Выявление полиморфизма гена рецептора

Проект
Клинические рекомендации
Выявление полиморфизма гена рецептора витамина D для
прогноза развития остеопении у больных бронхиальной
астмой
Москва 2015
1
Разработчики: д.м.н, профессор Ревякина В.А., д.м.н, профессор Сенцова Т.Б., к.м.н.
Кувшинова Е.Д., к.м.н. Ворожко И.В., Тимофеева А.М., Шавкина М.И., Березина Е.Ю.
Организация-разработчик:
Федеральное
государственное
бюджетное
научное
учреждение «Научно-исследовательский институт питания»
2
Содержание
Стр.
Разработчики……………………………………………………………………..
3
1. Введение……………………………………………………………………….
4
2. Методология…………………………………………………………………..
7
3. Описание медицинской разработки.………………………………………..
9
3.1. Результаты научно-исследовательской работы………………………
9
3.2. Сведения о патентовании………………………………………………
11
3.3. Степень готовности медицинской технологии к внедрению……….
11
3.4. Область применения медицинской технологии…………………….
11
3.5. Реализация в практике………………………………………………..
11
4. Заключение……………………………………………………………………
13
Список литературы……………………………………………………………….
14
Введение
3
Рост
распространенности
бронхиальной
астмы
у
детей
сопровождается
нарастанием тяжести течения, числа осложнений, высокой инвалидизацией и снижением
качества жизни. Существенный вклад в контроль симптомов бронхиальной астмы вносят
ингаляционные глюкокортикостероиды. Несмотря на имеющийся их опыт применения
при бронхиальной астме у детей, вопрос об их абсолютной безопасности окончательно не
решен. Данные о влиянии этих препаратов на костную минеральную плотность носят
противоречивый характер. Ряд исследователей считает, что на минеральную плотность
костной ткани могут влиять факторы, не связанные с основным заболеванием. Это
несбалансированное питание, в частности, недостаточное потребление кальция,
витамина D и белка; уровень физической активности; сопутствующие
заболевания.
Широко обсуждается роль полиморфизма генов, контролирующих костную массу, прежде
всего гена рецептора витамина D (VDR) и остеокальцина.
Витамин D взаимодействует со своим рецептором, играет важную роль в
кальциевом и фосфорном гомеостазе, регулируя рост и дифференцировку клеток костей,
кишечной абсорбции кальция и секреции паращитовидных гормонов. Полиморфизмы
гена VDR ассоциированы с циркулирующим уровнем остеокальцина, массой и
минеральной плотностью кости, остеопенией.
Контроль за факторами внешней среды, предусматривающий исключение или
уменьшение экспозиции аллергенов в первые годы жизни (пищевые, бытовые,
эпидермальные аллергены), уменьшение воздействия поллютантов,
выделение групп
риска развития остеопении, совершенствования диетотерапии и методов профилактики
снижения костной массы.
2.Методология
Методы, использованные для сбора/селекции доказательств:

поиск в электронных базах данных.
Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств:

оценка значимости в соответствии с уровнями доказательности
и классами рекомендаций (табл.1, 2).
Таблица 1. Уровни доказательности
4
Уровень
1
2
3
4
Источник доказательств
Проспективные рандомизированные контролируемые исследования.
Достаточное количество исследований с достаточной мощностью, с участием
большого количества пациентов и получением большого количества данных.
Крупные мета-анализы.
Как минимум одно хорошо организованное рандомизированное контролируемое
исследование.
Репрезентативная выборка пациентов
Проспективные с рандомизацией или без исследования с ограниченным количеством
данных.
Несколько исследований с небольшим количеством пациентов.
Хорошо организованное проспективное исследование когорты.
Мета-анализы ограничены, но проведены на хорошем уровне.
Результаты непрезентативны в отношении целевой популяции.
Хорошо организованные исследования «случай-контроль»
Нерандомизированные контролируемые исследования.
Исследования с недостаточным контролем.
