Medline - МойМио

N-ацетилцистеин улучшает состояние скелетных мышц у MDX мышей.
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенной и разрушительной формой
мышечной дистрофии, с частотой 1 на каждые 3500 новорожденных мальчиков. Она характеризуется
прогрессирующей дегенерацией мышц в результате текущих повреждений мышц и неполной регенерации. Это
вызывает глубокую мышечную слабость и таким образом люди часто оказываются в инвалидной коляске в
возрасте 10-12 лет и обычно умирают в результате дыхательной и / или сердечно-сосудистой недостаточности
примерно в 20 лет. МДД вызвана Х-хромосомной мутацией приводящей к отсутствию белка дистрофина в
мышцах (Hoffman и соавт. 1987). Дистрофин большой белок (427 кДа), который связывает цитоскелет с группой
мембраносвязанных белков, дистрофин-ассоциированного гликопротеинового (ДГК) комплекса. ДГК, в свою
очередь, связывается с внеклеточным матриксом и поэтому дистрофин составляет структурное звено между
цитоскелетом и внеклеточным матриксом. Мыши MDX также не имеют дистрофина и являются наиболее широко
используемой животной моделью МДД. Мышцы от мышей MDX проходят периоды мышечной дегенерации и
регенерации, которая является самой обширной в возрасте около 3-8 недель. Хотя они имеют более мягкий
фенотип, чем у пациентов с МДД, мыши MDX предоставили исследователям гораздо большее понимание
механизмов, которые вызывают дегенерацию мышц при МДД, и также играют ключевую роль в тестировании
потенциальных терапевтических стратегий (Khurana & Davies, 2003). В последние годы наша лаборатория была
сосредоточена на классе ионных каналов, известные как механочувствительные или активированные каналы
(ДЗО), которые как мы показали, способствуют повреждению мышц у мышей MDX (Енг и др. 2005;.. Уайтхед и
др. 2006a ). Это хорошо известно, что MDX мышцы более восприимчивы к повреждениям при растягивании эксцентричном сокращении мышц, чем обычно (Petrof соавт. 1993). Мы обнаружили, что поступление кальция
через ДЗО является важной причиной повреждения мышц, так как SAC блокаторы предотвращают рост
внутриклеточного Ca 2 + и значительно улучшить силу после сокращения в растянутых мышцах MDX (Енг и др..
2005). Совсем недавно мы также показали, что стрептомицин понижает проницаемость мембран и улучшает
мышечную силу у MDX мышей после сокращений, как в изолированных мышцах, так и в интактных мышцах у
мышей, подвергнутых упражнениям на беговой дорожке (Уайтхед и др.. 2006a). В скелетных мышцах, повышение
внутриклеточного Ca 2 + может увеличить производство активных форм кислорода (АФК) в митохондриях и
НАДФН-оксидазы (Martins и соавт. 2008). АФК, такие как гидроксильные радикалы, также приводит к
повышению проницаемости мембран в мышечных волокнах из-за повышенного внутриклеточного Ca2 +, скорее
всего, через перекисное окисление липидов (вой и Publicover, 1990). Поэтому, стрес-индуцированный Ca2 +
приток через ДЗО может усилить образование АФК, и увеличение проницаемости мембраны в мышцах MDX.
АФК постулируются в качестве возможной причины дистрофических повреждений мышц в течение ряда лет
(Rando, 2002;. Уайтхед и др. 2006b; Tidball & Велинг-Henricks, 2007). Работы, проведенные Rando и его коллегами
показали, что мышечные трубочки от MDX мышц гораздо более восприимчивы к индуцированной гибели клеток,
чем дикий тип мышц (Rando соавт. 1998). Эта группа также показала, что у 3-недельных мышей MDX, возраст,
когда нет явных признаков повреждения мышц, есть свидетельства окислительного стресса, как показали,
повышенное содержание продуктов окисления липидов и увеличение производства антиоксидантных ферментов
(Disatnik ET Ал. 1998). Это важное открытие предположило, что увеличение производства АФК было основной
особенностью дистрофических повреждений мышц. Другое АФК-опосредованное влияние на дистрофические
мышцы увеличивает окисление белков, как у мышей MDX (Hauser и соавт. 1995) и у пациентов с МДД (Хайкок
соавт. 1996), что может привести к широкому кругу вредного воздействия на сократительную функцию мышц
(Smith & Reid, 2006).Еще одно свидетельство в поддержку окислительного стресса как причины дистрофической
патофизиологии в исследованиях in vivo, в которых MDX мыши, получавшие антиоксиданты, полученные из
зеленого чая (Buetler соавт. 2002) или низкое содержание железа, что снижает гидроксильные радикалы (Борнман
др. . 1998), показали, уменьшение признаков повреждений мышц. Недавнее исследование также показало, что
синтетический аналог витамина Е, IRFI-042, который имеет сильные антиоксидантные свойства, улучшает MDX
мышечную функцию и уменьшает активацию фактора транскрипции ядерного фактора kB (NF-kB), который
может активировать АФК (Мессина и соавт. 2006). NF-kB регулирует транскрипцию множества генов, но особое
значение в дистрофических мышцах провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-α (Hodgetts соавт. 2006) и
матриксные металлопротеиназы (Hnia соавт. 2007), которые, как было показано вносят свой вклад в повреждение
мышц. Кроме того Kumar & Boriek (2003) показали, что циклическое, пассивное растяжение диафрагмы MDX
усиливает активацию NF-Кб, которая была ослаблена антиоксидантом N-ацетилцистеином (АЦ).В данной работе
мы используем АЦ для изучения влияния АФК на повреждение мышц у MDX мышей. АЦ был выбран потому, что
является эффективным антиоксидантом в скелетных мышцах. В изолированных препаратах мышц он защищает от
сокращене-индуцированного окислительного стресса (Sandstrom соавт. 2006) и снижает усталость мышц (Smith &
Reid, 2006). Кроме того, после перорального введения АЦ, как было показано, он ингибирует NF-kB активацию в
ненагруженных мышцах мышей (Farid соавт. 2005) и задерживает усталость мышц у человека (McKenna и соавт.
