта. Кроме того, положительная динамика изменений
уровня естественной колонизации эпителиоцитов полости рта у пациентов
позволяла в короткие сроки оценить эффективность лечебных и
профилактических мероприятий с использованием иммуномодуляторов и
оральных антисептиков.
22
Выводы
1.
Половые гормоны, цитокины и микробные метаболиты способны влиять на
функциональный
статус
эпителиоцитов
слизистых
оболочек,
разнонаправлено меняя их адгезивность в отношении C. albicans in vitro.
Прогестерон, лютеинизирующий гормон, IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α и
метаболиты
C.albicans
значительно
усиливают
адгезивность
эпителиоцитов, тогда как эстрадиол, эстриол, тестостерон, хорионический
гонадотропин человека и IFN-α - существенно снижают.
2.
Обработка буккальных клеток иммуномодуляторами и оральными
антисептиками in vitro снижает способность эпителиоцитов адгезировать
C. albicans.
3.
Изменение способности к рецепции C. albicans у буккальных и
вагинальных эпителиоцитов под действием половых гормонов in vitro
носит характер сильной прямой корреляции.
4.
Кандида-зависимая активация системы NF-kB способствует усилению
контактного взаимодействия буккальных клеток с C. albicans. Активность
МАР - киназ существенно не влияет на изменение адгезивных параметров
эпителиальных клеток в системах с C. albicans.
5.
Иммуномодуляторы разных групп разнонаправлено стимулируют
экспрессию toll - подобных рецепторов на эпителиоцитах. Фунгальные
метаболиты C.albicans, C.glabrata и C.krusei увеличивают способность
эпителиоцитов к экспрессии TLR-2 и TLR-4, тогда как бактериальные
метаболиты S. aureus, E.faecium и E.coli, напротив, подавляют.
6.
Среди буккальных эпителиоцитов здоровых людей общее количество TLR4 – позитивных клеток в популяции выше, чем TLR-2 – позитивных. У
пациентов с заболеваниями пародонта процент эпителиоцитов,
экспрессирующих TLR-4 снижается, а экспрессирующих TLR-2 –
повышается; при этом существенно увеличивается процент клеток,
имеющих оба рецептора. Изменение экспрессии TLR-2 и TLR-4 на
буккальных клетках под действием иммуномодуляторов выражено слабее
у больных с пародонтитом по сравнению со здоровыми.
7.
Индекс естественной колонизации буккального эпителия повышается у
взрослых и детей при хронических патологиях различного генеза
(онихомикоз,
микробная
экзема,
респираторные
заболевания).
Положительная динамика изменения уровня естественной колонизации,
т.е. приближение его к значениям, характерным для здоровых людей,
показывает эффективность лечебных и профилактических мероприятий с
использованием иммуномодуляторов и оральных антисептиков.
23
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Влияние препарата «Гриппферон» на взаимодействие буккальных
эпителиоцитов с Candida albicans / О.А. Лукова, М.И. Заславская, Т.В.
Махрова, А.Н. Маянский // Естествознание и гуманизм, межвузовский
сборник научных трудов « Современный мир». –2007. –Т. 4. –№4. – С.64.
2. Лукова О.А. Действие α-интерферона на адгезию в системе «Candida
albicans- эпителиоциты» / О.А. Лукова, М.И. Заславская, Т.В. Махрова //
Современная микология в России: материалы второго съезда микологов
России.- М., 2008. - С. 277-278.
3. Заславская М.И. Адгезивные реакции буккальных эпителиоцитов у
пациентов детского возраста с онихопатиями/ М.И. Заславская, Ю.В.
Мишина, О.А. Лукова // Современная микология в России: материалы 2-го
съезда микологов России.- М. – 2008.- С.429.
4. Заславская М.И. Роль нуклеарного фактора-kВ в обеспечении контакта
эпителиоцитов с Candida albicans / М.И. Заславская, О.А.Лукова // Проблемы
медицинской микологии: тезисы докладов XI научно-практической
конференции по медицинской микологии. – 2008. – Т. 10. – № 2. – С. 44.