Рандомизированные клинические исследования с как минимум 1 значительной или
как минимум 3 незначительными методологическими ошибками.
Ретроспективные или наблюдательные исследования.
Серия клинических наблюдений.
Противоречивые данные, не позволяющие сформировать окончательную
рекомендацию
Мнение эксперта/данные из отчета экспертной комиссии, экспериментально
подтвержденные и теоретически обоснованные
Таблица 2. Уровни рекомендаций.
5
Уровень
A
B
Описание
Рекомендация основана на высоком уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 1 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
Рекомендация основана на среднем уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 2 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
C
Рекомендация основана на слабом уровне
доказательности (но как минимум 1
убедительная публикация 3 уровня
доказательности, показывающая значительное
превосходство пользы над риском) или
нет убедительных данных ни о пользе, ни о
риске)
D
Отсутствие убедительных публикаций 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающих
значительное превосходство пользы над риском,
либо убедительные публикации 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающие
значительное превосходство риска над пользой
Расшифровка
Метод/терапия первой линии;
либо в сочетании со
стандартной
методикой/терапией
Метод/терапия второй линии;
либо при отказе,
противопоказании, или
неэффективности стандартной
методики/терапии.
Рекомендуется
мониторирование побочных
явлений
Нет возражений против
данного метода/терапии
или нет возражений против
продолжения данного
метода/терапии.
Рекомендовано при отказе,
противопоказании или
неэффективности стандартной
методики/терапии, при
условии отсутствия побочных
эффектов
Рекомендация основана на
мнении экспертов, нуждается
в проведении исследований
Методы, использованные для анализа доказательств:
Доказательной базой для рекомендаций служили публикации, входящие в Кохрайновскую
библиотеку, в базы данных EMBASE и PubMED/MEDLINE.
Описание методов, использованных для анализа доказательств:
Были использованы: Щеплягина Л.А., Моисеева Т.Ю. Проблемы остеопороза в
педиатрии:возможности профилактики // Русский медицинский журнал. - 2003- Т.П. №27.-С. 1554-1556. 117; Щеплягина Л.А., Моисеева Т.Ю. Проблемы остеопороза в
педиатрии:научные и практические задачи // Российский педиатрический журнал. -2004.№1.-С.4-11.. Agertoft L,-Pedersen S. Bone mineral density in children with asthma receiving
long-term treatment with inhaled budesonide // Am. J. Respir. Crit. Care Med1998.-Vol 157. - №
L - P. 178-183.; Zhao CN, Fan Y, Huang JJ, Gao T, Wang C, Hou LH. The Association of
GSDMB and ORMDL3 Gene Polimorphisms With Asthma: A Meta-Analisis. Allergy Asthma
Immunol Res. 2015 7 (2) 175-85.; Liu Z. Liu L. Chen X, He W, Yu X. Associations study of
vitamin D receptor gene polymorphisms with diabetic microvascular complication: a metaanalysis. Gene, 2014, 546 (1),6-10.
6
Основные рекомендации:
 Сила рекомендаций (A-D) приводятся при изложении текста технологии.
3. Описание медицинской разработки
Выявление полиморфизма гена рецептора витамина D может служить критерием,
для прогноза развития остеопении у больных бронхиальной астмой для прогноза развития
остеопении у больных бронхиальной астмой (уровень В).
Проводился сбор анамнеза и выяснение семейной истории аллергических
заболеваний. Оценка состояния минеральной плотности костной ткани и показателей
костного метаболизма у детей с бронхиальной астмой в зависимости от вида
противовоспалительной базисной терапии. Осуществлялось клиническое обследование
детей; функциональное исследование легких на приборе «Спиротест»; оценка питания
методом интервьюирования родителей с учетом количества потребленных ребенком
молочных и мясных продуктов. Проведен расчет потребляемого кальция, содержащегося
в молочных продуктах и общего объема мясных продуктов в суточном рационе, а также
сравнительный анализ с рекомендуемыми нормативами; исследование минеральной
плотности
костной
ткани
-
методом
двойной
рентгеновской
абсорбциометрии
поясничного отдела позвоночника на остеоденсигометре. Для характеристики костной
минеральной плотности изучались: содержание минерала в костной ткани, костная
минеральная плотность, интегральный показатель Z-score.
