Посмотреть файл - Российский НИИ гематологии и
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКОБИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА» На правах рукописи Петрова Екатерина Вадимовна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ, ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ И КОНТРОЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ МИЕЛОИДНЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ И МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКИМИ СИНДРОМАМИ Специальность 14.01.21 – гематология и переливание крови Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Абдулкадыров Кудрат Мугутдинович, доктор биологических наук Мартынкевич Ирина Степановна Санкт-Петербург – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ…...............……...........................................................................................4 ГЛАВА 1 СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О РОЛИ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В УСТАНОВЛЕНИИ ДИАГНОЗА, ОПРЕДЕЛЕНИИ ПРОГНОСТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ И МОНИТОРИНГА ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ БОЛЬНЫХ С ОМЛ И МДС (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).........................................................................9 1.1 Современные методы лабораторной диагностики больных острыми миелобластными лейкозами и миелодиспластическими синдромами...............9 1.2. Характеристика и классификация ОМЛ и МДС.......................................15 1.2.1 Классификация ОМЛ.................................................................................15 1.2.2 Классификация и этиопатогенез МДС.....................................................18 1.2.3 Возраст как независимый прогностический фактор у больных ОМЛ и МДС………………................................................................................................20 1.3 Генетические аберрации, участвующие в патогенезе ОМЛ и МДС.......23 1.3.1 Хромосомные нарушения и мутации генов при ОМЛ...........................23 1.3.2 Хромосомные нарушения и мутации генов при МДС............................30 1.4 Анализ мутаций в генах FLT3, CKIT, NRAS и NPM1.................................33 ГЛАВА 2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ…..…………………………………………………………………………48 2.1 Характеристика исследуемой группы больных ОМЛ...............................48 2.2 Характеристика исследуемой группы больных МДС...............................49 2.3 Метод исследования хромосом....................................................................52 2.4 Методы анализа мутационного статуса генов FLT3, NPM1, CKIT и NRAS........................................................................................................................53 2.5 Статистическая обработка полученных данных........................................58 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ БОЛЬНЫХ С ОМЛ.......................................................................59 3.1 Общая характеристика мутационного статуса больных ОМЛ.................59 3 3.2 Частота встречаемости и влияние на прогноз мутаций в гене FLT3.......61 3.3 Роль мутаций в гене NPM1 у больных ОМЛ…………..............................65 3.4 Исследование группы больных ОМЛ с мутациями в гене NRAS.............71 3.5 Прогностические особенности течения заболевания у больных ОМЛ с мутациями в гене CKIT……..........................…….............................................74 ГЛАВА 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ БОЛЬНЫХ МДС...........................................................................77 4.1 Частота встречаемости и прогностические особенности мутаций генов FLT3, NPM1 и NRAS у больных МДС..........................................................77 ГЛАВА 5 ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................................82 5.1 Обсуждение результатов исследования группы больных ОМЛ…….…..82 5.2 Обсуждение результатов исследования группы больных МДС…………96 ВЫВОДЫ.....................................................................................................................102 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ......................................................................103 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................................................104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................106 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) и миелодиспластические синдромы (МДС) представляют гетерогенную группу миелоидных заболеваний с разным биологическим фенотипом. В настоящее время принципиально важным прогностическим маркером риска, который используется для определения интенсивности терапии таких больных, является кариотип. Рядом исследователей доказано, что выживаемость больных с несбалансированными и множественными хромосомными повреждениями достоверно хуже, чем больных со сбалансированными аберрациями. Наибольшие затруднения в прогнозировании выживаемости и риска развития рецидива заболевания представляет группа больных ОМЛ и МДС с нормальным кариотипом, показатели выживаемости в которой значительно варьируют при проведении стандартной цитостатической терапии. Низкая частота встречаемости хромосомных аберраций и вместе с тем вариабельность клинического течения заболеваний с однотипными цитогенетическими поломками обуславливают целесообразность поиска новых маркеров, позволяющих распределить больных на более однородные группы риска. Современная терапия гемобластозов заключается в проведении высокодозной химиотерапии и/или трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Однако в существующих протоколах выбор интенсивности постремиссионной терапии осуществляется без учета прогностических факторов. Это, с одной стороны, необоснованно увеличивает риск токсической смерти, а с другой – повышает вероятность возникновения рецидива заболевания. Нерешенность вопросов о сроках инициации и количестве курсов высокодозной терапии, выборе кандидатов на трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток и условиях прекращения лечения определяют актуальность использования в диагностике ОМЛ и МДС высокоинформативных молекулярно- 5 генетических методов исследования с целью поиска новых прогностических маркеров заболевания. Динамическое изучение генотипа лейкозных клеток в совокупности с эффективностью терапии позволяют оценить прогностический потенциал молекулярно-генетических аберраций как маркеров ответа на лечение и критериев выбора поддерживающего интенсивности лечения и терапии, выявить обосновать потенциальных назначение кандидатов на трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток. Комплексное исследование повреждений генов делает возможной разработку эффективных таргетных препаратов, которые в совокупности со стандартной цитостатической терапией способны снижать объем опухолевых клеток и значительно увеличивать выживаемость. Современные методы лабораторной диагностики позволяют выявить большое количество молекулярно-генетических маркеров, характерных для ОМЛ и МДС. Однако не все повреждения имеют высокую частоту встречаемости и прогностический потенциал. Актуальность работы обусловлена выбором наиболее часто встречающихся и прогностически значимых молекулярногенетических маркеров. Степень разработанности темы Большое генетических количество повреждений работ посвящено у больных ОМЛ исследованию и МДС. молекулярно- Тем не менее, противоречивые результаты о частоте встречаемости и прогностическом значении молекулярно-генетических маркеров опухолевых клеток, полученные в различных лабораториях, а также недостаточная изученность их корреляции с клинико-гематологическими, возрастными и цитогенетическими особенностями, свидетельствуют о необходимости выполнения дополнительных исследований. Цель исследования Оценить роль молекулярно-генетических методов исследования в диагностике и прогнозировании течения острых миелоидных лейкозов и миелодиспластических синдромов. 6 Задачи исследования Исследовать частоту встречаемости и прогностический потенциал 1. мутаций генов NRAS, CKIT, FLT3 и NPM1 у больных острыми миелоидными лейкозами и миелодиспластическими синдромами. Выявить 2. особенности распределения молекулярно-генетических повреждений в зависимости от клинико-гематологических особенностей и варианта кариотипа при острых миелоидных лейкозах и миелодиспластических синдромах. 3. Разработать алгоритм диагностики больных острыми миелоидными лейкозами и миелодиспластическими синдромами, основанный на возможностях молекулярно-генетических методов анализа. Научная новизна исследования В настоящем исследовании впервые: – получены новые данные о частоте встречаемости и прогностическом потенциале мутаций генов NRAS, CKIT, FLT3 и NPM1, выявляемых при помощи молекулярно-генетических методик у больных острыми миелоидными лейкозами и миелодиспластическими синдромами; – выявлены особенности распределения молекулярно-генетических повреждений в генах NRAS, CKIT, FLT3 и NPM1 в зависимости от возраста больных и варианта кариотипа при острых миелоидных лейкозах и миелодиспластических синдромах; – разработан алгоритм диагностики острых миелоидных лейкозов и миелодиспластических синдромов, включающий хромосомные и молекулярно-генетические маркеры опухолевых клеток. Практическая значимость исследования Предложен алгоритм диагностики больных острыми миелоидными лейкозами и миелодиспластическими синдромами с использованием современных достижений молекулярно-генетических технологий, позволяющий адекватно верифицировать вариант заболевания, определить прогностические особенности молекулярно-генетических повреждений и тем самым выбрать оптимальную 7 современную терапию, что в свою очередь обеспечивает достижение у пациентов длительной безрецидивной выживаемости. Методология и методы исследования В работе использованы клинико-лабораторные, цитогенетические, молекулярно-генетические и статистические методы анализа. Положения, выносимые на защиту 1. Достоверное влияние мутаций в генах CKIT, FLT3 и NPM1 на прогноз заболевания позволяет включить их в перечень генов, используемых в диагностике больных ОМЛ. 2. Мутации в генах CKIT и NRAS чаще встречаются у пациентов с ОМЛ с благоприятным кариотипом, а в генах FLT3 и NPM1 у больных ОМЛ с нормальным кариотипом. 3. Мутация FLT3-ITD ассоциируется с возрастом больных старше 60 лет и повышенным уровнем лейкоцитов в периферической крови и бластов в костном мозге, что может быть использовано для прогнозирования вероятности обнаружения данной мутации. 4. Прогноз течения заболевания у больных ОМЛ и МДС может существенно меняться в зависимости от количества и вариантов обнаруженных мутаций, что обуславливает необходимость изучения в совокупности мутационного статуса различных генов. Внедрение результатов исследования в практику Молекулярно-генетические методы детекции мутаций в генах NRAS, CKIT, FLT3 и NPM1 внедрены и широко используются в практической и научноисследовательской деятельности лаборатории молекулярной генетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научноисследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства». Результаты исследования применяются в работе гематологических отделений Санкт-Петербурга – городской больницы №15, городской больницы №17, Ленинградской областной клинической больницы. 8 Личный вклад соискателя в выполнение работы Автором лично выполнялись: планирование исследований; оптимизация условий реакций и проведение скрининга мутационного статуса генов NRAS, CKIT, FLT3 и NPM1 с использованием различных молекулярно-генетических методов исследования; ведение первичной документации и сбор информации из историй болезни; анализ полученных данных, статистическая обработка и обобщение результатов. Степень достоверности и апробация результатов Степень достоверности обусловлена проведением молекулярно- генетических исследований у большой группы больных (200 пациентов с ОМЛ и 80 больных МДС), использованием достоверных методов исследования, качеством проведения лабораторных анализов и статистической обработкой полученных результатов. Материалы диссертации представлены на 17th Congress of the European Hematology Association (Амстердам, 2012), Конгрессе ГНЦ (Москва, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярно-генетические и иммуногенетические методы диагностики в практике врача гематолога» (СанктПетербург, 2013), ELN Frontiers Meeting (Прага, 2013), на Всероссийской научнопрактической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2014), II Конгрессе гематологов России (Москва, 2014), 19th Congress of the European Hematology Association (Милан, 2014), ELN Frontiers Meeting (Берлин, 2014). По теме диссертации опубликованы 12 печатных работ, из них – 7 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, обсуждения, практических рекомендаций и библиографии. Список литературы включает 182 источника литературы на русском и иностранном языках. Работа содержит 48 рисунков и 6 таблиц. 9 ГЛАВА 1 СОВРЕМЕННОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ О РОЛИ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В УСТАНОВЛЕНИИ ДИАГНОЗА, ОПРЕДЕЛЕНИИ ПРОГНОСТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ И МОНИТОРИНГА ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ БОЛЬНЫХ С ОМЛ И МДС (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1 Современные методы лабораторной диагностики больных острыми миелобластными лейкозами и миелодиспластическими синдромами ОМЛ – это злокачественное заболевание крови, при котором происходит трансформация нормальных гемопоэтических клеток в неконтролируемо пролиферирующие, неспособные к дифференцировке лейкозные клетки. МДС объединяет клональные миелоидные заболевания, характеризующиеся дисплазией клеток костного мозга, типичными цитогенетическими аномалиями и вероятностью прогрессирования в ОМЛ [71]. Заболеваемость ОМЛ составляет примерно 2,3 на 100000 населения в год. За последние 20 лет она не претерпела существенных изменений. Стандартизованная по возрасту заболеваемость среди мужчин выше, чем среди женщин (2,9 и 1,9 на 100000 населения в год соответственно). С возрастом заболеваемость увеличивается: до 65 лет она составляет 1,3, после 65 лет – 12,6 на 100000 населения в год [89]. Средняя частота заболеваемости МДС составляет 4,3 на 100000 населения в год (медиана встречаемости заболевания 72 года) [150]. Хотя в настоящее время данные заболевания достаточно хорошо изучены, патогенетические механизмы их возникновения зачастую остаются неизвестными. К возможным этиологическим факторам относят: воздействие радиации или химических предрасположенность, соединений предшествующую (бензол), химиотерапию, генетическую курение или врожденные генетические синдромы [51]. Точный диагноз ОМЛ и МДС играет основную роль в распределении больных на группы риска и в принятии решения о выборе адекватной терапии. Начиная с 1970-х годов, диагностика ОМЛ и МДС подверглась значительным 10 изменениям. Первоначально, единственными доступными диагностическими методами исследования были морфологические и цитохимические. В настоящее время в рутинную лабораторную практику по исследованию миелопролиферативных неоплазий входят следующие методы: классическая цитогенетика, молекулярная цитогенетика (флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) и сравнительная геномная гибридизация), молекулярная генетика (полимеразная цепная иммунофенотипирование реакция методом (ПЦР), секвенирование) мультипараметрической и проточной цитометрии (МПЦ) [53]. Использование современного спектра диагностических методов и анализ совокупности полученных данных позволяют улучшить понимание патогенетических механизмов возникновения заболевания, верифицировать по нозологиям и прогностическим группам в пределах одного варианта заболевания. Клональные хромосомные аберрации, являющиеся независимыми прогностическими факторами, обнаруживаются примерно у 50-60% больных ОМЛ и 30-50% пациентов с МДС [45]. Спектр хромосомных аномалий включает сбалансированные и несбалансированные перестройки: потеря/приобретение части или целой хромосомы, транслокации, инверсии, инсерции и другие, встречающиеся одиночно или в сочетании. Молекулярные изменения, которые вовлекают гены, кодирующие факторы транскрипции, рецепторные тирозинкиназы, протоонкогены и супрессоры, также представлены широко [100]. Обнаружение молекулярных аномалий позволяет усовершенствовать биологическую классификацию ОМЛ и МДС и охарактеризовать случаи с нормальным кариотипом (НК). Таким образом, получение развернутой и более полной информации о конкретном пациенте с ОМЛ или МДС может быть достигнуто только с использованием комбинации всех методов. Проведение комплексного анализа дает возможность получить развернутую картину заболевания: морфологические, цитохимические методы исследования и МПЦ позволяют определить вариант заболевания, кариотипирование дает информацию о всех высокоспецифичных и редких клональных генетических перестройках, 11 видимых под микроскопом, тогда как метод FISH, являясь дополнением к цитогенетике, позволяет обнаружить субмикроскопические аберрации. Молекулярные методы используются как для подтверждения результатов выше перечисленных исследований (уточняя также вариант перестройки), так и для мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) и детекции мутаций в различных генах, благодаря более высокой чувствительности. Выбор маркера МОБ и метода его анализа требует учёта многих факторов. Классические морфологические и цитогенетические методы не обладают достаточной чувствительностью, а современные технологии (иммунофенотипирование методом МПЦ и различные варианты количественной ПЦР, в частности, обратнотранскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР)) при очевидных преимуществах в чувствительности и скорости анализа имеют особенности, осложняющие интерпретацию результатов (таблица 1) [73;120]. Например, иммунофенотипирование опухолевых клеток проводится на фоне подавляющего количества нормальных. Кроме этого, в динамике заболевания возможно изменение фенотипа клеток, что особенно характерно для острых лейкозов. Это подразумевает, детектировать что не для менее мониторинга двух МОБ маркеров. методом МПЦ Следовательно, не необходимо существует универсального метода для детекции МОБ, и для получения адекватной картины заболевания необходим комплексный подход как и в дебюте заболевания, с применением различных методов анализа. 12 Таблица 1 – Сравнительная характеристика лабораторных методов анализа при ОМЛ и МДС Метод Морфология Цитогенетика FISH МПЦ ПЦР, ОТ-ПЦР Клетки Хромосомы Клетки Клетки ДНК, мРНК 100 – 200 100 – 1000 100 – 1000 50 тыс. – 1 млн. 1 млн. Чувствительность 5% 1 – 2% 0,2 – 1% 10 3 – 10 4 10 2 – 10 6 Скорость анализа Низкая Низкая Низкая Высокая Высокая Морфологичес Выявление Выявление Иммунофенот Определение различных кая хромосомных ипирование аберраций в онкогенах, характеристика нарушений Анализируемый объект Среднее кол-во анализируемых клеток Возможности анализа клеток Порог клинической значимости Полный гематологическ ий ответ Полный цитогенетический ответ генетических количественный анализ аберраций экспрессии генов Подтверждение Определение Большой молекулярный диагноза МОБ ответ (3 log), определение МОБ 13 Таким образом, алгоритм современной лабораторной диагностики ОМЛ и МДС должен решать следующие задачи: постановка точного диагноза с определением варианта заболевания, мониторинг МОБ в период полной гематологической, морфологической и молекулярной ремиссий, а также низкие стоимость, трудоемкость и временные затраты. И только комплексный подход к диагностике, включающий последовательное применение всех методов анализа, позволяет реализовать данные задачи. В качестве базовых методов используются морфологические, цитогенетические и МПЦ, а по результатам данных исследований проводится дальнейшая диагностика более чувствительными молекулярно-генетическими методами, такими как FISH, ПЦР и секвенирование. Использование совокупности названных методов является необходимым для оценки прогноза заболевания и выбора адекватной терапии. Прогностические факторы при ОМЛ и МДС разделяют на две основные группы: относящиеся к индивидуальным характеристикам пациента (анамнез, общий соматический статус) и характеризующие лейкозный клон. Наиболее неблагоприятными для ОМЛ считают следующие показатели: 1) клинические – возраст менее 2х и старше 60 лет, критерий ECOG (eastern cooperative oncology group) >1, предшествующая химиотерапия или МДС, повреждения центральной нервной системы (ЦНС); 2) гиперлейкоцитоз; 3) морфологические – варианты M0, M5, M7 (по франко-американобританской (ФАБ) классификации); 4) иммунофенотипические – экспрессия CD56, CD7; 5) цитогенетические – комплексный кариотип, inv(3) или t(3;3), t(6;9), t(6;11), t(1;19), -5, -7; 6) молекулярные – FLT3-ITD, MLL-PTD, мутации CKIT, гиперэкспрессия BAALC, WT1, ERG2 и другие [20]. В настоящее время, среди онкогематологии, перспективным молекулярных методов диагностики направлением является в полногеномное секвенирование – революционный метод, позволяющий наиболее полно 14 охарактеризовать заболевание на молекулярном уровне. Следует отметить, что одно из первых опубликованных исследований полного генома человека было у пациента с ОМЛ [102]. Технологии полногеномного секвенирования на сегодняшний день уже позволили обнаружить мутации в 281 гене у пациентов с ОМЛ, в сравнении с известными до недавнего времени мутациями только в 16 (~6%) генах. Также появилась возможность прогнозирования течения заболевания в пределах одного варианта, например, у пациентов с острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ) с t(15;17) обнаруживают редкие мутации в генах-участниках транслокации, которые могут способствовать дальнейшей прогрессии заболевания [174]. Использование метода полногеномного секвенирования является актуальным для пациентов с нормальным кариотипом или с аберрациями с неизученным прогностическим потенциалом [103]. обнаруживать новые специфичные мутации и Метод дает возможность подбирать направленную (таргетную) терапию, а также детектировать патерны клональной эволюции у пациентов с рецидивом заболевания. В ближайшее время, выявление с помощью метода полногеномного секвенирования специфичных для ОМЛ и МДС мутаций, может быть использовано для выделения группы здоровых людей с высоким риском развития этих заболеваний. Тем не менее, выделяют следующие недостатки данного метода: не дает информации об эпигенетических модификациях и аберрантной экспрессии генов, имеет высокую стоимость и сложности в интерпретации результатов. Однако, использование таких разновидностей данного метода, как секвенирование экзома, транскриптома, отдельных генов позволяет говорить о том, что данный метод уже в ближайшем будущем сможет войти в рутинную практику многих лабораторий [135]. 15 1.2 Характеристика и классификация ОМЛ и МДС 1.2.1 Классификация ОМЛ Для создания воспроизводимой и клинически значимой классификации ОМЛ исследователями было предложено несколько вариантов. Франкоамерикано-британская классификация ОМЛ с вариантами M0-M7 базировалась на морфологических, особенностях иммуногистохимических опухолевых клеток [25]. прогностическая значимость результатов исследований обусловили их и Высокая иммунофенотипических информативность и цитогенетического и молекулярного включение в классификацию Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ). Данная классификация была предложена в 2001 году и дополнена в 2008 году. Классификация ВОЗ выделяет четыре основные группы ОМЛ: – ОМЛ с характерными генетическими аберрациями (сбалансированные транслокации, мутации генов); – с миелодисплазией (из предшествующего МДС); – связанные с проводимым ранее лечением (облучение, алкилирующие препараты и другие); – ОМЛ, неподходящие под описание предыдущих групп. Также сюда относят: миелоидную саркому, связанную с синдромом Дауна миелопролиферацию и неоплазии из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток [170; 171]. К группе ОМЛ с характерными генетическими перестройками относят семь вариантов хромосомных аберраций, а также ОМЛ с мутациями в генах FLT3, NPM1 или CEBPA. Цитогенетические перестройки представлены сбалансированными транслокациями или инверсиями, выявляемыми у 20-30% больных ОМЛ. Такие перестройки могут встречаться как одиночно, так и в сочетании с другими хромосомными аберрациями или мутациями, что может существенно повлиять на прогноз течения заболевания [154]. 