2006). Здесь мы использовали два экспериментальных подхода: (1) растянутых сокращений изолированных MDX
мышц с или без АЦ и (2) молодых мышей MDX, получавших перорально АЦ в течение 6 недель. В частности, мы
протестировали три основные гипотезы с помощью этих экспериментов. (1) Есть ли у АФК способствовать
снижать силу мышц и повышать проницаемость мембран после сокращения в растянутых изолированных
мышцах MDX? (2) Может ли АЦ снижать внутриклеточный уровень АФК и обеспечивает защиту от
повреждения мышц MDX в естественных условиях? (3) Может ли лечение АЦ снижать NF-kB активацию и
регулировать экспрессию ключевых белков сарколеммы, ассоциированных с комплексом дистрофина?
Методика
Животные
Особи мужского пола MDX и дикого типа (C57 BL/10 ScSn) мышей в 3 или 8-недельном возрасте были
поставлены Центром,, WA, Австралия. Эксперименты были одобрены Комитетом по использованию животных
из Университета Сиднея.
Эксперименты на изолированных мышцах.
Мыши были убиты подкожной инъекцией пентобарбитала натрия (163 мг кг-1). Мышцы разгибателя пальцев
(EDL) иссекают в возрасте 8 - 10 недель. Алюминиевые клипы были прикреплены к сухожилиям на обоих
концах мышц. Мышцу помещали в камеру из плексигласа и клипы были расположены на металлических крючках,
которые были прикреплены к датчику силы и рычагу двигателя (модель 300B-LC, Аврора Научно Инк, Онтарио,
Канада ). Два платиновых электрода расположили параллельно мышцам при условии стимуляции. Мышцы
перфузировали стандартным раствором, содержащим (мм): NaCl (121), KCl (5), CaCl2 (1,8), MgCl 2 (0,5), NaH2PO4
(0,4), NaHCO3 (24) и глюкозу (5,5). Раствор постоянно продувают 95% O2 и 5% CO2 (рН 7,4). Эксперименты
проводились при комнатной температуре (~ 22 ° C) и 35 ° С, как описано ниже.
Сокращения изолированных мышц.
В этих экспериментах, мышцы подвергали перфузии с любым стандартным контрольным раствором или
стандартным раствором, содержащим 20 мм N-ацетилцистеина (АЦ). Эта концентрация АЦ, как ранее было
показано, мало влияет на изометрическую силу, возникающую в скелетных мышцах (Khawli & Reid, 1994).
Первоначально, мышца была стимулирована два или три раза при 120 Гц, чтобы определить супрамаксимальное
напряжение, а затем отдыхали в течение 30 мин при комнатной температуре. Отношение длины натяжения к
максимальному спазму было определено путем стимулирования мышц (120 Гц, 300 мс) с 60-секундными
интервалами. Мышцы затем установили на ее оптимальную длину (Lo). В это время, 0,02% (вес / объем) синий
краситель Эванса (СКЭ) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) добавляли к перфузату, с или без АЦ, до
конца эксперимента. СКЭ представляет собой мембранно-проницаемый флуоресцентный краситель, и это широко
используемый маркер мембранных сбоев в скелетных мышцах (Hamer и соавт. 2002). Единичное тетаническое
сокращение проводили через 30 мин после измерения напряжения, для того, чтобы подтвердить, что подготовка
была стабильной. Температура камеры затем повышалась до 35 ° С. Это было достигнуто путем нагревания
раствора на водяной бане, и направляя его через специально разработанный алюминиевый теплообменник, что
обеспечило постоянную температуру в камере. Через 1 мин при 35 ° С мышцы подвергали трем растяжениям через
30 сек друг от друга. Каждое сокращение составляет 300 мс спазмов от Lo + 30%, с 150 мс после начала
стимуляции и в течение 100 мс (скорость растяжения, 3 × Lo S-1). Через 60 минут после того как провели
растяжение, длину натяжения снова измеряли и определяли максимальную изометрическую силу. Мышца была
заморожена в изопентане охлажденном в жидком азоте, и хранили при -80 ° С. Замороженные EDL сечения (10
мкм) помещали на L-лизин покрытых слайдах, фиксировали в ледяном метаноле (-22 ° С) в течение 5 мин, а затем
сушили на воздухе при комнатной температуре (~ 22-25 ° С) . Для количественной оценки поглощение СКЭ в
мышечных волокнах, секции рассматривались под флуоресцентным микроскопом (Zeiss Axioplan 2), при
диапазоне 545/30 нм и 570 нм
нижних частот. Цифровые изображения были захвачены ПЗС-камерой,
прикрепленой к микроскопу (Zeiss AxioCam HRM). Все разделы были обследованы с использованием идентичных
оптических параметров. СКЭ положительные мышечные волокна с интенсивностью флуоресценции, которая
превысила заданный порог, были включены в анализ. Площадь СКЭ положительных волокон рассчитывали как
процент от всей площади поперечного сечения мышцы. Для экспериментов в естественных условиях MDX мыши
в возрасте 3 недель были разделены на две группы контрольных мышей, получавших обычную питьевую воду
(кон) и обработанных мышей, получающих питьевую воду, содержащую 1% (~ 60 мм) N-ацетилцистеин (АЦ)
(Farid др. Ал. 2005). После 6 недель лечения (9 недель) мышей забивали, и EDL и передняя большеберцовая (TA)
мышцы были удалены. EDL мышцы были установлены в Tissue-Tek и замораживали в изопентане охлаждаенной в
жидком азоте. TA мышцы быстро замораживали в жидком азоте.
Иммуноокрашивание и обнаружение центральных ядер.
EDL сечения (10 мкм) с контрольной группы и получавшей АЦ MDX мышей и подобранных по возрасту мышей
дикого типа были использованы как для иммунного окрашивания дистрофина, и визуализации центральных ядер.
Подробности процедуры были описаны ранее (Yeung соавт. 2005). Во-первых, поперечные сечения инкубировали
с AffiniPure Fab и Fc-фрагментами (Jackson ImmunoResearch лаборатории, West Grove, PA, США) в концентрации
60 мкг л в 2% БСА в течение 30 мин, затем промывали в фосфатно-солевом
буфере (ФСБ ), а затем блокировали в 2% БСА в течение 15 мин. Ранее нами было показано, что эта процедура
предотвращает неспецифическое связывание антимышиными вторичными антителами к эндогенным
иммуноглобулинам мыши в срезе ткани. В качестве первичных антител были использованы мышиные
моноклональные антитела против: кавеолина-3, разбавленного 1: 50 (BD Transduction Laboratories, США), βдистрогликана, разбавленного 1: 20 (NCL-би-DG, Novocastra лаборатории, Ньюкасл, Великобритания) и атрофина,
разбавленого 1: 20 (NCL-Drp2, Novocastra Laboratories). Вторичные антитела были козьими антимышиными
конъюгированными с Су3 антителами, разбавленными 1: 200 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Для
обнаружения ядер вторичные антитела содержали флуоресцентный окрашивающий ядра 4 ',6-диамидино-2фенилиндол (DAPI, Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, США), который был разбавлен 1: 100. Флуоресцентные
изображения поперечных сечений были приняты с 5 × или 20 × (Zeiss плана Neola), и количество мышечных
волокон с центральными ядрами рассчитывали как процент от общего количества волокон с видимыми ядрами
(т.е. оба центральных и периферических).
