Pril_21-1 - Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

advertisement
Министерство образования и науки Российской Федерации
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
УДК 577.151.03, 577.151.45
№ госконтракта 02.740.11.0766
№ госрегистрации И100921055352
Инв.№ 12
УТВЕРЖДАЮ
Ректор СФУ
академик РАН
Е.А. Ваганов
______________________
(подпись)
“____” ноября 2010 г.
М.П.
ОТЧЕТ
О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ
В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009-2013 годы
по теме:
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКАХ И ИХ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МОДЕЛЯХ; СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ НОВОГО
ПОКОЛЕНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ СЕНСОРОВ ДЛЯ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ
(промежуточный, этап № 2)
Наименование этапа: «Изучение молекулярно-клеточного механизма биолюминесценции
грибов»
Руководитель НИР, академик, д-р медиц. наук,
проф.
_________________
подпись, дата
Красноярск 2010
И.И.Гительзон
СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ
Руководитель темы, д-р медиц. наук,
профессор-консультант ИФБиБТ
СФУ, научный руководитель НОЦ
«Енисей», академик РАН
Д.б.н., профессор, зав. кафедрой
биофизики ИФБиБТ СФУ
И.И. Гительзон
_________________ (введение, разделы 1-5,
подпись, дата
заключение)
Д. ф.-м.н., профессор кафедры
биофизики ИФБиБТ СФУ
П.И. Белобров
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Д.б.н., профессор ИЦМиМ СФУ
Н.С. Кудряшева
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Д.ф.-м.н., профессор кафедры
биофизики ИФБиБТ СФУ
С.И .Барцев
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
К.б.н., доцент кафедры биофизики
ИФБиБТ СФУ
Е.Н. Есимбекова
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
К.б.н., с.н.с кафедры биофизики
ИФБиБТ СФУ
И.В. Свидерская
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
К.б.н., доцент кафедры биофизики
ИФБиБТ СФУ
В.В. Межевикин
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
К.б.н., доцент кафедры биофизики
ИФБиБТ СФУ
И.Е. Суковатая
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
К.ф.-м.н., директор ИФБиБТ СФУ,
директор НОЦ «Енисей»
В.А. Сапожников
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
К.ф.-м..н., доцент кафедры биофизики
ИФБиБТ СФУ
Е.В. Немцева
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Инженер СФУ
М.В. Даценко
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Инженер СФУ
С.М. Гусев
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
В.А .Кратасюк
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
К.т.н., в.н.с. НИЧ СФУ
_________________
А.Г. Суковатый
подпись, дата
(раздел 5)
Инженер СФУ
О.С. Максимова
_________________ (оформление документов по
подпись, дата
проекту)
Электроник сектора
административных территориальных
сегментов МКИВС СФУ
А.В. Суханов
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Аспирант СФУ
В.О. Шеходанов
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Аспирант СФУ
Н.В. Шманько
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Старший преподаватель ИМ СФУ
Р.Г. Углев
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Аспирант СФУ
В.В. Зыков
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Начальник отдела интеллектуальной
собственности СФУ
_________________
подпись, дата
Л.И. Черепанова
(раздел 1-3)
Аспирант СФУ
А.С. Тарасова
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Начальник отдела ОРГиП ЦГП НИЧ
СФУ
С.А. Кузнецов
_________________ (оформление документов по
подпись, дата
проекту)
Аспирант СФУ
М.А. Александрова
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Аспирант СФУ
О.А. Вшивкова
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
А.М. Кондик
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Магистр ИФБиБТ СФУ
_________________
подпись, дата
Магистр ИФБиБТ СФУ
А.В. Орлова
(раздел 5)
А.В. Архипова
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Аспирант СФУ
Д.В. Гульнов
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Аспирант СФУ
И.А. Денисов
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Студентка ИФБиБТ СФУ
А.Е. Безруких
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Студентка ИФБиБТ СФУ
Г.А. Кудряшева
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
К.А. Лукьяненко
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
А.Г. Туманян
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Магистр ИФБиБТ СФУ
Н.С. Бука
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Студентка ИФБиБТ СФУ
Н.А. Зайцева
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Магистр ИФБиБТ СФУ
Е.В. Васюнькина
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
_________________
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
_________________
подпись, дата
Студентка ИФБиБТ СФУ
_________________
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
_________________
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
О.С. Сутормин
(раздел 5)
А.С. Якимов
(раздел 5)
Т.И. Авсиевич
(раздел 5)
В.А. Черняев
(раздел 5)
Е.С. Мамаева
_________________ (раздел 1-3)
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
Е.С. Балакина
_________________ (раздел 1-3)
подпись, дата
Студент ИФБиБТ СФУ
Д.А. Митрюшкина
_________________ (раздел 1-3)
подпись, дата
Аспирант ИБФ СО РАН
Н.О. Ронжин
_________________ (раздел 1-3)
подпись, дата
К.х.н., н.с. ИФБ СО РАН
Н.В. Белогурова
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Инженер СФУ
Р.Р. Алиева
_________________ (раздел 5)
подпись, дата
Координатор НОЦ «Енисей»
_________________
подпись, дата
А.Ю. Денисова
(раздел 5)
Референт ИБФ СО РАН
Г.Е. Касаева
_________________ (раздел 1-3)
подпись, дата
Д.б.н., в.н.с., зав. лабораторией ИБФ
СО РАН
В.С. Бондарь
_________________ (реферат, раздел 1-3,
подпись, дата
заключение)
К.б.н., н.с. ИБФ СО РАН
К.В. Пуртов
_________________ (раздел 1-3)
подпись, дата
К.б.н., н.с. ИБФ СО РАН
Г.А. Выдрякова
_________________ (введение, разделы 1-3)
подпись, дата
К.б.н., с.н.с. ИБФ СО РАН
С.Е. Медведева
_________________ (реферат, введение, разделы 1-4,
подпись, дата
заключение)
К.б.н., в.н.с. ИБФ СО РАН
Э.К. Родичева
_________________ (раздел 2)
подпись, дата
Лаборант ИБФ СО РАН
Д.А. Котов
_________________ (раздел 2)
подпись, дата
Инженер-технолог ИБФ СО РАН
А.И. Петров
_________________ (раздел 3)
подпись, дата
К.б.н., с.н.с. ИБФ СО РАН
К.б.н., с.н.с. ИБФ СО РАН
Лаборант ИБФ СО РАН
С.н.с. ИБФ СО РАН
К.б.н., с.н.с. ИБФ СО РАН
К.б.н., зав. лабораторией ИБФ СО
РАН
К.б.н., с.н.с. ИБФ СО РАН
К.т.н., доцент ИКиИТ СФУ
Аспирант центра технологий
электронного обучения СФУ
Электроник центра обслуживания
систем обработки данных СФУ
Нормоконтролер
_________________ Н.С. Мануковский
(разделы 2-3)
подпись, дата
_________________ В.С. Ковалев
(раздел 2-3)
подпись, дата
_________________ Н.Н. Озимок
(раздел 3)
подпись, дата
А.П. Пузырь
_________________ (раздел 2-3)
подпись, дата
_________________ О.А. Могильная
(раздел 2-3)
подпись, дата
_________________ Г.С. Калачева
(раздел 3)
подпись, дата
_________________ Н.А. Тюлькова
(разделы 1)
подпись, дата
_________________ В.А. Комаров
(раздел 5)
подпись, дата
_________________ А.А.Трухин
(раздел 5)
подпись, дата
_________________ Д.Ю.Худоногов
(раздел 5)
подпись, дата
_________________ О.С. Максимова
(весь отчет и документы)
подпись, дата
УДК 001.891[047]:006.354
МКС 01.140.20
Т62
ОКСТУ 0007
Ключевые слова: научно-технический документ, отчет, научно-исследовательская работа,
заключительный отчет, промежуточный отчет
РЕФЕРАТ
Отчет _7_ с., ?.ч, 41_ рис., _13_ табл., _61_ источник
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ, ЛЮЦИФЕРАЗА, СВЕТЯЩИЕСЯ
БАКТЕРИИ,
СВЕТЯЩИЕСЯ
ГРИБЫ,
МИКРООКРУЖЕНИЕ,
ИММОБИЛИЗАЦИЯ,
ВЯЗКОСТЬ СРЕДЫ, СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ, МОДЕЛИРОВАНИЕ, ВКЛЮЧЕНИЕ В
ГЕЛЬ, ИННОВАЦИОННОЕ ОБРАЗОВАНИЕ
Проект направлен на понимание механизма биолюминесценции светящихся грибов и
использования этого природного явления для создания аналитических систем предельно
высокой чувствительности для применения в биологических исследованиях, медицине и
биотехнологии.
В отчете по второму этапу представлены результаты исследования биолюминесценции
грибов, механизм которого остается не расшифрованным, и результаты разработки путей
использования этого явления для аналитических целей.
Цель проекта: Разработка и исследование физико-химических экспериментальных
моделей для изучения функционирования цепей сопряжения ферментов и механизмов
стабилизации ферментов внутри клетки и в растворе на примере люминесцентной системы
светящихся бактерий и грибов.
Цель
второго
этапа
проекта:
Изучение
молекулярно-клеточного
механизма
биолюминесценции грибов
План НИР второго этапа работы (2010 г.) над проектом включал следующие основные
задачи:
1. Разработка оптимальной среды для поддержания длительного стабильного излучения
грибных систем.
2. Исследование условия выделения компонентов грибной биолюминесцентной системы из
мицелия и плодовых тел.
3. Изучение клеточной организации биолюминесцентной системы грибов.
4 Изучение биофизических параметров грибной биолюминесценции.
За отчетный период получены следующие основные результаты:
1. Молекулярно-биологическими методами установлено, что культура вьетнамского гриба
является представителем вида Neonothopanus nambi,
ранее описанный вьетнамским
исследователем Дао Тхи Ван (2002) как Omphalotus af. illudent.
2. Исследованы параметры роста культуры N. nambi на средах разного состава. Подобраны
питательные среды на основе стандартных реагентов и сибирских растений (осина,
сосна, береза), выбраны оптимальные условия культивирования гриба, определены
основные параметры роста. Поиск заменителей вьетнамского субстрата (опилки гевеи и
неочищенные зерна риса) для культивирования гриба на более доступных субстратах
показал, что мицелий гриба N. nambi успешно развивается на субстрате, основу которого
составляют опилки березы или осины. При этом морфология роста гриба на опилках
осины аналогична росту на опилках гевеи. Опилки сосны менее пригодны для
выращивания N. nambi ввиду очень слабого роста на них мицелия. Эксперименты также
показали, что зерно пшеницы успешно заменяет зерно риса в процессе искусственного
выращивания гриба N. nambi. Среди нескольких относительно дешевых и легко
доступных сред предпочтение отдано картофельной среде, на которой хорошо
развивается мицелий с высоким уровнем свечения. Свечение мицелия наблюдается
после прекращения его роста. Предположительно фактором, лимитирующим рост,
является азот. Интенсивное свечение сопровождалось локальным потемнением мицелия
и выделением в глубину агара темно-зеленого экссудата, который со временем
становился темно-коричневым. При механическом повреждении мицелия (надрезе
колонии) интенсивность свечения и выделение экссудата в зоне надреза резко нарастали
в течение 1-2 часов и длилось 3-5 суток. Мицелий в зоне свечения постепенно
покрывается темно-коричневым налетом, таким же, каким над зоной свечения
покрывается стекло. Это может свидетельствовать о сопряженности выделения
окрашенных летучих компонентов и реакции свечения. Кроме того, по нашим
наблюдениям процесс свечения сопровождает процесс накопления окрашенных веществ
в среде, что подтверждается отдельными данными о сопряжении процессов лигнинолиза
и биолюминесценции.
3. Методом масс-спектрометрии исследован липидный и жирнокислотный состав
экстрактов, полученных из сухой биомассы плодовых тел гриба N. nambi. При этом в
исследованных экстрактах гриба не обнаружен иллудин - компонент высших грибов,
обладающий цитостатическим действием. Выявлено низкое содержание липидов (5,3%
сухого вещества) в биомассе исследуемой культуры N. nambi. Содержание неомыляемой
фракции не превышало 6,0 % от общего количества липидов. Омыляемые компоненты, в
состав которых входят жирные кислоты ациллипидов, составили 30,2% от суммы
липидов. Жирнокислотный состав экстрактов, полученных из сухой биомассы плодовых
тел гриба N. nambi, исследован методом масс-спектрометрии. Жирнокислотный состав
исследуемого гриба оказался весьма необычным. Обнаружены жирные кислоты с
количеством атомов углерода от 8 до 26. Особенностью жирнокислотного состава N.
nambi оказалось также большое количество изомеров линолевой кислоты (С18:2): в
зрелых плодовых телах – 7-8 изомеров, в мицелии и молодых плодовых телах – 3-4. При
этом количество некоторых изомеров достигало 45% от общего количества жирных
кислот. Данные о положении двойных связей в изомерах были подтверждены массспектрометрией
ДМОК
(диметилоксазолиновых)
производных
соответствующих
жирных кислот, поскольку введение в цепь жирной кислоты оксазолинового кольца
позволяет точно определить положение двойной связи в молекуле.
4. Получены первичные данные о структурно-функциональной организации и физикохимических свойствах люминесцентной системы светящегося гриба N. nambi. Показано,
что образцы мицелия, выращенные на твердых и жидких питательных средах, обладают
способностью длительной светопродукции – выход
люминесцентного сигнала на
максимум достигается в течение от 40 мин до 5 часов от момента помещения образца в
измерительную кювету. При этом установлено, что биолюминесценция мицелия может
иметь бифазный или монофазный характер, в зависимости от состава питательной
среды. Показано, что люминесцентная система N. nambi является кислородзависимой и,
вероятно, локализована в клеточной мембране гриба, так как в гомогенатах, полученных
после разрушения мицелия, люминесцентная активность не обнаруживается. Ионы
двухвалентных металлов оказывают действие на люминесцентную систему гриба, ионы
марганца активируют светоизлучение, a ионы Ni, Co, Mg ингибируют ее, не влияют на
излучение ионы Ca. Показано, что супероксид анион радикал не принимает участия в
реакции светоизлучения N nambi, что отличает эту люминесцентную систему от
люминесцентных систем светящихся грибов P. stipticus, A. mellea, M. citricolor, P.
japonicus, O. olearius, M. lux-coeli.
5. Выявлен низкомолекулярный термостабильный компонент, значительно (на 2 порядка)
повышающий светопродукцию светящегося мицелия гриба.
6. Показана возможность длительного поддержания свечения мицелия (20 суток и более),
что открывает возможность создания долго действующих («ждущих») сигнальных
тестов на появление токсикантов в водных и воздушных средах.
Работа
имеет
высокую
практическую
значимость:
понимание
механизма
биолюминесценции и длительное свечение мицелия грибов являются основой для создания
нового класса биолюминесцентных сенсоров, работающих в режиме ожидания и выдающих
тревожный сигнал при появлении токсикантов в воздушной или водной среде.
Проведены поисковые исследования для определения биохимических и биофизических
параметров свечения гриба N. nambi, которые позволили установить ряд ранее неизвестных
явлений и фактов: зарегистрирован спектр излучения N. nambi, обнаружен эффект стимуляции
его свечения ионами Mn и Cu ингибирования ионами Ca и Mg. Показана возможность
многократного усиления свечения N. nambi.Эти результаты существенны для продвижения к
пониманию механизма свечения грибов, до настоящего времени не расшифрованного, и для
создания тест-системы на основе биолюминесцентной системы гриба N. nambi
Научно-образовательный процесс.
Показана возможность использования биолюминесцентной системы N. nambi для
визуализации биохимических и биофизических процессов, что дает ряд очевидных
дидактических преимуществ при преподавании биохимии и биофизики в университетах.
Сотрудниками
ИБФ
разработан
информационно-образовательный
портал
«Биолюминесценция и светящиеся организмы» (http://bl.ibp.ru), представляющий сведения обо
всех аспектах биолюминесценции и ее использовании, о коллективах России и других стран,
занимающихся изучением биолюминесценции различных организмов. Студенты, аспиранты
СФУ и другие пользователи сети имеют свободный доступ к выставленным на портале
ресурсам. Полученные в ходе проекта данные также будут представлены в соответствующем
разделе портала.
СОДЕРЖАНИЕ (СТРАНИЦЫ НАДО ВЫВЕРИТЬ!!! ВСТАВИТЬ ПРОПУЩЕННЫЕ В
СОДЕРЖАНИЕ)
РЕФЕРАТ…………………………………………………………………………………… …….…7
СОДЕРЖАНИЕ……………………………………………………………………………….11
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ………………….……… ……...13
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………………..14
РАЗДЕЛ 1 ОПИСАНИЕ ПРОБЛЕМЫ И ПУТИ РЕШЕНИЯ………….…………….17
1.1 Актуальность проблематики………………………………………………………………...17
1.2 Предлагаемые подходы………………………………………………………………………19
1.3 Практическая значимость……………………………………………………………………20
РАЗДЕЛ 2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………………………..21
2.1 Источники культур светящихся грибов, использованных для работы по проекту………21
2.1.1 Отбор светящихся культур грибов из коллекций ……………………………………….21
2.1.2. Выделение светящихся культур грибов из природных источников…………………….21
2.2 Культивирование грибов……………………………………………………………………..21
2.2.1 Способы культивирования………………………………………………………………..21
2.2.2. Питательные среды…………………………………………………………………………..22
2.2.3. Определение показателей роста и свечения мицелия грибов…………………………….22.
2.3 Молекулярная идентификация культуры светящихся грибов…………………………......23
2.4 Метод атомной абсорбции…………………………………………………………………....24
2.5 Регистрация свечения мицелия грибов……………………………………………………....25
2.6 Влияние модельных токсикантов на биолюминесценцию грибов…………………………25
РАЗДЕЛ 3 ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНОГО МЕХАНИЗМА
БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ГРИБОВ………………………………………………….…...27
3.1 Разработка оптимальной среды для поддержания стабильного и длительного излучения
грибных систем…………………………………………………………………………………….27
3.1.1. Отбор культур – кандидатов для применения в биолюминесцентных тест системах…27
3.1.2 Уточнение таксономического положения культуры Omphalotus af. Illudent……………..29
3.1.3. Содержание основных компонентов в древесине гевеи и зольных элементов базидиом
гриба N. nambi………………………………………………………………………….31
3.1.4. Подбор компонентов питательной среды для выращивания гриба N. nambi……………..33
3.1.5. Влияние добавок Fe, Cu и Mn на рост гриба N. nambi ……………………………………..35
3.1.6. Рост гриба N. nambi на различных сахарах………………………………………………..37
3.1.7. Рост и биолюминесценция гриба N. nambi на богатых органических средах…………..39
3.1.8. Рост и биолюминесценция гриба N. nambi на различных природных лигноцеллюлозных
субстратах……………………………………………………………………………………………40
3.2. Исследование условия выделения компонентов грибной биолюминесцентной системы из
мицелия и плодовых тел............................................................................………………………...45
3.2.1. Приготовление образцов…………………………………………………………………….45
3.2.2. Экспериментальная оценка возможности выделения компонентов биолюминесцентной
системы гриба N. nambi……………………………………………………………………………..45
3.3. Изучение клеточной организации биолюминесцентной системы грибов..…….…...47
3.3.1. Морфология светящихся грибов Armellaria borealis……………………………………….47
3.3.2. Морфология светящихся грибов Neonothopanus nambi…………………………………….48
3.3.3. Микроморфология светящихся грибов Neonothopanus nambi…………………………......50
3.3.4. Биохимический состав биомассы светящихся грибов Neonothopanus nambi…………… 53
3.3.5. Поиск субстрата биолюминесцентной реакции…………………………………………….58
3.3.6. Состав питательных сред, используемых для выращивания культуры гриба N. nambi….60
3.4. Изучение биофизических параметров грибной биолюминесценции……………………..61
3.4.1. Характеристика биолюминесценции гриба N. nambi……………………………………….61
3.4.2. Спектр биолюминесценции гриба N. nambi………………………………………………….62
3.4.3. Оценка возможности использования светящихся грибов
в биолюминесцентном анализе…………………………………………………………………….63
РАЗДЕЛ 4 НАУЧНО-ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ПРОЦЕСС……………………………..69
Раздел 5. Достижение Программных индикаторов. Комментарии…………………………..70
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………………………79
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ……………………………...83
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
Биолюминесценция
- свечение живых организмов
Хемилюминесценция
- излучение света в результате дезактивации молекул,
образованных в ходе химической реакции
Люцифераза
- фермент, катализирующий биолюминесцентную реакцию
Эмиттер
- молекула в электронно-возбужденном состоянии, ответственная
за излучение регистрируемой люминесценции
I
- интенсивность люминесценции
С14
- тетрадеканаль
ФМН
- флавинмононуклуотид
ФМНН2
- восстановленный флавинмононуклеотид
ТВ
- токсические вещества
ВВЕДЕНИЕ
Исследование биолюминесценции грибов преследует двоякую цель:

фундаментальную – раскрытие механизма излучения грибов;

прикладную
–
разработка
биотехнологических
основ
биолюминесцентного
тестирования с использованием люминесцентных систем грибов.
В отличие от биолюминесцентных систем бактерий и многих видов животных
(одноклеточных – жгутиковые, кишечнополостных, (включая полипы, медузы, грибневики),
ракообразных, моллюсков и рыб, которые удалось расшифровать за последние десятилетия,
светоизлучающая система грибов остается нераспознанной. Дискутируется два альтернативных
представления: что свечение грибов обеспечено классической фермент-субстратной системой
люцифераза-люциферин и в противоположность ему, что свечение грибов в отличие от всех
ранее описанных видов биолюминесценции бактерий и животных вызывается окислением
органических субстратов без участия специализированного фермента. Наличие фунгальной
люциферазы подвергается сомнению или вообще отрицается. Поскольку грибы представляют
собой третье царство живой природы, эволюционно удаленное от двух остальных – растений и
животных, познание механизма их люминесценции представляет фундаментальный интерес.
Биохимия грибов весьма своеобразна и это дает основание ожидать, что их биолюминесцентная
система может оказаться принципиально иной, нежели уже описанные биолюминесцентные
системы бактерий и животных. В этом фундаментальный интерес изучения грибной
биолюминесценции.
