Waters Waters AccQ Tag Amino Acid Analysis Method ОПИСАНИЕ МЕТОДА

advertisement
Waters
Waters AccQ Tag Amino Acid Analysis Method
ОПИСАНИЕ МЕТОДА
-2-
СОДЕРЖАНИЕ.
I
II
ВВЕДЕНИЕ. _________________________________________________________ 3
I.1
Описание химических реакций. ____________________________________________ 3
I.2
Сравнение методов анализа аминокислот.____________________________________ 4
I.3
Набор реагентов AccQ Fluor. _______________________________________________ 5
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ. __________________________________________________ 6
II.1 Приготовление реагента. __________________________________________________ 6
II.2 Использование реагента ___________________________________________________ 6
II.3 Дериватизация калибровочного стандарта. __________________________________ 7
II.4 Дериватизация образцов. __________________________________________________ 7
III HPLC МЕТОД ________________________________________________________ 8
III.1
Стандартный AccQ Tag метод. ___________________________________________ 8
III.2
Использование метода с двухкомпонентным градиентом ____________________10
IV ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА С УФ-ДЕТЕКЦИЕЙ. ___________________ 11
V
АНАЛИЗ СЛОЖНЫХ ОБРАЗЦОВ. ____________________________________ 13
V.1 Анализ образцов, содержащих Cysteine и Metionine. __________________________13
V.1.1
V.1.2
V.1.3
Дисульфидный обмен.________________________________________________________ 15
Окисление перформиковой кислотой. ___________________________________________ 16
Алкилация сульфогидрильной группы___________________________________________ 18
V.2 Анализ энзиматичных гидролизатов. _______________________________________ 20
V.2.1
V.2.2
V.2.3
Приготовление модифицированного элюэнта А. __________________________________ 20
Подготовка калибровочного стандарта, содержащего Asn, Gln и Trp. __________________ 21
Подготовка образца. _________________________________________________________ 21
V.3 Анализ коллагеновых гидролизатов. ________________________________________ 22
V.3.1
V.3.2
V.3.3
Анализ гликопротеиновых гидролизатов. ________________________________________ 23
Приготовление модифицированного элюэнта А. __________________________________ 23
Приготовление стандарта с GalNH2 и GlсNH2. ____________________________________ 24
VI НОМЕРА ПО КАТАЛОГУ ____________________________________________ 25
VII ГИДРОЛИЗ ОБРАЗЦОВ. _____________________________________________ 26
-3-
I
I.1
ВВЕДЕНИЕ.
ОПИСАНИЕ ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ.
Метод AccQ Tag ( акью таг ) основан на применении дериватизационного
реагента, специально синтезированного для анализа аминокислот. 6-aminoquinolyl-Nhydrozysuccinimidyl carbamate ( ACQ ) представляет собой an N-hydroxysuccinimideactivated hetrocyclic carbamate – новый класс амино-дериватизирующих химикатов.
Реагент AccQFluor превращает как первичные так и вторичные
аминокислоты в стабильные флюоресцирующие деривативы.
Излишек реагента быстро гидролизуется, продуцируя 6aminoquinoline ( AMQ ), N-hydroxysuccinimide, (NHS) и двуокись
углерода, которые не мешают разделению и детекции
аминокислот.
Процесс дериватизации очень прост и состоит в добавлении реагента к образцу с
определенным рН и последующем нагреве. Обычные буферы и детергенты имеют очень
слабое влияние на реакцию и на воспроизводимость результатов.
Реакция дериватизации аминокислот
Гидролиз реагента.
-4-
I.2
Детекция
Чувствительность
Стабильность
деривативов
Кинетика
реакции
Вторичные
аминокислоты
Полное
разделение всех
пиков
СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ АНАЛИЗА АМИНОКИСЛОТ.
DABS-CI
PITC
FMOC-CI
OPA
УФ
УФ
Флюоро
Флюоро
Pmol
Pmol
Fmol
Fmol
Флюоро
/УФ
Fmol
отличная
хорошая
отличная
плохая
отличная
Медленная
Средняя
Быстрая
Быстрая
Быстрая
Да
Да
Да
Нет
Да
Да
Да
Нет
Да
Да
DABS-CI – 4-dimethylaminoazobenzene-sulfonychloride
PITC – phenyl isothiocyanate
FMOC-CI – 9-fuorenylmethyl chloroformate
OPA – ortho-phtalalehyde
AQC – 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate
AQC
-5-
I.3
НАБОР РЕАГЕНТОВ ACCQ FLUOR.