Окрашивание дигидроетидиумом на АФК.
Дигидроетидиум (ДГЭ) является широко используемым показателем продукции АФК как в пробирке (Benov
соавт. 1998), так и в естественных условиях (Robinson и соавт. 2006). Он окисляется АФК, в частности
супероксидом (О2-), образуя бромид этидия, который флуоресцирует красным (Benov соавт. 1998). Поэтому
интенсивность флуоресценции в ядрах клеток является мерой продукции АФК. АФК измеряли путем инкубации
EDL сечений с 5 мкм ДГЭ в PBS при 37 ° С в течение 30 мин. ДГЭ интенсивность оценивали путем подсчета
количества пикселей превышающий заданный порог, который был создан с целью устранения помех от любой
фоновой флуоресценции.
Вестерн-блоттинг.
Замороженные мышцы TA лизировались Polytron PT 1200 гомогенизатором (Kinematica, Littau / Люцерн,
Швейцария) с использованием ледяного буфера для лизиса либо общего лизата или ядерной фракции. Для полного
лизата мышцы лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мм NaCl, 25 мМ ЭДТА, 25 мм EGTA,
1% Тритон Х-100, ингибитора протеазы, калпаин, ингибитора фосфатазы (Sigma) . Через 30 мин инкубации
гомогенаты центрифугировали при 15 800 g в течение 30 мин при 4 ° С, и супернатант удаляли. Для ядерных
фракций два буфера были использованы. Во-первых, мышцы лизировали в буфере, содержащем 10 мМ Hepes, 1,5
мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 0,5 мМ DTT, 0,05% NP40, протеазы, калпаина 1 и фосфатазного ингибитора. Мышечные
лизаты хранили на льду в течение 10 мин и затем центрифугировали при 800g в течение 10 мин при 4 ° C.
Надосадочную жидкость удаляли, а осадок, содержащий ядерные белки, затем ресуспендировали в буфер,
используемый для общего лизата. Через 30 мин гомогенаты центрифугировали при 15 800 g в течение 30 мин при
4 ° С и супернатант удаляли. Концентрацию белка в надосадочной жидкости определяли с помощью анализа
Брэдфорда (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).В общей сложности 20 мкг белка на лунку загружали в 4% (укладки) 12% (решить) полиакриламидном геле. Белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и переносили на
нитроцеллюлозную мембрану с использованием мини Транс-блот передачи (Bio-Rad). Мембраны блокировали в
течение 30 мин при 5% обезжиренного сухого молока в PBS-Tween 20 при комнатной температуре. Для полного
лизата мембраны инкубировали с первичными антителами против кавеолина-3, разводили 1: 1000 в блокирующем
буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. Ядерные фракции инкубировали с первичными антителами к
NF-kB (p65 фосфо S276, Abcam, Cambridge, UK), разбавленными 1: 500 в блокирующем буфере в течение ночи
при 4 ° С. После промывки PBS-T, мембраны были инкубированы в течение 1 ч при комнатной температуре с
HRP-конъюгированными анти-мышинными (для кавеолином-3) или анти-кроличьими (для NF-kB) вторичными
антителами (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) в разведении 1: 1000. Мышиные моноклональные βактиновые антитела (Sigma) использовали в качестве контроля для обеспечения равной нагрузки.
Статистика
Все данные представлены как среднее значение ± S.E.M. Значительная разница между группами была определена
с использованием критерия Стьюдента для непарных данных или двухфакторного дисперсионного анализа.
Уровень значимости был установлен на уровне р <0,05.
Результаты
MDX мышцы обработанные АЦ улучшают силу после сокращения.
Сокращения проводили при 35 ° С, а не при комнатной температуре, так как АФК в изолированных скелетных
мышцах, как известно, значительно возрастет в этом диапазоне температур (Arbogast и Reid, 2004). В
предварительных экспериментах, мы обнаружили, что снижение силы мышц MDX от трех растянутых
сокращений при 35 ° С было сопоставимо (~ 35%). Поэтому мы решили использовать три сокращения в
нынешней серии экспериментов. Как показано на рис. 1А, сила сокращения вызванного растяжением было
значительно больше в MDX мышцах, чем дикий тип. Через 60 мин после сокращения (фиг. 1В), среднее усилие
было 35 ± 3% для мышц MDX контроля (n = 9), который был значительно меньше, чем у MDX мышц с АЦ, где
величина составила 51 ± 2% (Р <0,001, п = 11). Дикий тип мышц имел среднюю силу 69 ± 4% (n = 4), значительно
больше, чем оба MDX (Р <0,001). Для того, чтобы установить, что АЦ-индуцированная защита от стрессиндуцированной потери силы была присуща MDX мышцам, мы также провели несколько экспериментов с АЦ у
дикого типа мышц. АЦ не оказал существенного влияния на снижение силы мышей дикого типа (72 ± 1%, N = 6).
АЦ предотвращает поглощение СКЭ в MDX мышцах после сокращения.
Поступление в мышечные волокна СКЭ было использовано для оценки повышенной проницаемости мембраны у
MDX и дикого типа мышц после сокращения. EDL мышцы были заморожены через 60 мин после растяжения, и
сечений, взятые из середины мышцы живота, были использованы для количественного анализа СКЭ. На рис. 2А,
сечения показывают, что MDX контрольные мышцы имели значительно больше СКЭ-положительных волокон,
чем дикий тип, в то время АЦ предотвращает увеличение поглощения красителя в MDX мышцах. Когда данные
были собраны (фиг.2В), мышцы MDX контроля имели 8,6 ± 1,8% (N = 8) СКЭ положительных волокон по
сравнению с 1,8 ± 0,7% дикого типа мышц (п = 5, P <0,05) и до 2,6 ± 0,8% для MDX мышц АЦ (N = 7, р <0,05). Эти
данные предполагают, что АФК способствуют наиболее повышенной проницаемости участка мембраны в MDX
мышц при 35 ° С.