Но это же обстоятельство определяет и практический интерес биолюминесценции грибов.
В последние десятилетия получило интенсивное развитие новое направление в аналитике
– создание биолюминесцентных тестов для использования в биологии и медицине,
биотехнологии и экологическом контроле такие тесты создаются на уровне геномов,
ферментов, клеток и целых организмов. Их разработка и предложение потребителям стало
предметом
конкуренции.
Каждая
вновь
открытая
или
генносконструированная
биолюминесцентная тест-система становится предметом патентования и дорого стоит.
Конкурентная погоня за новыми тест-системами, в которой участвуют многие компании,
прежде всего фармакологические и биотехнологические весьма остра.
Поэтому перспективен поиск новых биолюминесцентных систем для практического
использования. Светящиеся грибы в этом отношении заслуживают особого внимания, прежде
всего потому, что в силу удаленности этого таксона от других форм жизни можно ожидать, что
и их светоизлучающая система окажется весьма своеобразной.
Открыто к настоящему времени уже более 80 видов светящихся грибов, относящихся к
разным таксонам высших грибов. Ярких отличий в их свечении пока не выявлено, но поскольку
эта способность представлена среди видов грибов мозаично, можно ожидать, что видовые
различия существуют и будут открываться по мере описания генов и ферментов,
обеспечивающих эту функцию у грибов. Каждый вновь описанный в этом отношении вид
может быть предметом патентования.
Еще две особенности свечения грибов привлекательны для решения на их основе весьма
актуальной в настоящее время задачи – создания т.н. «ждущих» аларм-тестов для оперативного
обнаружения токсичности, появляющейся в водной и воздушной среде, в закрытых
помещениях, в особенности.
Преимуществом грибных биолюминесцентных систем в этом отношении является
длительность их свечения и возможность экспозиции тест-системы в воздушной среде.
На этапе работы по проекту, результаты которого представляются в настоящем отчете,
ставились задачи:
1). введение в биотехнологическую культуру ряда видов светящихся грибов из дикой
природы и из коллекций с целью выбора наиболее удобных для работы штаммов, выбор
штаммов для дальнейшей детальной работы (не более 2-3);
2). описание классическими – культуральными и морфологическими методами избранного штамма гриба и его точное таксономическое определение генетическими методами.
Разработка рецепта питательной среды для получения препаративных количеств биомассы
светящихся грибов.
3). Изучение биохимического состава биомассы мицелия и плодовых тел избранного вида,
изучение биофизических параметров свечения избранного вида, кинетики излучения и его
спектра. Подготовка создания аларм-теста на основе биолюминесцентной системы грибов.
4). Разработка и подбор субстрата и питательной среды для обеспечения длительного
(неделями и в пределе месяцами) роста грибной культуры, используемой в качестве тестобъекта в «ждущих» системах.
Как видно из нижеследующего изложения по всем этим направлениям за отчетный этап
получены существенные результаты, обеспечивающие дальнейшее развитие работы.
Стартовой кадровой основой для организации работ по проекту является коллектив
сотрудников СФУ и Института биофизики СО РАН, который сформировался в 1999 году после
получения
гранта
русско-американской
программы
CRDF
и
Минобразования
РФ
«Фундаментальные исследования и высшее образование» и создания научно-образовательного
центра (НОЦ) «Енисей». Образовательные идеи и научные достижения НОЦ «Енисей»
послужили основой инновационной образовательной программы в рамках проекта «Разработка
современной системы подготовки отечественных профессионалов для проведения коммерчески
ориентированных научных исследований в области физико-химической, молекулярной и
клеточной технологий», реализуемой в Институте фундаментальной биологии и биотехнологии
(ИФБиБТ) СФУ. Предлагаемые в проекте исследования являются естественным продолжением
исследований, проводимых в НОЦ «Енисей» в предыдущие годы.
На основе этих научных исследований разрабатывается современная система подготовки
отечественных профессионалов для проведения коммерчески ориентированных научных
исследований в области физико-химической, молекулярной и клеточной технологий.
План НИР второго этапа 2010 года работы над проектом включал следующие основные
задачи:
1. Разработка оптимальной среды для поддержания длительного стабильного излучения
грибных систем.
2. Исследование условия выделения компонентов грибной биолюминесцентной системы из
мицелия и плодовых тел.
3. Изучение клеточной организации биолюминесцентной системы грибов.
4 Изучение биофизических параметров грибной биолюминесценции
Другой целью настоящего проекта являлось вовлечение молодежи в научную
деятельность. Реализация этой цели осуществлялась путем привлечения студентов и
аспирантов к выполнению работ, связанных с темой проекта, в лаборатории нанобиотехнологии
и биолюминесценции Института биофизики.
Раздел 1. Описание проблемы и пути решения.
1.1 Актуальность проблематики
Биолюминесценция - способность живых организмов излучать видимый свет, весьма
широко распространенное природное явление. При изучении светящихся организмов
достигнуты
существенные
результаты
в
понимании
механизмов
светоизлучения:
охарактеризована структурно-функциональная организация нескольких люминесцентных
систем, из некоторых светящихся организмов выделены и ферменты (люциферазы),
катализирующие
реакции
преобразования
энергии
химических
связей
субстратов
(люциферинов) в кванты видимого света, определены их первичная и пространственная
структуры, определены структуры некоторых субстратов. С помощью методов молекулярной
биологии и генной инженерии выделены, клонированы и экспрессированы в клеткахреципиентах гены ряда люцифераз, что открыло возможности получения надежных источников
сырья для выделения этих ферментов в больших количествах. Это интенсифицировало
изучение физико-химических свойств светоизлучающих ферментов и механизма их действия и
стимулировало поиск вариантов их практического использования. Как сами светящиеся
организмы, так и люциферазы являются весьма перспективными биомаркерами для
высокочувствительных методов микроанализа, используемых при решении широкого спектра
биологических, биотехнологических и медицинских задач.
В биолюминесцентном анализе широко используются генетически модифицированные
бактерии, несущие lux-гены светящихся бактерий и других светящихся организмов [1-3].
Однако с помощью бактериальных биотестов не всегда можно оценить воздействие веществ на
эукариотические организмы и обнаружить токсичные вещества в воздушной среде. Разработка
и использование биотестов более высоко организованных видов (дрожжи, черви, грибы),
несущих
гены
люминесцентной
системы,
открывает
новые
перспективы
развития
биолюминесцентного анализа. Способностью излучать видимый свет обладают некоторые
высшие грибы - известно около 80 светящихся видов [4-7], которые обнаружены в разных
регионах Земного шара (Северная и Южная Америка, Европа, Азия, в том числе в Сибири,
Австралия, Африка, Бразилия). Длительное свечение грибов (от нескольких дней до нескольких
недель) в широком температурном диапазоне (4 до 500С [8]), наличие воздушного мицелия
делают перспективным создание на их основе новых биолюминесцентных биотестов
непрерывного действия, которые могут быть использованы для обнаружения токсичности, в
том числе и в воздушной среде.
До настоящего времени лишь несколько групп исследователей во всем мире (в Германии,
Англии и Бразилии) предприняли попытки использования светящихся грибов в качестве
потенциальных объектов для создания биотестов. Например, светящиеся грибы A. mellea,
Micena citricolor и Gerronema viridilucens были использованы для разработки тестов на
токсичность [9-11]. Weitz с соавторами [12] проводили исследование биотестов на основе
светящихся грибов для определения токсичности 3,5 – дихлорфенола (ДХФ), пентахлорфенола
(ПХФ) и солей тяжелых металлов (меди и цинка). Соли цинка ингибировали свечение мицелия
A. mellea. При воздействии 3,5-ДХФ, ПХФ и меди на Armillaria mellea и Mycena citricolor
наблюдалось уменьшение интенсивности люминесценции мицелия, причем мицелий A. mellea
был существенно менее чувствителен к 3,5 ДХФ, чем мицелий M. citricolor. Показатель ЕС50
для 3,5-ДХФ, ПХВ и меди (но не цинка) для светящихся грибов был того же порядка, что и у
бактериальных биотестов.
Близкие результаты были получены на рекомбинантных бактериальных биотестах
Pseudomonas fluorescens 8866 Tn luxCDABE при воздействии этих же токсичных веществ [13], а
также на дрожжевых и нематодных рекомбинантных биотестах [14,15]. Однако, культура A.
mellea была более чувствительна к меди, чем P. fluorescens 8866 и P. putida F1, тогда как M.
citricolor оказалась менее чувствительной.
Известны успешные попытки получить рекомбинантные светящиеся грибы для создания
биосенсора на токсичность веществ. Подходящими видами для этих целей признаны Neurospors
sp и Aspergillus sp., у которых получены люминесцирующие или флюоресцирующие нити
грибов [16]. Люминесцирующие белки включают люциферазу Gaussia и обелин, а кодирующий
ген
находится
в
этих
объектах
под
индуцибельным
промотором
или
усилителем
чувствительности к тест-веществу. Генетически модифицированные биолюминесцентные
грибы Aspergillus awamori с геном рекомбинантного экворина были использованы для
определения ионов кальция [17]. Чуть позже Mendes&Stevani [10] показали возможность
использовать в качестве тест-объекта для определения токсичности ионов металлов (Pb(II),
Cd(II), Al(III)) бразильский светящийся гриб Gerronema viridilucens.
Сравнение чувствительности люминесценции светящихся грибов и рекомбинантных
бактериальных люминесцентных биотестов к различным токсическим веществам (ТВ)
показало, что культура грибов A. mellea была более чувствительной к меди, чем бактериальные
культуры P. fluorescens 8866 и P. putida F1, в то время как культура гриба M. citricolor оказалась
менее чувствительной к этому ТВ [9,13].
Светящийся глобулярный мицелий A. mellea и Mycena citricolor был использован в
качестве тест-объектов британскими и новозеландскими исследователями [9,10,13]. При
использовании биотестов на основе светящихся грибов для определения токсичности фенолов и
солей тяжелых металлов показано, что для светящихся грибов падение люминесценции на 50 %
(ЕС50) после действия фенолов и меди было того же порядка, что и для бактериальных
биотестов [10]. Известны успешные попытки получить рекомбинантные светящиеся грибы
Neurospora sp., and Aspergillus sp, содержащие гены люциферазы веслоногого рачка рода
Gaussia
и
фотопротеина
обелина
для
создания
биосенсора
[18].
Генетически
модифицированные биолюминесцентные грибы Aspergillus awamori с геном рекомбинантного
экворина были использованы для определения изменения концентрации ионов кальция под
воздействием различных ТВ [19].
Несмотря на значительное число работ, посвященных исследованиям люминесценции
высших грибов, механизмы их свечения пока остаются не расшифрованными, в отличие от
биолюминесцентной системы бактерий. Противоречивы мнения относительно структурнофункциональной организации люминесцентных систем светящихся высших грибов и структуре
люцифераз и люциферинов светящихся грибов [5,10-26]. Изучение именно этих вопросов
представляет не только фундаментальный академический интерес, но и имеет очевидное
практическое значение для использования светящихся грибов для биолюминесцентной
аналитики. Исходя из этого, значительное внимание на данном этапе работы было уделено
также изучению биохимических аспектов люминесценции светящегося гриба Neonothopanus
nambi, как основного объекта исследований.
1.2 Предлагаемые подходы
При выполнении данного этапа работы основные усилия фокусировались на изучении
светящегося
гриба
Neonothopanus
nambi,
как
основного
объекта
исследований.
Отличительными особенностями данного вида светоизлучающего гриба и преимуществами как
объекта исследований являются продолжительное свечение, отмечающееся для всех стадий
роста, и культивируемость и сравнительно быстрый рост в лабораторных условиях. Поскольку
в литературе отсутствуют данные об исследованиях люминесцентной системы N. nambi, все
технологии и приемы проведения экспериментов разрабатывались впервые, а полученные в
ходе исследований результаты являются новыми и имеют приоритетный характер. Основу
методологической базы комплексных исследований за отчетный период составили:
Микробиологические методы: Разработка и оптимизация технологий культивирования
светящегося гриба N. nambi, с целью получения исходной биомассы с устойчивым уровнем
биолюминесценции.
Биохимические методы: Исследования структурно-функциональной организации и
физико-химических свойств люминесцентной системы гриба N. nambi. Скрининг данного вида
гриба с целью выявления в нем практически значимых продуктов (лектины, иллуидин)
биолого-медицинского назначения.
Аналитические методы: Изучение возможностей применения светоизлучающего гриба
N. nambi в создании новых люминесцентных индикаторных и диагностических тест-систем для
биологических и медицинских приложений.
Молекулярно-биологические
методы:
Определение
видовой
принадлежности
культуры вьетнамского светящегося гриба методом ДНК-типирования и сравнение полученных
нуклеотидных последовательностей ДНК сиквенсами баз данных GenBank в программе BLAST.
1.3 Практическая значимость
Реализация целей проекта нужна как для решения фундаментальной проблемы механизма
биолюминесценции грибов, так и для прикладных задач биолюминесцентного анализа, в
котором использование биолюминесцентных систем грибов обещает, по крайней мере, два
существенных преимущества в сравнении с бактериальными биотестами – длительность
свечения грибов, достигающая недель и месяцев, что важно для создания «ждущих» алармтестов, и возможность прямого определения токсикантов в воздушной среде. Показанная на
этом этапе исследования возможность длительного (20 суток и более) поддержания свечения на
подобранных средах подтвердила перспективность этого пути.
Раздел 2. Методы исследования
2.1. Источники культур светящихся грибов, использованных для работы по проекту
2.1.1 Отбор светящихся культур грибов из коллекций
Культуры светящихся грибов были получены из трех коллекций:
1. Коллекции культур базидиомицетов Ботанического Института им. В.Л. Комарова РАН
(Санкт-Петербург). Отбор проводили визуально по свечению мицелия, после выращивания
грибов на чашках Петри на сусло-агаре (4 и 1,5 % соответственно) и картофельнодекстрозном агаре (Biokar diagnostics, 39 г/л) в темной камере при 26оС., Свечение
наблюдали уже на 3-и сутки роста невооруженным глазом через 3-5 минут после адаптации к
темноте.
2. частной коллекции штаммов Dao T.V. (BIO-LUMI Co., Ltd., Ho Chi Minh City, Vietnam)
3. Коллекции культур Института леса СО РАН (Красноярск)
2.1.2 Выделение светящихся культур грибов из природных источников
Сбор светящихся грибов осуществляли маршрутным методом:
В экспедиционном маршруте по Южному Вьетнаму были обследованы грибы из лесных
сообществ Национального парка Кат Тьен и двух территорий Заповедника Винь Кыу:
локального участка сохранившегося диптерокарпового леса и окрестности лесной станции TW
Cuc вдоль реки Ма Да.
Собранные образцы (базидиомы и ткани плодового тела) светящихся грибов
фиксировали с использованием фотодокументирования и необходимых дополнительных
описаний, высушивали на электросушилке и упаковывали в зип-пакеты на подложках из
бумажных салфеток с добавлением в каждый пакет силикагеля.
2.2. Культивирование грибов
2.2.1. Способы культивирования
1. Периодическое культивирование на жидкой и твердой среде
2. Глубинное культивирование
3. Твердофазное культивирование гриба в пластиковых мешках
2.2.2. Питательные среды
Питательные среды стерилизовали 30 мин при 1 атм. Основные среды, используемые для
выращивания светящихся грибов:

Среда с отваром пшеничного зерна – для поддержания маточного материала.
Для приготовления отвара пшеничное зерно замачивали в воде (1 кг на 2 литра), нагревали,
кипятили в течение 10-15 минут, не допуская разваривания зерна, затем настаивали в течение
часа при комнатной температуре. По окончании жидкость – отвар пшеничного зерна,
фильтровали и стерилизовали. Перед употреблением концентрат отвара разводили в 2,5 - 3 раза.

Среда Сабуро: 40 г глюкозы, 10 г пептона, 1 л дист. воды.

Среда с молочной сывороткой: смесь отфильтрованной сыворотки и воды (1:0), (1:1),
(1:2).

Среда с картофельным отваром: 200 г картофеля кипятили 10 мин, 20 г сахарозы, 1 л
воды.

Субстрат для твердофазного культивирования гриба в пластиковых мешках:
Для приготовления субстрата опилки вымачивали в 1 - 0,5 % растворе извести в течение
суток. Затем к 1 кг влажных опилок добавляли 20 г на кукурузного экстракта, 3 г сернокислого
аммония, 2 г MgSO4×7H2O, и 1 г KH2PO4. Субстрат помещали в пластиковые мешки, общей
массой общей массой 1 кг.
2.2.3. Определение показателей роста и свечения мицелия грибов.
Влияние органических и неорганических соединений на рост мицелия грибов оценивали
стандартными методами путем измерения радиальной скорости роста (Kr) колоний на
поверхности агаризованой среды в период линейной фазы роста (рис.2.1.1).
Рис. 2.1.1 Фазы роста колонии гриба на поверхности агаровой среды.
Культуры грибов выращивали в чашках Петри в термостате при 28оС. Для каждого варианта
использовали пять чашек (пять повторностей). Колонии измеряли один раз в сутки в течение 710 суток подряд. По окончании каждой серии измерений определяли среднюю величину Kr,
стандартное отклонение и доверительные интервалы. Затем в течение 15- 20 суток продолжали
фиксировать интенсивность свечения мицелия. Интенсивность свечения оценивали в
относительных единицах с помощью люминометра, а также визуально. Дополнительно
учитывали плотность мицелия, выделение окрашенных экссудатов и другие проявления
активности культуры гриба.
2.3. Молекулярная идентификация культуры светящихся грибов
Уточнение видовой принадлежности культуры, описанного ранее как Omphalotus af.
Illudent, проводили метод ДНК-типирования. Область ITS1-5.8S-ITS2 (Internal Transcribed
Spacer
=
внутренние
амплифицировали
с
транскрибируемые
использованием
спейсеры)
комбинации
геномной
рибосомальной
праймеров:
NS5-fw
ДНК
(5'-
TGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') и NS4-rev (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [27].
ПЦР-продукты
секвенировали
и
полученные
нуклеотидные
последовательности
ДНК
сравнивались с сиквенсами баз данных GenBank в программе BLAST. Амплифицированные ITS
фрагменты ДНК использовали в для клонирования и последующего сиквенса, на основании
которого был проведен филогенетический анализ полученных клонов.
2.4. Метод атомной абсорбции. (Брицке, 1982)
Пробу определенного объема предварительно минерализовали смесью кислот азотной и
хлорной при нагревании. Минерализат переносили в мерную колбу и в растворе определяли
содержание металлов на атомно-абсорбционном спектрофотометре Квант-2а (Россия).
Одновременно
проводили
холостое
определение
для
выяснения
чистоты
реактивов.
Калибровочные графики строили по растворам соответствующих солей металлов. Растворы
готовили из государственных стандартных образцов.
1. Калий и натрий определяли из тех же минерализатов, но методом пламенной
фотометрии на пламенном фотометре Flapho ( Карал Цейс, Германия).
2.
Липиды
экстрагировали
смесью
растворителей
хлороформ-изопропанол
в
соотношении 1:1 по объему.
Метиловый эфиры жирных кислот (МЭЖК) получали после кислотного метанолиза
липидов. Метанолиз липидов проводили в смеси метанола и серной кислоты (50:1 по объему)
при температуре 900 С в течение двух часов на водяной бане, используя обратный холодильник.
МЭЖК анализировали на хромато-масс-спектрометре Agilent 5975Inert (Agilent, США),
используя капиллярную колонку HP-FFAP длиной 30 м и внутренним диаметром 0.25 мм.
Условия хроматографирования: газ-носитель – гелий, скорость 1 мл/мин; температура ввода
проб – 220 0 С, начальная температура хроматографирования 1200 С, подъем температуры до
1900 С со скоростью 30 С/мин, 5 мин изотермальный режим, и далее до 2300 С со скоростью 100
С/мин и 20 мин иотермальный режим: температура интерфейса - 2400 С, температура ионного
источника -1750 С; режим электронного удара при 70 eV; режим сканирования фрагментов от
45 до 450 m/z при 0.5 с/сек. Положение двойных связей в ненасыщенных ЖК устанавливали по
масс-спектрам диметилоксазолиновых производных (ДМОЗ) жирных кислот. ДМОЗ были
приготовлены следующим образом: 0.2 мл 2-амино-2-метил-1- пропанола было добавлено к
омыленным липидам, через раствор пропускался гелий, колба плотно закрывалась и
нагревалась до 1900 С в течение 2 часов. Затем к реакционной смеси добавлялось 2 мл
дистиллированной воды, раствор подкисляли, ДМОЗ экстрагировали смесью гексана-ацетона
(96:4 по объему).
3. Анализ аминокислот. 50 мг пробы переносили в ампулу из толстого стела 12х120 мм
и добавляли 20 мл 6N HCl. Ампулу запаивали, гидролиз сухого остатка проводили в термостате
при 1100С в течение 22 часов. После гидролиза содержимое ампулы охлаждали, фильтровали и
переносили в выпарительную чашку. Выпаривание производили на кипящей водяной бане.
Сухой остаток растворяли в 20 мл буфера рН 2.2, отбирали 1900 мкл и добавляли 100 мкл
диметилсульфоксида (ДМС). 100 мкл раствора пропускали через специальный патрон для
очистки раствора аминокислот от примесей. Патрон промывали 1000 мкл буфера (буфер рН2.2
+ 5% (ДМС). Анализ проводили на аминокислотном анализаторе A0326V2 (Knauer, Германия).
На колонку А0992-13vl наносили 20 мкл образца, разделение аминокислот проходило в
градиенте температуры и элюента по прописи, предлагаемой фирмой. Задание условий
хроматографирования, расшифровку хроматограмм по предлагаемому фирмой стандарту и
обсчет результатов проводили по специальной программе, прилагаемой к прибору.
4. Выделение иллудина из биомассы грибов проводили по методу [28], анализ этой
фракции проводили на хромато-масс-спектрометре Agilent 5975Inert (Agilent, США) на колонке
HP-5S.