16 Анализ кариотипа, который является независимым прогностическим фактором, позволяет выделять отдельные группы внутри одной нозологии и широко используется как основа для выбора адекватной (риск адоптированной) терапии. По результатам цитогенетического исследования пациентов с ОМЛ разделяют на следующие группы: с благоприятным, промежуточным I, промежуточным II и неблагоприятным прогнозами течения заболевания (таблица 2) [115]. Таблица 2 – Молекулярно-генетическая классификация ОМЛ Прогноз Благоприятный Факторы t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1 inv(16)(p13.1q22) или t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11 Мутации в гене NPM1 без FLT3-ITD (НК) Мутации в гене CEBPA (НК) Промежуточный-I Мутации в гене NPM1 и FLT3-ITD (НК) FLT3-ITD без мутаций в гене NPM1 (НК) Дикий тип NPM1 без FLT3-ITD (НК) Промежуточный-II Неблагоприятный t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL; Цитогенетические аберрации неклассифицированные в другие группы inv(3)(q21q26.2) или t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1 t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214 t(v;11q23); MLL перестройки –5 или del(5q); –7; abn(17p); комплексный кариотип* *Комплексный кариотип - ≥3 хромосомных аберраций (в отсутствии t(8;21), inv(16) or t(16;16), t(15;17), t(9;11)), t(v;11)(v;q23), t(6;9), inv(3) или t(3;3). 17 Следует отметить, что до 45% пациентов с ОМЛ не имеют хромосомных перестроек и классифицируются, как больные с нормальным кариотипом. Их относят в группу промежуточного I риска. Группа пациентов с НК является очень гетерогенной по скорости ответа на терапию и течению заболевания [75]. Последние исследования свидетельствуют о влиянии мутаций различных генов на течение ОМЛ у пациентов с НК. Так, наличие мутации FLT3-ITD считается неблагоприятным прогностическим фактором, а пациентов с НК и мутациями в генах NPM1 и CEBPA без FLT3-ITD относят к группе благоприятного прогноза [97; 127]. Данная большая группа больных с НК нуждается в поиске новых прогностических маркеров и проведении дополнительных исследований патогенеза заболевания с целью подбора адекватного режима терапии. У таких пациентов молекулярные методы анализа дают возможность получить более полную информацию о развитии и прогрессии лейкозогенеза. К группе пациентов с благоприятным прогнозом относят больных с транслокациями t(8;21) и inv16(p13q22)/t(16;16)(p13;q22), известными как аберрации с участием основного связывающего фактора (СВF – core binding factor). Наличие данных перестроек ассоциировано с достижением полных ремиссий (ПР) у более чем 90% пациентов, а также с пятилетней безсобытийной выживаемостью (БСВ) в 50% случаев и с резко снизившимся за последние годы количеством рецидивов [82]. Основную часть пациентов с неблагоприятным прогнозом составляют больные с комплексным кариотипом (наличие трех или более хромосомных аберраций структурного или численного характера). В последнее время детальный анализ данной группы, привел к выделению субгруппы с наиболее неблагоприятным исходом – это пациенты с моносомным кариотипом (МК) [32]. МК определяется как две или более моносомии или одиночная моносомия с дополнительной структурной перестройкой. МК является относительно часто встречающейся патологией кариотипа при ОМЛ (около 10% всех случаев, с увеличением до 20% у пожилых пациентов), а 4х-летняя выживаемость в данной субгруппе составляет только 3% по сравнению с 13% без МК [31; 108]. Таким 18 образом, цитогенетическое исследование является одним из обязательных методов анализа в дебюте ОМЛ, позволяющих выявить у пациентов МК, ассоциирующийся с наиболее высоким риском прогрессии заболевания. 1.2.2 Классификация и этиопатогенез МДС Наиболее часто МДС возникает de novo (первичный МДС), но есть случаи, когда заболевание является следствием предшествующего воздействия радиации или химиотерапии по поводу других (опухолевых) заболеваний (вторичный МДС) [3]. Диагноз МДС ставится после тщательного исследования мазков периферической крови и подтверждается обнаружением в костном мозге признаков дисплазии ростков кроветворения и гиперклеточности. Стандартная цитогенетика вместе с FISH являются незаменимыми методами как для диагностики МДС, так и для определения прогностических особенностей течения заболевания. ФАБ классификация МДС, опубликованная в 1982 году, базировалась на количестве миелобластов в периферической крови (ПК) и костном мозге (КМ), моноцитов и кольцевых сидеробластов в ПК. Таким образом, было выделено 5 вариантов МДС: рефрактерная анемия (РА), рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами (РАКС), рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ), рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации (РАИБ-Т) и хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ). В 1999 году (дополненная в 2001, 2008 годах) была опубликована классификация ВОЗ, которая содержала 7 вариантов МДС. В ФАБ классификацию было предложено внести следующие изменения: убрать вариант РАИБ-Т; классифицировать миелодиспластическую/миелопролиферативную дисплазию; ХММЛ как установить количество бластов, разграничивающее МДС от ОМЛ на уровень 20%; включить в классификацию цитогенетические аберрации из-за их высокой прогностической значимости (выделить 5q- синдром в отдельную группу) [26]. 19 Международная прогностическая шкала IPSS (International Prognostic Scoring System) была создана в 1997 году и включала данные о числе цитопений в ПК, проценте бластных клеток в КМ и цитогенетических поломках. Согласно последней дополненной шкале R-IPSS (revised International Prognostic Scoring System), выделяют 5 прогностических групп, основанных на хромосомных аберрациях, выявленных у больных МДС: с очень хорошим, хорошим, промежуточным, плохим и очень плохим прогнозами (рисунок 1). Еще одна шкала – WPSS, объединившая классификацию ВОЗ совместно с IPSS, содержит также данные о зависимости пациентов от гемотрансфузий. Рисунок 1 – Классификация R-IPSS [66] На данный момент нет точных данных о причинах трансформации нормального гемапоэза в неэффективный диспластический. Предполагается, что данный процесс является многоступенчатым и в его регуляции могут принимать участие генетические, эпигенетические изменения, повреждения сигнальных рецепторов и факторов микроокружения. На первом этапе происходит инициация процесса за счет воздействия внешних факторов (радиация, химические соединения, тяжелые металлы, курение) у генетически предрасположенных лиц (с естественными полиморфизмами генов, отвечающих за репарацию ДНК и метаболизм канцерогенов). Возникающие при этом мутации специфических генов 20 приводят к гиперэкспрессии проапоптотических онкопротеинов, таких как Myc и P53. Таким образом, избыточный апоптоз на ранних стадиях заболевания обуславливает неспособность КМ экспортировать необходимое количество клеток в ПК, что подтверждается значительным количеством цитопений в ПК [4]. На более поздней стадии регуляция таких генов как NF-κB, p-Akt, Bim-1, Bcl-2, Bcl-XL и белков теплового шока приводит к супрессии апоптоза и нарастанию массы лейкозных клеток. На данном этапе наблюдается появление различных хромосомных аномалий, которые встречаются у 30-50% пациентов с de novo МДС и 80% больных со вторичным МДС [36; 173]. Наиболее типичные хромосомные аберрации, описанные при МДС – это частичная или полная потеря хромосом, например, -5, 5q-, -7, 7q-, 11q-, 13q-, 20q-, -Y [72]. Обнаружение дополнительных хромосом встречается реже и в основном это – +8. Такие сбалансированные перестройки, как t(15;17), inv(16) и t(8;21) крайне редко встречаются у пациентов с МДС [50]. Данные хромосомные изменения, как правило, сопровождаются мутациями таких генов как FLT3, NRAS, P53, а также метилированием генов-промоутеров. Таким образом, комплексная диагностика пациентов с МДС, в том числе с использованием таких чувствительных и высокоинформативных методов, как кариотипирование, FISH и молекулярно-генетическое исследование, дает возможность разделять пациентов на прогностические группы риска и выбирать адекватное терапевтическое пособие. 1.2.3 Возраст как независимый прогностический фактор у больных ОМЛ и МДС ОМЛ и МДС – заболевания, чаще выявляемые у пожилых людей (медиана составляет 66 лет и 72 года, соответственно), с резко увеличивающейся частотой заболеваемости после 55 лет (рисунок 2). 21 Рисунок 2 – Заболеваемость ОМЛ в зависимости от возраста [164] Возраст больного на момент постановки диагноза является одним из важнейших независимых прогностических факторов у пациентов с ОМЛ и МДС [33]. Основными причинами низкой выживаемости в группе пациентов пожилого возраста по сравнению с молодыми больными являются резистентность к проводимой терапии, а также высокий риск развития тяжелых токсических осложнений [99]. Это связано в первую очередь с особенностями биологических свойств лейкозных клеток у пожилых пациентов. Ряд исследователей показали, что лейкозные клетки у пожилых больных чаще экспрессируют антиген CD34, ген множественной лекарственной резистентности трансмембранный P-гликопротеин (кодируется геном (MDR1), ABCB1), а также который обеспечивает активное выведение цитостатиков (антрациклинов) из клеток [105]. В результате возникает полирезистентность к проводимой химиотерапии. Показано, что процент резистентных форм заболевания увеличивается с каждыми десятью прожитыми годами [58]. Важным биологическим фактором, который позволяет прогнозировать течение ОМЛ и МДС, является кариотип. Низкие частота, длительность полных ремиссий, а также общая выживаемость (ОВ) ассоциированы преимущественно с множественными цитогенетическими поломками [7]. У пожилых больных по сравнению с молодыми наблюдается увеличение числа неблагоприятных 22 цитогенетических аберраций [1]. Ретроспективный анализ пяти клинических исследований SWOG (Southwest Oncology Group) показал, что свыше 50% пациентов старше 75 лет имеют неблагоприятные цитогенетические перестройки, которые ассоциируются с низким уровнем полных ремиссий – 33%. Тем не менее, даже с благоприятным цитогенетическим прогнозом, пожилые пациенты показывают худшую выживаемость по сравнению с более молодыми (совместное исследование SWOG и AMLCG (acute myeloid leukemia cooperative group)) (рисунок 3). Это объясняется тем, что даже при отсутствии у пожилых больных резистентности к цитостатическим препаратам и редукции общей массы опухолевого клона, с возрастом сильно снижается способность КМ к восстановлению. Рисунок 3 – Пятилетняя выживаемость пациентов ОМЛ в зависимости от возраста [164] Риск смерти от тяжелых токсических осложнений также увеличивается с возрастом пациента в связи с ухудшением общего состояния здоровья больного, функционирования различных систем организма и присоединением сопутствующих заболеваний. Из-за высокого уровня коморбидности, пожилые пациенты изначально получают менее интенсивную химиотерапию. Juliusson G. с соавторами сообщали, что только 45% больным в группе от 70 до 74 лет была предложена интенсивная химиотерапия по сравнению с 92% больных от 60 до 64 лет и 98% для группы моложе 50 лет [90]. По результатам исследования Menzin с соавторами, из 2657 пациентов старше 65 лет только 30% была назначена 23 интенсивная химимотерапия. Медиана выживаемости в данной группе составила два месяца, а 2-х летняя ОВ составила лишь 6% [109]. Совокупность данных об особенностях течения заболевания у пожилых пациентов послужила основой для формирования различных прогностических моделей, способствующих выбору адекватной терапии для данной сложной группы больных. Несмотря на это, пожилой возраст остается одним из основных факторов, негативно влияющих на количество полных ремиссий и выживаемость. 1.3 Генетические аберрации, участвующие в патогенезе ОМЛ и МДС 1.3.1 Хромосомные нарушения и мутации генов при ОМЛ Предполагают, что в основе патогенеза ОМЛ лежит многоступенчатый процесс, который включает два основных этапа [88]. На начальном этапе появление мутаций I класса инициирует митоген-независимую пролиферацию и обеспечивает выживаемость лейкозных клеток, которые, тем не менее, сохраняют способность к дифференцировке. Однако возникающая при этом генетическая нестабильность предрасполагает к возникновению дополнительных изменений – мутаций II класса, которые воздействуют на регуляцию транскрипции, блокируя созревание клеток. Считается, что именно комбинация мутаций двух классов приводит к развитию лейкоза [137; 176]. К I классу относятся мутации генов, участвующих в активации сигнальных путей – это рецепторные тирозинкиназы (FLT3, СKIT) и протоонкогены (NRAS). II класс мутаций представлен генетическими перестройками, сопровождающимися формированием химерных генов, функционирующих как транскрипционные факторы (RUNX1-RUNX1T1, MYX11-CBFB, PML-RARA). Нарушения в эпигенетической регуляции (гены, участвующие в метилировании ДНК – TET2, IDH1/2, DNMT3A) относят к мутациям III класса [123]. На данный момент, исследователи предполагают, что в патогенезе ОМЛ участвует три и более аберраций [155]. Благодаря использованию метода полногеномного секвенирования удалось подтвердить данную теорию и появилась возможность 24 контролировать количество и эволюцию лейкозного клона на разных этапах развития заболевания [52]. Такой подход показывает, что ОМЛ, будучи моноклональным или олигоклональным в дебюте заболевания, может приобретать в процессе развития новые субклоны за счет появления дополнительных мутаций. То есть, лейкемические клетки также как и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) имеют иерархию и стандартная химиотерапия способна воздействовать только на более дифференцированные лейкозные клетки, что подтверждает необходимость использования комбинации химиотерапии для уменьшения объема опухолевой массы и таргетных препаратов, направленных против образующихся субклонов с дополнительными мутациями (рисунок 4). Рисунок 4 – Гипотетическая модель развития de novo и вторичного ОМЛ [142] Наиболее изучены в настоящее время генетические механизмы лейкозогенеза, связанные с участием, так называемого основного связывающего фактора (CBF). CBF – гетеродимерный транскрипционный фактор, состоящий из двух субъединиц (CBFα и CBFβ) и играющий ключевую роль в нормальном гемопоэзе [77; 125]. Субъединица CBFα связывается непосредственно с промотерной последовательностью генов, вовлеченных в гемопоэз, а CBFβ 25 усиливает афинность связи в образовавшемся комплексе и препятствует его деградации (рисунок 5). Оба гетеродимерных компонента вовлечены в хромосомные транслокации, ассоциированные с лейкемией [154]. Хромосомные аберрации t(8;21) и inv(16)/t(16;16) приводят к сцеплению компонентов CBF с другими генами и таким образом изменяют их свойства. Рисунок 5 – Роль CBF в транскрипционной активации генов, ответственных за синтез интерлейкина-3 (ИЛ-3), гранулоцитарно-моноцитарного колонестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), рецептора М-КСФ, Т-клеточного рецептора фактора роста, промотор тяжелой цепи иммуноглобулина (Eµ) и других [46] Сбалансированная реципрокная транслокация t(8;21)(q22;q22), часто выявляемая цитогенетическая перестройка у пациентов с ОМЛ (встречается у 15% взрослых больных), ассоциируется с M2 вариантом (30-40% случаев) [83]. Характерная клиническая особенность пациентов с t(8;21) связана с благоприятным прогнозом течения заболевания, высоким уровнем ремиссий и длительной медианой выживаемости [5; 114]. Транслокация между 8 и 21 хромосомами затрагивает ген AML1 (CBFα, RUNX1) на 21 хромосоме и ген ETO (RUNX1T1) на 8 хромосоме. Образующийся в результате химерный ген RUNX1/RUNX1T1 ингибирует транскрипционную активность нормального AML1, что приводит к нарушению процессов созревания и развития гемопоэтических клеток [84]. Транслокация t(8;21) часто встречается вместе с другими хромосомными перестройками, например, с потерей половой хромосомы, а также примерно в 3-4% случаев ОМЛ обнаруживают вариантную t(8;21) [168]. 26 Клинически пациенты с t(8;21) показывают хороший ответ на химиотерапию с 97% уровнем ПР и показателем десятилетней ОВ 61% [113]. Инверсия inv(16)(p13.1q22) или t(16;16)(p13.1;q22), характерные аберрации для ОМЛ с эозинофилией, приводят к сцеплению генов CBFβ на 16q22 и MYH11 на 16p13. Инверсия inv(16)/t(16;16) является единственной перестройкой в 70% случаев ОМЛ, дополнительно могут встречаться трисомии 22, 21 и 8 хромосом и делеция 7q, которые не влияют на благоприятный прогноз течения заболевания. 92% пациентов с inv(16)/t(16;16) выходят в ПР с десятилетней ОВ в 55% [77]. Таким образом, оба компонента транскрипционного фактора CBF (α и β) играют ключевую роль в развитии приблизительно 30% острых нелимфобластных лейкозов [3]. Несмотря на то, что CBF-лейкозы относят к группе с благоприятным прогнозом, у 30-50% пациентов наблюдается рецидив заболевания [126]. Группа достаточно гетерогенна в отношении длительности ПР, что вероятно обусловлено наличием широкого спектра мутаций генов (например, СKIT, FLT3, NRAS и KRAS) примерно у 90% пациентов с ОМЛ с t(8;21) и inv(16) (рисунок 6). Рисунок 6 – Вторичные генетические повреждения при CBF-ОМЛ [126] 27 Так как данные мутации могут существенно влиять на прогноз течения заболевания и ухудшать показатели ОВ и безрецидивной выживаемости (БРВ) больных, они должны быть включены в перечень обязательных исследований у больных ОМЛ как в дебюте заболевания, так и на различных этапах его развития. Например, ретроспективные исследования подтвердили неблагоприятное прогностичекое влияние мутаций в гене CKIT у пациентов с CBF-ОМЛ [8]. На сегодняшний день проведение диагностики данных мутаций включено в рекомендации национальной группы по исследованию рака (NCCN), где CBFОМЛ с мутациями в гене CKIT относят к группе промежуточного, а не благоприятного риска. Также значительное влияние на длительность безрецидивной и общей выживаемости оказывают гиперлейкоцитоз, мутации в гене FLT3 и пожилой возраст. Несмотря на достижения в теоретическом понимании природы CBF-ОМЛ, остаются сложности в подборе терапии для пациентов с данной формой лейкоза. Эта проблема была частично решена в случае острого промиелоцитарного лейкоза. ОПЛ соответствует M3 варианту (ФАБ) и насчитывает примерно 10% всех случаев ОМЛ [104]. Благодаря изучению патогенетических молекулярногенетических механизмов развития заболевания, ОПЛ сейчас является одной из самых курабильных форм ОМЛ. Диагноз ОПЛ ставится в соответствие с морфологическими особенностями лейкемических клеток, результатами иммунофенотипирования и наличием диссеминированной интраваскулярной коагуляции. Крайне важным является постановка точного диагноза ОПЛ в дебюте заболевания, так как без использования препаратов трансретиноевой кислоты (ATRA, третиноин) медиана выживаемости пациентов с ОПЛ может составлять менее одного месяца [2]. Применение препарата ATRA, который индуцирует дифференцировку злокачественных промиелоцитарных клеток, позволяет достигать продолжительные ремиссии у более 80% пациентов [124]. Примерно у 98% больных ОПЛ обнаруживается реципрокная транслокация t(15;17), ведущая к образованию химерного гена PML-RARα, который является высокоспецифической аберрацией для ОПЛ. В результате транслокации 28 происходит перенос гена опухолевого супрессора PML с 15-й хромосомы на длинное плечо 17-й хромосомы в регион гена рецептора ретиноевой кислоты RARα. Продуктом химерного гена PML-RARα является белок, накапливающийся в ядре и цитоплазме миелоидных клеток и ингибирующий процесс их дифференцировки за счет вовлечения транскрипционных факторов и гистоннаправленных ферментов [12]. Предполагается также, что PML-RARα инактивирует по доминантно-негативному механизму апоптогенную функцию нормального белка PML, образуя с ним гетеродимеры. В результате альтернативного сплайсинга могут образоваться три разных белковых продукта: bcr1, bcr2 или bcr3 [117; 144]. У небольшого числа больных ОПЛ обнаруживают t(11;17). Данная транслокация приводит к образованию двух типов химерных белков: PLZF-RARα (почти во всех случаях нечувствительный к ATRA) и NUMA-RARα. Другие редкие варианты ОПЛ (~0.5%) характеризуются наличием t(5;17) (химерный белок NPMRARα, чувствителен к ATRA) и STAT5β-RARα при интерстициальной del(17) (нечувствителен к ATRA). Цитогенетическая и молекулярно-генетическая диагностика таких редких форм ОПЛ позволяет определить чувствительность химерных белков к таргетным препаратам и подобрать адекватную терапию. Выявляются также дополнительные к t(15;17) хромосомные перестройки: трисомия 8 хромосомы, делеция 7q, 9q и isoder(17q)t(15;17), которые однако не оказывают негативного влияния на благоприятный прогноз заболевания. Пациенты с t(15;17) в 93% случаев достигают ПР с десятилетней ОВ 81% [113; 138]. В настоящее время, среди обнаруженных генетических аберраций выделяют девять функциональных категорий, которые могут встречаться либо совместно, либо взаимно исключать друг друга (рисунок 7). 29 Рисунок 7 – Круговая диаграмма генетических изменений, встречающихся при ОМЛ [39] Отмечают высокую частоту встречаемости сочетаных мутаций в генах FLT3, DNMT3A и NPM1, что обосновывает включение больных из этой группы в отдельную подгруппу ОМЛ [151]. С другой стороны, мутации, относящиеся к одному классу и несущие одинаковую функциональную нагрузку, практически никогда не встречаются одновременно у одного пациента. Например, мутации в генах NPM1, RUNX1, TP53 и CEBPA у больных ОМЛ не обнаруживают сочетано. В тех редких случаях, когда такие мутации обнаруживают при обследовании одного больного, говорят о том, что они находятся в различных субклонах [17; 142]. Крупное проспективное исследование показало, что у более 99% пациентов с ОМЛ обнаруживается хотя бы одна соматическая мутация из показанных девяти категорий [163]. Также было отмечено, что в группе промежуточного риска наблюдалась высокая гетерогенность обнаруженных мутаций по сравнению с группами благоприятного и неблагоприятного прогноза (рисунок 8). 