Улучшение мышц при помощи пропуска экзона 51 у mdx мышей... пропуском экзона 52.
advertisement
Улучшение мышц при помощи пропуска экзона 51 у mdx мышей с пропуском экзона 52. Yoshitsugu Aoki1,2, Akinori Nakamura1, Toshifumi Yokota1,3, Takashi Saito1,4, Hitoshi Okazawa5, Tetsuya Nagata1 and Shin'ichi Takeda1 1. Department of Molecular Therapy, National Institute of Neuroscience, National Center of Neurology and Psychiatry (NCNP), Tokyo, Japan 2. Department of System Neuroscience, Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental School University Graduate School, Tokyo, Japan 3. Research Center for Genetic Medicine, Children's National Medical Center, Washington, DC, USA 4. Department of Pediatrics, Tokyo Women's Medical University, Tokyo, Japan 5. Department of Neuropathology, Medical Research Institute, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan Опубликованна в7 сентября 2010 Введение Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) является серьезным заболеванием мышц, характеризуемым мутациями в гене дистрофина, которые, главным образом, разрушают рамку считывания, приводящую к отсутствию функционального белка. Схожие мутации вызывают мышечную дистрофию Беккера (МДБ),у которой намного более умеренный фенотип, как правило в результате сокращения в структуре гена дистрофина, которые вызывают экспрессию ограниченного количества внутренне усеченного, но частично функционального белка. Антисмысловые олигонуклеотиды (AO) - установленная пропускающая экзон терапия МДД, которая вызывает сплайсинг транскриптов дистрофина, был продемонстрирован, чтобы исключить определенные экзоны, таким образом исправляя измененую рамку считывания, приводя к производству сокращенного, но частично функционального белка 3,4,5,6,7 "подобного Беккеру" В результате пропуска экзона, МДД может быть преобразована в более умеренный фенотип МДБ. Принцип, лежащий в основе терапии пропуска экзона, был продемонстрирован в культурах клеток мыши или человека в vitro. Кроме того, в естественных условиях исследования на крысиных или собачьих моделях животных представили преклинические свидетельства для терапевтического потенциала пропускающих экзон стратегий. Однако, число пациентов, у которых есть та же самая мутация, как у мыши или собаки, как оценивается, довольно низок. С другой стороны, горячая точка для делеций между экзонами 45 и 55 встречается у > 60 % пациентов с делециями. В частности пропуск экзон, который предназначается для экзона 51, теоретически применим к самому высокому проценту (13 %) пациентов МДД с делециями. Недавно, эффективная экспрессия дистрофина в структуре после пропуска экзона 51 была успешно продемонстрирована у людей, используя местную внутримышечную инъекцию антисмысловых олигонуклеатидов. Функциональность продуцированного дистрофина, произведенного при пропуске экзона 51 , определена у пациентов, с делецией в структуре. Изменения в структуре около стержня, который закодирован экзонами 50 и 51, могут уменьшить серьезность этой болезни. Следовательно, желательно использовать модель животных, чтобы исследовать функциональность молекулярной структуры стерженя после пропуска экзона 51. У mdx мышей удален (mdx52) экзон 52 из гена дистрофина,что привело к преждевременной остановке кодона в экзоне 53. Эта мышь испытывает недостаток дистрофина и проявляет особенности миодистрофии. Здесь, мы показали эффективное восстановление функции дистрофина: рамка считывания была восстановлена пропуском экзона 51, и мы наблюдали значительное улучшение скелетной мускулатуры и ее функции у mdx52 мышей. Мы описываем первое успешное исследование для системного восстановления дистрофина путем восстановления структуры стерженя и восстановление функции при пропуске экзона 51 у мышей. Результаты Два AO для 5` и 3` мест сплайсинга достигли эффективного пропуска экзона 51 у mdx52 мышей. Пропуск экзона 51 из крысиного гена дистрофина у mdx52 мыши исправляют открытую рамку считывания, приводящую к производству усеченного дистрофина, который короче на две трети в области стержня и напоминает человеческий дистрофин после пропуска экзона 51 (рисунка 1a). Мы сначала идентифицировали эффективные последовательности AO при внутримышечной инъекции в переднюю большеберцовую мышцу (ПБМ) mdx52 мышей. Чтобы оптимизировать дозу, крысиный B30 (mB30) AO был введен 8-недельным mdx52 мышам в дозах 110 мкг. mB30 AO разработанный для пропуска мышинного экзона 51 был основан на АО, который предназначается для человеческого экзона 51 (рисунок 2a). Мыши были подвергнуты эвтаназии спустя 2 недели после инъекции; ПБМ были изолированы и проанализированы при помощи ОТ-ПЦР и иммуногистохими. Используя ОТ-ПЦР для последовательности, обрамляющей экзоны 50 и 53, была обнаружена группа ДНК, эквивалентная мРНК недостающих экзонов 51 и 52. Мы нашли, что mB30 восстановил экспрессию дистрофина в очень зависимой от дозы степени (Дополнительный рисунок S1). Тогда, мы проектировали 13 последовательностей AO, предназначающихся или для экзонных последовательностей или для соединений экзона/интрона мышинного экзона 51. Последовательности и составы этих AO описаны в Таблице 1 и рисунке 2a. Мы тогда непосредственно вводили один или два из 14 AO в ПБМ mdx52 мышей. Спустя две недели после инъекции, мы проанализировали фракции РНК с помощью ОТ-ПЦР и иммуногистохимии и вестерн блот анализом. Среди исследованных AO, 51D, mB30, и 51I, как показал ОТ-ПЦР, были способны к пропуску экзона 51 на уровне приближающемуся к 50 % (Рисунок 2b, c). 