2.5. Регистрация свечения мицелия грибов
Для
измерения
биолюминесценции
образцов
мицелия
использовали
кюветные
люминометры (модель БЛМ 8801 и модель БЛМ 8802) отечественного производства (СКТБ
«Наука», Красноярск, Россия), калиброванные по радиоактивному стандарту Гастингса-Вебера
(одна люминесцентная единица составляет 108 фотонов в 1 секунду). Люминесцентные сигналы
регистрировали с помощью самописца (модель 2210) фирмы «LKB» (Швеция). Для ряда
исследований использовали также планшетный люминометр (модель Luminoscan Ascent)
фирмы «ThermoElectron Co» (Финляндия).
Для
регистрации
спектра
люминесценции
гриба
N.
nambi
использовали
спектрофлуориметр (модель Aminco-Bowman, Series 2 luminescent spectrometer) фирмы Thermo
Spectronic (USA).
2.6. Влияние модельных токсикантов на биолюминесценцию грибов
В качестве модельных токсикантов использовали водные растворы солей, в том числе
тяжелых металлов: Na2WO4, NiSO4, CoCl2, (NH4)2MoO4, CrSO4, ZnSO4, Li2SO4, AlCl3, MnCl2,
CsCl, CdSO4*8H2O, SnCl2, HgCl2, ацетата свинца Рb(ОСОСН3)2, а также бензохинона,
фенантренхинона (PNQ), 5-амино-2-3 дигидро- 1,4-фталазиндиона (A-DHFD) и 1,2-нафтохинон4-сульфоновой кислоты (NQ-SA) в концентрациях 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, и 1 мг/мл.
Эксперименты по действию токсикантов проводили при наличии видимого свечения
мицелия грибов рода Armillaria, выращенных на агаризованной среде Сабуро при комнатной
температуре. Измерения проводили на кюветном люминометре БЛМ-8802 (Красноярск, СКТБ
Наука) и на планшетном люминометре Luminoscan Ascent «ThermoElectron Co», (Финляндия).
Кусочки агаризованной среды площадью около 3×3 мм2 с растущей светящейся культурой
грибов помещали в лунки планшета (куда предварительно для предотвращения высыхания
агара вносили 50 мкл стерильной дистиллированной воды), после чего измеряли исходную
интенсивность люминесценции. После добавления 200 мкл исследуемого вещества в лунки с
культурой повторно измеряли люминесценцию через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. В контрольных
вариантах вносили 200 мкл дистиллированной воды. Действие токсикантов на свечение
мицелия грибов N.nambi, выращенных при температуре 25-27оС на жидкой среде с
картофельным отваром, регистрировали после выдерживания мицелиальной пленки в
дистиллированной воде не менее 2 суток, чтобы создать условия стабильного высокого уровня
свечения.
Токсичность исследуемых растворов оценивали по величине биолюминесцентного
индекса (BI), который рассчитывали по формуле: BI=Io/Ik, где Io – нормированное
относительно исходного значение интенсивности свечения грибного мицелия в опыте, Ik –
нормированное относительно исходного значение интенсивности люминесценции грибного
мицелия в контроле. Нормированные значения рассчитывали по отношению к исходному
свечению. Растворы исследуемых веществ считали токсичными, если отклонение величины
биолюминесцентного индекса от 1 (нормированное значение контроля) превышало 20% .
Раздел 3. Изучение молекулярно-клеточного механизма биолюминесценции
грибов
3.1. Разработка оптимальной среды для поддержания стабильного и длительного
излучения грибных систем.
3.1.1. Отбор культур – кандидатов для применения в биолюминесцентных тест системах
Отбор, культур грибов для создания перспективных тест систем и биосенсоров включал
несколько этапов. На первом этапе критерием отбора было различимое, невооруженным глазом
свечение образцов мицелия или базидиом гриба (Рис. 3.1.1.).
Рис. 3.1.1. Культуры светящихся грибов при дневном свете и в темноте
На этом этапе из всех доступных источников было отобрано 11 культур (8 видов):
- из Коллекции культур базидиомицетов Ботанического Института им. В.Л. Комарова РАН,
Санкт-Петербург:
1043 Armillaria gallica - Пермская область, Россия
0350 A. mellea – Ленинградская область, Россия
0356 A. mellea – Минская область, Беларусь
0358 A. mellea – Богемия, Чешская республика
0918 A. mellea – Иркутская область, Россия
0491 Lampteromyces japonicus, Англия
- из частной коллекции Dao Thi Van (BIO-LUMI Co., Ltd., Ho Chi Minh City, Vietnam)
Omphalotus af. illudent – Провинции Бинь Фыок (Binh Phuoc) и Бинь Зыонг (Binh
Duong), Южный Вьетнам
- из Коллекции культур Института леса СО РАН (Красноярск)
Armillaria borealis.
- из образцов плодовых тел светящихся грибов собранных в экспедиционной поездке по
Южному Вьетнаму
Roridomyces roridus
Mycena sp.
Filoboletus manipularis
На втором этапе культуры сравнивали по интенсивности и продолжительности свечения
грибного мицелия. По этим параметрам культуры Armillaria borealis и Omphalotus af. illudent
имели наилучшие показатели. Таксономическое положение и фото базидиом этих видов в
естественных условиях даны на рисунках 3.1.2 и 3.1.3.
Царство:
Fungi
Отдел:
Basidiomycota
Класс:
Agaricomycetes
Порядок:
Agaricales
Семейство:
Physalacriaceae
Род:
Armillaria
Вид:
borealis
Armillaria borealis Marxm. & Korhonen
Рис. 3.1.2. Внешний вид и таксономическое положение гриба Armillaria borealis
Дереворазрушающий гриб Armillaria borealis (опенок осенний северный). Базидиомы
диаметром 2 − 8,5 см. от желтовато-коричневого до ярко-охристого цвета. Ризоморфы
дихотомически разветвленные до 3-5 мм в диаметре. Распостранен в Северной Европе,
Скандинавии, России. Встречается как на лиственных, так и хвойных деревьях. Часто является
возбудителем комлевой гнили растущих деревьев (англ. - butt rot): гниль, поражающая комель.
Сравнительно недавно выделен в обособленный вид. Ранее его рассматривали как
морфологический вариант гриба Armillaria mellea (Vahl: Fr.) Kumm. [29]. У данного вид, как и у
других представителей рода Armillaria, светится только мицелий в зоне роста (обычно это край
колонии). На агаровых средах колония растет относительно медленно. Линейная скорость роста
составляет в среднем 0,75 мм за сутки.
Царство:
Fungi
Отдел:
Basidiomycota
Класс:
Basidiomycetes
Порядок:
Boletales
Семейство:
Paxillaceae
Род:
Omphalotus
Вид:
af. illudent
Omphalotus af. Illudent
Рис. 3.1.3. Внешний вид и таксономическое положение гриба Omphalotus af.illudent.
Согласно описанию (Dao, 2002; 2006) плодовые тела гриба O. af. illudent встречаются на
стволах погибших деревьев гевеи (Hevea brasiliensi) в Южных провинциях Вьетнама.
Базидиомы этого вида белого цвета диаметром 2,5 – 5 см. Споровый порошок белого цвета.
Споры имеют яйцевидную форму 1,8-2 x 1,2-1,3 μ в диаметре. Свечение наблюдается в фазе
замедления или/и после прекращения роста. Светится и мицелий, и базидиомы (плодовые тела).
Максимальная интенсивность свечения отмечена на питательной среде, один литр которой
содержит 20 г глюкозы 50 г сухого дрожжевого экстракта, 1,6 мл 1N HCl и 15 г агара. Для
выращивания гриба Dao Thi Van [30,31] рекомендует использовать более богатые питательные
среды, приготовленные на основе дрожжевого сусла с добавлением глюкозы и пептона.
Линейная скорость роста мицелия на этих средах составляет 3-3,5 мм за сутки.
3.1.2 Уточнение таксономического положения культуры Omphalotus af. illudent
Культура светящегося дереворазрушающего гриба была выделена в 2002 году Дао Тхи
Ван и описана как Omphalotus af. illudent [30]. Её определение и описание было сделано по
краткому определителю Jean-Marie Polese, [32]. В доступной нам микологической литературе, а
также на специализированных сайтах Интернета нет описания вида, относящегося к роду
Omphalotus под таким видовым названием. Имеется описание вида со схожим названием:
Omphalotus illudens (Schwein.) Bresinsky & Besl. Для уточнения видовой принадлежности гриба
было проведено ДНК-типирование. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей
ДНК с сиквенсами баз данных выявило их 98 % совпадение с сиквенсами типовой культуры
Neonothopanus nambi (Speg.) R.H. Petersen & Krisai 1999 (синонимы: Agaricus nambi Speg., 1883;
Dendrosarcus nambi (Speg.) Kuntze, 1898; Pleurotus nambi (Speg.), 1887).
Проведенное с помощью кластерного анализа более детальное сравнение с другими
культурами и видами родов Omphalotus и Neonothopanus [33] показало тесную связь культур N.
nambi из Вьетнама Малайзии и Австралии. (рис. 3.1.4). Культура N. nambi из Пуэрто-Рико
попадает в тот же самый кластер, что и малазийская, австралийская и вьетнамская, но отстоит
от них на расстоянии, близком межвидовому внутри группы, включающей различные виды
рода Omphalotus. Это означает, что культуры из Юго-Восточной Азии отличаются от культуры
из Южной Америки.
Рис. З.1.4 Анализ сходства полученных клонов с представителями рода Omphalotus
Дополнительным биохимическим признаком, характеризующим принадлежность
культуры к роду Omphalotus является наличие в биомассе гриба иллудина [34,35]. Иллудин секвитерпен, продукт вторичного метаболизма, обладающий противоопухолевой активностью.
Содержание иллудина в грибах составляет от 60-70 мкг до 12 мг на грамм сырой биомассы. Для
выявления иллудина тестировали экстракты, как сухой, так и сырой биомассы плодовых тел
вьетнамского гриба, собранных Дао Тхи Ван в 2009 г. в природной среде обитания. В качестве
контроля использовали экстракты гриба Lampteromyces japonicus (штамм 0491 Коллекции
базидиомицетов БИНа) продуцента иллудина [28]. На хромато масс-спектрограмме спиртового
экстракта L. japonicus, подготовленного по методу Kanamori-Kataoka с соавторами
присутствуют пики со временем удержания 38,047 и 39,731 мин, соответствующие изомерам
иллудина S и M. На хромато масс-спектрограмме экстрактов вьетнамской гриба N.nambi пики с
таким временем удержания не обнаружены.
Таким образом, светящийся гриб, распространенный в южном Вьетнаме и описанный
ранее как Omphalotus aff. illudent [30,31], идентифицирован нами как Neonothopanus nambi
(Speg.) R.H. Petersen & Krisai 1999 (Рис. 3.1.5.).
Царство:
Fungi
Отдел:
Basidiomycota
Класс:
Agaricomycetes
Порядок:
Agaricales
Семейство:
Marasmiaceae
Род:
Neonothopanus
Вид:
nambi
Neonothopanus nambi (Speg.) R.H. Petersen & Krisai 1999
Рис. 3.1.5. Внешний вид и таксономическое положение гриба Neonothopanus nambi
3.1.3. Содержание основных компонентов в древесине гевеи и зольных элементов
базидиом гриба N. nambi
Вид N. nambi встречается в тропических лесах Южного Вьетнама, в основном на
погибших стволах гевеи (Hevea brasiliensi) иногда на древесине ореха кешью (Anacardium
occidentale) а также лагерстремии (Lagerstroemia spp.). Согласно литературным данным [36-38]
древесина гевеи, имеет типичный для лиственных пород качественный и количественный
состав биополимеров (Таб. 3.1.1).
Таблица 3.1.1
Содержание основных компонентов в древесине гевей (% на сухую массу)
Компонент
Содержание, %
Экстрактивные вещества
Зола
2,7-6,5
0,2 - 1,8
Древесина свободная от экстрактивных в-в
Целлюлоза
50 – 52,1
Лигнин
17,8 – 24,8
Нецеллюлозные полисахариды (гемицеллюлозы)
24 – 30,7
В составе нецеллюлозных полисахаридов:
Ксилоза
11- 22
Манноза
2-3,2
Галактоза
1,2-2
Арабиноза
0,2 -07
Рафиноза
0,4
Уроновые кислоты
1,5-3,4
Крахмал
6,3
Протеины
0,8
Состав экстрактивных веществ определяли методом хромато-масс-спектрометрии после
обработки образцов древесины спирт-хлороформной смесью. Из коры экстрагировалось 1,5 %,
а из древесины около 4,5 % органических соединений в пересчете на сухое вещество образца.
Экстракты содержали несколько функциональных групп химических соединений: жирные
кислоты, производные фенолов, терпены, фталаты, более 10 компонентов стероидного ряда, из
которых были идентифицированы стигмастерол, β-ситостерол, спинастерол и стигма-4-ен-3-он
Результаты анализа представлены в таблице 3.1.2.
Таблица 3.1.2
Состав спирт-хлороформенного экстракта коры и древесины гевее в % от суммы
Органическое соединение
Кора
Древесина
Фенольные соединения
11.5
34.68
Ванилин
1,08
1,00
Сквален
4,04
3,41
14:0
0,37
0,90
15:0
-
0,37
16:0
4,22
16,60
16:1
-
0,76
17:0
-
0,36
18:0
3,10
6,21
18:1
-
9,65
Сумма стеринов
74,99
26,06
Стигмастерол
40,53
10,49
β-Ситостерол
12,48
4,64
Спинастерол
1,75
4,07
Стигма-4-ен-3-он
5,70
0,34
из них:
Для изучения потребностей гриба в химических элементах было проведено определение
их содержания в древесине гевеи и биомассе базидиом, собранных непосредственно в ареале
распространения N. nambi. Результаты определения представлены в таблице 3.1.3.
Таблица 3.1.3
Содержание химических элементов в древесине гевее и биомассе базидиом гриба N. nambi
Объект
Макроэлементы, г/кг
Микроэлементы мг/кг
K
Na
Ca
Mg
Fe
Cu
Zn
Mn
Ni
Co
Cr
Древесина
7,92
0,05
1,77
0,55
68,68
3,38
33,63
82,05
0,77
0,04
2,48
Гриб
27,0
0,23
0,014
0,88
588,2
24,9
52,99
17,59
1,88
0,05
4,52
При сравнении минерального состава древесины гевеи, и биомассы базидиом гриба N.
nambi выявлено, что содержание калия, натрия, магния, железа, меди, никеля, кобальта и хрома
в биомассе гриба выше, а кальция и марганца ниже, чем в древесине. Содержание в биомассе
гриба калия, натрия железа и меди в несколько раз превышает их концентрацию в древесине
соответственно в 3,4; 4,6; 8,6 и 7,3 раза. В биомассе гриба наиболее высоким было содержание
калия, а из микроэлементов железа.
3.1.4 Подбор компонентов питательной среды для выращивания гриба N. nambi.
Для выращивания гриба N. nambi Dao Thi Van [30,31] рекомендует использовать
несколько питательных сред на основе дрожжевого сусла с добавлением глюкозы и пептона
(таб. 3.1.4)
Таблица 3.1.4
Среды для выращивания гриба N. nambi
Наименование и состав сред*
1
2
3
4
5
6
Картофельно-глюкозная среда
1. Отвар картофеля
2. Глюкоза
Среда Hamada (Н)
1. Глюкоза
2. Дрожжевой экстракт
3. HCl 1N
Количество
г / литр
200/1000 мл
20
20
5
1,6 мл
Глюкозо-пептонная среда
1. Глюкоза
2. Пептон
3. Дрожжевой экстракт
4. КН2PO4
5. MgSO4  7Н2O
20
5
3
1
0,5
Сусло с дрожжевым экстрактом (YM)
1. Глюкоза
2. Пептон
3. Дрожжевой экстракт
4. Экстракт сусла
10
5
3
3
Сусло с глюкозой и пептоном (М)
1. Глюкоза
2. Экстракт сусла
3. Пептон
2
20
1
Среда Ваксмана (Waksman's medium)
1. Глюкоза
2. Пептон
3. КН2PO4
4. MgSO4  7Н2O
20
5
1
0,5
*При выращивании гриба в чашках Петри к средам добавляют 20 г/л агар-агара.
Отмечается, что при относительно низкой интенсивности свечения максимальная
радиальная скорость роста мицелия (3,5 мм/сутки) наблюдается на агаровой среде-YM,
максимальный прирост биомассы мицелия на жидкой среде, включающей сусло, глюкозу и
пептон (среда-М). В противоположность этому, минимальная радиальная скорость роста гриба
и максимальная интенсивность свечения мицелия наблюдается на агаре Hamada (среда-Н).
Предположительно рост мицелия гриба, лимитируют минеральные компоненты калий, магний
или фосфор, поскольку содержание соединений углерода в среде-Н относительно высокое. На
связь между началом фазы лимитирования роста и биолюминесценцией указывают и другие
авторы. Например, W.L. Lingle [39] отмечает, что действие факторов, ограничивающих рост
гриба Panellus stripticus, провоцирует свечение мицелия одновременно с индукцией синтеза
грибных оксидаз в частности, Mn-зависимой лигнин пероксидазы. Эти наблюдения
показывают, что сбалансированный состав среды и обусловленный этим обильный рост
мицелия, скорее всего не будет способствовать длительному и устойчивому свечению. Поэтому
задача разработки среды была сведена к оптимизации условий индукции оксидаз и подбору
сахаров и их концентрации, обеспечивающих длительное и устойчивое свечение мицелия.
Состав сред, рекомендованных T.V. Dao [30,31], показывает, что для роста гриба
достаточно наличия в среде простых углеводов (глюкозы), солей фосфора, магния, калия и
азота в органической форме. Однако при наличии в среде компонентов (экстрактов сусла,
дрожжевого экстракта, пептона, картофельного отвара) со сложным, неопределенным составом
возникают трудности анализа экзометаболитов и действия стимулирующих рост гриба добавок.
Поэтому при составлении базовой среды для выращивания и экспериментов была выбрана
среда Ваксмана, в которой пептон заменили аспарагином, добавили соли натрия, калия и
кальция (с учетом содержания этих элементов в биомассе базидиом гриба), в качестве
индуктора биосинтеза оксидаз в состав среды включили аминокислоту фенилаланин.
Положительное влияние фенилаланина на свечение было выявлено в единичном эксперименте
при опудривании мицелия N. nambi на агаровой среде. Аналогичное действие на
биолюминесценцию гриба Panellus stypticus оказывает вератровый спирт [40].
Таким образом, окончательный вариант среды включал следующие компоненты (г/л):
KH2PO4 – 1; MgSO4  7 H2O – 0,5; Аспарагин моногидрат – 1; Калий лимоннокислый 3-х
замещенный – 0,5; NaCl – 0,1; CaCO3 – 0,1; Фенилаланин – 0,05; Углеводы – 20; Агар-агар – 20.
Данный состав среды использовали при определении влияния микроэлементов на рост мицелия
гриба.
3.1.5 Влияние добавок Fe, Cu и Mn на рост гриба N. nambi
Для изучения влияния микроэлементов на рост мицелия были отобраны железо, медь и
марганец. Тестирование проводили путем добавления элементов к среде с глюкозой (20 г/л) в
форме соответствующих сернокислых солей FeSO4, MnSO4 и CuSO4 в дозе 10 мг/л. Выбор этих
микроэлементов обусловлен их наибольшим содержанием в биомассе базидиом гриба, а также
с учетом их вовлеченности в процессы окислительной деструкции основных полимеров
древесины – целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнина [41]. Результаты тестирования представлены
на рисунке 3.1.6.
Cкорость роста мицелия, мм/сут
7
6
5
4
3
Б/Д
Fe
Cu
Mn
Mn+Cu
Mn+Cu+Fe
Микроэлементы, добавленные к основной среде
Рис. 3.1.6. Влияние добавок Fe, Cu и Mn на роста мицелия N. nambi на агаровой среде.
Обозначено: Б/Д – без добавок.
Полученные данные показывают, что предложенный состав среды без внесения добавок
обеспечивает более высокую радиальную скорость роста мицелия (Kr = 4,8), чем состав сред,
включающих пептон и экстракты сусла. Добавки ионов Cu и особенно Mn также ускоряют рост
мицелия. На средах с добавками Mn скорость роста мицелия достигала 6,2 мм/сут. С учетом
этого в основу среды был включен марганец в форме MnSO4. Оптимизированный вариант
базовой среды приведен в таблице 3.1.5.
Таблица 3.1.5
Состав базовой среды для выращивания культуры N. nambi.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Компоненты среды*
Содержание в
среде, г/л
KH2PO4
MgSO4  7 H2O
Аспарагин моногидрат
NaCl
Калий лимоннокислый 3-х замещенный
CaCO3
Фенилаланин
MnSO4
Углеводы
1
0,5
1
0,1
0,5
0,1
0,05
0,01
20 – 40
*При выращивании гриба в чашках Петри к среде добавляют 20 г / л агар-агара.
Этот вариант среды использовали при выращивания гриба N. nambi для изучения влияния
различных сахаров на его рост.
3.1.6. Рост гриба N. nambi на различных сахарах
При подборе основного источника углерода, используемого грибом для роста,
тестировали восемь сахаров: глюкозу, мальтозу, ксилозу, галактозу, арабинозу, трегалозу,
сахарозу и лактозу. При выборе сахаров ориентировались на химический состав древесины
гевеи. Результаты тестирования синтетической среды при добавлении 2% различных сахаров в
качестве основного источника углерода приведены на рисунках 3.1.7 - 3.1.8.
Лактоза
Галактоза
Ксилоза
Трегалоза
Арабиноза
С ахароза
Мальтоза
Глюкоза
4,0
4,4
4,8
5,2
5,6
6,0
6,4
Радиальная скорость роста мицелия, мм/сут
Радиальная скорость роста мицелия,
мм/сут.
Рис. 3.1.7. Рост мицелия гриба N. nambi на агаризованой среде с добавкой различных
сахаров (2 %).
6,4
Глюкоза
6,0
5,6
Сахароза
5,2
4,8
Лактоза
4,4
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Содержание сахара в среде, %
Рис. 3.1.8. Рост мицелия гриба N. nambi на агаризованой синтетической среде при различных
концентрациях глюкозы, сахарозы и лактозы.