30 Рисунок 8 – Частота встречаемости мутаций различных генов при ОМЛ [163] 1.3.2 Хромосомные нарушения и мутации генов при МДС Делеция 5q- является наиболее часто встречающейся поломкой при МДС (выявляется в 10-15% случаев). Делеция длинного плеча 5 хромосомы – это интерстициальная делеция крупного сегмента различных размеров в районе 5q1333 (так называемый CDR (common deleted region) – делетированный регион) [10]. CDR содержит множество генов, из которых наибольший интерес представляют – SPARC, NPM1, CTNNA1(α-catenin) и EGR1. При отсутствии других аберраций наличие делеции 5q- ассоциируется с благоприятным прогнозом и низким риском трансформации в ОМЛ. Риск трансформации увеличивается в случае обнаружения у пациентов более 5% бластов в костном мозге и дополнительных хромосомных аберраций. Для лечения пациентов МДС низкого риска с делецией 5q- в 2005 организацией FDA (food and drug administration) был одобрен препарат второго поколения иммуномодуляторов – леналидомид. Леналидомид селективно ингибирует рост патологического клона с del(5q) за счет индукции экспрессии гена SPARC [95]. Моносомия 7 хромосомы или делеция 7q- (регионы 7q11-22 и 7q31-36) являются частой находкой при миелоидных заболеваниях, встречаются в 5-10% случаев de novo МДС и почти в 50% вторичных МДС. Потеря хромосомного материала приводит к развитию МДС за счет нарушения функций генов- 31 опухолевых супрессоров. Моносомию 7 хромосомы рассматривают как дополнительную (II класс мутаций) аберрацию, участвующую в процессе развития МДС/ОМЛ. Данная аберрация ассоциируется с низкой чувствительностью к проводимой терапии и высоким риском трансформации в ОМЛ [122]. Цитогенетический анализ является одним из основных методов в диагностике МДС (внесен в рекомендации ВОЗ 2008) (рисунок 9). Рисунок 9 – Частота встречаемости хромосомных аберраций при МДС [145] Так, при рефрактерных цитопениях подтверждением диагноза МДС служат только характерные хромосомные перестройки. Данный метод используется для распределения пациентов по группам риска в современных классификациях, например, IPSS, WPSS, R-IPSS [68]. Однако, использование стандартного метода кариотипирования позволяет обнаружить хромосомные перестройки только у половины пациентов с МДС. Вторую половину больных МДС относят к группе низкого риска, из которой более 80% пациентов могут иметь НК. 32 Дополнительное использование более чувствительных методов, например, сравнительной геномной гибридизации или метода детекции однонуклеотидных замен позволяет детектировать у больных с НК соматические или клональные несбалансированные хромосомные аберрации. В том числе: криптические делеции и дупликации, а также потерю гетерозиготности [37; 118]. A. Mohamedali с соавт. проанализировали 119 пациентов из группы МДС низкого риска методом сравнительной геномной гибридизации и обнаружили следующие хромосомные маркеры, не детектируемые стандартной цитогенетикой: однородительские дисомии в 46%, делеции в 10% и дупликации в 8% случаев [112]. До недавнего времени информация о специфичных мутациях генов при МДС была крайне скудной. Использование метода полногеномного секвенирования позволило идентифицировать соматические мутации у 75-80% пациентов с МДС. Данные повторяющиеся мутации чаще затрагивают гены, участвующие в эпигенетической регуляции (TET2, IDH1/2, DNMT3A), регуляции процессов сплайсинга (SF3B1, SRSF2), сигналинга цитокинов (RAS) и модификации гистонов (ASXL1, EZH2) [86]. Часто при МДС встречаются мутации генов TET2, SRSF2 и ASXL1. Кроме того, наиболее изучены в настоящее время мутации генов, которые считались на протяжении 15 лет до открытия метода полногеномного секвенирования единственными специфичными для МДС мутациями (например, в генах RAS, P53). Мутации в генах NRAS и KRAS детектируются примерно у 10-30% пациентов с МДС и могут быть идентифицированы как в дебюте заболевания, так и при прогрессии. Их прогностическое значение до сих пор неизвестно, но многие авторы сообщают об их неблагоприятном влиянии на течение заболевания. Мутация FLT3-ITD редко выявляется у больных МДС (до 5% случаев) и почти всегда у пациентов из группы высокого риска МДС. Точечная мутация в гене Jak2 V617F, часто выявляемая при хронических миелопролиферативных неоплазиях, детектируется примерно в 10% случаев с del(5q), а при варианте РАИБ-Т ее встречаемость увеличивается до 66% [140]. 33 R. Bejar с соавторами обследовали 439 больных МДС, мутации у которых были идентифицированы в 18 генах у 51% всех пациентов и у 52% больных с НК [24]. Обнаружение мутаций в генах RUNX1, P53 и NRAS ассоциировалось с тяжелой тромбоцитопенией и высоким количеством бластов в костном мозге. Мутации в генах P53, EZH2, ETV6, RUNX1 и ASXL1 оказывали независимое неблагоприятное влияние на прогноз заболевания и коррелировали с худшей ОВ. Также было показано наличие связи между вариантом кариотипа и мутациями в некоторых генах (рисунок 10). Например, мутации в гене TET2 чаще встречались у пациентов с НК и почти всегда детектировались совместно с мутациями в других генах. У больных с комплексным кариотипом часто детектировали мутации в гене P53. 24,2% пациентов с мутацией в гене P53 имели дополнительно повреждения 17 хромосомы, что говорит о полном подавлении нормального функционирования гена P53. Р Рисунок 10 – Мутации различных генов и цитогенетические аберрации у больных МДС 1.4 Анализ мутаций в генах FLT3, CKIT, NRAS и NPM1 К настоящему времени возможности молекулярно-генетических методов исследования позволили выявить широкий спектр мутаций различных генов, специфичных для больных ОМЛ и МДС. Наибольший интерес для исследователей представляют гены, кодирующие FLT3, NPM1, CEBPA, CKIT, 34 NRAS, WT1, ТЕТ2, DNMT3A, MLL и некоторые другие [59]. Среди них был проведен отбор генов, с наиболее часто встречающимися мутациями при ОМЛ и МДС и высокой прогностической значимостью. Рецептор FLT3 (fms-related tyrosine kinase 3) является одним из представителей суперсемейства трансмембранных рецепторных тирозинкиназ. FLT3 локализован в локусе 13q12 и экспрессируется на клеточной поверхности гемопоэтических прогениторных клеток, кодирует белок, состоящий из 993 аминокислотных остатков. Структуру FLT3 можно представить в виде двух частей: рецепторная часть расположена на клеточной мембране и состоит из 5 иммуноглобулиновых доменов, которые связываются с лигандом. Внутренняя часть состоит из подмембранного (юкстамембранного) домена и двух каталитических (киназных) доменов [159] (рисунок 11). Рисунок 11 – Структура III класса семейства рецепторных тирозинкиназ [38] Экспрессия FLT3 тирозинкиназы обнаружена преимущественно в стволовых кроветворных CD34+ клетках, в лимфоцитах тимуса и лимфоузлов. FLT3, как и другие члены III класса рецепторных тирозинкиназ, играет существенную роль в пролиферации, дифференцировке и выживании нормальных гемопоэтических стволовых клеток [153]. Известно, что многие клетки 35 гемопоэтического ряда (клетки костномозгового окружения, фибробласты, клетки миелоидного и В- и Т-клеточных рядов) способны продуцировать лиганд – трансмембранный белок, переходящий в растворимую форму во внеклеточном пространстве и взаимодействующий со своим рецептором. Связывание рецепторов с лигандом ведет к их димеризации и взаимодействию с внутриклеточными Src-киназами, что приводит к запуску каскада реакций по MAP-киназному пути и экспрессии генов, отвечающих за пролиферацию клеток. Возникновение мутаций приводит к конститутивной активации рецептора и он становится способен к независимой от лиганда димеризации и аутофосфорилированию, при этом активируя такие факторы, как SHC, RAS, ERK, AKT и STAT5 белки [111] (рисунок 12). Рисунок 12 – Сигнальные пути, активируемые за счет связывания рецептора FLT3 со своим лигандом [161] Мутации в гене FLT3 являются одними из наиболее часто встречающихся мутаций у пациентов с ОМЛ (обнаруживаются в 15-30% случаев). У больных МДС частота встречаемости мутаций в гене FLT3 составляет 5-10%. Мутации, как правило, затрагивают два района гена – район с 14 по 15 экзон (подмембранный домен), и 20 экзон (киназный домен). Для FLT3 рецептора 36 характерно 2 основных типа мутаций – внутренняя тандемная дупликация (FLT3ITD) и точечная мутация в «А-петле» (FLT3-ALM) [81]. FLT3-ITD встречается примерно у 24% больных ОМЛ, размер инсерции может составлять от 3 до 400 пар оснований [70]. Считается, что мутация FLT3-ITD нарушает структуру домена, который в норме препятствует спонтанной димеризации рецептора. У детей с диагнозом ОМЛ FLT3-ITD встречается значительно реже по сравнению со взрослыми пациентами (у 1% детей в возрасте до 1 года), тогда как частота встречаемости мутации в киназном домене совпадает. Мутация FLT3-ITD детектируются у многих пациентов с t(15;17) (40-45%) и t(6;9) (70%), ассоциируется с гиперлейкоцитозом и повышенным содержанием бластов в костном мозге, редко встречается при М6, М7 и М0 (ФАБ) вариантах ОМЛ [62]. В редких случаях (5%) у больных ОМЛ помимо FLT3-ITD в подмембранном домене встречаются небольшие инсерции, делеции и миссенс мутации (FLT3-JM-PMs). Несмотря на то, что клиническая значимость данных мутаций остается неизвестной, D.L. Stirewalt с соавторами показали, что FLT3JM-PMs также как и FLT3-ITD приводят к конститутивной активации рецептора, но в меньшей степени (степень фосфорилирования рецептора оказалась ниже) [157]. Точечная мутация в 20 экзоне гена FLT3 (чаще всего замена аспарагина в 835 положении) встречается у 5-7% пациентов с ОМЛ, чаще у больных с НК. Мутации в гене FLT3 могут быть сочетаны с мутациями в генах NPM1 и DNMT3A и обнаруживаются как в дебюте заболевания, так при развитии рецидива [103]. Есть данные о том, что наличие мутации в гене NPM1 у пациентов с FLT3-ITD с невысоким уровнем аллельной нагрузки может снижать негативное влияние тандемной дупликации на прогноз течения заболевания [130]. Наличие мутации FLT3-ITD у больных ОМЛ ассоциировано с резистентностью лейкозных клеток к стандартной терапии, быстрой прогрессией заболевания и неблагоприятным прогнозом как у взрослых, так и у детей [171]. Исследование механизмов экспрессии FLT3-ITD и FLT3-ALM показали, что активация FLT3 рецептора при наличии разных мутаций не эквивалентна [79]. 37 Для пациентов с мутацией FLT3-ITD характерны худшие показатели БРВ и ОВ, а также более длительный период выхода в полную ремиссию. Мультивариантный анализ установил, что наличие FLT3-ITD является самым значимым неблагоприятным прогностическим фактором по частоте достижения ремиссий и бессобытийной выживаемости. Выживаемость пациентов с FLT3-ITD составляет всего 20-30% по сравнению с 50% без мутации [158]. Однако необходимо учитывать, что прогностическая ценность обнаружения данной мутации промежуточного показана риска. У преимущественно больных с для пациентов благоприятным из группы прогнозом и с неблагоприятными хромосомными перестройками наличие мутаций в гене FLT3 не оказывало статистически значимого влияния на течение заболевания [47]. В то же время, исследователи отмечают некоторые молекулярные особенности мутаций в гене FLT3, коррелирующие с прогнозом течения заболевания. Например, важную роль играет соотношение мутантного аллеля ITD к аллелю дикого типа (ITD-AR). Однако основной задачей остается установление порогового уровня. Так, для оценки прогноза у пациентов с FLT3-ITD Thiede C. с соавторами использовали в своем исследовании значение порогового уровня равное 0,78. Общая выживаемость пациентов с низким уровнем аллельной нагрузки (менее 0,78) составила 60%, тогда как у пациентов с ITD-AR более 0,78 общая выживаемость была равна 0% (p=0,006) [165]. Похожие результаты были получены и при исследовании особенностей течения заболевания у детей. В работе Zwaan C.M. с соавторами было продемонстрировано, что пациенты с уровнем ITD-AR более 0,69 имели низкий уровень ОВ, в то время как пациенты с ITD-AR менее 0,69 не отличались по прогностическим особенностям течения заболевания от пациентов без мутации [182]. Механизмы регуляции уровня аллельной нагрузки на сегодняшний день находятся в стадии изучения. Одним из возможных объяснений высокого уровня ITD-AR у некоторых пациентов с ОМЛ является потеря гетерозиготности хромосомы 13q12 [30]. Еще одним прогностическим фактором может служить размер инсерции у пациентов с FLT3-ITD. Исследование 151 больного с мутацией показало, что 38 пациенты с крупным размером вставки имели статистически значимый более высокий риск рецидива по сравнению с контрольной группой [158]. Исследования в данной области продолжаются, но очевиден тот факт, что различные характеристики мутации в подмембранном домене (размер, вид, аллельная нагрузка) могут иметь уникальную биологическую и клиническую значимость, тем самым внося дополнительную сложность в использование FLT3-ITD в качестве прогностического маркера. Лечение пациентов с FLT3-ITD часто является трудной задачей, так как больные плохо отвечают на стандартные режимы химиотерапии. Поэтому альтернативным, рекомендуемым видом терапии для таких больных, может служить аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК). Использование алло-ТГСК достоверно увеличивает показатели ОВ и БРВ у больных ОМЛ с плохим прогнозом по сравнению с группой пациентов, получающих интенсивную химиотерапию. Вместе с тем высокий риск смерти, связанной с проведением алло-ТГСК (20%), а также тот факт, что после трансплантации данные пациенты остаются в группе высокого риска раннего рецидива делают спорным решение о проведении трансплантации [101]. Сигнальный путь рецептора FLT3 является удобной мишенью для ингибиторов тирозинкиназ (ИТК). В настоящее время найдены несколько видов соединений, прошедших разные фазы клинических исследований и показывающих различную эффективность при терапии больных ОМЛ с мутациями в гене FLT3. Сорафениб относят к наиболее изученным ингибиторам FLT3 первого поколения. Препарат показал отличную фармакокинетику и значительную активность в первой фазе исследований. Он специфично редуцирует основную массу лейкемических бластов в ПК (с 81% до 7,5%) и КМ (с 75,5% до 34%) [181]. Также активно проводится изучение активности других ингибиторов FLT3: AC220, CEP701, PKC412, SB1518, TG02 и т.д. Однако проблема резистентности пациентов к ингибиторам остается нерешенной. Результаты исследований показывают, что современные ИТК не являются высокоэффективными одиночными агентами для пациентов с ОМЛ с мутациями в 39 FLT3, но есть данные об успешном их применении в комплексе со стандартной химиотерапией [128]. Протоонкоген CKIT (v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) локализован в локусе q12 хромосомы 4 человека и кодирует трансмембранный гликопротеин, который также как и FLT3 относится к семейству тирозинкиназ III типа, чьим лигандом является фактор стволовых клеток. CKIT (CD117) часто используют в качестве фенотипического маркера гемапоэтических стволовых клеток. В норме CKIT экспрессируется только в недифференцированных или слабо-дифференцированных клетках. После связывания рецептора со специфичным лигандом происходит его димеризация, фосфорилирование ключевых киназных сайтов, приводящее к активации сигнальных путей RAS/ERK, JAK/STAT и PI3K, Src киназ [106]. Активация данных путей при участии СKIT связана с пролиферацией, дифференцировкой, адгезией, секрецией, выживанием и реорганизацией клеточного цитоскелета. Мутации рецептора CKIT были описаны при различных миелоидных заболеваниях. В ранних исследованиях была отмечена связь мутаций в CKIT с патогенезом при мастоцитозе, а позднее мутации в этом гене были также описаны у пациентов с ОМЛ и МДС/МПЗ (миелопролиферативные заболевания) [106]. Гиперэкспрессия или мутации CKIT приводят к неконтролируемой стимуляции пролиферации клеток, снижению чувствительности к апоптотическим сигналам, изменению в процессах миграции и адгезии. Вместе с тем снижение чувствительности к апоптозу способствует возникновению лекарственной резистентности [167]. У больных ОМЛ экспрессия гена CKIT наблюдается также на поверхности полностью дифференцированных клеток. Мутации CKIT сравнительно редко встречаются у больных ОМЛ (2-8% всех случаев ОМЛ), и чаще ассоциируются с CBF-лейкозами (до 50% больных) и ОМЛ с трисомией 4 хромосомы (как одиночной, так и в сочетании с t(8;21)). В то же время мутации CKIT не были обнаружены у пациентов с t(15;17). Чаще всего мутации в гене CKIT детектируются у пациентов с вариантами M1, M4, M4eo и в 70% случаев M2. Активационные мутации CKIT в большинстве случаев 40 выявляются в подмембранном домене, который регулирует димеризацию рецептора, а также в киназном домене. Наиболее часто встречающейся мутацией является замена аспарагиновой кислоты в положении 816 киназного домена CKIT (экзон 17). Данная мутация приводит к конститутивной активации рецептора. Позже была обнаружена еще одна активационная мутация в 17 экзоне – N822K. Мутации 8 экзона затрагивают иммуноглобулиновые домены рецептора и представлены инсерциями и делециями до 6-7 нуклеотидов в районе Asp419. Также выявляют тандемные дупликации в 11 и 12 экзонах подмембранного домена рецептора [175; 180]. Проведенные исследования исключают обнаружение сочетанных мутаций в генах CKIT и FLT3. Это связано с идентичными функциями, выполняемыми данными рецепторными тирозинкиназами в клетке и подтверждается тем, что мутации в этих генах ассоциированы с различными цитогенетическими поломками: в гене CKIT – с t(8;21) и inv(16), в гене FLT3 – c t(15;17) и НК-ОМЛ. У пациентов с t(8;21) наличие мутаций в CKIT ассоциировано с гиперлейкоцитозом в дебюте заболевания и неблагоприятным прогнозом [15]. Cairoli R. с соавторами отмечали, что у пациентов с мутацией D816 гена CKIT статистически выше вероятность рецидива и более низкий уровень безсобытийной выживаемости по сравнению с больными без мутации (13,5% против 80%, соответственно) [34]. В то же время Care R.S. с соавторами обнаружили, что наибольший негативный прогностический потенциал имеют мутации 8 экзона гена CKIT у больных с inv(16) [35]. Обнаружение мутаций в гене CKIT может определять выбор препарата таргетной терапии. Исследования показали, что лейкемические клетки с мутацией в данном гене чувствительны к таким ИТК, как Иматиниб и Сунитиниб. Данные препараты способны ингибировать независимое от лиганда фосфорилирование рецептора CKIT. Гливек обладает значительной активностью против СKIT дикого типа и СKIT с мутациями в подмембранном домене, но неэффективен в отношении CKIT с точечными мутациями в тирозинкиназном домене. BMS354825 и Дазатиниб являются эффективными в обоих случаях [69; 91]. 41 Другим не менее важным геном, мутации в котором имеют важное прогностическое значение для пациентов с ОМЛ и МДС, является нуклеофозмин В23 (NPM1). Ген, кодирующий нуклеофозмин локализован в положении 5q35, состоит из 12 экзонов и кодирует 3 изоформы протеина – B23.1, B23.2, B23.3. Белок В23.1 состоит из 294 аминокислот и экспрессируется во многих тканях [44]. Гидрофобный N-конец белка отвечает за образование димеров и определяет активность белка как шаперона. Центральная часть протеина участвует в образовании комплексов между гистонами и нуклеосомами, способствуя их ацетилированию и влияя, таким образом, на регуляцию экспрессии генов. Гидрофильный C-конец имеет РНК- и ДНК-связывающую активность и несет сигнал ядерной локализации, обеспечивающий локализацию белка в ядре (рисунок 13) [9; 65]. Рисунок 13 – Структура и функции NPM1 [55] Таким образом, NPM1 выполняет в клетке множество функций: связывание, стабилизация и активация P53, приводящие к регуляции пролиферации и апоптоза; поддержание геномной стабильности (репарация двунитевых 42 разрывов); участие в биогенезе рибосом, регуляция дупликации и расхождения центросом [134]. Ген NPM1 способен функционировать одновременно и как онкоген и как супрессор, в зависимости от уровня экспрессии и места локализации в клетке. С одной стороны NPM1 является протоонкогеном, так как взаимодействует и обеспечивает стабилизацию многих регуляторов клеточного роста, в том числе супрессоров опухолей P53 и ARF, а также протоонкогена MDM2. С другой стороны он выполняет функцию супрессии развития опухолей, так как является ядерным сенсором онкогенного стресса, а в случае мутации обеспечивает чувствительность бластных клеток к химиотерапевтическим агентам [57]. В норме NPM1 имеет ядерную локализацию. Связываясь с супрессорами опухолей P53 и ARF он обеспечивает их точную внутриклеточную локализации и стабилизацию. В отсутствии NPM1 или при наличии мутации, ARF изменяет свою внутриклеточную локализацию, перемещается в цитоплазму и подвергается деградации, нарушая, таким образом, P53-ARF – опухоле-супрессорный путь. Кроме того отсутствие ядерного NPM1 приводит к дерегуляции FBW7γ (ядерной убиквитинлигазы, вовлеченной в деградацию MYC), что ведет к повышению экспрессии транскрипционного фактора MYC и нерегулируемой экспрессии генов, в том числе вовлеченных в клеточную пролиферацию и развитие опухолей [78]. Кроме того известно, что мутации гена NPM1 ассоциируются с благоприятным прогнозом, что связано с чувствительностью данных клеток к химиотерапевтическим препаратам и радиационной терапии. Полагают, что это опосредовано тем, что мутантный нуклеофозмин взаимодействует в цитоплазме с транскрипционным фактором (ТФ) NF-κB, регулирующим более 80 геновмишеней, удерживает его в цитоплазме и способствует деградации. Показано, что активность данного ТФ не только связана с устойчивостью опухолей к химиотерапевтическим агентам и радиационной терапии, но и то, что NF-κB сам может опосредовать экспрессию генов, вовлеченных в развитие опухолей, ангиогенез и метастазирование [43]. 43 Мутации в гене NPM1 являются наиболее часто встречающимися мутациями при ОМЛ (25%-35% всех случаев de novo ОМЛ и у 50-60% больных с НК). Частота встречаемости мутаций в NPM1 у пациентов старше 65 лет снижается до 16%. В норме происходит постоянная миграция белка из ядра в цитоплазму, с преимущественной локализацией в ядре, где он выполняет множественные функции. Мутации приводят к сдвигу рамки считывания и образованию более длинного белка, который локализуется в цитоплазме [41; 166]. Мутации в гене NPM1 крайне стабильны на протяжении всего течения заболевания и детектируются при развитии рецидива даже через несколько лет от постановки диагноза. Наличие мутаций в NPM1 взаимно исключает обнаружение мутаций в гене CEBPA. Мутации NPM1 ассоциированы с различными хромосомными аберрациями (15%) и обнаруживаются в CD34+ мультилинейной дисплазией (23%), лейкозных клетках и прелейкемических гемопоэтических стволовых клетках [54]. Могут встречаться сочетано с мутациями в генах FLT3, DNMT3A и IDHI. Клинические и лабораторные особенности ОМЛ с мутациями в NPM1 включают: высокую частоту выявления у женщин, гиперклеточность КМ и лейкоцитоз, повышенную экспрессию CD33 и отсутствие или низкую экспрессию CD34 [56]. Мутации в гене NPM1 представляют в основном инсерции от 4 до 11 пар нуклеотидов (в основном TCTG) в район домена кодирующего сигнал ядерной локализации (956-959). В гене NPM1 обнаруживают более 50 видов мутаций, которые обычно встречаются в гетерозиготе. Редко мутации затрагивают 9 и 11 экзоны гена и также как и при мутациях 12 экзона приводят к цитоплазматической локализации белка. По результатам многочисленных исследований, мутации в гене NPM1 являются фактором благоприятного прогноза у пациентов с НК [63; 147]. Не ясным на сегодняшний день остается прогностическое значение мутаций NPM1 в группе больных с различными хромосомными аберрациями. Также стоит отметить, что мнения исследователей расходятся в отношении прогноза для пациентов с мутациями в NPM1 совместно с FLT3-ITD. В большинстве работ 44 наличие мутаций гена FLT3 определяет неблагоприятный прогноз заболевания независимо от мутационного статуса NPM1 [64]. Прогностическая значимость мутаций NPM1 в сочетании с FLT3-ITD была рассмотрена в группе из 1485 больных ОМЛ. Обнаружение мутаций в NPM1 ассоциировалось с хорошим ответом на индукционную терапию и длительной ОВ только у пациентов без мутации FLT3-ITD [166]. У пациентов с НК старше 60 лет, получавших высокодозную химиотерапию мутации в NPM1 детектировались в 56% случаев и также ассоциировались с благоприятным прогнозом [23]. Verhaak R.G. с соавторами показали, что пациенты с НК и мутациями NPM1 в отсутствии FLT3-ITD имели статистически значимую лучшую ОВ и безсобытийную выживаемость по сравнению с группой больных без мутаций в NPM1 [172]. Противоречивые данные были получены исследовательской группой из Японии, которая при мультивариантном анализе выявила связь наличия мутаций в NPM1 с высоким уровнем выхода пациентов в ПР и одновременно с большим количеством рецидивов. В исследовании французской группы не были обнаружены отличия по количеству ПР и длительности ОВ у пациентов с и без мутаций в NPM1[20]. В настоящее время предполагаемая схема терапии молодых пациентов с мутациями в NPM1 в отсутствие FLT3-ITD включает проведение интенсивной химиотерапии, а также ауто-ТГСК. На сегодняшний день нет информации о наличии направленной терапии для больных ОМЛ с мутациями в NPM1. Тем не менее, есть данные об успешном использовании препарата ATRA наряду со стандартной химиотерапией у пожилых пациентов с мутациями в гене NPM1 в отсутствие FLT3-ITD [146]. Дополнительно используют NSC348884 – ингибитор олигомеризации NPM1, а также деметилирующий агент 5-азацитидин в качестве альтернативы химиотерапии для пожилых пациентов [22]. RAS онкогены кодируют семейство мембран-связывающих белков (семейство ГТФаз), которые регулируют сигнальную трансдукцию. Они играют важную роль в процессах пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Существует три функциональные гена RAS: NRAS (neuroblastoma RAS viral (v-ras) 45 oncogene homolog), KRAS и HRAS, состоящие из четырех экзонов каждый [156]. Все гомологи могут иметь мутации в 12, 13 и 61 кодонах, которые нарушают ГТФ-азную активность RAS, обеспечивая тем самым конститутивную активацию RAS белков и таких эффекторов как RAF и MAP/ERK киназы (рисунок 14). Рисунок 14 – Активация RAS сигнального пути [87] Мутации в гене NRAS встречаются гораздо чаще, чем в HRAS и KRAS. Преимущественно мутации затрагивают 12 кодон – 43,6%, обеспечивая замену глицина на аспарагин, в 21% случаев – 13 кодон, в 24,9% – 61 кодон [16]. Мутации в гене NRAS могут встречаться в сочетании с другими точечными мутациями (например, в гене RUNX1) и всегда выявляются в гетерозиготе [49]. Мутации в гене NRAS встречаются примерно у 10% больных ОМЛ и у 5% пациентов с МДС и приводят к повышенной активности RAS сигнального пути, усилению клеточной пролиферации и блокированию апоптоза [131]. При исследовании пациентов с МДС, K. Takahashi с соавторами показали, что наличие мутаций в гене NRAS ассоциируется с увеличением числа случаев трансформации МДС в ОМЛ [162]. В то же время Al-Kali A. с соавторами не обнаружили отличий между контрольной группой и группой пациентов с мутацией в NRAS в 46 отношении риска трансформации в ОМЛ и длительности ОВ, отмечая только повышенное содержание лейкоцитов в ПК и КМ в дебюте заболевания у больных с мутациями в NRAS [14]. У больных ОМЛ в основном не находят корреляции между частотой встречаемости мутаций в NRAS и такими параметрами, как возраст, пол, количество лейкоцитов в дебюте заболевания, вариант ОМЛ по классификации ВОЗ [139]. Некоторые исследователи отмечают высокий процент выявления мутаций в гене RAS у пациентов с M4 (ФАБ) вариантом ОМЛ, в частности у пациентов с inv(16)/t(16;16) (35%), у которых также чаще выявляются мутации 61 кодона NRAS по сравнению с остальными пациентами [29]. Значительно реже мутации в гене NRAS встречаются у пациентов ОМЛ с комплексным кариотипом (1,5%) и t(15;17) (2%). В исключительных случаях обнаруживают сочетание мутаций NRAS и FLT3-ITD (у 2% больных). Прогностическое влияние мутаций в гене NRAS на течение заболевания у пациентов с ОМЛ и МДС до сих пор до конца не изучено. В литературе есть данные о неблагоприятном прогностическом значении данных мутаций. Например, Y. Shen с соавторами описывают негативное прогностическое влияние мутаций NRAS при ОМЛ, включающее более низкий уровень достижения полных ремиссий и худшую бессобытийную выживаемость [151]. В то же время исследования A. Neubauer с соавторами показали ассоциацию мутаций NRAS с благоприятным исходом [119]. Также имеются сведения об отсутствии влияния мутаций в гене RAS на прогноз течения заболевания [179]. В исследовании с участием 107 пациентов, где мутационный статус гена NRAS определяли в дебюте и при рецидиве заболевания, у 102 из 107 (95%) больных результаты в обоих случаях совпадали. У одного пациента из этой группы была выявлена мутация при рецидиве, тогда как у 4 из 8 больных с мутациями в NRAS в дебюте, они не были обнаружены при рецидиве заболевания. Данное исследование показывает, что мутации NRAS являются неподходящими маркерами для контроля МОБ при проведении лечения [16]. 