5. Заславская, М.И. Влияние препарата «Ксидифон» на взаимодействие
Candida albicans и щечных эпителиоцитов / М.И. Заславская, О.А. Лукова,
Т.В. Махрова // Проблемы медицинской микологии: тезисы докладов XI
научно-практической конференции по медицинской микологии. – 2008. – Т.
10. – № 2. – С. 61.
6. Лукова, О.А. Влияние ФНО-α
на взаимодействие нейтрофилов и
буккальных эпителиоцитов с Candida albicans / О.А. Лукова, М.И.
Заславская, Т.В. Махрова // Труды Х международного конгресса«
Современные проблемы аллергологии, иммунологии и имунофармакологии»
Российский аллергологический журнал. – 2009- №3.- с.467
7. Заславская, М.И. Влияние TNF- α и INF- α на взаимодействие буккальных
эпителиоцитов с Candida albicans. /М.И. Заславская, О.А. Лукова, Т.В.
Махрова // Тезисы сообщений на XII научно-практической конференции по
медицинской микологии. Проблемы медицинской микологии. – 2009. –
Т.11. – №2 –С. 73–74.
8. Лукова, О.А. Действие препарата «Деринат» на систему «Candida albicans буккальные эпителиоциты» / О.А. Лукова, Т.В. Махрова, М.И. Заславская //
Тезисы сообщений на XII научно-практической конференции по
медицинской микологии. Проблемы медицинской микологии. –2009. –Т.11.
–№2 –С. 92–93.
9. Заславская, М.И. Участие нуклеарного фактора-kВ в регуляции
взаимодействия эпителиоцитов полости рта с Candida albicans./ О.А. Лукова,
Т.В Махрова // Материалы 2-го международного конгресса по пробиотикам.
Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. –2009. –№4. –С.15.
10. Микробная колонизация эпителиоцитов полости рта у детей с
хроническими заболеваниями верхних дыхательных путей на фоне
сублингвального приема препарат с лизоцимом/ И.Ш.Якубова, М.И.
24
Заславская, О.А. Лукова, А.С. Поляшова // Материалы 2-го международного
конгресса по пробиотикам. Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. – 2009. –
№4. –С.46.
11.Эффективность применения этидроновой кислоты, как средство
профилактики воспалительных заболеваний полости рта / Т.В.
Лукоянова, В.С. Булгаков, Э.Г. Кравцов, М.И. Заславская, О.А.Лукова,
В.Н. Царев // Российская Стоматология. – 2010. – №3. – С.26–28.
12.Заславская, М.И. Влияние препарата Деринат на взаимодействие
эпителиоцитов слизистых оболочек с Candida albicans / М.И. Заславская,
О.А.Лукова, Т.В.Махрова // Сборник материалов XVII Российского
национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, –2010. –С.618.
13. Лукова, О.А. Действие некоторых иммуномодуляторов на систему
«Candida albicans - буккальные эпителиоциты» / О.А. Лукова, М.И.
Заславская, Т.В. Махрова // Современная микология в России. Том 3.
Материалы 3-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия
микологии. – 2012. – С. 478.
14. Исследование показателей резистентности полости рта на фоне применения
препарата с иммуномодулирующим эффектом в системах in vitro и in vivo /
М.И. Заславская, О.А. Лукова,
Н.В. Шебашова, И.А. Клеменова //
Современная микология в России. Том 3. Материалы 3-го Съезда микологов
России. М.: Национальная академия микологии. – 2012. – С.488.
15. Исследование показателей резистентности полости рта на фоне применения
препарата с иммуномодулирующим эффектом в системах in vitro и in vivo /
О.А. Лукова, Н.В. Шебашова, Т.В. Махрова, М.И. Заславская // Сборник
трудов I Международной интернет-конференции «Медицина в XXI веке:
традиции и перспективы».- 2012.- С. 148–149.