51D и 51I были разработаны для 5′ сайтов сплайсинга и экзона 51, соответственно. Было сообщения о том, что комбинация двух AO, направленных на соответствующие экзоны, вызывает более эффективный пропуск экзона, чем при единственной инъекции. Мы поэтому ввели комбинации двух AO в ПБМ mdx52 мышей, и нашли, что комбинация двух AO, 51A + 51D, показала ~75 % эффективности, самое высокое значение среди комбинаций, что мы исследовали. 51A предназначен 3′ сайту сплайсинга экзона 51. Иммуногистохимия показала, что при использовании комбинации 51A + 51D 50-70 % волокон в поперечных сечениях мышц дистрофинположительны(рисунок 2f), и ~50 % экспрессии дистрофина при вестерн блот анализе по сравнению с нормальным контролем (рисунок 2 g). Сопоставляя эти результаты, мы пришли к заключению, что ко-инъекция двух AO, 51A + 51D, была оптимальной комбинацией для пропуска экзон 51. Рисунок 1 Рисунок 2 Таблица 1 AO восстановил экспрессию дистрофина во всем теле в зависимой от дозы степени у mdx52 мышей Чтобы исследовать эффект системной поставки, мы внутривенно вводили дозу 51A + 51D 160 или 320 мг/кг 8недельным mdx52 мышам. Мыши были подвергнуты эвтаназии спустя 2 недели после инъекции; мышцы были изолированы и проанализированы ОТ-ПЦР и иммуногистохимически. Мы нашли, что AO восстановили экспрессию дистрофина во всем теле в зависимой от дозы степени: 320 мг/кг ~45 % эффективность при ОТ-ПЦР (Рисунок 3a, b) и 45% дистрофин-положительных волокон при иммуногистохимии (рисунок 3c) в икроножных мышцах. Рисунок 3. Повторная системная поставка AO вызвала очень эффективный образование дистрофина в скелетных мышцах всего тела. Затем, мы внутривенно вводили 320 мг/кг 51A +51D 8-недельным mdx52 мышам, семь раз с недельным интервалом. Спустя две недели после заключительной инъекции скелетные мышцы и сердце были исследованы. Мы идентифицировали группы КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ДНК, соответствующие экзону 51 пропущенному почти во всех скелетных мышцах рассматриваемых мышей при ОТ-ПЦР(рисунок 4a). Уровни эффективности пропуска экзона были переменными: ~67 % в квадрицепсе (QC), 64 % в икроножной мышце, 63 % в брюшных мышцах, 54 % в спинных мышцах, 43 % в трицепсе, 29 % в передней большеберцовой, 24 % в дельтовидной мышце, 21 % в межреберных мышцах, 18 % в диафрагме, и 3 % в сердечной мышце (рисунок 4b). Экспрессия дистрофина была также оценена количественным вестерн блот анализом (рисунок 4c). Уровни экспрессии в квадрицепсе, икроножной мышце, и трицепсе были самыми высокими - 30-40 % нормальных уровней. В передней большеберцовой мышце, межреберных, спинных мышцах, и диафрагме 10-20 % нормальных уровней, тогда как уровень экспрессии дистрофина в сердце составлял только 1 % нормальных уровней (рисунок 4d). Мы обнаружили дистрофин-положительные волокна в 60-80 % всех скелетных мышц при иммуногистохимии, наиболее заметные в квадрицепсе, икроножных и спинных мышцах (рисунок 4e). Кроме того, большинство неположительных волокон в нашем исследовании показало слабые сигналы наличия дистрофина. Рисунок 4 Мы исследовали экспрессию компонентов, включенных в дистрофин-гликопротеиновый комплекс в квадрицепсе иммуногистохимией. Экспрессия α-саркогликана коррелировала с экспрессией дистрофина (рисунок 4f). Мы также наблюдали восстановление экспрессии β-дистрогликана и α1-синтрофина в сарколемме (данные, не показаны). С другой стороны, экспрессия утрофина была снижена в дистрофин-положительных волокнах (рисунок 4f). Структура дистрофина укороченная в области стержня уменьшила патологию скелетной мускулатуры. Скелетные мышцы Мdx52 мышей показали гипертрофию и увеличенние центрально образованных ядер в волокнах. Спустя две недели после семи последовательных инъекций комбинации AO полный вес длинного разгибателя пальцев (ДРП) имел тенденцию к снижению у рассматриваемых мышей по сравнению с мышами, не получавшими лечения (рисунок 5a). Мы наблюдали меньшую дегенерацию мышц и меньше клеточных инфильтратов в рассматриваемой ПБМ по сравнению с такой же у мышей не получавших лечение (рисунок 5b). Мы оценили подробные гистологические изменения в рассматриваемых мышцах и сравнили их с изменениями в мышцах контрольной группы. Изменение размера волокна в ПБМ было меньше чем у контрольной группы (рисунок 5c). Мы отметили существенное уменьшение площади поперечного сечения волокон мышц у рассматриваемых мышей по сравнению с теми у невылеченных мышей (рисунок 5d). Проценты центрально образованных ядро в волокнах были ниже в трицепсе, икроножных мышцах, квадрицепсе, и брюшных мышцах чем в диафрагме и ПБМ (рисунок 5e). Эти изменения отражают улучшение гипертрофии волокон мышц и дистрофических изменений у рассматриваемых mdx52 мышей. Рисунок 5 Структура дистрофина в значительной степени восстановила функцию мышц Чтобы исследовать функцию AO-индуцированного дистрофина, мы оценили функцию скелетных мышц с помощью тестов после семи инъекций препарата. Защита волокон мышц против повреждения была установлена при определении уровней креатининкиназы в сыворотке у рассматриваемых мышей (рисунок 6a), которые были снижены. Существенные улучшения выносливости при однообразном механическом труде (рисунок 6b), максимальная сила передней конечности (рисунок 6c), и определенная тетаническая сила длинного разгибателя пальцев (рисунок 6d) наблюдались у рассматриваемых mdx52 мышей по сравнению с контрольными mdx52 мышами. Рисунок 6 Эффективность повторной инъекции AO у mdx52 мышей подтверждена экспрессией гена Анализ экспрессии гена широко использовался, чтобы представить экспрессию гена для диагноза болезни и эффективности терапии в геноме одновременно. ПБМ при дистрофии были сравнены с нормальными ПБМ человека и mdx мыши в различных стадиях болезни. Чтобы оценить профиль экспрессии гена мускулов ПБМ после пропуска экзона 51, мы выполнили анализ экспрессии гена (рисунок 7a). Анализ экспрессии гена показал, что