Лечение АЦ снижает содержание центральных ядер у MDX мышей
Регенерацию мышечных волокон после периода некроза можно количественно определить по наличию
центральных ядер в сечениях мышц. В этих экспериментах MDX мышей обрабатывали 1% АЦ в питьевой воде от
3 до 9 недель- в период наиболее обширного повреждения и регенерации. В сечении мышц от MDX мышей в
возрасте 9 недель было большое количество волокон, содержащих центральные ядра, и заметно меньше в MDX
мышцах мышей, получавших АЦ (фиг.3А). Среднее число волокон с центральными ядрами составляло 70 ± 3%
для MDX мышц контроля (N = 6), и было значительно сокращено до 46 ± 3% в
MDX получавших АЦ (N = 6, р <0,001, рис. 3В). Учитывая, что дикий тип мышц не имел центральных ядер (рис.
3), этот результат показывает, что в мышцах MDX мышей, получавших АЦ, было примерно на одну треть меньше
поврежденных волокон, чем у MDX мышей контроля.
Лечение АЦ защищает от потери сил при сокращениях.
В эксперементах на изолированных мышцах (как описано ранее) АЦ обеспечивает защиту против снижения
силы MDX мышц. Таким образом, мы хотели исследовать в естественных условиях, может ли лечение АЦ у
мышей MDX также защищать от стресс-индуцированного повреждения. Первую серию экспериментов проводили
при комнатной температуре. EDL мышцы изолированные от мышей всех групп прошли серию из четырех
сокращений с измерением мышечной силы через 60 мин. В это время средняя сила для контрольных MDX
мышц составила 53 ± 2% от первоначального значения (п = 6), в то время как мышцы от мышей, получавших
лечение АЦ, имели значительно большую силу 60 ± 1% (п = 4, р <0,05 ). Во второй серии экспериментов при 35 °
С, силы достоверно не различалась между контролем и леченными MDX мышами (данные не показаны). Эти
результаты показывают, что концентрация АЦ в мышцах мышей была достаточной для защиты от
индуцированных АФК при комнатной температуре, но не при 35 ° С, где АФК намного больше (см. обсуждение).
АЦ предотвращает чрезмерную продукцию АФК в мышцах мышей MDX.
Для того, чтобы проверить, является ли лечение АЦ фактором снижения уровня АФК в мышцах MDX, мы
использовали АФК-чувствительный краситель - ДГЕ. EDL сечения инкубировали с 5 мкм ДГЕ при 37 ° С, и
измеряли интенсивность флуоресценции выше указанного порога. Как показано на рис. 4А, MDX мышцы
контроля имели гораздо более широкое распространение и интенсивное окрашивание ядер, чем любые леченные
MDX или контроль дикого типа мышц. Также может быть видно, что самое яркое окрашивание в контрольных
мышцах MDX происходит в плотно упакованных областях, которые будут соответствовать проникновению
воспалительных клеток, так как эти клетки могут производить значительное количество АФК (Nguyen & Tidball,
2003). Как показано на рис. 4B, площадь окрашивания в MDX мышцах 24,3 ± 4,4% (N = 9), которая значительно
меньше (Р <0,05) в леченных MDX мышцах (7,5 ± 4,4%, п = 6, P <0,05) и контроле дикого типа (3,8 ± 1,4%, п = 5,
р <0,01).
Лечение АЦ снижает ядерную экспрессию NF-kB белка у MDX мышей.
NF-kB обычно находится в цитозоле, но при активации определенных стимулов, в том числе АФК,
транслоцируется в ядро и связывается с ДНК для регуляции экспрессии генов. Поэтому нам было интересно
посмотреть, если АЦ может снизить активацию NF-kB в мышцах MDX. В этих экспериментах мы использовали
Вестерн-блоттинг для количественной оценки ядерной транслокации NF-субъединицы белка p65. Как показано на
рис. 5A, p65 уровни были значительно больше для мышц MDX контроля, чем для дикого типа, тогда как АЦ
значительно
снижал
экспрессию
белка
в
MDX
мышцах.
Лечение АЦ снижает кавеолин-3 и увеличивает содержание β-дистрогликана и атрофина в сарколемме у MDX
мышей.
В этих экспериментах, мы хотели определить, какие вещества были вовлечены в регуляцию экспрессии
дистрофина-ассоциированных белков. Вестерн-блоттинг показал, что кавеолин-3 у MDX мышей были примерно
вдвое больше, чем у дикого типа, и лечение вело к снижению его уровня у мышей MDX (фиг.5В). Когда
объединенные данные были нормированы на показатели дикого типа, MDX мышцы контроля были 1,9 ± 0,2 раз
больше (N = 6), и это значение было значительно сокращено путем обработки АЦ до 1,3 ± 0,2 (р <0,05, N = 5). EDL
сечение от дикого типа, MDX контроля и MDX АЦ-обработанных мышей подвергали иммунному окрашиванию с
антителами к кавеолину-3, β-дистрогликану и атрофину. Что подтвердило результаты вестерн-блоттинга,
мышечные секции АЦ-обработанных мышей MDX показали менее интенсивное окрашивание к кавеолину-3 по
сравнению с MDX контроля (см. рис. 3А). Мы также обнаружили, что сарколемное окрашивание β-дистрогликана
и атрофина было увеличено для леченных мышц по сравнению с контрольными мышами MDX (рис. 6). Как и
ожидалось, окрашивания атрофина было незначительным у дикого типа мышц.
Обсуждение.
Существует немало свидетельств окислительного повреждения дистрофических мышц, а также положительное
влияние антиоксидантов (Мессина и др. 2006;. Hnia и др. 2007 год.). Дистрофин-дефицитные клетки более
чувствительны к АФК-индуцированному повреждению (Rando соавт. 1998) и есть свидетельства регуляции
эндогенных антиоксидантных систем обороны, приводящей к повышенной продукции АФК (Tidball & ВелингHenricks, 2007). В текущем исследовании, мы использовали антиоксидант АЦ для получения новых данных,
которые увеличили понимание роли АФК в остром повреждении мышц, вызванным сокращениями при
растяжении, и в рамках текущего дегенеративного процесса, который происходит естественно в мышцах
интактных мышей MDX. Мы также обнаружили, что АФК играют важную роль в регуляции дистрофинассоциированных белков, которая может быть отменена путем обработки АЦ. Наша интерпретация этих
результатов представлена на рис. 7. Данные, представленные в этой статье соответствуют недавним результатам
нашей лаборатории, в которой АЦ применялся для улучшения функции левого желудочка и мышцы, уменьшал
признаки поражения сердца и дегенерации у мышей MDX (Williams & Allen, 2007).
