Полный текст статьи
advertisement
Трансплантация гемопоэтических клеток обеспечивает платформу для трансплантации миобластов у собак с дистрофией. Предисловие. Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенной и тяжелой формой мышечной дистрофии у людей, возникает у 1 из 3500 живорожденных . Это Х-сцепленное рецессивное заболевание, вызванное мутацией в гене дистрофина, крупнейшем гене, выявленном в геноме человека. Мутации присутствуют при рождении, но симптомы не проявляются до 3-5 лет. Прогрессивная мышечная слабость и истощение сил приковывает к инвалидной коляске с 12-летнего возраста, и смерти в третьем десятилетии жизни в результате дыхательной и / или сердечной недостаточности. Трансплантация стволовых мышечных клеток обладает большим потенциалом для долгосрочного ремонта дистрофических мышц. Действительно, внутримышечная трансплантация спутниковых клеток от нормального сингенного донора mdx мышам приводит к образованию дистрофина-положительных мышечных волокон. Тем не менее, малые клинические испытания на человеке показали, что внутримышечные инъекции донорских миобластов приводит к переходной экспрессии дистрофина в небольшом количестве. В отсутствие иммуносупрессии, инъекции донорских миобластов вызывают клеточный иммунный ответ, который разрушает вновь образованные миофибриллы. Иммуносупрессивные препарат, такие как циклоспорин и FK 506, ингибируют деятельность кальциневрина и предотвращают отторжение трансплантата. Тем не менее, у пациентов, получавших циклоспорин не обнаружено увеличения числа дистрофин-положительных мышечных волокон относительно пациентов, получавших плацебо. Было установлено, что циклоспорин сам по себе не достаточно мощный для предотвращения отторжения трансплантата, кроме того, циклоспорин может негативно повлиять на приживление миобластов, а деятельность кальциневрина имеет важное значение для дифференциации миогенных клеток в пробирке и в естественных условиях. Более того, хроническая системная иммуносупрессия связана с серьезными побочными эффектами и значительным риском. Рассматриваемые вместе, эти наблюдения показывают, что при трансплантации миогенных стволовых клеток требуется альтернатива традиционной иммуносупрессии. Немиелобластные гемопоэтические клетки (НСТ) приводит к смешанному химеризму, который определяется как сосуществование клеток донора и реципиента. В клинике, трансплантация немиелобластных клеток амбулаторная процедура, которая хорошо переносится у более чем 1200 пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями крови. Смешанный химеризм как у грызунов и крупных животных успешно индуцировал толерантность к донорским почкам, печени, тонкому кишечнику, сердцу, легким, поджелудочной железе и островковых клеток, без иммуносупрессии. В частности, донорские почки пересаживаются смешанным химерным реципиентам, полностью работоспособны и сохранились, по крайней мере 5 лет, даже если только 10% лимфоцитов у реципиентов были донорского происхождения. Таким образом, мы стремились определить могут ли НСТ быть использованы для создания иммунной толерантности для доклинических исследований пересадки миогенных стволовых клеток.Собачьей модель МДД (cxmd) характеризуется точечойя мутацией в акцепторной области сайтов сплайсинга интрона 6 гена дистрофина, представляя стоп-кодон в изменение рамки считывания, в результате чего полное отсутствие белка дистрофина. Дистрофических фенотип собаки точно повторяет заболеваний человека, что делает эту модель идеальной для исследования потенциальных методов лечения. HCT сама по себе не в состоянии восстановить экспрессию дистрофина у XMD собак. Таким образом, мы специально определим могут ли миелоабластные и немиелоабластные HCT у XMD собак позволить прижиться донорским мышечным стволовым клеткам и восстановить экспрессию дистрофина. Результаты. HCT и протокол трансплантации миобластов Костный мозг и G-CSF мобилизованые мононуклеарные клетки периферической крови (ММК) были собраны у двух нормальных доноров и пересажены двум облученным DLA-идентичным cxmd реципиентам (рис. 1а, материалы и методы). Клетки одного реципиента cxmd были получены из донорских (табл. 1, G289, полная химера), в то время как второй реципиент имел сочетание гемопоэтических клеток донора и реципиента (табл. 1, G604, смешанная химера). Производные скелетных мышц мононуклеарные клетки, выделенные из тех