Наибольшая радиальная скорость роста мицелия (Kr = 6,08 мм/сут) зафиксирована на
среде с добавлением глюкозы. Медленнее всего мицелий прирастал на среде с лактозой (Kr =
4,5 мм/сут). При увеличении концентрации сахарозы до 3 %, а лактозы до 3,5 % радиальная
скорость роста мицелия достигала максимальной величины соответственно 5,74 и 5,81 мм в
сутки, и приближалась к максимальной скорости роста мицелия на среде с глюкозой - 6,12
мм/сут при концентрации глюкозы 2,3 % (рис 3.1.8). Как правило, свечение мицелия
наблюдалось после полного зарастания чашки Петри. Мицелий на среде без добавок, или при
содержании глюкозы 2 - 5 г/л начинал светиться через 7-10 суток. При более высоком
содержании глюкозы свечение мицелия начиналось только через 2-3 недели. Свечение на чашке
можно было наблюдать в течение 1-3 недель, оно проявлялось в виде диффузных пятен, редко
светилась
вся
колония
целиком.
Интенсивное
свечение
сопровождалось
локальным
потемнением мицелия и образованием в глубине агара темно-коричневых областей (рис. 3.1.9).
При механическом повреждении мицелия (надрезе колонии) интенсивность свечения и
выделение экссудата в зоне надреза резко нарастали в течение 1-2 часов. Этот эффект
стимуляции свечения механическим повреждением мицелия после однократного воздействия
длился до 3-5 суток.
Рис. 3.1.9. Локальное потемнение мицелия и образование в глубине агара темнокоричневых областей (вид на дно чашки Петри)
Таким образом, синтетическая среда с аспарагином с добавлением фенилаланина и солей
марганца рекомендуется как базовая среда для выращивания мицелия светящегося гриба N.
nambi. Дополнительным подтверждением полноценности предложенной среды является
образование небольших (диаметром 1-1,5 см) плодовых тел (базидиом) в чашках Петри на
агаровой среде с добавлением сахарозы (рис. 3.1.10).
14-06-2009
15-06-2010
Рис. 3.1.10. Фотографии базидиом гриба N. nambi на агаровой среде с сахарозой. Цифрами
указаны даты образования плодовых тел.
3.1.7. Рост и биолюминесценция гриба N. nambi на богатых органических средах.
Для наращивания биомассы и поддержания культуры гриба N. nambi и, в отсутствии
достаточного количества естественных для данного вида субстратов, проведено апробирование
несколько вариантов относительно дешевых и легко доступных сред, на основе отвара
пшеничного зерна и молочной сыворотки. Для приготовления сред использовали разведенные в
несколько раз концентрированный отвар пшеничного зерна и молочную сыворотку, а также их
смеси в разных соотношениях. Результаты тестирования сред представлены на рисунке 3.1.11.
Радиальная скорость роста мицелия, мм/сут
8
7
6
5
4
100/0
80/20
50/50
25/75
10/90
0/100
Отвар зерна / молочная сыворотка в среде, %
Рис. 3.1.11. Рост мицелия гриба N. nambi на средах с различным соотношением молочной
сыворотки и отвара зерна
Наибольшая радиальная скорость роста мицелия (6,1 – 6,3 мм/сут) была отмечена в
вариантах, в которых доля сыворотки в среде составляла 50-90 %. Среда с таким соотношением
компонентов
обеспечивала
высокую
плотность
роста
мицелия
и,
равномерное,
не
спровоцированное механическим повреждением, свечение всего мицелия на многих чашках..
Интенсивное свечение сопровождалось локальным потемнением мицелия в виде опалин и
образованием в глубине агар-агара темно-зеленого экссудата, который со временем становился
темно-коричневым. Более интенсивное свечение и образование зеленого экссудата
происходило в месте надреза мицелия на агаровой среде. При помещении открытой чашки
Петри со зрелым мицелием во влажную камеру при температуре 28-29оС интенсивность
свечения резко увеличивалась. Период интенсивного свечения всей поверхности мицелия
продолжался 2-3 суток.
При использовании в качестве субстрата питательной среды с картофельным отваром
были получены похожие результаты. Принимая во внимание необходимость повторяемости
состава среды для экспериментов, предпочтение для дальнейших исследований было отдано
среде с картофельным отваром, поскольку она готовилась из одной партии картофеля, а
сыворотка не всегда доступна от одного источника.
Рост
3.1.8.
и
биолюминесценция
гриба
N.
nambi
на
различных
природных
лигноцеллюлозных субстратах
Первые успешные эксперименты по выращиванию плодовых тел (базидиом) гриба в
контролируемых условиях были проведены T.V. Dao [30,31,42]. Для культивирования гриба в
качестве субстрата использовались опилки гевеи. Для получения плодовых тел готовый
субстрат помещают в пластиковые мешки, стерилизуют в автоклаве, охлаждают, затем вносят
инокулят гриба в виде зернового мицелия. Засеянный субстрат инкубируют при температуре
27-29оС до полного зарастания субстрата мицелием в течение 20 суток. Еще в течение 20 суток
происходит созревание мицелия (рис. 3.1.12). После этого субстрат переносят в помещение с
температурой 24-26оС и относительной влажностью воздуха 85-90% и мешки открывают. После
удаления пленки с торцевой части блоков интенсивность и площадь свечения мицелия
(открытой части) возрастает. Интенсивное свечение наблюдается в течение 3-5 суток при этом
на поверхности открытой части субстрата образуется темно-бурая корка. Через 5-7 суток на
поверхности субстрата образуются небольшие 2-5 см в диаметре плодовые тела (рис. 3.1.12).
А
Б
В
Рис. 3.1.12 Фазы роста гриба N. nambi на опилках гевей. А - проросший мицелием субстрат в
пластиковых пакетах через 20 суток культивирования. Б - Свечение мицелия перед
вскрытием пакетов на 40 –вые сутки роста. В- Внешний вид базидиом гриба через 5 суток
после вскрытия пакетов [30,31,42].
Для изучения биолюминесцентной системы гриба оценивали возможность получения
плодовых тел в лабораторных условиях с использованием в качестве субстрата древесины
сосны, березы и осины. Контролем служили блоки с опилками гевеи, приготовленными при
участии и по технологии Дао Тхи Ван. Было проведено несколько последовательных серий
экспериментов, в которых оценивали: максимальную скорость зарастания субстрата мицелием;
максимальную площадь свечения открытой для газообмена с окружающим воздухом части
блока в первые сутки после освобождения торцевой части блока от пленки; продолжительность
периода интенсивного свечения. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.1.6.
Таблица 3.1.6.
Показатели роста и биолюминесценции гриба N. nambi на древесине гевеи, березы, осины и
сосны
Субстрат
(в виде опилок)
Максимальная
скорость зарастания
мицелием субстрата,
мм / сутки
Максимальная
площадь свечения
мицелия открытой
части субстрата,
%
Продолжительность
интенсивного
свечения,
сутки.
Гевея
Осина
Береза
Сосна
3,5
3
3
1,5
80-95
40-60
10-15
2-5
3-5
2-3
1-2
1-2
Экспериментальная оценка субстратов, приготовленных с использованием древесины гевеи,
осины, березы и сосны подтвердила, что древесина гевеи является наиболее подходящим
субстратом для роста и биолюминесценции гриба. Показатели максимальной скорости
зарастания (колонизации субстрата) и максимальная площадь свечения мицелия, свободной для
газообмена части блока соответственно составили 3,5 мм/сутки и 80-95 %. В процессе
тестирования субстратов было обнаружено образование летучих соединений. Их выделение и
осаждение на поверхностях в виде бурого налета интенсифицировалось одновременно с ростом
свечения мицелия после удаление пленки с торцевой части блока (Рис. 3.1.13).
Рис. 3.1.13. Бурый налет летучих соединений на алюминиевой фольге, размещенной над
открытой частью субстратного блока.
Плодовые тела гриба N. nambi удалось получить только при его выращивании в чашках
Петри на агаровой среде с добавлением сахарозы. Попытки инициировать плодоношение N.
nambi на других субстратах и в условиях твердофазного культивирования в пластиковых
мешках пока не увенчались успехом. Известные приемы инициации плодоношения понижение на 4-5оС температуры в камерах плодоношения (холодовой шок) или/и увеличение
относительной воздуха до 85-90% не дали результатов. В противоположность этому
плодоношение других видов дереворазрушающих грибов в частности вешенок (Pleurotus
sajorcaju), привезенных одновременно с культурой N. nambi, было обильным. При
выращивании гриба N. nambi на агаровых средах образование базидиом удалось наблюдать
только дважды, каждый раз в одно и тоже время года 14.06.2009 и 15.06.2010 (Рис. 3.1.9).
Вопрос о временной динамике люминесценции живых систем, является одним из ключевых для
создания биодатчиков, желательно дальнейшее изучение влияния внешних факторов на рост и
люминесценцию светящихся грибов.
Таким образом, при выращивании гриба N. nambi на различных средах можно отметить
следующие особенности:
1.
Мицелий гриба способен развиваться как на богатых органических средах, так и на
минимальных синтетических средах, включающих в качестве основного источника углерода
моно и дисахариды. На средах с добавлением пшеничного отвара и/или молочной сыворотки
плотность мицелия на 20 -30 % выше, чем при росте на базовой синтетической среде. При
обильном росте и ограниченном доступе кислорода на богатых органических средах
(молочной сыворотке, картофельном отваре и др.) может происходить выделение экссудата
зеленого цвета (предположительно хингидрона), который со временем темнеет (Рис. 3.1.14).
Рис. 3.1.14. Зеленый пигмент на агаровой среде с молочной сывороткой на чашках Петри и в
пробирках
2. Свечение мицелия наблюдается после прекращения роста мицелия. Мицелий в зоне
свечения покрывается темно-коричневым налетом (“копотью”). В результате свечения
происходит возгонка окисление и полимеризация, предположительно p-бензохинона. Стекло
в зоне свечения, также покрывается “копотью” (Рис. 3.1.15). При выращивании гриба на
лигноцеллюлозных субстратах бурая “копоть” оседает как на открытой поверхности
субстрата, образуя темно-коричневую корку, так и виде бурого налета на близь лежащих
поверхностях (Рис. 3.1.13).
Рис. 3.1.15. Темно-коричневые области у мицелия при выращивании в жидкой среде и на стекле
пробирок (зерновой мицелий).
3. При выращивании на чашках Петри (90 мм диаметром) свечение имеет пятнистый характер
(Рис. 3.1.16). Обычно 1- 2 небольшие 5-15 мм зоны свечения на одной чашке. Свечение
зон мицелия может продолжаться от 3-5 до 15-20 суток и более. На обогащенных
органикой средах (молочная сыворотка, картофельный, морковный отвары и др) может
светиться мицелий на всей поверхности среды чашки Петри.
Рис. 3.1.16. Рост и свечение мицелия N. nambi на агаровой среде
4.
При механическом повреждении мицелия (надрезе колонии) происходит инициация
свечения, которое развивается в течение 1-2 часов после воздействия и длится 3-5 суток. На
обогащенных органикой средах параллельно с высвечиванием в зоне надреза происходит
выделение зеленого экссудата.
В результате проведенных исследований особенностей роста и биолюминесценции
светящихся грибов были сделаны следующие выводы.
1. Из 11 культур (8 видов) светящихся дереворазрушающих грибов, выделенных из
природных мест обитания, а также полученных из музейных коллекций, перспективными для
создания люминесцентных тест-систем объектами проекта выбраны вид Armellaria borealis,
произрастающий в окрестностях Красноярска, и Neonothopanus nambi, предоставленный для
исследований Дао Тхи Ван и описанный первично ею как вид Omphalotus af. illudent. С
помощью методов генетического анализа и биохимических тестов вид переопределен как
Neonothopanus nambi (Speg.) R.H. Petersen & Krisai 1999.
Поскольку культура гриба вьетнамского происхождения имеет линейную скорость роста
примерно в 5 раз выше, чем культура A.borealis, а также принимая во внимание сроки
выполнения работ по проекту, окончательный выбор был сделан в пользу культуры
Neonothopanus nambi как основного объекта исследований при решении задач проекта.
2. Разработан состав синтетической (базовой) среды для выращивания гриба N. nambi и
изучения биолюминесценции, включающий минеральные соли, аспарагин, лимоннокислый
калий, фенилаланин и сахара. Базовая агаровая среда с глюкозой обеспечивает более высокую
радиальную скорость роста мицелия гриба (6,1 мм/сут) по сравнению с аналогом (3,5 мм/сут).
Полноценность предложенной среды подтверждает образование плодовых тел (базидиом) при
добавлении сахарозы. Предложены простые и доступные органические среды для хранения и
поддержания культуры N.nambi.
3. Среди нескольких относительно дешевых и легко доступных сред предпочтение
отдано среде с картофельным отваром, на которой хорошо развивается мицелий с высоким
уровнем свечения.
4. Зафиксированы ранее не отмеченные культуральные особенности роста гриба
N.nambi, предположительно связанные с механизмом свечения: образование зеленых
экссудатов при недостатке кислорода и выделение летучих соединений с образованием темного
налета на мицелии, субстрате и окружающих поверхностях.
3.2. Исследование условий выделения компонентов грибной биолюминесцентной системы
из мицелия и плодовых тел
3.2.1. Приготовление образцов.
Для исследований условий выделения компонентов биолюминесцентной системы, были
использованы образцы мицелия гриба Neonothopanus nambi, которые получали при
выращивании на твердых и жидких питательных средах. В экспериментах использовали также
сухие образцы мицелия и плодовых тел этого вида гриба, полученные после их высушивания
при температурах 30-35oС до постоянного веса. Для разрушения мицелия применяли:
растирание образцов на холоду (при +4oС) в водных и буферных растворах с нейтральным
значением рН, предварительное замораживание мицелия при -20oС (в морозильной камере) и 170oС (использование жидкого азота) с последующим растиранием в керамической ступке,
растирание с помощью гомогенизатора (система стекло-стекло), обработка образцов 5%-ным
раствором Тритона Х-100 (солюбилизация).
3.2.2.
Экспериментальная
оценка
возможности
выделения
компонентов
биолюминесцентной системы гриба N. nambi.
При выполнении комплекса биохимических исследований был получен ряд важных
результатов, имеющих принципиальное значение для развития представлений о структурнофункциональной организации и свойствах люминесцентной системы гриба N. nambi.
Экспериментально установлено, что свежевыращенные (как на твердых, так и на жидких
питательных средах) образцы мицелия гриба N. nambi обладают способностью длительной
светопродукции (рис. 3.3.2.1). Показано, что образцы, помещенные в кювету люминометра, в
начальный момент обладают низким уровнем свечения. С течением времени люминесценция
заметно увеличивается и может существенно превышать исходный уровень. При этом время
выхода люминесценции на максимальный уровень может составлять от 40 минут до 5 часов.
Возможно, наблюдаемый значительный подъем светопродукции связан с восстановительными
процессами, происходящими в мицелии после его механического повреждения в момент взятия
образцов для анализа.
Показано, что люминесцентная система N. nambi является кислород зависимой прокачивание кислорода или воздуха через кювету люминометра, содержащую образцы
мицелия, существенно повышает уровень люминесцентного сигнала. Удаление кислорода из
реакционной среды добавкой дитионита натрия или замещение его на газообразный азот
сопровождается падением светового сигнала до нулевого уровня. Последующее восстановление
газовой среды (барботаж реакционной системы кислородом или воздухом) приводит к
восстановлению светоизлучения. Показано, что использование системы реагентов Фентона
(Fe2+ и Н2О2) не оказывает стимулирующего действия на люминесцентную систему гриба.
Одновременные добавки в реакционную смесь Fe2+ (концентрации 1 мМ и 4 мМ) и Н2О2
(концентрация 20 мМ) не повышали уровень люминесценции. Не приводила к увеличению
светопродукции и добавка диэтилдитиокарбамата натрия в концентрации 1 мМ, как ингибитора
супероксиддисмутазы. Исходя из этого, на данном этапе исследований можно предполагать,
что изучаемая люминесцентная система, вероятнее всего, функционирует без участия
супероксид анион радикала и это отличает ее от люминесцентных систем светящихся грибов P.
stipticus, A. mellea, M. citricolor, P. japonicus, O. olearius, M. lux-coeli, описанных в работах О.
Шимомуры [24,26].
В то же время, показано, что люминесценция мицелия N. nambi стимулируется
добавками только перекиси водорода (концентрации 1 – 20 мМ), что может свидетельствовать в
пользу участия пероксидазы (или нескольких пероксидаз) в механизме светопродукции данного
вида гриба. Такая версия представляется правомочной, поскольку известно, что многие высшие
грибы содержат активно функционирующие лигнинолитические ферментные комплексы, в
состав которых входит несколько ферментов, обладающих пероксидазной активностью
[например, 43-47].
Показано, что ионы некоторых двухвалентных металлов влияют на люминесцентную
систему N. nambi. Интенсивность люминесценции мицелия повышается в 1.5 – 3 раза при
добавке ионов Mn в концентрации 10 - 40 мМ. Ионы Са при концентрациях 5 – 80 мМ
практически не оказывают действия на светоизлучение мицелия, а ионы Mg в концентрации 20
мМ понижают уровень люминесценции на 15-25%. Ионы Ni и Co в концентрации 10 мМ
снижают уровень люминесценции на 25-30% и 50-60% соответственно. Установлено, что
добавка ЭДТА в концентрациях 10 - 20 мМ заметно (в 2 – 3 раза) повышает уровень
люминесценции мицелия, вероятно, за счет связывания ионов двухвалентных металлов,
которые могут оказывать ингибирующее действие на люминесцентную систему. Механизм
обнаруженной стимуляции изучаемой люминесцентной системы ионами марганца можно
объяснить, если принять во внимание высказанную выше версию и допустить наличие в
составе лигниноразрушающего ферментного комплекса у данного вида гриба Mn-пероксидазы
(или пероксидаз). Известно, что пероксидазный комплекс высших грибов может содержать Mnпероксидазу
и
гибридную
Мn-пероксидазу
[48,49].
Данное
предположение
требует
дальнейшего исследования.
Обнаружено, что экстракты, полученные после разрушения мицелия N. nambi и удаления
обломков центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин, содержат активатор
люминесценции. Добавка аликвот полученного экстракта к образцам светящегося мицелия
повышает уровень их светопродукции на 1.5 – 2 порядка и более. Обнаруженным активатором
реакции может являться субстрат (или регулятор) люминесцентной системы N. nambi. Как
показали эксперименты, термообработка полученного активатора в течение 1 – 3 минут на
кипящей водяной бане не устраняет его стимулирующего действия. Предварительная обработка
экстрактов частицами детонационных наноалмазов (полифункциональный адсорбент для
связывания белковых и пептидных компонентов) также не устраняет его стимулирующего
действия. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что выявленный компонент
является низкомолекулярным термоустойчивым соединением. Обнаруженное соединение
может являться субстратом или регулятором люминесцентной системы изучаемого вида гриба.
Дальнейшие исследования будут направлены на выделение активатора и изучение его физикохимических свойств.
Получены принципиально важные результаты, свидетельствующие в пользу того, что
люминесцентная система N. nambi структурирована на клеточной мембране или в других
клеточных структурах. Их разрушение приводит к необратимой утрате способности гриба
светиться. При этом установлено, что момент дезинтеграции мицелия не сопровождается
излучением света. Установлено также, что свечение гомогенатов, полученных при разных
способах дезинтеграции мицелия, не удается восстановить кислородом, добавками ионов
марганца, ЭДТА, сменой буферных систем. Аналогичные результаты были получены с
образцами мицелия и плодовых тел гриба, предварительно высушенных при мягких
температурных условиях (30-35oС). Было показано, что сухие образцы мицелия и плодовых тел,
помещенные в воду или буферную систему с нейтральным значением рН, не восстанавливают
светоизлучающую способность.
3.3 Изучение клеточной организации биолюминесцентной системы грибов.
3.3.1. Морфология светящихся грибов Armellaria borealis.
В процессе роста гриба Armellaria borealis среда темнеет за счет выделения продуктов
метаболизма – некий темно-коричневый компонент поступает непосредственно в среду через
нижнюю часть мицелия и формирует капли на поверхности мицелия на границе раздела воздухмицелий (рис. 3.3.1.).
Рис. 3.3.1. Мицелий Armellaria borealis: (А) - на поверхности жидкой среды (Сабуро), возраст
культуры – 2 месяца, (Б) - капли окрашенного продукта на поверхности мицелия
При росте на твердой питательной среде Armellaria borealis формирует плотный мицелий,
темно-коричневый компонент также, как и в жидкой культуре, наблюдается на нижней
поверхности мицелия, контактирующей с питательной средой, и на верхней поверхности
контакта мицелия с воздушной средой (рис.3.3.2.)
Рис.3.3.2. Мицелий Armellaria borealis:(А) - на поверхности твердой среды (Сабуро), возраст
культуры – 20 дней, (Б) - капли окрашенного продукта на поверхности мицелия
3.3.2. Морфология светящихся грибов Neonothopanus nambi.
Светящиеся грибы Neonothopanus nambi при росте на жидкой среде без перемешивания
формируют мицелий на ее поверхности (рис.3.3.3.- 3.3.4.). В процессе роста в мицелии
формируются темные области, можно обнаружить образование мелких окрашенных капель
экссудата на поверхности, контактирующей с воздухом. По мере старения культуры,
наблюдалось увеличение зоны потемнения и количества капель экссудата.
Рис. 3.3.3. Мицелий Neonothopanus nambi при выращивании в стационарной жидкой среде
с картофельным отваром, 20 дней после посева
Рис. 3.3.4. Мицелий Neonothopanus nambi при выращивании в стационарной жидкой среде с
картофельным отваром, 2,5 месяца после посева
При выращивании на твердой среде с картофельным отваром, на ее поверхности
формируется колония с плотным ядром и многочисленными короткими гифами по периферии
(Рис. 3.3.5.)