Для оценки вклада генетических факторов в формирование минеральной плотности
костной ткани исследовался Fokl, Apal, Taql полиморфизм гена рецептора витамина D,.
Они определялись с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим
рестрикционным анализом. Она основана на многократном копировании(амплификации)
in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов определенных участков ДНК с
помощью ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей
ДНК,
начиная
с
олигонуклеотидных
праймеров.
Благодаря
этому
происходит
экспоненциальное увеличение количества специфических фрагментов ДНК [23]. Пятью
основными компонентами ПЦР являются: а) Taq-ДНК-полимераза -термостабильный
фермент из термофильной бактерии Thermus aquaticus; б)пара праймеров. Это специально
синтезированные
короткие,
длиной
20-30
оснований,
одноцепочечные
ДНК
(дезоксиолигонуклеотиды), комплиментарные 3' концам цепей копируемой ДНКматрицы. Благодаря им ограничивается фрагмент ДНК, который будет скопирован TaqДНК-полимеразой; в) 4 типа дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ); г) копируемая ДНК.
7
Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минеральное масло.
ПЦР состоит из 3 основных процедур: подготовка исследуемой пробы материала
(изоляция ДНК), собственно ПЦР и определение продукта ПЦР (амплифицированной
ДНК). Лейкоцитарная ДНК была выделена из 3 мл цельной крови при помощи набора для
изоляции ДНК WizardTM Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, U.S.A.).
Каждый цикл ПЦР состоит из трех этапов
1. Денатурация. На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в
образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего
двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных
молекул.
2. На втором этапе происходит отжиг - присоединение прайм еров к
одноцепочечной ДНК-мишени с образованием коротких двухцепочечных участков ДНК,
необходимых для инициации синтеза ДНК. Праймеры берутся в избытке по отношению к
матрице. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа,
означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится
тимин, а напротив гуанина — цитозип. Если это условие не соблюдено, то отжига
праймеров не происходит.
После отжига праймеров с образовавшимся комплексом праймер-матрица
связывается Taq-полимераза и начинает достраивание второй цепи ДНК (синтез ДНК
протекает в направлении от 5' к 3' для обеих новых цепей).
3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят
до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной
эффективностью. Двухнитевые фрагменты ДНК равные по "длине расстоянию между
двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. В дальнейшем этапы
денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом
цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается. Синтезированные
в ходе первого цикла ПЦР цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации
Определение полиморфизма гена VDR проводилось с помощью рестриктаз Fokl,
Apai, Taql, Аллели гена рецептора витамина D при наличии сайта рестрикции
обозначались как f, t, а, при его отсутствии как F, Т, А. Для визуализации результатов
амплификации был применен метод электрофореза, основанный на разделении молекул
ДНК по размеру. Для этого была приготовлена пластина агарозного геля, представляющая
собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации
2% с добавлением специального красителя ДНК (бромистого этидия), встраивающегося
плоскостными группами в молекулы ДНК. При заливке с помощью гребенок в геле были
8
сформированы специальные лунки, в которые внесли продукты амплификации. Затем
пластину
геля
поместили
в
аппарат
для
горизонтального
гель-электрофореза,
подключенного к источнику постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК
двигается в геле от минуса к плюсу, при чем более короткие молекулы ДНК движутся
быстрее, чем длинные. После окончания электрофореза, гель помещают на фильтр
трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне. Энергия
ультрафиолета,
поглощаемая
ДНК,
передается
на
краситель,
заставляя
его
флуоресцировать. Генотипы были определены как FF, ТТ, АА, НН гомозиготы
(отсутствие сайта рестрикции), Ff, Tt, Аа, Hh гетерозиготы и ff, tt, аа, hh гомозиготы
(наличие сайта рестрикции).