же доноров были обработаны для инъекций сразу после изоляции и культивированы в течение 14 дней до инъекции (рис. 1b, материалы и методы). G289 подверглись миелоаблативной HCT в 5,5 месячном возрасте, после трансплантации миобластов в возрасте 32 месяцев. G604 прошли немиелоаблативную HCT в 7 месяцев, и трансплантацию миобластов в возрасте 18 месяцев. Введение донорских мышечных клеток восстановало экспрессию дистрофина у химерных XMD собак Ферментативное переваривание скелетных мышц из биоптатов у HCT доноров дало смешанную популяцию мононуклеаров, которые включали сателлитные клетки и фибробласты. Свежевыделенные мышечные клетки вводили внутримышечно в нескольких местах в двуглавую мышцу бедра химерных получателей. Криосекции биопсии взяты от четырех до двадцати четырех недель после инъекции были проанализированы на экспрессию дистрофина. Ожидалось, что если введенные клетки в скелетных мышцах XMD химерных собак были дифференциацированы и слияние компетентно, то экспрессия дистрофина будет восстановлена. Действительно, внутримышечная инъекция 1 × 106 свежих донорских мышцечных клеток полностью химерныхм cxmd реципиентам, G289, восстановила экспрессию дистрофина в мышечных волокнах по результатам биопсии через пять-десять недель после инъекции (рис. 2а). Экспрессия дистрофина наблюдалась на протяжении участка биопсии, протяженностью примерно 0,5 см в месте инъекции (данные не представлены). Кроме того, инъекции 4,5 × 106 свежевыделенных донорских мышечных клеток, полученных непосредственно из мышц смешанной химерной XMD собаки, G604, восстановили экспрессию дистрофина в волокнах, сгруппированых вблизи узлов инъекций при биопсии на 4, 8 и 24 неделе после инъекции (рис. 2б). Экспрессия дистрофина, по-видимому, сохраняется в течение не менее 1000 мкм длины волокна, по оценке изучения серийных срезов (данные не представлены). Количественное выражение донорского вклада в cxmd мышцы реципиента Количество доноров с диким типом мРНК дистрофина оценивали в режиме реального времени ОТ-ПЦР с использованием пробы , которая специфично выявляет сплайсинговые сигналы дистрофина дикого типа, а не ненормальные формы сплайсинга в cxmd мышцах. Уровень мРНК дистрофина наблюдаемый у донора дикого типа произвольно установили как 100, и в результате относительный уровень мРНК дистрофина у полностью химерных cxmd реципиентов составил 0,00035% (G289), прежде чем произведена трансплантации клеток. Уровня дистрофина в G289 значительно увеличилась до 6,48% (р = 0,0007) за десять недель после введения свежевыделенных клеток. Относительный уровень мРНК дистрофина в скелетных мышцах в G604 был 0.0019% до инъекции (табл. 2). И увеличился до 1,29% (р = 0,003) через 4 недели после инъекции свежих клеток, и оставался постоянным в течение 24 недель после введения на уровне 1,32% (р = 0,01). Таким образом, у G289 и G604 значения экспрессии дистрофина были значительно выше после того, как в мышцы произведена трансплантация клеток. Потому что мононуклеары спутниковые и стволовые клетки не экспрессируют дистрофин, это означает, что мышечные клетки, полученные от донора, дифференцировались в миофибриллы способные синтезировать дистрофин.. Геномная ДНК (gDNA), выделенная из группы серийных криосекций при биопсии мышц и проанализирована VNTR-ПЦР, с подтверждением сохранения значительного количества донорских, производных ДНК. Полностью химерные XMD собаки, G289, показавшие в среднем 13,9% донорской ДНК после предварительной инъекции клеток донорской крови (табл. 3).Через 10 недель после введения свежевыделенных клеток, в среднем 20,2% ДНК составляла донорская(р = 0,0017), а наибольшее значение донорской ДНК составило 23,1%.Смешанные химерные XMD собаки, G604, показали в среднем 5,0% донорской ДНК перед введением мышечных клеток. Через 24 недели после введения свежевыделенных клеток, в среднем, 9,3% составила донорская ДНК (р = 0,007), с самым высоким значением в 12,3%. Введение донорских мышечных клеток не вызывает иммунного ответа у реципиентов, получивших НСТ. Чтобы определить наличие иммунного ответа и инфильтрация иммунными клетками реципиента введенных донорских клеток, криосекции были проанализированы с использованием антител, направленных против CD45 гемопоэтических клеток; CD3, специфического маркера Т-клеток , а также CD14, специфического маркера моноцитов / макрофагов. Минимальная клеточная