Набор реагентов AccQ Fluor содержит пять комплектов деривтизационных
реагентов, обеспечивающих проведение аминокислотного анализа по методу Waters
AccQ Tag. Каждый комплект состоит из пробирок со следующими веществами:
1. AccQ Fluor Borate Buffer – пробирка 1. Добавляется к образцу для создания
требуемого уровня рН.
2. AccQ Fluor Reagent Powder – пробирка 2А. Порошок дериватизационного реагента
6-aminoquinolil-N-hydrooxysuccinimidyl carbamate ( AQC ).
3. AccQ Fluor Reagent Diluent – пробирка 2В. Содержит растворитель ( ацетонитрил )
для разведения реагента.
Количества реагентов, содержащихся в наборе, достаточно для дериватизации 250
образцов.
Waters AccQ Tag метод заключается в дериватизации пептидных и протеиновых
гидролизатов аминокислот и содержит следующие основные этапы:
1. Дериватизация образцов и стандартов при помощи реагентов;
2. Разделение деривативов методом обращенно-фазовой хроматографии с
флюорометрической или УФ-детекцией;
3. Количественный расчет ( хроматографическая компьютерная программа ).
Чистота реагентов. Набор реагентов производится на заводе Waters,
сертифицированном в соответствии с требованиями ISO 9002. Набор содержит
минимальный аминокислотный фон.
Хранение. Набор реагентов AccQ Fluor может храниться при комнатной
температуре до 6 месяцев.
-6-
II
II.1
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАГЕНТА.
1. Нагрейте термостат до 55 оС;
2. Встряхните пробирку 2А, что бы весь порошок собрался на дне;
3. Промойте микропипетку 1 мл растворителя из пробирки 2В;
4. Перенесите 1 мл растворителя из пробирки 2В в пробирку 2А;
5. Плотно закройте пробирку 2А и встряхните;
6. Поставьте пробирку 2А в термостат и нагревайте до полного растворения порошка
( около 10 мин.).
Полученный раствор представляет собой примерно 10 мМ AQC в ацетонитриле.
*** Раствор может храниться в течении недели при комнатной температуре.
II.2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕАГЕНТА
Приготовленный в соответствии сразделом II.1 реагент используется для
образования стабильных флюоресцентных деривативов аминокислот.
*** Поставляемый калибровочный стандарт содержит по 2.5 мМ каждой аминокислоты за
исключением Cystine ( 1.25 мМ ). Возьмите 40 мкл стандарта и добавьте 960 мкл воды ( качества
Milli-Q ). Приготовленный раствор содержит 100 пМ/мкл каждой аминокислоты за исключением
Cystine ( 50 мМ/мкл ). Храните раствор при –20 оС до 1 месяца.
-7II.3
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ КАЛИБРОВОЧНОГО СТАНДАРТА.
Для дериватизации 100 пМ/мкл калибровочного стандарта проделайте следующее:
1. Нагрейте термостат до 55 оС;
2. Добавьте 10 мкл калибровочного стандарта в пробирку ( лучше сразу использовать
мкл коническую вставку для стандартной пробирки автосамплера );
3. Добавьте в пробирку 70 мкл боратного буфера и пробирки 1;
4. Добавьте 20 мкл реагента AccQ Fluor и встряхните пробирку;
5. Оставьте пробирку на 1 мин при комнатной температуре;
6. Прогрейте пробирку в термостате в течении 10 мин.
*** Нагревание превращает побочный продукт тирозина в моно-дериватизированный компонент. При
комнатной температуре превращение идет гораздо медленнее.
5 мкл инжекция стандарта содержит 50 пмоль каждой аминокислоты за исключением
цистина ( 25 пмоль ).
II.4
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ ОБРАЗЦОВ.
Прежде чем дериватизировать сухие образцы, необходимо снова перевести их в
раствор.
Приготовьте 20 мМ раствор HCl добавлением 10 мкл 6-нормальной соляной кислоты в 3
мл деионизованной воды ( типа Milli Q ).
1. Добавьте в пробирку с сухим образцом 20 мкл 20 мМ HCl;
2. Нагрейте термостат до 55 оС;
3. Добавьте в пробирку 60 мкл боратного буфера и пробирки 1;
4. Добавьте 20 мкл реагента AccQ Fluor и встряхните пробирку;
5. Оставьте пробирку на 1 мин при комнатной температуре;
6. Прогрейте пробирку в термостате в течении 10 мин.
*** Дериватизованные образцы могут храниться 1 неделю при комнатной
температуре.
-8-
III
HPLC МЕТОД
III.1 СТАНДАРТНЫЙ ACCQ TAG МЕТОД.
Для анализа используется специальная колонка Waters AccQ Tag. Рекомендуется
использование предколонки Nova Pack C18.
Метод элюции – градиентный, скорость потока 1 мл/мин.
Таблица градиента.