профили экспрессии гена ПБМ коррелировали между рассматриваемыми и контрольными mdx52 мышами (r2 = 0.97), и, не были следствием неожиданной экспрессией вспомогательных генов или нарушением регуляции обусловленных стрессом белков. Мы установили, что дистрофин-связанные белки, такие как дистрофин, NOсинтаза, и α1-синтрофин были повышены, уровни α-саркогликана, и β-дистрогликана были неизменны, и утрофин был снижен. Мы также нашли, что уровень воспалительных цитокинов был снижен у рассматриваемых mdx52 мышей. Количественный ОТ-ПЦР после анализа экспрессии гена показал, что уровни экспрессии дистрофина и н NO-синтазы были в 3.4 и 1.9 раза выше чем у контрольных mdx52 мышей, соответственно; однако, они составляли только 33 и 40 % нормальных уровней, соответственно (рисунок 7b). Уровни экспрессии утрофина были повышены у контрольных mdx52 мышей, но повышены у рассматриваемых mdx52 мышей по сравнению с диким типом (ВЕС) мыши (рисунок 7b). У рассматриваемых mdx52 мышей мы наблюдали уменьшенные уровни нескольких классов C-C хемокинов (Ccls), такие как Ccl7, Ccl21b, и Ccl2, которые являются маленькими цитокинами, которые вызывают перемещение моноцитов и других типов клеток, таких как естественные киллеры и дендритные клетки (рисунок 7c). Рисунок 7 Не обнаружено токсичности после повторного введения AOs mdx52 мышам. Не было отмечено симптомов болезни и смертельных случаиев во время периода лечения AO. Чтобы далее контролировать потенциальную токсичность в главных органах при лечении AOs, мы сравнили серию маркеров сыворотки, обычно используемых в качестве индикаторов поражения печени и почек в контрольных группах и у mdx52 мышей, получавших лечение. Не было обнаружено существенных различий среди этих трех групп в уровнях креатинина, азота мочевины крови, АЛТ, АСТ, общего билирубина, щелочной фосфатазы, и γ-ГТТ (Дополнительный рисунок S2a). Гистологическая экспертиза печени и почек не показала признаков повреждения ткани или увеличение инфильтрации моноцитов у рассматриваемых mdx52 мышей (Дополнительный рисунок S2b). Эти данные подтверждают, что эта комбинация AO была нетоксична в этом исследовании. In vitro исследование действия на клеточную культуры АО. Мы спроектировали несколько AOs основанных на крысиных последовательностях: hAc (51Ac) для 5 ′ сайта сплайсинга, и hDo1 (51D1) и hDo2 (51D2) для 3′ сайтов сплайсинга человеческого экзона 51. Последовательности и состав AO описаны в Дополнительной Таблице S1. MyoD-переделанные фибробласты ( 5017 клеток) были исследованы после 48-часовой инкубации с одним или двумя AOs при заключительной концентрации 1, 5, или 10 мкМоль/л. Среди исследованных AOs, hAc +hDo1, и B30 , как показывал ОТ-ПЦР, были способны к стимуляции пропуска экзона 51 на уровне, приближающемся 50 и 30 %, соответственно (Дополнительный рисунок S3). С другой стороны, hAc, hDo1, или hDo2 были менее эффективными при стимулировании пропуска экзона 51 (Дополнительный рисунок S3). Эти результаты предполагают, что ко-инъекция двух AOs могла вызвать очень эффективный пропуск экзона 51 в клетках больных МДД. Обсуждение Это - первый отчет, показывающий широко распространенную индукцию дистрофина, в структуре которого отсутствует большая часть стержня, после пропуска экзона 51, и восстановление функции мышц терапевтическими уровнями у мышей. Экзон пропускающие продукты- несколько форм дистрофина, в структуре которых есть недостаток в части молекулярной структуры в зависимости от пропущенных экзонов, молекулярная структура дистрофина составлена из актин-обязательной области 1 в N-конце (ABD1), центральной области стержня, содержащей 24 повторения подобных спектрину (R1-24), четырех областей стержня, вставку с 20 аминокислотами между повторениями подобными спектрину (сегмент 5), богатую цистеином область, и C-конец (рисунок 1b). До сих пор, в структуре дистрофина, сформированной после пропуска экзона 23, которая испытывает недостаток в половине 6-ого повторения подобного спектрину и части 7-ого, уменьшил патологию мышц и их функции у mdx мышей с точечной мутацией в экзоне 23. Эти результаты были совместимы с фактом, что удаление в структуре центральной области стержня у людей как правило приводит к умеренной МДБ. Однако, серьезность МДБ с удалениями в структуре включая стержень может измениться значительно,в стержне есть богатые пролином, невоспроизводимые сегменты, которые могут придавать гибкость дистрофину. Среди них области стержня закодированые экзонами 50 и 51, расположены между 19-ыми и 20-ыми повторениями подобными спектрину, и является склонным к делециям. Сообщалось, что стержень 3 более важен чем стержень 2 в предотвращении вырождения мыщц и созревания мыщц у микродистрофин ΔR4-R23/mdx трансгенных мышей. У дистрофина в структуре после пропуска экзона 51 предсказан недостаток в большей части стержня 3 (рисунок 1b); стержни 1, 2, 3, и 4 состоят из 75, 50, 43, и 72 остатка аминокислоты, соответственно. Маленький сегмент стержня 3, который кодируется следующим экзоном 51 состоит из 13 остатков аминокислоты с двумя пролинами и не был функциональным как стержень (рисунок 1c). Этот остающийся фрагмент делиться на сегменты, которые состоят из остатков 20 аминокислот с одним пролином и расположен между 15-ыми и 16-ыми повторениями подобными спектрину. Основанный на молекулярной структуре дистрофина, маленький сегмент стержня 3 мог бы действовать как "поворот", который связан со спиралью 20-ого повторения. Наши результаты предполагают, что стержень 3 более важен в коротком микродистрофине (167 kDa) чем в дистрофине во всю длину с недостатком в стержене 3 из-за пропуска экзона 51 (420 kDa). В структуре экспрессии дистрофина в скелетных мыщцах 20 % от нормального уровня