инфильтрация наблюдалось у донора и реципиента в дистрофических скелетных мышцах до трансплантации, о чем свидетельствует случайные клетки, экспрессирующие CD45 (рис. 2 ). Существовало отсутствие CD3-положительных Т-клеток (данные не приведены), но CD14позитивные макрофаги четко прослеживается в небольших количествах в дистрофичных мышцах реципиента (рис. 2d ) Через 10 недель после трансплантации клеток, постоянная минимальная лимфоцитарная инфильтрация наблюдалось (рис. 2 - CD45). Тщательное изучение криосекций не обнаружило CD3-позитивных клеток (данные не представлены), однако небольшая область CD14-положительных клеток была обнаружена, что указывает на моноциты / макрофаги, которые обычно проникают в вырождающиесь скелетные мышцы (рис. 2d ). Таким образом, инъекции донорских мышечных клеток в cxmd мышцы не вызывает иммунной клеточной инфильтрации. Внутримышечные инъекции донорских мышечных клеток способствует восстановлению структуры мышц и снижению регенерации у химерных XMD собак Для терапии стволовыми клетками, чтобы получить эффект, функции должны быть восстановлены в скелетных мышцах. Тем не менее, локализованные инъекции, используемые в данном исследовании исключают функциональные улучшения. Таким образом, мы оценили улучшения в структуре мышц на основе гистологического исследования. Окраска гематоксилин-эозином криосекций G289 реципиента до трансплантации показала поразительную потерю мышечной структуры, значительные различия в мышечной массе волокон и увеличение жировой и соединительной ткани по сравнению с нормальными мышцами донора (рис. 3а ). Введение свежевыделенных мышечных клеток, заметно улучшило структуру мышц на 10 неделе после трансплантации и в результате меньше соединительной и жировой тканей и снижение изменение размера диаметра волокна по сравнению с предидушими результатами (рис. 3а). Новоиспеченные скелетные мышечные волокна или волокна, которые дифференцировались из миоцитов в результате регенерации характеризуются ядрами, расположенными в центре мышечных волокон. Тем не менее, около 10% ядер в мышцах G289 реципиента были в центре, что говорит о том, что часть дистрофических мышц регенерировала (рис. 3б). Инъекция свежих мышечных клеток сократила число центрально расположенных ядер у G289 реципиентов менее чем на 5%, что было статистически значимым по сравнению с данными до инъекции (р <0,01). В совокупности эти результаты предположили, что приживление донорских мышц восстановило экспрессию дистрофина и стабилизировало cxmd мышцы, предотвращая повторные попытки регенерации. Донорские мышечные клетки восстановливают экспрессию дистрофина Наши данные показывают, что непосредственное введение свежевыделенных донорских производных мышечных клеток прижилось без иммунного отторжения у химерных получателей. Тем не менее, многие стволовые клетки и процедуры пересадки требуют увеличения клеток в культуре, которые могли бы изменить иммуногенный статус донорских клеток. Таким образом, определить, является ли подобные приживления произойти при использованиии клеток, выращенных в культуре донорских мышечных клеток, полученных из культуры до введения в двуглавую мышцу бедра химерных cxmd получателей. Мы использовали стандартную последовательную технику предварительного покрытия для обогащения миобластов и предварительно проанализировали клетки пластины 2 (PP2) и 6 (§ 6) (рис. 1б). Для того, чтобы установить были ли полученные мононуклеары миогенными, прилипшие клетки PP2 и PP6 были зафиксированы в пролиферации (Справочная рис. 1а) и дифференциации (Supplemental рис. 1b). Иммуное окрашивание с антителами, специфичными к десмину и Pax7 двух маркеров миобластов в культуре, установлено, что более 90% пролиферирующих культивируемых клетках были миогенными. Для оценки потенциальной дифференциации в пробирке, PP2 и PP6 клетки культивировали и фиксировали после дополнительных 72 часов. Популяция PP2 дифференцированы для формирования многоядерных миофибрилл, которые экспрессировали миогенин и тяжелые цепи миозина (MyHC)- два маркера миогенной дифференциации (рис. 1б Справочная - PP2). Популяция PP6 также экспрессировала миогенин и MyHC, но оставалась в основном мононуклеарными (рис. 1б Справочная - § 6). Мышиные мышечные клетки, полученные из культивированных в сопоставимых условиях, показали аналогичные результаты [28,29]. Как и свежевыделенные мышечные