3.1. Результаты научно-исследовательской работы:
Наследственная предрасположенность к бронхиальной астме по линии родителей
наблюдалась в 24,7% случаев, из них по материнской линии у 10%, по линии ближайших
родственников у 39,4%. Большинство детей с бронхиальной астмой имели показатели
роста в пределах популяционного коридора нормы (10-90 процентиль). Гармоничное
физическое развитие отмечено у 58,7% детей. Дисгармоничное (избыток массы тела 1-ой
степени) наблюдалось у 34, 9%. Показатели длины и массы тела ниже 25 процентиля
имели 6,4% детей. 28,4% детей находилось в периоде обострения, а 39,5% имели
неустойчивую ремиссию, 32,1% были в состоянии полной ремиссии.
У обследованных детей с бронхиальной астмой независимо от степени тяжести
заболевания, вида и дозы ингаляционных глюкокортикостероидов
сохраняются
физиологические закономерности минерализации костной ткани и костного метаболизма
(нарастание содержания минерала в костной ткани и костной минеральной плотности по
мере линейного роста ребенка). Абсолютные показатели минеральной плотности костной
ткани выше, чем больше возраст ребенка. Установлена корреляция между показателями
минерала в костной ткани и возрастом (r=0,89), ростом (r=0,90) и весом (r=0,89). При
анализе частоты встречаемости снижения минеральной плотности костной ткани,
в
зависимости от тяжести течения бронхиальной астмы, не выявлено значимых различий
между группами с различной степенью тяжести бронхиальной астмы.
Анализ внешнесредовых факторов риска был ориентирован на оценку количества
потребленных молочных и мясных продуктов ребенком за неделю и анализ двигательной
активности.
Установлена
статистически
значимая
взаимосвязь
уровня
костной
минеральной плотности и количества употребляемых молочных продуктов, а также
содержания костного минерала и количества мясных продуктов в рационе.
9
Половина детей получали с молочными продуктами менее 50% рекомендуемой
возрастной нормы кальция, из них у 17,1% детей (все со сниженной костной минеральной
плотности) вообще не употребляли молока и молочных продуктов из-за непереносимости
или пищевых привычек. В группе детей, потреблявших мясные продукты в количестве,
превышающим 50% рекомендуемой возрастной нормы отмечались более высокие
показатели костной минеральной плотности, чем в группе детей, употреблявших мясо
менее 50% рекомендуемой возрастной нормы. Кроме того, у детей, употреблявших мясо
менее 50% рекомендуемой дозы, показатели содержания минерала в костной ткани были
ниже средневозрастных норм.
Использование методов математической статистики позволило доказать, что
потребление кальция с молочными продуктами меньше 50% рекомендуемой возрастной
нормы в 2.7 раза превышает риск развития остеопении, а недостаточное потребление мяса
практически в 2 раза увеличивает вероятность снижения минерала в костной ткани по
отношению с нормой.
Рассматривая генетические факторы риска развития оспеопении у больных
бронхиальной астмой, установлено, что рецессивные и доминантные аллели генов, в том
числе гена
рецептора витамина
D, распределены в популяции неравномерно. По
результатам генетического тестирования выявлено следующее распределение генотипов
полиморфного маркера Fok I:: носители FF-генотипа составило 42,3%,
носители Ff-
генотипа – 44,2%, носители ff-генотипа 13,5%. Соответственно, частота аллеля F
составила - 64,4%, а частота аллеля f – 35,6% (табл.1).
Таблица 1. Частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера Fok I гена
VDR у пациентов с БА (абс. и в % от количества человек в группе)
10
Частота генотипов
Пациенты с
БА
FF
N=52 (104)
Ff
22
23
(42,3) (44,2)
Частота аллелей
Ff
F
f
7 (13,5)
67
(64,4)
37 (35,6)
.