Рис. 3.3.5. Колония Neonothopanus nambi при выращивании на среде с отваром картофеля,
20 дней после посева
При посеве Neonothopanus nambi на комбинированную среду (в центре – среда с
картофельным отваром, по периферии голодный агар) ядро колонии формируется слабо,
наблюдается быстрый рост гифов на поверхности сред разного состава, при этом скорость
распространения гифов не зависит от площади более богатой среды, расположенной в центре
(Рис. 3.3.6.).
Рис. 3.3.6. Формирование мицелия Neonothopanus nambi на комбинированной среде (в центре –
среда с картофельным отваром, по периферии голодный агар), 20 дней после посева.
3.3.3. Микроморфология светящихся грибов Neonothopanus nambi.
Для исследования микроморфологии мы использовали дикариотическую культуру,
выращенную из тканей плодового тела. При микроскопировании полученной мицелиальной
культуры обнаруживаются кольцевые структуры (Рис. 3.3.7.), а также пряжки (Рис. 3.3.8. ),
характерные для дикарионов базидиомицетов.
Рис. 3.3.7. кольцевые структуры и пряжки в культуре мицелия N.nambi
Рис. 3.3.8 пряжки в культуре мицелия N.nambi
На Рис. 3.3.9 можно видеть начальную стадию конидиегенеза.
Гифы мицелия различаются по толщине (Рис. 3.3.10), что характерно для рода Neonothopanus
Petersen & Krisai-Greilhuber [50]. Толщина гиф составила от 1,35 мкм до 4,93 мкм, размеры
пряжек были 4,57 – 4,84×2,3 – 2,91 мкм (Рис. 3.3.10 - 3.3.11).
Рис. 3.3.10
При
Гифы мицелия
электронно-микроскопическом
обнаружено
наличие
специфических
Рис. 3.3.11
исследовании
Гифы мицелия
соответствующих
«чашеобразных»
структур
на
выращенного на МЕА среде (Рис. . 3.3.12 - 3.3.13).
Рис. 3.3.12. «Чашеобразные» структуры на гифах мицелия
образцов
гифах
было
мицелия,
Рис. 3.3.13. «Чашеобразные» структуры на гифах мицелия
В образцах мицелия, выращенного на PDA, такие структуры отсутствовали. Роль данных
структур не выяснена, однако можно утверждать, что они не имеют отношения к свечению,
поскольку способность светиться сохраняет мицелий, выращенный на обеих средах.
3.3.4. Биохимический состав биомассы светящихся грибов Neonothopanus nambi.
Биомасса грибов, собранных в лесах Вьетнама и любезно предоставленная нам Дао Тхи
Ван, содержала небольшое количество общего азота – от 3 до 3,5 % от сухого вещества, что
соответствует содержанию 18-22 % в сухой биомассе «сырого протеина». Общее количество
аминокислот в биомассе грибов составило около 13 %. В составе аминокислот обнаружены
аспарагиновая кислота (1,35), треонин (0,81), серин (0,77), глютаминовая кислота (1,69), глицин
(0,75), аланин (0,94), валин (0,76), метионин (0,07), изолейцин (0,65), лейцин (1,03), тирозин
(1,74), фенилаланин (0,64), гистидин (0,69) и лизин (1,02) (Таблица 3.3.1). Данные приведены в
% от сухого вещества.
Таблица 3.3.1
Состав аминокислот биомассы Neonothopanus nambi, выращенной в естественных условиях
обитания (в % от сухого в-ва)
Кислота
Аспарагиновая кислота
Треонин
Серин
Глютаминовая кислота
Глицин
Результат
1,35
0,81
0,76
1,69
0,75
Аланин
Валин
Метионин
Изолейцин
Лейцин
Тирозин
Фенилаланин
Гистидин
Лизин
Сумма аминокислот
0,94
0,76
0,07
0,65
1,03
1,74
0,64
0,69
1,02
13,0
Содержание липидов в биомассе грибов, собранных в естественных условиях в течение
лета 2009 г. и высушенных на воздухе до сухого состояния, колебалось от 7,6 до 8,4 % от
сухого вещества. Омыляемая фракция, в состав которой входят свободные жирные кислоты и
кислоты ацилсодержащих липидов, составляла около 30 % от липидов или 2,4 % от сухого
вещества. Фракция неомыляемых веществ, представленная липидными компонентами, не
содержащими жирные кислоты, достигала 33 % от липидов или 2,6 % от сухого вещества. Для
идентификации
жирных
кислот
был
использован
метод
хромато-масс-спектрометрии
метиловых эфиров жирных кислот и ДМОК производных жирных кислот, последние позволяют
с большой достоверностью определить положение двойных связей в алифатической цепи. В
качестве примера приведены масс-спектры ДМОК производных основных изомеров линолевой
кислоты – 18:2ω6,8 и 18:2ω7,9 (рис. 3.3.14 и рис 3.3.15, соответственно).
Abundance
Scan3340(37.130min): DMOXBLAK.D\data.ms
126.1
14000
12000
10000
333.3
8000
6000
276.3
55.1
4000
182.1
81.1
2000
222.2
105.1
248.2
152.2
304.1
0
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
m/z-->
Рис. 3.3.14. Масс-спектр ДМОК производного 18:2ω6,8, идентифицирующими ионами
положения двойных связей в молекуле являются m/z 248 и 222.
A
bundance
S
can3553(39.270m
in): D
M
O
X
B
LA
K
.D
\data.m
s
126.1
45000
333.3
40000
35000
30000
25000
276.1
20000
15000
67.1
10000
182.1
222.2
95.1
5000
304.3
248.2
154.1
0
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
m
/z-->
Рис. 3.3.15. Масс-спектр ДМОК производного 18:2ω7,9; идентифицирующие ионы
положения двойных связей m/z 234 и 210
Состав жирных кислот липидов, выделенных из биомассы грибов, собранных в
естественных
условиях
обитания,
характеризовался
высоким
содержанием
изомеров
октадекадиеновой кислоты (18:2) (Таблица 3.3.1, Рис. 3.3.15.). Кроме линолевой кислоты,
положение двойных связей которой соответствует ω6,9; были идентифицированы 18:2 ω7,9;
18:2 ω6,8; 18:2 ω5,8; 18:2 ω5,7 в цис- и транс- форме. Относительное содержание этих изомеров
составляло более 40% от суммы жирных кислот. Доля линолевой кислоты не превышала 20 %.
Из насыщенных кислот были идентифицированы миристиновая (0,8 % от суммы ЖК),
пентадекановая (6,7 %), пальмитиновая (15,7%), гептадеценовая (0,8%), стеариновая (2,1%). В
небольших количествах обнаружены короткоцепочечные и длинноцепочечные (до 25 атомов
углерода) ЖК, общая доля которых не превышает 2 %. Среди моноеновых кислот найдены два
изомера С16 кислот - 16:1ω7 и 16:1ω5; два изомера С17 кислот –17:1ω9, 17:1ω8; два изомера
С18 кислот – олеиновая (18:1ω9) и вакценовая (18:1ω7). Их относительное содержание не
превышало 9 % в общем ЖК составе и основной, более 7%, была олеиновая кислота.
Полиеновые кислоты были представлены, кроме линолевой кислоты и ее изомеров, 16:2ω6,9 и
17:2ω5,8 и линоленовой кислотой - α-18:3, но содержание этих кислот было минорным. Нужно
отметить, что в составе жирных кислот определялись гидроксикислоты с различным
положением гидроксильных групп. Гидроксикислоты с бета-положением гидроксильных групп
являлись минорными компонентами и были найдены в ограниченном числе образцов. В
основном ОН – группы занимали положение 2 и среди них идентифицированы 2-ОНпальмитиновая и стеариновая (2-ОН-16 и 2ОН-18) кислоты, содержание которых в спектре
кислот не превышало 2-3% (Таблица 3.3.2). Синтез гидроксикислот часто обнаруживается в
базидомицетах. Чаще всего это связано с высокой липогеназной активностью грибов. Однако в
этом случае образуется серия гидроксикислот, производных линолевой кислоты, с положением
гидроксильных групп у 8 или 11 атомов углерода. Функциональная значимость 2- и 3-ОН
кислот пока не понятна, но они достаточно широко распространены среди базидомицет. Что
касается высокого содержания изомеров линолевой кислоты в липидах исследованных нами
грибов,
собранных
в
лесах
Вьетнама,
оставалось
непонятным,
связано
ли
это
с
таксономическими особенностями метаболизма жирных кислот гриба, или влиянием факторов
окружающей среды и способа фиксирования проб. Известно, что базидомицеты синтезируют
ограниченный набор жирных кислот и основной из них, более 50%, является линолевая
кислота.
Поэтому нами были проанализированы отдельно плодовые тела и мицелий, выросшие в
естественных условиях, и мицелий, выращенный в лабораторной культуре на двух средах –
картофеле и сыворотке.
Как следует из результатов таблицы 3.3.2., липиды из мицелия и плодовых тел,
выращенные в естественных условиях, но отобранные и зафиксированные в другие даты,
содержали значительно меньше изомеров 18:2 кислот, а линолевая кислота составляла около
40% от суммы жирных кислот. Кроме того, состав жирных кислот мицелия, выращенного в
лабораторной культуре, существенно зависел от среды (рис. 3.3.16 - 3.3.18). На картофельной
среде содержание линолевой кислоты было максимальным и составляло около 53 % от суммы
ЖК, а на сыворотке – основной ненасыщенной кислотой была олеиновая 18:1ω9. Во всех
пробах мицелия были обнаружены изомеры 18:2 кислот и 2-ОН-кислоты, но в существенно
меньших количествах. На данном этапе работы можно предположить, что исследуемые грибы
способны синтезировать изомеры линолевой кислоты, но интенсивность их синтеза зависит от
многих факторов, в частности, от условий выращивания.
Abundance
21.222
1.2e+07
TIC: MEFAGRIBDARK.D\data.ms
33.728
31.014
1e+07
29.646
34.868
17.944
8000000
29.794
6000000
29.020
4000000
15.522
2000000
26.178
21.863 24.929
11.554
5.00
10.00
34.378
32.631
25.85
22
7.557
15.00
20.00
25.00
30.00
41.029
40.798
35.00
40.00
51.138
58.592
45.258
45.00
50.00
55.00
Time-->
Рис. 3.3.16. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов Neonothopanus
nambi, выращенных в естественных условиях обитания
Abundance
TIC
:M
IC
G
R
IBSIV.D
\data.m
s
21.028
1.8e+07
29.558
1.6e+07
1.4e+07
15.415
29.073
1.2e+07
30.742
1e+07
8000000
6000000
11.380
4000000
17.644
7.593
21.596
2000000
16.819
19.082
4.760
5.00
10.00
15.00
29.818
24.593
23.156
25.524
20.00
25.00
34.496
40.578
32.292
36.990
30.00
35.00
40.00
50.781
45.00
50.00
55.00
Tim
e-->
Рис. 3.3.17. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов мицелия
Neonothopanus nambi, выращенного в лабораторных условиях на сыворотке
A
b
u
n
d
a
n
ce
T
IC
:M
IC
G
R
IB
P
O
T
.D
\d
a
ta
.m
s
3
0
.5
8
3
6
0
0
0
0
0
0
5
5
0
0
0
0
0
5
0
0
0
0
0
0
4
5
0
0
0
0
0
4
0
0
0
0
0
0
3
5
0
0
0
0
0
2
0
.6
0
0
3
0
0
0
0
0
0
2
5
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
1
5
0
0
0
0
0
2
9
.1
4
1
1
0
0
0
0
0
0
5
0
0
0
0
0
1
5
.3
2
71
7
.6
0
6
2
8
.5
5
0
2
1
.4
1
9
1
1
.3
6
2
5
.0
0
1
0
.0
0
2
9
.3
5
0
2
4
.4
9
6
1
5
.0
0
2
0
.0
0
2
5
.0
0
4
0
.5
6
4
3
3
.9
8
5
4
.3
9
2
3
2
.2
3
43
3
0
.0
0
3
5
.0
0
4
0
.0
0
4
5
.0
0
T
im
e
-->
Рис. 3.3.18. Ионная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов мицелия
Neonothopanus nambi, выращенного в лабораторных условиях на картофеле
Во фракции неомыляемых веществ из грибов, собранных в естественных условиях,
содержалось большое количество разнообразных компонентов, относящихся к фенольным
соединениям, стеринам, сесквитерпенам и ряду веществ, природа которых пока не понятна.
Стерины составляли 50-70 % в неомыляемой фракции и были представлены 9 компонентами,
среди которых идентифицированы эргостастерол (ergosta-5,8,22-trien-3-ol), производные
ланостана (lanostan-8-en-3-ol, 24-methylen). Эргостастерол являлся основным стерином
неомыляемой фракции и составлял основную долю стеринов – более 80%. Состав и содержание
остальных компонентов неомыляемой фракции существенно варьировали, поэтому для
окончательных выводов требуются дальнейшие исследования.
Таблица 3.3.2.
Состав жирных кислот липидов мицелия, плодовых тел грибов Neonothopanus nambi,
выращенных в естественных и лабораторных условиях
Объект
ЖК
Мицелий
картофель
Мицелий
сыворотка
Мицелий
ест.усл..
Плодов.тело
ест.усл.
Гриб
ест. усл.
Гриб
ест. усл.
8:0
9:0
10:0
12:0
3-ОН-10
13:0
И-14:0
14:0
14:1
3-ОН-12
Аи-15:0
И-15:0
15:0
15:1
И-16:0
16:0
16:1ω7
16:1ω5
Аи-17:0
И-17:0
И-17:1
16:2
17:0
17:1ω9
17:1ω8
И-18:0
17:2ω5,6
2-ОН-14
18:0
18:1ω9
18:1ω7
18:2ω6,9
19:0
19:1ω8
18:2ω5,8
18:3ω3
18:2ω6,8
18:2ω5,7
2-ОН-16
20:0
18:2ω7,9
20:1
20:2ω6
3-ОН-16
20:3ω6
21:0
22:0
2-ОН-18
23:0
24:0
25:0
Сл.
Н.о.
Сл.
Сл.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
1.31
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
1.34
Сл.
Н.о.
24.02
1.28
0.97
Н.о.
Н.о.
Н.о.
0.10
0.38
Сл.
0.23
Н.о.
Сл.
Н.о.
2.51
9.14
0.51
52.77
Н.о.
Н.о.
0.66
0.27
Сл.
Н.о.
1.19
Сл.
0.62
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Сл.
2.59
Н.о.
Н.о.
Н.о.
0.19
Н.о.
0.63
1.19
Н.о.
0.11
0.14
5.70
0.27
0.30
0.37
1.10
0.02
0.40
29.95
1.36
0.09
0.52
0.53
Н.о.
Сл.
1.03
Сл.
0.31
0.13
0.04
Н.о.
19.55
23.83
1.76
7.64
0.07
0.10
Н.о.
0.21
0.27
Н.о.
0.13
0.30
0.58
0.11
0.06
Н.о.
0.05
0.09
0.41
Сл.
0.17
0.31
Н.о.
Сл.
Н.о.
Сл.
0.17
Н.о.
Н.о.
Н.о.
0.85
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
4.13
Сл.
Н.о.
27.53
1.06
0.45
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Сл.
0.71
Сл.
Сл.
Н.о.
Сл.
Н.о.
4.16
10.45
1.66
39.99
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Сл.
4.44
Н.о.
Сл.
Сл.
Сл.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Сл.
Сл.
Н.о.
4.39
Н.о.
0.08
Н.о.
0.04
0.08
Н.о.
Н.о.
Н.о.
0.69
Н.о.
0.35
Н.о.
Н.о.
4.88
Сл.
Н.о.
18.62
0.70
0.19
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Сл.
0.64
0.11
Сл.
Н.о.
Сл.
Н.о.
2.74
6.20
2.01
44.15
Н.о.
Н.о.
1.55
0.13
2.01
1.40
0.51
Сл.
10.30
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Н.о.
Сл.
1.48
Н.о.
1.27
Н.о.
темный
0.01
0.02
0.02
0.06
0.01
0.02
0.03
0.61
0.03
0.15
0.67
0.22
4.80
0.37
0.07
18.82
0.95
0.19
0.11
0.02
0.03
0.14
1.32
0.46
1.45
Н.о.
0.06
0.02
4.09
10.45
2.63
12.35
Н.о.
1.24
2.44
Сл.
18.34
2.23
1.00
Сл.
11.18
Н.о.
0.07
0.06
Н.о.
Н.о.
0.21
1.15
0.23
0.98
0.71
светлый
0.01
0.02
Сл.
0.03
Н.о.
0.01
Н.о.
0.76
Н.о.
Н.о.
Н.о.
0.01
6.76
0.028
Сл.
15.47
0.74
0.24
Н.о.
Н.о.
Н.о.
0.03
0.78
0.36
0.04
Н.о.
0.07
2.08
7.72
1.53
19.37
Н.о.
Сл.
3.15
Сл.
23.02
1.85
0.78
Сл.
12.08
Н.о.
0.08
Н.о.
Н.о.
Н.о.
0.12
1.10
0.20
0.98
0.60
3.3.5. Поиск субстрата биолюминесцентной реакции
Кроме исследований общего биохимического состава биомассы грибов нами были
предприняты попытки поиска субстрата биолюминесцентной реакции. Известно, что ряд
светящихся грибов используют в реакции биолюминесценции иллудин – сесквитерпен
(sesquiterpene) с хорошо изученной структурой, для этого вещества опубликованы масс-спектры
и условия выделения. Нами была воспроизведена методика выделения и анализа органической
фракции, содержащей, возможно, этот сесквитерпен. Однако нами не было обнаружено это
соединение у N. nambi (Рис. 3.3.19). В качестве контроля воспроизводимости метода был
выбран мицелий светящегося гриба Lampteromyces japonicus, в котором ранее был обнаружен
иллудин. На хроматограмме этого гриба (Рис. 3.3.20) четко видны пики, масс-спектры которых
соответствуют иллудину S и M, но такие пики отсутствуют у светящегося гриба N. nambi (Рис.
3.3.19).
Abundance
TIC: GRIBILLUDINTLC.D\data.ms
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
Time-->
Рис. 3.3.19. Ионная хроматограмма фракции из Neonothopanus nambi, в которой предполагалось
наличие иллудина.
Abundance
TIC: JAPO
NIL.D\data.m
s
2400000
2200000
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
Tim
e-->
Рис. 3.3.20. Ионная хроматограмма фракции из гриба Lampteromyces japonicus, содержащего
иллудин S и М.
Таким образом, иллудин не является субстратом люминесценции у исследуемого гриба
N.nambi.
3.3.6. Состав питательных сред, используемых для выращивания культуры гриба N.
nambi
В литературе [51] имеются сведения о наличии в древесине разных пород различных
органических веществ (табл.3.3.3.)
Таблица 3.3.3.
Содержание органических веществ в древесине разных пород.
Органические вещества
гемицеллюлоза
Целлюлоза
Лигнин
зола
сосны
21,7
50,2
26,3
0,17-0,26
осины
21,2-30,4
49,4
18,1
0,26
березы
23,9-27,8
45,7
19,7
0,14-0,26
гевеи
29
50
17,8
0,82
Мы исследовали минеральный состав и некоторые компоненты, экстрагируемые
органическими растворителями, из коры и древесины гевеи – одного из природных субстратов
для роста люминесцирующих грибов N. nambi (Таблица 3.3.4.). Показано, что в коре
содержание макроэлементов (калий, натрий, кальций, магний) существенно выше, чем в
древесине, особенно кальция, концентрация которого в коре составляла 74 г/кг сух. в-ва, в то
время как в древесине – всего около 2 г/кг. Содержание таких микроэлементов, как железо,
цинк, марганец, свинец и кадмий, было в 2-4 раза выше в коре, чем в древесине, и составляло
для железа - 290 и 69 мг/кг, для цинка - 128 и 34 мг/кг, для марганца – 356 и 82 мг/кг, для
свинца – 2,3 и 1,5 мг/кг, для кадмия - 1,4 и 0,3 мг/кг, соответственно для коры и древесины.
Концентрации меди, никеля и кобальта отличались незначительно, а хрома – была выше в
древесине и составляла 2,5 мг/кг.
Изучены некоторые химические показатели гриба, биомасса которого собрана в лесах
его естественного обитания. Отмечено, что в биомассе гриба соотношение макроэлементов
существенно отличалось от его естественного субстрата – коры и древесины гевеи. Накопление
кальция в биомассе было минимальным и составляло всего 0,014 г/кг, в то время как
содержание калия было максимальным – до 27 г/кг сухого вещества, в коре и древесине эти
цифры были ниже - 16 и 8 г/кг, соответственно. Концентрации натрия и магния в биомассе
гриба были не уровне 0,2 и 0,9 г/кг и не существенно отличались от концентраций в субстрате.
Наблюдалось концентрирование в биомассе таких микроэлементов как железо – до 600 мг/кг,
меди – до 25 мг/кг, хрома – до 4,5 мг/кг по сравнению с субстратом. Однако содержание цинка,
марганца, свинца и кадмия в грибе было значительно ниже, чем в коре и древесине. Так
концентрация марганца была только на уровне 18 мг/кг, цинка – 53 мг/кг, свинца -0,5 мг/кг и
кадмия – 0,4 мг/кг (Таблица 3.3.4.).
Таблица 3.3.4.
Некоторые показатели химического состава коры и древесины гевее и гриба N. nambi,
собранного с гевеи в естественных условиях обитания
Объект
Показатели
Макроэлементы (г/кг):
Калий
Натрий
Кальций
Магний
Микроэлементы (мг/кг):
Железо
Медь
Цинк
Марганец
Никель
Свинец
Кобальт
Хром
Кадмий
Липиды (% от сух. в-ва)
Общий азот (%)
Кора
Древесина
Гриб
16,08
0,23
73,86
1,51
7,92
0,05
1,77
0,55
27,00
0,23
0,014
0,88
290,17
3,41
128,03
355,88
0,65
2,26
0,066
0,046
1,37
1,50
Н.д.
68,68
3,38
33,63
82,05
0,77
1,53
0,035
2,480
0,29
4,47
Н.д.