клетки, введение культуры PP6 клеток не вызывают иммунной инфильтрации в месте инъекции (данные не представлены). Кроме того, введение культуры PP6 клеток восстановили экспрессию дистрофина в скелетных мышцах химерных cxmd реципиентов (рис. 4а, б). Уровень дистрофина достиг максимума 1.45% от дикого типа уровней у полных химерных собак, G289, и 0,05% у смешанных химерных собак, G604 (табл. 4). Хотя эти уровни были значительно выше по сравнению с уровнем до инъекции (р = 0,0026 и р = 0,009 соответственно), максимальные уровни дикого дистрофина были меньше, чем достигается после введения свежевыделенных клеток (табл. 2). Дискусссия. Поиск клинически значимых средств восстановления долгосрочной экспрессии дистрофина в скелетных мышцах было постоянной проблемой в области исследования дистрофии Дюшенна. Трансплантация миобластов у нормальных пациентов не удалась, в связи с иммунным отторжением донорских клеток. В то время как долгосрочные иммуносупрессии могут продлить выживаемость мышечной клетки, но они токсичны для многих органов, включая почки, печень, мышцы, кости и центральной нервной системы, и оставляет пациента уязвимым к оппортунистическим инфекциям. В этом исследовании мы показали, что НСТ установили иммунную толерантностиь cxmd собак, позволяющую стабильное приживление донорских мышечных клеток, полученных в отсутствие фармакологической иммуносупрессии. Важно отметить, что донорские мышечные клетки восстановили экспрессию дистрофина , по крайней мере на 24 недели после трансплантации. Хотя белок дистрофин был обнаружен широко по всем криосекциям из мышечной биопсии, полученной после инъекции клеток, уровень дистрофина был относительно низкий. В частности, было предложено в исследованиях пропуска экзона, что уровень дистрофина мРНК должен достичь только 10% от общего уровня дистрофина, что может вернуть пострадавшие мышцы к мягкому фенотипу Беккера [30]. Тем не менее, вполне возможно, что уровень мРНК не может точно отражать уровень белка настоящее время [31]. Хотя белок дистрофин легко обнаружить антителами, окрашиванием криосекций мышц, дистрофин, по оценкам, составляет менее 0,01% от цитоплазматической РНК присутствующей в скелетных мышцах взрослого [32], предполагая, что мышечное волокно может производить только предельное количество транскриптов дистрофина. Таким образом, измерения уровня дистрофина не может точно отражать уровень функционального белка дистрофина. Недавние исследования аллогенной трансплантации 107 культурных миобластов у МДД пациентов, с использованием протокол "с высокой плотностью инъекции", в результате от 3,5% до 26% дистрофинположительных волокон в зоне места инъекции через 4 недели после трансплантации [33], а у одного пациент а некоторые регионы мышц - 34,5% положительных волокон через 18 месяцев после трансплантации [34]. Этот протокол опирается на использование FK506, чтобы предотвратить иммунное отторжение. В нашем исследовании мы показали, что введение в 10 - 20 раз меньше свежевыделенных клеток дает в результате экспрессию дистрофина в волокнах, которые охватывают примерно 30-70% волокон в области инъекции. Важно отметить, что устойчивое приживление не зависит от иммунитета. Это важное различие, так как побочные эффекты FK506 лечения включают тремор, артериальную гипертензию, нарушения функции почек, гипомагниемию, неврологическую токсичность и долгосрочную токсичность для печени и почек. Хотя только две собаки были включены в наше исследование, важно отметить, что результаты в отдельных участках инъекции в пределах одной собаки неизменно показывают аналогичную картину выражения дистрофина. Кроме того, экспрессия дистрофина явно восстановлена у химерных собак. Учитывая, что НСТ вызывает толерантность к другим органам, например, почкам, легким и тонкому кишечнику, небольшое количество животных в этом исследовании, тем не менее представляют собой окончательную демонстрацию аллогенной толерантности к донорским миобластам, и обеспечивает важную модель, по которой по дальнейшему совершенствованию экспрессию дистрофина после пересадки мышечных клеток. Достижение большей экспрессии дистрофина требует совершенствования приживления производных донорских мышц. Более 40 лет успеха в переводе результатов собак для человека в клинике подчеркивает, что HCT является клинически значимой платформой для изучения и улучшения трансплантации