АЦ предотвращает стресс-индуцированную проницаемость мембран в мышцах MDX
Это широко распространенное мнение, что поверхностная мембрана дистрофических мышц более хрупкая, чем у
нормальных мышц, что тем самым делает ее более восприимчивой к микро повреждениям во время мышечного
сокращения, особенно при сокращениях после растяжений (Moens и др. 1993;. Petrof соавт. 1993). Тем не менее,
мы недавно сообщили, что большую часть повышенной проницаемости мембраны после сокращений мышц
MDX при комнатной температуре можно предотвратить путем применения стрептомицин SAC блокаторов и
GsMTx4 (Whitehead и соавт. 2006a). Учитывая, что эти препараты также предотвращают стресс-индуцированный
рост внутриклеточного Ca 2 + в MDX волокнах (Енг и др.. 2005), мы предположили, что пути Ca 2 +-зависимых
повреждений были наиболее вероятной причиной повышенной проницаемости мембраны. В текущем
исследовании, результаты экспериментов на изолированной мышце
показывают, что АЦ препятствует повышенной проницаемости мембран, связанной с сокращениями в растянутых
мышцах MDX при 35 ° С. Таким образом, это дает дополнительные свидетельства, показывающие, что
индуцированное увеличение проницаемости мембраны в мышцах MDX не является первичным следствием
механической травмы, а скорее возникает из-за эффектов АФК и / или Ca2 + притока через УКД (Whitehead и
соавт. 2006a). Хотя число СКЭ положительных волокон в данном исследовании является относительно небольшим
по сравнению с большим дефицитом силы, они являются надежными показателями повреждения. СКЭ
поглощение отражает значительное увеличение проницаемости мембраны от небольшой популяции серьезно
поврежденных, пренекротических волокон (Хамер и др., 2002;.. Уайтхед и др. 2006a), тогда как большинство
волокон может исключить СКЭ и остаются возбудимыми, но все еще повреждены и имеют большой дефицит
силы (Енг и др.. 2005).
АФК вклад в стресс-индуцированную силу сокращения мышц у MDX.
Отличительной особенностью повреждений, связанных с растянутыми нормальносокращающимися мышцами,
является сохранение снижения силы в течение нескольких дней (Morgan & Allen, 1999). Как и ожидалось,
снижение силы было значительно больше для MDX мышц по сравнению с диким типом (Moens и др. 1993;.
Уайтхед и др. 2006a.). Важно отметить, что АЦ обеспечивал значительную защиту силы сокращения мышц у
MDX, но не у дикого типа. Это говорит о том, что чрезмерная продукця АФК и окислительное повреждение при
сокращениях не является неотъемлемой чертой нормальных скелетных мышц, а скорее аномалия, связанная с
дистрофическими мышцами. Пока неясно, как увеличение АФК вызвало снижение мышечной силы в наших
экспериментах, но хорошо известно, что АФК могут окислять сократительные белки и белки возбуждениясокращения (ЕС) в скелетных мышцах, что окислительно-восстановительный баланс влияет на способность мышц
вырабатывать силу (Reid, 2001 ). Кроме того, увеличение АФК опосредованной проницаемости мембран может
также вносить вклад в потерю силы у MDX мышц через приток Na +, который может вызвать деполяризацию
мембраны и уменьшить возбудимость мышечных волокон.
Лечение АЦ уменьшает повреждения мышц MDX в естественных условиях.
После 6 недель орального приема АЦ, мышцы у мышей MDX показали заметное снижение повреждений. Наличие
центральных ядер в мышечных волокнах является хорошо установленным показателем регенерации после
повреждения мышцы (McGeachie соавт. 1993). Лечение АЦ значительно сократил количество мышечных волокон
MDX с центральными ядрами, подразумевая, что прогрессирование повреждения мышц было замедлено. Уровни
АФК существенно возросли в MDX мышцах и значительно ослаблялись лечением (см. рис. 4). Это говорит о том,
что повышение окислительного повреждения является важным фактором в течение этого длительного периода (39 недельного возраста) мышечной дистрофии у MDX мышей. ДГЕ окрашенные срезы мышц мышей MDX также
показали области
плотно упакованых, интенсивно окрашенных клеток, которые, возможно, являются
воспалительными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы. Эти клетки, как известно, производят
существенные концентрации АФК при участии НАДФ оксидазы, которые могут вызвать лизис мышечных клеток
в воспалительных каскадах (Nguyen & Tidball, 2003). Таким образом, воспалительные клетки могут обеспечить
дополнительный источник АФК в мышцах MDX, который усугубляет уже существующие повреждения,
вызванные внутриклеточными АФК-опосредованными путями.
АЦ лечение ингибирует экспрессию NF-kB у MDX мышей.
NF-kB активации обусловлено различных клеточных стимулов, в том числе АФК. При активации NF-kB
транслоцируется в ядро и регулирует транскрипцию многих генов (Kumar и соавт. 2004). NF-kB связывания ДНК
было показано, что возросла во много раз в мышцах от пациентов с МДД (Monici соавт. 2003) и MDX мышей
(Мессина и соавт. 2006), даже в молодом возрасте (15 дней), задолго до начала измеримых повреждения мышц
(Kumar & Boriek, 2003). Это согласуется с увеличением окислительного стресса в мышцах молодых MDX (Disatnik
соавт. 1998) и, следовательно, АФК-индуцированная активация NF-kB, вероятно, будет фактором,
способствующим обширной волне повреждения мышц, которая следует этому период покоя. Среди генов,
регулируемых NF-kB, ряд, как было показано, участвуют в дистрофическом процессе заболевания, включая
провоспалительные цитокины, таких как ФНО-(Основание и Torrisi, 2004;. Hodgetts и др., 2006), и матриксные
металлопротеиназы, которые вызывают расщепления β-дистрогликана (Hnia соавт. 2007). Наши результаты
показывают, что лечение АЦ значительно снижает экспрессию ядерного NF-p65 белка, что показывает, что АФК
являются важным медиатором NF-kB активации и транслокации в ядро. Наши результаты также согласуются с
недавними работами, которые показывают, что NF-kB ДНК связывающая активность значительно снижается у
MDX мышей, получавших лечение антиоксидантом (Мессина и др. 2006;.. Hnia и др. 2007, Фарид и др. 2005 ).