47 Считается, что наличие мутаций в NRAS делает лейкемические клетки более чувствительными к фарнезилтранферазы, воздействию которая высоких связывается доз с цитарабина. RAS и Ингибиторы индуцирует его биологическую активность, являются наиболее изученными ингибиторами RAS. Однако, такие препараты как типифамиб и лонафамиб показали высокую токсичность и субоптимальную активность как у пожилых, так и молодых пациентов и поэтому не были одобрены к дальнейшим фазам исследования [133]. Таким образом, ОМЛ и МДС являются гетерогенными заболеваниями по скорости ответа на цитостатическую терапию, длительности общей и безрецидивной выживаемости. Это обусловлено в первую очередь тем, что патогенез данных заболеваний - это многоступенчатый процесс, включающий не только различные хромосомные аберрации, но и множественные повреждения генов. Современные методы лабораторной диагностики позволяют выявить большое количество молекулярно-генетических маркеров, характерных для ОМЛ и МДС. Это сделало возможной разработку эффективных таргетных препаратов, а также облегчило выбор адекватной терапии. Однако противоречивые результаты различных лабораторий о прогностическом значении молекулярно-генетических маркеров опухолевых клеток свидетельствуют о необходимости выполнения дополнительных исследований. При этом основной задачей является разработка алгоритма генетической диагностики ОМЛ и МДС с использованием комплексного подхода, с учетом в совокупности всех индивидуальных характеристик больного таких, как возраст, кариотип, наличие повреждения генов, клинико-гематологические, морфологические и иммунофенотипические особенности. 48 ГЛАВА 2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ 2.1 Характеристика исследуемой группы больных ОМЛ В исследование было включено 200 пациентов с ОМЛ. Возраст больных составил от 18 до 86 лет (медиана 55 лет). Среди них было 93 (46,5%) мужчины и 107 (53,5%) женщин. У 190 больных (95,0%) был верифицирован de novo ОМЛ и у 10 (5,0%) – вторичный из предшествующих МДС или лимфомы. Распределение по морфологическим вариантам в соответствие с ФАБ классификацией ОМЛ было следующим: 4 (2,0%) пациента – с М0, 30 (15,0%) – с М1, 66 (33,0%) – с М2, 20 (10,0%) – с М3, 47 (13,5%) – с М4, 19 (9,5%) – с М5, 1 (0,5%) – с М6, у 3 (1,5%) больных вариант ОМЛ не был дифференцирован (рисунок 15). Таким образом, наибольшее количество пациентов было с диагнозом острого миелобластного лейкоза с созреванием. Рисунок 15 – Распределение больных ОМЛ в соответствие с ФАБклассификацией По результатам цитогенетического исследования больные были разделены на 4 группы: с нормальным кариотипом – 97 (48,5%) пациентов, с благоприятным кариотипом – 18 (9,0%) больных, с неблагоприятным кариотипом – 28 (14,0%) 49 пациентов, с прочими хромосомными аномалиями – 57 (28,5%) больных (рисунок 16). Рисунок 16 – Варианты кариотипа в исследуемой группе больных ОМЛ Причем в группе с неблагоприятным кариотипом пациенты были также дополнительно разделены на следующие категории: с комплексным кариотипом (более 3 хромосомных аберраций в отсутствии t(8;21), inv(16) or t(16;16), t(15;17), t(9;11), t(v;11)(v;q23), t(6;9), inv(3) или t(3;3)) – 4 пациента, с моносомным кариотипом (более 2 моносомии или одиночная моносомия в присутствии структурной перестройки) – 10 больных, с другими неблагоприятными перестройками – 14 пациентов. 2.2 Характеристика исследуемой группы больных МДС Нами было обследовано 80 пациентов с диагнозом МДС, проходивших лечение в гематологической клинике ФГБУ «Российский научно- исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА» и других гематологических отделениях лечебных учреждений Санкт-Петербурга и Ленинградской области с 2007 по 2014 год. В исследование было включено 37 мужчин и 43 женщины. Медиана возраста пациентов составила 66 лет (22-83 года) (рисунок 17). В соответствие с классификацией ВОЗ были выделены следующие группы МДС: с РА – 10 пациентов, с РАКС – 3, с РАИБ-1 – 18, с РАИБ-2 – 26, с РЦМД – 50 11, с 5q- синдромом – 4; МДС/МПЗ: ХММЛ – 6 больных. У 2-х пациентов был поставлен диагноз вторичный МДС. Рисунок 17 – Распределение больных МДС по группам в зависимости от возраста Согласно современной прогностической шкале R-IPSS пациенты с МДС были разделены на 5 групп с: очень хорошим – 1 больной, хорошим – 40 больных, промежуточным – 19 больных, плохим – 6 больных и очень плохим прогнозом – 14 больных (рисунок 18). Рисунок 18 – Классификация пациентов в соответствие со шкалой R-IPSS 51 Аномальный кариотип у пациентов с МДС был представлен в виде интерстециальных делеций, моносомий, дополнительных хромосом и несбалансированных транслокаций. Нормальный кариотип был идентифицирован у 32 (40,0%) больных. Комплексный кариотип был обнаружен у 18 (22,5%) больных, повреждения 5-ой хромосомы у 8 (10,0%) пациентов, моносомия или делеция 7-ой хромосомы у 4-х (5,0%) больных. У оставшихся 18 (22,5%) пациентов были обнаружены различные аберрации хромосом (рисунок 19). Рисунок 19 – Хромосомные аберрации у пациентов с МДС Анализ ОВ больных с различными прогностическими вариантами показал, что выживаемость пациентов с хорошим и промежуточным прогнозами значительно лучше по сравнению с пациентами с плохим и очень плохим прогнозами (р = 0,001) (рисунок 20). Рисунок 20 – ОВ пациентов с МДС в зависимости от прогноза по шкале R-IPSS 52 2.3 Метод исследования хромосом Приготовление препаратов из суспензии клеток костного мозга включало следующие этапы. Костный мозг в объеме 2-3 мл забирали в стандартную пробирку, содержащую 100-500 ед. гепарина, перемешивали. В 15 мл пробирки смешивали: 4,0 мл среды RPMI (с антибиотиком и глутамином), 1 мл сыворотки, костный мозг, выдержав оптимальную концентрацию – 2×10 9 клеток на 1 мл среды RPMI, колцемид, в концентрации, рекомендованной производителем. Стандартное время культивирования составляло 24 часа при температуре +37 С в закрытой системе. Далее клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант удаляли пипеткой, оставляя 0,3-0,5 мл жидкости над осадком. Осадок разбивали энергичным встряхиванием и добавляли 8-10 мл гипотонического раствора (0,55% раствор KCl), перемешивали пипетированием и инкубировали 30 мин при +37 С. Далее следовал этап фиксации. Осаждали клетки с помощью центрифугирования (10 мин, 1000 об/мин). Осадок тщательно разбивали встряхиванием в 0,5 мл надосадочной жидкости. К осадку добавляли 5 капель 5% уксусной кислоты, перемешивали, центрифугировали 10 минут. К осадку струйно приливали 8-10 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1) и перемешивали пипетированием. Затем фиксатор меняли 2-3 раза, добавляя порции по 5-7 мл. Следующий этап – приготовление препаратов. Раскапывание суспензии проводили на обезжиренные предметные стекла, охлажденные в морозильной камере или в холодной воде, нанося на препарат с высоты 30-50 см по 30-50 мкл суспензии. Стекла обжигали над пламенем спиртовки и высушивали при комнатной температуре. Далее проводили окраску с применением трипсина (GTG-техника). Обрабатывали стекло в 0,25% растворе трипсина (время подбиралось эмпирически 10-60 сек.). Окрашивали 1 минуту в растворе красителя Гимза, разведенном на фосфатном буфере (pH = 6,8). Cмывали краситель проточной водой и высушивали. 53 В каждом исследовании было проанализировано не менее 20 метафазных пластин. Интерпретацию патологии кариотипа производили в соответствии с Международной номенклатурой дифференциально сегментированных хромосом (ISCN, 2013). Для цитогенетического анализа и архивирования, полученных данных, использовали «ВидеоТесТ». На компьютерную рисунке 21 систему представлен анализа результат изображений цитогенетического исследования пациента. Рисунок 21 – Кариограмма больного с множественными повреждениями хромосом (44,ХХ,add(1)(p36),-4,t(5;13)(q31;q34),inv(7)(p14q22),-13) 2.4 Методы анализа мутационного статуса генов FLT3, NPM1, CKIT и NRAS Выделение геномной ДНК из периферической крови или костного мозга проводили с помощью метода хлороформной экстракции. Для гемолиза эритроцитов добавляли к 3 мл крови (1 мл костного мозга) 12 мл NH4Cl (pH 6.97, 0,83%) и инкубировали 20 минут при +4 С. Осаждали лейкоциты, отбирали 10-20 54 мкл и ресуспендировали в 400 мкл лизирующего буфера, инкубировали 10 минут при +65 С. Добавляли 600 мкл хлороформа, после центрифугирования переносили фазу, содержащую ДНК в преципитирующий буфер, осаждали и растворяли в 1,2 М NaCl. Осаждали ДНК в 96% C2H5OH при -20 С и отмывали в 70% C2H5OH, высушивали и растворяли в 100 мкл H2O. Выделение РНК проводили с помощью наборов АмплиСенс Лейкоз Квант (Интерлабсервис, Россия). Праймеры для проведения полимеразной цепной реакции были подобраны с помощью программы Vector NTI (таблица 3). Таблица 3 – Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для амплификации фрагментов генов FLT3, NPM1, NRAS, CKIT Название праймера Последовательность ( 5 3 ) FLT3-ITD_F GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC FLT3-ITD_R CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC FLT3-TKD_F TGTGTTCACAGAGACCTGG FLT3-TKD _R ATTGCCCCTGACAACATA NPM1_F ATTATGTGAAGAATTGCTTCCGG NPM1_R ACAGCCAGATATCAACTGTTACA NRAS_F CTGGTGTGAAATGACTGAGT NRAS_R ATACACAGAGGAAGCCTTC CKIT8ex_F CATTTCTGTTTTCCTGTAGCA CKIT8ex_R ATCATCTCACCTCTGCTCA CKIT11ex_F GTGATGATTCTGACCTACAA CKIT11ex_R TTCATACTGACCAAAACTCA CKIT17ex_F CAGCCAGAAATATCCTCCTTACT CKIT17ex_R TGTCAAGCAGAGAATGGGTACTC 55 Анализ мутаций в данном исследовании проводили методом ПЦР с последующей детекцией продуктов амплификации в полиакриламидном геле (6%) либо рестрикцией или секвенированием полученного фрагмента. Размер продукта амплификации нормального аллеля гена FLT3 14-15 экзона составляет 329 п.н., размер мутантного аллеля увеличивается на размер инсерции, которая может составлять от 3 до 400 п.н. (рисунок 22). Рисунок 22 – Электрофореграмма, иллюстрирующая анализ мутации FLT3-ITD Определение точечной мутации в 20 экзоне (замена аспарагина в 835 положении) проводили также методом ПЦР, но с последующим анализом длин рестрикционных фрагметнов. Если в клетках пациента присутствовала аллель с мутацией, то рестриктаза была не способна распознавать сайт рестрикции в таком фрагменте и фрагмент оставался интактным от воздействия рестриктазы, что позволяло идентифицировать наличие мутации у такого пациента (рисунок 23) [177]. Рисунок 23 – Электрофореграмма, иллюстрирующая анализ мутации FLT3-TKD 56 Мутации в гене NPM1 представляют в основном инсерции четырех пар оснований. Анализ мутаций в гене NPM1 был выполнен с помощью ОТ-ПЦР с последующим разделением продуктов с помощью электрофореза (рисунок 24) [40]. Рисунок 24 – Электрофореграмма, иллюстрирующая анализ мутации в гене NPM1 В нашем исследовании проводили анализ мутаций в 8 и 11 экзонах CKIT методом ПЦР, с последующей детекцией электрофорезом. Мутацию D816V в 17 экзоне CKIT определяли также при помощи ПЦР, с последующим проведением гидролиза рестриктазой HinfI и электрофорезом. При наличии данной точечной замены появлялся дополнительный сайт рестрикции для рестриктазы и следовательно на электрофорезе можно было наблюдать наличие дополнительного фрагмента (рисунок 25). Рисунок 25 – Электрофореграмма, иллюстрирующая анализ мутации D816V в 17 экзоне CKIT 57 Для анализа мутаций в гене NRAS проводили ОТ-ПЦР, с дальнейшим прямым секвенированием амплифицированного фрагмента. Секвенирование проводили с прямого и обратного праймеров (рисунок 26). Рисунок 26 – Детектирование мутаций в гене NRAS методом прямого секвенирования 58 2.5 Статистическая обработка полученных данных Статистическую обработку данных проводили с помощью программы STATISTICA 10.0. Анализ общей и безрецидивной выживаемости проводили с использованием метода Каплана-Майера. В качестве точки отсчета для вычисления общей и безрецидивной выживаемости выбрали дату постановки диагноза ОМЛ. Для сравнения различий в непрерывных данных использовали непараметрический U-тест Манна-Уитни. Статистически достоверными считали различия при значимости р<0,05 [6]. 59 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ БОЛЬНЫХ ОМЛ 3.1 Общая характеристика мутационного статуса больных ОМЛ Мутации в генах FLT3, NPM1, NRAS и CKIT были обнаружены у 105 (52,5%) из 200 обследованных пациентов. Всего было выявлено 128 мутаций генов FLT3, NPM1, NRAS и CKIT: 48 (24,0%) – FLT3-ITD, 13 (6,5%) – FLT3-TKD, 41 (20,5%) – в гене NPM1, 20 (10,0%) – в гене NRAS, 6 (3,0%) – в гене CKIT (рисунок 27). У 82 (41,0%) пациентов были обнаружены одиночные мутации. У 23 (11,5%) больных мутации носили сочетанный характер: у 2 (1,0%) пациентов – FLT3-ITD и FLT3-TKD, у одного (0,5%) – FLT3-TKD и в гене NPM1, у 17 (8,5%) – FLT3-ITD и в гене NPM1, у 3 (1,5%) – в генах NPM1 и NRAS. Рисунок 27 – Частота встречаемости мутаций в различных генах в исследуемой группе больных ОМЛ Достоверно чаще (p = 0,001) мутации определялись у больных с нормальным кариотипом – у 80 (82,5%) из 97 изученных пациентов (у 47 (58,8%) 60 из 80 пациентов были обнаружены одиночные мутации и у 33 (41,2%) – сочетанные мутации) и в группе промежуточного прогноза – у 29 (50,9%) из 57 больных. Тогда как в группе больных с неблагоприятным кариотипом мутации были выявлены только у 8 из 28 больных, причем у трех больных с мутациями из этой группы был выявлен моносомный кариотип, а у остальных 5 – прочие неблагоприятные поломки (таблица 4). Таблица 4 – Мутации в генах FLT3, NPM1, NRAS и CKIT у больных с разными вариантами кариотипа Кариотип Нормальный Благоприятный Неблаг. Компл. Моносомный Др. неблаг. перестройки Другие аберрации Пациенты Без FLT3- FLT3- NPM1 NRAS C KI (%) мутации ITD TKD 97 18 4 10 14 17 7 4 7 9 30 1 0 1 3 6 0 0 0 2 31 1 0 0 0 10 6 0 0 0 T 1 3 0 2 0 57 28 13 5 9 4 0 Распределение больных ОМЛ с мутациями по гендерному признаку показало, что мутации в гене FLT3 чаще обнаруживались у женщин, в NPM1 – у мужчин, хотя разница была статистически не значимой, в генах NRAS и CKIT распределялись поровну (рисунок 28). Рисунок 28 – Распределение больных ОМЛ с мутациями по гендерному признаку 61 При изучении возрастных особенностей пациентов ОМЛ с мутациями было установлено, что наибольшее количество мутаций обнаруживалось у пациентов в возрасте от 60 до 69 лет (рисунок 29). Рисунок 29 – Распределение больных ОМЛ с мутациями по возрасту 3.2 Частота встречаемости и влияние на прогноз мутаций в гене FLT3 Мутации FLT3-ITD были обнаружены у 48 из 200 пациентов, что составило 24,0%, FLT3-TKD – у 13 из 200 больных (6,5%). Медиана возраста больных с FLT3-ITD составила 53 года (от 22 до 84 лет) и не отличалась от медианы возраста больных без мутации (55 лет (от 18 до 86)) (р = 0,529). Некоторые исследователи [92] отмечают значительное увеличение частоты встречаемости мутаций FLT3ITD у пациентов старше 55 лет. Чтобы проверить данную закономерность, было проведено исследование встречаемости мутации FLT3-ITD в двух группах: младше 55 и старше 55 лет. Частота встречаемости не отличалась в обеих группах и составила 24,8% и 23,9%, соответственно. Пациенты с мутацией FLT3-TKD были незначительно старше больных без мутации – медиана возраста была равна 61 год по сравнению с 54 годами, соответственно (р = 0,106). Мутации в гене FLT3 детектировались при всех морфологических вариантах (кроме М6). Мутации FLT3-ITD чаще обнаруживались у больных с вариантами М2 (р = 0,040) и М4: у 10 (15,2%) из 66 пациентов с М2 вариантом и у 14 (29,2%) из 48 больных с М4 вариантом. Мутации FLT3-TKD были найдены 62 преимущественно у больных с М1 вариантом (у 6 (20,0%) из 30 пациентов (р = 0,001)). При сопоставлении результатов цитогенетического и молекулярно- генетического исследований было обнаружено, что мутации в гене FLT3 детектировались только у 1 (5,6%) из 18 пациентов с благоприятным прогнозом и у 6 (21,4%) из 28 больных с неблагоприятным прогнозом. Тем не менее, мутация FLT3-ITD была обнаружена у 2-х (100%) больных с неблагоприятной транслокацией t(6;9) (2 пациента) (р = 0,011). Мутации в FLT3 чаще детектировались у пациентов с нормальным кариотипом: FLT3-ITD – у 30 (30,9%) (р = 0,032) и FLT3-TKD – у 6 (6,2%) из 97 больных и промежуточным прогнозом: FLT3-ITD – у 13 (22,8%) и FLT3-TKD – у 5 (8,8%) из 57 больных. Мутация FLT3ITD ни у одного пациента не была обнаружена в сочетании с мутациями в генах NRAS (р = 0,008) и CKIT. Однако было показано, что мутации в гене FLT3 часто детектируются в сочетании с мутациями в гене NPM1: с FLT3-ITD у 16 пациентов (р = 0,012) и с FLT3-TKD у 1 больного. У 33,3% больных с сочетанными мутациями в генах FLT3 и NPM1 диагностировали М4 вариант лейкоза. У 1,0% больных была детектирована сочетанная встречаемость FLT3-ITD и FLT3-TKD. У пациентов с мутациями FLT3-ITD и FLT3-TKD был обнаружен высокий уровень лейкоцитов по сравнению с пациентами без мутации: 68,1×10 9 /л (0,6400,0×10 9 /л) против 35,1×10 9 /л (1,0-362,0×10 9 /л) (р = 0,001) и 79,8×10 9 /л (1,7362,0×10 9 /л) против 37,3×10 9 /л (0,6-400×10 9 /л) (р = 0,014), соответственно. У больных с FLT3-ITD также выявлялся значительный процент бластов в КМ по сравнению с пациентами без мутации: 71,3% (21,0-92,0%) в сравнении с 60,2% (20,0-100,0%), соответственно (р = 0,042). Процент бластов в КМ у больных с FLT3-TKD, а также уровень тромбоцитов в ПК в дебюте заболевания у пациентов с FLT3-ITD и FLT3-TKD не отличались от данных показателей у пациентов без мутаций (р = 0,830, р = 0,520 и р = 0,827, соответственно). Пациенты с мутациями FLT3-ITD реже достигали ПР (61,1% ) по сравнению с 77,0% больных без мутации (р = 0,057), а с мутациями FLT3-TKD в 50,0% случаев против 75,8% случаев без мутации (р = 0,056). Медианы ОВ и БРВ 63 пациентов с FLT3-ITD по сравнению с больными без мутации составили: 5,4 месяцев в сравнении с 12,8 месяцами и 4,9 месяцами в сравнении с 10,0 месяцами, соответственно (р = 0,001 и р = 0,001, соответственно) (рисунок 30). В ходе исследования не прогностического удалось фактора оценить в значение группах мутации пациентов с FLT3-ITD благоприятной как и неблагоприятной цитогенетикой из-за недостаточного количества пациентов. Рисунок 30 – ОВ и БРВ больных ОМЛ с мутацией и без мутации FLT3-ITD Мы изучили прогностическое влияние мутации FLT3-ITD в зависимости от возраста больных (до и после 65 лет). Была обнаружена четкая тенденция к ухудшение ОВ у пациентов с мутациями FLT3-ITD (р = 0,070) (рисунок 31). Рисунок 31 – Общая выживаемость больных с мутацией FLT3-ITD и без мутации в группе пациентов старше 65 лет 64 ОВ и БРВ пациентов с FLT3-TKD по сравнению с больными без мутации из общей группы и из группы пациентов с НК достоверно не отличались (р = 0,112, р = 0,161 и р = 0,874, р = 0,890, соответственно). Исключение больных с мутацией FLT3-ITD из исследуемой группы позволило получить значительное ухудшение показателей ОВ и БРВ у пациентов с FLT3-TKD по сравнению с больными без мутаций в гене FLT3 (р = 0,037 и р = 0,042, соответственно). ОВ и БРВ больных с FLT3-ITD и с FLT3-TKD значимо не отличались (р = 0,776 и р = 0,771, соответственно). Кривые выживаемости представлены на рисунках 32, 33. Рисунок 32 – Общая выживаемость больных с мутациями в гене FLT3 и без мутаций Рисунок 33 – Безрецидивная выживаемость больных ОМЛ с и без мутаций в гене FLT3 65 3.3 Роль мутаций в гене NPM1 у больных ОМЛ Количество пациентов с мутациями в гене NPM1 составило 41 из 200 больных (20,5%). Медиана возраста больных с мутацией в гене NPM1 была 55 лет (23-76 лет) и не отличалась от возраста пациентов без мутации – 55 лет (18-86 лет). С целью изучения частоты встречаемости мутаций в гене NPM1 в зависимости от возраста больных, разделили всех пациентов на 4 возрастные группы: 18-39, 40-55, 56-69 и старше 70 лет. Наименьшая встречаемость мутаций в NPM1 оказалась в группе пациентов старше 70 лет (2 (7,7%) из 26 больных). Чаще мутации встречались в группах 40-55 и 56-69 лет (15 (23,1%) из 65 больных, и 18 (27,4%) из 68 больных, соответственно) (рисунок 34). Рисунок 34 – Частота встречаемости мутаций в гене NPM1 в различных возрастных группах В группе 97 больных с НК мутации были обнаружены у 31 пациента, что составило 32,0%. В группе больных с НК и мутациями в гене NPM1 самая низкая встречаемость отмечалась также у больных старше 70 лет (2 из 15 больных, 13,3%), а самая высокая – у больных от 40 до 55 лет (у 13 (44,8%) из 29 больных) (рисунок 35). Медиана возраста пациентов с НК и мутациями в гене NPM1 66 составила 55 лет (24-76 лет) в сравнении с 59 годами (18-84 лет) у пациентов без мутаций (р = 0,010). Рисунок 35 – Частота встречаемости в гене NPM1 в различных возрастных группах у больных с НК Мутации в гене NPM1 были выявлены у 21 мужчины и у 20 женщин. При этом было детектировано увеличение количества лейкоцитов в ПК и бластов в КМ у больных с мутациями в NPM1 по сравнению с группой без мутаций: 50,6×109 /л (0,6-260,0×10 9 /л) против 40,6×10 9 /л (1,0-400,0×10 9 /л) и 66,6% (22,0-94,0%) против 60,5% (20,0-100,0%), соответственно, но различие не было статистически значимым (р = 0,183 и р = 0,261, соответственно). Мутации в гене NPM1 встречались у пациентов с различными морфологическими вариантами ОМЛ кроме М3 (р = 0,020) и М6 (ФАБ). Мутации часто детектировались у пациентов с М5 вариантом – у 6 из 19 больных, что составило 31,6%. Также мутации в NPM1 были выявлены у 13 (27,1%) из 48 пациентов с М4 вариантом и у 1 (25,0%) из 4 больных с М0 вариантом (рисунок 36). 