У детей 5-18 лет с нормальной минеральной плотностью костной ткани выявлена
популяционная частота генотипов Fokl полиморфизма (Ff-42,3%, FF – 44,2 %, ff- 13,5%),
(F - 64,4%, f – 35,6%), Taql полиморфизма гена рецептора витамина D (Tt - 48,21%, TT 46,43%, tt - 5,36%).
Частота различных аллелей Fok полиморфизма гена рецептора витамина D у
обследованных детей составила доминантного F-аллеля -64,4%, рецессивного аллеля 44,5%, что сопоставимо с данными зарубежных авторов. Отмечено относительно
преобладание гомозиготного FF-варианты Fok 1 полиморфизма у детей с остеопенией, но
данные
различия
были
статистически
не
значимыми.
Не
выявлено
прямого
статистического значимого влияния полиморфизма гена рецептора витамина D на
показатели минеральной плотности костной ткани у детей с бронхиальной астмой
Установлено влияние полиморфизма гена рецептора витамина D на процессы
фосфорно-кальциевого метаболизма
и минерализации костной ткани у больных
бронхиальной астмой. Показана взаимосвязь генотипа Fokl полиморфизма гена рецептора
витамина D с уровнем кальцийурии. Не выявлено отрицательного влияния приема низких,
средних и высоких доз ингаляционных кортикостероидов сроком от 6 месяцев до 7 лет на
рост у обследованных детей с различной степенью тяжести бронхиальной астмы.
Установлена взаимосвязь доминантного и рецессивного гомозиготных FF и ff
генотипов
с
более
низкими
показателями
длины
тела
при
рождении;
рецессивного гомозиготного ff генотипа с гипокальциурией. У детей с генотипом FF
показатели длины тела при рождении были ниже, у детей с этим генотипом отмечалась
гипокальциурия.
3.2 Сведения о патентовании: нет
11
3.3 Степень готовности разработки к внедрению: научно-исследовательская разработка
может быть внедрена в практику лечебно-профилактических учреждений, центров
здоровья,
диетологических
кабинетов
лечебно-профилактических
учреждений
в
Российской Федерации в виде методических указаний по выявлению генетических
полиморфизмов рецептора витамина D.
3.4 Область применения разработки:
- здравоохранение: внутренние болезни, диетология, гастроэнтерология, аллергические
болезни, терапия, обучение студентов высших медицинских учебных заведений,
курсантов
сертификационных
и
тематических
циклов
усовершенствования
и
специализации врачей по диетологии, нутрициологии, аллергологии.
3.5. Реализация в практике: клиника ФГБНУ «НИИ питания», кафедра диетологии и
нутрициологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного
образования» Минздрава России, кафедра диетологии и нутрициологии ГБОУ ВПО
«Российский
национальный
исследовательский
медицинский
университет
имени
Н.И.Пирогова» Минздрава России.
12
4. Заключение
Описанный способ опробован при обследовании и лечении 109 детей (92 мальчика, 17
девочек) 5-18 лет с легкой персистирующей, среднетяжелой и тяжелой формой
бронхиальной астмы, что позволило разработать индивидуальные ротационные диеты
для каждого больно и рекомендации по проведению диетотерапии у этого контингента
пациентов. С целью повышения эффективности ранней диагностики остеопении
рекомендуется использовать остеоденситометрию в оценке костной плотности у детей с
бронхиальной астмой, в первую очередь из групп риска при плановом обследовании.
Рекомендуется относить в группу риска развития остеопении у детей с бронхиальной
астмой, больных получающих молочных продуктов и мяса менее 50% рекомендуемых.
средневозрастных норм, а также занимающих физической культурой менее 3 часов в
неделю. Детям с бронхиальной астмой целесообразно включение в рацион питания
продуктов, богатых кальцием и животным белком.