Лечение АЦ регулирует экспрессию дистрофин-ассоциированных белков, в то время как большинство белков
комплекса регулируются по принципу отрицательной связи кавеолином-3, что представляет собой заметное
исключение, с уровнем приблизительно в 2 - 3 раза выше у MDX (Vaghy и др. 1998 год, Repetto и соавт. 1999). В
наших экспериментах вестерн-блоттинг показал, что экспрессия кавеолина-3 снизилась при лечении АЦ у MDX
мышей, и это сопровождалось повышенной экспрессией β-дистрогликана и гомолога дистрофина, атрофина на
сарколемме (рис. 6). Это говорит о том, что АФК-опосредованные пути способствуют нарушению регуляции этих
белков в MDX мышцах. Мы предполагаем, что кавеолин-3 может играть важную роль в регулировании этой
реконструкции комплекса ДАГ в дистрофических мышцах. Трансгенная сверхэкспрессия кавеолина-3 у мышей
приводит к понижающей регуляции β-дистрогликана и дистрофина, и производит МДД-подобные мышечные
заболевания (Galbiati соавт. 2000). Кроме того кавеолин-3 конкурирует с дистрофином и атрофином за тот же сайт
связывания (С-концевой хвост) у β-дистрогликана (Sotgia соавт. 2000),
предполагая, что нормальный баланс между кавеолином-3 и дистрофином / атрофином необходим для
предотвращения дегенерации мышц. Фосфорилирование тирозина в β-дистрогликане ингибирует связывание
дистрофина и атрофина, и не влияет на связывание кавеолина-3 (Илсли соавт. 2002). Это фосфорилирование
тирозина опосредовано киназой, первоначально, также приводит к интернализации β-дистрогликана из мембраны
во внутриклеточные везикулы (Sotgia соавт. 2003). Таким образом, учитывая, что SRC киназу активирует АФК
(Chen и соавт. 2005), мы предполагаем, что АЦ ингибирует индуцированную первоначально активацию киназы,
что повышает экспрессию β-дистрогликана на мембране и связывание его с атрофином (см. рис. 7 ). Это очень
важное открытие, так как избыточная экспрессия трансгенного атрофина может предотвратить дистрофию также
как дистрофин (Khurana & Davies, 2003). Одним из следствий является то, что эффективность фармакологических
агентов, созданных для активации эндогенного атрофина, может быть повышена за счет антиоксидантного
лечения.
Возможные источники повышенной продукции АФК в растянутых мышцах MDX.
Учитывая повышенное окислительное повреждение мышц MDX важно выяснение источника(ов) избыточной
продукции АФК, особенно после сокращений. Два наиболее вероятных кандидата: митохондрии и НАДФНоксидаза. Известно, что перегрузка митохондриальным Ca2 + 2 может ускорить образование АФК в мышцах
(Brookes соавт. 2004), возможно, через увеличенную кальций-зависимую активность фосфолипазы. Это, казалось
бы, вероятным источником АФК в дистрофических мышцах, учитывая, что внутриклеточный Ca2 + повышается в
MDX волокнах после сокращений (Енг и др.. 2005) и усвоения митохондриального кальция больше в MDX
миотубы, чем у дикого типа (Роберт и др. . 2001). Тем не менее, было показано, что активация NF-kB при
циклических растяжениях в мышцах диафрагмы MDX можно предотвратить путем введения АЦ, но не SAC
блокатора гадолиния (Kumar & Boriek, 2003). Таким образом, казалось бы, что в этих условиях, стрессиндуцированное увеличение АФК происходит независимо от притока Ca 2 + через ДЗО и последующей
митохондриальной Ca2 + перегрузки. НАДФ Н оксидаза способствует увеличению продукции АФК после
осмотического набухания в MDX миоцитах (Юнг и др.. 2008) и активируется как Ca 2 +-зависимые и независимые
пути в осмотически растянутых скелетных мышцах (Martins и соавт. 2008). Таким образом, НАДФН-оксидаза
является вероятным источником стресс-индуцированной продукции АФК в мышцах MDX.
Антиоксиданты как потенциальный терапевтический подход для МДД.
Клинические испытания антиоксидантов у пациентов с МДД предприняты два десятилетия назад разочаровывали
исследователей (Rando, 2002). Однако существует ряд факторов, которые могли бы объяснить отрицательный
результат. Во-первых, эти исследования начались на продвинутой стадии заболевания, когда значительная потеря
мышечных волокон уже произошла. Антиоксиданты, как можно было бы ожидать, могли уменьшить или
предотвратить повреждение мышц и вырождение, но не заменить потерянные волокна. Во-вторых,
антиоксиданты, используемые в этих исследованиях (СОД, витамин Е и селен) не проникали через мембранну и
были бы неэффективны для внутриклеточных АФК. АЦ, с другой стороны, является мембрана-проникающим
агентом и
может воздействовать на
внутриклеточные АФК, а также повысить уровни эндогенных
антиоксидантов, таких как GSH (Sandstrom соавт. 2006) и увеличение Mg-активности СОД.(Barreiro соавт. 2005 ).
Таким образом, исходя из наших текущих результатов с АЦ и последних документов положительный эффект от
других антиоксидантов на мышцы MDX стоит пересмотреть антиоксиданты, как терапевтический вариант для
МДД. Важно отметить, что с клинической точки зрения, АЦ был одобрен для применения у людей и показал
преимущества при широком диапазоне заболеваний (Arakawa и Ito, 2007). Ясно, что дистрофический процесс
заболевания является сложным и многофакторным, о чем свидетельствует постоянно растущее число
фармакологических подходов, которые обеспечивают различную степень защиты от повреждения мышц у мышей
MDX (Khurana & Davies, 2003). Наши данные показывают, что АЦ может обеспечить надежную защиту от
текущей дегенерации мышц у интактных мышей MDX и от повреждения в результате сокращений. Логическое
продолжение этих результатов состоит в объединении АЦ или других антиоксидантов, блокаторов параллельных
путей повреждения в мышцах MDX для того, чтобы обеспечить более эффективный терапевтический подход для
МДД.