Время
%А
%В
%С
Кривая
Нач. условия
100
0
0
0.5
99
1
0
11
18
95
5
0
6
19
91
9
0
6
28
83
17
0
6
35
0
60
40
11
38
100
0
0
11
Элюэнт А – AccQ Tag Eluent A ( sodium acetate 19%, phosphoric acid 6-7% 3 ethyl amine 1 –2 %,
water, 72 –73%, sodium azide 0.1% ).

Элюэнт В – ацетонитрил.

Элюэнт С – вода.
Температура колонки 37 оС .
Для детекции используется флюориметр: λ EХ = 250 нм, λ EM = 395 нм.
Так же возможно использование УФ-детектора на длине волны 248 нм, хотя
чувствительность при этом будет ниже ( см, раздел IV ).
-9-
Для приготовления элюэнта А в лабораторных условиях проделайте следующее:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Отвесьте 190.4 г ацетата натрия;
Добавьте 1 л деионизованной воды ( типа milli-Q ) и размешайте;
Доведите рН растовора до 5.2 85% фосфориковой кислотой;
Добавьте 10 мл раствора EDTA ( концентрация 1 г/л );
Добавьте 23.7 мл триэтиламина ( 17.2 г );
Доведите рН до 5.02 фосфориковой кислотой.
Концентрированный раствор храниться до 6 месяцев при температуре 4 оС.
Рабочий элюэнт готовят смешиванием 100 мл концентрата и 1000 мл воды.
1.
AMQ
13.72
12.
Pro
28.45
2.
Asp
15.47
13.
Cys
32.06
3.
Hyp
17.98
14.
Tyr
32.51
4.
Ser
20.17
15.
Hyl1
32.97
5.
Glu
21.10
16.
Val
33.50
6.
Gly
22.17
17.
Hyl2
33.84
7.
His
22.85
18.
Met
34.17
8.
NH3
23.61
19.
Lys
36.26
9.
Arg
25.21
20.
Ile
37.36
10.
Thr
25.55
21.
Leu
37.90
11.
Ala
26.51
22.
Phe
39.07
- 10 -
III.2 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА С ДВУХКОМПОНЕНТНЫМ ГРАДИЕНТОМ
Анализ может быть проведен с бинарной градиентной системой.
Элюэнт А – Waters AccQ Tag Eluent.
Элюэнт В – смесь ацетонитрила с водой 60/40.
ТАБЛИЦА ГРАДИЕНТА
Time
Flow
%A
%B
Curve
Initial
1.0
100
0
0.5
1.0
98
2
6
15.0
1.0
97
7
6
19.0
1.0
90
10
6
32.0
1.0
67
33
6
33.0
1.0
67
33
6
34.0
1.0
0
100
6
37
1.0
0
100
6
38
1.0
100
0
6
64
1.0
100
0
6
65
1.0
0
100
6
100
1.0
0
100
6
- 11 -
IV
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА С УФ-ДЕТЕКЦИЕЙ.
При дериватизации образцов реагентом Waters AccQ Tag - 6-aminoquinolil-Nhydrooxysuccinimidyl carbamate ( AQC ), излишек реагента быстро гидролизуется, что