На основе предложенного способа выявления полиморфизма рецептора витамина
D сформированы группы риска по развитию остеопении у детей с бронхиальной астмой,
разработаны профилактические рекомендации по диетотерапии, что позволило добиться
значительного
уменьшения
клинических
проявлений
заболевания,
снижению
эффективных доз лекарственных препаратов, повышению качества жизни больных.
13
Литература:
1.Щеплягина Л.А., Моисеева Т.Ю. Проблемы остеопороза в педиатрии:возможности
профилактики // Русский медицинский журнал. - 2003- Т.П. -№27.-С. 1554-1556. 117
2. Щеплягина Л.А., Моисеева Т.Ю. Проблемы остеопороза в педиатрии:
научные и практические задачи // Российский педиатрический журнал. -2004.-№1.-С.4-11.
3. Agertoft L,-Pedersen S. Bone mineral density in children with asthma receiving long-term
treatment with inhaled budesonide // Am. J. Respir. Crit. Care Med1998.-Vol 157. - № L - P.
178-183.
4.. Agertoft L, Pedersen S. Effect of Long-Term Treatment with Inhaled Budesonide on Adult
Height in Children with Asthma. // N Engl J Med. - 2000.- Vol. 343. -№12 -P.1064-1069.
5. Alroy I-., Towers T.L, Freedman L.P. Transcriptional repression of the interleukin-2 gene by
vitamin D3: direct inhibition of NFATp/AP-1 complex formatioirby a nuclear hormone receptor
// Mol Cell Biol. - 1995. - Vol. 15. -P.5789-5799.
6. Ames S.K., Ellis K.J., Gimn S.K., Copeland K.C., Abrams S.A.Vitamin D Receptor Gene
Fokl Polymorphism Predicts Calcium Absorption and Bone Mineral Density in Children // J
Bone Miner Res. - 1999. - Vol. 14. - P.740-746.
7. Anderson G.G., Morrison J.F.J. Molecular biology and genetics of allergy and asthma // Arch
Dis Child. - 1998. - Vol. 78. - P.488-496.
8.. Baran D.T., Faulkner K.G., Genant H.K., Miller P.D. Диагностика и лечение остеопороза:
принципы использования костной денситометрии //
9.Vitamin D receptor gene polymorphism, bone mass, body size, and vitamin D receptor density
// Calcif Tissue Int. - 1995. - Vol.57. - №2. - P. 161 -162.
10. Blumsohn A, Herrington K, Hannon R.A., Eastell R. The Effect of Calcium Supplementation
on the Circadian Rhythm of Bone Resorption // Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism. - 1994. - Vol. 79.- №3. - P.535-537.
11.. Bonjour J-P, Carrie A-L, Ferrari S, et al. Calcium-enriched foods and bone mass growth in
prepubertal girls: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial // J Clin Invest. - 1997. Vol.99. - P . 1287-1294.
12.. Brand P.L. Inhaled corticosteroids reduce growth. Or do they?// Eur Respir J. -2001.-Vol.
17.-P.287-294.
13. Brown M.A., Haughton M.A., Grant S.F., Gunneli A.S. Genetic Control of Bone Density and
Turnover: Role of the Collagen I d , Estrogen Receptor, and Vitamin D Receptor Genes // J Bone
Miner Res. - 2001. - Vol. 16. - №16.- P.758-764.
14. Cantorna M.T. Vitamin D and Autoimmunity: Is Vitamin D Status an Environmental Factor
Affecting Autoimmune Disease Prevalence? // Society for Experimental Biology and Medicine. 2000. - Vol.223. - P.230-233.
15. Covar R.A., Leung D.Y., McCormick D., Steelman J., Zeitler P., Spahn J.D. Risk factors
associated with glucocorticoid-induced adverse effects in children
with severe asthma // J Allergy Clin Immunol. - 2000. - Vol.106. - P.651-659.
16. Delmas P.D., Eastell R., Gamero P., Seibel M.J. The use of biohemical marcers of bone
turnover in osteoporosis // Osteoporos Int. - 2000. - Vol. 6. -S2-17.
14