Ссылки
↵ Arakawa M & Ito Y (2007). N-acetylcysteine and neurodegenerative diseases: Basic and clinical pharmacology.
Cerebellum 6, 308–314. CrossRef
↵ Arbogast S & Reid MB (2004). Oxidant activity in skeletal muscle fibers is influenced by temperature, CO2 level and
muscle-derived nitric oxide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 287, R698–R705. Abstract/FREE Full Text
↵ Barreiro E, Sanchez D, Galdiz JB, Hussain SN & Gea J (2005). N-acetylcysteine increases manganese superoxide
dismutase activity in septic rat diaphragms. Eur Respir J 26, 1032–1039. Abstract/FREE Full Text
↵ Benov L, Sztejnberg L & Fridovich I (1998). Critical evaluation of the use of hydroethidine as a measure of superoxide
anion radical. Free Radic Biol Med 25, 826–831. CrossRef
Medline
↵ Bornman L, Rossouw H, Gericke GS & Polla BS (1998). Effects of iron deprivation on the pathology and stress protein
expression in murine X-linked muscular dystrophy. Biochem Pharmacol 56, 751–757. CrossRef
Medline
↵ Brookes PS, Yoon Y, Robotham JL, Anders MW & Sheu SS (2004). Calcium, ATP, and ROS: a mitochondrial love-hate
triangle. Am J Physiol Cell Physiol 287, C817–C833. Abstract/FREE Full Text
↵ Buetler TM, Renard M, Offord EA, Schneider H & Ruegg UT (2002). Green tea extract decreases muscle necrosis in mdx
mice and protects against reactive oxygen species. Am J Clin Nutr 75, 749–753. Abstract/FREE Full Text
↵ Chen DB, Li SM, Qian XX, Moon C & Zheng J (2005). Tyrosine phosphorylation of caveolin 1 by oxidative stress is
reversible and dependent on the c-src tyrosine kinase but not mitogen-activated protein kinase pathways in placental
artery endothelial cells. Biol Reprod 73, 761–772. Abstract/FREE Full Text
↵ Disatnik MH, Dhawan J, Yu Y, Beal MF, Whirl MM, Franco AA & Rando TA (1998). Evidence of oxidative stress in mdx
mouse muscle: studies of the pre-necrotic state. J Neurol Sci 161, 77–84. CrossRef
Medline
↵ Farid M, Reid MB, Li YP, Gerken E & Durham WJ (2005). Effects of dietary curcumin or N-acetylcysteine on NF-κB
activity and contractile performance in ambulatory and unloaded murine soleus. Nutr Metab (Lond) 2, 20. CrossRef
Medline
↵ Galbiati F, Volonte D, Chu JB, Li M, Fine SW, Fu M, Bermudez J, Pedemonte M, Weidenheim KM, Pestell RG, Minetti C &
Lisanti MP (2000). Transgenic overexpression of caveolin-3 in skeletal muscle fibers induces a Duchenne-like muscular
dystrophy phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 9689–9694. Abstract/FREE Full Text
↵ Grounds MD & Torrisi J (2004). Anti-TNFα (Remicade) therapy protects dystrophic skeletal muscle from necrosis. FASEB
J 18, 676–682. Abstract/FREE Full Text
↵ Hamer PW, McGeachie JM, Davies MJ & Grounds MD (2002). Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage:
optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat 200, 69–79. CrossRef
Medline
↵ Hauser E, Hoger H, Bittner R, Widhalm K, Herkner K & Lubec G (1995). Oxyradical damage and mitochondrial enzyme
activities in the mdx mouse. Neuropediatrics 26, 260–262. Medline
↵ Haycock JW, MacNeil S, Jones P, Harris JB & Mantle D (1996). Oxidative damage to muscle protein in Duchenne
muscular dystrophy. Neuroreport 8, 357–361. Medline
↵ Hnia K, Hugon G, Rivier F, Masmoudi A, Mercier J & Mornet D (2007). Modulation of p38 mitogen-activated protein
kinase cascade and metalloproteinase activity in diaphragm muscle in response to free radical scavenger administration
in dystrophin-deficient Mdx mice. Am J Pathol 170, 633–643. CrossRef
Medline
↵ Hodgetts S, Radley H, Davies M & Grounds MD (2006). Reduced necrosis of dystrophic muscle by depletion of host
neutrophils, or blocking TNFα function with Etanercept in mdx mice. Neuromuscul Disord 16, 591–602. CrossRef
Medline
↵ Hoffman EP, Brown RH Jr & Kunkel LM (1987). Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy
locus. Cell 51, 919–928. CrossRef
Medline
↵ Howl JD & Publicover SJ (1990). Permeabilisation of the sarcolemma in mouse diaphragm exposed to Bay K 8644 in
vitro: time course, dependence on Ca2+ and effects of enzyme inhibitors. Acta Neuropathol 79, 438–443. CrossRef
Medline
↵ Ilsley JL, Sudol M & Winder SJ (2002). The WW domain: linking cell signalling to the membrane cytoskeleton. Cell Signal
14, 183–189. CrossRef
Medline
↵ Jung C, Martins AS, Niggli E & Shirokova N (2008). Dystrophic cardiomyopathy: amplification of cellular damage by Ca2+
signaling and reactive oxygen species-generating pathways. Cardiovasc Res (in press).
↵ Khawli FA & Reid MB (1994). N-acetylcysteine depresses contractile function and inhibits fatigue of diaphragm in vitro. J
Appl Physiol 77, 317–324. Abstract/FREE Full Text
↵ Khurana TS & Davies KE (2003). Pharmacological strategies for muscular dystrophy. Nat Rev Drug Discov 2, 379–390.