были выделены умеренные фенотипы МДБ. Кроме того, 20-30 % восстановление в структуре экспрессии дистрофина привело к защите от дистрофии мышц и восстановлению функции скелетной мускулатуры у трансгенных mdx мышей. Как первый шаг, мы выявили оптимальные последовательности AO включая mB30 для пропуска экзона 51. Определенные последовательности AO были оценены в эффективности пропуска экзона, используя основанные на клетках экспериментальные системы. Однако, в естественных условиях эффективность ФМО, которые довольно трудно поставить в клетки млекопитающих в культуре из-за их нейтральной химии, могла отличаться от этого in vitro. Поэтому, мы исследовали mdx52 мышей для проверки последовательностей AO для пропуска экзона 51 внутримышечной инъекцией в естественных условиях. Мы также показали, что одновременная поставка двух последовательностей AO, направленных и против 3 ′ и против 5′ сайтов сплайсинга, стимулировала пропуск экзона 51 более эффективно чем любая или две последовательности AO, предназначающиеся для области экзона у mdx52 мышей. Эта комбинация AO работала синергистическим способом, где увеличение действия было больше чем совокупный эффект каждого отдельного AO. Мы обнаружили, что пропускающая эффективность, вызванная систематически поставленным PMO, увеличилась пропорционально дозе AO у mdx52 мыши. О зависимом от дозы восстановлении экспрессии дистрофина в мышцах mdx мышей систематически поставленным ФМО также сообщали, терапевтическая доза (320 мг/кг/дозы) AO у mdx52 мыши, чтобы вызвать 20-30 % уровней дистрофина приблизительно в четыре раза больше дозы (80 мг/кг/дозы), требуемой для пропуска экзона 23 у mdx мыши. Мы должны рассмотреть возможность, что различие генетического фона мышей mdx52 (C57BL/6J) и mdx (C57BL/10) могло влиять на свойства пропуска экзона. Наши результаты предполагают, что терапевтическая доза требуемого AO отличается, в зависимости от экзона. Поскольку пропуск экзона при помощи AO воздействует на первую модуляцию РНК, это исследование, используя мышей, как модель МДД, могло предположить человеческие эквиваленты доз, основанных на площади поверхности тела. Недавно, пресс-релизы для PRO051 и для AVI-4658 показали, что пациенты с МДД, которые получили 2-6 и 2-20 мг/кг, соответственно, вызвали определенный пропуск экзона 51 и экспрессию дистрофина в связи с дозой. В этом исследовании уровень экспрессии дистрофина у рассматриваемых mdx52 мышей вернулся примерно к 2030 % нормальных уровней, и уровней КФК и функции мышц, значительно восстановленной у рассматриваемых мышей. Эти результаты показывают, что дистрофин, который в структуре испытывает недостаток в большей части стержня 3, снижает выраженность патологии на гистологическом уровне. С другой стороны, выносливость при механическом труде рассматриваемых mdx52 мышей была все еще значительно ниже, чем у мышей дикого типа по сравнению с восстановлением силы передней конечности и определенной тетанической силы длинного разгибателя пальцев. Эти результаты подобны данным, произведенным, используя микродистрофин у mdx мышей. У нас есть две теории для объяснения неполного восстановления: недостаточная экспрессия дистрофина или дефектная молекулярная структура дистрофина из-за пропуска экзона 51. Чтобы исследовать эти возможности, мы теперь пытаемся увеличить уровень экспрессии дистрфина, используя большую дозу ФМО и используя поставленный пептидом ФМО у mdx52 мышей. Улучшение гистопатологии, продемонстрированной сокращением центрально образованных ядер в волокнах у рассматриваемых mdx52 мышей, было отмечено в мускулах с высокими уровнями экспрессии дистрофина, эффект был незначителен в мышцах с низкими уровнями дистрофина, в соответствии с предыдущим отчетом. Это примечательно, что более высокие уровни экспрессии дистрофина замечены в мышцах с выраженной патологией, и что низкие уровни экспрессии были найдены в менее затронутых мускулах. Мы предлагаем возможность, что антигравитационные мышцы, такие как квадрицепс, передняя большеберцовая мышца, трицепс, брюшные и спинные мышцы эффективно включили ФМО в волокна. Мы показали, что антигравитационные мускулы были, главным образом, затронуты у mdx52 мышей во время периода, который мы исследовали; поэтому, мышцы усвоили большинство AO. Наша хрупкая мембранная гипотеза была предложена как фон для проникновения ФМО в мышцы с дистрофическими изменениями. Эта гипотеза также, объясняет неэффективное проникновение ФМО в диафрагму, где дистрофические изменения хронически сохранились, как ранее сообщающийся. Чтобы проверить на изменения в уровнях экспрессии гена под мы выполнили анализ экспрессии гена. Воспалительные хемокины Ccl2, Ccl7, и Ccl21b снижались после лечения, они играют важную роль в перемещении макрофагов, CD4 + и CD8 + T клеток, также известно, что истощение этих клеток у mdx мышей уменьшило повреждение сарколеммы. Эти данные показали, что воспалительный процесс, который мог ухудшить патологию, был предотвращен у mdx52 мышей. Измерение уровня хемокинов могло бы быть индексом терапевтических эффектов у mdx52 мышей. В заключение этот отчет описывает первое успешное усилие системного восстановления дистрофина, в структуре которого есть недостаток в большей части стержня 3, и функции мышц ФМО-установленным пропуском экзоном 51 у мышей, модели МДД. Поскольку структура дистрофина, испытывающего недостаток в большей части стержня 3 у мышей, напоминает человеческий дистрофин после пропуска экзона 51, наши результаты чрезвычайно ободряющие, для продолжающихся системных клинических испытаний при МДД. Кроме того, терапевтическая доза у мышей предлогает теоретически эквивалентную дозу у людях. Материалы и Методы Животные. Мdx52 мыши были произведены