67 Рисунок 36 – Распределение больных с мутациями в NPM1 в зависимости от морфологического варианта ОМЛ (ФАБ) При анализе частоты встречаемости мутаций в гене NPM1 было обнаружено, что достоверно чаще эти мутации выявлялись у больных с НК – у 31 (32,0%) из 97 больных (р = 0,001). Только у одного пациента с благоприятным вариантом кариотипа (45,X,-Y,t(8;21)(q22;q22)) обнаружили мутацию в гене NPM1 (р = 0,100). У пациентов с промежуточным прогнозом мутации выявлялись в 9 (15,8%) из 57 случаев (р = 0,298): у 2-х больных с дополнительной 8-ой хромосомой и по одному больному с inv(9), моносомией по 16 хромосоме, del(9), t(2;12), del(20), c маркерной хромосомой и моносомией по Y хромосоме. Мутации не были обнаружены ни у одного из 17 пациентов с t(15;17) (р = 0,029). Статистически значимой оказалась низкая частота встречаемости мутаций в гене NPM1 у больных с неблагоприятным вариантом кариотипа – ни у одного больного из этой группы (28 больных) не было обнаружено данных мутаций (р = 0,004) (рисунок 37). 68 Рисунок 37 – Распределение больных ОМЛ с мутациями в NPM1 в зависимости от варианта кариотипа Все пациенты с мутациями в NPM1 были обследованы на наличие мутаций в генах FLT3 (FLT3-ITD, FLT3-TKD), NRAS и CKIT. Достоверно чаще у пациентов с мутациями в гене NPM1 обнаруживалась мутация FLT3-ITD – у 17 (35,4%) из 48 больных (р = 0,003). Значимой разницы в наличии остальных мутаций у больных с и без мутации в гене NPM1 не наблюдалось. Ни у одного из 6 больных с мутацией в гене CKIT не было обнаружено мутаций в NPM1 (таблица 5). Таблица 5 – Ассоциация мутаций в NPM1 с наличием других мутаций Общее количество Больные с Больные без пациентов мутацией в NPM1 мутации в NPM1 (n=200) (n=41, 20,5%) (n=159, 79,5%) FLT3-ITD 48 16 32 0,012 FLT3-TKD 13 1 2 0,579 NRAS 20 3 17 0,521 CKIT 6 0 6 0,207 p 69 Была исследована прогностическая значимость мутаций в гене NPM1. При сравнении числа пациентов у которых наблюдалась полная ремиссия, в группах с и без мутаций в гене NPM1 выявили, что 82,4% больных с мутациями в гене NPM1 достигли ПР, в то время как в группе пациентов без мутаций ПР была получена 71,1% больных (р = 0,186). В группе больных с НК также не было выявлено значимых отличий по достижению пациентами ПР между данными 2-мя группами – 81,5% против 78,4%, соответственно (р = 0,751). В группе пациентов старше 60 лет больные с мутациями в гене NPM1 достоверно чаще достигали ПР по сравнению с пациентами без мутации (84,6% и 47,7%, соответственно; р = 0,019). На рисунках 38 и 39 представлены кривые ОВ и БРВ больных с мутациями в NPM1 и без мутаций в общей исследуемой группе и в группе больных с НК. Для всей исследуемой группы медиана ОВ больных с мутацией в NPM1 составила 15,3 месяцев по сравнению с 10,1 месяцами у пациентов без мутации (р = 0,002), для группы с НК ОВ равнялась 18,2 месяцам по сравнению с 11,6 месяцами, соответственно (р = 0,002). БРВ также оказалась значительно более долгой у пациентов с мутациями в NPM1 по сравнению с больными без мутации: 10,1 месяц против 8,8 месяцев (р = 0,020), соответственно – в общей исследуемой группе, и 17,7 месяцев и 10,0 месяцев (р = 0,016) в группе больных с НК. Рисунок 38 – ОВ и БРВ пациентов с ОМЛ с и без мутаций в гене NPM1 во всей исследуемой группе 70 Рисунок 39 – ОВ и БРВ больных ОМЛ с НК с и без мутаций в гене NPM1 В проведенном исследовании была продемонстрирована высокая частота встречаемости сочетаных мутаций в генах NPM1 и FLT3 (FLT3-ITD). В связи с этим, проанализировали ОВ и БРВ в 4-х группах больных : NPM1+/FLT3-, NPM1/FLT3-, NPM1+/FLT3+, NPM1-/FLT3+. При разделении больных на группы в зависимости от мутационного статуса генов NPM1 и FLT3 установлено, что пациенты с одиночными мутациями нуклеофозмина и FLT3-ITD показывали лучшую и худшую ОВ и БРВ, соответственно по сравнению с группой без мутаций (р = 0,012 и р = 0,001; р = 0,017 и р = 0,001 соответственно). В то же время, больные, у которых детектировались сочетано данные мутации, не отличались по прогнозу от пациентов без мутаций (р = 0,398) (рисунок 40). Рисунок 40 – ОВ и БРВ пациентов с ОМЛ с разным мутационным статусом генов NPM1 и FLT3 71 3.4 Исследование группы больных ОМЛ с мутациями в гене NRAS Мутации в гене NRAS были обнаружены у 20 из 200 пациентов, что составило 10,0%. Чаще всего мутации встречались в 12 кодоне – у 13 (65,0%) из 20 больных. В 13 кодоне мутации обнаружили у 6 (30,0%) пациентов и в 61 кодоне – у 1 (5,0%) больного. Все мутации в 12 кодоне были представлены точечной заменой глицина на аспарагиновую кислоту (G12D). В 13 кодоне были найдены следующие замены: G13D (4 больных), G13V (1 больной), G13C (1 больной). В 61 кодоне была детектирована замена глутамина на аргинин (Q61R). У всех больных мутации в гене NRAS были обнаружены в гетерозиготе. Распределение больных ОМЛ с мутациями в гене NRAS в зависимости от морфологического варианта показало, что мутации чаще встречались у больных с М2, а также М4 вариантами болезни. Не было обнаружено ни одной мутации в гене NRAS у больных с М0, М3 (р = 0,127) и М6 вариантами ОМЛ. В основном мутации обнаруживались у больных с de novo ОМЛ – у 19 (10,0%) из 190 пациентов и только у 1 пациента со вторичным ОМЛ из предшествующей лимфомы. При анализе клинических данных было установлено, что медиана возраста больных с мутациями в гене NRAS составила 53 года (22-73 года), в то время как медиана пациентов без мутации в этом гене была 55 лет (18-86 лет) (р = 0,192). Среднее количество лейкоцитов в ПК в дебюте заболевания у больных с мутациями в гене NRAS было незначительно выше (p = 0,128), чем у больных без мутаций (46,4×10 9 /л (4,4-140,0×10 9 /л) и 42,4×10 9 /л (0,6-400,0×10 9 /л), соответственно), тогда как среднее количество тромбоцитов в ПК наоборот было ниже (p = 0,285) – 58,8×10 9 /л (1,1-205,0×10 9 /л) и 70,8×10 9 /л (2,0-334,0×10 9 /л), соответственно. Среднее количество бластов в КМ в дебюте заболевания у пациентов с мутацией было выше (р = 0,096) по сравнению с больными без мутации (72,0% (39,4-87,6%) и 60,8% (20,0-100,0%), соответственно). При оценке встречаемости мутаций в гене NRAS в зависимости от варианта кариотипа было выделено несколько групп больных: с благоприятным 72 кариотипом – с t(8;21) и inv(16), с НК, с неблагоприятным кариотипом и с другими хромосомными аберрациями, в том числе с t(15;17). Обнаружили, что достоверно чаще мутации в NRAS встречались у пациентов с благоприятным кариотипом – у 6 (33,3%) из 18 больных (р = 0,001), в частности у больных с inv(16) – у 4 (66,7%) из 6 больных (р = 0,001). Половина из 20 больных с мутациями в гене NRAS имела НК. Также мутации были найдены у 4 (7,0%) из 57 пациентов с промежуточным прогнозом, у которых детектировали хромосомные поломки в виде трисомии 8-ой и 21-ой хромосом, а также t(10;12). Было отмечено, что один пациент из группы промежуточного прогноза с мутацией в NRAS имел t(3;3), единственный из всей исследуемой группы. В группе пациентов с t(15;17) и неблагоприятными хромосомными аберрациями ни у одного больного не было обнаружено мутаций в гене NRAS (р = 0,151 и р = 0,057, соответственно). Мутации в гене NRAS встречались в сочетании с мутациями нуклеофозмина (были найдены у 3 (7,3%) из 41 пациента), и не детектировались в сочетании с мутациями генов FLT3 и CKIT. Было показано, что 58,3% больных с мутациями в гене NRAS достигали ПР по сравнению с 75,5% пациентов без мутации (p = 0,191). При анализе общей и безрецидивной выживаемости больных с и без мутаций в гене NRAS не было выявлено достоверно значимых отличий (р = 0,435 и р = 0,423, соответственно). Медиана ОВ и БРВ пациентов с и без мутаций в гене NRAS составила 9,0 и 10,6 месяцев, и 8,1 и 9,0 месяцев, соответственно (рисунок 41). Рисунок 41 – ОВ и БРВ больных ОМЛ с и без мутаций в NRAS 73 В группе пациентов с НК больные с мутациями в гене NRAS имели худшую ОВ и БРВ по сравнению с больными без мутаций – медианы составили 5,5 и 13,9 месяцев; 6,5 и 10,3 месяцев, соответственно. Однако эти отличия не были статистически значимыми (р = 0,856 и р = 0,650, соответственно) (рисунок 42). Рисунок 42 – ОВ и БРВ больных ОМЛ с и без мутаций в NRAS у больных с НК Так как наиболее часто мутации в гене NRAS встречались у пациентов с благоприятным кариотипом, мы оценили влияние данных мутаций на течение заболевания в этой группе. При этом наблюдали тенденцию к ухудшению ОВ и БРВ у пациентов с мутациями (р = 0,214 и р = 0,160, соответственно) (рисунок 43). Рисунок 43 – ОВ и БРВ больных ОМЛ с и без мутаций в гене NRAS и благоприятным кариотипом 74 3.5 Прогностические особенности течения заболевания у больных ОМЛ с мутациями в гене CKIT Мутации в гене СKIT выявлялись у 6 из 200 пациентов, что составило 3,0%. Нами не были обнаружены мутации в 8 и 11 экзонах гена СKIT в данной группе, у всех 6 пациентов детектировалась замена аспарагина на валин в положении 816 (D816V) 17 экзона. Мутации D816V были детектированы у 3-х мужчин и 3-х женщин. Медиана возраста больных в с мутациями в гене СKIT составила 60 лет (47-74 года), а в группе пациентов без мутации – 55 лет (18-86 лет) (р = 0,346). Среднее количество лейкоцитов и тромбоцитов в ПК в дебюте заболевания у больных с мутациями D816V составило: 40,7×10 9 /л (2,1-100×10 9 /л) и 86,7×10 9 /л (23,3-214,2×10 9 /л), соответственно по сравнению с 42,8×10 9 /л (0,6-400,0×10 9 /л) и 70,4×10 9 /л (1,1-334,0×10 9 /л), соответственно в группе больных без мутации (р = 0,962 и р = 0,899, соответственно). Средний процент бластов в КМ был равен 70,0% (36,0-96,0%) у больных с мутацией и 61,8% (20,0-100,0%) у пациентов без мутации (р = 0,757). При анализе результатов цитогенетического исследования обнаружено, что из 6 пациентов с мутацией D816V у 3 пациентов установлен диагноз CBF-ОМЛ с t(8;21) (р = 0,001). У одного пациента при цитогенетическом исследовании выявили НК и у двух больных детектировали неблагоприятный кариотип с моносомией 7-ой хромосомы (р = 0,001). Мутации не были найдены ни у одного из 17 пациентов с t(15;17) и ни у одного из 6 больных с inv(16) (рисунок 44). Распределение пациентов с мутациями в гене СKIT с учетом морфологического варианта заболевания показало у 3 (4,6%) из 6 больных М2 вариант, а у одного (2,1%) пациента – М4. У данных 4 пациентов был поставлен диагноз de novo ОМЛ, остальные 2 пациента с мутациями D816V имели вторичный ОМЛ из предшествующего МДС. Таким образом, из общей группы больных (10 пациентов) со вторичными ОМЛ у 2-х (20,0%) обнаруживались мутации в СKIT (р = 0,001). 75 Рисунок 44 – Распределение больных ОМЛ с мутациями в СKIT в зависимости от варианта кариотипа При исследовании сочетанной встречаемости мутаций в гене СKIT с мутациями в других генах (FLT3, NPM1, NRAS) было отмечено, что у всех 6 больных с мутацией D816V данная мутация являлась одиночной. ПР достигли 75,0% пациентов с мутациями в гене СKIT и 73,4% больных без мутации (р = 0,944). Медиана ОВ больных с мутациями D816V составила 7,8 месяцев и 10,2 месяца у пациентов без мутации (р = 0,254). Медиана БРВ была равна 6,7 месяцам и 8,9 месяцам, соответственно (р = 0,041) (рисунок 45). Рисунок 45 – ОВ и БРВ больных ОМЛ из общей исследуемой группы с и без мутаций в СKIT 76 Так как у 3 (50,0%) из 6 пациентов с мутациями в гене СKIT обнаружили наличие t(8;21), мы проанализировали отдельно данную группу пациентов. Среднее количество лейкоцитов в ПК в дебюте составило 20,0×10 9 /л у больных с мутациями D816V и 14,2×10 9 /л у больных без мутации (р = 0,406). Медиана ОВ и БРВ в группах с и без мутации были: 11,4 и 26,6 месяца (р = 0,224), и 11,1 и 17,3 месяцев (р = 0,162), соответственно. У 2-х пациентов с мутациями в гене CKIT и моносомией 7-ой хромосомы медиана ОВ составила 2,0 месяца, тогда как у пациентов с моносомией 7-ой хромосомы без мутации ОВ была равна 7,4 месяца (р = 0,165). 77 ГЛАВА 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ БОЛЬНЫХ МДС 4.1 Частота встречаемости и прогностические особенности мутаций генов FLT3, NPM1 и NRAS у больных МДС При исследовании мутационного статуса генов FLT3, NPM1 и NRAS у 80 пациентов с МДС, мутации были обнаружены у 8 пациентов. Мутации в гене FLT3 были найдены у 4 пациентов, что составило 5,0%: мутация FLT3-ITD детектировалась у 3-х больных (3,8%) и FLT3-TKD – у 1-го больного (1,3%). Одиночные мутации в гене NPM1 были обнаружены у 2-х (2,5%) больных, также как и в гене NRAS – у 2-х (2,5%) пациентов. Мутации в гене NRAS детектировались в 12 кодоне: G12D и G12R. У 7 из 8 пациентов мутации были изолированными, у одного больного они носили сочетанный характер – FLT3TKD и в гене NPM1 (рисунок 46). Рисунок 46 – Частота встречаемости мутаций в генах FLT3, NPM1 и NRAS у исследуемых больных МДС В таблице 6 представлены общие сведения о пациентах с МДС с мутациями в генах FLT3, NPM1 и NRAS. 78 Таблица 6 – Характеристика пациентов с МДС и мутациями в генах FLT3, NPM1 и NRAS ФИО Пол пациента Возраст, Диагноз Кариотип Обнаруженные мутации лет К.Б.И. м 64 РАИБ-1 46, XY FLT3-ITD Н.Е.Н. м 66 РАИБ-2 48-50, XY, FLT3-ITD +6,+8,+14,+20 Ш.И.В. ж 40 РАИБ-2 mos46, XX, del(9) FLT3-ITD Н.А.Д. м 69 РАИБ-2 46, XY, del(7)(q32) NPM1 Ч.Н.К. ж 75 РАИБ-1 46, XX, del(8)(q24) NPM1 С.В.А. ж 63 РАИБ-2 46, XX FLT3-TKD +NPM1 Е.И.В. ж 65 РАИБ-1 46, XX ,del(5)(q13) NRAS (G12R) С.М.П. м 61 РАИБ-2 mos 47, XY, i(17)(q10), NRAS (G12D) +19 Таким образом, показано, что мутации с одинаковой частотой встречались как у женщин так и у мужчин. Медиана возраста у больных с мутациями в генах FLT3, NPM1 и NRAS составила 64,5 лет (40-75 лет) по сравнению с группой без мутаций, где медиана возраста была равна 67,0 лет (22-83 лет) (р = 0,553). При распределении больных с мутациями на 3 возрастные группы: 40-59, 60-69 и старше 70 лет, выявлена значительно более частая встречаемость мутаций у больных в возрасте 60-69 лет – у 6 из 8 больных (р = 0,012) (рисунок 47). Всем пациентам с мутациями был поставлен диагноз de novo МДС. У всех 8-ми (100,0%) пациентов с мутациями была выявлена рефрактерная анемия с избытком 79 бластов (р = 0,014), в том числе РАИБ-1 – у 3-х больных и РАИБ-2 – у 5-ти пациентов. Рисунок 47 – Частота встречаемости мутаций у пациентов с МДС в зависимости от возраста По результатам кариотипирования было обнаружено, что в соответствии со шкалой R-IPSS, 4 из 8 пациентов с мутациями относятся к группе промежуточного прогноза и 3 пациента – к группе хорошего прогноза (в том числе 2 больных с НК). Только у 1 из 8 пациентов с мутациями найден неблагоприятный комплексный кариотип. При анализе 3-х пациентов с мутациями FLT3-ITD было выявлено, что ОВ пациентов с мутацией была короче в сравнении с ОВ больных без мутации – 8,2 и 14,0 месяцев, соответственно (р = 0,294). У больной К.Б.И. из этой группы определялся нормальный кариотип (хороший прогноз) и количество бластов в миелограмме 4%. Больная принимает дакоген и жива в течение 8,2 месяцев без прогрессирования. У другой пациентки (Ш.И.В.), 40 лет, с FLT3-ITD найдена одиночная аберрация с участием 9-ой хромосомы. Она была отнесена к группе промежуточного прогноза, процентное содержание бластных элементов в миелограмме составляло 11%. Несмотря на молодой возраст у пациентки Ш.И.В. 80 через 6 месяцев от дебюта заболевания была зафиксирована трансформация в ОМЛ и смерть. Пациент Н.Е.Н. был отнесен к группе крайне неблагоприятного прогноза по причине наличия избыточного количества бластов в КМ (18,0%) и множественных хромосомных аберраций (+6,+8,+14,+20). Продолжительность жизни больного Н.Е.Н. составила всего 1,1 месяца. У пациентки С.В.А. в возрасте 63 лет было обнаружено сочетание двух мутаций – FLT3-TKD и в гене NPM1. Больная имела нормальный кариотип и количество бластов в КМ равнялось 6%. Терапия оказалась неэффективной, больная умерла через 5 месяцев после установления диагноза. У двух пациентов с мутациями в гене NPM1 при кариологическом исследовании выявлены неблагоприятная делеция q (длинного) плеча 7-ой хромосомы (у Н.А.Д.) и делеция q плеча 8-ой хромосомы (у Ч.Н.К.). Больная Н.А.Д. в возрасте 69 лет, с числом бластов в КМ 18,2%, назначенное лечение – малые дозы цитозара, умерла через 9 месяцев от начала заболевания. У больной Ч.Н.К. количество бластов превышало 5%. Больная жива в течение 17,0 месяцев без прогрессии опухолевого процесса. Пациенты Е.И.В. и С.М.П. с мутациями в гене NRAS имели избыточное количество бластов и хороший и промежуточный прогнозы, соответственно. Однако примерно через год от начала заболевания у обоих больных была отмечена трансформация в ОМЛ. ОВ пациента С.М.П. составила 16,1 месяц. Несмотря на наличие благоприятного прогностического маркера делеции 5qпродолжительность жизни больной Е.И.В. составила 16,9 месяцев. Таким образом, мы проанализировали особенности течения заболевания у больных МДС с использованием клинико-гематологических, морфологических, цитогенетических и молекулярно-генетических методов исследования. Выделены прогностические группы в зависимости от наличия хромосомных повреждений в соответствие с современной шкалой R-IPSS. Показано, что продолжительность жизни пациентов достоверно зависит от прогностического варианта кариотипа: выживаемость пациентов с хорошим и промежуточным кариотипами оказалась значительно лучше по сравнению с пациентами с плохим и очень плохим 81 кариотипами. Частота встречаемости мутаций в генах FLT3, NPM1 и NRAS у больных МДС оказалась достаточно низкой. Практически у всех пациентов с МДС с мутациями были детектированы дополнительные хромосомные аберрации. Были охарактеризованы особенности течения заболевания для каждого больного с мутациями в генах FLT3, NPM1 и NRAS. По результатам исследования показано, что у всех больных с мутациями в генах FLT3, NPM1 и NRAS был диагностирован МДС в стадии РАИБ-1 или РАИБ-2. 82 ГЛАВА 5 ОБСУЖДЕНИЕ 5.1 Обсуждение результатов исследования группы больных ОМЛ Современная диагностика ОМЛ и МДС определяет прогноз течения заболевания и выбор направленной терапии. Повышенный интерес в настоящее время вызывает исследование мутационного статуса генов с высокой частотой встречаемости при ОМЛ и МДС, а также со значительным прогностическим потенциалом. Ген FLT3 относят к III классу рецепторных тирозинкиназ, экспрессирующегося преимущественно в гемапоэтических стволовых клетках [143]. При взаимодействии со своим лигандом FL, FLT3 играет важную роль в регуляции различных клеточных процессов (выживание, пролиферация, дифференцировка стволовых клеток) [96]. Повышенная экспрессия FLT3 наблюдается в опухолевых клетках больных ОМЛ и B-ОЛЛ, что приводит к неконтролируемой пролиферации этих клеток и блоку апоптоза. Многие исследователи подчеркивают, что FLT3 играет важную роль в формировании патогенеза острых лейкозов, а наличие мутаций и высокая экспрессия данного гена сильно влияют на прогноз заболевания [13; 38; 67]. В различных исследованиях была показана высокая частота встречаемости мутаций в гене FLT3: FLT3-ITD – у 15-45%, FLT3-TKD – у 5-10% больных. Таким образом, мутации в данном гене являются одними из наиболее часто встречающихся при ОМЛ. Например, в работе M. Nakao с соавт. [116], где были впервые опубликованы сведения о мутации FLT3-ITD, встречаемость данной мутации равнялась 17%, а в исследовании N. Govedarovic с соавт. [74] она достигала 44,7%. В результате исследования мутации FLT3-ITD были обнаружены у 24,0% больных, FLT3-TKD – у 6,5% пациентов. В некоторых исследованиях наблюдается корреляция частоты встречаемости мутаций в гене FLT3 и возраста больных. Так, H. Kiyoi с соавт. показали значительное увеличение частоты встречаемости мутаций FLT3-ITD у пациентов старше 55 лет с 25% до 31,4% [92]. В данной работе, мы не обнаружили такой закономерности – 83 пациенты в группах моложе 55 и старше 55 лет имели примерно одинаковую частоту встречаемости мутаций FLT3-ITD (24,8% и 23,9%, соответственно). Что касается пациентов с мутацией FLT3-TKD, то они были старше больных без мутации (медиана 61 год по сравнению с 54 годами, соответственно; р = 0,106). Мутации в гене FLT3 выявляются при всех морфологических вариантах ОМЛ. Тем не менее, выделяют наибольшую частоту встречаемости мутации FLT3-ITD при М3 и М5 вариантах, и вероятную (из-за низкой частоты встречаемости) ассоциацию мутации FLT3-TKD с М4, М5 вариантами. Значительно реже мутации в FLT3 обнаруживают при М6, М7 вариантах ОМЛ [148]. В ходе нашего исследовании, мутации в гене FLT3 были обнаружены у пациентов с различными морфологическими вариантами (кроме М6). Мутации FLT3-ITD достоверно чаще детектировались у больных с вариантами М2 (15,2%). Мутации FLT3-TKD были найдены преимущественно у больных с М1 вариантом (20,0%). Наиболее значимой является ассоциация мутаций в гене FLT3 с хромосомными перестройками и мутациями в других генах. Мутации в FLT3 чаще встречаются у больных с нормальным кариотипом и промежуточным прогнозом, а также у больных с t(15;17). У пациентов с CBF-ОМЛ данные мутации обнаруживаются достаточно редко, как и у больных с неблагоприятным прогнозом (исключение составляют пациенты с t(6;9)) [97; 165]. В различных работах также была показана редкая встречаемость мутаций в гене FLT3 в сочетании с мутациями в генах NRAS и CKIT, CEBPα [92; 93 156]. В тоже время B. Falini с соавт. [56] и T. Suzuki с соавт. [160] обнаружили статистически значимую ассоциацию мутаций в генах FLT3 и NPM1. В нашем исследовании, мутации в гене FLT3 крайне редко обнаруживались у пациентов с благоприятным кариотипом – лишь у 5,6% пациентов. Схожую картину наблюдали у больных с неблагоприятным кариотипом, мутации были выявлены у 21,4% больных. Однако следует отметить тот факт, что при этом мутация FLT3-ITD была найдена у 100% больных с неблагоприятной 84 транслокацией t(6;9). Вместе с этим, мутации в гене FLT3 значительно чаще выявлялись у пациентов с нормальным кариотипом и промежуточным прогнозом. Было отмечено, что мутации в гене FLT3 не обнаруживались в сочетании с мутациями в генах NRAS и CKIT. Есть предположения о невозможности их сочетанного присутствия в одной клетке из-за их принадлежности к мутациям одного (I) класса, так, как продукты всех трех генов выполняют в клетке идентичные функции. С другой стороны была показана высокая частота встречаемости сочетанных мутаций в генах FLT3 и NPM1 (у 27,9% больных). Также у двух пациентов были обнаружены одновременно мутации в юкстамембранном и тирозинкиназном доменах гена FLT3. Высокая частота встречаемости сочетаных мутаций в генах FLT3 и NPM1 позволяет говорить в пользу теории о том, что для запуска лейкогенеза недостаточно наличия одной аберрации. Данный процесс является многоступенчатым и затрагивает как минимум два гена. Эти мутации относятся к различным классам (I и II) и оба гена отвечают за активацию разных сигнальных путей в клетке. Многие исследования с использованием мышиных моделей подтверждают данный факт [136]. Мутации FLT3-ITD часто ассоциируют со значительным повышением уровня лейкоцитов в ПК и высоким процентом бластов в КМ у пациентов с ОМЛ. Данные относительно мутации FLT3-TKD остаются противоречивыми, так как многие авторы не обнаруживают подобной закономерности [60; 156]. Однако, U. Bacher с соавт. [18] показали выраженный лейкоцитоз у больных с FLT3-TKD по сравнению с пациентами без мутации. В ходе нашего исследования у пациентов с мутациями FLT3-ITD и FLT3TKD наблюдали статистически значимый более высокий уровень лейкоцитов по сравнению с пациентами без мутаций (68,1×10 9 /л и 35,1×10 9 /л; 109,8×10 9 /л и 37,3×10 9 /л, соответственно). Однако только у больных с мутациями FLT3-ITD отмечали высокий процент бластов в КМ по сравнению с пациентами без мутации (71,3% и 60,2%, соответственно). Наличие значительного лейкоцитоза у больных с мутациями в гене FLT3 можно объяснить тем, что мутации ведут к 85 конститутивной активации рецептора, вызывающей бесконтрольную пролиферацию, блокирование апоптоза и дифференцировки лейкемических клеток. Данная аномальная активация тирозинкиназы FLT3 приводит к запуску различных сигнальных путей в клетке, включая регуляцию MAP киназ, транскрипционного фактора STAT5, Act киназ, отвечающих за клеточное деление и способность к выживанию. На сегодняшний день многие исследовательские лаборатории представили данные о высокой прогностической значимости мутаций в гене FLT3 [129]. Различные исследователи показали, что наличие мутации FLT3-ITD является неблагоприятным прогностическим фактором у пациентов с ОМЛ, влияющим на ОВ, БРВ и БСВ, особенно у пациентов с промежуточным прогнозом по результатам кариотипирования [94; 101; 110]. Тем не менее, важно отметить разрозненность в выбранных популяционных группах, режимах терапии и длительности ремиссий. Так, в некоторых исследованиях показано, что наличие таких дополнительных факторов как пожилой возраст и неблагоприятный кариотип могут нивелировать негативное влияние мутаций в гене FLT3. В исследовании D.L. Stirewalt с соавт. пациентов старше 55 лет наличие мутации FLT3-ITD не было ассоциировано с ухудшением прогноза [156]. В некоторых работах показано негативное влияние мутаций FLT3-ITD на БРВ и БСВ, но не на ОВ [148; 165]. Авторы объясняют это тем, что в их исследуемую группу входили пациенты, получавшие в качестве терапии высокие дозы цитарабина, благоприятно влиявшего на длительность ОВ. В работах, где больных лечили с использованием стандартных доз цитарабина, наличие мутаций FLT3-ITD оказывало влияние как на БРВ и БСВ, так и на ОВ. Однако N. Boissel [28], проводивший сравнительный анализ трех групп больных с различными режимами терапии, не выявил наличия влияния мутаций FLT3-ITD на ОВ ни в одной из групп. Таким образом, данный вопрос остается спорным. Что касается влияния наличия мутаций в гене FLT3 на достижение ПР, то большинство исследователей сходятся во мнении, что такой корреляции не наблюдается. 