588,19
24,92
52,99
17,59
1,88
0,50
0,05
4,52
0,49
5,95
3-3,5
3.4. Изучение биофизических параметров грибной биолюминесценции.
3.4.1. Характеристика биолюминесценции гриба N. nambi
Выращенный на различных средах мицелий имел примерно одинаковый уровень свечения.
Выращивание его проводили в колбах и на чашках Петри на жидких средах и на чашках Петри
на агаризованной среде при температуре 25-27оС. Слабое свечение мицелия регистрировалось
на 7-14 день после посева, затем оно увеличивалось и продолжалось в течение одного-трех
месяцев и более на достаточно стабильном уровне.
Установлено (рис. 3.4.1), что биолюминесценция мицелия N. nambi может иметь
бифазный или монофазный характер, в зависимости от состава питательной среды,
применяемой для выращивания гриба. Можно предположить, что наблюдаемые различия могут
быть связаны с особенностями химического состава используемого субстрата и, как следствие,
возможными различиями в физиолого-биохимических свойствах полученных образцов
мицелия.
Показано,
что
образцы
свежевыращенного
мицелия,
помещенные
в
дистиллированную воду способны в течение длительного времени (более двух недель)
сохранять способность светопродукции. Установлено, что в данных условиях в течение первых
2-3-х суток уровень люминесценции мицелия существенно (до 2-3-х порядков) возрастает.
Рис. 3.4.1. Биолюминесценция образцов мицелия N. nambi, полученных при
выращивании на разных субстратах: А - опилки гевеи, Б - агар.
3.4.2. Спектр биолюминесценции гриба N. nambi
Установлено, что спектр люминесценции гриба N. nambi, зарегистрированный с помощью
спектрофлуориметра (модель Aminco-Bowman, Series 2 luminescent spectrometer) фирмы
(Thermo Spectronic, USA), располагается в видимой области в диапазоне длин волн от480 до 700
нм с максимумом 527-535 нм (рис. 3.4.2.). Эти данные хорошо согласуются с результатами ряда
зарубежных авторов [52-55], полученными при работе с другими видами высших светящихся
грибов. Основываясь на этих фактах, можно предполагать, что люминесценция всех известных
светящихся высших грибов имеет одинаковый максимум световой эмиссии в области 530 нм
(зеленый цвет). В свою очередь, это свидетельствует либо о сходстве эмиттеров
люминесценции у разных видов высших светоизлучающих грибов, либо о наличии в них
одного и того же эмиттера. Асимметричность спектра относительно максимума и его
протяженность в красную область за 700 нм требуют дальнейшего исследования.
Рис. 3.4.2. Спектр биолюминесценции мицелия N.nambi в условиях in vivo.
3.4.3. Оценка возможности использования светящихся грибов в биолюминесцентном
анализе
 Возможность использования грибов рода Armillaria
Проведено сравнение действия токсикантов органической и неорганической природы на
уровень свечения воздушного мицелия культур Armillaria borealis (табл. 3.4.1).
Таблица 3.4.1.
Культуры грибов, использованные в экспериментах
Наименование
Armillarea borealis
(Marxm. & Korhonen)
Номер штамма Место и год выделения
в Коллекции
3к-4
Красноярский край,
(2007)
Источник получения
Коллекция культур
ИЛ СОРАН:
В качестве модельных токсикантов использовали водные растворы солей, в том числе
тяжелых металлов: Na2WO4, NiSO4, CoCl2, (NH4)2MoO4, CrSO4, ZnSO4, Li2SO4, AlCl3, MnCl2,
CsCl, CdSO4*8H2O, SnCl2, HgCl2, ацетата свинца Рb(ОСОСН3)2, а также бензохинона,
фенантренхинона (PNQ), 5-амино-2-3 дигидро- 1,4-фталазиндиона (A-DHFD) и 1,2-нафтохинон4-сульфоновой кислоты (NQ-SA) в концентрациях 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, и 1 мг/мл.
Токсичность исследуемых растворов оценивали по величине биолюминесцентного индекса
(BI), который рассчитывали по формуле: BI=Io/Ik, где Io – нормированное относительно
исходного значение интенсивности свечения грибного мицелия в опыте, Ik – нормированное
относительно исходного значение интенсивности люминесценции грибного мицелия в
контроле.
Культуры выращивали на агаризованной среде Сабуро при комнатной температуре.
Эксперименты по действию токсикантов проводили при наличии видимого свечения мицелия.
Измерения проводили на планшетном люминометре Luminoscan Ascent «ThermoElectron Co»,
(Финляндия). Кусочки агаризованной среды площадью около 3×3 мм2 с растущей светящейся
культурой грибов помещали в лунки планшета (куда предварительно для предотвращения
высыхания агара вносили 50 мкл стерильной дистиллированной воды), после чего измеряли
исходную интенсивность люминесценции. После добавления 200 мкл исследуемого вещества в
лунки с культурой повторно измеряли люминесценцию через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. В
контрольных вариантах вносили 200 мкл дистиллированной воды. Нормированные значения
рассчитывали по отношению к исходному свечению. Растворы исследуемых веществ считали
токсичными, если отклонение величины биолюминесцентного индекса от 1 (нормированное
значение контроля) превышало 20% .
Предварительно нами был проведен эксперимент по кратковременному воздействию (3
минуты) растворов CuSO4 и бензохинона в концентрациях 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, и 1
мг/мл на свечение мицелия A. mellea (табл. 3.4.2). Минимальная концентрация бензохинона (106
мг/мл) вызывала уменьшение уровня свечения на 21% по сравнению с начальным в то время,
как трехминутное воздействие бензохинона в концентрации 1 мг/мл вызвало падение уровня
люминесценции на 73%. Воздействие раствора CuSO4 в концентрации 10-6 мг/мл приводило к
уменьшению люминесценции на 15%, а в концентрации 1 мг/мл к ее 67%-ому падению по
сравнению с начальным значением.
Таблица 3.4.2.
Величина остаточной люминесценции (в процентах) по истечении 3-х минут после добавления
токсичного вещества.
Токсичное
вещество
Бензохинон
CuSO4
1 мг/мл
27
33
Концентрация токсичного вещества (мг/мл)
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
мг/мл
мг/мл
мг/мл
мг/мл
мг/мл
35
42
63
65
74
52
58
88
67
81
10-6
мг/мл
79
85
Исследовано действие ряда органических и неорганических веществ в концентрациях от
10-5 мг/мл до 1 мг/мл на свечение культур A. borealis. Показано, что для определения
токсического действия растворов исследуемых веществ на свечение грибного мицелия
достаточно 5 мин экспозиции. Так, на рис.3.4.3 и 3.4.4 приведены данные по определению
биолюминесцентного индекса культуры A. borealis при воздействии на нее модельных
токсикантов в течение 5 (рис. 3.4.3) и 30 (рис. 3.4.4) минут. Как следует из приведенных на
рисунках данных, действие наиболее эффективных токсикантов проявляется уже после 5 минут
экспозиции, поэтому в дальнейшем мы не приводим данные, полученные для 10, 15, 20, 25 и 30
минут воздействия исследуемых растворов на культуры светящихся грибов.
1мг/мл
6
Биолюминсцентный индекс БИ
10^(-1)мг/мл
10^(-2)мг/мл
5
10^(-3)мг/мл
4
10^(-4)мг/мл
10^(-5)мг/мл
3
2
1
oC
l2
4)
2M
oO
4
C
rS
O
Pb
-a 4
ce
ta
te
Zn
SO
4
Li
2S
O
4
Al
C
l3
M
nC
l2
C
dS Cs
C
O
4* l
8H
2O
5S
am
nC
in
l2
on2H
be
3D
g
P
1,
he nz o Cl2
ih
2na
qu
yd
N
n
in
ro
ap
on
- 1 tre
ht
n
e
,4
ho
e
qu -Ph qui
no
in
t
h
on
ne
al
az
ein
4di
su
lf o one
ni
c
ac
id
O
4
C
iS
N
(N
H
N
a2
W
O
4
0
Рис.3.4.3. Нормированные значения свечения Armillaria borealis под воздействием токсикантов (5 мин).
Область, ограниченная пунктирными линиями, обозначает норму БИ=0,8-1,2.
6
1мг/мл
10^(-1)мг/мл
10^(-2)мг/мл
10^(-3)мг/мл
10^(-4)мг/мл
10^(-5)мг/мл
Биолюминесцентный индекс БИ
5
4
3
2
1
ro
-1
ne
ap
,4
qu
ht
-P
in
ho
ht
on
qu
ha
e
in
la
on
zi
nd
eio
4ne
su
lfo
ni
c
ac
id
l2
no
ne
N
1,
2-
5-
am
in
o2
-3
D
ih
yd
Ph
e
n-
na
nt
re
be
nz
o
qu
i
gC
l2
H
2O
Sn
C
l
sC
8H
C
l2
4
l3
nC
M
Al
C
4
2S
O
Li
SO
Zn
4
et
at
e
rS
O
C
O
4*
dS
C
(N
Pb
-a
c
oO
4
l2
4)
2M
oC
C
iS
O
4
N
H
N
a2
W
O
4
0
Рис. 3.4.4. Нормированные значения свечения Armillaria borealis под воздействием токсикантов (30 мин)
Культура A. borealis оказалась чувствительной к действию ионов металлов Mn, Cs, Pb, Cd и
Al. Растворы солей этих металлов в разных концентрациях стимулировали свечение мицелия
данной культуры, а растворы солей Co, Cr и низкие концентрации ацетата свинца его
ингибировали. Действие растворов органических веществ не было столь выраженным (рис.
3.4.3 - 3.4.4), при этом имели место как стимуляция, так и ингибирование свечения.
Стимуляция свечения растворами солей некоторых металлов и отдельными органическими
веществами может быть обусловлена особенностями метаболизма грибов. Так, клетками грибов
синтезируются ферменты – металлопротеины, в состав которых входят ионы металлов,
например, марганец-зависимые лигнинпероксидазы, а также лакказы и тирозиназы, в состав
которых входят одно- и двухвалентные ионы меди, а субстратами являются фенольные
соединения [56].

Возможность
использования
биолюминесцентном анализе.
мицелия
гриба
Neonothopanus
nambi
в
Проведен качественный анализ влияния различных токсикантов на люминесценцию
мицелия гриба N. nambi. Использованы растворы следующих токсикантов: 1,2-нафтохинон,
парабензохинон, пирокатехин, толухинон и газообразные аммиак, диэтиловый эфир,
углекислый газ.
Выбраны стандартные условия для получения стабильного свечения гриба, необходимого
для проведения работ по биотестированию. Мицелий гриба выращивается в течение 7-10 дней
на жидкой среде с картофельным отваром, затем отмывается водой, через 3-5 часов после этой
процедуры свечение стабилизируется. Кусочки мицелия гриба помещали в кювету
биолюминометра БЛМ-8802М. Измерения проводили при температуре 26оС. Интенсивность
люминесценции падала в течение 30-60 сек из-за интенсивного потребления мицелием
кислорода. Для стабилизации интенсивности люминесценции мицелия в кювету через иглу,
соединенную с насосом, подавался воздух для насыщения кислородом объема в измеряемой
кювете. Показано, что 1,2-нафтохинон в концентрации 1 мг/мл ингибировал люминесценцию
мицелия на 90%, а пары аммиака – на 50%.
Следует подчеркнуть, что в наших экспериментах был использован грибной мицелий,
выращенный на твердой питательной среде, а известные в литературе экспериментальные
данные получены с использованием глобулярного мицелия, выращенного в жидкой среде в
условиях глубинного культивирования. Светящийся грибной мицелий на твердофазном
носителе представляется предпочтительным тест-объектом при создании биотеста для
определения токсичности в воздушной среде. В то же время, использование агаровых блоков
оказалось не лишено недостатков, поскольку, с одной стороны, в процессе нарезания блоков
происходит нарушение структуры мицелия, с другой, они не могут быть использованы при
длительном мониторинге. Таким образом, необходим дальнейший поиск возможностей
создания твердофазного тест-объекта для создания биосенсоров с целью определения
токсичности не только в водной, но и воздушной среде.
Тем не менее, как следует из проведенных нами экспериментов, светящийся мицелий
грибов на твердофазном носителе может быть использован в качестве тест-объекта
биосенсоров. Более того, по чувствительности к воздействию модельных токсикантов
мицелиальные культуры исследованных грибов оказались близкими, а в некоторых случаях и
более чувствительными по сравнению со светящимися бактериями (табл. 3.4.3.).
Как известно, лиофилизированные светящиеся бактерии широко используются для
обнаружения токсикантов в водных источниках [57,58]. Бактериальный биолюминесцентный
биотест позволяет определить присутствие в пробах небольших количеств токсикантов (табл.
3.4.3.).
Таблица 3.4.3.
Чувствительность люминесценции светящихся бактерий и грибов к химическим веществам
Вещество
Чувствительность бактерий [59] Чувствительность грибов
HgCl2
2,7×10-8 мг/мл
10-5мг/мл
CuSO4
1,2×10-2 мг/мл
10-4-10-5мг/мл
ацетат свинца 10-3 мг/мл
По
10-5мг/мл
CoCl2
3×10-3 мг/мл
10-5мг/мл
MnCl2
5×10-2 мг/мл
10-3-10-5мг/мл
Бензохинон
4×10-8 мг/мл
10-5мг/мл
полученным
нами
данным
светящийся
грибной
мицелий
оказался
более
чувствительным по сравнению со светящимися бактериями к таким токсикантам, как CuSO4,
ацетат свинца, CoCl2 и MnCl2 и менее чувствительным к воздействию бензохинона и хлорида
ртути. Интересно отметить высокую чувствительность грибного свечения к присутствию солей
алюминия и отдельных грибов к растворам солей вольфрама и цинка.
Сравнение чувствительности люминесценции светящихся грибов и рекомбинантных
бактериальных люминесцентных биотестов к различным токсическим веществам показало, что
культура грибов A. mellea была более чувствительной к меди, чем бактериальные культуры P.
fluorescence 8866 и P. putida F1, в то время как культура гриба M. citricolor оказалась менее
чувствительной к этому токсиканту [9,12,13].
В
настоящее
время
несколькими
исследовательскими
группами
в
мире
предпринимаются попытки создания биосенсоров на основе светящихся грибов. Так,
бразильские исследователи использовали новый вид светящихся грибов Gerronema viridilucens
в качестве тест-объекта биосенсора [10,11,18]. Светящийся мицелий A. mellea и
Mycena
citricolor был использован в качестве тест-объектов британскими и новозеландскими
исследователями [9,12, 19]. При использовании биотестов на основе светящихся грибов для
определения токсичности фенолов и солей тяжелых металлов показано, что для светящихся
грибов падение люминесценции на 50 % (ЕС50) после действия фенолов и меди было того же
порядка, что и для бактериальных биотестов [19]. Известны успешные попытки получить
рекомбинантные светящиеся грибы для создания биосенсора на токсичность веществ [60].
Генетически модифицированные биолюминесцентные грибы Aspergillus awamori с геном
рекомбинантного экворина были использованы для определения изменения концентрации
ионов кальция под воздействием различных токсикантов [17].
Таким образом, проведенные нами эксперименты показали, что воздушный мицелий
светящихся грибов может быть использован в качестве тест-объекта биосенсора при
соответствующей адаптации к условиям измерений. Для экспресс-тестирования достаточно
воздействия токсикантов на светящийся мицелий в течение 5 минут. Результаты наших
экспериментов подтвердили и дополнили имеющиеся литературные данные о том, что
светящиеся грибы не уступают клеткам светящихся бактерий по чувствительности к
воздействию модельных токсикантов. Использование в качестве тест-объекта светящегося
грибного мицелия на твердофазном носителе является перспективным направлением
биотестрования, так как позволит использовать длительно светящийся тест-объект и проводить
непрерывный мониторинг воздушной среды.
Раздел 4. Научно-образовательный процесс.
Показана возможность использования биолюминесцентной системы N. nambi для
визуализации биохимических и биофизических процессов, что дает ряд очевидных
дидактических преимуществ при преподавании биохимии и биофизики в университетах.
В ИБФ СО РАН создана и поддерживается специализированная Коллекция культур
ИБСО (CCIBSO 836), содержащая 400 штаммов 4 видов природных морских светящихся
бактерий, рекомбинантные штаммы E.coli, несущие конструкции с lux-геном, а также культуры
5 видов светящихся грибов, произрастающих в России, Беларуси, Вьетнаме. Сотрудниками
разрабатывается информационная система Коллекции Культур ИБСО. Она включает Вэб портал «Биолюминесценция и светящиеся организмы», электронную Коллекцию ИБСО и
прикладные программы для администрирования информационной системы. Информационнообразовательный Вэб-портал «Биолюминесценция и светящиеся организмы» [61] является
единственным русскоязычным ресурсом (с параллельной англоязычной версией), который
представляет сведения по общим вопросам биолюминесценции, о различных светящихся
организмах, особенностях организации клеток и люминесцентных систем, ссылки на
публикации и полезные ресурсы интернета, а также информацию об исследовательских
группах, занимающихся изучением биолюминесценции. Студенты, аспиранты СФУ и другие
пользователи сети имеют свободный доступ к выставленной на портале информации и широко
используют представленные ресурсы при выполнении и написании курсовых, дипломных,
магистерских
и
аспирантских
работ,
затрагивающих
проблемы
биолюминесценции.
Полученные в ходе проекта данные также будут представлены в соответствующем разделе
портала.
Раздел 5. Достижение Программных индикаторов
В таблице 5.1. представлены основные Программные индикаторы, достигнутые в ходе
выполнения 1 и 2 этапов настоящего проекта.
Таблица 5.1.
Программные индикаторы по проекту
Индикатор
Обозн.
И.1.1.1
И.1.1.2
И.1.1.3
И.1.1.4
П.1.1.1
П.1.1.2
Наименование
Количество кандидатов наук –
исполнителей НИР, представивших
докторские диссертации в
диссертационный совет (нарастающим
итогом)
Количество аспирантов – исполнителей
НИР, представивших кандидатские
диссертации в диссертационный совет
(нарастающим итогом)
Количество студентов, аспирантов,
докторантов и молодых исследователей,
закрепленных в сфере науки, образования
и высоких технологий (зачисленных в
аспирантуру или принятых на работу в
учреждения высшего профессионального
образования, научные организации,
предприятия оборонно-промышленного
комплекса, энергетической, авиационнокосмической, атомной отраслей и иных
приоритетных для Российской
Федерации отраслей промышленности) в
период выполнения НИР (нарастающим
итогом)
Количество исследователей –
исполнителей НИР, результаты работы
которых в рамках НИР опубликованы в
высокорейтинговых российских и
зарубежных журналах
Количество докторов наук –
исполнителей НИР, работающих в
научной или образовательной
организации на полную ставку,
принявших участие в работах в течение
всего срока реализации НИР
Количество молодых кандидатов наук –
исполнителей НИР, работающих в
Требование Задания
Дости
гнуто
к
начал
у
этапа
Приращ
ение на
отчетно
м этапе
Выпо
лнен
ие
нарас
тающ
им
итого
м на
коне
ц
отчет
ного
этапа
Ед.
изм.
Знач
ение
Срок
достижен
ия
чел.
0
15.11.2010
0
0
0
чел.
1
15.11.2010
0
1
1
чел.
5
15.11.2010
31
6
37
чел.
5
15.11.2010
5
18
23
2
15.11.2010
6
0
6
чел.
П.1.1.3
П.1.1.4
П.1.1.5
П.1.1.6
научной или образовательной
организации на полную ставку,
принявших участие в работах в течение
всего срока реализации НИР (как
правило, соискателей ученой степени
доктора наук)
Количество аспирантов, принявших
участие в работах в течение всего срока
реализации НИР
Количество студентов, принявших
участие в работах в течение всего срока
реализации НИР
Доля привлеченных на реализацию НИР
внебюджетных средств от объема средств
федерального бюджета
Доля фонда оплаты труда молодых
участников НИР (молодых кандидатов
наук, аспирантов и студентов) в общем
объеме фонда оплаты труда по НИР
чел.
чел.
чел.
3
1
4
15.11.2010
6
4
10
15.11.2010
16
3
19
15.11.2010
40
0
40
15.11.2010
50
50
50
3
15.11.2010
3
4
%
20
%
50
В этом разделе даны комментарии к этой таблице.
И.1.1.1. На 1 и 2 этапе выполнения проекта кандидатами наук – исполнителей НИР не
было запланировано и представлено докторских диссертаций в диссертационный совет.
И.1.1.2. Ц.6.2. Белогуровой Надеждой Валентиновной была защищена кандидатская
диссертация
по
теме.
"СПЕКТРАЛЬНО-ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ
АНАЛИЗ
Са2+РЕГУЛИРУЕМЫХ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ РЕАКЦИЙ ФОТОПРОТЕИНОВ" 23 сентября
2010 года в Ученом совете МГУ им.М.В. Ломоносова по специальности «Биофизика». Таким
образом план по этому показателю выполнен.
И.1.1.3. Количество студентов, аспирантов, докторантов и молодых исследователей,
закрепленных в сфере науки, образования и высоких технологий (зачисленных в аспирантуру
или принятых на работу в Научно-исследовательскую часть СФУ, Институт фундаментальной
биологии и биотехнологии СФУ, Институт биофизики СО РАН и другие учреждения в период
выполнения НИР представлено в списке исполнителей Приложения 21, а также в Приложении
19а. В 2010 году запланирован показатель 5, который значительно превышен уже на первом
этапе (показатель - 31 человек), а на втором этапе выполнения проекта добавилось еще 8
человек.
И.1.1.4. Количество исследователей – исполнителей НИР, результаты работы которых в
рамках НИР опубликованы в высокорейтинговых российских и зарубежных журналах (1 этап -5
исполнителей, 2 этап – 18, нарастающим итогом – 23) подсчитывалось на основании
публикаций, выполненных как по теме этап 1 (21 публикация), так и по теме этапа 2 (1
публикация), но распределение проводили по временным интервалам этапов:
Этап 1:
1.
2.
3.
Kratasyuk V., Esimbekova E., Nemtseva E., Sviderskaya I., Sukovataya I. Models of
enzymes’ functioning inside the luminous bacteria: new approach // J. of Luminescence,
V.25 N 2, 2010, p. 196-197.