приводит к образованию 6-aminoquinoline ( AMQ ).
При использовании флюориметра отклик от AMQ более чем в два раза меньше
чем отклик самого маленького пика стандарта, при УФ-детекции пик вырастает более чем
в 200 раз. Это может приводить к плохому разделению между AMQ и Asp.
Чувствительность при УФ-детекции меньше в 2-20 раз в зависимости от
аминокислоты и составляет 0.5-1.0 pmol.
Готовый элюэнт А производства Waters содержит азид натрия ( для
предотвращения роста микробактериальной флоры ). Переход от одного элюэнта к
другому во время анализа приводит к изменению уровня базовой линии. Приготовление
элюэнта без азида натрия уменьшает сдвиг базовой линии. При приготовлении элюэнта
качество воды и триэтиламина имеют существенное значение. Соблюдение рН с
точностью 0.05 существенно для воспроизводимости.
Уменьшение рН элюэнта А на 0.1 увеличивает разделение между AMQ и Asp,
однако ухудшает разделение между Asp и Ser, Glu и Gly.
УФ-детекция дает улучшенную чувствительность по Trp ( 10 pmol ).
ПРИМЕР АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УФ-ДЕТЕКЦИИ.
Образец: Hydrolyzed Barley Meal.
Пробоподготовка:
1. 100 мкг образца гидролизованы 5 мл 6N HCl под аргоновым одеялом в течении 24
часов при 112 oC
2. добавлен внутренний стандарт ( Aab ), долита вода до 200 мл.
3. Отфильтрован 1 мл, 5 мкл из которого дериватизованы в соответствии со
стандартным протоколом AccQ Tag.
Концентрация образца: 0.5 мг/мл ( посля разведения ).
Объем инжекции: 10 мкл.
Элюэнты:
 A – Приготовлен из концентрата элюэнта А. рН доведен до 4.95 фосфориковой
кислотой;
 B – ацетонитрил;
 C – вода.
- 12 -
Таблица градиента.
Time
Flow
%A
%B
%C
%D
Curve
Initial
1.0
100
0
0
0
*
20
1.0
95
5
0
0
6
24
1.0
91
9
0
0
6
34
1.0
83
17
0
0
6
40
1.0
0
60
40
0
11
43
1.0
100
0
0
0
11
60
1.0
0
60
40
0
11
100
0.0
0
60
40
0
6
- 13 -
V
АНАЛИЗ СЛОЖНЫХ ОБРАЗЦОВ.
Сложные образцы могут содержать аминокислоты, не присутствующие в
калибровочном стандарте. Такие образцы могут требовать специальной пробоподготовки
и специальных хроматографических условий.
Рассматривается анализ следующих образцов:





Performic acid oxidised samples;
Cysteine modifications;
Glycoproteins with glucosamine or galactosamine;
Collagen-type samples with Hyp and Hyl;
Enzimatic digests ( samples with Asn and Gln ).
V.1
АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ, СОДЕРЖАЩИХ CYSTEINE И METIONINE.
Количественный анализ Cys в пептидных и белковых образцах затрудняется
нестабильностью этой аминокислоты в кислых условиях дериватизационного процесса.
Данный раздел описывает три метода для анализа цистеиновых деривативов.
Метод
Элюэнты, реагенты
Преимущества
Использование
стандартных
хроматографических
условий AccQ Tag,
хороший выход
цистеина.
Недостатки
Дисульфидный обмен
Требует добавления
DTDPA во время
гидролиза
Оксидация цистеина в
цистеиковую кислоту
( Cya ), метионина в
метионин сульфон
( metone )
перформиковой
кислотой
Требует добавления
перформиковой
кислоты в образец
перед гидролизом. рН
элюэнта отличен от
стандартного.
Улучшенный выход
Cys в виде Cya и Met в
виде Metone
Более сложная
пробоподготовка, Tyr
нестабилен, His
частично разрушается
Алкилация
сульфогидрильной
группы
Требует
нестандартных
реагентов и
модифицированного
элюэнта
Хороший выход
цистеина, образец
пригоден для
дальнейших
исследований
( секвенирование )
Сложная
пробоподготовка,
нестандартные
реагенты
- 14 Еще одна сложность состоит в том, что значительное количество цистеина
присутствует в виде димера ( Cys2), который необходимо перевести в мономер перед
алкилизацией. Приведены структуры основных деривативов цистеина.
Cysteine
HOOCCHCH2SH
│
NH2
Cystine
HOOCCHCH2S – SCH2CHCOOH
│
│
NH2
NH2
Cysteic Acid
HOOCCHCH2SO3-│
NH2
Homocysteine
HOOCCHCH2CH2SH
│
NH2
Homocystine
HOOCCHCH2CH2S – SCH2CH2CHCOOH
│
│
NH2
NH2
- 15 -
V.1.1
Дисульфидный обмен.
Метод дисульфидного обмена использует кислотный ( HCl ) гидролиз в
присутствии реагента 3,3’-dithiodipropionic acid ( DTDPA ) для перевода Cys и Cys2 в
стабильные дисульфиды. Дериватив выходит между Pro и Cys в стандартных условиях.
Анализ остальных аминокислот не нарушается.

Подготовка реагента.
Растворите DTDPA в 0.2 М NaOH в концентрации 1 мг/мл.

Подготовка стандартов.
1. Перенесите 10 мкл стандарта в пробирку.
2. Добавьте 10 мкл раствора DTDPA.
3. Высушите под вакуумом.
4. Гидролизуйте образец, используя стандартную процедуру.
5. Дериватизируйте стандарт в стандартных условиях Accq Tag.
5 мкл инжекция содержит 50 pmol всех аминокислот, включая деривативы цистеина.

Подготовка образца.
1. Высушите образец под вакуумом
2. Добавьте 10 мкл раствора DTDPA и высушите под вакуумом
3. Гидролизуйте образец, используя стандартную процедуру.
4. Дериватизируйте стандарт в стандартных условиях Accq Tag.
- 16 -
V.1.2 Окисление перформиковой кислотой.
Цистеин и в меньшей степени метионин нестабильны в стандартных условиях
гидролиза с серной кислотой. Для лучшего количественного определения этих
серосодержащих аминокислот можно окислить их перформиковой кислотой. В ходе
реакции цистеин и цистин образуют цистеиковую кислоту, а метионин – метионсульфон.

Подготовка образцов.
1. Приготовьте раствор перформиковой кислоты смешав в пропорции 19/1 ( по объему
) 97% муравьиную кислоту и 30% перекись водорода. Выдержите 1 час при 22 оС в
закрытом флаконе.
2. Высушите образцы под вакуумом
3. Добавьте 10 мкл раствора перформиковой кислоты к образцу и выдержите 30 мин при
комнатной температуре.
4. Высушите образцы под вакуумом
5. Гидролизуйте образец, используя стандартную процедуру.
6. Дериватизируйте образец в стандартных условиях Accq Tag.

Приготовление модифицированного элюэнта.
1. Растворите несколько pellets NaOH в 10 мл воды.
2. Разведите концентрат элюэнта А – 100 мл концентрата на 800 мл воды. РН такого
раствора должен быть в диапазоне 5.02 – 5.07.
3. Доведите рН элюэнта до величины 5.10 – 5.15 раствором NaOH.