86 Клиническая значимость мутаций FLT3-TKD является противоречивой. В некоторых исследованиях была показана тенденция к ухудшению ОВ и БРВ у пациентов с данной мутацией по сравнению с остальными больными, но разница не являлась статистически значимой [18]. В других работах прослеживалось статистически достоверное негативное влияние наличия данной мутации [178]. В результате проведенного исследования, нами не было обнаружено статистически значимого влияния мутаций FLT3-ITD и FLT3-TKD на достижение пациентами ПР. При сравнении ОВ и БРВ пациентов с мутациями FLT3-ITD и FLT3-TKD и больных без мутаций были получены следующие результаты. Обнаружено статистически значимое негативное влияние наличия мутации FLT3ITD на ОВ и БРВ по сравнению с остальными пациентами. Даже у пациентов из неблагоприятной возрастной группы старше 65 лет была детектирована тенденция к ухудшению прогноза у пациентов с мутацией. Это дает основание считать, что наличие мутации FLT3-ITD является независимым негативным прогностическим маркером. Что касается мутации FLT3-TKD, то нами не были получены данные о ее влиянии на ОВ и БРВ больных ОМЛ. Однако при сравнении ОВ и БРВ больных с мутациями FLT3-TKD и пациентов без мутации FLT3-ITD, мы получили отрицательное влияние наличия данной мутации (р = 0,037 и р = 0,042, соответственно). При этом ОВ и БРВ больных с FLT3-ITD и с FLT3-TKD значимо не отличались. Таким образом, высокая частота встречаемости и негативное прогностическое влияние мутаций в гене FLT3 (как FLT3-ITD, так и FLT3-TKD) у пациентов с ОМЛ, позволили включить их в алгоритм лабораторной диагностики пациентов с ОМЛ. Нуклеофозмин (NPM1) – это белок, который способен перемещаться из ядра в цитоплазму и выполнять в клетке множественные функции: биогенез и экспорт рибосом, удвоение центросомы, репарация ДНК и ответ на стрессовые воздействия [57]. Нуклеофозмин вовлечен в различные хромосомные транслокации и играет важную роль в патогенезе лейкозов. Мутации в гене NPM1 87 являются одними из наиболее часто встречающихся при ОМЛ. По литературным данным, встречаемость мутаций в этом гене у больных ОМЛ составляет 25-35% с увеличением этого количества у пациентов с НК до 46-64% [55]. Однако отмечают значительное снижение частоты встречаемости мутаций в NPM1 в странах Азии по сравнению с европейской популяцией (14,3-28,2% и 35,0%, соответственно). В нашем исследовании частота встречаемости мутаций в NPM1 была равна 20,5%, а у пациентов с НК – 32,0%. Все лейкозные клетки с мутациями в NPM1 также содержали аллель дикого типа, что сочетается с литературными данными [160]. На сегодняшний день ген нуклеофозмина достаточно хорошо охарактеризован и исследованы его клинические и прогностические особенности при ОМЛ. Однако точные механизмы с участием цитоплазматического нуклеофозмина, приводящие нормальные клетки к трансформации в злокачественные лейкозные до сих пор не описаны и требуют дальнейшего исследования. Также как и влияние различных сочетаний мутаций на прогноз течения заболевания. Во многих работах отмечают ассоциацию наличия мутаций в гене NPM1 с различными клиническими данными [54; 56; 57]. Так было показано, что частота мутаций увеличивается с возрастом пациентов. Встречаемость мутаций в гене NPM1 значительно выше у взрослых больных по сравнению с пациентами моложе 35 лет. В основном частота встречаемости мутаций составляет от 25 до 41% у взрослых и от 0 до 12% у детей и молодых пациентов. Наблюдается увеличение частоты встречаемости мутаций в гене NPM1 после 21 года: 15% – у группы в возрасте 21-35 лет, 40% – в группе от 35 до 60 лет и 50% – у больных старше 60 лет [172]. Также сообщалось о том, что медиана возраста пациентов с мутациями в NPM1 значительно выше, чем у больных без мутации. По данным некоторых исследователей мутации в гене NPM1 чаще встречаются у женщин, чем у мужчин [149], хотя другие авторы не отмечают такой корреляции [54]. В нашем исследовании медиана возраста больных с мутацией не отличалась от возраста пациентов без мутации и составила 55 лет. Однако больные с НК с 88 мутациями в NPM1 оказались значительно моложе пациентов без мутации (55 и 59 лет, соответственно). Нами не было выявлено различия по частоте встречаемости мутации у женщин и мужчин. При разделении пациентов на группы в зависимости от возраста было обнаружено, что мутации встречались значительно реже у больных старше 70 лет и у пациентов от 18 до 39 лет (в 7,7% и в 14,6% случаев, соответственно). У больных в группах от 40 до 55 лет и от 56 до 69 лет частота встречаемости мутаций в гене NPM1 была гораздо выше. Мутации в гене NPM1 встречаются у больных с различными морфологическими вариантами заболевания. Тем не менее, при анализе исследований, включающих больных с М3 вариантом, только в работе R.G.W. Verhaak с соавт. [172] были представлены данные об одном пациенте с мутацией в гене NPM1 в группе пациентов с М3 вариантом ОМЛ, тогда как другие авторы показали, что ОПЛ с транслокацией t(15;17) не несет мутаций нуклеофозмина. В основном мутации в гене NPM1 выявляются у больных с М4 и М5 вариантами ОМЛ. К другим клиническим показателям, ассоциирующимся с наличием мутаций относятся повышенный уровень лейкоцитов, тромбоцитов и процент бластов в дебюте заболевания [166]. В ходе исследования мы обнаружили, что в группе больных с М3 и М6 ОМЛ ни у одного больного не были выявлены мутации в гене NPM1. Мутации часто детектировались у пациентов с М4 и М5 вариантами (у 27,1% и 31,6%, соответственно). Был обнаружен незначительно более высокий уровень лейкоцитов, тромбоцитов в ПК и бластов в КМ у пациентов с мутацией по сравнению с другими больными в дебюте заболевания. Наличие мутаций в гене NPM1 было статистически достоверно ассоциировано с НК у больных ОМЛ (р = 0,001). При этом у пациентов с аномальным расположением нуклеофозмина не обнаруживались такие хромосомные аберрации как t(15;17) и inv(16). Только у одного больного была найдена прогностически благоприятная хромосомная поломка – t(8;21). Вместе с этим нами показано отсутствие мутаций в гене нуклеофозмина у больных с неблагоприятным кариотипом (р = 0,004). У небольшого числа пациентов с промежуточным кариотипом с мутациями в NPM1 в основном выявлялись 89 одиночные аберрации (трисомии, делеции, моносомии). Данные хромосомные нарушения возможно имеют характер вторичных событий, возникающих в процессе развития лейкоза. Также мы обнаружили достаточно редкую встречаемость мутаций в гене NPM1 при вторичных лейкозах – только у одного пациента. Таким образом, как было показано в нашем исследовании мутации в гене нуклеофозмина характерны для больных с de novo ОМЛ без хромосомных аберраций. Полученные результаты подтверждают выводы проведенных ранее исследований, где мутации нуклеофозмина достоверно чаще выявляются у больных с НК. Частота встречаемости мутаций в этой группе возрастает по разным данным до 45,7-64% по сравнению с общей группой пациентов. Тогда как у больных с различными хромосомными перестройками встречаемость мутаций составляет всего 8,5-19%. В соответствие с этими данными у больных с множественными хромосомными поломками исключают наличие мутаций в гене NPM1 [56]. В настоящее время считают, что ОМЛ с мутациями нуклеофозмина относятся к отдельной подгруппе ОМЛ независимо от обнаруживаемых хромосомных аберраций. Как было показано ранее, значительно чаще мутации нуклеофозмина встречаются в сочетании с мутациями FLT3-ITD, что подтверждает теорию «двух событий» в развитии лейкозогенеза. Группа итальянских ученых, первая обнаружившая клетки с аномальным расположением нуклеофозмина, в своем докладе также отмечала высокую частоту сочетаной встречаемости мутации FLT3-ITD и в гене NPM1. Согласно их данным до 40% пациентов с мутациями в гене NPM1 имеют также и мутацию FLT3-ITD по сравнению с 15-25% больных с геном NPM1 дикого типа [54]. Следует отметить, что типы мутаций в этих генах носят аналогичный характер – являются внутренними тандемными дупликациями. Нами не было обнаружено корреляции между встречаемостью мутаций в NPM1 и FLT3-TKD (р = 0,579), и мутаций в генах CKIT и NRAS (р = 0,521 и р = 0,207, соответственно). Такие результаты сочетаются с данными других исследований. Только в работе R.G.W. Verhaak с соавт. [172] была 90 обнаружена негативная корреляция между встречаемостью мутаций в генах NPM1 и NRAS. Во многих исследованиях показана ассоциация мутаций в гене NPM1 с более высоким уровнем полных ремиссий в группе больных с НК по сравнению с пациентами с НК без мутации. Предполагается, что присутствие в лейкозных клетках цитоплазматического нуклеофозмина обеспечивает повышенную чувствительность этих клеток к воздействию химиотерапии за счет связывания и инактивации транскрипционного фактора NF-κB [42]. Нами также констатирована тенденция к увеличению процента больных, которые достигли ПР в группе с мутациями в NPM1 по сравнению с остальными больными. Идентичные результаты получены и у больных с НК. Однако при анализе ОВ и БРВ в общей исследуемой группе и в группе больных с НК было обнаружено, что у пациентов с мутациями в гене нуклеофозмина прогноз оказался значительно лучше, чем у больных без мутации (р = 0,002). Так как во многих работах, а также и в нашем исследовании была продемонстрирована высокая частота встречаемости сочетанных мутаций в гене NPM1 и мутации FLT3-ITD, мы проанализировали ОВ и БРВ у таких пациентов по сравнению с больными без мутаций. Больные, у которых детектировались сочетано данные мутации, не отличались по прогнозу от пациентов без мутаций, то есть присутствие мутации в гене нуклеофозмина нивелировало негативное влияние FLT3-ITD. Полученные нами результаты сочетаются с данными других исследователей. Ими [166; 149] было показано, что больные с мутациями в нуклеофозмине имели лучшую ОВ во всей группе по сравнению с пациентами без мутации, а при наличии мутации FLT3-ITD дополнительно к мутации в NPM1 наблюдалось ухудшение выживаемости. В некоторых работах не было отмечено влияния мутаций в гене NPM1 на прогноз в общей группе предположительно из-за сильного негативного влияния мутаций в гене FLT3. Полученные данные демонстрировали, что мутации в гене NPM1 часто встречаются в группе больных с НК, гетерогенной по скорости ответа на проводимую терапию и длительности ОВ и БРВ, и имеющей промежуточный 91 прогноз течения заболевания. Таким образом, мутационный статус гена NPM1 может служить важным прогностическим маркером для таких пациентов. В то время как наличие мутации в гене FLT3 может негативно влиять на прогноз у пациентов с мутациями нуклеофозмина. Эти данные обуславливают целесообразность включения детекции мутационного статуса генов NPM1 и FLT3 в современные алгоритмы диагностики ОМЛ. Семейство протоонкогенов RAS играет важную роль в регуляции таких внутриклеточных процессов как пролиферация, дифференцировка и апоптоз. Мутации гена NRAS являются наиболее часто встречающимися мутациями RAS сигнального пути при ОМЛ и детектируются в среднем у 10-15% больных [16]. В нашей исследуемой группе мутации в гене NRAS выявлялись у 10,0% больных ОМЛ. Мутации данного гена незначительно чаще встречались в группе пациентов с de novo ОМЛ по сравнению с группой больных вторичными лейкозами. Эти данные совпадают с большинством исследований. Однако в работе T. Illmer с соавт. [85] было показано значительное увеличение мутаций в гене NRAS у больных со вторичными ОМЛ (43%) и ОМЛ, связанными с проведением предшествующей цитостатической терапии (75%), по сравнению с de novo ОМЛ (17%). При сравнительном анализе встречаемости мутаций в гене NRAS в зависимости от варианта кариотипа нами была обнаружена их ассоциация с благоприятными хромосомными поломками у больных ОМЛ. Особенно часто данные мутации встречались у больных с inv(16) – у 20% пациентов из всей исследуемой группы. Большинство исследователей отмечало данную закономерность и частота встречаемости составляла от 26% до 38% [16]. Только в исследовании I. Panagopoulos с соавт. [121] были приведены данные о низкой встречаемости мутаций NRAS у больных с inv(16) – у 1 из 8 больных – возможно из-за недостаточного количества пациентов, включенных в исследование. C. Haferlach с соавт. [80] показали, что мутации в NRAS часто встречаются у больных с inv(3)/t(3;3) (у 20% больных) также эта корреляция наблюдается и в других работах. По нашим данным, из всей исследуемой группы только у одного 92 пациента была обнаружена t(3;3) и она обнаруживалась в сочетании с мутацией в гене NRAS. Как показало наше исследование, мутации в общей группе пациентов встречаются чаще в 12 кодоне гена NRAS. Мутация в 61 кодоне была обнаружена только у одного пациента и сочеталась с наличием inv(16). В некоторых исследованиях показана значимая высокая встречаемость совместно inv(16) или inv(3)/t(3;3) и мутаций 61 кодона гена NRAS. Таким образом, предполагается, что механизмы, приводящие к образованию inv(16) или inv(3)/t(3;3), изначально с большей вероятностью инициируют мутации в 61 кодоне гена NRAS, чем в 12 или 13 кодонах. Что касается больных с t(15;17) и пациентов с неблагоприятным кариотипом, то ни у одного пациента из этой группы нами не были обнаружены мутации в гене NRAS и данная закономерность не была статистически достоверной (р = 0,151 и р = 0,057, соответственно) (возможно из-за небольшой исследуемой группы). Однако она подтверждается аналогичными результатами литературных данных [16]. При исследовании морфологических вариантов ОМЛ, мы обнаружили, что чаще мутации в NRAS встречались у пациентов с М4 вариантом (12,5%). Данная закономерность наблюдается и в других исследованиях [85]. В некоторых работах авторы отмечают высокую встречаемость мутаций в NRAS у больных с М4 вариантом с эозинофилией и не находят в тоже время такой корреляции в отношении больных с М4 вариантом [132]. В нашем исследовании не была выделена отдельно группа пациентов с М4 с эозинофилией, возможно, поэтому мы нашли ассоциацию наличия мутаций в гене NRAS с М4 вариантом. В литературе были представлены данные о понижении уровня лейкоцитов в ПК пациентов с мутациями в гене NRAS по сравнению с больными без мутации [93]. Однако нами не было обнаружено данной корреляции, уровень лейкоцитов в обеих группах практически не отличался (46,4×10 9 /л и 42,4×10 9 /л, соответственно). Несмотря на то, что мутации в гене NRAS у больных ОМЛ были впервые выявлены в 1987 году, дискуссии о прогностическом влиянии данных мутаций 93 продолжаются до сих пор. Полученные нами результаты не выявили значимого влияния наличия мутаций в NRAS на прогноз течения заболевания. Так число больных, вышедших в ПР, ОВ и БРВ пациентов с мутациями в NRAS и без мутации значительно не отличались. В группе больных с благоприятным кариотипом, у которых мутации в гене NRAS встречались достоверно чаще (р = 0,001), была обнаружена тенденция к ухудшению ОВ и БРВ у больных с мутациями в NRAS по сравнению с остальными больными (р = 0,214 и р = 0,160, соответственно). В крупном исследовании U. Bacher с соавт. [16] также не было найдено значимых отличий при оценке прогноза заболевания у пациентов с и без мутаций в гене NRAS. Однако ими была обнаружена тенденция к улучшению прогноза у пациентов с НК и мутациями в гене NRAS по сравнению с остальными больными. В своем исследовании H. Kiyoi с соавт. [93] показали негативное влияние мутаций в NRAS в группе больных с благоприятным кариотипом. M-T. Krauth с соавт. [98] выделили в своей работе группу больных с t(8;21), у которых изучали влияние мутаций в различных генах на прогноз течения заболевания. В результате ими не было обнаружено достоверных отличий по длительности ОВ в группе с мутациями в NRAS и без них. Таким образом, основную сложность в корректной оценке прогностического потенциала мутаций в NRAS составляет малочисленный объем исследований и относительно небольшая частота встречаемости данных мутаций. Противоречивые данные о прогностическом значении мутаций в NRAS не позволяют на сегодняшний день включить этот маркер в стандартный алгоритм обследования пациентов с ОМЛ. В нашем исследовании частота встречаемости мутаций в гене CKIT во всей исследуемой группе составила 3%, что согласуется с литературными данными, где приводятся значения 2-8%. У всех пациентов была найдена мутация тирозинкиназного домена CKIT D816V. В большинстве исследований данная мутация является наиболее часто встречаемой по сравнению с мутациями 8-го и 11-го экзонов. В редких случаях исследователи обнаруживают вместе мутации в 8 и 17 экзонах CKIT [Care, 2003]. Мы не обнаружили значимых отличий в количестве лейкоцитов (40,7×10 9 /л и 42,8×10 9 /л, соответственно) и тромбоцитов 94 (86,7×10 9 /л и 70,4×10 9 /л, соответственно) в ПК, а также проценте бластов (70,0% и 61,8%, соответственно) в КМ у пациентов с и без мутаций в CKIT. Также не было найдено отличия в этих группах в отношении возраста или пола пациентов. Следует отметить, что статистически значимой оказалась высокая встречаемость D816V у пациентов со вторичными лейкозами (из МДС) по сравнению с больными с de novo ОМЛ (р = 0,001). Также было детектировано, что мутации в гене CKIT значительно чаще встречаются у больных из группы благоприятного прогноза с t(8;21) – у 25% больных. Была обнаружена высокая частота встречаемости мутаций D816V у больных с моносомией 7 хромосомы (р = 0,001). Полученный результат не нашел подтверждения в литературных источниках. В соответствие с литературными данными, обнаружение мутаций в гене CKIT ассоциируется с благоприятным кариотипом, а именно с CBF-лейкозами. В большинстве исследований частота встречаемости мутаций в CKIT у больных CBF-лейкозами составляет около 25% [27]. Однако в некоторых исследованиях это значение доходит до 50% у больных с t(8;21) [175]. Этот факт дает основание предположить, что кооперация данных нарушений лежит в основе образования лейкозного клона. Данные о том, что у некоторых пациентов в ПР еще детектируется t(8;21), а мутации в гене CKIT уже не обнаруживаются, говорят о том, что образование AML1-ETO является первичным событием в процессе лейкозогенеза, но имеет крайне ограниченный пролиферативный потенциал in vivo. Поэтому требуется возникновение 2-го события – мутации в гене CKIT. Выявление транслокации t(8;21) у пациентов с острыми миелобластными лейкозоми ассоциируется с благоприятным прогнозом течения заболевания, высоким уровнем ремиссий и длительной медианой выживаемости. Однако присутствие в этой группе мутаций в CKIT может существенно изменить прогноз. Результаты нашего исследования показали, что наличие мутации в 816 кодоне гена CKIT приводит к значительному ухудшению показателей БРВ по сравнению с больными без мутации. В группе больных с t(8;21) нами была показана тенденция к уменьшению длительности ОВ и БРВ у больных с мутациями D816V по сравнению с больными без мутации (р = 0,224 и р = 0,162, соответственно). 95 Крупное исследование итальянских авторов показало достоверную ассоциацию мутаций в гене CKIT с высоким уровнем рецидивов и худшей ОВ у пациентов с t(8;21) [35]. Было также отмечено, что точечные мутации в 816 кодоне наиболее негативно влияют на прогноз по сравнению с мутациями в 8 и 11 экзонах. Это можно объяснить тем, что у пациентов с мутациями в 816 кодоне детектировалось значительное увеличение уровня лейкоцитов по сравнению с остальной группой. Следует отметить, что в группе больных с inv(16) исследователи не обнаружили значимое отличие в длительности ОВ и БРВ у больных с и без мутаций в CKIT [34]. В некоторых странах диагностику мутаций в CKIT уже внесли в стандартный алгоритм обследования больных с ОМЛ и есть рекомендации по проведению ТГСК для больных с CBF-лейкозами и мутациями в CKIT в период первой ПР [107]. Таким образом, согласно данным нашего исследования обнаружение мутаций в гене CKIT у пациентов ОМЛ с t(8;21) является частым событием. Наличие мутаций в гене CKIT у больных ОМЛ с t(8;21) делает ее гетерогенной в отношении длительности ремиссий и ответа на проводимую терапию. Наличие мутации D816V в гене CKIT ассоциируется с высоким риском развития рецидива. Это свидетельствует о важности включения данного маркера в стандартный алгоритм диагностики пациентов с ОМЛ. По результатам проведенных исследований был предложен алгоритм генетической диагностики пациентов с ОМЛ (рисунок 48). 96 Рисунок 48 – Алгоритм генетической диагностики пациентов с ОМЛ 5.2 Обсуждение результатов исследования группы больных МДС Затруднения, с которыми сталкиваются врачи-гематологи при установлении диагноза МДС, а именно низкая клеточность КМ, разрастание фиброзной ткани, минимальные признаки дисплазии и другие, могут быть разрешены за счет проведения комплексного обследования, в том числе с применением генетических методов диагностики. Так, U. Bacher с соавт. исследовали большую группу больных с неподтвержденным диагнозом МДС после проведения иммунофенотипирования и анализа морфологии клеток. Они использовали методы кариотипирования и определяли мутации в различных генах. В результате ими был подтвержден диагноз МДС у 5,3% больных только за счет результатов цитогенетических исследований, а мутации были выявлены у более 15% пациентов [19]. Таким образом, рекомендуется проведение стандартной цитогенетики для подтверждения диагноза, установления группы риска больных МДС, а также использование молекулярно-генетических методов для составления 97 наиболее полной характеристики заболевания в каждом индивидуальном случае и для подбора таргетной терапии. В нашем исследовании, была охарактеризована группа больных МДС с применением морфологических, цитогенетических и молекулярно-генетических методов исследования. При этом не была обнаружена разница в частоте заболеваемости МДС у мужчин и женщин. Медиана возраста пациентов составила 66 лет, причем наибольшая заболеваемость наблюдалась в пределах от 60 до 79 лет, со снижением в интервале 50-59 лет. В основном все пациенты (кроме 2-х) имели диагноз de novo МДС. При разделении больных на группы в соответствии с классификацией ВОЗ было показано, что у большей части больных обнаруживалась рефрактерная анемия с избытком бластов, причем у 59,1% этих пациентов количество бластов в миелограмме превышало 5%. По результатам цитогенетического исследования пациенты были распределены в 5 прогностических групп (в соответствие со шкалой R-IPSS). Половина больных из исследуемой группы имела хороший прогноз, 23,8% пациентов – промежуточный и 17,5% – крайне неблагоприятный. Меньше всего больных имели плохой и очень хороший прогнозы. Нормальный кариотип был детектирован у 40,0% пациентов, комплексный – у 22,5%, прогностически благоприятная поломка del(5q) обнаруживалась у 10,0%, неблагоприятные повреждения 7-ой хромосомы – у 5,0%. У остальных больных были найдены различные повреждения хромосом, представленные в основном делециями, потерями хромосом и дополнительными хромосомами, а также несбалансированными транслокациями. При исследовании ОВ больных с различными прогностическими вариантами было выявлено, что выживаемость пациентов с хорошим и промежуточным прогнозами значительно лучше по сравнению с пациентами с плохим и очень плохим прогнозами. Согласно литературным данным, МДС ассоциируется с наличием у больных разнообразных хромосомных аберраций, которые используются для подтверждения диагноза, определения группы риска и мониторинга МОБ [145]. Однако до половины пациентов с МДС имеют НК. Предполагается, что как и 98 ОМЛ, МДС может рассматриваться как многоступенчатый процесс с участием мутаций тирозинкиназ (мутации I класса) и транскрипционных факторов (мутации II класса). Это подтверждается тем, что практически у всех пациентов с МДС с мутациями имеются дополнительные хромосомные аберрации [24]. В ходе исследования мутационного статуса больных МДС, было обнаружено, что мутации в генах FLT3, NPM1 и NRAS встречались у 10,0% пациентов. У всех, кроме одного пациентов мутации были одиночными. Не было обнаружено различия между группами больных с мутациями и без в отношении гендерного признака или возраста. Мутации достоверно чаще встречались у больных в возрасте от 60 до 69 лет (p = 0,012). У всех пациентов с мутациями был поставлен диагноз de novo МДС рефрактерная анемия с избытком бластов. Различные литературные источники подтверждают тот факт, что наиболее часто мутации выявляются у пациентов с первичными МДС с неблагоприятными вариантами, такими как, РАИБ или РАИБ-Т [140]. Почти все пациенты с мутациями принадлежали к группам хорошего и промежуточного прогноза, только у одного больного был идентифицирован комплексный кариотип. Мутации в гене FLT3, особенно FLT3-ITD, часто встречаются при ОМЛ и имеют неблагоприятное влияние на течение заболевания. Что касается пациентов с МДС, то здесь прогностическое значение мутаций в FLT3 остается неопределенным. Частота встречаемости данных мутаций в среднем составляет 4% [76]. В нашей работе мутации в гене FLT3 были обнаружены у 5,0% больных МДС, при этом мутация FLT3-ITD была детектирована в 3,8% случаев, а FLT3TKD в 1,2%, в сочетании с мутацией в гене NPM1. У всех 4-х пациентов с мутациями в гене FLT3 был установлен de novo МДС РАИБ, причем у трех пациентов количество бластов в КМ превышало 5%. У двух больных был обнаружен НК, один пациент имел одиночную аберрацию, один – комплексные изменения кариотипа. Таким образом, нам не удалось выявить корреляцию между наличием мутаций в гене FLT3 и вариантом кариотипа, больные распределялись и по разным прогностическим группам (R-IPSS) – с хорошим, промежуточным и крайне неблагоприятным прогнозом. 