направленной генной стратегией. Восьминедельные mdx52 самцы и мыши WT использовались в этом исследовании. Все экспериментальные протоколы в этом исследовании были одобрены Экспериментальным Комитетом по Уходу за животными и b[ Использованию Национального Института Нейробиологии, Национального Центра Невралгии и Психиатрии (NCNP), Токио, Япония. Последовательности антисмысловых олигонуклеатидов и способы доставки. Тринадцать AO для пропуска экзона 51 во время сплайсинга прем РНК дистрофина у мышей были разработаны, чтобы связываться с 5′ сайтом сплайсинга(51A), 3′ сайтом сплайсинга(51D), и другими областями внутри экзонов (51B, 51C, 51E, 51F, 51 г, 51-ый, 51I, 51J, 51 K, 51L, 51M). Последовательности и положения AO описаны в Таблице 1. mB30, которая соответствует человеческому Б30, было также специально предназначено для этого исследования. Чтобы проектировать эти последовательности, мы использовали ранее разработанные последовательности и считали переднюю большеберцовцю мышцу подходящей структурой, чтобы избежать само - и гетеродимеризации. Все последовательности синтезировались, используя основу морфолино(Генные Инструменты, Philomath, Орегон). Десять микрограммов ФMO были введены в каждый мускул ПБМ mdx52 мышей. Мышцы были получены спустя 2 недели после внутримышечной инъекции. Чтобы исследовать оптимальную терапевтическую дозу, в общей сложности 80 (касательно 15), 160 или 320 мг/кг/дозы AO были введены в вену хвоста mdx52 мышей отдельно. Мышцы были изолированы спустя 2 недели после системной инъекции и проанализированы От-ПЦР и иммуногистохимически. После исследования повышения дозы доза 320 мг/кг ФМО в 200 мкл физ. раствора, 50 или 200 мкл, была введена в вену хвоста mdx52 мышей или мышей WT, семь раз c еженедельныv интервалjv. Мыши были исследованы спустя 2 недели после заключительной инъекции. М немедленно заморожены в охлажденном жидким азотом изопентане и сохранены при −80 °C для ОТ-ПЦР, иммуногистохимии, вестерн блот анализа, и анализа экспрессии гена. Печень и почки были также заморожены в жидком азоте и сохранены при −80 °C для патологического анализа. ОТ-ПЦР и упорядочивание КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ДНК. Полная РНК была извлечена из клеток или замороженных секций ткани, используя TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) у рассматриваемых mdx52 мышей, и от WT и контрольных mdx52 мышей. Двести нанограммов полного шаблона РНК использовались для ОТПЦР с комплектом Транскрипции QuantiTect (Qiagen, Кроули, Великобритания) согласно инструкциям изготовителя. Продукт КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ДНК (1 мкл) тогда использовался в качестве шаблона для ПЦР в 25 мкл с 0.125 единицами полимеразы TaqDNA (Qiagen). Смесь реакции включала 10× буфер ПЦР ( Базель, Швейцария), 10 ммоль/л каждого dNTP (Qiagen), и 10 ммоль/л каждого праймера. Последовательности праймера были Ex50F 5 ′-TTTACTTCGGGAGCTGAGGA-3 ′ и Ex53R 5 ′-ACCTGTTCGGCTTCTTCCTT-3 ′ для увеличения КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ДНК от экзонов 50-53. Условия были 95 °C в течение 4 минут, 35 циклов 94 °C в течение 1 минуты, 60 °C в течение 1 минуты, 72 °C в течение 1 минуты, и наконец 72 °C в течение 7 минут. Интенсивность групп ПЦР была проанализирована при использовании программного обеспечения ImageJ, и пропускающая эффективность была вычислена при использовании следующей формулы [(интенсивность пропущенной группы) / (интенсивность пропущенной группы + интенсивность непропущенной группы)]. После того, как получающиеся группы ПЦР были извлечены, используя комплект извлечения геля (Qiagen), прямое упорядочивание продуктов ПЦР было выполнено Биоматричной Лабораторией (Чиба, Япония). Иммуногистохимия и окрашивание гематоксилином, эозином. По крайней мере десять 8 мкм криосекций были окращены. Последовательные секции были обработанны поликлональными антителами кролика P7 против области прута дистрофина(подарок от Ци-Лонга Лу, Медицинского центра Каролины, Шарлотты, Северная Каролина), антиα-саркогликан моноклональными антителами кролика (Лаборатории Novocastra, Ньюкасл, Великобритания), анти-βдистрогликан моноклональными антителами мыши (Лаборатории Novocastra), анти-α 1-синтрофин моноклональными антителами мыши (Лаборатории Novocastra), анти-NO синтаза мноклональными антителами кролика (Zymed, Сан-Франциско, Калифорния), и анти-утрофин поликлональными антителами кролика. Алекса-488 или 568 (Молекулярные Исследования, Кембридж, Великобритания) использовалась в качестве вторичного антитела. 4 ′, 6-диамидино-2-фенилиндол (Vectashield; Векторные Лаборатории, Берлингейм, Калифорния), использовался для ядерного контрастного окрашивания. Максимальное количество дистрофин-положительных волокон в одной секции было посчитано, и размеры волокна ПБМ были оценены, используя флюоресцентный микроскоп BZ-9000 (Keyence, Осака, Япония). Hematoxylin и eosin (H&E) окрашивание были выполнены, используя Харриса H&E. Вестерн блот анализ. Белок мышц из криосекций был извлечен буферным лизисом как описано ранее , два двадцать микрограммов белка были загружены на 5-15 % XV Гелей Pantera (DRC, Токио, Япония). Образцы были переданы на мембрану Immobilon polyvinylidene (Millipore, Биллерика, Массачусетс) полусухи в 5 мA/мм2 в течение 1.5 часов. Мембрана была выведена с C-терминальными моноклональными антителами Dys2 (Novocastra) при комнатной температуре в течение 1 часа. Связанное основное антитело было обнаружено пероксидазой с антимышинными антителами козы IgG (Cedarlane, Берлингтон, НА) и хемилюминесцентным основанием (Проникните, Рокфорд, Иллинойс). Анти-β-актиновые антитела использовалось в качестве контроля. Интенсивность сигнала обнаруженных