Приготовление стандартов содержащих Cya и Metone.
Внешний стандарт.
1
Приготовьте 2.5 мМ растворы цистеиковой кислоты и метона в 0.1 мМ HCl.
2
Приготовьте рабочий стандарт, смешав в указанных пропорциях следующие
компоненты.
- 17 Компонент
Объем, мкл
Metone, 2.5 мМ
40
Cya, 2.5 мМ
Смесь стандартов
аминокислот,
Waters P/N 088122
Вода
40
40
880
Готовая смесь содержит 100 пмоль/мкл каждой аминокислоты.
Смесь хранится до 1 месяца при 20 оС.
Смесь с внутренним стандартом ( α-aminobutiric acid ).
1
Приготовьте 2.5 мМ растворы цистеиковой кислоты и метона в 0.1 мМ HCl.
2
Приготовьте рабочий стандарт, смешав в указанных пропорциях следующие
компоненты.
Компонент
Объем, мкл
Metone, 2.5 мМ
40
Cya, 2.5 мМ
Смесь стандартов
аминокислот,
Waters P/N 088122
Концентрат
внутреннего стандарта
Вода
40
40
40
880
Готовая смесь содержит 100 пмоль/мкл каждой аминокислоты.
Смесь хранится до 1 месяца при – 20 оС.

Приготовление концентрата внутреннего стандарта.
Добавьте 6.45 мг альфа-аминобутириковой кислоты в 25 мл 0.1М серной кислоты.
Храните концентрат до 6 месяцев при – 20 оС.
- 18 -
V.1.3 Алкилация сульфогидрильной группы
Алкилация более селективна чем перфомиковое окисление и гораздо меньше
влияет на анализ остальных аминокислот.
Наиболее часто применяется алкилация 4-винилпиридином и карбоксиметилцистеином.

Приготовление буфера.
1. Перенесите в мерный цилиндр 6.4 мл N-ethylmorpholine;
2. Доведите объем до 100 мл водой( качества Milli-Q );
3. Доведите рН до 8.3 уксусной кислотой.

Подготовка образца.
1. Поместите образец в плотно закрываемую пробирку, высушите под вукуумом, азотом
или лиофилизацией;
2. Растворите обоазец в 1 мл буфера;
3. Добавьте 1 г Guanidinum-HCl ( Gu-HCl ) и размешайте;
4. Добавьте 4 мг Dithiothreitol ( DTT ) и размешайте;
5. Закупорьте пробирку под азотным одеялом и выдержите при комнатной температуре 4
часа;
6. Добавьте 8 мкл 4-Vinylpyridine ( 4-VP ), закупорьте пробирку под азотным одеялом и
выдержите при комнатной температуре от 4 до 16 часов;
7. Добавьте 3мл воды;
8. Обессольте обращенно-фазовой хроматографией или диализом.

Приготовление стандарта.
Приготовьте 2.5 мМ раствор пиридилэтила цистеина ( PEC );
В 920 кмл воды добавьте 40 кмл раствора РЕС и 40 мкл стандарта аминокислот Waters;
Дериватизируйте 10 мкл смеси по стандартной методике AccQ Tag;
5 мкл инжекция содержит по 50 пмоль аминокислот.
- 19 -