миобластов. Материалы и методы Трансплантации гемопоэтических клеток. Уход и использование животных одобрено Комитетом онкологического научного центра Фреда Хатчинсона, который полностью аккредитован Ассоциацией по оценке и аккредитации лаборатории по уходу животных. Собаки были сохранены в социальных группах, где это возможно. Все собаки были включены в профилактические программы ветеринарной медицины, которые включали обычные глистогонные и стандартные серии иммунизации против чумы плотоядных, парвовируса, аденовируса тип 2, вирус парагриппа, коронавируса и бешенства. Смешанные породы собак XMD были сохранены как колония в онкологическом научном центре, как описано ранее [27]. Однопометники состояли из здорового дикого типа доноров и реципиентов XMD собак, которые были сопоставимы по внутрисемейным набрам гистосовместимости с помощью двух полиморфных маркеров, один из которых расположен в классе Я региона и один из которых расположен в регионе класса II главного комплекса гистосовместимости [35,36]. Соответствие подтверждено во всех случаях DRB1 секвенирования генов [37]. HCT протокол для собак XMD был описан ранее [27]. День HCT был обозначен день 0. Клеток донора костного мозга были извлечены за 30 дней до трансплантации, под общим наркозом через иглы из плеча и бедра, а также заморожены. Подкожные инъекции рекомбинантного гранулоцитарного собачьего колониестимулирующего фактора (РКГ-CSF; 5мг/кг; подарок от Amgen, Thousand Oaks, Калифорния) донорам с -5 до -1 день, была использована для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга в периферическую кровь. Лейкоферез были проведен для сбора Г-КСФ "мобилизованых" мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК-G) в 0 день с помощью чрескожного центрального двойного катетера [38] и сепарации непрерывного кровотока (Cobe 2997; Cobe BCT, Лейквуд , CO [39]) В день 0, каждый реципиент получил нацеленную инъекцию в разовой дозе 7 сГр / мин от линейного ускорителя (Varian Clinac 4, Пало-Альто, Калифорния) [40]. Один реципиент получил 200 сГр, а другой получил 920 сГр. В течение 4 часов, размороженные донорские клетки костного мозга и свежевыделенные G-МНПК вводили внутривенно. Последующая иммуносупрессия состояла из оральных циклов циклоспорина (CSP), 10 мг / кг два раза в день, с самого первого дня -2 по 35 [41]. Все собаки получили стандартную поддерживающую терапию, которая включала введение жидкости, содержащие электролиты, системные антибиотики. Химеризм и флуоресцентные VNTR-PCR Гемопоэтический химеризм наблюдали в течение первых 8 недель, два раза в неделю в течение следующих 10 недель, а затем ежемесячно. Донорский химеризм считался стабильным 28 недель после HCT. Периферийные образцы крови были разделены на лимфоциты, гранулоциты и эритроциты крови. Геномная ДНК (gDNA) была выделена из лимфоцитов и гранулоцитов с использованием QIAamp ДНК Mini Kit (Qiagen). ДНК была также изолирована из серийных криосекций из образцов биопсии мышц с использованием тех же QIAamp ДНК Mini Kit (Qiagen), а также проанализированы таким же образом, как и гемопоэтический химеризм. В частности, был определен химеризм флуоресцентным переменным числом тандемных повторов (VNTR)-ПЦР с использованием ABI Prism 310 Genetic Analyzer и Джин Scan 3.1 Программного обеспечения (Applied Biosystems, Foster City, CA). Праймеры, специфичные для собачьего полиморфизма были использованы, для отличия доноровреципиентов [42,43]. Изоляция мышечных клеток, культуры и инъекции Для каждого эксперимента дикого типа донора проведено две биопсии скелетных мышц, которые, как правило, брались из двуглавой мышцы бедра. Первые образцы биопсии скелетных мышц обработаны 400 ед / мл коллагеназы типа I (Sigma-Aldrich) в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS, Invitrogen) или Дульбеко (DMEM, Invitrogen) с добавлением 5 мМ CaCl2. Мононуклеары освобождены от мышц высевали на чашки для культивирования и поддерживались в питательной среде (DMEM, 20% ЭТС, 2,5 нг / мл bFGF, пенициллин и стрептомицин, L-глютамин). Методика, аналогичная описанной в Ку-Петерсен и др. (рис. 1б) была использована для отделения клеточных популяций на основе дифференциального разделения. Клетки культивировали в течение 14 дней. Вторая биопсия скелетных мышц была взята у донора в тот же день, когда клетки должны были быть введены реципиенту. Опять же, мононуклеарные клетки были выделены с помощью коллагеназы типа 1, однако, клетки дважды отмывали в PBS, ресуспендировали в 250 мкл PBS, и готовы к прямым инъекциям (свежие клетки). Небольшое количество подсчитываются и анализировали на жизнеспособность с трипановым синим. Клетки с 6 пластины (§ 6), как описано выше, были собраны с использованием буфера не-ферментативной клеточной диссоциации, дважды промыли PBS, осадок ресуспендировали в 250 мкл PBS, и подготовлены для инъекций. 