Sukovataya I.E., Kratasyuk V.A., Buka N.S. Effect of pH of reaction media on kinetic
parameters of coupled enzyme system NADH:FMN-oxidoreductase-luciferase in solvents
of increased viscosity // J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.188-189.
Sukovataya I.E., Kratasyuk V.A., Buka N.S. A comparative kinetic study of
bioluminescence reaction of luciferase from Ph.leiognathi and V.harveyi in solvents
changed the dielectric permittivity // J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.189-190.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Esimbekova E., Anna Kondik, Kratasyuk V. Bioluminescent module of biosensor for
ecological bioassay // J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.194-195.
Esimbekova E., Bezrukikh A., Orlova A., Kratasyuk V. Еnzyme-based bioluminescent
biosensors: mechanisms of biological module stabilization // J. of Luminescence, V.25 N 2,
2010, p.195-196.
Nemtseva E.V., Gulnov D.V., Esimbekova E.N. Kratasyuk V.A. Fluorescence of the
components of bacterial bioluminescent reaction in viscous media: a model of in vivo
conditions // J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.193.
Hu E., Bartsev S.I., Liu H. Conceptual design of a bioregenerative life support system
containing crops and silkworms. Adv. Space Res.- 2010.- v.45,- P.929-939.
Kudryasheva G. A., Nemtseva E.V. Effect of halogenated anthracenes on bacterial
bioluminescent reaction // Luminescence 2010, V.25, P. 197-198.
Kudryasheva NS, Kirillova TV, Vasyunkina EV. Classification of effects of Exogenous
compounds on Bioluminescent Assay Systems. Luminescence, V.25, N2, P.151-152.
M. Alexandrova, T. Rozhko, G.Badun, L.Bondareva, G.Vydryakova, A.Bolsunovsky,
N.Kudryasheva. Effect of Tritium on Growth and Luminescence of P.Phosphoreum.
Luminescence, V.25, N2, P.125-126.
11.
Nemtseva E.V., Gulnov D.V., Gerasimova M.A. Photophysical characteristics of
flavinmononucleotide in viscous media // Luminescence 2010, V.25, P. 191-192.
12.
Tarasova AS, Fedorova ES, Kudryasheva NS. General and oxidative toxicity of oxidizer in
the presence of humic substances. Bioluminescent monitoring. Luminescence, V.25, N2,
P.136-137.
13.
N. Belogurova, N. Kudryasheva. Discharged Photoprotein Obelin: Fluorescence
Peculiarities. J.Photochem.Photobiol.B, V.101 (2010) 103–108.
NV Belogurova, NS Kudryasheva. Fluorescence Characteristics of Discharged
Photoprotein Obelin. Luminescence, 2010, V.25, N2, P.135.
M. Alexandrova, T. Rozhko, G.Badun, L.Bondareva, G.Vydryakova, A.Bolsunovsky,
N.Kudryasheva. Effect of Tritium on Growth and Luminescence of P.Phosphoreum.
Luminescence, 2010, V.25, N2, P.125-126.
Tarasova AS, Fedorova ES, Kudryasheva NS. General and oxidative toxicity of oxidizer in
the presence of humic substances. Bioluminescent monitoring. Luminescence, 2010, V.25,
N2, P.136-137.
Kudryasheva NS, Kirillova TV, Vasyunkina EV. Classification of effects of Exogenous
compounds on Bioluminescent Assay Systems. Luminescence, 2010, V.25, N2, P.151-152.
N. Belogurova, N. Kudryasheva. Fluorescence Percularities of Discharged Photoprotein
Obelin. Luminescence, 2010, V.25, N3, P.242-243
M. Alexandrova, T. Rozhko, N.Kudryasheva, G.Vydryakova, A.Bolsunovsky. Effect of
Americium-241 on luminous bacteria. Luminescence, 2010, V.25, N3, P.241-242.
T.Kirillova, M.Gerasimova, N.Kudryasheva. Effect of halogenated fluorescent compounds
on bioluminescent reactions. Luminescence, 2010, V.25, N3, P.265-266.
T. Rozhko, G.Vydryakova, A.Kuznetsov, L.Bondareva, A.Bolsunovsky, N.Kudryasheva.
Comparison of bioluminescent assay systems for monitoring radioactive toxicity.
Luminescence, 2010, V.25, N3, P.267-268.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Этап 2:
1.
Vydryakova G.A., Bissett J., Psurtseva N.V., Shoukouhi P., Dao T.V., Gitelson J.I.
Presence of the luminous mushroom Neonothopanus nambi (Speg.) R.H. Petersen & Krisai
in South Vietnam Luminescence 2010; 25: (81–216) 187-188
П.1.1.1 Количество докторов наук – исполнителей НИР, работающих в научной или
образовательной организации на полную ставку, принявших участие в реализации НИР не
изменялось, начиная с 1 этапа выполнения проекта. В выполнении проекта участвуют
академик, д.м.н., проф. И.И. Гительзон, д.б.н., проф. В.А .Кратасюк, д.ф.-м.н., проф. П.И.
Белобров, д.ф.-м.н., проф. Н.С. Кудряшева, д.ф.-м.н. С.И .Барцев, д.б.н. В.С. Бондарь.
П.1.1.2. Количество молодых кандидатов наук – исполнителей НИР, работающих в
научной или образовательной организации на полную ставку, принявших участие в работах по
этапу 1 -3, по этапу 2 – 4:
1.
Пуртов К.В., к.б.н., н.с. Института биофизики СО РАН
2.
Немцева Е.В., к.ф-м.н., доцент кафедры биофизики Института фундаментальной
биологии и биотехнологии СФУ
3.
Комаров В.А., к.т.н., доцент Института космических и информационных
технологий СФУ
4.
Белогурова Н.В., к.х.н., н.с. Института биофизики СО РАН
П.1.1.3, Ц.6.1. Количество аспирантов, принявших участие в работах в течение всего
срока реализации НИР в сумме составляет 10 человек. 6 аспирантов начали работу по этапу 1 и
далее к ним присоединилось еще 4 аспиранта.
Это аспиранты СФУ В.О. Шеходанов, М.А. Александрова, О.А. Вшивкова, И.А.
Денисов, А.А.Трухин, А.С. Тарасова, Н.В. Шманько, Д.В. Гульнов и аспиранты Института
биофизики СО РАН В.В. Зыков и
Н.О. Ронжин
П.1.1.4. В выполнении работ по проекту активное участие, в основном, приняли студенты 2-5
курсов и магистранты кафедры биофизики ИНФиБТ СФУ (16 студент на этапе 1, на этапе 2
добавилось 3 студентов). Списки студентов приведены в Приложениях 21 и 19а.
П.1.1.5. На реализацию НИР на первом этапе выполнения проекта было привлечено 20%
внебюджетных средств от объема средств федерального бюджета по гранту Американского
фонда поддержки гражданских исследований (CRDF), № RUX0-002-KR-06/BP4M02
«Биолюминесцентные биосенсоры для экологического мониторинга: стабилизация
биологического модуля».
П.1.1.6 Доля фонда оплаты труда молодых участников НИР (молодых кандидатов наук,
аспирантов и студентов) в общем объеме фонда оплаты труда по НИР составила 50%. При этом
следует учитывать, что дополнительно часть студентов принята на работу в Научноисследовательскую часть СФУ на должности лаборантов и инженеров для выполнения
исследований по гранту № 2.2.2.2/5309 Министерства образования и науки РФ, Федеральное
агентство по образованию, Аналитическая ведомственная целевая программа «Развитие
научного потенциала высшей школы», проект «Моделирование процессов функционирования
сопряженных ферментативных систем в клетке на примере ферментов светящихся бактерий».
ИР 1.1.1 Разработка УМК в рамках НИР в 2010 году не была запланирована
ИР 1.1.2 Разработка новых образовательных программ бакалавриата в рамках НИР 2010
года не была запланирована.
ИР 1.1.3 Количество разработанных образовательных программ магистратуры в рамках
НИР- 4, хотя и не были запланированы в 2010 году.
Это 2 магистерские программы по направлению «Физика»: «Биофизика» и «Человек и
окружающая среда: основы контроля и надзора», магистерская программа по направлению
«Экология и природопользование»: «Устойчивое развитие и экологическая безопасность» и
магистерская программа для Университета Шанхайской организации сотрудничества,
сделанная по стандартам 3 поколения «Устойчивое развитие и экологическая безопасность».
ИР 1.1.5 Количество разработанных образовательных программ дополнительного
образования в рамках НИР - 2.
Под руководством д.б.н., профессора Кратасюк Валентины Александровны были
разработаны для Открытого внутреннего конкурса Сибирского федерального университета на
реализацию краткосрочных дополнительных образовательных программ повышения
квалификации профессорско-преподавательского состава вузов России по направлению:
«Проблемы формирования единого инновационного пространства СФУ» 2 программы:
1. «Аспекты инновационной деятельности преподавателя ВУЗа». В мае 2010 года по
программе были проведены занятия для группы преподавателей разных вузов России»
2.
«Научно-образовательная деятельность преподавателя в автономном ВУЗе»
ИР1.1.6. Количество изданных (подготовленных) монографий, учебников и учебных
пособий по результатам выполнения НИР – 0, так как не было запланировано.
ИР 1.1.7. Количество подготовленных и опубликованных статей в высокорейтинговых
российских журналах по результатам выполнения НИР –нет в связи с длинными сроками
принятия публикаций в российские журналы не было запланировано в 2010 году
ИР 1.1.8. Количество подготовленных и опубликованных статей в высокорейтинговых
зарубежных журналах по результатам выполнения НИР - см. список публикаций по пказателю
И 1.1.4. За период выполнения первого этапа опубликована 1 статья, на втором этапе -21
статья.
ИР 1.1.9. Количество сделанных докладов на всеросийских конференциях и семинарах по
результатам выполнения НИР: 1 этап -13, 2 этап -3
Список и докладов конференций включает:
1) Всероссийская научно-методическая конференция и выставка « Повышение
качества высшего профессионального образования», Россия, Красноярск, 15 октября 2010
г.
Кратасюк В.А. «Мировые тенденции в подготовке научно-исследовательских кадров
высшей квалификации» (пленарный доклад). (пленарный доклад).
2) Всероссийская научная конференции с международным участием «Гуминовые
вещества в биосфере», Санкт-Петербург, 1-4марта 2010г
Тарасова А.С., Кудряшева Н.С. Изучение процессов детоксикации гуминовыми
веществами растворов металлов переменной валентности на примере феррицианида калия.
Труды всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые
вещества в биосфере». Санкт-Петербург 1-4марта 2010г. Издательский дом С.-Петербургского
гос.ун-та, 2010. ISBN 978-5-288-05010-7. с. 350-355.
3) XVI Всероссийская научная конференция студентов физиков и молодых ученых
ВНКСФ-16, г.Волгоград, 2010 г.
Безруких А.Е., Термостабильность и термоинактивация биферментной системы
НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в желатине. Получен диплом за лучший доклад
среди студентов младших курсов. Тезисы Всероссийской научной конференции студентов,
аспирантов и молодых ученых физиков ВНКСФ – 16 Г. Волгоград
Орлова А.В., Стабилизация многокомпонентного иммобилизованного реагента для
биолюминецентного анализа. Тезисы Всероссийской научной конференции студентов,
аспирантов и молодых ученых физиков ВНКСФ – 16 Г. Волгоград
4) Межвузовская региональная научная конференция студентов, аспирантов и
молодых учёных-физиков НКСФ-XXXIX, Красноярск, 13-17 апреля 2010г
Безруких А. Е. Термоинактивация би-ферментной системы НАДН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза в желатине.
Бука Н.С. Кинетика бактериальной биферментной биолюминесцентной системы в
вязких средах.
Сутормин О. С. Влияние глицерина и са-харозы на стабильность сопряженной
ферментативной системы NAD(P)H:FMN- ок-сидоредуктаза-люцифераза.
Тарасова А. С. Изучение влияния гуминовых веществ на общую и окислительную
токсичность растворов окислителя.
ИР 1.1.10. Количество сделанных докладов на международных конференциях и семинарах
по результатам выполнения НИР; 1 этап -23, 2 этап -14
Список конференций и докладов включает:
1) 16th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April
2010, Lyon, France
Sukovataya I.E., Kratasyuk V.A., Buka N.S. Effect of pH of reaction media on kinetic
parameters of coupled enzyme system NADH:FMN-oxidoreductase-luciferase in solvents of increased
viscosity // Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence &
Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.188189.
Sukovataya I.E., Kratasyuk V.A., Buka N.S. A comparative kinetic study of bioluminescence
reaction of luciferase from Ph.leiognathi and V.harveyi in solvents changed the dielectric permittivity
// Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23
April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.189-190.
Kratasyuk V., Esimbekova E., Nemtseva E., Sviderskaya I., Sukovataya I. Models of
enzymes’ functioning inside the luminous bacteria: new approach // Abstracts of the 16th International
Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of
Luminescence, V.25 N 2, 2010, p. 196-197.
Esimbekova E., Anna Kondik, Kratasyuk V. Bioluminescent module of biosensor for
ecological bioassay // Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence &
Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.194195.
Esimbekova E., Bezrukikh A., Orlova A., Kratasyuk V. Еnzyme-based bioluminescent
biosensors: mechanisms of biological module stabilization // Abstracts of the 16th International
Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of
Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.195-196.
Vydryakova G.A., Bissett J., Psurtseva N.V., Shoukouhi P., Dao T.V., Gitelson J.I. Presence
of the luminous mushroom Neonothopanus nambi (Speg.) R.H. Petersen & Krisai in South Vietnam //
Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23
April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010
Nemtseva E.V., Gulnov D.V., Esimbekova E.N. Kratasyuk V.A. Fluorescence of the
components of bacterial bioluminescent reaction in viscous media: a model of in vivo conditions //
Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23
April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.193.
Nemtseva E.V., Gulnov D.V., Gerasimova M.A. «Photophysical characteristics of
flavinmononucleotide in viscous media». // Abstracts of the 16th International Symposium on
Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25
N 2, 2010, p.191-192.
Kudryasheva G.A., Nemtseva E.V. «Effect of halogenated antracenes on bacterial
bioluminescent reaction». Luminescence, // Abstracts of the 16th International Symposium on
Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25
N 2, 2010, p.197-198.
Tarasova A.S., Fedorova E. S, Kudryasheva N.S. General and oxidative toxicity of oxidizer in
the presence of humic substances. Bioluminescent monitoring // Abstracts of the 16th International
Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of
Luminescence, V.25 N 2, 2010, p.136-137.
Alexandrova M., Rozhko T., Badun G., Bondareva L., Vydryakova G., Bolsunovsky A.,
KudryashevaN. Effect of tritium on growth and luminescence of P.phosporeum // Abstracts of the 16th
International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon,
France. in J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, p. 125-126
IA Denisov, VV Mezhevikin, PI Belobrov. Imitation modeling concept for processing the
signals of luciferase-based bioassay, // Abstracts of the 16th International Symposium on
Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25
N 2, 2010, p.193-194.
NV Belogurova, NS Kudryasheva. Fluorescence Characteristics of Discharged Photoprotein
Obelin. // Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence,
19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25 N 2, 2010, P.135.
Kudryasheva NS, Kirillova TV, Vasyunkina EV. Classification of effects of Exogenous
compounds on Bioluminescent Assay Systems. // Abstracts of the 16th International Symposium on
Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25
N 2, 2010, P.151-152.
N. Belogurova, N. Kudryasheva. Fluorescence Percularities of Discharged Photoprotein
Obelin. // Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence,
19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25, N3, P.242-243
Alexandrova M., Rozhko T., Kudryasheva N., Vydryakova G., Bolsunovsky A.. Effect of
Americium-241 on luminous bacteria, Luminescence // Abstracts of the 16th International Symposium
on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence,
V.25, N.3(7) 2010, ISSN 1522-7235, P. 241-242
T.Kirillova, M.Gerasimova, N.Kudryasheva. Effect of halogenated fluorescent compounds on
bioluminescent reactions. Luminescence, // Abstracts of the 16th International Symposium on
Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23 April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence,
V.25, N.3(7) 2010, ISSN 1522-7235, P.265-266.
T. Rozhko, G.Vydryakova, A.Kuznetsov, L.Bondareva, A.Bolsunovsky, N.Kudryasheva.
Comparison of bioluminescent assay systems for monitoring radioactive toxicity. Luminescence//
Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence & Chemiluminescence, 19-23
April 2010, Lyon, France. in J. of Luminescence, V.25, N.3(7) 2010, ISSN 1522-7235, P 267-268.
2) XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых
«Ломоносов» Москва, 12-15 апреля 2010г.
Васюнькина Е. В., Александрова М.А, Роль перекисных соединений при воздействии
радионуклидов на биолюминесцентные системы- Материалы докладов XVII Международной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» Москва, 2010г.
Александрова М.А. Сравнение воздействия альфа- и бета-излучателей на
жизнедеятельность люминесцентных бактерий. Материалы докладов XVII Международной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» Москва, 2010г.
3) XIV международный симпозиум по биолюминесцентной спектрометрии (XIV.
International Symposium on Luminiscence Spectrometry), Прага, Чешская республика 13-16
июля 2010г
Kudryasheva NS. Upper electron-excited states in bioluminescencexiv. XIV. International
Symposium on Luminiscence Spectrometry, Прага, Чешская республика, 13-16 июля 2010г.
4) 5-ая Центрально-Европейская конференция –Химия к Биологии (The 5th Central
European Conference – Chemistry towards Biology (CtB2010), Примоштен, Хорватия, 8-11
сентября 2010г.
Alexandrova MA, Badun GA, Vydryakova GA, Kudryasheva NS. Effect of radionuclides on
luminous bacteria. Book of abstracts of the 5th Central European Conference- Chemistry towards
Biology, ISBN-130978-953-6690-83-1 EAN 9789536690831 p. 60.
Kudryasheva NS. Physoco-Chemical Classification of Toxic Effects on Bioassay systems.
Book of abstracts of the 5th Central European Conference- Chemistry towards Biology, ISBN-130978953-6690-83-1 EAN 97895366908315
N. Belogurova, N. Kudryasheva. Discharged Photoprotein Obelin: Fluorescence Peculiarities.
Materials of V-th Europein Conference – Chemistry towards Biology, Primoshten, Croatia, Sept. 2010.
p. 65.
G. Kudryasheva, E. Nemtseva “Biological effect of halogenated anthracences on biochemical
processes” Materials of V-th Europein Conference – Chemistry towards Biology, Primoshten, Croatia,
Sept. 2010.
5) Международная конференция «Проблемы экологии»,Чтения памяти профессора
Михаила Михайловича Кожова, 20-25 сентября 2010 г.,Иркутск
Александрова М.А., Бондарева Л.Г., Выдрякова Г.А., Кудряшева Н.С Исследование
радиотоксичности тритий-содержащих растворов биолюминесцентным методом. Тезисы
докладов Международной научной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 20-25
сентября 2010 г.) – Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. ISBN 978-5-9624-0452-3, с. 370
Тарасова А.С., Кудряшева Н.С. Биолюминесцентный мониторинг детоксикации
гуминовыми веществами растворов неорганического окислителя. Тезисы докладов
Международной научной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.)
– Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. ISBN 978-5-9624-0452-3, с. 472.
Денисов И.А. Биолюминесцентный мониторинг детоксикации гуминовыми веществами
растворов неорганического окислителя. Тезисы докладов Международной научной
конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.) – Иркутск: Изд-во Иркут.
гос. ун-та, 2010. ISBN 978-5-9624-0452-3, с. 472.
Якимов А.С., Денисов И.А., Создание микрофлюидной части устройства на основе
биолюминесцентного сигнала для идентификации токсических веществ. Тезисы докладов
Международной научной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.)
– Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. ISBN 978-5-9624-0452-3, с. 491.
Денисов И.А., Межевикин В.В, Имитационное моделирование кинетики
биолюминесцентного сигнала для идентификации токсических веществ. Тезисы докладов
Международной научной конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.)
– Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. ISBN 978-5-9624-0452-3, с. 402.
Выдрякова Г.А., Гусев А.А., Медведева С.Е, Родичева Э.К. Светящиеся грибы –
перспективный тест-объект биолюминесцентного биотеста (Иркутск, 20-25 сентября 2010 г.) –
Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. ISBN 978-5-9624-0452-3.
6) XI Международная научно -практическая конференция
«СОВРЕМЕННЫЕ ИНФОРМАЦИОННЫЕ И ЭЛЕКТРОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ» «СИЭТ2010», 24 - 28 мая 2010, Одесса, Украина
П. И. Белобров, И. А. Денисов, А. Г. Туманян, Е. Н. Есимбекова, Л. В. Мешайкина, А. С.
Якимов, В. А. Кратасюк Люциферазные биосенсоры для экологического мониторинга//
http://www.tkea.com.ua/siet/prog.pdf
7) XIII Всероссийский семинар «Моделирование неравновесных систем 2010», 15 – 17 октября 2010 г., Красноярск
И.А. Денисов, Е.С. Надеждина, П.И. Белобров, Модель динамической организации
микротрубочек внутри клетки, 2010, с. 43-49.
8) 12 Международная конференция коллекций культур, 25 сентября – 1 октября
2010, Бразилия
G.A. Vydryakova, P. Shoukouhi, N.V. Psurtseva, V. Dao, J. Bissett. Unusual ITS Sequence
Heterogeneity in the Luminous Mushroom Neonothopanus nambi from Vietnam.
9) 30th European Congress of Molecular Spectroscopy, 30 August – 3 September 2010,
Florence, Italy
Nemtseva E.V., Gulnov D. V., Gerasimova M. A., Kratasyuk V.A. «Fluorescent spectroscopy
of the components of bacterial bioluminescent system in viscous media», Book of Abstracts of the
30th European Congress of Molecular Spectroscopy, 30 August – 3 September 2010, Florence, Italy,
p. 76.