99 Задачей нашего исследования являлся анализ влияния мутаций на прогноз течения заболевания. Проанализировав данные по каждому пациенту, мы получили следующие результаты. В ходе нашего исследования, одна из пациенток с мутацией FLT3-ITD с благоприятным прогнозом и низким количеством бластов хорошо отвечала на терапию, прогрессии заболевания не выявлено. У других трех пациентов наблюдалась трансформация и летальный исход в течение 1,1-6 месяцев. У одного из трех больных был неблагоприятный прогноз – наличие множественных хромосомных нарушений и избыточное количество бластов, ОВ была крайне низкой. У других двух пациентов с FLT3ITD и FLT3-TKD+NPM1, несмотря на молодой возраст (у больной с FLT3-ITD) и хороший прогноз, была выявлена трансформация в ОМЛ. В целом, ОВ больных с мутацией FLT3-ITD была ниже по сравнению с пациентами без мутации, но различие не было значимым. Что касается прогностической значимости мутаций в гене FLT3, то исследователи отмечают значимое негативное влияние данной мутации на продолжительность жизни и риск трансформации [67]. Например, L-Y. Shih с соавт. [152] показали в своем исследовании негативное влияние мутаций FLT3ITD на прогноз у больных МДС. У всех пациентов с FLT3-ITD они наблюдали трансформацию в ОМЛ в течение чытерех месяцев от начала заболевания. Медиана ОВ больных с FLT3-ITD была достоверно ниже, чем у пациентов без мутации. В некоторых других работах исследователям не удалось установить влияние мутаций в гене FLT3 на прогноз [47]. Было показано, что мутации в гене нуклеофозмина гораздо чаще (до 15%) встречаются у пациентов с диагнозом МДС/МПЗ, и только у около 4% больных с диагнозом МДС. В исследовании A. Bains с соавт. [21] было детектировано, что больные с одиночной мутацией в гене NPM1 имели низкий риск прогрессии в ОМЛ и длительную выживаемость. Однако если мутация встречалась в сочетании с мутациями в гене FLT3, то трансформация наблюдалась во всех случаях, а прогноз был крайне неблагоприятным. По нашим данным, частота встречаемости мутаций в гене NPM1 была достаточно низкой и составила 3,8% (в 2,5% случаев 100 была обнаружена одиночно, в 1,3% - в сочетании с FLT3-TKD), возможно из-за небольшого количества больных с диагнозом МДС/МПЗ в исследуемой группе. Оба пациента с одиночной мутацией в нуклеофозмине имели промежуточный прогноз по результатам цитогенетического исследования. 75-летняя больная с РА и del(8q) жива без прогрессии в течение 17 месяцев от начала заболевания, несмотря на наличие такого неблагоприятного фактора как пожилой возраст. У 69-летнего пациента с мутацией в NPM1 и избытком бластом в КМ была найдена неблагоприятная аберрация del(7q), выживаемость составила 9 месяцев. Таким образом, из-за малого количества пациентов в данной группе и наличия у них неблагоприятных факторов, влияющих на прогноз, невозможно сделать заключение о значении мутаций в гене NPM1 в группе больных с МДС. Частота встречаемости как и прогностическое влияние мутаций в NRAS сильно варьируют от исследования к исследованию. Используя современные технологии секвенирования в среднем мутации в гене NRAS встречаются в 0-6,0% случаев МДС. В основном это мутации 12 кодона. В некоторых исследованиях наблюдали значительное ухудшение ОВ и высокий риск прогрессии в ОМЛ у таких пациентов [162]. В других работах наличие мутаций в NRAS не влияло на прогноз [14]. В нашей работе мутации 12 кодона гена NRAS были выявлены в у 2,5% больных. Несмотря на хороший и промежуточный прогнозы, а также наличие у одной пациентки благоприятного маркера – делеции 5q, оба пациента прогрессировали в ОМЛ, ОВ составила около 16 месяцев. В целом, у больных МДС мутации в генах FLT3, NPM1 и NRAS являются достаточно редким явлением. Возможной причиной, как отмечают некоторые исследователи, является тот факт, что мутации возникают не в дебюте МДС, а к моменту его трансформации в ОМЛ [162]. Следовательно скрининг мутационного статуса может использоваться при мониторинге терапии больных МДС в качестве маркера прогрессии заболевания. Также при исследовании прогностического влияния мутаций в этих генах некоторые затруднения вызывают пожилой возраст подавляющего большинства больных с мутациями (старше 60 лет) и наличие избыточного количества бластов в КМ, так как эти группы сами по себе 101 ассоциируются с высокой степенью риска трансформации. Так как патогенез МДС ассоциирован с аберрациями различных генов, функционирующих в качестве медиаторов основных сигнальных путей в клетке, дальнейшие исследования комбинаций таких повреждений, а также процесса активации сигнала являются критичными для выявления их потенциала в процессе трансформации заболевания. в ОМЛ и понимания механизмов инициации данного 102 ВЫВОДЫ 1. Мутации в генах FLT3 и NPM1 существенно чаще обнаруживаются у пациентов в возрасте 60-69 лет с МДС РАИБ-1 и РАИБ-2 и у больных ОМЛ с нормальным кариотипом, определяя прогноз заболевания. Мутации в генах CKIT и NRAS чаще встречаются у пациентов с благоприятным кариотипом. 2. Мутация FLT3-ITD ассоциируется с повышенным уровнем лейкоцитов в периферической крови и бластов в костном мозге в дебюте ОМЛ, а также негативным влиянием на выживаемость пациентов и высоким риском развития рецидива. 3. Мутация FLT3-TKD достоверно снижает общую и безрецидивную выживаемость больных ОМЛ по сравнению с пациентами с генотипом FLT3-ITD-. 4. Инсерции в гене NPM1 у пациентов с ОМЛ являются благоприятным фактором, коррелирующим с длительной безрецидивной выживаемостью у всех больных, за исключением пациентов с генотипом FLT3-ITD+/NPM1+. 5. Мутации в гене CKIT чаще встречаются у больных с t(8;21) и связаны с высоким риском рецидива заболевания у пациентов с ОМЛ. Мутации в гене NRAS статистически значимо не влияют на прогноз у больных ОМЛ и МДС. 6. Изучение мутационного статуса генов CKIT, FLT3 и NPM1 способствует улучшению диагностики больных ОМЛ и имеет определяющее значение в прогнозировании пациентов. длительности общей и безрецидивной выживаемости 103 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Значительный прогностический потенциал генов CKIT, NPM1 и FLT3 позволяет рекомендовать проведение скрининга их мутационного статуса у всех пациентов с ОМЛ при первичной диагностике независимо от результатов других исследований. 2. Исследование аномалий генов NRAS, NPM1 и FLT3 у больных миелодиспластическими синдромами обусловлено необходимостью уточнения диагноза заболевания, а также оценки риска трансформации в ОМЛ. 3. Поиск сочетанной встречаемости мутаций в генах, несущих разную функциональную нагрузку, необходим для установления наиболее точного прогноза течения заболевания у пациентов с ОМЛ и МДС. 104 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ алло-ТГСК – аллогенная трансплантация костного мозга БРВ – безрецидивная выживаемость БСВ – безсобытийная выживаемость ВОЗ – всемирная организация здравоохранения ГМ-КСФ – гранулоцитарно-моноцитарный колонестимулирующий фактор ГСК – гемопоэтическая стволовая клетка ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИЛ-3 – интерлейкин-3 ИТК – ингибитор тирозинкиназ КМ – костный мозг МДС – миелодиспластический синдром МК – моносомный кариотип МОБ – минимальная остаточная болезнь МПЗ – миелопролиферативное заболевание МПЦ – мультипараметрическая проточная цитометрия НК – нормальный кариотип ОВ – общая выживаемость ОМЛ – острый миелобластный лейкоз ОПЛ – острый промиелоцитарный лейкоз ОТ-ПЦР – обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция ПК – периферическая кровь ПР – полная ремиссия ПЦР – полимеразная цепная реакция РА – рефрактерная анемия РАИБ – рефрактерная анемия с избытком бластов РАИБ-Т – рефрактерная анемия с избытком бластов в трансформации РАКС – рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами РНК – рибонуклеиновая кислота 105 РЦМД – рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией ТФ – транскрипционный фактор ФАБ – франко-американо-британская ассоциация ХММЛ – хронический миеломоноцитарный лейкоз ЦНС – центральная нервная система AMLCG – acute myeloid leukemia cooperative group (ОМЛ кооперативная группа) CBF – core binding factor (основной связывающий фактор) CDR – common deleted region (делетированный регион) CKIT – v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog ECOG – шкала eastern cooperative oncology group (объединенная восточная онкологическая группа) FDA – food and drug administration (продуктовый и лекарственный контроль) FISH – флуоресцентная in situ гибридизация FLT3 – fms-related tyrosine kinase 3 (тирозинкиназа третьего типа) IPSS – шкала international prognostic scoring system (международная прогностическая система) NPM1 – нуклеофозмин В23 NRAS – neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog R-IPSS – revised international prognostic scoring system (обновленная международная прогностическая система) SWOG – southwest oncology group (юго-западная онкологическая группа) 106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абдулкадыров, К.М. Возрастные особенности кариотипа острого миелоидного лейкоза / К.М. Абдулкадыров, И.С. Мартынкевич, С.В. Грицаев с соавт. // Терапевтический архив. - 2011. - № 1.- С. 51-55. 2. Абдулкадыров, К.М. Клиническая гематология, справочник / К.М. Абдулкадыров. - Москва – Санкт-Петербург, 2006. - 447 с. 3. Абдулкадыров, К.М. Новейший справочник / К.М. Абдулкадыров. - М.: Сова, 2004.– 928 с. 4. Волкова, М. А. Клиническая онкогематология: руководство для врачей / М. А. Волкова. - М.: Медицина, 2001. - 576 с. 5. Воробьёв А.И. Руководство по гематологии / А.И. Воробьёв. – М.: Ньюдиамед, 2003. – 280 с. 6. Глянц, С. Медико-биологическая статистика / С. Глянц. - М.: Практика, 1999. – 459 с. 7. Грицаев, С.В. Комплексный кариотип – маркер крайне неблагоприятного прогноза у больных острыми миелоидными лейкозами с развернутыми вариантами миелодиспластического синдрома старше 70 лет с высоким индексом коморбидности / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, К.М. Абдулкадыров с соавт. // Терапевтический Архив. - 2012. - Т. 7. – С. 16-21. 8. Грицаев, С.В. Гетерогенность острого миелоидного лейкоза с транслокацией t(8;21) (q22;q22) / С.В. Грицаев, И.С. Мартынкевич, И.С. Зюзгин с соавт. // Терапевтический архив. - 2014. - № 7. - С. 45-52. 9. Демидова, И.А. Мутации гена нуклеофозмина при острых лейкозах / И.А. Демидова // Клиническая онкогематология. – 2008. - T. 1. - № 4. – C. 297302. 10. Рукавицын, О.А. Гематология. Атлас-справочник / О.А. Рукавицын С.В. Скворцов, М. Н. Зенина. - Детство-Пресс, 2009. – 256 с. 11. Сергеев, А.Г. Диагностическое и прогностическое значение генетических аномалий опухолевых клеток при лейкозах / А.Г. Сергеев, Р.А. 107 Иванов, Л.Г. Фечина // Гематология и трансфузиология. - 2000. - Т. 45. - № 1. - С. 28-35. 12. Харченко, М.Ф. Ретроспективный цитохимических, электронно-микроскопичеких анализ морфологических, биохимических особенностей бластных клеток при остром промиелоцитарном лейкозе / М.Ф. Харченко, К.М. Абдулкадыров, И.С. Мартынкевич с соавт. // Клиническая медицина. - 2004. - № 8. - С. 51-56. 13. Abu-Duhier, F.M. Identification of novel FLT3 Asp835 mutations in adult acute myeloid leukaemia / F.M. Abu-Duhier, A.C. Goodeve, G.A. Wilson et al. // Br J Haematol. – 2001. – V. 113. – P. 983-988. 14. Al-Kali, A. Prognostic impact of RAS mutations in patients with myelodysplastic syndrome / A.Al-Kali, A. Quintás-Cardama, R. Luthra et al. // Am J Hematol. – 2013. – V. 88. - № 5. – P. 365–369. 15. Allen, C. The importance of relative mutant level for evaluating impact on outcome of KIT, FLT3 and CBL mutations in core-binding factor acute myeloid leukemia / C. Allen, R.K. Hills, K. Lamb et al. // Leukemia. – 2013. – V. 27. – P. 1891– 1901. 16. Bacher, U. Implications of NRAS mutations in AML: a study of 2502 patients / U. Bacher, T. Haferlach, C. Schoch et al. // Blood. – 2006. – V. 107. - № 10. – P. 3847-3853. 17. Bacher, U. Molecular genetics in acute myeloid leukemia / U. Bacher, S. Schnittger, T. Haferlach // Curr Opin Oncol. - 2010. – V. 22, № 36. - P. 646-655. 18. Bacher, U. Prognostic relevance of FLT3-TKD mutations in AML: the combination matters an analysis of 3082 patients / U. Bacher, C. Haferlach, W. Kern et al. // Blood. – 2008. – V. 111. - № 5. – P. 2527-2537. 19. Bacher, U. The Impact of Cytomorphology, Cytogenetics, Molecular Genetics, and Immunophenotyping in a Comprehensive Diagnostic Workup of Myelodysplastic Syndromes / U. Bacher, T. Haferlach, W. Kern et al. // Cancer. – 2009. – V. 115. - № 19. – P. 4524-4532. 108 20. Bain, B.J. Leukaemia Diagnosis, 4th Edition / B.J. Bain. - Wiley- Blackwell, 2010. - 404 pages. 21. Bains, A. FLT3 and NPM1 Mutations in Myelodysplastic Syndromes / A. Bains, Rajyalakshmi Luthra, L. Jeffrey Medeiros et al. // Am J Clin Pathol. – 2011. – V. 135. – P. 62-69. 22. Balusu, R. Targeting levels or oligomerization of nucleophosmin 1 induces differentiation and loss of survival of human AML cells with mutant NPM1 / R. Balusu, W. Fiskus, R. Rao et al. // Blood. – 2011. – V. 118. – P. 3096-3106. 23. Becker, H. Favorable prognostic impact of NPM1 mutations in older patients with cytogenetically normal de novo acute myeloid leukemia and associated geneand microRNA-expression signatures: a Cancer and Leukemia Group B study / H. Becker, G. Marcucci, K. Maharry et al. // Journal of Clinical Oncology. – 2010. – V. 28. – P. 596–604. 24. Bejar, R. Clinical Effect of Point Mutations in Myelodysplastic Syndromes / R. Bejar, K. Stevenson, O. Abdel-Wahab et al. // N Engl J Med. – 2011. – V. 364. – P. 2496-2506. 25. Bennett, J.M. Proposals for the classification of the acute leukaemias French-American-British (FAB) co-operative group / J.M. Bennett, D. Catovsky, M.T. Daniel et al. // Br J Haematol. - 1976. - V. 33. - № 4. - P. 451–458. 26. Beris, P. Overview of myelodysplastic syndromes / Beris P., G. Georgiou // Semin Hematol. - 2012. - V. 49. - № 4. - P. 287-294. 27. Boissel, N. Incidence and prognostic impact of CKIT, FLT3, and Ras gene mutations in core binding factor acute myeloid leukemia (CBF-AML) / N. Boissel, H. Leroy, B. Brethon et al. // Leukemia. – 2006. – V. 20. - № 6. – P. 965-970. 28. Boissel, N. Prognostic significance of FLT3 internal tandem repeat in patients with de novoacute myeloid leukemia treated with reinforced courses of chemotherapy / N. Boissel, J.M. Cayuela, C. Preudhomme et al. // Leukemia. – 2002. – V. 16. – P. 1699-1704. 29. Bowen, D. RAS mutation in acute myeloid leukemia is associated with distinct cytogenetic subgroups but does not influence outcome in patients younger than 109 60 years / D. Bowen, M. Frew, R. Hills et al. // Blood. – 2005. – V. 106. – P. 2113– 2119. 30. Brandts, C.H. Constitutive activation of Akt by Flt3 internal tandem duplications is necessary for increased survival, proliferation, and myeloid transformation / C.H. Brandts, B. Sargin, M. Rode et al. // Cancer Res. – 2005. – V. 65. - № 21. – P. 9643-9650. 31. Breems, D.A. Acute myeloid leukemia with monosomal karyotype at the far end of the unfavorable prognostic spectrum / D.A. Breems, B. Lowenberg // Haematologica. - 2011. - V. 96. - P. 491–493. 32. Breems, D.A. Monosomal karyotype in acute myeloid leukemia: a better indicator of poor prognosis than a complex karyotype / D.A. Breems, W.L. Van Putten, G.E. De Greef et al. // Clin Oncol. - 2008. - V. 26. - P. 4791–4797. 33. Buchner, T. Age-related risk profile and chemotherapy dose response in acute myeloid leukemia: a study by the German Acute Myeloid Leukemia Cooperative Group / T. Buchner, W.E. Berdel, C. Haferlach et al. // Journal of Clinical Oncology. 2009. - V. 27. - P. 61–69. 34. Cairoli, R. Prognostic impact of CKIT mutations in core binding factor leukemias:an Italian retrospective study blood / R. Cairoli, A. Beghini, G. Grillo et al. // Blood. – 2006. – V. 107. – P. 3463-3468. 35. Care, R.S. Incidence and prognosis of CKIT and FLT3 mutations in core binding factor (CBF) acute myeloid leukaemias / R.S. Care, P.J. Valk, A.C. Goodeve et al. // British Journal of Haematology. – 2003. – V. 121. – P. 775–777. 36. Cazzola, M. The genetic basis of myelodysplasia and its clinical relevance / M. Cazzola, M.G. Della Porta, L. Malcovati // Blood. 2013. - V. 122. - № 25. - P. 40214034. 37. Ceesay, M. Myelodysplastic syndromes / M. Ceesay, W. Ingram, G.J. Mufti // Molecular Hematology, Third Edition. - 2010. - P. 89-103. 38. Chan, P.M. Differential signaling of Flt3 activating mutations in acute myeloid leukemia: a working model / P.M. Chan // Protein Cell. – 2011. – V. 2. - № 2. – P. 108–115. 110 39. Chen, S.J. A panoramic view of acute myeloid leukemia / S.J. Chen, Y. Shen, Z. Chen // Nat Genet. - 2013. – V. 45. - № 6. – P. 586-587. 40. Chen, W. Nucleophosmin Gene Mutations in Acute Myeloid Leukemia / W. Chen, G.Z. Rassidakis, L.J. Medeiros // Arch Pathol Lab Med. – 2006. - V. 130. - P. 1687-1692. 41. Chou, W.C. Nucleophosmin mutations in de novo acute myeloid leukemia: the age-dependent incidences and the stability during disease evolution / W.C. Chou, J.L. Tang, L.I. Lin et al. // Cancer Res. – 2006. – V. 66. – P. 3310-3316. 42. Cilloni, D. Increase sensitivity to chemotherapeutical agents and cytoplasmatic interaction between NPM leukemic mutant and NF-kappaB in AML carrying NPM1 mutations / D. Cilloni, F. Messa, V. Rosso et al. // Leukemia. – 2008. – V. 22. – P. 1234–1240. 43. Colombo, E. Nucleophosmin and its complex network: a possible therapeutic target in hematological diseases / E. Colombo, M. Alcalay, P.G. Pelicci // Oncogene. – 2011. – V. 30. –P. 2595–2609. 44. Cordell, J.L. Detection of normal and chimeric nucleophosmin in human cells / J.L. Cordell, K.A. Pulford, B. Bigerna et al // Blood. – 1999. – V. 93. – P. 632642. 45. Corrêa de Souza, D. Cytogenetic as an important tool for diagnosisand prognosis for patients with hypocellular primary myelodysplastic syndrome / D. Corrêa de Souza, C. de Souza Fernandez, A. Camargo et al. // Biomed Res Int. - 2014. - № 542395. - P.1-10. 46. Dash, A. Molecular genetics of acute myeloid leukemia / A. Dash, D.G. Gilliland // Best Practice & Research Clinical Haematology. - 2001. - V. 14. - № 1. – P. 49-64. 47. Daver, N. Effect of NPM1 and FLT3 mutations on the outcomes of elderly patients with acute myeloid leukemia receiving standard chemotherapy / N. Daver, T. Liu Dumlao, F. Ravandi et al.// Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia. – 2013. – V. 13. – P. 435–440. 111 48. Daver N. FLT3 mutations in myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic leukemia / N. Daver, P. Strati, E. Jabbour // Am J Hematol. - 2013. V. 88. - № 1. - P. 56–59. 49. Davids, M.S. The molecular pathogenesis of myelodysplastic syndromes / M.S. Davids, D. P. Steensma // Cancer Biology & Therapy. - 2010. - V. 10. - № 4. - P. 309-319. 50. Deeg, H.J. Five-group cytogenetic risk classification, monosomal karyotype, and outcome after hematopoietic cell transplantation for MDS or acute leukemia evolving from MDS / H.J. Deeg, B.L. Scott, M. Fang et al. // Blood. - 2012. V. 120. - P. 1398-1408. 51. Deschler, B. Acute myeloid leukemia: epidemiology and etiology / B. Deschler, M. Lubbert // Cancer. - 2006. - V. 107. - № 9. - P. 2099-2107. 52. Ding, L. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing / L. Ding, T.J. Ley, D.E. Larson et al. // Nature. - 2012. – V. 481. – P. 506–510. 53. Dohner, H. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet / H. Dohner, E.H. Estey, S. Amadori et al. // Blood. - 2010. - V. 115. - P. 453–474. 54. Falini, B. Acute myeloid leukemia with mutated nucleophosmin (NPM1): is it a distinct entity / B. Falini, M.P. Martelli, N. Bolli et al. // Blood. 2011. – V. 117. – P. 1109–1120. 55. Falini, B. Acute myeloid leukemia carrying cytoplasmic/mutated nucleophosmin (NPMc+ AML): biologic and clinical features / B. Falini, I. Nicoletti, M.F. Martelli et al. // Blood. – 2007. – V. 109. – P. 874-885. 56. Falini, B. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype / B. Falini, C. Mecucci, E. Tiacci et al. // N Engl J Med. – 2005. – V. 352. – P. 254–266. 112 57. Federici, L. Nucleophosmin mutations in acute myeloid leukemia: A tale of protein unfolding and mislocalization / L. Federici, B. Falini // Protein science. – 2013. – V. 22. – P. 545—556. 58. Filipits, M. Drug resistance factors in acute myeloid leukemia: a comparative analysis / M. Filipits, T. Stranzl, G. Pohl et al. // Leukemia. - 2000. - V. 14. - № 1. - P. 68-76. 59. Foran, M.J. New prognostic markers in acute myeloid leukemia: perspective from the Clinic / M.J. Foran // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. – 2010. – P. 47-55. 60. Frohling, S. Prognostic significance of activating FLT3 mutations in younger adults (16 to 60 years) with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: a study of the AML Study Group Ulm / S. Frohling, R.F. Schlenk, J. Breitruck et al. Blood. – 2002. – V. 100. – P. 4372-4380. 61. Gaidzik, V. Prognostic implications of gene mutations in acute myeloid leukemia with normal karyotype / V. Gaidzik, K. Döhner // Semin Oncol. – 2008. – V. 35. –P. 346-355. 62. Gale, R.E. Relationship between FLT3 mutation status, biologic characteristics, and response to targeted therapy in acute promyelocytic leukemia / R.E. Gale, R. Hills, A.R. Pizzey et al. // Blood. – 2005. – V. 106. – P. 3768–776. 63. Gale, R.E. The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level, number, size, and interaction with NPM1 mutations in a large cohort of young adult patients with acute myeloid leukemia / R.E. Gale, C. Green, C. Allen et al. // Blood. – 2008. - V. 111. – P. 2776–2784. 64. Gallagher, R. Duelling mutations in normal karyotype AML / R. Gallagher // Blood. – 2005. – V. 106. – P. 3681-3682. 65. Gallo, A. Structure of nucleophosmin DNA-binding domain and analysis of its complex with a G-quadruplex sequence from the c-MYC promoter / A. Gallo, C. Lo Sterzo, M. Mori et al. // J Biol Chem. – 2012. - V. 287. – P. 26539-26548. 113 66. Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2014 update on diagnosis, risk-stratification, and management / G. Garcia-Manero // American Journal of Hematology. - 2014. - V. 89. - № 1. - P. 97-108. 67. Georgiou, G. Serial determination of FLT3 mutations in myelodysplastic syndrome patients at diagnosis, follow up or acute myeloid leukaemia transformation: Incidence and their prognostic significance / G. Georgiou, V. Karali, C. Zouvelou et al. // Br J Haematol. – 2006. – V. 134. – P. 302–306. 68. Giagounidis, A. Morphology, cytogenetics and classification of MDS / A. Giagounidis, D. Haase // Best Practice & Research Clinical Haematology. – 2013. – V. 26. – P. 337–353. 69. Giles, F.J. SU5416, a small molecule tyrosine kinase receptor inhibitor, has biologic activity in patients with refractory acute myeloid leukemia or myelodysplastic syndromes / F.J. Giles, A.T. Stopeck, L.R. Silverman et al // Blood. – 2003. – V. 102. – P. 795-801. 70. Gilliland, D.G. The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia / D.G. Gilliland, J.D. Griffin // Blood. – 2002. – V. 100. – P. 1532-1542. 71. Gocek, E. Differentiation therapy of acute myeloid leukemia / E. Gocek, E. Marcinkowska // Cancers. - 2011. - V. 3. - P. 2402-2420. 72. Gondek, L.P. Chromosomal lesions and uniparental disomy detected by SNP arrays in MDS, MDS/MPD, and MDS-derived AML / L.P. Gondek, R. Tiu, C.L. O’Keefe et al. // Blood. - 2008. - V. 111. - P. 1534-1542. 73. Gorczyca, W. Cytogenetics, FISH and molecular testing in hematologic malignancies / W. Gorczyca. – NY.: Informa, 2008. - 326 p. 74. Govedarovic, N. Frequency and prognostic impact of FLT3/ITD mutation in patients with acute myeloid leukaemia / N. Govedarovic, G. Marjanovic // J BUON. – 2011. – V. 16. - № 1. – P. 108-111. 75. Graubert, T.A. New molecular abnormalities and clonal architecture in AML: from reciprocal translocations to whole-genome sequencing / T.A. Graubert, A.M. Brunner, A.T. Fathi // Am Soc Clin Oncol Educ Book. - 2014. - P. 334340. 114 76. Greenberg, P.L. Molecular and genetic features of myelodysplastic syndromes / P.L. Greenberg // Int. Jnl. Lab. Hem. – 2012. – V. 34. – P.215–222. 77. Grimwade, D. National Cancer Research Institute Adult Leukaemia Working Group. Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Reasearch Council trial / D. Grimwade, R.K. Hills, A.V. Moorman et al. // Blood. - 2010. – V. 116. - № 3. – P. 354-365. 78. Grisendi, S. Nucleophosmin and cancer / S. Grisendi, C. Mecucci, B. Falini et al. // Cancer. – 2006. V. 6. – P. 493-505. 79. Grundler, R. FLT3-ITD and tyrosine kinase domain mutants induce 2 distinct phenotypes in a murine bone marrow transplantation model / R. Grundler, C. Miething, C. Thiede et al. // Blood. – 2005. - V. 105. - № 12. – P. 4792-4799. 80. Haferlach, C. The inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26) is frequently accompanied by alterations of the RUNX1, KRAS and NRAS and NF1 genes and mediates adverse prognosis both in MDS and in AML: a study in 39 cases of MDS or AML / C. Haferlach, U. Bacher, T. Haferlach et al. // Leukemia. – 2011. - № 25. – P. 874–877. 81. Hatzimichael, E. Gene mutations and molecularly targeted therapies in acute myeloid leukemia / E. Hatzimichael, G. Georgiou, L. Benetatos et al. // Am J Blood Res 2013;3(1):29-51 82. Hospital, M.A. Core-binding factor acute myeloid leukemia in first relapse: a retrospective study from the French AML Intergroup / M.A. Hospital, T. Prebet, S. Bertoli et al. // Blood. - 2014. - V. 124. - № 8. - P. 1312-1319. 83. Huang, L. Acute myeloid leukemia associated with variant t(8;21) detected by conventional and molecular studies / L. Huang, L.V. Abruzzo, J.R. Valbuena et al. // Am J Clin Pathol. - 2006. – V. 125. - № 2. – P. 267-72. 84. Ichikawa, M. A role for RUNX1 in hematopoiesis and myeloid leukemia / M. Ichikawa, A. Yoshimi, M. Nakagawa et al. // Int J Hematol. - 2013. – V. 97. – P. 726–734. 115 85. Illmer, T. Activation of the RAS pathway is predictive for a chemosensitive phenotype of acute myelogenous leukemia blasts / T. Illmer, C. Thiede, A. Fredersdorf et al. // Clin Cancer Res. – 2005. – V. 11. – P. 3217-3224. 86. Itzykson, R. Somatic mutations and epigenetic abnormalities in myelodysplastic syndromes / R. Itzykson, O. Kosmider, P. Fenaux // Best Practice & Research Clinical Haematology. - 2013. – V. 26. – P. 355–364. 87. Johnson, D.B. Molecular pathways: targeting NRAS in melanoma and acute myelogenous leukemia / D.B. Johnson, K.S. Smalley, J.A. Sosman // Clin Cancer Res. – 2014. - V. 20. - № 16ю - P. 4186-4192. 88. Jordan, C.T. Unique molecular and cellular features of acute myelogenous leukemia stem cells / C.T. Jordan // Leukemia. - 2002. – V. 16. – P. 559–562. 89. Juliusson, G. Age and acute myeloid leukemia: real world data on decision to treat and outcomes from the Swedish Acute Leukemia Registry / G. Juliusson, P. Antunovic, A. Derolf et al. // Blood. - 2009. - V. 113. - P. 4179-4187. 90. Juliusson, G. Most 70- to 79-year-old patients with acute myeloid leukemia do benefit from intensive treatment / G. Juliusson // Blood. 2011. – V. 117. - № 12. P. 3473-3474. 91. Kindler, T. Efficacy and safety of imatinib in adult patients with c-kit- positive acute myeloid leukemia / T. Kindler, F. Breitenbuecher, A. Marx et al. // Blood 2004. - V. 103. - P. 3644-3654. 92. Kiyoi, H. FLT3 in human hematologic malignancies / H. Kiyoi, T. Naoe // Leuk Lymphoma. - 2002. - V. 43. - P. 1541-1547. 93. Kiyoi, H. Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene mutations in acute myeloid leukemia / H. Kiyoi, T. Naoe, Y. Nakano et al. // Blood. - 1999. - V. 93. P. 3074-3080. 94. Koh, Y. Different clinical importance of FLT3 internal tandem duplications in AML according to FAB classification: possible existence of distinct leukemogenesis involving monocyte differentiation pathway / Y. Koh, J. Park, K.S. Ahn et al. // Ann Hematol. - 2009. - V. 88. - P. 1089–1097. 116 95. Komrokji, R.S. Deletion 5q MDS: Molecular and therapeutic implications / R.S. Komrokji, E. Padron, B.L. Ebert et al. // Best Practice & Research Clinical Haematology. - 2013. - V. 26. - P. 365–375. 96. Kottaridis, P.D. Flt3 mutations and leukaemia / P.D. Kottaridis, R.E. Gale, D.C. Linch // Br J Haematol. - 2003. - V. 122. - P. 523-538. 97. Kottaridis, P.D. The presence of a FLT3 internal tandem duplication in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic information to cytogenetic risk group and response to the first cycle of chemotherapy: analysis of 854 patients from the United Kingdom Medical Research Council AML 10 and 12 trials / P.D. Kottaridis, R.E. Gale, M.E. Frew et al. // Blood. - 2001. - V. 98. - P. 1752-1759. 98. Krauth, M-T. High number of additional genetic lesions in acute myeloid leukemia with t(8;21)/RUNX1-RUNX1T1: frequency and impact on clinical outcome / M-T. Krauth, C. Eder, T. Alpermann et al. // Leukemia. - 2014. - V. 28. - P. 1449–1458. 99. Krug, U. Complete remission and early death after intensive chemotherapy in patients aged 60 years or older with acute myeloid leukemia: a web-based application for prediction of outcomes / U. Krug, C. Rollig, A. Koschmieder et al. // Lancet. 2010. V. 376. - № 9757. - P. 2000–2008. 100. Kumar, C.C. Cytogenetic as an important tool for diagnosis / C.C. Kumar // Genes Cancer. - 2011. - V. 2. - № 2. - P. 95-107. 101. Levis M. FLT3 mutations in acute myeloid leukemia: what is the best approach in 2013 / M. Levis // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. -2013. V. 2013. - P. 220-226. 102. Ley, T.J. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome / T.J. Ley, E.R. Mardis, L. Ding et al. // Nature. - 2008. - V. 456. № 7218. - P. 66–72. 103. Ley, T.J. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia / T.J. Ley, L. Ding, M.J. Walter et al. // N Engl J Med. - 2010. - V. 363. - № 25. - P. 2424–2433. 104. Licht, J.D. Acute promyelocytic leukemia -weapons of mass differentiation / J.D. Licht // N Engl J Med. - 2009. – V. 360. - № 9. – P. 928–930. 117 105. Liersch, R. Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults – biological significance and clinical use / R. Liersch, C. Muller-Tidow, W.E. Berdel et al. // British Journal of Haematology. - 2014. - V. 165. - P. 17–38. 106. Liu, H. Structural basis for stem cell factor–KIT signaling and activation of class III receptor tyrosine kinases / H. Liu, X. Chen, P.J. Focia et al. // The EMBO Journal. - 2007. - V. 26. - P. 891–901. 107. Machado, L.E. The detection of KIT mutations in acute myeloid leukemia / L.E. Machado, J. R. Pinho, R. Sitnik et al. // Einstein. - 2012. - V. 10. - № 3. - P. 286291. 108. Medeiros, B.C. Prognostic impact of monosomal karyotype in young adult and elderly acute myeloid leukemia: the Southwest Oncology Group (SWOG) experience / B.C. Medeiros, M. Othus, M. Fang et al. // Blood. - 2010. - V. 116. - P. 2224–2228. 109. Menzin, J. The outcomes and costs of acute myeloid leukemia among the elderly / J. Menzin , K. Lang, C.C. Earle et al. // Arch Intern Med. - 2002. – V. 162. - № 14. – P. 1597-1603. 110. Meshinchi, S. Structural and functional Alterations of FLT3 in Acute Myeloid Leukemia / S. Meshinchi, F.R. Appelbaum // Clin Cancer Res. - 2009. - V. 15. № 13. - P. 4263–4269. 111. Mizuki, M. FLT3 mutations from patients with acute myeloid leukemia induce transformation of 32D cells mediated by the Ras and STAT5 pathways / M. Mizuki, R. Fenski, H. Halfter et al. // Blood. - 2000. - V. 96. - P. 3907-3914. 112. Mohamedali, A. Prevalence and prognostic significance of allelic imbalance by single nucleotide polymorphism analysis in low risk myelodysplastic syndromes / A. Mohamedali, J. Gaken, N.A. Twine et al. // Blood. - 2007. - V. 110. - P. 3365 – 3373. 113. Morrissette, J.J.D. Acute Myeloid Leukemia: Conventional cytogenetics, FISH, and moleculocentric methodologies / J.J.D. Morrissette, A. Bagg // Clin Lab Med. - 2011. – V. 31. – P. 659–686. 118 114. Mrozek, K. Advances in molecular genetics and treatment of core-binding factor acute myeloid leukemia / K. Mrozek, G. Marcuccia, P. Paschka et al. // Curr Opin Oncol. - 2008. – V. 20. - № 6. – P. 711–718. 115. Mrozek, K. Prognostic significance of the European LeukemiaNet standardized system for reporting cytogenetic and molecular alterations in adults with acute myeloid leukemia / K. Mrozek, G. Marcucci, D. Nicolet et al. // J Clin Oncol. 2012. - V. 30. - № 36. - P. 4515-4523. 116. Nakao, M. Internal tandem duplication of the FLT3 gene found in acute myeloid leukemia / M. Nakao, S. Yokota, T. Iwai et al. // Leukemia. - 1996. - V. 10. - P. 1911-1918. 117. Nasr, R. Eradication of acute promyelocytic leukemia-initiating cells through PML/RARA degradation / R. Nasr, M.C. Guillemin, O. Ferhi et al. // Nat Med. 2008. – V. 14. - № 12. – P. 1333–1342. 118. Natelson, E. A. Acquired Myelodysplasia or Myelodysplastic Syndrome: Clearing the Fog / E.A. Natelson, D. Pyatt // Advances in Hematology. - 2013. - 11 p. 119. Neubauer, A. Prognostic importance of mutations in the Ras protooncogenes in de novo acute myeloid leukemia / A. Neubauer, R.K. Dodge, S.L. George et al. // Blood. - 1994. -V. 83. - P. 1603-1611. 120. Paietta, E. Minimal residual disease in acute myeloid leukemia: coming of age / E. Paietta // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. - 2012. - V. 2012. - № 1 - P. 35-42. 121. Panagopoulos, I. NRAS mutations are rare in acute myeloid leukaemias with t(8;21) or inv(16) / I. Panagopoulos, P. Aman, B. Johansson et al. Eur J Haematol. -1996. - V. 56. - P. 68-71. 122. Panani, A.D. Cytogenetic aspects of adult primary myelodysplastic syndromes: Clinical implications / A.D. Panani, C. Roussos. // Cancer Letters/ - 2006. V. 235. - P. 177–190. 123. Park, S. Effects of somatic mutations are associated with SNP in the progression of individual acute myeloid leukemia patient: the two-hit theory explains 119 inherited predisposition to pathogenesis / S. Park, Y. Koh, S.S. Yoon // Genomics Inform. - 2013. – V. 11. - № 1. – P. 34-37. 124. Park, J.H. Managing acute promyelocytic leukemia without conventional chemotherapy: is it possible? / J.H. Park, M.S. Tallman // Expert Rev Hematol. - 2011. - V. 4. - № 4. – P. 427–436. 125. Paschka, P. Core binding factor acute myeloid leukemia / P. Paschka // Seminars in Oncology. - 2008. – V. 35. - № 4. – P. 410-417. 126. Paschka, P. Core-binding factor acute myeloid leukemia: can we improve on HiDAC consolidation? / P. Paschka, K. Dohner // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. - 2013. V. 2013. - P. 209-219. 127. Patel, J.P. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia / J.P. Patel, M. Gonen, M.E. Figueroa et al. // N Engl J Med. - 2012. V. 366. - P. 1079-1089. 128. Pemmaraju, N. Investigational FMS-like tyrosine kinase 3 inhibitors in treatment of acute myeloid leukemia / N. Pemmaraju, H. Kantarjian, M. Andreeff et al. // Expert Opin Investig Drugs. - 2014. - V. 23. № 7. - P. 943-954. 129. Port, M. Prognostic significance of FLT3 internal tandem duplication, nucleophosmin 1, and CEBPA gene mutations for acute myeloid leukemia patients with normal karyotype and younger than 60 years: a systematic review and meta-analysis / M. Port, M. Böttcher, F. Thol et al. // Ann Hematol. - 2014. - V. 93. - № 8. - P. 1279-86. 130. Pratcorona, M. Favorable outcome of patients with acute myeloid leukemia harboring a low-allelic burden FLT3-ITD mutation and concomitant NPM1 mutation: relevance to post-remission therapy / M. Pratcorona, S. Brunet, J. Nomdedeu et al. // Blood. - 2013. - V. 121. - № 14. - P. 2734-2738. 131. Pylayeva-Gupta, Y. RAS oncogenes: weaving a tumorigenic web / Y. Pylayeva-Gupta, E. Grabocka, D. Bar-Sagi // Nat Rev Cancer. - 2011. - V. 11. - P. 761–774. 132. Radich, J.P. NRAS mutations in adult de novo acute myelogenous leukemia: prevalence and clinical significance / J.P. Radich, K.J. Kopecky, C.L. Willman et al. // Blood. - 1990. - V. 76. - P. 801-807. 120 133. Ramalho, A.S. Molecular targets for therapeutic interventions in human papillomavirus-related cancers / A.S. Ramalho, A.D. Lopes, A. Talans et al. // Oncology Reports. - 2010. - V. 24. - P. 1419-1426. 134. Ramos-Echazabal, G. In silico studies of potential phosphoresidues in the human nucleophosmin/B23: its kinases and related biological processes / G. RamosEchazabal, G. Chinea, R. Garcıa-Fernandez et al. // J Cell Biochem. - 2012. - V. 113. P. 2364–2374. 135. Rao, A.V. Are results of targeted gene sequencing ready to be used for clinical decision making for patients with acute myelogenous leukemia? / A.V. Rao, B.D. Smith // Curr Hematol Malig Rep. - 2013. - V. 8. - № 2. - P. 149–155. 136. Rau, R. NPMc+ cooperates with FLT3-ITD mutations to cause acute leukemia recapitulating human disease / R. Rau, D. Magoon, S. Greenblatt et al. // Experimental Hematology. - 2014. -V. 42. - P. 101–113. 137. Reilly, J.T. Pathogenesis of acute myeloid leukaemia and inv(16)(p13;q22): a paradigm for understanding leukaemogenesis / J.T. Reilly // Br J Haematol. - 2005. – V. 128. - № 1. – P. 18-34. 138. Reineke, E. L. Aberrant association of promyelocytic leukemia proteinretinoic acid receptor with coactivators contributes to its ability to regulate gene expression / E. L. Reineke, H. Liu, M. Lam et al. // J. Biol. Chem. - 2007. – V. 282. – P. 18584-18596. 139. Renneville, A. Cooperating gene mutations in acute myeloid leukemia: a review of the literature / A. Renneville, C. Roumier, V. Biggio et al. // Leukemia. 2008. – V. 22. - P. 915–931. 140. Rhyasen, G. W. Deregulation of microRNAs in myelodysplastic syndrome / G.W. Rhyasen, D.T. Starczynowski // Leukemia. – 2011. – V. 26. - №. 1. – P. 13–22. 141. Riva, L. Genomics of acute myeloid leukemia: the next generation / L. Riva, L. Luzi, P.G. Pelicci // Front Oncol. - 2012. - V. 2. - № 40. - P.1-12. 142. Rocquain, J. Combined mutations of ASXL1, CBL, FLT3, IDH1, IDH2, JAK2, KRAS, NPM1, NRAS, RUNX1, TET2 and WT1 genes in myelodysplastic 121 syndromes and acute myeloid leukemias / J.Rocquain,N. Carbuccia, V. Trouplin // BMC Cancer. - 2010. – V. 10. - № 401. – P.1-7. 143. Rosnet, O. Expression and signal transduction of the FLT3 tyrosine kinase receptor / O. Rosnet, H.J. Buhring, O. de Lapeyriere et al. // Acta Haematol. – 1996. – V. 95. – P. 218-223. 144. Sanz, M.A. Management of acute promyelocytic leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet / M.A. Sanz, D. Grimwade, M.S. Tallman et al. // Blood. - 2009. – V. 113. - № 9. – P.1875– 1891. 145. Schanz, J. New Comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes (MDS) and oligoblastic acute myeloid leukemia after MDS derived from an international database merge / J. Schanz, H.Tuchler et al. // J. Clin. Oncol. – 2012. – V. 10. - № 30. – P. 820-829. 146. Schlenk, R. F. Gene mutations and response to treatment with alltrans retinoic acid in elderly patients with acute myeloid leukemia / R.F. Schlenk, K. Dohner, M. Kneba et al. // Haematologica. – 2009. –V. 94. – P. 54-60. 147. Schlenk, R.F. Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia / R.F.Schlenk, K.Dohner, J. Krauter et al. // New England Journal of Medicine. –2008. –V. 358. – P. 1909–1918. 148. Schnittger, S. Analysis of FLT3 length mutations in 1003 patients with acute myeloid leukemia: correlation to cytogenetics, FAB subtype, and prognosis in the AMLCG study and usefulness as a marker for the detection of minimal residual disease / S. Schnittger, C. Schoch, M. Dugas et al. // Blood. – 2002. – V. 100. – P. 59-66. 149. Schnittger, S. Nucleophosmin gene mutations are predictors of favorable prognosis in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype / S. Schnittger, C. Schoch, W.Kern et al. // Blood. – 2005. – V. 106. – P. 3733–3739. 150. Sekeres, M.A. Epidemiology, natural history, and practice patterns of patients with myelodysplastic syndromes in 2010 / M.A. Sekeres // J Natl Compr Canc Netw. - 2011. - V. 9. - P. 57-63. 122 151. Shen, Y. Gene mutation patterns and their prognostic impact in a cohort of 1185 patients with acute myeloid leukemia / Y.Shen, Y.M. Zhu, X. Fan et al. // Blood. 2011. – V. 18. - № 20. – P.5593-5603. 152. Shih, L.Y. Acquisition of FLT3 or N-ras mutations is frequently associated with progression of myelodysplastic syndrome to acute myeloid leukemia / L.Y. Shih, C.F. Huang, P.N. Wang // Leukemia. - 2004. - V. 18. - P. 466–475. 153. Small, D. FLT3 mutations: biology and treatment / D. Small // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. – 2006. – P. 178-84. 154. Speck, N.A. Core-binding factors in haematopoiesis and leukaemia / N.A. Speck, D.G. Gilliland // Nat Rev Cancer. - 2002. -V. 2. - P. 502–513. 155. Stephens, P.J. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development / P.J. Stephens, C.D.Greenman, B.Fu et al. // Cell. - 2011. – V. 144. – P.27–40. 156. Stirewalt, D.L. FLT3, RAS, and TP53 mutations in elderly patients with acute myeloid leukemia / D.L. Stirewalt // Blood. – 2001. – V. 97. – P. 3589-3595. 157. Stirewalt, D.L. Receptor tyrosine kinase alterations in AML / D.L.Stirewalt, S.Meshinchi // Biology and therapy Cancer Treat Res. - 2010. – V. 109. – P. 85-108. 158. Stirewalt, D.L. Size of FLT3 internal tandem duplication has prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia / D.L. Stirewalt, K.J. Kopecky, S.Meshinchi // Blood. - 2006. – V. 107. – P. 3724-3726. 159. Stirewalt, D.L. The role of FLT3 in haematopoietic malignancies / D.L.Stirewalt, J.P.Radich // Nat Rev Cancer. – 2003. – V. 3. - № 9. – P. 650-65. 160. Suzuki, T. Clinical characteristics and prognostic implications of NPM1 mutations in acute myeloid leukemia / T. Suzuki, H. Kiyoi, K. Ozeki et al. // Blood. – 2005. – V. 106. – P. 2854–2861. 161. Swords, R. Targeting the FMS-like tyrosine kinase 3 in acute myeloid leukemia / R. Swords, C. Freeman, F. Gile // Leukemia. – 2012. – V. 26. – P. 2176– 2185. 123 162. Takahashi, K. Dynamic acquisition of FLT3 or RAS alterations drive a subset of patients with lower risk MDS to secondary AML / K. Takahashi, E. Jabbour, X. Wang et al. //Leukemia. – 2013. – P. 1–3. 163. The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and Epigenomic Landscapes of Adult De Novo Acute Myeloid Leukemia. - N Engl J Med.- 2013. - V. 368. - № 22. – P. 2059–2074. 164. Thein, M. S. Outcome of older patients with acute myeloid leukemia: an analysis of SEER data over 3 decades / M.S. Thein, W.B. Ershler, A. Jemal et al. // Cancer. - 2013. - V. 119. - № 15. - P.2720-2727. 165. Thiede, C. Analysis of FLT3-activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis / C. Thiede, C. Steudel, B. Mohr et al. // Blood. – 2002. – V. 99. – P. 4326-4335. 166. Thiede, C. Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutations in 1485 adult patients with acute myeloid leukemia (AML) / C. Thiede, S. Koch, E.Creutzig et al. // Blood. – 2006. – V. 107. – P. 4011-4020. 167. Torrent, M. Analysis of the activating mutations within the activation loop of leukemia targets FLT3 and CKIT based on protein homology modeling / M. Torrent, K. Rickert, B.S. Pan et al. // J Mol Graph Model. – 2004. – V. 23. – № 2. – P. 153-65. 168. Udayakumar, A.M. Complex t(8;13;21)(q22;q14;q22) - a novel variant of t(8;21) in a patient with acute myeloid leukemia (AMLM2) / A.M. Udayakumar, S. Alkindi, A.V. Pathare et al.// Arch Med Res. - 2008. – V. 39. - № 2. – P.252-256. 169. Vardiman, J. The classification of MDS: from FAB to WHO and beyond / J. Vardiman // Leuk Res. - 2012. - V. 36. - № 12. - P.1453-1458. 170. Vardiman, J. W. The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms / J.W. Vardiman, N.L. Harris, R.D. Brunning // Blood. 2002. V. 100. - P. 2292–2302. 171. Vardiman, J. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important 124 changes / J. Vardiman, J. Thiele, D. Arber et al. // Blood. – 2009. – V. 114. - №5. – P. 937–951. 172. Verhaak, R.G.W. Mutations in nucleophosmin (NPM1) in acute myeloid leukemia (AML): association with other gene abnormalities and previously established gene expression signatures and their favorable prognostic significance / R.G.W. Verhaak, C.S. Goudswaard, W.van Putten et al. // Blood. – 2005. – V. 106. – P. 37473754. 173. Visconte, V. Molecular pathogenesis of myelodysplastic syndromes / V. Visconte, C. Selleri, J.P. Maciejewski et al. // Translational Medicine. - 2014. - V. 8. № 4. - P.19-30. 174. Walter, M.J. Next-generation sequencing of cancer genomes: back to the future / M.J. Walter, T.A. Graubert, J.F. Dipersio et al. // Per Med. - 2009. - V. 6. - № 6. - P.653-662. 175. Wang, Y. AML1-ETO and CKIT mutation overexpression in t(8;21) leukemia: Implication in stepwise leukemogenesis and response to Gleevec / Y. Wang, G. Zhou, T. Yin et al.// Proc Natl Acad Sci. – 2005. – V. 102. - № 4. – P. 1104-1109. 176. Wang, Y. CKIT mutation cooperates with full-length AML1-ETO to induce acute myeloid leukemia in mice / Y. Wang, L.J. Zhao, C.F. Wu et al. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2011. – V. 108. - № 6. – P. 2450-2455. 177. Yamamoto,Y. Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies / Y. Yamamoto, H. Kiyoi, Y. Nakano et al. // Blood. – 2001. - V. 97. -№ 8. -P. 2434-2439. 178. Yanada, M. Prognostic significance of FLT3 internal tandem duplication and tyrosine kinase domain mutations for acute myeloid leukemia: a meta-analysis / M. Yanada, K. Matsuo, T. Suzuki et al. // Leukemia. – 2005. – V. 19. – P. 1345-1349. 179. Yang, X. RAS mutation analysis in a large cohort of Chinese patients with acute myeloid leukemia / X. Yang, J. Qian, A. Sun et al. // Clin Biochem. – 2013. – V. 46. - №7-8. – P. 579-83. 125 180. Zaker, F. Detection of KIT and FLT3 Mutations in Acute Myeloid Leukemia with Different Subtypes / F. Zaker, M. Mohammadzadeh, M. Mohammadi. // Arch. Iran. Med. – 2010. – V. 13. – P. 21–25. 181. Zhang, W. Mutant FLT3: a direct target of sorafenib in acute myelogenous leukemia / W. Zhang, M. Konopleva, Y. Shi et al. // Natl Cancer Inst. – 2008. – V. 100. - P. 184-198. 182. Zwaan, C.M. FLT3 internal tandem duplication in 234 children with acute myeloid leukemia: prognostic significance and relation to cellular drug resistance / C.M. Zwaan, S. Meshinchi, J.P. Radich et al. // Blood. – 2003. – V. 102. - №7. – P. 23872394.