6-см разрез был сделан в коже и мышцах XMD собак реципиентов для иммунной терапии. Нерастворимые швы были размещены непосредственно в мышцах, и 5 инъекций примерно 50 мкл вводили в мышцы окружающие шов, около 1 см3. Кожа была пришита и проводилось ежедневное наблюдение во время лечения. Для биопсии другой разрез был сделан в коже и мышцах, окружающих каждый нерастворимый шов, и шов был удален. Биопсия мышц была немедленно заморожена с использованием жидкого азота в охлажденном изопентане, и хранится при температуре -80 ° C. Иммуное крашивание Криосекции были разрезаны (8-10 мкм) из замороженных участков биопсии мышц с помощью Leica CM1850 криостата, и SuperFrost (Fisher Scientific). До окрашивания, срезы были зафиксированы в ацетоне при температуре 20 ° С в течение 10 минут, им дали высохнуть, и промыли в PBS. Срезы были заблокированы в блокирующем буфере (2% сыворотки козы, 1% БСА, 0,1% холодного желатина, 0,05% азида натрия, 0,01 М PBS), и инкубировали с первичными антителами, разведенными в основном буфере (1% BSA, 0,1 % холодного желатина, 0,05% азида натрия, 0,01 М PBS). Первичные антитела против дистрофина включали Dy8/6C5 и Dy4/6D3 (Vector Laboratories). Моноклональные антитела MANDYS102 (7D2), MANDYS107 (4H8) и MANEX1A (4C7), специфичные для дистрофина, были разработаны Гленн Моррис и получили из Банка развития исследований гибридомы под эгидой NICHD и поддерживается Университетом штата Айова, Отделением биологических наук, Iowa City, IA. Другие первичные антитела были использованы анти-CD45 (FHCRC биопрепаратов) и анти-CD14 (DAKO). FITCсопряженные анти-мышиные антитела (Jackson Immunoresearch) разводили в 1X PBS. Получение изображений. Культивируемые клетки фиксировали в 4% параформальдегиде, и 0,3% Тритон Х-100. Клетки были заблокированы 10% сывороткой козы и инкубировали с первичными антителами разведенными в основном буфере для разведения антител. Первичные антитела, специфичные для Pax7 (Atsushi Каваками), миогенин (F5D - Вудринг E. Wright), и MyHC (MF20 - Дональд А. Фишман), были получены из банка развития гибридомы. Моноклональные антитела, специфичные для D33 десмина были приобретены у DAKO. ФИТС-сопряженные анти-мышиные антитела вторично (Jackson Immunoresearch) разводили в 1X PBS. Срезы монтируются с использованием Vectashield содержащих DAPI. Выделение РНК и ОТ-ПЦР в реальном времени. РНК выделяли из группы серийных криосекций, взятых при биопсии скелетных мышц. Криосекции были немедленно заморожены и помещены в микроцентрифужные трубки, хранящиеся на сухом льду при -80 ° C до обработки. Криосекции инкубировали в RNALater на льду в течение 1 минуты до выделения РНК. РНК выделяли с помощью RNeasy мини комплекта (Qiagen), в соответствии с протоколом изоляции ткани. Изолированные РНК количественно исследовались при помощи RiboGreen (Invitrogen) и флуорометра и 100 мкг при помощи ОТ-ПЦР с использованием случайных гексамеров и High Capacity к ДНК набора обратной транскрипции (Applied Biosystems), или ген-специфичных праймеров и SuperScriptIII (Invitrogen).. ДНК амплифицировали с использованием BioRad iQ5 системы, праймеров и зондов, TaqMan специфичные для дистрофина или β-актина, как описано ранее [27]. Ct значения были преобразованы в относительные уровни экспрессии с использованием ΔΔCt метода. Ссылки: 1. Chakkalakal JV, Thompson J, Parks RJ, Jasmin BJ. Molecular, cellular, and pharmacological therapies for Duchenne/Becker muscular dystrophies (Review) FASEB J. 2005;19:880–891. [PubMed] 2. Nowak KJ, Davies KE. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment (Review) EMBO Reports. 2004;5:872–876. [PMC free article] [PubMed] 3. Karpati G, Pouliot Y, Zubrzycka-Gaarn E, Carpenter S, Ray PN, Worton RG, et al. Dystrophin is expressed in mdx skeletal muscle fibers after normal myoblast implantation. Am J Pathol. 