групп пятен была определена количественно, используя программное обеспечение ImageJ и нормализована к контролю. Уровни КФК сыворотки и тесты токсичности. Четыре mdx52 мыши были исследованы на ядовитые эффекты ФMO перед инъекцией, спустя 1 неделю после третьей инъекции, и спустя 2 недели после последней инъекции. Кровь была взята из артерии хвоста и центрифугировалась при 3 000 г в течение 10 минут. Биохимические маркеры: КФК, электролиты (натрий, калий, и ионы хлорида), азот мочевины крови, общий билирубин, щелочная фосфатаза, АЛТ, и АСТ были оценены как описано ранее, гистология печени, легкого и почек была исследована тщательно. Функциональное тестирование. Мыши выполняли в однообразный механический труд ЗНАКА-680S (Muromachi Kikai, Токио, Япония) и вынуждены достигнуть 5 м/мин в течение 5 минут. После 5 минут скорость увеличивалась на 1 м/минуту каждую минуту. Тест был остановлен, когда мышь уставала и не пыталась повторить пробу, и время истощения было определено. Сила сжатия у мышей была оценена метром силы сжатия (ЗНАК-380M; Muromachi Kikai). Мыши удерживались в 2 см от основы, имея возможность захватить металлический провод их передними конечностями, и натянутый мягко, пока они не выпустили его. Пять последовательных тестов на проявленную силу были выполнены для каждой мыши, с 5-секундными интервалами, и данные были усреднены. Длинный разгибатель пальцев был сохранен в растворе Krebs-Henseleit при 25 °C и стимулировался парой платиновых электродов, используя электронный стимулятор (СЕНАТОР 3301; Nihon Kohden, Токио, Япония). Arraycorder (WR300; Graphtec, Йокогама, Япония), использовался, чтобы управлять возбуждением и сделать запись силы сокращения мускула. Измерение определенной тетанической силы было выполнено как ранее описано. Анализ экспрессии гена. ПБМ от mdx52, подобранного возрастом WT, и контрольным mdx52 мышам (n = 3 каждый) использовались для этих экспериментов. Полная РНК была очищена, используя мини-комплект RNeasy (Qiagen) согласно протоколу изготовителя. Анализ множества экспрессии гена был выполнен отделением Agilent Technologies (Санта-Клара, Калифорния) в Японии. Три целых генома мыши (Agilent Technologies) использовались в этом исследовании. Глобальная нормализация была выполнена, чтобы сравнить гены от чипа до использования чипа GeneSpring 9.0 (Tomy Цифровая Биология, Denver, CO). Весь контроль качества данных был выполнен Affymetrix. Анализ данных был выполнен, используя GeneSpring 9.0 (Tomy Цифровая Биология). Дифференцированно выраженные гены были отобраны, если они прошли t-тест, параметрический тест, в котором различие, как предполагается, не равно. P <0.01 (с исправлением для многократного тестирования методом Benjamini и Hochberg для ложного уровня открытия) и 5%-ое сокращение между любыми двумя из групп, используемых в этом исследовании, считали существенным. Количественный ПЦР в реальном времени. Для генов, отобранных для множества экспрессии гена, мы использовали ту же самую РНК, которая была изолирована для множества экспрессии гена и готовую КОМПЛЕМЕНТАРНОЙ ДНК, используя Транскриптазу Суперподлинника III (Invitrogen). ПЦР в реальном времени был выполнен, используя Премикс SYBR комплектом Тэка II (Takara, Токио, Япония). Ценности экспрессии были нормализованы к 18 rRNA экспресии. Трансфекция культивируемых клеток AO. 5017 клеток с МДД были получены от Coriell (Камден, НьюДжерси). Фибробласты были культивированы в 20%-ой питательной среде, содержащую среду Орла Далбекко и F12 в 1:1 смесь (Invitrogen), 20%-ая эмбриональную бычью сыворотку (Биологические науки SAFC, Ленекса, Канзас) и 1%-ый пенициллин/стрептомицин (Sigma-Aldrich, Св. Луи, МО). Тогда, активизированная флюоресценцией клетки сортированы по MyoD-расширенной зеленой флуоресценции, фибробласты (MyoD-переделанные фибробласты) были культивированы в среде дифференцирования, содержащей измененную среду Орла Далбекко medium/F-12 в 1:1 смесь (Invitrogen), 2%-ая сыворотку лошади (Invitrogen), и 1%-ый пенициллин/стрептомицин (Sigma-Aldrich). hDo1, hDo2, и hAc были разработаны (Таблица 1) и синтезированы Генными Инструментами. MyoD-переделанные фибробласты были инфицированы одним или двумя AO при заключительной концентрации 10 мкмоль/л. EndoPorter (Генные Инструменты) был добавлен, чтобы дать заключительную концентрацию 6 мкмоль/л. После 48часовой инкубации с AO полная РНК была извлечена из MyoD-переделанных фибробластов Trizol (Invitrogen). Статистический анализ. Статистические различия были оценены односторонним дисперсионным анализом с различиями среди групп, оцененных сравнением Tukey. Данные представлены в виде ± SEM. Уровень значимости P <0.05. Ссылки Hoffman, EP, Brown, RH Jr and Kunkel, LM (1987). Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51: 919–928. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Monaco, AP, Bertelson, CJ, Liechti-Gallati, S, Moser, H and Kunkel, LM (1988). An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics 2: 90–95. | Article | PubMed | ChemPort | Wilton, SD, Fall, AM, Harding, PL, McClorey, G, Coleman, C and Fletcher, S (2007). Antisense oligonucleotide-induced exon skipping across the human dystrophin gene transcript. Mol Ther 15: 1288–1296. | Article | PubMed | ChemPort | Aartsma-Rus, A, Bremmer-Bout, M, Janson, AA, den Dunnen, JT, van Ommen, GJ and van Deutekom, JC (2002). Targeted exon skipping as a potential gene correction therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord 12 Suppl 1: S71–S77. | Article | PubMed | ISI Matsuo, M, Masumura, T, Nishio, H, Nakajima, T, Kitoh, Y, Takumi, T et al. (1991). Exon skipping during splicing of dystrophin mRNA precursor due to an intraexon deletion in the dystrophin gene of Duchenne muscular dystrophy kobe. J Clin Invest 87: 2127–2131. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Muntoni, F, Torelli, S and Ferlini, A (2003). Dystrophin and mutations: one gene, several proteins, multiple phenotypes. Lancet Neurol 2: 731–740. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Dunckley, MG, Manoharan, M, Villiet, P, Eperon, IC and Dickson, G (1998). Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum Mol Genet 7: 1083–1090. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | van Deutekom, JC, Bremmer-Bout, M, Janson, AA, Ginjaar, IB, Baas, F, den Dunnen, JT et al. (2001). Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum Mol Genet 10: 1547–1554. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Aartsma-Rus, A, De Winter, CL, Janson, AA, Kaman, WE, Van Ommen, GJ, Den Dunnen, JT et al. (2005). Functional analysis of 114 exon-internal AONs for targeted DMD exon skipping: indication for steric hindrance of SR protein binding sites. Oligonucleotides 15: 284–297. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Wilton, SD, Lloyd, F, Carville, K, Fletcher, S, Honeyman, K, Agrawal, S et al. (1999). Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides. Neuromuscul Disord 9: 330–338. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Arechavala-Gomeza, V, Graham, IR, Popplewell, LJ, Adams, AM, Aartsma-Rus, A, Kinali, M et al. (2007). Comparative analysis of antisense oligonucleotide sequences for targeted skipping of exon 51 during dystrophin pre-mRNA splicing in human muscle. Hum Gene Ther 18: 798–810. | Article | PubMed | ChemPort | Beggs, AH, Hoffman, EP, Snyder, JR, Arahata, K, Specht, L, Shapiro, F et al. (1991). Exploring the molecular basis for variability among patients with Becker muscular dystrophy: dystrophin gene and protein studies. Am J Hum Genet 49: 54– 67. | PubMed | ISI | ChemPort | Aartsma-Rus, A, Janson, AA, Kaman, WE, Bremmer-Bout, M, den Dunnen, JT, Baas, F et al. (2003). Therapeutic antisenseinduced exon skipping in cultured muscle cells from six different DMD patients. Hum Mol Genet 12: 907–914. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Yokota, T, Lu, QL, Partridge, T, Kobayashi, M, Nakamura, A, Takeda, S et al. (2009). Efficacy of systemic morpholino exonskipping in Duchenne dystrophy dogs. Ann Neurol 65: 667–676. | Article | PubMed | ChemPort | Alter, J, Lou, F, Rabinowitz, A, Yin, H, Rosenfeld, J, Wilton, SD et al. (2006). Systemic delivery of morpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophic pathology. Nat Med 12: 175–177. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Lu, QL, Mann, CJ, Lou, F, Bou-Gharios, G, Morris, GE, Xue, SA et al. (2003). Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nat Med 9: 1009–1014. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Bremmer-Bout, M, Aartsma-Rus, A, de Meijer, EJ, Kaman, WE, Janson, AA, Vossen, RH et al. (2004). Targeted exon skipping in transgenic hDMD mice: a model for direct preclinical screening of human-specific antisense oligonucleotides. Mol Ther 10: 232–240. | Article | PubMed | ChemPort | Fletcher, S, Honeyman, K, Fall, AM, Harding, PL, Johnsen, RD and Wilton, SD (2006). Dystrophin expression in the mdx mouse after localised and systemic administration of a morpholino antisense oligonucleotide. J Gene Med 8: 207–216. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Gebski, BL, Mann, CJ, Fletcher, S and Wilton, SD (2003). Morpholino antisense oligonucleotide induced dystrophin exon 23 skipping in mdx mouse muscle. Hum Mol Genet 12: 1801–1811. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Aartsma-Rus, A, Fokkema, I, Verschuuren, J, Ginjaar, I, van Deutekom, J, van Ommen, GJ et al. (2009). Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum Mutat 30: 293–299. | Article | PubMed Aartsma-Rus, A, Van Deutekom, JC, Fokkema, IF, Van Ommen, GJ and Den Dunnen, JT (2006). Entries in the Leiden Duchenne muscular dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule. Muscle Nerve 34: 135–144. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Prior, TW, Bartolo, C, Pearl, DK, Papp, AC, Snyder, PJ, Sedra, MS et al. (1995). Spectrum of small mutations in the dystrophin coding region. Am J Hum Genet 57: 22–33. | PubMed | ChemPort | van Deutekom, JC, Janson, AA, Ginjaar, IB, Frankhuizen, WS, Aartsma-Rus, A, Bremmer-Bout, M et al. (2007). Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med 357: 2677–2686. | Article | PubMed | ChemPort | Kinali, M, Arechavala-Gomeza, V, Feng, L, Cirak, S, Hunt, D, Adkin, C et al. (2009). Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, doseescalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol 8: 918–928. | Article | PubMed | ChemPort | Helderman-van den Enden, AT, Straathof, CS, Aartsma-Rus, A, den Dunnen, JT, Verbist, BM, Bakker, E et al. (2010). Becker muscular dystrophy patients with deletions around exon 51; a promising outlook for exon skipping therapy in Duchenne patients. Neuromuscul Disord 20: 251–254. | Article | PubMed Hoffman, EP, Kunkel, LM, Angelini, C, Clarke, A, Johnson, M and Harris, JB (1989). Improved diagnosis of Becker muscular dystrophy by dystrophin testing. Neurology 39: 1011–1017. | PubMed | ISI | ChemPort | Koenig, M and Kunkel, LM (1990). Detailed analysis of the repeat domain of dystrophin reveals four potential hinge segments that may confer flexibility. J Biol Chem 265: 4560–4566. | PubMed | ISI | ChemPort | Carsana, A, Frisso, G, Tremolaterra, MR, Lanzillo, R, Vitale, DF, Santoro, L et al. (2005). Analysis of dystrophin gene deletions indicates that the hinge III region of the protein correlates with disease severity. Ann