Приготовление модифицированного элюэнта А.
1. Растворите несколько pellets NaOH в 10 мл воды.
2. Разведите концентрат элюэнта А – 100 мл концентрата на 800 мл воды. рН такого
раствора должен быть в диапазоне 5.02 – 5.07.
3. Доведите рН элюэнта до величины 5.10 – 5.15 раствором NaOH.
Метод обеспечивает разделение Cm-Cys от Clu и PEC от Lys.
- 20 -
V.2
АНАЛИЗ ЭНЗИМАТИЧНЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ.
Последовательное Cleaving образца от карбоксильных окончаний, digestion
пеатидов и белков с карбоксилпептидазой дает дополнительную информацию к
получаемой из реакции деградации Эдмана. Метод Accq Tag являет собой идеальный
инструмент для анализа таких энзиматичных гидролизатов. Приведенный ниже метод
основан на работах D. R. Koop и B. N. Jones.1
В добавление к стандартным гидролизатам аминокислот энзиматичная digestion
может продуцировать Asn, Gln и Trp и поэтому требует модифицированного элюэнта А
для разделения упомянутых компонентов.
V.2.1 Приготовление модифицированного элюэнта А.
Добавьте 100 мг EDTA в 100 мл воды. Храните до 4-х месяцев при 4 оС;
Разведите концентрированную H3PO4 в 100 мл воды;
Отвесьте 19.04 г ацетата натрия и размешайте в 1 л воды;
Добавьте 700 мг ( 964 мкл ) триэтиламина;
Добавьте 1 мкл раствора EDTA;
Доведите рН до 5.80 раствором фосфориковой кислоты.
Профильтруйте через мембрану с порами 0.45 мкм ( Supor, P/N WAT200538 ).
1
Koop, D.R., Morgan, E.T., Tarr, G.E. and Coon, M. J. ( 19982 ), J.Biol. Chem. 257, 8472 – 8480.
Jones, B.N., in Methods in Protein Sequence Analysis, Chapter 13, pp 337 – 361.
- 21 -
V.2.2 Подготовка калибровочного стандарта, содержащего Asn, Gln и Trp.
1
Приготовьте 2.5 мМ растворы Asn, Gln и Trp;
2
Приготовьте рабочий стандарт, смешав в указанных пропорциях следующие
компоненты:
Компонент
Объем, мкл
Asn, 2.5 мМ
40
Gln, 2.5 мМ
40
Trp
Смесь стандартов
аминокислот,
Waters P/N 088122
Вода
40
40
840
Смешайте 10 мкл стандарта с 70 мкл боратного буфера;
Дериватизуйте, добавив 20 мкл реагента Accq Fluor.
V.2.3 Подготовка образца.
1
Алкилируйте Cys-содержащие образцы, как описано в разделе Алкилация
сульфогидрильной группы;
2
Растворите от 0.2 до 1.0 нмоль образца в 90 мкл 0.1 М ацетата натрия, рН 5.6;
3
Приготовьте концентрированный раствор карбоксипептитдазы Y ( CPase Y, 0.6 мг/мл
в воде ) и разведите 1:10 в буфере ацетата натрия;
4
Добавьте 10 мкл разведенной карбоксипептидазы в образец и выдерживыйте при
комнатной температуре.
5
Через регулярные промежутки отбирайте по 10 мкл, смешивайте с 10 мкл ледяной
уксусной кислотой и высушивайте под вакуумом;
6
Дериватизуйте в соответствии со стандартной процедурой Accq Tag.
- 22 V.3
АНАЛИЗ КОЛЛАГЕНОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ.
Коллагены ( волокнистые белки ) извлекаются из различных образцов, включая
кожу и соединительные ткани. Коллагены содержат высокие концентраци Gly, Pro и Hyp а
так же необычные структуры в виде тройной спирали, называемые тропоколлагенами.
Метод анализа коллагенов должен обеспечивать разделение нестандартных аминокислот,
появляющихся в ходе post-translation modification.
Такая модификация приводит к тому, что пролин присутствует в форме
гидрооксипролина ( Hyp ), а лизин в форме 4-гидрооксилизина ( Hyl ).
Другое нетипичное свойство коллагенов – присутствие большого количества
cross-links между боковыми цепочками аминокислот, некоторые из которых
кислотоустойчивы и могут быть разделены после гидролиза. Обычно AQC деривативы
таких компонентов вымываются во время регенерации колонок так как содержат
множественные точки дериватизации.
Анализ коллагеновых образцов проводится любым из способов, описанными выше:


Окисление перформиковой кислотой;
Карбоксипептидазный
Для разделения Hyp и Hyl приготовьте модифицированный элюэнт А, как описано в
разделе Окисление перформиковой кислотой.
Приготовьте калибровочный стандарт, смешав в указанных пропорциях следующие
компоненты:
Компонент
Объем, мкл
Hyl, 2.5 мМ
40
Hyp, 2.5 мМ
Смесь стандартов
аминокислот,
Waters P/N 088122
Вода
40
40
880
Смешайте 10 мкл стандарта с 70 мкл боратного буфера;
Дериватизуйте, добавив 20 мкл реагента Accq Fluor.
Образцы готовятся в соответствии со стандартной процедурой AccQ Tag.
- 23 -
V.3.1 Анализ гликопротеиновых гидролизатов.
Post-translation modification белков карбогидратными moieties производит
гликопротеины. Эти conjugated макромолекулы выполняют множество функций в живом
организме в том числе и как мембранные компоненты работающие как рецепторы и
учавствующие в процессах распознования клетками друг друга и других явлениях на
поверхности клетки. Гоикопротеины присутствуют в большинстве экспортируемых
клеткой белков. Размещение карбогидоатно-белковых связей и структура sugar moieties
является предметом широкого изучения.
Важность гликопротеинов в связи с анализом аминокислот проистекает из
присутствия ацетилированных форм аминосахаров, особенно галактозамина ( GalNH2 ) и
глюкозамина ( GlсNH2 ). Гидролиз гликопротеинов, содержащих N-ацетилированные
аминосахара, в течение 16 – 24 часов не дает материала, достаточного для
количественного расчета, для этого требуются более milder условия. Аминосахара
реагируют с AQC, образуя стабильные adducts, которые необходимо отделять от обычных
аминокислот.
V.3.2 Приготовление модифицированного элюэнта А.
См. раздел V.2.1.
- 24 -
V.3.3 Приготовление стандарта с GalNH2 и GlсNH2.
Смешайте в указанных пропорциях:
Компонент
Объем, мкл
GalNH2, 2.5 мМ
40
GlсNH2, 2.5 мМ
Смесь стандартов
аминокислот,
Waters P/N 088122
Вода
40
40
880
Смешайте 10 мкл стандарта с 70 мкл боратного буфера;
Дериватизуйте, добавив 20 мкл реагента Accq Fluor.
Образцы готовятся в соответствии со стандартной процедурой AccQ Tag.
- 25 -
VI
AccQ Tag Chemistry Pakage
НОМЕРА ПО КАТАЛОГУ
Содержит:
Набор дериватизационных реагентов Accq Fluor на 250 анализов;
Колонку AccQ Tag;
AccQ Tag элюэнт 2 л;
Смесь стандартов аминокислот;
Руководство пользователя.
052875
AccQ Fluor Reagent Kit
052880
AccQ Tag Column 3.9*150 мм
052885
AccQ Tag Eluent A Concentrate, 1000 ml
052890
AccQ Tag Eluent B, 1000 ml
052895
Amino Acid Hydrolysate Standard
088122
2690 compatible 2 ml vials, pkg of 100 ( пробирки с крышками для автосамплера 2690,
100 шт. )
2690 Low volume insert 150 mkl, pkg of 100 ( конические вставки малого объема, 100
шт. )
717 compatible 4ml vials, pkg of 1440 (пробирки с крышками для автосамплера 717,
100 шт.)
270946
094171
073018
717 250 mkl conical LVI, pkg of 144 (конические вставки малого объема, 100 шт. )
015199
Корпус предколоночных вставок
046910
Nova Pak предколонки 3.9*20 мм, 2 шт.
044380
- 26 -
VII
ГИДРОЛИЗ ОБРАЗЦОВ.
Гидролиз образцов проводится в два этапа:


Сушка;
Гидролиз сухого образца.
Сушка.
Сушка производится под вакуумом при давлении 100 – 150 мторр. Если образец содержит
органические растворители, предварительно выдержите образец под азотом в течении 5 –
10 мин.
Гидролиз.
1. Добавьте 200 мкл 6-нормальной соляной кислоты;
2. Добавьте кристалл фенола ( вместо кристаллического фенола можно использовать
соляную кислоту с 1% ( по объему ) содержанием фенола ).
3. Поставьте пробирку в вакуумную установку и проделайте следующие циклы ( в
секундах ) вакуумирования ( при 1 – 2 торр ) / выдержки под азотом.
I
20 – 30
II
10
III
10
IV
20
После каждого цикла вакуумирования выдерживайте реакционную пробирку под азотом в
течении 5 сек.
После последнего цикла закупорьте пробирку ( под азотным одеялом ) и перенесите в
термостат.
4. Выдерживайте пробирку в течении 20 – 24 часов при 100 – 114 0С.
*** Гидролиз может быть выполнен в течении 1 часа при 150 0С, однако при этом
серин, треонин метионин и тирозин дают уменьгенный выход.
5. После окончания гидролиза высушите образцы под вакуумом ( 100 м торр ) в течении
5 минут.
Скачать