1989;135:27–32. [PMC free article] [PubMed] 4. Morgan JE, Hoffman EP, Partridge TA. Normal myogenic cells from newborn mice restore normal histology to degenerating muscles of the mdx mouse. J Cell Biol. 1990;111:2437–2449. [PMC free article] [PubMed] 5. Partridge TA, Morgan JE, Coulton GR, Hoffman EP, Kunkel LM. Conversion of mdx myofibres from dystrophin-negative to -positive by injection of normal myoblasts. Nature. 1989;337:176–179. [PubMed] 6. Huard J, Labrecque C, Dansereau G, Robitaille L, Tremblay JP. Dystrophin expression in myotubes formed by the fusion of normal and dystrophic myoblasts. Muscle Nerve. 1991;14:178–182. [PubMed] 7. Gussoni E, Pavlath GK, Lanctot AM, Sharma KR, Miller RG, Steinman L, et al. Normal dystrophin transcripts detected in Duchenne muscular dystrophy patients after myoblast transplantation. Nature. 1992;356:435–438. [PubMed] 8. Huard J, Bouchard JP, Roy R, Labrecque C, Dansereau G, Lemieux B, et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clinical Science. 1991;81:287–288. [PubMed] 9. Huard J, Bouchard JP, Roy R, Malouin F, Dansereau G, Labrecque C, et al. Human myoblast transplantation: preliminary results of 4 cases. Muscle Nerve. 1992;15:550–560. [PubMed] 10. Mendell JR, Kissel JT, Amato AA, King W, Signore L, Prior TW, et al. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med. 1995;333:832–838. [PubMed] 11. Miller RG, Sharma KR, Pavlath GK, Gussoni E, Mynhier M, Lanctot AM, et al. Myoblast implantation in Duchenne muscular dystrophy: the San Francisco study. Muscle Nerve. 1997;20:469–478. [PubMed] 12. Tremblay JP, Malouin F, Roy R, Huard J, Bouchard JP, Satoh A, et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 1993;2:99–112. [PubMed] 13. Huard J, Roy R, Bouchard JP, Malouin F, Richards CL, Tremblay JP. Human myoblast transplantation between immunohistocompatible donors and recipients produces immune reactions. Transplant Proc. 1992;24:3049–3051. [PubMed] 14. Friday BB, Horsley V, Pavlath GK. Calcineurin activity is required for the initiation of skeletal muscle differentiation. J Cell Biol. 2000;149:657–666. [PMC free article] [PubMed] 15. Semsarian C, Wu MJ, Ju YK, Marciniec T, Yeoh T, Allen DG, et al. Skeletal muscle hypertrophy is mediated by a Ca2+dependent calcineurin signalling pathway. Nature. 1999;400:576–581. [PubMed] 16. Storb R, Yu C, Wagner JL, Deeg HJ, Nash RA, Kiem H-P, et al. Stable mixed hematopoietic chimerism in DLAidentical littermate dogs given sublethal total body irradiation before and pharmacological immunosuppression after marrow transplantation. Blood. 1997;89:3048–3054. [PubMed] 17. Sandmaier BM, Storb R. Nonmyeloablative therapy and hematopoietic cell transplantation for hematologic disorders. In: Blume KG, Forman SJ, Appelbaum FR, editors. Thomas’ Hematopoietic Cell Transplantation. Third. Blackwell Publishing Ltd; Oxford, UK: 2004. pp. 1164–1176. 18. Kuhr CS, Allen MD, Junghanss C, Zaucha JM, Marsh CL, Yunusov M, et al. Tolerance to vascularized kidney grafts in canine mixed hematopoietic chimeras. Transplantation. 2002;73:1487–1493. [PubMed] 19. Yunusov MY, Kuhr C, Georges GE, Sale GE, Spector M, Lesnikova M, et al. Survival of small bowel transplants in canine mixed hematopoietic chimeras: preliminary results. Transplant Proc. 2002;34:3366–3367. [PubMed] 20. Colson YL, Xu H, Huang Y, Ildstad ST. Mixed xenogeneic chimerism induces donor-specific humoral and cellular immune tolerance for cardiac xenografts. J Immunol. 2004;173:5827–5834. [PubMed] 21. Luo B, Nanji SA, Schur CD, Pawlick RL, Anderson CC, Shapiro AM. Robust tolerance to fully allogeneic islet transplants achieved by chimerism with minimal conditioning. Transplantation. 2005;80:370–377. [PubMed] 22. Kuhr CS, Yunusov M, Sale G, Loretz C, Storb R. Long-term tolerance to kidney allografts in a preclinical canine model. Transplantation. 2007;84:545–547. [PubMed] 23. Kenyon NS, Yu C, Han D, Storb R, Ricordi C. Stable hematopoietic chimerism leads to acceptance of DLA matched allogeneic islets in the absence of immunosuppression. Blood. 2000;96 Part 1:376a. #1623 abstract. 24. Cooper BJ, Winand NJ, Stedman H, Valentine BA, Hoffman EP, Kunkel LM, et al. The homologue of the Duchenne locus is defective in X-linked muscular dystrophy of dogs. Nature. 