CrossRef
Medline
↵ Kumar A & Boriek AM (2003). Mechanical stress activates the nuclear factor-κB pathway in skeletal muscle fibers: a
possible role in Duchenne muscular dystrophy. FASEB J 17, 386–396. Abstract/FREE Full Text
↵ Kumar A, Takada Y, Boriek AM & Aggarwal BB (2004). Nuclear factor-κB: its role in health and disease. J Mol Med 82,
434–448. Medline
↵ Martins AS, Shkryl VM, Nowycky MC & Shirokova N (2008). Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals
produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres. J Physiol 586, 197–210. Abstract/FREE Full Text
↵ McGeachie JK, Grounds MD, Partridge TA & Morgan JE (1993). Age-related changes in replication of myogenic cells in
mdx mice: quantitative autoradiographic studies. J Neurol Sci 119, 169–179. CrossRef
Medline
↵ McKenna MJ, Medved I, Goodman CA, Brown MJ, Bjorksten AR, Murphy KT, Petersen AC, Sostaric S & Gong X (2006). Nacetylcysteine attenuates the decline in muscle Na+,K+-pump activity and delays fatigue during prolonged exercise in
humans. J Physiol 576, 279–288. Abstract/FREE Full Text
↵ Messina S, Altavilla D, Aguennouz M, Seminara P, Minutoli L, Monici MC, Bitto A, Mazzeo A, Marini H, Squadrito F &
Vita G (2006). Lipid peroxidation inhibition blunts nuclear factor-κB activation, reduces skeletal muscle degeneration, and
enhances muscle function in mdx mice. Am J Pathol 168, 918–926. CrossRef
Medline
↵ Moens P, Baatsen PH & Marechal G (1993). Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced
by contractions with stretch. J Muscle Res Cell Motil 14, 446–451. CrossRef
Medline
↵ Monici MC, Aguennouz M, Mazzeo A, Messina C & Vita G (2003). Activation of nuclear factor-κB in inflammatory
myopathies and Duchenne muscular dystrophy. Neurology 60, 993–997. Abstract/FREE Full Text
↵ Morgan DL & Allen DG (1999). Early events in stretch-induced muscle damage. J Appl Physiol 87, 2007–2015.
Abstract/FREE Full Text
↵ Nethery D, Callahan LA, Stofan D, Mattera R, DiMarco A & Supinski G (2000). PLA2 dependence of diaphragm
mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Appl Physiol 89, 72–80. Abstract/FREE Full Text
↵ Nguyen HX & Tidball JG (2003). Null mutation of gp91phox reduces muscle membrane lysis during muscle inflammation
in mice. J Physiol 553, 833–841. Abstract/FREE Full Text
↵ Petrof BJ, Shrager JB, Stedman HH, Kelly AM & Sweeney HL (1993). Dystrophin protects the sarcolemma from stresses
developed during muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 3710–3714. Abstract/FREE Full Text
↵ Rando TA (2002). Oxidative stress and the pathogenesis of muscular dystrophies. Am J Phys Med Rehabil 81, S175–
S186. CrossRef
Medline
↵ Rando TA, Disatnik MH, Yu Y & Franco A (1998). Muscle cells from mdx mice have an increased susceptibility to
oxidative stress. Neuromuscul Disord 8, 14–21. CrossRef
Medline
↵ Reid MB (2001). Invited Review: redox modulation of skeletal muscle contraction: what we know and what we don't. J
Appl Physiol 90, 724–731. Abstract/FREE Full Text
↵ Repetto S, Bado M, Broda P, Lucania G, Masetti E, Sotgia F, Carbone I, Pavan A, Bonilla E, Cordone G, Lisanti MP &
Minetti C (1999). Increased number of caveolae and caveolin-3 overexpression in Duchenne muscular dystrophy.
Biochem Biophys Res Commun 261, 547–550. CrossRef
Medline
↵ Robert V, Massimino ML, Tosello V, Marsault R, Cantini M, Sorrentino V & Pozzan T (2001). Alteration in calcium
handling at the subcellular level in mdx myotubes. J Biol Chem 276, 4647–4651. Abstract/FREE Full Text
↵ Robinson KM, Janes MS, Pehar M, Monette JS, Ross MF, Hagen TM, Murphy MP & Beckman JS (2006). Selective
fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 15038–15043.
Abstract/FREE Full Text
↵ Sandstrom ME, Zhang SJ, Bruton J, Silva JP, Reid MB, Westerblad H & Katz A (2006). Role of reactive oxygen species in
contraction-mediated glucose transport in mouse skeletal muscle. J Physiol 575, 251–262. Abstract/FREE Full Text
↵ Smith MA & Reid MB (2006). Redox modulation of contractile function in respiratory and limb skeletal muscle. Respir
Physiol Neurobiol 151, 229–241. CrossRef
Medline
↵ Sotgia F, Bonuccelli G, Bedford M, Brancaccio A, Mayer U, Wilson MT, Campos-Gonzalez R, Brooks JW, Sudol M &
Lisanti MP (2003). Localization of phospho-β-dystroglycan (pY892) to an intracellular vesicular compartment in cultured
cells and skeletal muscle fibers in vivo. Biochem 42, 7110–7123. CrossRef
Medline
↵ Sotgia F, Lee JK, Das K, Bedford M, Petrucci TC, Macioce P, Sargiacomo M, Bricarelli FD, Minetti C, Sudol M & Lisanti MP
(2000). Caveolin-3 directly interacts with the C-terminal tail of β-dystroglycan. Identification of a central WW-like domain
within caveolin family members. J Biol Chem 275, 38048–38058. Abstract/FREE Full Text
↵ Tidball JG & Wehling-Henricks M (2007). The role of free radicals in the pathophysiology of muscular dystrophy. J Appl
Physiol 102, 1677–1686. Abstract/FREE Full Text
↵ Vaghy PL, Fang J, Wu W & Vaghy LP (1998). Increased caveolin-3 levels in mdx mouse muscles. FEBS Lett 431, 125–127.
CrossRef
Medline
↵ Whitehead NP, Streamer M, Lusambili LI, Sachs F & Allen DG (2006a). Streptomycin reduces stretch-induced membrane
permeability in muscles from mdx mice. Neuromuscul Disord 16, 845–854. CrossRef
Medline
↵ Whitehead NP, Yeung EW & Allen DG (2006b). Muscle damage in mdx (dystrophic) mice: role of calcium and reactive
oxygen species. Clin Exp Pharmacol Physiol 33, 657–662. CrossRef
Medline
↵ Williams IA & Allen DG (2007). The role of reactive oxygen species in the hearts of dystrophin-deficient mdx mice. Am J
Physiol Heart Circ Physiol 293, H1969–H1977. Abstract/FREE Full Text
↵ Yeung EW, Whitehead NP, Suchyna TM, Gottlieb PA, Sachs F & Allen DG (2005). Effects of stretch-activated channel
blockers on [Ca2+]i and muscle damage in the mdx mouse. J Physiol 562, 367–380. Abstract/FREE Full Text
Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org
Оригинал статьи: http://jp.physoc.org/content/586/7/2003.long