10) Международная молодежная экономическая школа «Как превратить научные идеи
в инновационный бизнес», Новосибирск, Академгородок, ИЭОПП СО РАН, 19-22 сентября
2010
Кратасюк В.А. «Биолюминесцентные биосенсоры: от идеи до коммерциализации»
ИР 1.1.11 Количество созданных в рамках НИР объектов интеллектуальной собственности
(всего- 3), в т.ч.:
ИР 1.1.12 Изобретение -3
Получено положительное решение о выдаче 3 патентов:
1.Кудряшева Н.С., Белогурова Н.В. Флуоресцентный способ определения концентрации
кальция. Заявка на патент РФ, рег.№2009130133/13, приоритет от 05.08.2009.
2. Кратасюк В.А., Есимбекова Е.Н. Биолюминесцентный биомодуль и способ его
приготовления. Заявка на патент РФ, рег. № 2009110636, приоритет от 23.03.2009.
3.Кратасюк В.А., Есимбекова Е.Н. Экспресс-способ биотестирования природных, сточных
вод и водных растворов. Заявка на патент РФ, рег. № 2009113656, приоритет от 10.04.2009.
Таким образом, по индикаторам И1.1.2, П1.1.5, П1.1.6 Ц6.2 выполнены плановые
показатели; по индикаторам И1.1.3, И1.1.4, П1.1.1, П1.1.2, П1.1.3, П1.1.4, Ц6.1, Ц7, Ц8, Ц8.1,
ИР1.1.3, ИР1.1.5, ИР 1.1.8, ИР1.1.9, ИР1.1.10, ИР1.1.11, ИР1.1.12 показатели существенно
превышены.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
За отчетный период получены следующие основные результаты:
1. В постоянную биотехнологическую культуру введены два вида светящихся грибов –
Armellaria borealis из сибирского леса и Neonathopanus nambi из лесов южного Вьетнама.
2. Разработана методика и подобраны среды и условия культивирования, позволяющие
получать препаративные количества биомассы грибов, обеспечивающие их систематическое
исследование.
3. Для культивирования N. nambi подобрана питательная среда из доступных в сибирских
условиях материалов. Показано, что опилки осины – березы успешно заменяют древесину
каучуконосной гевеи - природного субстрата N. nambi, а пшеница заменяет зерна риса.
Этот вид избран в качестве основного для дальнейшего исследования из-за наибольшей
скорости роста и наличия светоизлучающей системы как в мицелии так и в плодовых телах.
4. Методами генетического анализа определено таксономическое положение вьетнамского
гриба, первоначально определенного как Omphalotus af. illudent (Dao Thi Van, 2002) и в
настоящее время переопределенного в совместной работе Г. Выдряковой (ИБФ), Дао Тхи
Ван (Biolum Co, Vietnam) и J. Bissett (Agriculture and Agri-Food Canada, Canada) как
Neonathopanus nambi.
5. Выполнено детальное биохимическое исследование химического состава биомассы мицелия
и плодовых тел N. nambi. Определен аминокислотный, жирнокислотный, элементный состав.
6. Методом масс-спектрометрии исследован липидный и жирнокислотный состав экстрактов,
полученных из сухой биомассы плодовых тел гриба N. nambi. При этом в исследованных
экстрактах гриба не обнаружен иллудин – компонент высших грибов, обладающий
цитостатическим действием. Выявлено низкое содержание липидов (5,3% сухого вещества) в
биомассе исследуемой культуры N. nambi. Содержание неомыляемой фракции не превышало
6,0% от общего количества липидов. Омыляемые компоненты, в состав которых входят
жирные кислоты ациллипидов, составили 30,2% от суммылипидов. Жирнокислотный состав
экстрактов, полученных из сухой биомассы плодовых тел гриба N. nambi, исследован
методом масс-спектрометрии. Он оказался весьма необычным. Обнаружены жирные
кислоты с количеством атомов углерода от 8 до 26. Особенностью жирнокислотного состава
N. nambi оказалось также большое количество изомеров линолевой кислоты (С 18:2) в
зрелых подовых телах – 7-8 изомеров, в мицелии и молодых плодовых телах – 3-4. При этом
количество некоторых изомеров достигало 45% от общего количества жирных кислот.
Данные о положении двойных связей были подтверждены масс-спектрометрией ДМОК
(диметилоксазолиновых) - производных соответствующих жирных кислот, поскольку
введение в цепь жирной кислоты оксазолинового кольца позволяет точно определить
положение двойной связи в молекуле.
7. Определен спектр излучения N. nambi. Установлено его сходство по сравнению с
исследованными по этому параметру видами светоизлучающих грибов. Это позволяет с
высокой вероятностью предположить, что светоизлучающая система этого вида идентична
или очень близка системам других грибов.
8. Исследована кинетика излучения мицелия N. nambi и ее реакции на внешние воздействия
химические (влияние ряда токсикантов) и механические.
По чувствительности к некотором из них биолюминесцентные системы N. nambi и A.borealis
превосходят бактериальные биолюминесцентные тест-системы, по другим сопоставимы или
менее чувствительны. Это показывает, что для грибных биолюм-тестов есть ниша, отличная
от бактериальных биолюм-тестов.
9. Получены первичные данные о структурно-функциональной организации и физикохимических свойствах люминесцентной системы N. nambi. Показано, что образцы мицелия,
выращенные на твердых и жидких питательных средах, обладают способностью длительной
светопродукции – развитие люминесцентного сигнала до максимума достигается от
нескольких часов и длится до нескольких недель.
10.
Показано, что люминесцентная система N. nambi является кислородзависимой и,
вероятно, локализована в клеточной мембране гриба, в гомогенатах, полученных после
разрушения мицелия, люминесцентная активность не обнаруживается.
11.
Ионы двухвалентных металлов оказывают действие на люминесцентную систему гриба,
ионы ионы Mn активируют светоизлучение, а ионы Ni, Co, Mg ингибируют ее, не влияют на
излучение ионы Ca.
12.
Показано, что
супероксид
анион радикал
не принимает
участия в реакции
светоизлучения N. nambi, что отличает эту люминесцентную систему от люминесцентных
систем других грибов.
13.
Обнаружен низкомолекулярный термостабильный компанент, значительно (до 2-х
порядков) повышающий светопродукцию мицелия гриба.
14.
Показана возможность длительного поддержания свечения мицелия (20 суток и более),
что открывает перспективы создания долго действующих («ждущих») сигнальных тестов на
появление токсикантов в водных и воздушных средах.
По материалам работ готовятся публикации в рецензируемых журналах.
Полученные результаты создают достаточную основу для дальнейшего планомерного
изучения природы свечения грибов: в фундаментальном - расшифровка биохимической и
генетической основы биолюминесценции грибов и прикладном направлениях – создании
грибных биолюминесцентных тест-систем, действующих длительно в режиме ожидания.
В следующем году исследования биолюминесценции грибов будут включать:
 измерение кинетических параметров грибной биолюминесценции с целью выявления
природы ее катализатора;
 получение экспериментальных данных для решения ключевого вопроса о механизме
свечения грибов – ферментативного или хемилюминесцентного;
 изучение генетической организации механизма, обеспечивающего свечение грибов;
разработка принципов создания нового класса «ждущих» аларм-сенсоров токсичности на
основе молекулярно-клеточного механизма биолюминесценции грибов.
Для создания научно-образовательного пространства, включающего преподавателей,
научных работников, молодых ученых, студентов и аспирантов разных специальностей
развивается инновационный образовательный процесс на основе новых полученных
результатов. Развиваются новые принципы ведения научных исследований со студентами,
магистрантами и аспирантами при выполнении курсовых и дипломных работ, а также
магистерских и кандидатских диссертаций по темам проекта, внедряются в учебный процесс
разработанные ранее Учебно-методические комплексы дисциплин, активно развивается научноисследовательская и инновационная деятельность в рамках Молодежной Международной
Открытой Лаборатории Перспективных Исследований и Технологий (МОЛПИТ), регулярно
проводятся заседания Научно-образовательного семинара по биохимической физике.
На следующем этапе будут проведены исследования по теме «Создание прототипов
экспериментальных моделей для исследования функционирования ферментов в клетках
светящихся бактерий», работа будет происходить по следующим направлениям:
1.
Получение
прототипов экспериментальных моделей для цепи сопряжения двух
ферментов светящихся бактерий в растворах повышенной вязкости и в матричной
структуре геля. Сравнительная оценка 4 прототипов экспериментальных моделей.
2.
Анализ соответствия вязкости клеточной цитоплазмы вязкостям в прототипах
экспериментальных моделей и спектров флуоресценции и анизотропии флуоресценции в
исследуемых физико-химических моделях.
3.
Сравнение активности и стабильности биолюминесцентной системы в клетке светящихся
бактерий, прототипах физико-химических моделей и в растворах для определения
адекватности предложенных моделей.
4.
Разработка математической модели, описывающей количественные зависимости выхода
активности
иммобилизованной
биолюминесцентной
системы
от
концентрации
компонентов реакции, срока хранения, вязкости среды иммобилизации. Исследование
соответствия математической модели параметрам физико-химических моделей.
5.
Исследование физико-химической
модели функционирования ферментов в клетке и
концепции ее использования для понимания механизмов стабилизации.
6.
Подбор условий для совместной иммобилизации в гели различной природы ферментов и
их субстратов и кофакторов, оценка эффективности их взаимодействия.
Выполнение индикаторов по проекту: по индикаторам И1.1.2, П1.1.5, П1.1.6 Ц6.2
выполнены плановые показатели; по индикаторам И1.1.3, И1.1.4, П1.1.1, П1.1.2, П1.1.3, П1.1.4,
Ц6.1, Ц7, Ц8, Ц8.1, ИР1.1.3, ИР1.1.5, ИР 1.1.8, ИР1.1.9, ИР1.1.10, ИР1.1.11, ИР1.1.12
показатели существенно превышены.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1.
Bechor O, Smulski D.R., Van Dyk T.K., LaRossa R.A., Belkin S. Recombinant microorganisms
as environmental biosensors: pollutants detection by Escherichia coli bearing fabA'::lux fusions.
//J.Biotechnology. 2002. V. 94. № 1. P. 125–132.
2.
Roda A., Pasini P., Mirasoli M., Michelini E. and Guardigli M. Biotechnological applications of
bioluminescence and chemiluminescence. //TRENDS in Biotechnology, 2004. V.22. № 6.: P. 295303.
3.
Girotti S., Ferri E.N, Fumo M.G., Maiolin E. Monitoring of environmental pollutants by
bioluminescent bacteria. //Anal Chim Acta. 2008. V.608: P. 2–29.
4.
Herring, P.J. Luminous fungi. Mycologist, 1994. V. 8: P.181-183.
5.
Desjardin, D. E., Oliveira A.G., Stevani, C. V. Fungi bioluminescence revisited. //Photochem
Photobiol Sci. 2008. V.7. P. 170-182.
6.
Выдрякова Г.А., Псурцева Н.В., Белова Н.В., Пашенова Н.В., Гительзон И.И. Светящиеся
грибы и перспективы их использования //Микология и фитопатология 2009, т.43, № 5, с
369-375.
7.
Vydryakova G.A., Psurtseva N.V., Belova N.V., Gusev A.A., Pashenova N.V., Medvedeva S.E.,
Rodicheva E.K., Gitelson J.I. Luminous mushrooms /Light emission: Biology and Scientific
applications, World Scientific Publishing, New Jersey-London-Singapore-Hong Kong, 2009. P.
79-82
8.
Ячевский А.А. Основы микологии / Под ред. Н.А. Наумова. М.; Л., 1933.
9.
Horswell J., Weitz H.J., Percival H.J., Speir T.W. Impact of heavy metal amended sewage sludge
on forest soils as assessed by bacterial and fungal biosensors //Biol Fertil Soils. 2005. V. 42. P.
569-576.
10. Mendes L., Prada S., Stevani C. Evaluation of fungal acute toxicity of metals to basidiomycete
fungi using a Brazilian bioluminescent species Gerronema viridilucens /Proceedings of the
SETAC 26th Annual Meeting in North America (USA). 2005.
11. Mendes LF, Stevani CV. Evaluation of metal toxicity by a modified method based on the fungus
Gerronema viridilucens bioluminescence in agar medium. //Environ Toxicol Chem. 2010
Feb;29(2):320-6.
12. Weitz H.J. Colin D., Campbell C.D., Killham K. Development of a novel, bioluminescence-based,
fungal bioassay for toxicity testing //Environ. Microbiol. 2002. V. 4. V. 422-429.
13. Hollis, R.P. Construction and application of a luminescent eukaryotic biosensor. 1999. PhD
Thesis, University of Aberdeen.
14. Hollis, R.P., Killham, K., and Glover, L.A. Design and application of a biosensor for monitoring
toxicity of compounds to eukaryotes. //Appl Environ Microbiol 2000. 66:1676–1679.
15. Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A.J.R., Paton, G.I., and Glover, L.A. Development and application of
bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensor. //FEBS Lett 2001.
493: 36–39.
16. Brock M, Jouvion G, Droin-Bergère S, Dussurget O, Nicola MA, Ibrahim-Granet O.
Bioluminescent Aspergillus fumigatus, a new tool for drug efficiency testing and in vivo
monitoring of invasive aspergillosis. //Appl Environ Microbiol. 2008, 74(22):7023-35.
17. Kozlova O., Zwinderman M., Christofi N. A new short term toxicity assay using Aspergillus
awamori with recombinant aequorin gene. //BMC Microbiol 2005, 5:40-42.
18. Assunção N.A., Soares Ch.O., Domingues O., Stevani C.V., Bechara E.J.H. Direct Analysis of
Reduced and Oxidized Glutathione by CE-ESI-MS/MS /Proceedings of 2 Congress BrMass
(Sociedade Brasileira de Espectrometria de Massas – BrMASS). 2007.
19. Paton GI, Viventsova E, Kumpene J, Wilson MJ, Weitz HJ, Dawson JJ. An ecotoxicity
assessment of contaminated forest soils from the Kola Peninsula. //Sci Total Environ. 2006. V.
355. № 1-3. P. 106-17.
20. Airth, R.L., and Foerster, G.E. The isolation of catalytic components required for cell-free fungal
bioluminescence. //Arch Biochem Biophys 1962. 97: 567–573.
21. Kuwabara, S., and Wassink, E.C. Purification and properties of the active substance of fungal
luminescence. In: Bioluminescence in Progress. Johnson, F.H., and Haneda, Y. (eds) Princeton,
USA: Princeton University Press, 1966. pp. 233–245.
22. Kamzolkina O. V., Danilov V. S. and Egorov N. S., Nature of luciferase from the bioluminescent
fungus Armillariella mellea, //Dokl. Akad. Nauk SSSR, 1983, 271, 750–752.
23. O’Kane, D.J., Lingle, W.L., Porter, D., and Wampler, J.E. Development and localization of
bioluminescence in the fruiting bodies of the mushroom Panellus stypticus. //Photochem Photobiol
1986. 43: 100s.
24. Shimomura O. The role of superoxide dismutase in regulating the light emission of luminescent
fungi. //J. Exp. Bot. 1992. 43: 1519.
25. Isobe M., Takahashi H., Usami K., Hattori M. and Nishigohri Y. Bioluminescence mechanism on
new systems //Pure & Appl. Chem. 1994. V. 66. No. 4. P. 765-772.
26. Shimomura, O. Bioluminescence: chemical principles and methods. World Scientific Publishing
Co. Pte. Ltd. 2006. 470 p.
27. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal
RNA genes for phylogenetics. In: Innis AM, Gelfand DH, Snisnky JJ, White TJ, eds. PCR
Protocols: a guide to method and applications. New York: Academic Press. 1990. p 315–322.
28. Kanamori-Kataoka, M., Seto, Y., Kuramoto M. Development of a method for determining illudin
S in food by gas chromatography-mass spectrometry //Journal of Health Science V.52(3). 2006,
p.237-242
29. Павлов И.Н., Миронов А.Г., Кутафьева Н.П. Морфологические признаки грибов комплекса
Armillaria mellea sensu lato циркумбореальной области //Хвойные бореальной зоны, 2006. Т.
23, № 3, с.14-21.
30. Dao T.V. The first discovery of the bioluminescent mushroom and reseach on biology of the new
fungi:
Omphalotus
af.illudent
//The
graduation
thesis,
2002.
http://www.khoahocphothong.com.vn/newspaper/detail/1990/nuoi-trong-nam-phat-quang-tai-vietnam.html
31. Dao T.V. Physiological and cultural properties of the luminous fungus Omphalotus af. illudent
//Журнал СФУ. Серия: Биология. 2009. Т. 2. № 2. С. 157-171
32. Дао Т.В, Культивирование светящегося гриба Omphalotus af. illudent (neonothopanus nambi)
/ Дао Тхи Ван // Биотехнология. - 2009. - N 6. - С. 74-78.
33. Polese Jean-Marie Le mini-guide des champignons. Losang: Köneman 2000. P.381.
34. Vydryakova G.A., Bissett J., Psurtseva N.V., Shoukouhi P., Dao T.V., Gitelson J.I. Presence of
the luminous mushroom Neonothopanus nambi (Speg.) R.H. Petersen & Krisai in South Vietnam
//Luminescence 2010; 25: (81–216) 187-188
35. Kirchmair M, Pöder R, Huber CG, Miller OK. Chemotaxonomical and morphological
observations in the genus Omphalotus Fayod (Omphalotaceae). //Persoonia 2002. 17(4):583–600.
36. Kirchmair M., Morandell S., Stolz D., Pöder R. Phylogeny of the genus Omphalotus based on
nuclear ribosomal DNA-sequences //Mycologia, 2004, 96(6), pp. 1253–1260.
37. Tomimura Y. Chemical characteristics of rubberwood damaged by Sinoxylon conigern Gerstäcker
//Bull. For. & For. Prod. Res. Inst. N 365. 1993. P 33-43.
38. Suzuki S., Rodriguez E.B., Saito K., Shintani H., Iiyama K. Compositional and structural
characteristics of residual biomass from tropical plantations //J Wood Sci 1998. 44:40-46
39.
Okino E.Y.A., Resck I.S., Santana M.A.E., et al. Evaluation of wood chemical constituents of
Hevea brasiliensis and Cupressus decomposed by Gloeophyllum striatum using CP/MAS
13
C
NMR and HPLC techniques. //Journal of Tropical Forest Science. 2010. 22(2): 184–196
40. Lingle W.L. Bioluminescence and ligninolysis during secondary metabolism in the fungus
Panellus. /VII-th International symposium on bioluminescence and chemiluminescence. //J
Bioluminescence and Chemiluminescence. 1993. 8. P.100
41. Lingle W. L. Effects of veratryl alcohol on growth and bioluminescence of Panellus stypticus,
/Abstract,Mycol. Soc. Am.Newslett., 1989, 40, 36.
42. Рабинович М.Л., Болобова А.В., Кондращенко В.И. Теоретические основы биотехнологии
древесных композитов. Кн. I. Древесина и разрушающие её грибы. М.: Наука, 2001. 264 с.
43. Dao T.V. The first discovery of the bioluminescent mushroom and research on biology of the new
fungi: Omphalotus af.illudent 2006.
http://www.springbrook.info/research/external/Omphalotus.af.illudent_A_M.pdf
44. Hatakka A. Biodegradation of lignin /In: Biopolymers. Lignin, humic substances and coal. WileyVCH, Weinheim, Germany. 2001. V.1: P.129-180.
45. Hofrichter M. Review: lignin conversion by manganese peroxidase (MnP) //Enzyme Microb.
Technol. 2002. V.30. P. 454–466.
46. Лисов А.В. Гибридная Mn-пероксидаза гриба Panus Tigrinus 8/18 //Дис. ... канд. биол. наук:
03.00.04 : Пущино, 2005 95 c. РГБ ОД, 61:05-3/1341.
47. Айзенштадт М.А., Боголицын К.Г. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных
соединений //Химия растительного сырья. 2009. №2. С. 5–18.
48. Camarero S., Sarcar S., Ruiz-Duenas F. J., Martinez M. J., Martinez A. T. Description of a
versatile peroxidase involved in the natural degradation of lignin that has both manganese
peroxidase and lignin peroxidase substrate interaction sites //J. Biol. Chem. 1999. V.274. №15.
P.10324-10330.
49. Лисов
А.В.,
Леонтьевский
А.А.,
Головлёва
Л.А.
Гибридные
Mn-пероксидазы
базидиомицетов (обзор) //Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. №5. С.598606
50. Petersen, R.H., Krisai-Greilhuber, I. Type specimen studies in Pleurotus. //Persoonia 1999. 17,
201–219
51. Fengel von D. und G. Wegener. Wood: Chemisry, Ultrastructure, Reactions. Berlin-New York:
Walter de Gruyter 1984., 613 S.
52. Airth, R.L., and McElroy, W.D. Light emission from extracts of luminous fungi. //J.Bacteriol
1959. 77: 249–250.
53. Endo M., M. Kajiwara and K. Nakanishi. Fluorescent constituents and cultivation of
Lampteromyces japonicus, //Chem. Commun., 1970, 309.
54. O’Kane D.J., Lingle W.L., Porter D., Wampler J.E. Spectral analysis of the bioluminescence of
Panellus stypticus. //Mycologia. 1990. V. 82. P. 607-616.
55. Oliveira A.G. and Stevani C.V. The enzymatic nature of fungal bioluminescence //Photochem.
Photobiol. Sci., 2009, 8, 1416 – 1421.
56. Decker H., Terwilliger N. Cops and robbers: putative evolution of copper oxygen-binding
proteins. //J. Exp. Biol. 2000. V. 203. P. 1777-1782.
57. Stom D.I., Geel T.A., Balayan A.E., Shachova G.I., Kuznetsov A.M., Medvedeva S.E.
Bioluminescent method in studying the complex effect of sewage components. //Arch. Environ.
Contam. Toxicol. 1992. V.22. P.203-208.
58. Родичева Э.К., Кузнецов А.М., Медведева С.Е., Биолюминесцентные биотесты на основе
светящихся бактерий для экологического мониторинга. //Вестник ОГУ, 2004. Т.5: C. 96-100.
59. Родичева Э.К., Выдрякова Г.А., Медведева С.Е. Каталог культур светящихся бактерий.
Новосибирск: Наука. 1997. 125 стp.
60. Патент WO/2004/076685
61. http://bl.ibp.ru
Скачать