Hum Genet 69(Pt 3): 253–259. | Article | PubMed Baumbach, LL, Chamberlain, JS, Ward, PA, Farwell, NJ and Caskey, CT (1989). Molecular and clinical correlations of deletions leading to Duchenne and Becker muscular dystrophies. Neurology 39: 465–474. | PubMed | ISI | ChemPort | Gillard, EF, Chamberlain, JS, Murphy, EG, Duff, CL, Smith, B, Burghes, AH et al. (1989). Molecular and phenotypic analysis of patients with deletions within the deletion-rich region of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene. Am J Hum Genet 45: 507–520. | PubMed | ISI | ChemPort | Koenig, M, Beggs, AH, Moyer, M, Scherpf, S, Heindrich, K, Bettecken, T et al. (1989). The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion. Am J Hum Genet 45: 498–506. | PubMed | ISI | ChemPort | Coral-Vázquez, R, Arenas, D, Cisneros, B, Peñaloza, L, Kofman, S, Salamanca, F et al. (1993). Analysis of dystrophin gene deletions in patients from the Mexican population with Duchenne/Becker muscular dystrophy. Arch Med Res 24: 1–6. | PubMed | Araki, E, Nakamura, K, Nakao, K, Kameya, S, Kobayashi, O, Nonaka, I et al. (1997). Targeted disruption of exon 52 in the mouse dystrophin gene induced muscle degeneration similar to that observed in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun 238: 492–497. | Article | PubMed Aartsma-Rus, A, Kaman, WE, Weij, R, den Dunnen, JT, van Ommen, GJ and van Deutekom, JC (2006). Exploring the frontiers of therapeutic exon skipping for Duchenne muscular dystrophy by double targeting within one or multiple exons. Mol Ther 14: 401–407. | Article | PubMed | ChemPort | De Angelis, FG, Sthandier, O, Berarducci, B, Toso, S, Galluzzi, G, Ricci, E et al. (2002). Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells. Proc Natl Acad Sci USA 99: 9456–9461. | Article | PubMed | ChemPort | Aartsma-Rus, A, van Vliet, L, Hirschi, M, Janson, AA, Heemskerk, H, de Winter, CL et al. (2009). Guidelines for antisense oligonucleotide design and insight into splice-modulating mechanisms. Mol Ther 17: 548–553. | Article | PubMed | ChemPort | Adams, AM, Harding, PL, Iversen, PL, Coleman, C, Fletcher, S and Wilton, SD (2007). Antisense oligonucleotide induced exon skipping and the dystrophin gene transcript: cocktails and chemistries. BMC Mol Biol 8: 57. | Article | PubMed | ChemPort | Banks, GB, Judge, LM, Allen, JM and Chamberlain, JS (2010). The polyproline site in hinge 2 influences the functional capacity of truncated dystrophins. PLoS Genet 6: e1000958. | Article | PubMed Yoshimura, M, Sakamoto, M, Ikemoto, M, Mochizuki, Y, Yuasa, K, Miyagoe-Suzuki, Y et al. (2004). AAV vector-mediated microdystrophin expression in a relatively small percentage of mdx myofibers improved the mdx phenotype. Mol Ther 10: 821–828. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Wells, DJ, Wells, KE, Asante, EA, Turner, G, Sunada, Y, Campbell, KP et al. (1995). Expression of human full-length and minidystrophin in transgenic mdx mice: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet 4: 1245–1250. | Article | PubMed | ISI | ChemPort | Mitrpant, C, Adams, AM, Meloni, PL, Muntoni, F, Fletcher, S and Wilton, SD (2009). Rational design of antisense oligomers to induce dystrophin exon skipping. Mol Ther 17: 1418–1426. | Article | PubMed Wang, Q, Yin, H, Camelliti, P, Betts, C, Moulton, H, Lee, H et al. (2010). In vitro evaluation of novel antisense oligonucleotides is predictive of in vivo exon skipping activity for Duchenne muscular dystrophy. J Gene Med 12: 354–364. | Article | PubMed Wu, B, Lu, P, Benrashid, E, Malik, S, Ashar, J, Doran, TJ et al. (2010). Dose-dependent restoration of dystrophin expression in cardiac muscle of dystrophic mice by systemically delivered morpholino. Gene Ther 17: 132–140. | Article | PubMed Reagan-Shaw, S, Nihal, M and Ahmad, N (2008). Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J 22: 659– 661. | Article | PubMed | ChemPort | de Lateur, BJ and Giaconi, RM (1979). Effect on maximal strength of submaximal exercise in Duchenne muscular dystrophy. Am J Phys Med 58: 26–36. | PubMed | Shivers, RR and Atkinson, BG (1984). The dystrophic murine skeletal muscle cell plasma membrane is structurally intact but “leaky” to creatine phosphokinase. A freeze-fracture analysis. Am J Pathol 116: 482–496. | PubMed | Heemskerk, H, de Winter, C, van Kuik, P, Heuvelmans, N, Sabatelli, P, Rimessi, P et al. (2010). Preclinical PK and PD studies on 2'-O-methyl-phosphorothioate RNA antisense oligonucleotides in the mdx mouse model. Mol Ther 18: 1210–1217. | Article | PubMed | ChemPort | Porter, JD, Guo, W, Merriam, AP, Khanna, S, Cheng, G, Zhou, X et al. (2003). Persistent over-expression of specific CC class chemokines correlates with macrophage and T-cell recruitment in mdx skeletal muscle. Neuromuscul Disord 13: 223–235. | Article | PubMed | ISI Demoule, A, Divangahi, M, Danialou, G, Gvozdic, D, Larkin, G, Bao, W et al. (2005). Expression and regulation of CC class chemokines in the dystrophic (mdx) diaphragm. Am J Respir Cell Mol Biol 33: 178–185. | Article | PubMed Lu, QL, Rabinowitz, A, Chen, YC, Yokota, T, Yin, H, Alter, J et al. (2005). Systemic delivery of antisense oligoribonucleotide restores dystrophin expression in body-wide skeletal muscles. Proc Natl Acad Sci USA 102: 198–203. | Article | PubMed | ChemPort | Spitali, P, Heemskerk, H, Vossen, RH, Ferlini, A, den Dunnen, JT, ‘t Hoen, PA et al. (2010). Accurate quantification of dystrophin mRNA and exon skipping levels in Duchenne Muscular Dystrophy. Lab Invest (epub ahead of print) Переведено проектом МОЙМИО http://www.mymio.org/ Оригинальная статья http://www.nature.com/mt/journal/v18/n11/full/mt2010186a.html