1988;334:154–156. [PubMed] 25. Fletcher S, Ly T, Duff RM, McC HJ, Wilton SD. Cryptic splicing involving the splice site mutation in the canine model of Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 2001;11:239–243. [PubMed] 26. Sharp NJ, Kornegay JN, Van Camp SD, Herbstreith MH, Secore SL, Kettle S, et al. An error in dystrophin mRNA processing in golden retriever muscular dystrophy, an animal homologue of Duchenne muscular dystrophy. Genomics. 1992;13:115–121. [PubMed] 27. Dell’Agnola C, Wang Z, Storb R, Tapscott SJ, Kuhr CS, Hauschka SD, et al. Hematopoietic stem cell transplantation does not restore dystrophin expression in Duchenne muscular dystrophy dogs. Blood. 2004;104:4311–4318. [PubMed] 28. Qu-Petersen Z, Deasy B, Jankowski R, Ikezawa M, Cummins J, Pruchnic R, et al. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J Cell Biol. 2002;157:851–864. [PMC free article] [PubMed] 29. Jankowski RJ, Deasy BM, Cao B, Gates C, Huard J. The role of CD34 expression and cellular fusion in the regeneration capacity of myogenic progenitor cells. J Cell Sci. 2002;115:4361–4374. [PubMed] 30. Shiga N, Takeshima Y, Sakamoto H, Inoue K, Yokota Y, Yokoyama M, et al. Disruption of the splicing enhancer sequence within exon 27 of the dystrophin gene by a nonsense mutation induces partial skipping of the exon and is responsible for Becker muscular dystrophy. J Clin Invest. 1997;100:2204–2210. [PMC free article] [PubMed] 31. Jansen RC, Nap JP, Mlynarova L. Errors in genomics and proteomics. Nat Biotechnol. 2002;20:19. [PubMed] 32. Smith KP, Moen PT, Wydner KL, Coleman JR, Lawrence JB. Processing of endogenous pre-mRNAs in association with SC-35 domains is gene specific. J Cell Biol. 1999;144:617–629. [PMC free article] [PubMed] 33. Skuk D, Goulet M, Roy B, Chapdelaine P, Bouchard JP, Roy R, et al. Dystrophin expression in muscles of duchenne muscular dystrophy patients after high-density injections of normal myogenic cells. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 2006;65:371–386. [PubMed] 34. Skuk D, Goulet M, Roy B, Piette V, Cote CH, Chapdelaine P, et al. First test of a “high-density injection” protocol for myogenic cell transplantation throughout large volumes of muscles in a Duchenne muscular dystrophy patient: eighteen months follow-up. Neuromuscular Disorders. 2007;17:38–46. [PubMed] 35. Burnett RC, Francisco LV, DeRose SA, Storb R, Ostrander EA. Identification and characterization of a highly polymorphic microsatellite marker within the canine MHC class I region. Mamm Genome. 1995;6:684–685. [PubMed] 36. Wagner JL, Burnett RC, DeRose SA, Francisco LV, Storb R, Ostrander EA. Histocompatibility testing of dog families with highly polymorphic microsatellite markers. Transplantation. 1996;62:876–877. [PubMed] 37. Wagner JL, Works JD, Storb R. DLA-DRB1 and DLA-DQB1 histocompatibility typing by PCR-SSCP and sequencing (Brief Communication) Tissue Antigens. 1998;52:397–401. [PubMed] 38. Lee R, Storb R, Little M-T, Joslyn A, Spector M, Kuhr CS. Percutaneous central dual-lumen catheter for apheresis in the canine. J Invest Surg. 2002;15:337–341. [PubMed] 39. Sandmaier BM, Storb R, Santos EB, Krizanac-Bengez L, Lian T, McSweeney PA, et al. Allogeneic transplants of canine peripheral blood stem cells mobilized by recombinant canine hematopoietic growth factors. Blood. 1996;87:3508–3513. [PubMed] 40. Storb R, Raff R, Deeg HJ, Graham T, Appelbaum FR, Schuening FG, et al. Dose rate-dependent sparing of the gastrointestinal tract by fractionated total body irradiation in dogs given marrow autografts. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1998;40:961–966. [PubMed] 41. Zaucha JM, Zellmer E, Georges G, Little M-T, Storb R, Storer B, et al. G-CSF-mobilized peripheral blood mononuclear cells added to marrow facilitates engraftment in nonmyeloablated canine recipients: CD3 cells are required. Biol Blood Marrow Transplant. 2001;7:613–619. [PubMed] 42. Yu C, Ostrander E, Bryant E, Burnett R, Storb R. Use of (CA)n polymorphisms to determine the origin of blood cells after allogeneic canine marrow grafting. Transplantation. 1994;58:701–706. [PubMed] 43. Scharf SJ, Smith AG, Hansen JA, McFarland C, Erlich HA. Quantitative determination of bone marrow transplant engraftment using fluorescent polymerase chain reaction primers for human identity markers. Blood. 1995;85:1954–1963. [PubMed] Оригинальная статья: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2536604/?tool=pubmed Переведено проектом МОЙМИО: http://www.mymio.org