16. Лукова, О.А. Влияние препарата «Рибомунил» на взаимодействия щечных
эпителиоцитов с Candida albicans in vitro / О.А. Лукова, Е.И. Руднева //
Тезисы сообщений на XVI научно-практической конференции по
медицинской микологии. Проблемы медицинской микологии. – 2013.- Т.15.
– №2 –С. 100.
17. Заславская, М.И. Влияние женских половых гормонов на контактные
взаимодействия эпителиоцитов слизистых оболочек с Candida albicans в
экспериментах in vitro / М.И. Заславская, О.А. Лукова, Т.В. Махрова //
Тезисы сообщений на XVI научно-практической конференции по
медицинской микологии. Проблемы медицинской микологии. –2013.- Т.15.
–№2 –С.77.
18. Expression of TLR-2 and TLR-4 by mucosal epithelial cells after exposition with
metabolites of Candida and bacterial representatives of human microbiota / М.И.
Заславская, О.А.Лукова, Н.А. Александрова, В.С. Кропотов // Тезисы
материалов III Санкт-Петербургского международного экологического
форума. Инфекция и иммунитет. – 2014. – С.60-61.
19. Лукова, О.А. Значение нуклеарного фактора-kB и митоген-активированных
киназ в регуляции адгезивных взаимодействий буккальных эпителиоцитов с
Candida albicans/ О.А. Лукова, М.И. Заславская, Н.А. Александрова //
25
Материалы
всероссийской
Научно-практической
конференции,
посвященной 95-летию ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной.
Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения. –
2014. –С.200.
20. Руднева, Е.И. Влияние рибосомальных белков респираторных
бактерий на адгезивные свойства буккальных эпителиоцитов / Е.И.
Руднева, О.А. Лукова, А.Н. Маянский // Журнал микробиологии,
эпидемиологии и иммунобиологии.–2014.–№2.–С.85–90.
21. Лукова, О.А. Влияние женских половых гормонов и цитокинов на
адгезивные взаимодействия эпителиальных клеток слизистых оболочек
с Candida albicans in vitro/ О.А. Лукова, Н.А. Александрова, М.И.
Заславская // Медицинский альманах.–2014.–№5(35).–С.102–104.
Список сокращений
ДМСО
ЗФР
ЛГ
ОРЗ
ФСГ
ХГЧ
ЧБД
CD
sICAM-1
IFN
IL
NF-kB
NK
PAMPs
TLRs
TNF-α
диметилсульфоксид
забуференный физиологический раствор (рН 7,2-7,4)
лютеинизирующий гормон
острое респираторное заболевание
фолликулостимулирующий гормон
хорионический гонадотропин
часто болеющие дети
маркёры клеточной дифференцировки (cluster of differentiation)
растворимые молекулы межклеточной адгезии 1
интерферон (interferon)
интерлейкин (interleukin)
нуклеарный фактор kB
естественный киллер (natural killer)
патоген-ассоциированные паттерны и молекулярные образы
микроорганизмов
- толл-подобные рецепторы (toll-like receptor)
- фактор некроза опухоли α (tumor necrosis factors)
-
Благодарности
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю
Заславской М.И. за ценные советы на различных этапах выполнения работы, а
также огромную признательность доценту кафедры микробиологии и
иммунологии ГБОУ НижГМА Минздрава РФ к.м.н. Махровой Т.В. за
консультации и помощь в организации экспериментов. Автор благодарит
директора Нижегородского филиала ГНЦДК Минздрава РФ, д.м.н. Клеменову
И.А за организацию совместных лабораторных исследований биоматериала,
полученного от пациентов с микробной экземой и онихомикозом. Автор
выражает благодарность в.н.с. Маянской И.В. за предоставление возможности
выполнения исследований на проточном цитофлюориметре в ФГУ
"Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии" Минздрава России, а также
всем соавторам, принимавшим участие в научном исследовании.
Скачать